Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ලබා දෙන්නෙමු.
දියර බයොප්සි (LB) යනු ජෛව වෛද්‍ය ක්ෂේත්‍රයේ වේගයෙන් ජනප්‍රිය වෙමින් පවතින සංකල්පයකි.මෙම සංකල්පය ප්‍රධාන වශයෙන් පදනම් වී ඇත්තේ සංසරණීය බාහිර සෛල DNA (ccfDNA) කොටස් හඳුනා ගැනීම මත වන අතර ඒවා ප්‍රධාන වශයෙන් විවිධ පටක වල සෛල මිය යාමෙන් පසු කුඩා කොටස් ලෙස මුදා හරිනු ලැබේ.මෙම කොටස් වලින් කුඩා කොටසක් විදේශීය (විදේශීය) පටක හෝ ජීවීන්ගෙන් ආරම්භ වේ.වර්තමාන කාර්යයේදී, අපි මෙම සංකල්පය ඔවුන්ගේ ඉහළ මුහුදු ජලය පෙරීමේ හැකියාව සඳහා ප්‍රසිද්ධ සෙන්ටිනල් විශේෂයක් වන මට්ටි සඳහා යොදා ගෙන ඇත.සාගර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය පිළිබඳ තොරතුරු සැපයීම සඳහා විවිධ ප්‍රභවයන්ගෙන් පාරිසරික DNA කොටස් ග්‍රහණය කර ගැනීමට ස්වභාවික පෙරහන් ලෙස ක්‍රියා කිරීමට මට්ටි සතු හැකියාව අපි භාවිතා කරමු.අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මස්සල් හීමොලිම්ෆ් 1 සිට 5 kb දක්වා ප්‍රමාණයෙන් විශාල වශයෙන් වෙනස් වන DNA කොටස් අඩංගු බවයි.වෙඩි බෙහෙත් අනුපිළිවෙලින් පෙන්නුම් කළේ DNA කොටස් විශාල ප්‍රමාණයක් විදේශීය ක්ෂුද්‍රජීවී සම්භවයක් ඇති බවයි.ඒවා අතර, වෙරළබඩ සාගර පරිසර පද්ධතිවල බහුලව දක්නට ලැබෙන විවිධ ධාරකයන්ට ආසාදනය කරන වෛරස් ඇතුළු බැක්ටීරියා, පුරාවිද්‍යා සහ වෛරස් වලින් DNA කොටස් අපට හමු විය.අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ මට්ටි සඳහා යොදන LB සංකල්පය සාගර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය පිළිබඳ පොහොසත් නමුත් තවමත් ගවේෂණය නොකළ දැනුමේ මූලාශ්‍රයක් නියෝජනය කරන බවයි.
සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය මත දේශගුණික විපර්යාස (CC) බලපෑම වේගයෙන් වර්ධනය වන පර්යේෂණ ක්ෂේත්‍රයකි.ගෝලීය උනුසුම් වීම වැදගත් කායික ආතතීන් ඇති කරනවා පමණක් නොව, සාගර ජීවීන්ගේ තාප ස්ථායීතාවයේ පරිණාමීය සීමාවන් තල්ලු කරයි, විශේෂ ගණනාවක වාසස්ථානයට බලපායි, වඩාත් හිතකර තත්වයන් සෙවීමට ඔවුන් පොළඹවයි [1, 2].මෙටාසෝවන් වල ජෛව විවිධත්වයට බලපෑම් කිරීමට අමතරව, CC සත්කාරක-ක්ෂුද්‍ර ජීවී අන්තර්ක්‍රියා වල සියුම් සමතුලිතතාවයට බාධා කරයි.මෙම ක්ෂුද්‍රජීවී dysbacteriosis සාගර පරිසර පද්ධති වලට බරපතල තර්ජනයක් එල්ල කරයි, එය සාගර ජීවීන් බෝවන රෝග කාරක වලට වඩාත් ගොදුරු වේ [3, 4].ගෝලීය සාගර පරිසර පද්ධති කළමනාකරණය සඳහා බරපතල ගැටළුවක් වන සමූහ මරණවලදී SS වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බව විශ්වාස කෙරේ [5, 6].බොහෝ සාගර විශේෂවල ආර්ථික, පාරිසරික හා පෝෂණ බලපෑම් සැලකිල්ලට ගත් විට මෙය වැදගත් කරුණකි.මෙය විශේෂයෙන්ම සත්‍ය වන්නේ ධ්‍රැවීය ප්‍රදේශ වල ජීවත් වන bivalves සඳහා වන අතර, CK හි බලපෑම් වඩාත් ක්ෂණික හා දරුණු වේ [6, 7].ඇත්ත වශයෙන්ම, Mytilus spp වැනි bivalves.සාගර පරිසර පද්ධති මත CC හි බලපෑම නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ.බොහෝ විට එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් හෝ සෛල ශක්‍යතාව සහ ෆාගෝසයිටික් ක්‍රියාකාරකම් වැනි සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් මත පදනම් වූ ක්‍රියාකාරී ජෛව සලකුණු ඇතුළත් ද්වි-ස්ථර ප්‍රවේශයක් භාවිතා කරමින් ඔවුන්ගේ සෞඛ්‍යය නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා සාපේක්ෂව විශාල ජෛව සලකුණු සංඛ්‍යාවක් සංවර්ධනය කර තිබීම පුදුමයක් නොවේ.මුහුදු ජලය විශාල ප්‍රමාණයක් අවශෝෂණය කිරීමෙන් පසු මෘදු පටක වල එකතු වන විශේෂිත පීඩන දර්ශකවල සාන්ද්‍රණය මැනීම ද මෙම ක්‍රමවලට ඇතුළත් වේ.කෙසේ වෙතත්, bivalves හි ඉහළ පෙරීමේ ධාරිතාව සහ අර්ධ-විවෘත සංසරණ පද්ධතිය, රෝගියා කළමනාකරණය සඳහා සරල සහ අවම ආක්‍රමණශීලී ප්‍රවේශයක් වන දියර බයොප්සි (LB) සංකල්පය භාවිතා කරමින් නව hemolymph biomarkers සංවර්ධනය කිරීමට අවස්ථාවක් සපයයි.රුධිර සාම්පල [9, 10].මිනිස් LB හි සංසරණ අණු වර්ග කිහිපයක් සොයා ගත හැකි වුවද, මෙම සංකල්පය මූලික වශයෙන් පදනම් වී ඇත්තේ ප්ලාස්මා තුළ සංසරණය වන බාහිර සෛල DNA (ccfDNA) කොටස්වල DNA අනුක්‍රමික විශ්ලේෂණය මතය.ඇත්ත වශයෙන්ම, මානව ප්ලාස්මා තුළ DNA සංසරණ පැවැත්ම 20 වන සියවසේ මැද භාගයේ සිට දැනගෙන ඇත [11], නමුත් එය ccfDNA මත පදනම් වූ සායනික රෝග විනිශ්චය කිරීමට හේතු වී ඇත්තේ මෑත වසරවලදී පමණි.මෙම සංසරණ ඩීඑන්ඒ කොටස් පැවතීම සෛල මරණයෙන් පසු ජානමය DNA (න්‍යෂ්ටික සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රිය) නිෂ්ක්‍රීයව මුදා හැරීමට හේතු වේ. නිරෝගී පුද්ගලයන් තුළ, ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩු (<10 ng/mL) නමුත් විවිධ ව්‍යාධිවලින් පෙළෙන හෝ ආතතියට ලක්වන රෝගීන් තුළ 5-10 ගුණයකින් වැඩි කළ හැකි අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පටක හානි සිදුවේ. නිරෝගී පුද්ගලයන් තුළ, ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩු (<10 ng/mL) නමුත් විවිධ ව්‍යාධිවලින් පෙළෙන හෝ ආතතියට ලක්වන රෝගීන් තුළ 5-10 ගුණයකින් වැඩි කළ හැකි අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පටක හානි සිදුවේ. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/мл), но может повышатьсуся в 5-10 в ной патологией или подвергающихся stressu, приводящему к повреждению тканей. නිරෝගී පුද්ගලයන් තුළ, cccDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩුය (<10 ng/mL), නමුත් විවිධ ව්‍යාධි ඇති රෝගීන් හෝ පටක හානිවලට තුඩු දෙන ආතතිය යටතේ එය 5-10 ගුණයකින් වැඩි විය හැක.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承帅皅理或承受帎-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 ඔබ 中 , ccfdna 的 浓度 较 ඔබ （<10 ng/ml增加 5-10 倍 , 从而 组 织。。 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 දක්වා ными патологиями или stressom, что приводит к повреждению тканей. නිරෝගී පුද්ගලයන් තුළ ccfDNA සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් අඩු (<10 ng/ml) වේ, නමුත් විවිධ ව්‍යාධි හෝ ආතතිය ඇති රෝගීන් තුළ 5-10 ගුණයකින් වැඩි කළ හැකි අතර එමඟින් පටක වලට හානි සිදු වේ.ccfDNA කොටස්වල විශාලත්වය පුළුල් ලෙස වෙනස් වේ, නමුත් සාමාන්‍යයෙන් 150 සිට 200 bp දක්වා පරාසයක පවතී.[12].ස්වයං-ව්‍යුත්පන්න ccfDNA විශ්ලේෂණය, එනම් සාමාන්‍ය හෝ පරිණාමනය වූ ධාරක සෛල වලින් ccfDNA, න්‍යෂ්ටික සහ/හෝ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජෙනෝමය තුළ පවතින ජානමය සහ එපිජෙනටික් වෙනස්කම් හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි අතර එමඟින් විශේෂිත අණුක ඉලක්කගත ප්‍රතිකාර තෝරා ගැනීමට වෛද්‍යවරුන්ට උපකාර කරයි [13] .කෙසේ වෙතත්, ccfDNA ccfDNA වැනි විදේශීය මූලාශ්‍රවලින් ගර්භණී සමයේදී කළල සෛලවලින් හෝ බද්ධ කළ අවයවවලින් [14,15,16,17] ලබා ගත හැක.ccfDNA යනු ආසාදන කාරකයක (විදේශීය) න්‍යෂ්ටික අම්ල පවතින බව හඳුනා ගැනීම සඳහා වැදගත් තොරතුරු මූලාශ්‍රයක් වන අතර එමඟින් රුධිර සංස්කෘතීන් විසින් හඳුනා නොගත් පුළුල් ආසාදන ආක්‍රමණශීලී නොවන ලෙස හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසයි, ආසාදිත පටක වල ආක්‍රමණශීලී බයොප්සි වළක්වා ගත හැකිය [18].මෑත කාලීන අධ්‍යයනයන් ඇත්ත වශයෙන්ම පෙන්වා දී ඇත්තේ වෛරස් හා බැක්ටීරියා රෝග කාරක හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කළ හැකි පොහොසත් තොරතුරු මූලාශ්‍රයක් මිනිස් රුධිරයේ අඩංගු වන අතර මානව ප්ලාස්මාවේ ඇති ccfDNA වලින් 1% ක් පමණ විදේශීය සම්භවයක් ඇති බවයි [19].මෙම අධ්‍යයනයන් මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ ජීවියෙකුගේ සංසරණ ක්ෂුද්‍රජීවයේ ජෛව විවිධත්වය ccfDNA විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් තක්සේරු කළ හැකි බවයි.කෙසේ වෙතත්, මෑතක් වන තුරු, මෙම සංකල්පය මිනිසුන් තුළ පමණක් භාවිතා කරන ලද අතර, අඩු වශයෙන්, අනෙකුත් පෘෂ්ඨවංශීන් තුළ [20, 21].
වර්තමාන පත්‍රිකාවේ, අපි වසර මිලියන 35කට පෙර නිර්මාණය වූ විශාල සානුවක් උඩ පිහිටි දූපත් සමූහයක් වන subantarctic Kerguelen Islands හි බහුලව දක්නට ලැබෙන දකුණු විශේෂයක් වන Aulacomya atra හි ccfDNA විශ්ලේෂණය කිරීමට LB විභවය භාවිතා කරමු.ගිනිකඳු පිපිරීමක්.in vitro පර්යේෂණාත්මක පද්ධතියක් භාවිතා කරමින්, අපි සොයා ගත්තේ මුහුදු ජලයේ DNA කොටස් ඉක්මනින් මට්ටි විසින් ලබාගෙන hemolymph මැදිරියට ඇතුළු වන බවයි.ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය පෙන්වා දී ඇත්තේ මස්සල් හීමොලිම්ෆ් සීසීඑෆ්ඩීඑන්ඒ හි ස්වකීය සහ ස්වයං නොවන සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් අඩංගු වන අතර, සහජීවන බැක්ටීරියා සහ සීතල ගිනිකඳු සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල සාමාන්‍ය ජෛව විද්‍යාවේ DNA කොටස් ඇතුළුව.Hemolymph ccfDNA විවිධ ධාරක පරාසයන් සහිත වෛරස් වලින් ලබාගත් වෛරස් අනුපිළිවෙල ද අඩංගු වේ.අස්ථි මාළු, මුහුදු ඇනිමෝන්, ඇල්ගී සහ කෘමීන් වැනි බහු සෛලීය සතුන්ගෙන් DNA කොටස් ද අපට හමු විය.අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ සාගර පරිසර පද්ධතිවල පොහොසත් ප්‍රවේණික ප්‍රතිපෝෂණයක් ජනනය කිරීම සඳහා සාගර අපෘෂ්ඨවංශීන් සඳහා LB සංකල්පය සාර්ථකව යෙදිය හැකි බවයි.
වැඩිහිටි (මි.මී. 55-70 දිග) Mytilus platensis (M. platensis) සහ Aulacomya atra (A. atra) පෝට්-ඕ-ප්‍රංශයේ අන්තර් උදම් පාෂාණ වෙරළවලින් (049°21.235 S, 070°13.490 E.) එකතු කරන ලදී.2018 දෙසැම්බරයේ Kerguelen Islands. අනෙකුත් වැඩිහිටි නිල් මට්ටි (Mytilus spp.) වාණිජ සැපයුම්කරුවෙකුගෙන් (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ලබාගෙන කෘත්‍රිම අති ක්ෂාර 10-20 L අඩංගු උෂ්ණත්වය පාලනය කළ (4°C) වායුකෘත ටැංකියක තැන්පත් කරන ලදී.(කෘතිම මුහුදු ලුණු Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).එක් එක් අත්හදා බැලීම සඳහා, තනි ෂෙල් වෙඩි වල දිග සහ බර මනිනු ලැබේ.
මෙම වැඩසටහන සඳහා නොමිලේ විවෘත ප්‍රවේශ ප්‍රොටෝකෝලයක් මාර්ගගතව ඇත (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).කෙටියෙන්, LB hemolymph විස්තර කර ඇති පරිදි පැහැර ගන්නා මාංශ පේශි වලින් එකතු කරන ලදී [22].හීමොලිම්ෆ් මිනිත්තු 3 ක් සඳහා 1200×g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කිරීම මගින් පැහැදිලි කරන ලදී, අධි ප්‍රවාහය භාවිතා කරන තෙක් (-20 ° C) ශීත කරන ලදී.cfDNA හුදකලා කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීම සඳහා, නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව NucleoSnap cfDNA කට්ටලය (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) භාවිතයෙන් සාම්පල (1.5-2.0 ml) දියකර සකස් කරන ලදී.ccfDNA තවදුරටත් විශ්ලේෂණය කරන තුරු -80 ° C දී ගබඩා කර ඇත.සමහර අත්හදා බැලීම් වලදී, QIAamp DNA පරීක්ෂක කට්ටලය (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) භාවිතයෙන් ccfDNA හුදකලා කර පිරිසිදු කරන ලදී.සම්මත PicoGreen විශ්ලේෂණයක් භාවිතයෙන් පිරිසිදු කරන ලද DNA ප්‍රමාණනය කරන ලදී.අධි සංවේදී DNA කට්ටලයක් භාවිතයෙන් Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) භාවිතයෙන් කේශනාලිකා විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් හුදකලා ccfDNA කොටස් ව්‍යාප්තිය විශ්ලේෂණය කරන ලදී.නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව ccfDNA සාම්පලයේ 1 µl භාවිතා කරමින් විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
hemolymph ccfDNA කොටස් අනුක්‍රමණය කිරීම සඳහා, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) Illumina MiSeq PE75 කට්ටලයේ Illumina DNA මිශ්‍ර කට්ටලය භාවිතයෙන් වෙඩි බෙහෙත් පුස්තකාල සකස් කරන ලදී.සම්මත ඇඩප්ටරයක් ​​(BioO) භාවිතා කරන ලදී.අමු දත්ත ගොනු NCBI අනුක්‍රමික කියවීමේ ලේඛනාගාරයෙන් ලබා ගත හැකිය (SRR8924808 සහ SRR8924809).FastQC [23] භාවිතයෙන් මූලික කියවීමේ ගුණාත්මකභාවය තක්සේරු කරන ලදී.Trimmomatic [24] ක්ලිපින් ඇඩප්ටර සහ දුර්වල ගුණාත්මක කියවීම් සඳහා භාවිතා කර ඇත.නොගැලපීම් වලක්වා ගැනීම සඳහා යුගල කරන ලද අන්ත සහිත ෂොට්ගන් කියවීම් අවම වශයෙන් 20 bp අතිච්ඡාදනය සහිත දිගු තනි කියවීම් වලට ඒකාබද්ධ කරන ලදී [25]. Bivalve NCBI වර්ගීකරණ දත්ත ගබඩාවක් (ඉ අගය <1e−3 සහ 90% සමජාතීය) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ ඒකාබද්ධ කළ කියවීම් විවරණය කරන ලද අතර අඩු සංකීර්ණතා අනුපිළිවෙලවල් ආවරණය කිරීම DUST [26] භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. Bivalve NCBI වර්ගීකරණ දත්ත ගබඩාවක් (ඉ අගය <1e−3 සහ 90% සමජාතීය) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ ඒකාබද්ධ කළ කියවීම් විවරණය කරන ලද අතර අඩු සංකීර්ණතා අනුපිළිවෙලවල් ආවරණය කිරීම DUST [26] භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. Объединные чтенные були аннотированы с помощю BLASTN s ISPOLUSOvaniem bazy dannыh taksonomies BI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выности 26]. NCBI bivalve Taxonomy දත්ත සමුදාය (e අගය <1e-3 සහ 90% homology) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ එකතු කරන ලද කියවීම් විවරණය කරන ලද අතර DUST [26] භාවිතයෙන් අඩු සංකීර්ණතා අනුක්‍රමික ආවරණ සිදු කරන ලදී.ඔබ NCBI低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩列掩蔽 掩蔽Объединные чтенные були аннотированы с помощую BLASTN s ISPOLYSOVANIEM ටක්සොනොමිචෙස්කොයි ඩීප්ස් ков NCBI (значение e <1e-3 සහ 90% гомологии) දූවිලි [26]. NCBI bivalve වර්ගීකරණ දත්ත සමුදාය (e අගය <1e-3 සහ 90% homology) භාවිතයෙන් BLASTN සමඟ එකතු කරන ලද කියවීම් සටහන් කරන ලද අතර, DUST [26] භාවිතයෙන් අඩු සංකීර්ණතා අනුක්‍රමික ආවරණ සිදු කරන ලදී.කියවීම් කණ්ඩායම් දෙකකට බෙදා ඇත: බයිවල්ව් අනුපිළිවෙලට සම්බන්ධ (මෙහි ස්වයං කියවීම් ලෙස හැඳින්වේ) සහ සම්බන්ධ නොවූ (ස්වයං-කියවීම් නොවන).කොන්ටිග්ස් ජනනය කිරීම සඳහා MEGAHIT භාවිතයෙන් කණ්ඩායම් දෙකක් වෙන වෙනම රැස් කරන ලදී [27].මේ අතර, පිටසක්වල ක්ෂුද්‍රජීව කියවීම්වල වර්ගීකරණ ව්‍යාප්තිය Kraken2 [28] භාවිතයෙන් වර්ගීකරණය කරන ලද අතර Galaxy [29, 30] හි ක්‍රෝනා පයි ප්‍රස්ථාරයකින් ප්‍රස්ථාරිකව නිරූපණය කරන ලදී.ප්‍රශස්ත kmers අපගේ මූලික පරීක්ෂණ වලින් kmers-59 ලෙස තීරණය විය. අවසාන විවරණයක් සඳහා BLASTN (bivalve NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e−10 සහ 60% homology) සමඟ පෙළගැස්වීමෙන් ස්වයං කොන්ටිග්ස් පසුව හඳුනා ගන්නා ලදී. අවසාන විවරණයක් සඳහා BLASTN (bivalve NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e−10 සහ 60% homology) සමඟ පෙළගැස්වීමෙන් ස්වයං කොන්ටිග්ස් පසුව හඳුනා ගන්නා ලදී. Затем собственные контиги били идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (බසා ඩැන්නික් ඩබ්ලිව්, ඩබ්ලිව්. ение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. අවසාන විවරණ සඳහා BLASTN (NCBI bivalve දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% homology) සමඟ ගැලපීම මගින් ස්වයං-සන්ධි පසුව හඳුනා ගන්නා ලදී.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e值< 1e-10% 和60%最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной анотации путем сопоставление для двустворчатых молллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTN (NCBI bivalve දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% homology) සමග ගැලපීම මගින් අවසාන විවරණ සඳහා ස්වයං-contigs පසුව හඳුනා ගන්නා ලදී. සමාන්තරව, BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e−10 සහ 60% homology) සමඟින් ස්වයංක්‍රීය නොවන කණ්ඩායම් contigs සටහන් කර ඇත. සමාන්තරව, BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e−10 සහ 60% homology) සමඟින් ස්වයංක්‍රීය නොවන කණ්ඩායම් contigs සටහන් කර ඇත. Параллельно чужеродные груповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (Bаза dannыh nt NCBI, <NCBI, 10 60%). සමාන්තරව, BLASTN (NT NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% homology) සමඟ විදේශීය කණ්ඩායම් contigs විවරණය කරන ලදී.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной grouppe, бли аннотированы с помосульно контиги, бесплатно <1e-10 и гомология 60%). සමාන්තරව, BLASTN (nt NCBI දත්ත සමුදාය, e අගය <1e-10 සහ 60% homology) සමඟ ස්වයං කණ්ඩායම් නොවන contigs විවරණය කරන ලදී. BLASTX nr සහ RefSeq ප්‍රෝටීන් NCBI දත්ත සමුදායන් (e අගය <1e−10 සහ 60% homology) භාවිතා කරමින් nonself contigs මත ද පවත්වන ලදී. BLASTX nr සහ RefSeq ප්‍රෝටීන් NCBI දත්ත සමුදායන් (e අගය <1e−10 සහ 60% homology) භාවිතා කරමින් nonself contigs මත ද පවත්වන ලදී. BLASTX TAKJE был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq10 ඔලෝගියා 60%). BLASTX nr සහ RefSeq NCBI ප්‍රෝටීන් දත්ත සමුදායන් (e අගය < 1e-10 සහ 60% homology) භාවිතයෙන් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග්ස් මත ද සිදු කරන ලදී.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI BLASTX tакже выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr සහ RefSeq NCBI 60%). BLASTX nr සහ RefSeq NCBI ප්‍රෝටීන් දත්ත සමුදායන් (e අගය <1e-10 සහ 60% homology) භාවිතයෙන් ස්වයං-නොවන කොන්ටිග්ස් මතද සිදු කරන ලදී.BLASTN සහ BLASTX-නොවන ස්වයං-කොන්ටිග්ස් සංචිත අවසාන කොන්ටිග්ස් නියෝජනය කරයි (පරිපූරක ගොනුව බලන්න).
PCR සඳහා භාවිතා කරන ප්‍රාථමිකයන් S1 වගුවේ දක්වා ඇත.Taq DNA පොලිමරේස් (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA ඉලක්කගත ජාන විස්තාරණය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.පහත සඳහන් ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි භාවිතා කරන ලදී: මිනිත්තු 3 ක් සඳහා 95 ° C, විනාඩි 1 ක් සඳහා 95 ° C, විනාඩි 1 ක් සඳහා නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය, විනාඩි 1 ක් සඳහා 72 ° C දී දිගු කිරීම, චක්‍ර 35 ක් සහ අවසානයේ විනාඩි 10 ක් ඇතුළත 72 ° C..PCR නිෂ්පාදන 95 V දී SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) අඩංගු agarose gels (1.5%) හි ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් මගින් වෙන් කරන ලදී.
මස්සල් (Mytilus spp.) 500 ml ඔක්සිජන් සහිත මුහුදු ජලය (32 PSU) තුළ පැය 24 ක් 4 ° C දී හුරුපුරුදු විය.මානව ගැලැක්ටින්-7 cDNA අනුක්‍රමය (NCBI ප්‍රවේශ අංකය L07769) කේතනය කරන ඇතුළු කිරීමක් අඩංගු ප්ලාස්මිඩ් DNA 190 μg/μl අවසාන සාන්ද්‍රණයකින් කුප්පියට එකතු කරන ලදී.ඩීඑන්ඒ එකතු කිරීමකින් තොරව එකම තත්ත්‍වයන් යටතේ ඉන්කියුබේෂන් කරන ලද මට්ටි පාලනය විය.තුන්වන පාලන ටැංකියේ මට්ටි නොමැති DNA අඩංගු විය.මුහුදු ජලයේ DNA වල ගුණාත්මක භාවය නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා, එක් එක් ටැංකියෙන් මුහුදු ජලය සාම්පල (20 μl; පුනරාවර්තන තුනක්) නියමිත වේලාවට ගන්නා ලදී.ප්ලාස්මිඩ් ඩීඑන්ඒ සොයාගැනීමේ හැකියාව සඳහා, එල්බී මට්ටි නියමිත වේලාවට අස්වනු නෙළන ලද අතර qPCR සහ ddPCR මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.මුහුදු ජලයේ ඇති අධික ලවණ ප්‍රමාණය හේතුවෙන්, සියලුම PCR විශ්ලේෂණයන්ට පෙර ඇල්කොට්ස් PCR ගුණාත්මක ජලයේ (1:10) තනුක කර ඇත.
Digital droplet PCR (ddPCR) BioRad QX200 ප්‍රොටෝකෝලය (Mississauga, Ontario, Canada) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.ප්රශස්ථ උෂ්ණත්වය තීරණය කිරීම සඳහා උෂ්ණත්ව පැතිකඩ භාවිතා කරන්න (වගුව S1).QX200 drop generator (BioRad) භාවිතයෙන් බිංදු උත්පාදනය කරන ලදී.ddPCR පහත පරිදි සිදු කරන ලදී: මිනිත්තු 5 ක් සඳහා 95 ° C, තත්පර 30 ක් සඳහා 95 ° C චක්‍ර 50 ක් සහ මිනි 1 ක් සහ තත්පර 30 ක් සඳහා 72 ° C, විනාඩි 5 ක් සඳහා 4 ° C සහ විනාඩි 5 ක් ඇතුළත 90 ° C.QX200 drop reader (BioRad) භාවිතයෙන් බිංදු සහ ධනාත්මක ප්‍රතික්‍රියා ගණන (පිටපත් ගණන/µl) මනිනු ලැබේ.ජල බිඳිති 10,000ට අඩු සාම්පල ප්‍රතික්ෂේප විය.ddPCR ධාවනය කරන සෑම අවස්ථාවකම රටා පාලනය සිදු නොකෙරේ.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) සහ LGALS7 විශේෂිත ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) භාවිතයෙන් සියලුම ප්‍රමාණාත්මක PCR 20 µl වලින් සිදු කරන ලදී.qPCR 95 ° C දී මිනිත්තු 15 ක ඉන්කියුබේෂන් සමඟ ආරම්භ කරන ලද අතර පසුව චක්‍ර 40 ක් 95 ° C දී තත්පර 10 ක් සහ තත්පර 60 ක් සඳහා 60 ° C දී එක් දත්ත එකතුවක් සමඟ ආරම්භ කරන ලදී.qPCR අවසානයේ තත්පර 5 සඳහා 95 ° C, තත්පර 60 සඳහා 65 ° C සහ 97 ° C අනුක්‍රමික මිනුම් භාවිතා කරමින් ද්‍රවාංක වක්‍ර ජනනය කරන ලදී.පාලන සාම්පල හැර සෑම qPCR එකක්ම තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලදී.
මට්ටි ඔවුන්ගේ ඉහළ පෙරීමේ අනුපාතය සඳහා ප්‍රසිද්ධ වී ඇති බැවින්, අපි මුලින්ම විමර්ශනය කළේ ඔවුන්ට මුහුදු ජලයේ ඇති DNA කොටස් පෙරීමට සහ රඳවා තබා ගත හැකිද යන්නයි.මෙම කොටස් ඔවුන්ගේ අර්ධ-විවෘත වසා පද්ධතියේ එකතු වේද යන්න ගැනද අපි උනන්දු වෙමු.නිල් මට්ටි ටැංකිවලට එකතු කරන ලද ද්‍රාව්‍ය DNA කොටස්වල ඉරණම සොයා බැලීමෙන් අපි මෙම ගැටලුව පර්යේෂණාත්මකව විසඳා ගත්තෙමු.DNA කොටස් ලුහුබැඳීම පහසු කිරීම සඳහා, අපි මානව ගැලැක්ටින්-7 ජානය අඩංගු විදේශීය (ස්වයං නොවේ) ප්ලාස්මිඩ් DNA භාවිතා කළෙමු.ddPCR මුහුදු ජලයේ සහ මට්ටි වල ප්ලාස්මිඩ් DNA කොටස් සොයා ගනී.අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මට්ටි නොමැති විට මුහුදු ජලයේ DNA කොටස් ප්‍රමාණය කාලයත් සමඟ (දින 7 දක්වා) සාපේක්ෂව නියතව පැවතියේ නම්, මට්ටි ඉදිරියේ මෙම මට්ටම පැය 8 ක් ඇතුළත සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ අතුරුදහන් වූ බවයි (රූපය 1a,b).ඉන්ට්‍රාවල්වුලර් තරලය සහ හීමොලිම්ෆ් (පය. 1c) තුළ මිනිත්තු 15ක් ඇතුළත බාහිර DNA කොටස් පහසුවෙන් අනාවරණය විය.මෙම කොටස් නිරාවරණය වීමෙන් පැය 4 ක් දක්වා තවමත් අනාවරණය කර ගත හැකිය.DNA කොටස් සම්බන්ධයෙන් මෙම පෙරීමේ ක්‍රියාකාරකම බැක්ටීරියා සහ ඇල්ගී වල පෙරීමේ ක්‍රියාකාරකම් සමඟ සැසඳිය හැක [31].මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ මස්කූරුවලට ඔවුන්ගේ තරල මැදිරි තුළ විදේශීය DNA පෙරීමට සහ රැස් කර ගත හැකි බවයි.
ddPCR මගින් මනිනු ලබන මට්ටි (A) හෝ නොමැති (B) හි මුහුදු ජලයේ ප්ලාස්මිඩ් DNA වල සාපේක්ෂ සාන්ද්‍රණය.A හි, ප්‍රතිඵල ප්‍රතිශත ලෙස ප්‍රකාශ කර ඇති අතර, පෙට්ටිවල මායිම් 75 සහ 25 වැනි ප්‍රතිශත නියෝජනය කරයි.සවි කර ඇති ලඝුගණක වක්රය රතු පැහැයෙන් පෙන්වා ඇති අතර, අළු පැහැයෙන් සෙවන ලද ප්රදේශය 95% විශ්වාසනීය පරතරය නියෝජනය කරයි.B හි, රතු රේඛාව මධ්යන්යය නියෝජනය කරන අතර නිල් රේඛාව සාන්ද්රණය සඳහා 95% විශ්වාසනීය පරතරය නියෝජනය කරයි.C ප්ලාස්මිඩ් DNA එකතු කිරීමෙන් පසු විවිධ කාලවලදී මට්ටි වල hemolymph සහ valvular තරලය තුළ ප්ලාස්මිඩ් DNA සමුච්චය වීම.ප්‍රතිඵල නිරපේක්ෂ පිටපත් අනාවරණය කර ඇත/mL (±SE) ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.
මීළඟට, සීමිත මානව බලපෑම් සහිත දුරස්ථ දූපත් සමූහයක් වන Kerguelen Islands හි මට්ටි ඇඳන් වලින් එකතු කරන ලද මට්ටි වල ccfDNA සම්භවය අපි විමර්ශනය කළෙමු.මෙම කාර්යය සඳහා, mussel hemolymphs වලින් cccDNA හුදකලා කර පිරිසිදු කර ඇත්තේ මානව cccDNA පිරිසිදු කිරීමට බහුලව භාවිතා වන ක්‍රම මගින් [32, 33].මට්ටි වල සාමාන්‍ය hemolymph ccfDNA සාන්ද්‍රණය මිලිලීටර හීමොලිම්ෆ් පරාසයකට අඩු මයික්‍රොග්‍රෑම් වල ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (වගුව S2, පරිපූරක තොරතුරු බලන්න).මෙම සාන්ද්‍රණ පරාසය සෞඛ්‍ය සම්පන්න පුද්ගලයින්ට වඩා විශාල වේ (මිලිලීටරයකට අඩු නැනෝග්‍රෑම්), නමුත් දුර්ලභ අවස්ථාවන්හිදී, පිළිකා රෝගීන් තුළ, ccfDNA මට්ටම මිලිලීටරයකට මයික්‍රොග්‍රෑම් කිහිපයකට ළඟා විය හැකිය [34, 35].hemolymph ccfDNA හි ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය පිළිබඳ විශ්ලේෂණයකින් පෙන්නුම් කළේ මෙම කොටස් 1000 bp සිට 1000 bp දක්වා ප්‍රමාණයෙන් විශාල ලෙස වෙනස් වන බවයි.5000 bp දක්වා (රූපය 2).ccfDNA ඇතුළුව අඩු සාන්ද්‍රණයක් ඇති DNA සාම්පල වලින් ප්‍රවේණික DNA ඉක්මනින් හුදකලා කිරීමට සහ පිරිසිදු කිරීමට අධිකරණ වෛද්‍ය විද්‍යාවේ බහුලව භාවිතා වන ක්‍රමයක් වන සිලිකා පාදක QIAamp Investigator Kit භාවිතයෙන් සමාන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී [36].
mussel hemolymph හි නියෝජිත ccfDNA ඉලෙක්ට්‍රෝෆෝග්‍රෑම්.NucleoSnap ප්ලාස්මා කට්ටලය (ඉහළ) සහ QIAamp DNA විමර්ශන කට්ටලය සමඟ උපුටා ගන්නා ලදී.බී වයලීන කුමන්ත්‍රණය, මට්ටි වල hemolymph ccfDNA සාන්ද්‍රණය (± SE) බෙදා හැරීම පෙන්නුම් කරයි.කළු සහ රතු රේඛා පිළිවෙලින් මධ්‍ය සහ පළමු සහ තුන්වන කාර්තු නියෝජනය කරයි.
මිනිසුන්ගේ සහ ප්‍රයිමේටේට් වල ccfDNA වලින් ආසන්න වශයෙන් 1% විදේශීය මූලාශ්‍රයක් ඇත [21, 37].Bivalves වල අර්ධ විවෘත සංසරණ පද්ධතිය, ක්ෂුද්‍රජීවී බහුල මුහුදු ජලය සහ mussel ccfDNA ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය අනුව, අපි උපකල්පනය කළේ mussel hemolymph ccfDNA හි ක්ෂුද්‍රජීවී DNA වල පොහොසත් සහ විවිධ සංචිතයක් අඩංගු විය හැකි බවයි.මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි Kerguelen දූපත් වලින් එකතු කරන ලද Aulacomya atra සාම්පල වලින් hemolymph ccfDNA අනුක්‍රමණය කළ අතර, මිලියන 10 කට අධික කියවීම් ලබා දුන් අතර, එයින් 97.6%ක් තත්ත්ව පාලනය සමත් විය.BLASTN සහ NCBI bivalve දත්ත සමුදායන් (Fig. S1, අතිරේක තොරතුරු) භාවිතයෙන් ස්වයං සහ ස්වයං නොවන මූලාශ්‍ර අනුව කියවීම් පසුව වර්ගීකරණය කරන ලදී.
මිනිසුන් තුළ, න්‍යෂ්ටික සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රිය DNA යන දෙකම රුධිරයට මුදා හැරිය හැක [38].කෙසේ වෙතත්, වර්තමාන අධ්‍යයනයේ දී, A. atra ජෙනෝමය අනුපිළිවෙලට හෝ විස්තර කර නොමැති බැවින්, මට්ටියන්ගේ න්‍යෂ්ටික ප්‍රවේණික DNA විස්තරාත්මකව විස්තර කිරීමට නොහැකි විය.කෙසේ වෙතත්, bivalve පුස්තකාලය භාවිතයෙන් අපගේම සම්භවයක් ඇති ccfDNA කොටස් ගණනාවක් හඳුනා ගැනීමට අපට හැකි විය (රූපය S2, අතිරේක තොරතුරු).අනුක්‍රමණය කරන ලද A. ඇට්‍රා ජානවල අධ්‍යක්ෂණය කරන ලද PCR විස්තාරණය මගින් අපගේම සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් පවතින බව අපි තහවුරු කළෙමු (රූපය 3).ඒ හා සමානව, A. atra හි මයිටොකොන්ඩ්‍රිය ජෙනෝමය පොදු දත්ත සමුදායන්හි පවතින බැවින්, A. atra හි hemolymph හි මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ccfDNA කොටස් පවතින බවට සාක්ෂි සොයාගත හැකිය.මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් DNA කොටස් තිබීම PCR විස්තාරණය මගින් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 3).
PCR මගින් විස්තාරණය කරන ලද A. atra (රතු තිත් - කොටස් අංකය: SRX5705969) සහ M. ප්ලැටෙන්සිස් (නිල් තිත් - කොටස් අංකය: SRX5705968) හි hemolymph හි විවිධ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාන පැවතුනි.Breton et al., 2011 B වෙතින් අනුවර්තනය කරන ලද රූපය A. atra වෙතින් hemolymph supernatant වර්ධක කිරීම FTA කඩදාසි මත ගබඩා කර ඇත.PCR මිශ්‍රණය අඩංගු PCR නලයට කෙලින්ම එකතු කිරීමට 3 mm පන්ච් එකක් භාවිතා කරන්න.
මුහුදු ජලයේ ඇති බහුල ක්ෂුද්‍රජීවී අන්තර්ගතය සැලකිල්ලට ගෙන, අපි මුලින් අවධානය යොමු කළේ hemolymph හි ක්ෂුද්‍රජීවී DNA අනුක්‍රමවල ගුනාංගීකරනය කෙරෙහිය.මෙය සිදු කිරීම සඳහා, අපි විවිධ උපාය මාර්ග දෙකක් භාවිතා කරමු.BLAST සහ අනෙකුත් මෙවලම් සමග සැසඳිය හැකි නිරවද්‍යතාවයකින් ක්ෂුද්‍රජීවී අනුපිළිවෙලවල් හඳුනා ගත හැකි ඇල්ගොරිතම මත පදනම් වූ අනුක්‍රමික වර්ගීකරණ වැඩසටහනක් වන Kraken2 භාවිතා කරන ලද පළමු උපායමාර්ගය [28].6719 කට වඩා වැඩි කියවීම් බැක්ටීරියා සම්භවයක් බවට තීරණය කරන ලද අතර 124 සහ 64 පිළිවෙලින් පුරාවිද්‍යා සහ වෛරස් වලින් විය (රූපය 4).වඩාත් බහුල බැක්ටීරියා DNA කොටස් වූයේ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) සහ Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).මෙම ව්‍යාප්තිය සමුද්‍ර නිල් මට්ටි ක්ෂුද්‍රජීව [39, 40] පිළිබඳ පෙර අධ්‍යයනයන්ට අනුකූල වේ.Gammaproteobacteria බොහෝ Vibrionales (රූපය 4b) ඇතුළුව Proteobacteria (44%) හි ප්රධාන පන්තිය විය.ddPCR ක්‍රමය A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] හි ccfDNA හි Vibrio DNA කොටස් පවතින බව තහවුරු කරන ලදී.ccfDNA හි බැක්ටීරියා සම්භවය පිළිබඳ වැඩි විස්තර ලබා ගැනීම සඳහා, අතිරේක ප්රවේශයක් ගන්නා ලදී (රූපය S2, අතිරේක තොරතුරු). මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අතිච්ඡාදනය වූ කියවීම් යුගල-අවසාන කියවීම් ලෙස එකලස් කරන ලද අතර BLASTN සහ 1e−3 හි e අගය සහ >90% සමජාතීය සමඟ කඩඉමක් භාවිතයෙන් ස්වයං (bivalves) හෝ ස්වයං ප්‍රභවයක් ලෙස වර්ගීකරණය කර ඇත. මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අතිච්ඡාදනය වූ කියවීම් යුගල-අවසාන කියවීම් ලෙස එකලස් කරන ලද අතර BLASTN සහ 1e−3 හි e අගය සහ >90% සමජාතීය සමඟ කඩඉමක් භාවිතයෙන් ස්වයං (bivalves) හෝ ස්වයං ප්‍රභවයක් ලෙස වර්ගීකරණය කර ඇත. В В В В том случае перекрывающиеся били собраны как чтения с parnыmy cornsamies и били классии ye (dвустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения и готом 3 0% මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අතිච්ඡාදනය වන කියවීම් යුගල-අවසාන කියවීම් ලෙස එකතු කරන ලද අතර BLASTN සහ 1e-3 හි e අගය භාවිතා කර ස්වදේශීය (ද්විකාකාර) හෝ මුල් නොවන ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලද අතර >90% සමජාතීය සමග කඩඉම්.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倚和值和 90%分类为自身（双壳类）或非自身来源。පිපිරුම 0% 同源性 的 分类 自身 В В В В том случае перекрываюющеся били собраны как чтения с parnыmy konchamis и класифицы устворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-30 මෙම අවස්ථාවෙහිදී, අතිච්ඡාදනය වන කියවීම් යුගල-අවසාන කියවීම් ලෙස එකතු කර e BLASTN සහ 1e-3 අගයන් සහ සමජාතීය සීමාවක් > 90% භාවිතා කරමින් ස්වකීය (bivalves) හෝ මුල් නොවන ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී.A. atra genome තවමත් අනුක්‍රමණය කර නොමැති බැවින්, අපි MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) එකලස් කිරීමේ de novo එකලස් කිරීමේ උපාය මාර්ගය භාවිතා කළෙමු.සම්භවය ඇති යැපෙන්නන් (bivalves) ලෙස මුළු contigs 147,188 හඳුනාගෙන ඇත.මෙම contigs පසුව BLASTN සහ BLASTX භාවිතා කරමින් 1e-10 ඊ-අගය සහිතව පුපුරවා හරින ලදී.මෙම උපාය මාර්ගයෙන් A. atra ccfDNA හි ඇති ද්විවාල්ව නොවන කොටස් 482 හඳුනා ගැනීමට අපට හැකි විය.මෙම DNA කොටස් වලින් අඩකට වඩා (57%) බැක්ටීරියා වලින් ලබාගෙන ඇත, ප්‍රධාන වශයෙන් සල්ෆොට්‍රොෆික් සහජීවන ඇතුළු ගිල් සහජීවනයන්ගෙන් සහ ගිල් සහජ සොලෙමියා වේලම් (පය. 5).
වර්ග මට්ටමේ සාපේක්ෂ බහුලත්වය.B ප්‍රධාන ෆයිලා දෙකක ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය (Firmicutes සහ Proteobacteria).ddPCR C Vibrio spp හි නියෝජිත විස්තාරණය.A. atra hemolymphs තුනක 16S rRNA ජානයේ (නිල්) කොටස්.
එකතු කරන ලද කොන්ටිග්ස් 482 ක් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.මෙටාජෙනොමික් කොන්ටිග් විවරණවල වර්ගීකරණ ව්‍යාප්තියේ සාමාන්‍ය පැතිකඩ (ප්‍රොකැරියෝට සහ යුකැරියෝට).B BLASTN සහ BLASTX මගින් හඳුනාගත් බැක්ටීරියා DNA කොටස්වල සවිස්තරාත්මක ව්‍යාප්තිය.
ක්‍රැකන්2 විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ mussel ccfDNA හි පුරාවිද්‍යා DNA කොටස්, Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), සහ Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a) ගේ DNA කොටස් ඇතුළුව.මීට පෙර කැලිෆෝනියානු මට්ටියන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රජාව තුළ හමු වූ Euryarchaeota සහ Crenarchaeota වෙතින් ලබාගත් DNA කොටස් තිබීම පුදුමයට කරුණක් නොවිය යුතුය [42].Euryarchaeota බොහෝ විට ආන්තික තත්වයන් සමඟ සම්බන්ධ වුවද, Euryarchaeota සහ Crenarcheota යන දෙකම සමුද්‍ර ක්‍රයෝජනික් පරිසරයේ බහුලව දක්නට ලැබෙන ප්‍රොකැරියෝට අතර වන බව දැන් හඳුනාගෙන ඇත [43, 44].Kerguelen සානුවෙහි [45] පතුල කාන්දුවීම් වලින් විස්තීර්ණ මීතේන් කාන්දුවීම් සහ Kerguelen දූපත් වෙරළට ඔබ්බෙන් නිරීක්ෂණය කළ හැකි ක්ෂුද්‍රජීවී මීතේන් නිෂ්පාදනය පිළිබඳ මෑත කාලීන වාර්තා අනුව, මට්ටි වල මෙතනොජනික් ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් සිටීම පුදුමයක් නොවේ.
අපගේ අවධානය ඩීඑන්ඒ වෛරස් කියවීම් වෙත යොමු විය.අපගේ දැනුමට අනුව, මට්ටි වල වෛරස් අන්තර්ගතය පිළිබඳ පළමු ඉලක්කගත අධ්‍යයනය මෙයයි.අපේක්ෂා කළ පරිදි, අපි බැක්ටීරියාභක්ෂක (Caudovirales) DNA කොටස් සොයාගත්තා (රූපය 6b).කෙසේ වෙතත්, වඩාත් සුලභ වෛරස් DNA පැමිණෙන්නේ ඕනෑම වෛරසයක විශාලතම ජෙනෝමය ඇති න්‍යෂ්ටික සයිටොප්ලාස්මික් විශාල DNA වෛරසය (NCLDV) ලෙසද හැඳින්වෙන nucleocytoviruses කාණ්ඩයෙනි.මෙම කාණ්ඩය තුළ, බොහෝ DNA අනුක්‍රම අයත් වන්නේ Mimimidoviridae (58%) සහ Poxviridae (21%) යන පවුල්වලට වන අතර, එහි ස්වභාවික ධාරක පෘෂ්ඨවංශීන් සහ ආත්‍රපෝඩාවන් ඇතුළත් වන අතර, මෙම DNA අනුක්‍රමවලින් කුඩා ප්‍රතිශතයක් දන්නා වෛරස් ඇල්ගී වලට අයත් වේ.සාගර යුකැරියෝටික් ඇල්ගී ආසාදනය කරයි.මෙම අනුපිළිවෙල පැන්ඩෝරා වෛරසයෙන් ද ලබා ගන්නා ලදී, දන්නා ඕනෑම වෛරස් ගණයේ විශාලතම ජෙනෝම ප්‍රමාණය සහිත යෝධ වෛරසය.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, hemolymph ccfDNA අනුපිළිවෙල අනුව තීරණය කරන ලද වෛරසය ආසාදනය වී ඇති බව දන්නා ධාරක පරාසය සාපේක්ෂව විශාල විය (රූපය S3, අතිරේක තොරතුරු).Baculoviridae සහ Iridoviridae වැනි කෘමීන් ආසාදනය කරන වෛරස් මෙන්ම ඇමීබා, ඇල්ගී සහ පෘෂ්ඨවංශීන් ආසාදනය කරන වෛරස් එයට ඇතුළත් වේ.Pithovirus sibericum ජෙනෝමයට ගැලපෙන අනුපිළිවෙලවල් ද අපට හමු විය.Pitoviruses ("zombie viruses" ලෙසද හැඳින්වේ) ප්‍රථම වරට සයිබීරියාවේ වසර 30,000ක් පැරණි නිත්‍ය තුහින වලින් හුදකලා විය [47].මේ අනුව, අපගේ ප්‍රතිඵල මෙම වෛරස් වල සියලුම නවීන විශේෂ වඳ වී නොමැති බව [48] සහ මෙම වෛරස් දුරස්ථ උපාක්ටික් සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල පවතින බව පෙන්නුම් කරන පෙර වාර්තා වලට අනුකූල වේ.
අවසාන වශයෙන්, අපි වෙනත් බහු සෛලීය සතුන්ගෙන් DNA කොටස් සොයා ගත හැකිදැයි පරීක්ෂා කළා.BLASTN සහ BLASTX විසින් nt, nr සහ RefSeq පුස්තකාල (ප්‍රවේණික සහ ප්‍රෝටීන්) සමඟින් විදේශීය කොන්ටිග්ස් 482 හඳුනා ගන්නා ලදී.අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ බහු සෛලීය සතුන්ගේ ccfDNA හි විදේශීය කොටස් අතර අස්ථි අස්ථි වල DNA ප්‍රමුඛ වන බවයි (රූපය 5).කෘමීන්ගේ සහ අනෙකුත් විශේෂවල DNA කොටස් ද සොයාගෙන ඇත.ඩීඑන්ඒ කොටස් වලින් සාපේක්ෂ වශයෙන් විශාල කොටසක් හඳුනාගෙන නොමැත, සමහර විට ගොඩබිම් විශේෂවලට සාපේක්ෂව සාගර විශේෂ විශාල සංඛ්‍යාවක් ප්‍රවේණික දත්ත සමුදායන්හි අඩුවෙන් නියෝජනය වීම නිසා විය හැකිය [49].
වර්තමාන ලිපියේ, අපි එල්බී සංකල්පය මට්ටි සඳහා යොදන්නෙමු, හීමොලිම්ෆ් සීසීඑෆ්ඩීඑන්ඒ වෙඩි තැබීමේ අනුපිළිවෙලින් සාගර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල සංයුතිය පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා දිය හැකි බව තර්ක කරයි.විශේෂයෙන්ම, අපි 1) mussel hemolymph සාපේක්ෂව විශාල (~ 1-5 kb) සංසරණ DNA කොටස්වල සාපේක්ෂ ඉහළ සාන්ද්රණය (මයික්රෝග්රෑම් මට්ටම්) අඩංගු බව සොයා ගත්තා;2) මෙම DNA කොටස් ස්වාධීන සහ ස්වාධීන නොවන 3) මෙම DNA කොටස්වල විදේශීය මූලාශ්‍ර අතර බැක්ටීරියා, පුරාවිද්‍යා සහ වෛරස් DNA මෙන්ම අනෙකුත් බහු සෛලීය සතුන්ගේ DNA ද අපට හමු විය;4) hemolymph හි මෙම විදේශීය ccfDNA කොටස් සමුච්චය වීම වේගයෙන් සිදුවන අතර මට්ටිවල අභ්‍යන්තර පෙරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වයට දායක වේ.අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ, මෙතෙක් ප්‍රධාන වශයෙන් ජෛව වෛද්‍ය ක්ෂේත්‍රයේ යෙදී ඇති LB සංකල්පය, සෙන්ටිනල් විශේෂ සහ ඔවුන්ගේ පරිසරය අතර අන්තර්ක්‍රියා වඩාත් හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා භාවිතා කළ හැකි පොහොසත් නමුත් ගවේෂණය නොකළ දැනුම් ප්‍රභවයක් කේතනය කරන බවයි.
ප්‍රාථමිකයන්ට අමතරව, මීයන්, බල්ලන්, බළලුන් සහ අශ්වයන් ඇතුළු ක්ෂීරපායින් තුළ ccfDNA හුදකලා වීම වාර්තා වී ඇත [50, 51, 52].කෙසේ වෙතත්, අපගේ දැනුමට අනුව, විවෘත සංසරණ පද්ධතියක් සහිත සාගර විශේෂවල ccfDNA හඳුනා ගැනීම සහ අනුක්‍රමණය කිරීම අපගේ අධ්‍යයනය ප්‍රථම වරට වාර්තා කරයි.මට්ටි වල මෙම ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක ලක්ෂණය සහ පෙරීමේ හැකියාව, අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන්, අනෙකුත් විශේෂවලට සාපේක්ෂව DNA කොටස් සංසරණය වීමේ විවිධ ප්‍රමාණයේ ලක්ෂණ පැහැදිලි කරයි.මිනිසුන් තුළ, රුධිරයේ සංසරණය වන බොහෝ DNA කොටස් 150 සිට 200 bp දක්වා වූ කුඩා කොටස් වේ.167 bp [34, 53] උපරිම උපරිමය සමඟ.DNA කොටස්වල කුඩා නමුත් සැලකිය යුතු කොටසක් 300 සහ 500 bp අතර ප්‍රමාණයෙන් යුක්ත වන අතර 5% ක් පමණ 900 bp ට වඩා දිගු වේ.[54].මෙම ප්‍රමාණය ව්‍යාප්ත වීමට හේතුව ප්ලාස්මා හි ccfDNA හි ප්‍රධාන මූලාශ්‍රය සෛල මිය යාමේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සෛල මිය යාමේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස හෝ නිරෝගී පුද්ගලයන්ගේ රුධිර සංසරණ රක්තපාත සෛල වල නෙරෝසිස් නිසා හෝ පිළිකා රෝගීන්ගේ පිළිකා සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස් නිසා සිදු වේ (සංසරක පිළිකා DNA ලෙස හැඳින්වේ)., ctDNA).මට්ටි තුළ අප සොයා ගත් hemolymph ccfDNA හි ප්‍රමාණයේ ව්‍යාප්තිය 1000 සිට 5000 bp දක්වා වූ අතර, mussel ccfDNA වෙනත් සම්භවයක් ඇති බව යෝජනා කරයි.මෙය තාර්කික උපකල්පනයකි, මන්ද මට්ටියන්ට අර්ධ-විවෘත සනාල පද්ධතියක් ඇති අතර ක්ෂුද්‍රජීවී ප්‍රවේණික DNA ඉහළ සාන්ද්‍රණයක් සහිත සාගර ජලජ පරිසරවල ජීවත් වේ.ඇත්ත වශයෙන්ම, බාහිර DNA භාවිතා කරන අපගේ රසායනාගාර පරීක්ෂණ මගින් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ මස්කූරු මුහුදු ජලයේ DNA කොටස් එකතු කරන බවයි, අවම වශයෙන් පැය කිහිපයකට පසු ඒවා සෛලීය අවශෝෂණයෙන් සහ/හෝ මුදා හැරීමෙන් සහ/හෝ විවිධ සංවිධානවල ගබඩා කිරීමෙන් පසු දිරාපත් වේ.සෛලවල දුර්ලභත්වය (ප්‍රොකැරියෝටික් සහ යුකැරියෝටික් යන දෙකම) සැලකිල්ලට ගෙන, අභ්‍යන්තර කුහරයේ මැදිරි භාවිතය ස්වයං-මූලාශ්‍රවලින් මෙන්ම විදේශීය ප්‍රභවයන්ගෙන් ලැබෙන ccfDNA ප්‍රමාණය අඩු කරයි.Bivalve සහජ ප්‍රතිශක්තියේ වැදගත්කම සහ සංසරණ phagocytes විශාල සංඛ්‍යාවක් සැලකිල්ලට ගනිමින්, ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් සහ/හෝ සෛලීය අපද්‍රව්‍ය ශරීරගත වීම මත විදේශීය DNA සමුච්චය වන සංසරණ phagocytes මගින් විදේශීය ccfDNA පවා පොහොසත් වන බව අපි තවදුරටත් උපකල්පනය කළෙමු.එකට ගත් විට, අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ Bivalve hemolymph ccfDNA යනු අණුක තොරතුරු වල අද්විතීය ගබඩාවක් වන අතර සෙන්ටිනල් විශේෂයක් ලෙස ඔවුන්ගේ තත්ත්වය ශක්තිමත් කරන බවයි.
බැක්ටීරියා මගින් ව්‍යුත්පන්න වූ hemolymph ccfDNA කොටස් අනුක්‍රමණය කිරීම සහ විශ්ලේෂණය කිරීම මගින් ධාරක බැක්ටීරියා වෘක්ෂලතා සහ අවට සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතියේ පවතින බැක්ටීරියා පිළිබඳ ප්‍රධාන තොරතුරු සැපයිය හැකි බව අපගේ දත්ත පෙන්වා දෙයි.සාම්ප්‍රදායික 16S rRNA හඳුනාගැනීමේ ක්‍රම භාවිතා කළේ නම්, අර්ධ වශයෙන් යොමු පුස්තකාල නැඹුරුවක් හේතුවෙන් මඟ හැරිය හැකි ආරම්භක බැක්ටීරියා A. atra gill හි අනුපිළිවෙල වෙඩි තැබීමේ ක්‍රමවේද මගින් අනාවරණය කර ඇත.ඇත්ත වශයෙන්ම, Kerguelen හි එකම mussel ස්ථරයේ M. ප්ලැටෙන්සිස් වෙතින් එකතු කරන ලද LB දත්ත අපගේ භාවිතය මගින් පෙන්නුම් කළේ ගිල් ආශ්‍රිත බැක්ටීරියා සහජීවනවල සංයුතිය මට්ටි විශේෂ දෙකටම සමාන බවයි (රූපය S4, අතිරේක තොරතුරු).ජානමය වශයෙන් වෙනස් මට්ටි දෙකක මෙම සමානතාවය Kerguelen [55, 56, 57, 58] හි සීතල, සල්ෆර් සහ ගිනිකඳු තැන්පතු වල බැක්ටීරියා ප්රජාවන්ගේ සංයුතිය පිළිබිඹු විය හැක.Port-au-France වෙරළ තීරය වැනි ජෛව ටර්බේටඩ් වෙරළබඩ ප්‍රදේශවලින් [59] මට්ටි අස්වැන්න නෙළන විට සල්ෆර් අඩු කරන ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගේ ඉහළ මට්ටම් හොඳින් විස්තර කර ඇත.තවත් සම්භාවිතාවක් වන්නේ තිරස් සම්ප්‍රේෂණය [60, 61] මගින් ආරම්භක මට්ටි වෘක්ෂලතාදිය බලපෑමට ලක් විය හැකි බවයි.සමුද්‍ර පරිසරය, මුහුදු පතුලේ මතුපිට සහ මට්ටි වල සහජීවන බැක්ටීරියා සංයුතිය අතර සහසම්බන්ධතාවය තීරණය කිරීම සඳහා තවත් පර්යේෂණ අවශ්‍ය වේ.මෙම අධ්‍යයනයන් දැනට සිදුවෙමින් පවතී.
හීමොලිම්ෆ් ccfDNA හි දිග සහ සාන්ද්‍රණය, එහි පිරිසිදු කිරීමේ පහසුව සහ වේගවත් වෙඩි බෙහෙත් අනුක්‍රමණයට ඉඩ සලසන උසස් තත්ත්වය සමුද්‍ර වෙරළබඩ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා mussel ccfDNA භාවිතා කිරීමේ බොහෝ වාසි වලින් කිහිපයකි.මෙම ප්‍රවේශය ලබා දී ඇති පරිසර පද්ධතියක වෛරස් ප්‍රජාවන් (වයිරෝම්) සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා විශේෂයෙන් ඵලදායී වේ [62, 63].බැක්ටීරියා, පුරාවිද්‍යා සහ යුකැරියෝට් මෙන් නොව, වෛරස් ජෙනෝමවල 16S අනුපිළිවෙල වැනි ෆයිලොජෙනටික් ලෙස සංරක්ෂණය කරන ලද ජාන අඩංගු නොවේ.සාමාන්‍යයෙන් වෙරළබඩ සමුද්‍ර පරිසර පද්ධතිවල වාසය කරන ධාරකයන්ට ආසාදනය කරන ccfDNA වෛරස් කොටස් සාපේක්ෂ වශයෙන් විශාල සංඛ්‍යාවක් හඳුනා ගැනීමට මට්ටි වැනි දර්ශක විශේෂවල ද්‍රව බයොප්සි භාවිතා කළ හැකි බව අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්වා දෙයි.ප්‍රොටෝසෝවා, ආත්‍රපෝඩාවන්, කෘමීන්, ශාක සහ බැක්ටීරියා වෛරස් (උදා: බැක්ටීරියාභක්ෂක) ආසාදනය කරන වෛරස් මෙයට ඇතුළත් වේ.Kerguelen (වගුව S2, පරිපූරක තොරතුරු) හි එකම මස්කූරු ස්ථරයේ එකතු කරන ලද නිල් මට්ටි (M. ප්ලැටෙන්සිස්) හි hemolymph ccfDNA virome පරීක්ෂා කිරීමේදී සමාන බෙදාහැරීමක් සොයා ගන්නා ලදී.ccfDNA හි ෂොට්ගන් අනුක්‍රමණය ඇත්ත වශයෙන්ම මිනිසුන්ගේ හෝ වෙනත් විශේෂවල වයිරෝම් අධ්‍යයනයේ වේගවත් වන නව ප්‍රවේශයකි [21, 37, 64].මෙම ප්‍රවේශය ද්විත්ව නූල් සහිත DNA වෛරස් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා විශේෂයෙන් ප්‍රයෝජනවත් වේ, මන්ද යත්, බැල්ටිමෝර්හි වඩාත් විවිධාකාර සහ පුළුල් කාණ්ඩයේ වෛරස් නියෝජනය කරන සියලුම ද්විත්ව නූල් DNA වෛරස් අතර තනි ජානයක් සංරක්ෂණය කර නොමැති බැවිනි.මෙම වෛරස් බොහොමයක් වර්ගීකරණය නොකළ නමුත් වෛරස් ලෝකයේ සම්පූර්ණයෙන්ම නොදන්නා කොටසකින් වෛරස් ඇතුළත් විය හැකි නමුත් [66], අපි සොයාගත්තා A. atra සහ M. platensis යන මට්ටි වල වෛරස් සහ ධාරක පරාසයන් විශේෂ දෙක අතරට වැටෙන බව.ඒ හා සමානව (රූපය S3 බලන්න, අමතර තොරතුරු).මෙම සමානතාවය පුදුමයට කරුණක් නොවේ, මන්ද එය පරිසරයේ පවතින DNA අවශෝෂණය කිරීමේදී තෝරා ගැනීමේ අඩුවක් පිළිබිඹු විය හැක.RNA වයිරෝමය සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා පිරිසිදු RNA භාවිතා කරමින් අනාගත අධ්‍යයනයන් දැනට අවශ්‍ය වේ.
අපගේ අධ්‍යයනයේ දී, අපි දේශීය ccfDNA එකලස් කිරීමට පෙර සහ පසු එකතු කරන ලද කියවීම් සහ කොන්ටිග්ස් දෙපියවර මකාදැමීම භාවිතා කළ Kowarski සහ සගයන්ගේ [37] ක්‍රියාවලින් අනුවර්තනය කරන ලද ඉතා දැඩි නල මාර්ගයක් භාවිතා කළ අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සිතියම්ගත නොකළ කියවීම් ඉහළ ප්‍රතිශතයක් ලැබුණි.එමනිසා, මෙම සිතියම්ගත නොකළ සමහර කියවීම්වලට තවමත් ඔවුන්ගේම සම්භවයක් තිබිය හැකි බව අපට බැහැර කළ නොහැක, මූලික වශයෙන් මෙම මට්ටි විශේෂය සඳහා යොමු ජෙනෝමයක් අප සතුව නොමැති බැවිනි.අපි ස්වයං සහ ස්වයං නොවන කියවීම් අතර ඇති චයිමරා සහ Illumina MiSeq PE75 මගින් ජනනය කරන ලද කියවීමේ දිග ගැන සැලකිලිමත් වූ නිසා අපි මෙම නල මාර්ගය භාවිතා කළෙමු.බොහෝ හඳුනා නොගත් කියවීම් සඳහා තවත් හේතුවක් නම්, සාගර ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්ගෙන් වැඩි ප්‍රමාණයක්, විශේෂයෙන් Kerguelen වැනි දුරස්ථ ප්‍රදේශවල, සටහන් කර නොතිබීමයි.අපි Illumina MiSeq PE75 භාවිතා කළෙමු, මිනිස් ccfDNA ට සමාන ccfDNA ඛණ්ඩක දිග උපකල්පනය කරයි.අනාගත අධ්‍යයනයන් සඳහා, hemolymph ccfDNA මිනිසුන්ට සහ/හෝ ක්ෂීරපායින්ට වඩා දිගු කියවීම් ඇති බව පෙන්වන අපගේ ප්‍රතිඵල අනුව, දිගු ccfDNA කොටස් සඳහා වඩාත් සුදුසු අනුක්‍රමික වේදිකාවක් භාවිතා කිරීම අපි නිර්දේශ කරමු.මෙම පරිචය ගැඹුරු විශ්ලේෂණය සඳහා තවත් ඇඟවීම් හඳුනා ගැනීම වඩාත් පහසු කරනු ඇත.දැනට ලබා ගත නොහැකි සම්පූර්ණ A. atra න්‍යෂ්ටික ජෙනෝම අනුපිළිවෙල ලබා ගැනීම ස්වයං සහ ස්වයං නොවන ප්‍රභවයන්ගෙන් ccfDNA වෙනස් කොට සැලකීමට ද බෙහෙවින් පහසුකම් සපයයි.අපගේ පර්යේෂණ මගින් මට්ටි සඳහා ද්‍රව බයොප්සි සංකල්පය යෙදීමේ හැකියාව පිළිබඳව අවධානය යොමු කර ඇති හෙයින්, මෙම සංකල්පය අනාගත පර්යේෂණ වලදී භාවිතා කරන බැවින්, මට්ටියන්ගේ ක්ෂුද්‍රජීවී විවිධත්වය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා මෙම ක්‍රමයේ විභවය වැඩි කිරීමට නව මෙවලම් සහ නල මාර්ග සංවර්ධනය කරනු ඇතැයි අපි බලාපොරොත්තු වෙමු.සාගර පරිසර පද්ධතිය.
ආක්‍රමණශීලී නොවන සායනික ජෛව සලකුණු කාරකයක් ලෙස, ccfDNA හි ඉහළ මානව ප්ලාස්මා මට්ටම් විවිධ රෝග, පටක හානි සහ ආතති තත්වයන් සමඟ සම්බන්ධ වේ [67,68,69].මෙම වැඩිවීම පටක හානියෙන් පසු එහිම සම්භවයක් ඇති DNA කොටස් මුදා හැරීම සමඟ සම්බන්ධ වේ.මට්ටි 30 ° C උෂ්ණත්වයකට කෙටියෙන් නිරාවරණය වූ උග්‍ර තාප ආතතිය භාවිතා කරමින් අපි මෙම ගැටළුව ආමන්ත්‍රණය කළෙමු.අපි ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකින් විවිධ වර්ගයේ මට්ටි තුනක් මත මෙම විශ්ලේෂණය සිදු කළෙමු.කෙසේ වෙතත්, උග්‍ර තාප ආතතියෙන් පසු ccfDNA මට්ටම්වල කිසිදු වෙනසක් අපට හමු නොවීය (රූපය S5, අමතර තොරතුරු බලන්න).මෙම සොයාගැනීම මගින් අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන් හෝ අර්ධ-විවෘත සංසරණ පද්ධතියක් ඇති බව සහ ඒවායේ ඉහළ පෙරීමේ ක්‍රියාකාරකම් හේතුවෙන් විදේශීය DNA විශාල ප්‍රමාණයක් රැස් කරන බව පැහැදිලි කළ හැක.අනෙක් අතට, බොහෝ අපෘෂ්ඨවංශීන් මෙන් මට්ටි, ආතති-ප්‍රේරිත පටක හානිවලට වඩා ප්‍රතිරෝධී විය හැකි අතර, එමඟින් ඔවුන්ගේ hemolymph [70, 71] තුළ ccfDNA මුදා හැරීම සීමා කරයි.
අද වන විට, ජලජ පරිසර පද්ධතිවල ජෛව විවිධත්වය පිළිබඳ DNA විශ්ලේෂණය ප්‍රධාන වශයෙන් අවධානය යොමු කර ඇත්තේ පාරිසරික DNA (eDNA) metabarcoding වෙතය.කෙසේ වෙතත්, මෙම ක්‍රමය සාමාන්‍යයෙන් ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන විට ජෛව විවිධත්ව විශ්ලේෂණයේදී සීමා වේ.වෙඩි බෙහෙත් අනුක්‍රමණය භාවිතා කිරීම PCR හි සීමාවන් සහ ප්‍රාථමික කට්ටලවල පක්ෂග්‍රාහී තේරීම මග හරියි.මේ අනුව, එක් අර්ථයකින් ගත් කල, අපගේ ක්‍රමය මෑතකදී භාවිතා කරන ලද අධි-ත්‍රෝගී eDNA ෂොට්ගන් අනුක්‍රමික ක්‍රමයට සමීප වන අතර එමඟින් ඛණ්ඩනය වූ DNA සෘජුවම අනුක්‍රමණය කිරීමට සහ සියලුම ජීවීන් පාහේ විශ්ලේෂණය කිරීමට හැකියාව ඇත [72, 73].කෙසේ වෙතත්, සම්මත eDNA ක්‍රමවලින් LB වෙන්කර හඳුනා ගන්නා මූලික ගැටළු ගණනාවක් තිබේ.ඇත්ත වශයෙන්ම, eDNA සහ LB අතර ප්රධාන වෙනස වන්නේ ස්වභාවික පෙරහන් ධාරක භාවිතා කිරීමයි.eDNA අධ්‍යයනය සඳහා ස්වභාවික පෙරහනක් ලෙස ස්පොන්ජ් සහ බිවල්ව් (Dresseina spp.) වැනි සාගර විශේෂ භාවිතා කිරීම වාර්තා වී ඇත [74, 75].කෙසේ වෙතත්, Dreissena ගේ අධ්යයනය DNA නිස්සාරණය කරන ලද පටක බයොප්සි භාවිතා කළේය.LB වෙතින් ccfDNA විශ්ලේෂණය සඳහා පටක බයොප්සි, විශේෂිත සහ සමහර විට මිල අධික උපකරණ සහ eDNA හෝ පටක බයොප්සි ආශ්‍රිත සැපයුම් අවශ්‍ය නොවේ.ඇත්ත වශයෙන්ම, අපි මෑතකදී වාර්තා කළේ LB වෙතින් ccfDNA සීතල දාමයක් පවත්වා නොගෙන FTA සහාය ඇතිව ගබඩා කර විශ්ලේෂණය කළ හැකි බවයි, එය දුරස්ථ ප්‍රදේශවල පර්යේෂණ සඳහා ප්‍රධාන අභියෝගයකි [76].දියර බයොප්සි වලින් ccfDNA නිස්සාරණය කිරීම ද සරල වන අතර වෙඩි බෙහෙත් අනුක්‍රමණය සහ PCR විශ්ලේෂණය සඳහා උසස් තත්ත්වයේ DNA සපයයි.eDNA විශ්ලේෂණය [77] හා සම්බන්ධ සමහර තාක්ෂණික සීමාවන් ලබා දීමෙන් මෙය විශාල වාසියකි.නියැදීමේ ක්‍රමයේ සරල බව සහ අඩු පිරිවැය දිගු කාලීන අධීක්ෂණ වැඩසටහන් සඳහා ද විශේෂයෙන් සුදුසු වේ.ඔවුන්ගේ ඉහළ පෙරීමේ හැකියාවට අමතරව, Bivalves හි තවත් ප්‍රසිද්ධ ලක්ෂණයක් වන්නේ ඔවුන්ගේ ශ්ලේෂ්මලයේ රසායනික මුකොපොලිසැකරයිඩ සංයුතියයි, එය වෛරස් අවශෝෂණය ප්‍රවර්ධනය කරයි [78, 79].මෙමගින් Bivalves ජෛව විවිධත්වය සහ දී ඇති ජලජ පරිසර පද්ධතියක දේශගුණික විපර්යාසවල බලපෑම සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා කදිම ස්වභාවික පෙරහනක් බවට පත් කරයි.eDNA හා සසඳන විට ධාරක-ව්‍යුත්පන්න DNA කොටස් පැවතීම ක්‍රමයේ සීමාවක් ලෙස දැකිය හැකි වුවද, eDNA හා සසඳන විට එවැනි දේශීය ccfDNA තිබීම හා සම්බන්ධ පිරිවැය සෞඛ්‍ය අධ්‍යයන සඳහා ලබා ගත හැකි විශාල තොරතුරු ප්‍රමාණයක් සඳහා එකවරම තේරුම් ගත හැකිය.ඕෆ්සෙට් සත්කාරක.ධාරක ධාරකයේ ප්‍රවේණියට අනුකලනය වී ඇති වෛරස් අනුක්‍රමික පැවැත්ම මෙයට ඇතුලත් වේ.Bivalves [80, 81] හි තිරස් අතට සම්ප්‍රේෂණය වන ලියුකේමික් රෙට්‍රො වයිරස් පැවතීම සැලකිල්ලට ගනිමින්, මට්ටි සඳහා මෙය විශේෂයෙන් වැදගත් වේ.eDNA ට වඩා LB හි තවත් වාසියක් නම්, එය ක්ෂුද්‍ර ජීවීන් (සහ ඒවායේ ප්‍රවේණි) ගිල ගන්නා hemolymph හි රුධිර සෛල සංසරණය කිරීමේ phagocytic ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රයෝජනයට ගැනීමයි.ෆාගෝසයිටෝසිස් යනු බයිවල්වල රුධිර සෛලවල ප්‍රධාන කාර්යයයි [82].අවසාන වශයෙන්, මෙම ක්‍රමය මගින් මට්ටි වල ඉහළ පෙරීමේ ධාරිතාව (මුහුදු ජලයේ සාමාන්‍ය 1.5 l/h) සහ දින දෙකක සංසරණයෙන් ප්‍රයෝජන ගන්නා අතර එමඟින් මුහුදු ජලයේ විවිධ ස්ථර මිශ්‍ර වීම වැඩි කරයි, විෂමජාතීය eDNA අල්ලා ගැනීමට ඉඩ සලසයි.[83, 84].මේ අනුව, mussel ccfDNA විශ්ලේෂණය යනු මට්ටි වල පෝෂණ, ආර්ථික සහ පාරිසරික බලපෑම් සැලකිල්ලට ගෙන සිත්ගන්නා මාර්ගයකි.මිනිසුන්ගෙන් එකතු කරන ලද එල්බී විශ්ලේෂණයට සමානව, මෙම ක්‍රමය බාහිර ද්‍රව්‍යවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ධාරක DNA වල ජානමය සහ එපිජෙනටික් වෙනස්කම් මැනීමේ හැකියාව ද විවෘත කරයි.නිදසුනක් ලෙස, නැනෝපෝර් අනුක්‍රමණය භාවිතයෙන් ස්වදේශීය ccfDNA හි ප්‍රවේණි-පුළුල් මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණය සිදු කිරීමට තුන්වන පරම්පරාවේ අනුක්‍රමික තාක්ෂණයන් අපේක්ෂා කළ හැක.මෙම ක්‍රියාවලිය පහසු කරවිය යුත්තේ මස්සල් ccfDNA කොටස්වල දිග, රසායනික පරිවර්තන අවශ්‍යතාවයකින් තොරව තනි අනුක්‍රමයකින් DNA මෙතිලේෂන් විශ්ලේෂණයට ඉඩ සලසන දිගු-කියවන අනුක්‍රමික වේදිකා සමඟ ඉතා මැනවින් අනුකූල වන බැවිනි.එබැවින්, දේශගුණික විපර්යාස හෝ දූෂකවලට නිරාවරණය වීමෙන් පසු ප්‍රතිචාරය පාලනය කරන යටින් පවතින යාන්ත්‍රණයන් පිළිබඳ වටිනා අවබෝධයක් ලබා දිය හැකිය [87].කෙසේ වෙතත්, LB භාවිතය සීමාවන් නොමැතිව නොවේ.මේ සඳහා පරිසර පද්ධතිය තුළ දර්ශක විශේෂ තිබීම අවශ්‍ය බව අමුතුවෙන් කිව යුතු නැත.ඉහත සඳහන් කළ පරිදි, දී ඇති පරිසර පද්ධතියක ජෛව විවිධත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා LB භාවිතා කිරීම සඳහා ප්‍රභවයෙන් DNA කොටස් තිබීම සැලකිල්ලට ගන්නා දැඩි ජෛව තොරතුරු නල මාර්ගයක් ද අවශ්‍ය වේ.තවත් ප්‍රධාන ගැටලුවක් වන්නේ සමුද්‍ර විශේෂ සඳහා යොමු ජෙනෝම තිබීමයි.සාගර ක්ෂීරපායී ජෙනෝම් ව්‍යාපෘතිය සහ මෑතකදී ස්ථාපිත කරන ලද Fish10k ව්‍යාපෘතිය [88] වැනි මුලපිරීම් අනාගතයේදී එවැනි විශ්ලේෂණ සඳහා පහසුකම් සපයනු ඇතැයි අපේක්ෂා කෙරේ.සමුද්‍ර පෙරහන-පෝෂණය කරන ජීවීන් සඳහා LB සංකල්පය යෙදීම අනුක්‍රමික තාක්‍ෂණයේ නවතම දියුණුවත් සමඟ අනුකූල වේ, පාරිසරික ආතතියට ප්‍රතිචාර වශයෙන් සමුද්‍ර වාසස්ථානවල සෞඛ්‍යය පිළිබඳ වැදගත් තොරතුරු සැපයීම සඳහා බහු-ඕම් ජෛව සලකුණු සංවර්ධනය සඳහා එය හොඳින් ගැලපේ.
ජෛව ව්‍යාපෘති SRR8924808 යටතේ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 NCBI අනුක්‍රමය කියවීමේ ලේඛනාගාරයේ ජාන අනුක්‍රමික දත්ත තැන්පත් කර ඇත.
Brierley AS, Kingsford MJ සාගර ජීවීන් සහ පරිසර පද්ධති මත දේශගුණික විපර්යාසවල බලපෑම.කෝල් ජීව විද්යාව.2009;19: P602-P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.සමුද්‍ර පරිසරයට දේශගුණික විපර්යාස සහ අනෙකුත් දේශීය ආතතීන්ගේ ඒකාබද්ධ බලපෑම් සලකා බලන්න.සාමාන්ය විද්යාත්මක පරිසරය.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.)මාර්තු පළමුවැනිදා විද්‍යාව.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. පුනරාවර්තන තාප ආතති තත්වයන් යටතේ තාපයට ඔරොත්තු දීමේ හැකියාව අඩු කිරීම නිල් මට්ටියන්ගේ ඉහළ ගිම්හාන මරණ පැහැදිලි කරයි.විද්‍යාත්මක වාර්තාව 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.සත්ව මරණ සංඛ්‍යාතය, හේතු සහ ප්‍රමාණයෙහි මෑත වෙනස්කම්.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.බහුවිධ විශේෂ නොවන විශේෂිත රෝග කාරක පින්න නොබිලිස්ගේ සමූහ මරණයට හේතු වන්නට ඇත.ජීවිතය.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.ආක්ටික් zoonotic රෝග මත දේශගුණික විපර්යාසවල විභව බලපෑම.Int J Circumpolar සෞඛ්‍යය.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.නිල් මට්ටි (Mytilus edulis spp.) වෙරළබඩ පරිසර දූෂණය නිරීක්ෂණයේ දී සංඥා ජීවීන් ලෙස: සමාලෝචනයක්.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. පිළිකා ප්‍රතිකාරයේදී දියර බයොප්සි ඒකාබද්ධ කිරීම.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.දියර බයොප්සි පරිණත වීම: පිළිකා DNA සංසරණය වීමට ඉඩ සලසයි.Nat Rev පිළිකා.2017;17:223-38.
මැන්ඩෙල් පී., මෙටයිස් පී. මානව ප්ලාස්මා හි න්යෂ්ටික අම්ල.Soc Biol අනුබද්ධ ආයතනවල රැස්වීම් මිනිත්තු.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. පිළිකා ප්‍රතිකාර සඳහා අණුක සලකුණක් ලෙස සෛල රහිත DNA සඳහා නව භූමිකාවක්.ජෛවමෝලර් විශ්ලේෂණය ප්‍රමාණ කිරීම.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy සායනයට ඇතුල් වේ - ක්රියාත්මක කිරීමේ ගැටළු සහ අනාගත අභියෝග.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
ලෝ YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW සහ වෙනත් අය.භ්රෑණ DNA මාතෘ ප්ලාස්මා සහ සෙරුමය තුළ පවතී.ලැන්සෙට්.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ගර්භණී සමයේදී කාන්තාවන්ගේ රුධිරයේ පරිභ්‍රමණය වන බාහිර සෛල ආර්එන්ඒ භාවිතයෙන් ගැබ්ගැනීම් සහ එහි සංකූලතා පිළිබඳ අධ්‍යයනය.මාත්‍රාව වෛද්‍ය විද්‍යාව.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.දියර බයොප්සි: වකුගඩු බද්ධ කිරීමකදී ඇලෝජෙනික් තුවාල හඳුනා ගැනීමට පරිත්‍යාගශීලී සෛල රහිත DNA භාවිතා කරයි.Nat Rev Nephrol.2021;17:591-603.
Juan FC, Lo YM පූර්ව ප්‍රසව රෝග විනිශ්චය පිළිබඳ නවෝත්පාදන: මාතෘ ප්ලාස්මා ජාන අනුක්‍රමණය.ඇනා MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.ආසාදිත ශරීර තරලවල මීළඟ පරම්පරාවේ මෙටජෙනොමික් අනුපිළිවෙල සමඟ වේගවත් රෝග කාරක හඳුනා ගැනීම.Nat Medicine.2021;27:115-24.