Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ලබා දෙන්නෙමු.
ඖෂධ පරීක්ෂාව සඳහා හෘදයේ කායික පරිසරය නිවැරදිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි විශ්වාසනීය in vitro පද්ධතියක අවශ්‍යතාවය පවතී.මිනිස් හෘද පටක රෝපණ පද්ධතිවල සීමිත ප්‍රමාණය හෘද ඖෂධ බලපෑම් පිළිබඳ වැරදි අර්ථකථනවලට හේතු වී ඇත.මෙහිදී, අපි හෘද චක්‍රයේ සිස්ටලික් සහ ඩයස්ටොලික් අවධීන්හිදී හෘද පෙති විද්‍යුත් යාන්ත්‍රිකව උත්තේජනය කරන සහ භෞතික විද්‍යාත්මක දිගුවකට භාජනය වන හෘද පටක රෝපණ ආකෘතියක් (CTCM) සකස් කර ඇත.දින 12 ක සංස්කෘතියෙන් පසුව, මෙම ප්රවේශය හෘද කොටස්වල ශක්යතාව අර්ධ වශයෙන් වැඩිදියුණු කළ නමුත් ඒවායේ ව්යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සම්පූර්ණයෙන්ම ආරක්ෂා කර නැත.එමනිසා, කුඩා අණු පිරික්සීමෙන් පසුව, අපගේ මාධ්‍යයට 100 nM ට්‍රයිඅයෝඩොතයිරොනීන් (T3) සහ 1 μM ඩෙක්සමෙතසෝන් (ඩෙක්ස්) එකතු කිරීමෙන් දින 12 ක් සඳහා කොටස්වල ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහය පවත්වා ගෙන යන බව අපට පෙනී ගියේය.T3/Dex ප්‍රතිකාරය සමඟ ඒකාබද්ධව, CTCM පද්ධතිය පිටපත් කිරීමේ පැතිකඩ, ශක්‍යතා, පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරකම් සහ ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව නැවුම් හෘද පටක මෙන් එකම මට්ටමේ දින 12ක් පවත්වා ගෙන ගියේය.මීට අමතරව, සංස්කෘතිය තුළ හෘද පටක අධික ලෙස දිගු කිරීම අධි රුධිර සංඥාවක් ඇති කරයි, CTCM හට හෘද ස්ට්‍රෙච් මගින් ප්‍රේරණය වන අධි මානසික තත්වයන් අනුකරණය කිරීමට ඇති හැකියාව සඳහා සාක්ෂි සපයයි.අවසාන වශයෙන්, CTCM හට දිගු කාලීනව සංස්කෘතිය තුළ හදවතේ කායික විද්‍යාව සහ ව්‍යාධි භෞතවේදය ආදර්ශනය කළ හැකි අතර, විශ්වාසදායක ඖෂධ පරීක්‍ෂණයක් සක්‍රීය කරයි.
සායනික පර්යේෂණ වලට පෙර, මිනිස් හදවතේ භෞතික විද්‍යාත්මක පරිසරය නිවැරදිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි විශ්වාසනීය in vitro පද්ධති අවශ්‍ය වේ.එවැනි පද්ධති වෙනස් වූ යාන්ත්‍රික දිගු, හෘද ස්පන්දන වේගය සහ විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක ගුණාංග අනුකරණය කළ යුතුය.මිනිස් හදවතේ ඖෂධවල බලපෑම පිළිබිඹු කිරීමේදී සීමිත විශ්වසනීයත්වයක් සහිත හෘද කායික විද්‍යාව සඳහා තිරගත කිරීමේ වේදිකාවක් ලෙස සත්ව ආකෘති බහුලව භාවිතා වේ1,2.අවසාන වශයෙන්, Ideal Cardiac Tsue Culture Experimental Model (CTCM) යනු මිනිස් හදවතේ කායික විද්‍යාව සහ ව්‍යාධි කායික විද්‍යාව නිවැරදිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කරන විවිධ චිකිත්සක සහ ඖෂධීය මැදිහත්වීම් සඳහා ඉතා සංවේදී සහ විශේෂිත වූ ආකෘතියකි.එවැනි පද්ධතියක් නොමැතිකම හෘදයාබාධ සඳහා නව ප්‍රතිකාර සොයා ගැනීම සීමා කරයි4,5 සහ වෙළඳපොළෙන් පිටවීමට ප්‍රධාන හේතුවක් ලෙස මත්ද්‍රව්‍ය හෘද විෂ වීමට හේතු වී තිබේ.
පසුගිය දශකය තුළ, හෘද වාහිනී නොවන ඖෂධ අටක් සායනික භාවිතයෙන් ඉවත් කර ඇත, මන්ද ඒවා QT පරතරය දිගු කිරීම නිසා කශේරුකා ආතරයිටිස් සහ හදිසි මරණයට හේතු වේ.මේ අනුව, හෘද වාහිනී කාර්යක්ෂමතාව සහ විෂ සහිත බව තක්සේරු කිරීම සඳහා විශ්වාසදායක පූර්ව සායනික පරීක්ෂණ උපාය මාර්ග සඳහා වැඩි අවශ්‍යතාවයක් පවතී.මිනිසා විසින් ප්‍රේරණය කරන ලද ප්ලූරිපොටෙන්ට් ප්‍රාථමික සෛල ව්‍යුත්පන්න හෘද සෛල (hiPS-CM) ඖෂධ පරීක්‍ෂාවේදී සහ විෂ සහිත පරීක්‍ෂණයේදී මෑතකාලීනව භාවිතා කිරීම මෙම ගැටලුවට අර්ධ විසඳුමක් සපයයි.කෙසේ වෙතත්, hiPS-CM වල නොමේරූ ස්වභාවය සහ හෘද පටකවල බහු සෛලීය සංකීර්ණත්වය නොමැතිකම මෙම ක්රමයේ ප්රධාන සීමාවන් වේ.ස්වයංසිද්ධ හැකිලීම් ආරම්භ වී ටික වේලාවකට පසු හෘද පටක හයිඩ්‍රොජෙල් සෑදීමට මුල් hiPS-CM භාවිතා කිරීමෙන් සහ කාලයත් සමඟ විද්‍යුත් උත්තේජනය ක්‍රමයෙන් වැඩි කිරීමෙන් මෙම සීමාව අර්ධ වශයෙන් ජය ගත හැකි බව මෑත අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත.කෙසේ වෙතත්, මෙම hiPS-CM ක්ෂුද්‍ර පටක වල වැඩිහිටි මයෝකාඩියම් වල පරිණත විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක සහ සංකෝචන ගුණ නොමැත.මීට අමතරව, මානව හෘද පටකයට වඩාත් සංකීර්ණ ව්‍යුහයක් ඇත, එන්ඩොතලියල් සෛල, නියුරෝන සහ ස්ට්‍රෝමල් ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් ඇතුළු විවිධ සෛල වර්ගවල විෂමජාතීය මිශ්‍රණයකින් සමන්විත වන අතර එය විශේෂිත බාහිර සෛල අනුකෘති ප්‍රෝටීන කට්ටල මගින් අන්තර් සම්බන්ධිත වේ.වැඩිහිටි ක්ෂීරපායී හදවතේ 11,12,13 නොවන හෘද සෛල නොවන ජනගහනයේ මෙම විෂමතාවය තනි සෛල වර්ග භාවිතා කරමින් හෘද පටක ආකෘති නිර්මාණය කිරීමට ප්‍රධාන බාධකයකි.මෙම ප්රධාන සීමාවන් කායික හා ව්යාධි තත්වයන් යටතේ නොවෙනස්ව හෘදයාබාධ පටක වගා කිරීම සඳහා ක්රම සංවර්ධනය කිරීමේ වැදගත්කම අවධාරණය කරයි.
මිනිස් හදවතේ සංස්කෘතික තුනී (300 µm) කොටස් නොවෙනස්ව පවතින මානව හෘදයාබාධයේ හොඳ ආකෘතියක් බව ඔප්පු වී ඇත.මෙම ක්‍රමය මිනිස් හෘද පටක වලට සමාන සම්පූර්ණ ත්‍රිමාණ බහු සෛලීය පද්ධතියකට ප්‍රවේශය සපයයි.කෙසේ වෙතත්, 2019 වන තෙක්, කෙටි (පැය 24) සංස්කෘතික පැවැත්මෙන් සංස්කෘතික හෘද කොටස් භාවිතය සීමා විය.මෙයට හේතුව භෞතික-යාන්ත්‍රික දිගුවක් නොමැතිකම, වායු-ද්‍රව අතුරුමුහුණත සහ හෘද පටක අවශ්‍යතා සඳහා සහාය නොදක්වන සරල මාධ්‍ය භාවිතය ඇතුළු සාධක ගණනාවක් නිසාය.2019 දී පර්යේෂණ කණ්ඩායම් කිහිපයක් පෙන්නුම් කළේ හෘද පටක රෝපණ පද්ධතිවලට යාන්ත්‍රික සාධක ඇතුළත් කිරීමෙන් සංස්කෘතික ආයු කාලය දීර්ඝ කිරීමට, හෘද ප්‍රකාශනය වැඩි දියුණු කිරීමට සහ හෘද ව්‍යාධි විද්‍යාව අනුකරණය කළ හැකි බවයි.17 සහ 18 අලංකාර අධ්‍යයනයන් දෙකකින් පෙන්නුම් කරන්නේ සංස්කෘතිය තුළ ඒකීය යාන්ත්‍රික පැටවීම හෘද ෆීනෝටයිප් කෙරෙහි ධනාත්මක බලපෑමක් ඇති කරන බවයි.කෙසේ වෙතත්, මෙම අධ්‍යයනයන් හෘද චක්‍රයේ ගතික ත්‍රිමාන භෞතික-යාන්ත්‍රික පැටවීම භාවිතා නොකළ අතර, හෘද කොටස් සමමිතික ආතන්ය බල 17 හෝ රේඛීය auxotonic loading 18 සමඟ පටවා ඇත.මෙම පටක දිගු කිරීමේ ක්‍රම බොහෝ හෘද ජාන යටපත් කිරීම හෝ අසාමාන්‍ය දිගු ප්‍රතිචාර හා සම්බන්ධ ජාන අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම හේතු විය.සැලකිය යුතු ලෙස, Pitoulis et al.19 බල පරිවර්තක ප්‍රතිපෝෂණ සහ ආතති ධාවකයන් භාවිතා කරමින් හෘද චක්‍රය ප්‍රතිසංස්කරණය කිරීම සඳහා ගතික හෘද පෙති සංස්කෘතිය ස්නානය සංවර්ධනය කරන ලදී.මෙම පද්ධතිය වඩාත් නිවැරදිව vitro හෘද චක්‍ර ආකෘති නිර්මාණය කිරීමට ඉඩ ලබා දුන්නද, ක්‍රමයේ සංකීර්ණත්වය සහ අඩු ප්‍රතිදානය මෙම පද්ධතියේ යෙදීම සීමා කරයි.අපගේ රසායනාගාරය මෑතකදී විද්‍යුත් උත්තේජනය භාවිතා කරමින් සරල කරන ලද සංස්කෘතික පද්ධතියක් සහ ඌරු මස් සහ මිනිස් හෘද පටක කොටස්වල ශක්‍යතාව දින 6ක් දක්වා පවත්වා ගැනීමට ප්‍රශස්ත මාධ්‍යයක් නිර්මාණය කර ඇත20,21.
වත්මන් අත්පිටපතෙහි, හෘද චක්‍රය තුළ ත්‍රිමාණ හෘද කායික විද්‍යාව සහ ව්‍යාධි භෞතික විද්‍යාත්මක ව්‍යාප්තිය ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම සඳහා හාස්‍යජනක ඉඟි ඇතුළත් කරන පෝර්සීන් හදවතේ කොටස් භාවිතා කරමින් හෘද පටක රෝපණ ආකෘතියක් (CTCM) අපි විස්තර කරමු.මෙම CTCM මගින් පූර්ව සායනික ඖෂධ පරීක්ෂාව සඳහා ක්ෂීරපායී හදවතේ කායික විද්‍යාව/ව්‍යාධි භෞතවේදය අනුකරණය කරන පිරිවැය-ඵලදායී, මධ්‍ය-නිපදවන හෘද පද්ධතියක් සැපයීම මගින් පූර්ව සායනික ඖෂධ පුරෝකථනයේ නිරවද්‍යතාවය මින් පෙර කිසිදා අත්කර නොගත් මට්ටමට වැඩි කළ හැක.
Hemodynamic යාන්ත්‍රික සංඥා vitro 22,23,24 හි cardiomyocyte ක්‍රියාකාරිත්වය පවත්වා ගැනීම සඳහා තීරණාත්මක කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.වත්මන් අත්පිටපතෙහි, අපි කායික සංඛ්‍යාතවල (1.2 Hz, විනාඩියකට බීට් 72) විද්‍යුත් හා යාන්ත්‍රික උත්තේජනයක් ඇති කිරීමෙන් වැඩිහිටි හෘද පරිසරය අනුකරණය කළ හැකි CTCM (රූපය 1a) නිපදවා ඇත.ඩයස්ටෝල් අතරතුර අධික පටක දිගු වීම වැළැක්වීම සඳහා, පටක ප්‍රමාණය 25% කින් වැඩි කිරීමට ත්‍රිමාණ මුද්‍රණ උපකරණයක් භාවිතා කරන ලදී (රූපය 1b).C-PACE පද්ධතිය මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද විද්‍යුත් වේගය හෘද චක්‍රය සම්පුර්ණයෙන්ම ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා දත්ත ලබා ගැනීමේ පද්ධතියක් භාවිතා කරමින් සිස්ටෝල් කිරීමට පෙර 100 ms ආරම්භ කිරීමට නියමිත විය.පටක රෝපණ පද්ධතිය ක්‍රමලේඛගත කළ හැකි වායුමය ක්‍රියාකාරකයක් (LB Engineering, Germany) භාවිතා කරමින් නම්‍යශීලී සිලිකොන් පටලයක් චක්‍රීයව ප්‍රසාරණය කර ඉහළ කුටියේ හෘද පෙති ප්‍රසාරණය කරයි.පද්ධතිය පීඩන පරිවර්තකයක් හරහා බාහිර වායු මාර්ගයකට සම්බන්ධ කර ඇති අතර එමඟින් පීඩනය (± 1 mmHg) සහ කාලය (± 1 ms) (රූපය 1c) නිවැරදිව සකස් කිරීමට හැකි විය.
a උපාංගයේ සංස්කෘතික කුටිය ඇතුළත නිල් පැහැයෙන් පෙන්වා ඇති 7 mm ආධාරක වළල්ලට පටක කොටස අමුණන්න.සංස්කෘතික කුටිය තුනී නම්‍යශීලී සිලිකොන් පටලයකින් වායු කුටීරයෙන් වෙන් කර ඇත.කාන්දු වීම වැළැක්වීම සඳහා එක් එක් කුටියක් අතර ගෑස්කට් එකක් තබන්න.උපාංගයේ පියනෙහි විද්යුත් උත්තේජනයක් සපයන ග්රැෆයිට් ඉලෙක්ට්රෝඩ අඩංගු වේ.b විශාල පටක උපාංගයේ ක්‍රමානුරූප නිරූපණය, මාර්ගෝපදේශ මුද්ද සහ ආධාරක වළල්ල.පටක කොටස් (දුඹුරු) උපාංගයේ පිටත කෙළවරේ වලක් තුළ තබා ඇති මාර්ගෝපදේශක වළල්ල සමඟ විශාල උපාංගය මත තබා ඇත.මාර්ගෝපදේශය භාවිතා කරමින්, හෘද පටක කොටස මත පටක ඇක්‍රිලික් ඇලවුම් සහිත ආධාරක වළල්ල ප්‍රවේශමෙන් තබන්න.c වැඩසටහන්ගත කළ හැකි වායව ක්‍රියාකාරකයක් (PPD) මගින් පාලනය වන වායු කුටීර පීඩනයේ ශ්‍රිතයක් ලෙස විද්‍යුත් උත්තේජනයේ කාලය පෙන්වන ප්‍රස්ථාරය.පීඩන සංවේදක භාවිතයෙන් විද්‍යුත් උත්තේජනය සමමුහුර්ත කිරීම සඳහා දත්ත ලබා ගැනීමේ උපකරණයක් භාවිතා කරන ලදී.සංස්කෘතික කුටියේ පීඩනය නියමිත සීමාවට ළඟා වූ විට, විද්‍යුත් උත්තේජනය අවුලුවාලීම සඳහා ස්පන්දන සංඥාවක් C-PACE-EM වෙත යවනු ලැබේ.d ඉන්කියුබේටර් රාක්කයක තබා ඇති CTCM හතරක රූපය.වායු පරිපථයක් හරහා උපාංග හතරක් එක් PPD එකකට සම්බන්ධ කර ඇති අතර, වායුමය පරිපථයේ පීඩනය නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා පීඩන සංවේදක hemostatic කපාටයට ඇතුල් කරනු ලැබේ.සෑම උපාංගයකම පටක කොටස් හයක් අඩංගු වේ.
තනි වායු ක්‍රියාකාරකයක් භාවිතා කරමින්, අපට CTCM උපාංග 4ක් පාලනය කිරීමට හැකි වූ අතර, ඒ සෑම එකක්ම පටක කොටස් 6ක් තබා ගත හැකි විය (රූපය 1d).CTCM හි, වායු කුටීරයේ වායු පීඩනය තරල කුටීරයේ සමමුහුර්ත පීඩනය බවට පරිවර්තනය කර හෘද පෙත්තෙහි භෞතික විද්‍යාත්මක ව්‍යාප්තිය ඇති කරයි (රූපය 2a සහ අතිරේක චිත්‍රපටය 1).80 mm Hg දී පටක දිගු කිරීම ඇගයීම.කලාව.25% කින් පටක කොටස් දිගු කිරීම පෙන්නුම් කරයි (රූපය 2b).මෙම ප්‍රතිශත දිගුව සාමාන්‍ය හෘද අංශයේ හැකිලීම සඳහා 2.2-2.3 µm කායික විද්‍යාත්මක සාර්කෝමියර් දිගකට අනුරූප වන බව පෙන්වා දී ඇත17,19,25.අභිරුචි කැමරා සැකසුම් භාවිතයෙන් පටක චලනය තක්සේරු කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 1).පටක චලනයේ විස්තාරය සහ ප්‍රවේගය (රූපය 2c, d) හෘද චක්‍රයේ දිගට සහ සිස්ටල් සහ ඩයස්ටෝල් අතරතුර කාලයට අනුරූප වේ (රූපය 2b).සංකෝචනය සහ ලිහිල් කිරීමේදී හෘද පටක වල දිගු වීම සහ ප්‍රවේගය සංස්කෘතිය තුළ දින 12 ක් නියතව පැවතුනි (රූපය 2f).සංස්කෘතිය තුළ කොන්ත්‍රාත්තුවේ විද්‍යුත් උත්තේජනයේ බලපෑම තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි සෙවනැලි ඇල්ගොරිතමයක් (පරිපූරක Fig. 2a,b) භාවිතයෙන් ක්‍රියාකාරී විරූපණය තීරණය කිරීම සඳහා ක්‍රමයක් සකස් කළ අතර විද්‍යුත් උත්තේජනය සමඟ සහ රහිතව විකෘතිතා අතර වෙනස හඳුනා ගැනීමට හැකි විය.හදවතේ එකම කොටස (රූපය 2f).කැපුම් (R6-9) හි චංචල කලාපයේ, විදුලි උත්තේජකයේ වෝල්ටීයතාවය විදුලි උත්තේජනයක් නොමැති විට වඩා 20% කින් වැඩි වූ අතර, එය සංකෝචන ක්‍රියාකාරිත්වයට විද්‍යුත් උත්තේජනයේ දායකත්වය පෙන්නුම් කරයි.
වායු කුටීර පීඩනය, තරල කුටීර පීඩනය සහ පටක චලන මිනුම්වල නියෝජිත අංශු මගින් කුටීර පීඩනය තරල කුටීර පීඩනය වෙනස් වන අතර පටක පෙත්තෙහි අනුරූප චලනය ඇති කරන බව තහවුරු කරයි.b ප්‍රතිශතයට (තැඹිලි) අනුරූප වන පටක කොටස්වල ප්‍රතිශතයේ (නිල්) ප්‍රතිශතයේ නියෝජිත අංශු.c හෘද පෙත්තෙහි මනින ලද චලිතය චලිතයේ මනින ලද වේගයට අනුකූල වේ.(d) හෘද පෙත්තක චක්‍රීය චලිතය (නිල් රේඛාව) සහ ප්‍රවේගය (තැඹිලි පැහැති තිත් රේඛාව) නියෝජනය කරන පථ.e චක්‍ර කාලය ප්‍රමාණ කිරීම (එක් කණ්ඩායමකට n = 19 පෙති, විවිධ ඌරන්ගෙන්), හැකිලීමේ කාලය (එක් කණ්ඩායමකට n = 19 පෙති), විවේක කාලය (එක් කණ්ඩායමකට n = 19 පෙති, විවිධ ඌරන්ගෙන්), පටක චලනය (n = 25).විවිධ ඌරන්ගෙන් පෙති)/කණ්ඩායම), උපරිම සිස්ටලික් ප්‍රවේගය (n = 24(D0), 25(D12) පෙති/විවිධ ඌරන්ගෙන් කණ්ඩායම්) සහ උපරිම ලිහිල් කිරීමේ අනුපාතය (n=24(D0), 25(D12) පෙති/විවිධ ඌරන්ගෙන් කණ්ඩායම්).ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්‍ෂණය කිසිදු පරාමිතියක සැලකිය යුතු වෙනසක් නොපෙන්වයි.f (රතු) සහ (නිල්) විද්‍යුත් උත්තේජනයකින් තොරව පටක කොටස්වල නියෝජිත වික්‍රියා විශ්ලේෂණ අංශු මාත්‍ර, එකම කොටසේ සිට පටක කොටස්වල කලාපීය ප්‍රදේශ දහයක්.විවිධ අංශ වලින් ප්‍රදේශ දහයක විද්‍යුත් උත්තේජනයක් ඇතිව සහ රහිතව පටක කොටස්වල වික්‍රියා ප්‍රතිශත වෙනස ප්‍රමාණනය කිරීම පහළ පුවරුවල පෙන්වයි. (විවිධ ඌරන්ගෙන් n = පෙති 8/කණ්ඩායම, දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය t-පරීක්‍ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (විවිධ ඌරන්ගෙන් n = පෙති 8/කණ්ඩායම, දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය t-පරීක්‍ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; **p<0,0001, **p<001, **p<00, **5). (n = 8 කොටස්/කණ්ඩායම විවිධ ඌරන්ගෙන්, දෙකේ වලිග සහිත සිසුන්ගේ t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 කොටස්/කණ්ඩායම, විවිධ ඌරන්ගෙන්, දෙකේ වලිග සහිත සිසුන්ගේ t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
අපගේ පෙර ස්ථිතික ජෛවමිතික හෘද පෙති සංස්කෘතික පද්ධතියේ [20, 21], අපි විද්‍යුත් උත්තේජනය යෙදීමෙන් සහ මධ්‍යම සංයුතිය ප්‍රශස්ත කිරීම මගින් හෘද පෙති වල ශක්‍යතාව, ක්‍රියාකාරිත්වය සහ ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව දින 6ක් පවත්වා ගෙන ගියෙමු.කෙසේ වෙතත්, දින 10 කට පසු, මෙම සංඛ්යා තියුනු ලෙස පහත වැටුණි.අපි අපගේ පෙර ස්ථිතික ජෛව අනුමිතික සංස්කෘතික පද්ධතිය 20, 21 පාලන තත්ත්‍වයේ (Ctrl) වගා කරන ලද කොටස් වෙත යොමු වන්නෙමු සහ අපි අපගේ කලින් ප්‍රශස්ත කළ මාධ්‍යය MC තත්ත්ව සහ සංස්කෘතිය ලෙස එකවර යාන්ත්‍රික සහ විද්‍යුත් උත්තේජනය (CTCM) යටතේ භාවිතා කරන්නෙමු.නමින් .පළමුව, අපි විද්‍යුත් උත්තේජනයකින් තොරව යාන්ත්‍රික උත්තේජනය දින 6 ක් සඳහා පටක ශක්‍යතාව පවත්වා ගැනීමට ප්‍රමාණවත් නොවන බව තීරණය කළෙමු (පරිපූරක Fig. 3a,b).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, STCM භාවිතයෙන් භෞතික-යාන්ත්‍රික සහ විද්‍යුත් උත්තේජනය හඳුන්වාදීමත් සමඟ, 12-දින හෘද කොටස්වල ශක්‍යතාව MS තත්ත්ව යටතේ නැවුම් හෘද කොටස්වල මෙන් නොව, MTT විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්වා ඇති පරිදි Ctrl තත්වයන් යටතේ නොවේ (රූපය 1).3a).මෙයින් ඇඟවෙන්නේ හෘද චක්‍රයේ යාන්ත්‍රික උත්තේජනය සහ අනුකරණය මගින් අපගේ පෙර ස්ථිතික සංස්කෘතික පද්ධතියේ වාර්තා වූ කාලය මෙන් දෙගුණයක් පටක කොටස් ශක්‍යව තබා ගත හැකි බවයි.කෙසේ වෙතත්, හෘද ට්‍රොපොනින් ටී සහ කොනෙක්සින් 43 හි ප්‍රතිශක්තිකරණ ලේබල් කිරීම මගින් පටක කොටස්වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව තක්සේරු කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ කොන්ක්සින් 43 ප්‍රකාශනය 12 වන දින MC පටක වල එදිනම පාලනයන්ට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ මට්ටමක පවතින බවයි.කෙසේ වෙතත්, ඒකාකාරී connexin 43 ප්රකාශනය සහ Z-තැටි සෑදීම සම්පූර්ණයෙන්ම නඩත්තු නොකළේය (රූපය 3b).පටක ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණ කිරීමට අපි කෘතිම බුද්ධි (AI) රාමුවක් භාවිතා කරමු, ප්‍රාදේශීයකරණයේ ශක්තිය අනුව හෘද පෙති වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සහ ප්‍රතිදීප්තතාව ස්වයංක්‍රීයව ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා troponin-T සහ connexin staining43 මත පදනම් වූ රූප මත පදනම් වූ ගැඹුරු ඉගෙනුම් නල මාර්ගයකි.මෙම ක්‍රමය යොමුවේ විස්තර කර ඇති පරිදි ස්වයංක්‍රීය හා අපක්ෂපාතී ආකාරයකින් හෘද පටක වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව විශ්වාසදායක ලෙස ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා Convolutional Neural Network (CNN) සහ ගැඹුරු ඉගෙනුම් රාමුවක් භාවිතා කරයි.26. MC පටක ස්ථිතික පාලන අංශ හා සසඳන විට දින 0 ට වැඩි දියුණු කරන ලද ව්‍යුහාත්මක සමානතාවයක් පෙන්නුම් කරයි.මීට අමතරව, Masson's trichrome staining, සංස්කෘතියේ 12 වන දින පාලන තත්වයන්ට සාපේක්ෂව MS තත්වයන් යටතේ ෆයිබ්‍රෝසිස් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු ප්‍රතිශතයක් අනාවරණය විය (රූපය 3c).CTCM විසින් 12 වන දින හෘද පටක කොටස්වල ශක්‍යතාව නැවුම් හෘද පටක වලට සමාන මට්ටමකට වැඩි කළද, එය හෘද කොටස්වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු නොකළේය.
තීරු ප්‍රස්ථාරයක් මගින් ස්ථිතික සංස්කෘතියේ (D12 Ctrl) හෝ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 # සමූහ, MC) pVA/# කණ්ඩායම් එක් ක්‍රමයකින් සිදු කරන ලද පෙත්තකින් නැවුම් හෘද පෙති (D0) හෝ හෘද පෙති සංස්කෘතියේ MTT ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්වයි. 0.0001 D0 හා සසඳන විට සහ **p <0.01 D12 Ctrl ට සාපේක්ෂව). තීරු ප්‍රස්ථාරයක් මගින් ස්ථිතික සංස්කෘතියේ (D12 Ctrl) හෝ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 # සමූහ, MC එක වෙනස් ආකාරයකට pVAs / MC) පෙත්තකින් නැවුම් හෘද පෙති (D0) හෝ හෘද පෙති සංස්කෘතියේ MTT ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්වයි. 0.0001 D0 හා සසඳන විට සහ **p <0.01 D12 Ctrl ට සාපේක්ෂව).ස්ථිතික සංස්කෘතිය (D12 පාලනය) හෝ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 පාලනය) (n = 18 (D0), 15 (D12 පාලනය) ) ), 12 (D12 MC) විවිධ අංශ වලින් සිදු කරන ලද 12 (D12 MC) පරීක්‍ෂණයකින් සිදු කරන ලද MTT නැවුම් හෘද කොටස් (D0) හෝ හෘද කොටස්වල සංස්කෘතිය දින 12 ක ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්නුම් කරයි.####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 හා සසඳන විට සහ **p <0.01 D12 Ctrl සමඟ සසඳන විට). අ养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测试，#0.0.0.0.与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)。 අ的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p <0.0001,与D12 Ctrl 相。,**p比,)නැවුම් හෘද කොටස් (D0) හෝ ස්ථිතික සංස්කෘතිය තුළ (D12 පාලනය) හෝ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 පාලනය) (n = 18 (D0), 15 (D12 පාලනය)) , 12 (D12 MC) අංශ/විවිධ ඌරන්, එක් මාර්ගයක ANO-කණ්ඩායම්වල දින 12 ක් වගා කරන ලද හෘද කොටස්වල MTT ශක්‍යතාව ප්‍රමාණනය කරන හිස්ටෝග්‍රෑම්####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 හා සසඳන විට, **p <0.01 D12 Ctrl හා සසඳන විට).b Troponin-T (කොළ), connexin 43 (රතු) සහ DAPI (නිල්) නැවුම් හුදකලා හෘද කොටස් (D0) හෝ ස්ථිතික තත්ව යටතේ (Ctrl) හෝ CTCM තත්ව (MC) යටතේ දින 12 ක් සඳහා සංස්කෘතික ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිදීප්ත රූප (හිස් පරිමාණය = 100). හෘද පටක ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) පෙති/කණ්ඩායම් බැගින් විවිධ ඌරන්ගෙන් කෘත්‍රිම බුද්ධිය ප්‍රමාණනය කිරීම, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ####p <0.0001 D0 සහ ****p2 Ctr දක්වා සංසන්දනය කරන විට.00001 සිට D0 දක්වා. හෘද පටක ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) පෙති/කණ්ඩායම් බැගින් විවිධ ඌරන්ගෙන් කෘත්‍රිම බුද්ධිය ප්‍රමාණනය කිරීම, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ####p <0.0001 D0 සහ ****p2 සමඟ සසඳන විට D0 සහ ****p2. Количественная оценка Strukturnoy целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7Dl12), (n = 7Dl10), езов/групп от разных свиней, проводится однофакторный TEST ANOVA D12 Ctrl). කෘතිම බුද්ධිය මගින් හෘද පටක වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණ කිරීම (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) කොටස්/කණ්ඩායම් විවිධ ඌරන්ගෙන්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරන ලදී; ####p <0.0001 එදිරිව D0 සහ ****p2 සමඟ සංසන්දනය කළ C.0.000 දක්වා.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) පෙති/කණ්ඩායම් එක් එක් විවිධ ඌරු, එක්-මාර්ග 1#00 පරීක්ෂණය;比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) පෙති/කණ්ඩායම් එක් එක් විවිධ ඌරන්, එක්-මාර්ග 1#00 පරීක්ෂණය;比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искуственный интелект для количественной оценки структурной целостности сердечности сердечной ткани (n = 7D) (n = 7D) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 එදිරිව D0 Для сравнения ****p01 12 Ctrl). හෘද පටක වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණ කිරීමට කෘතිම බුද්ධිය (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) කොටස්/කණ්ඩායම් එක් එක් විවිධ ඌරන්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය; ####p<0.0001 vs .D0 සිට .0000 දක්වා සංසන්දනය 0.0000 දක්වා c මැසන්ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් පැල්ලම (පරිමාණ හිස් = 500 µm) (පරිමාණ හිස් = 500 µm) (n = 10 පෙති/කණ්ඩායම් බැගින්, එක්-ආකාරයක ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ, D1-000 සිට D000 දක්වා සංසන්දනය කරන ලදී. trl). මැසන්ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් පැල්ලම (පරිමාණ හිස් = 500 µm) (පරිමාණ හිස් = 500 µm) (n = 10 පෙති/කණ්ඩායම් බැගින්, එක්-ආකාරයක ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ, D0#00 p <1 0 දක්වා සංසන්දනය කර D0#00 p <1 0 දක්වා සංසන්දනය කර ඇත. Ctrl). ඇ මැසෝනා (මැස්සෝනා (මැස්සිතාබ් බෙස් පොක්‍රිටියා = 500 මි.මී.) (n = 10 වර්‍ග/ගෘප්පූ සිට රාජ්‍ය විද්‍යාව##, выполняется односто односто, 01 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c මැසන්ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් පැල්ලම (ආලේපනය නොකළ පරිමාණය = 500 µm) (n = 10 කොටස්/කණ්ඩායම් විවිධ ඌරන්ගෙන්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරන ලද, D0 l). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右） උදාහරණය, C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代 表性 （左 左） 量化 （右度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova <#00比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 ඇ මැස්සෝනා (චිත්‍ර සංකලා = 500 mkm) (n = 10 ක්‍රසෝව්/ගෘප්පා, රූපවාහිනියෙන් සූක්ෂම, ප්‍රචාරක උපදේශන сперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් පැල්ලම (හිස් = 500 µm) (හිස් = 500 µm) (n = 10 කොටස්/කණ්ඩායම, එක් එක් ඌරෙකුගෙන්, එක්-මාර්ග විශ්ලේෂණයකින් පරීක්ෂා කරන ලද, D1 සිට D0 දක්වා සංසන්දනය කරන ලද D0 ට සසඳන විට p <0 0 දක්වා) වර්ණ ගැන්වූ හෘද කොටස්වල නියෝජිත රූප (වමේ) සහ ප්‍රමාණය (දකුණේ) Ctrl).දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
අපි උපකල්පනය කළේ සංස්කෘතික මාධ්‍යයට කුඩා අණු එකතු කිරීමෙන්, CTCM සංස්කෘතිය තුළ හෘද සෛලවල අඛණ්ඩතාව වැඩිදියුණු කළ හැකි අතර ෆයිබ්‍රෝසිස් වර්ධනය අඩු කළ හැකි බවයි.එබැවින් ව්‍යාකූල සාධක කුඩා සංඛ්‍යාවක් හේතුවෙන් අපගේ ස්ථිතික පාලන සංස්කෘතීන් 20,21 භාවිතා කර කුඩා අණු සඳහා අපි පරීක්‍ෂා කළෙමු.මෙම තිරය සඳහා Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) සහ SB431542 (SB) තෝරා ගන්නා ලදී.මෙම කුඩා අණු මීට පෙර hiPSC-CM සංස්කෘතීන් තුළ සාර්කොමර් දිග, ටී-ටියුබල් සහ සන්නායක ප්‍රවේගය වැඩි කිරීම මගින් හෘද සෛලවල පරිණතභාවය ඇති කිරීමට භාවිතා කර ඇත.මීට අමතරව, ඩෙක්ස් (ග්ලූකෝකෝටිකොයිඩ්) සහ එස්බී යන දෙකම දැවිල්ල මර්දනය කිරීමට දන්නා කරුණකි.එමනිසා, මෙම කුඩා අණු එකක් හෝ සංයෝජනයක් ඇතුළත් කිරීම හෘද කොටස්වල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව වැඩි දියුණු කරයිද යන්න අපි පරීක්‍ෂා කළෙමු.මූලික පරීක්ෂාව සඳහා, සෛල සංස්කෘතික ආකෘතිවල (1 μM Dex27, 100 nM T327, සහ 2.5 μM SB31) බහුලව භාවිතා වන සාන්ද්‍රණයන් මත පදනම්ව එක් එක් සංයෝගයේ මාත්‍රාව තෝරා ගන්නා ලදී.දින 12 ක සංස්කෘතියෙන් පසුව, T3 සහ ඩෙක්ස් සංයෝජනයෙන් ප්‍රශස්ත හෘද සෛල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සහ අවම තන්තුමය ප්‍රතිනිර්මාණය (පරිපූරක රූප 4 සහ 5).මීට අමතරව, මෙම T3 සහ Dex සාන්ද්‍රණය ද්විත්ව හෝ දෙගුණයක් භාවිතා කිරීම සාමාන්‍ය සාන්ද්‍රණයට සාපේක්ෂව හානිකර බලපෑම් ඇති කරයි (පරිපූරක Fig. 6a,b).
මූලික පිරික්සීමෙන් පසුව, අපි සංස්කෘතික තත්ත්‍ව 4 ක හිසට-හිස සැසඳීමක් සිදු කළෙමු (රූපය 4a): Ctrl: අපගේ ප්‍රශස්ත මාධ්‍යය භාවිතයෙන් අපගේ කලින් විස්තර කළ ස්ථිතික සංස්කෘතිය තුළ වගා කරන ලද හෘද කොටස්;20.21 TD: T3 සහ Ctrl s බදාදා ඩෙක්ස් එකතු කරන ලදී;MC: අපගේ කලින් ප්‍රශස්තකරණය කළ මාධ්‍යය භාවිතයෙන් CTCM හි වගා කරන ලද හෘද කොටස්;සහ MT: CTCM සමඟ T3 සහ Dex මාධ්‍යයට එකතු කර ඇත.වගා කිරීමෙන් දින 12 කට පසුව, MS සහ MT පටක වල ශක්‍යතාව MTT විශ්ලේෂණය මගින් තක්සේරු කරන ලද නැවුම් පටක වල මෙන් ම පවතී (රූපය 4b).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන්ට (TD) T3 සහ Dex එකතු කිරීම Ctrl තත්වයන්ට සාපේක්ෂව ශක්‍යතාවයේ සැලකිය යුතු දියුණුවක් ඇති නොකළ අතර, හෘද අංශවල ශක්‍යතාව පවත්වා ගැනීමේදී යාන්ත්‍රික උත්තේජනයේ වැදගත් කාර්යභාරයක් පෙන්නුම් කරයි.
දින 12 ක් සඳහා යාන්ත්‍රික උත්තේජනය සහ T3/Dex අතිරේකය මාධ්‍යයේ බලපෑම් ඇගයීම සඳහා භාවිතා කරන සංස්කෘතික තත්වයන් හතරක් නිරූපණය කරන පර්යේෂණාත්මක සැලසුම් රූප සටහනකි. b තීරු ප්‍රස්ථාරය නැවුම් හෘද පෙති (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MT), 12 (D12 Ctrl, D12 MT සහ D12 MT), 12 (D12 # කාණ්ඩයේ සිදු කරන ලද පරීක්‍ෂණය # VA# කාණ්ඩයෙන් සිදු කරන ලද පෙත්තක්) සියලුම සංස්කෘතීන් 4 තුළම (Ctrl, TD, MC, සහ MT) දින 12ක පශ්චාත් සංස්කෘතියේ ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්වයි. p <0.0001, ###p <0.001 D0 ට සාපේක්ෂව සහ **p <0.01 D12 Ctrl හා සසඳන විට). b තීරු ප්‍රස්ථාරය නැවුම් හෘද පෙති (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MT), 12 (D12 Ctrl, D12 MT සහ D12 MT), 12 (D12 # කාණ්ඩයේ සිදු කරන ලද පරීක්‍ෂණය # VA# කාණ්ඩයෙන් සිදු කරන ලද පෙත්තක්) සියලුම සංස්කෘතීන් 4 තුළම (Ctrl, TD, MC, සහ MT) දින 12ක පශ්චාත් සංස්කෘතියේ ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්වයි. p <0.0001, ###p <0.001 D0 හා සසඳන විට **p <0.01 D12 ctrl සමඟ සසඳන විට). b ගයිස්ටෝග්‍රම්මා පොකසිවෙට් කොලිචෙස්ට්වෙන්නුයු ඔෂෙන්කු ජයිස්නෙස්පොසොබ්නොස්ටි චෙරස් 12 දින පෝස්ලිව් පුවත්4 культивирования (කොන්ට්රෝල්, TD, MC සහ MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), D12 CtrD), 12 (D15 2 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0001, ##p <0,001 1 по сравнению с D12 Ctrl). b නැවුම් හදවත් කොටස් (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, සහ D12 MT), 12 (p# VAs MC සිට විවිධ කොටස් වලින් 12 (p# VA, MC) විවිධ කොටස් වලට සාපේක්ෂව සංස්කෘතීන් 4ම (පාලනය, TD, MC, සහ MT) සංස්කෘතියෙන් පසු දින 12ක ශක්‍යතාව ප්‍රමාණ කිරීම තීරු ප්‍රස්ථාරය පෙන්වයි. 0.0001, ###p <0.001 එදිරිව D0 සහ **p <0.01 by D12 Ctrl ට සාපේක්ෂව). b和D12 මෙ.ටොන්), 来自不同猪的12 (D12 MC)与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b ගයිස්ටෝග්‍රම්මා, පොකසයිවයුෂයා වර්ශ 4 යූස්ලෝවියා කුල්ටිවිරෝවානියාව (කොන්ට්‍රෝල්, ටීඩී, එම්සී සහ එම්ටී) පෝස්ට් ප්‍රචාරණ ව්‍යාපාරය (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MT), разных свиней 12 (D12 MC) සිට 001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b නැවුම් හදවත් කොටස් (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MT) හා සසඳන විට සියලුම සංස්කෘතීන් 4ම (පාලනය, TD, MC සහ MT) පෙන්වන හිස්ටෝග්‍රෑම්, විවිධ ඌරන් 12 (D12 MC) කොටස්/කණ්ඩායම, v.##001, v.##0p1, ##000p1; . D0, **p<0.01 එදිරිව පාලනය D12). c තීරු ප්‍රස්ථාරය නැවුම් හෘද පෙති (D0) හා සසඳන විට සියලුම සංස්කෘතීන් 4 තුළම (Ctrl, TD, MC, සහ MT) දින 12ක පසු සංස්කෘතියේ ග්ලූකෝස් ප්‍රවාහයේ ප්‍රමාණය පෙන්වයි (n = විවිධ ඌරන්ගෙන් පෙති 6ක්/කණ්ඩායමක්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ###p <0.001 ට සාපේක්ෂව D0001,***p 2001 ට සංසන්දනය කරන විට, l). c තීරු ප්‍රස්ථාරය නැවුම් හෘද පෙති (D0) හා සසඳන විට සියලුම සංස්කෘතීන් 4 තුළම (Ctrl, TD, MC, සහ MT) දින 12ක පසු සංස්කෘතියේ ග්ලූකෝස් ප්‍රවාහයේ ප්‍රමාණය පෙන්වයි (n = විවිධ ඌරන්ගෙන් පෙති 6ක්/කණ්ඩායමක්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ###p <0.001 ට සාපේක්ෂව D0001,***p 2001 ට සංසන්දනය කරන විට, l). c ගයිස්ටෝග්‍රම්මා පොකසිවෙට් කොලිචෙස්ට්වෙන්නුයු ඔෂෙන්කු පොටෝකා ග්ලූකෝස් චෙරෙස් 12 දින පෝස්ලේ පුවත්4. ультивирования (කොන්ත්‍රෝල්, ටීඩී, එම්සී සහ එම්ටී) ප්‍රචාරණය කිරීම සඳහා ස්වේච්ඡා යෝජනා ක්‍රම (ඩී 0) (n = 6 ව්‍යාප්ති/ගෘහගත කිරීම් торонний Выполняется тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 සහ ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram මගින් නැවුම් හෘද කොටස් (D0) හා සසඳන විට සියලුම සංස්කෘතීන් 4 (පාලනය, TD, MC සහ MT) යටතේ දින 12ක පශ්චාත් සංස්කෘතියේ ග්ලූකෝස් ප්‍රවාහය ප්‍රමාණ කිරීම පෙන්වයි (n = 6 කොටස්/විවිධ ඌරන්ගෙන් කොටස්/කණ්ඩායමක්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරන ලදී ; ###p <0.001 ට සාපේක්ෂව Drl. ඇ糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001,与D0 r,0.001,与D0, 0.120.比). සී后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , ， , , , , , , 猪 猪单匑AN0.0与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c ගයිස්ටෝග්‍රම්මා, පෝකසිවචය කොලිචෙස්ට්වෙන්නුයු ඔෂෙන්කු පොටෝකා ග්ලූකෝස් චෙරෙස් 12 දින පෝස්ලේ කුල්ඩ්4 вий культивирования (කොන්ට්රොල්, TD, MC සහ MT) по сравнению со со свезими срезами сердца (D0) (n = 6, ප්රස්තාරය, අනුපිළිවෙල односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению конто по сравнению. c නැවුම් හෘද කොටස් (D0) හා සසඳන විට සියලුම සංස්කෘතීන් 4 (පාලනය, TD, MC, සහ MT) සඳහා පශ්චාත් සංස්කෘතියෙන් දින 12 තුළ ග්ලූකෝස් ප්‍රවාහයේ ප්‍රමාණනය පෙන්වන හිස්ටෝග්‍රෑම් (n = 6 කොටස්/කණ්ඩායම, විවිධ ඌරන්ගෙන්, ඒකපාර්ශ්විකව ANOVA පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී, D0#0 1 ට සංසන්දනය කරන ලදී 1***p <0 දක්වා. (පාලනය).d කලාපීය පටක අංශ ස්ථාන දහයක නැවුම් (නිල්), දින 12 MC (කොළ), සහ දින 12 MT (රතු) පටකවල වික්‍රියා විශ්ලේෂණ බිම් කොටස් (n = 4 පෙති/කණ්ඩායම, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය; කණ්ඩායම් අතර සැලකිය යුතු වෙනසක් නොතිබුණි).e 10-12 දින ස්ථිතික තත්ව යටතේ (Ctrl) හෝ MT තත්ව (MT) යටතේ වගා කරන ලද හෘද කොටස් හා සසඳන විට නැවුම් හෘද කොටස්වල (D0) වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත ජාන පෙන්වන ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණය.f එක් එක් සංස්කෘතික තත්ත්වයන් යටතේ වගා කරන ලද හෘද කොටස් සඳහා සාර්කෝමියර් ජානවල තාප සිතියම.දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
මේද අම්ල ඔක්සිකරණයේ සිට ග්ලයිකොලිසිස් වෙත මාරුවීම මත පරිවෘත්තීය යැපීම හෘද සෛල විභේදනයේ ලක්ෂණයකි.නොමේරූ හෘද සෛල මූලික වශයෙන් ATP නිෂ්පාදනය සඳහා ග්ලූකෝස් භාවිතා කරන අතර cristae5,32 කිහිපයක් සහිත hypoplastic mitochondria ඇත.ග්ලූකෝස් උපයෝගිතා විශ්ලේෂණයන් පෙන්නුම් කළේ MC සහ MT තත්ව යටතේ ග්ලූකෝස් භාවිතය දින 0 පටක වල ඇති ආකාරයට සමාන බවයි (රූපය 4c).කෙසේ වෙතත්, Ctrl සාම්පල නැවුම් පටක වලට සාපේක්ෂව ග්ලූකෝස් භාවිතයේ සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කළේය.CTCM සහ T3/Dex සංයෝගය පටක ශක්‍යතාව වැඩි දියුණු කරන අතර දින 12 සංස්කෘතික හෘද කොටස්වල පරිවෘත්තීය සංසිද්ධිය ආරක්ෂා කරන බව මෙයින් පෙන්නුම් කෙරේ.මීට අමතරව, වික්‍රියා විශ්ලේෂණය පෙන්නුම් කළේ MT සහ MS තත්වයන් යටතේ දින 12 ක් සඳහා නැවුම් හෘද පටක වල වික්‍රියා මට්ටම් එලෙසම පවතින බවයි (රූපය 4d).
CTCM සහ T3/Dex හි සමස්ත බලපෑම හෘද පෙති පටකවල ගෝලීය පිටපත් කිරීමේ භූ දර්ශනයට විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, අපි විවිධ සංස්කෘතීන් හතරෙන් (පරිපූරක දත්ත 1) හෘද පෙති මත RNAseq සිදු කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, MT කොටස් නැවුම් හෘද පටකවලට ඉහළ පිටපත් කිරීමේ සමානකමක් පෙන්නුම් කළ අතර, ජාන 13,642 න් වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත 16 ක් පමණි.කෙසේ වෙතත්, අප කලින් පෙන්වා දුන් පරිදි, Ctrl පෙති සංස්කෘතිය තුළ දින 10-12 කට පසුව වෙනස් ලෙස ප්‍රකාශිත ජාන 1229 ක් ප්‍රදර්ශනය කළේය (රූපය 4e).මෙම දත්ත හෘදයේ සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් ජානවල qRT-PCR මගින් තහවුරු කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 7a-c).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, Ctrl කොටස් හෘද හා සෛල චක්‍ර ජාන අඩු කිරීම සහ ගිනි අවුලුවන ජාන වැඩසටහන් සක්‍රීය කිරීම පෙන්නුම් කරයි.මෙම දත්ත යෝජනා කරන්නේ සාමාන්‍යයෙන් දිගු කාලීන සංස්කෘතියකින් පසුව සිදුවන විභේදනය MT තත්ත්‍වයන් යටතේ සම්පූර්ණයෙන්ම දුර්වල වන බවයි (පරිපූරක Fig. 8a,b).සාර්කොමියර් ජාන පිළිබඳ ප්‍රවේශමෙන් අධ්‍යයනය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ MT තත්ව යටතේ පමණක් සාර්කොමියර් (පය. 4f) සහ අයන නාලිකාව (පරිපූරක පය. 9) කේතනය කරන ජාන Ctrl, TD සහ MC තත්ත්ව යටතේ මර්දනයෙන් ආරක්ෂා කරන බවයි.මෙම දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ යාන්ත්‍රික සහ හාස්‍ය උත්තේජක (T3/Dex) සංයෝජනයක් සමඟින්, හෘද පෙත්ත පිටපත් කිරීම සංස්කෘතියේ දින 12කට පසු නැවුම් හදවත් පෙති වලට සමානව පැවතිය හැකි බවයි.
මෙම පිටපත් කිරීමේ සොයාගැනීම් වලට සහය වන්නේ හෘද කොටස්වල හෘද සෛලවල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව MT තත්ව යටතේ දින 12 ක් සඳහා හොඳින් සංරක්ෂණය කර ඇති අතර, එය නොවෙනස්ව සහ දේශීයකරණය කරන ලද කනෙක්සින් 43 (පය. 5a) මගින් පෙන්නුම් කෙරේ.මීට අමතරව, Ctrl හා සසඳන විට MT තත්ව යටතේ හෘද අංශවල ෆයිබ්‍රෝසිස් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති අතර නැවුම් හෘද කොටස් වලට සමාන වේ (රූපය 5b).මෙම දත්ත මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ යාන්ත්‍රික උත්තේජනය සහ T3/Dex ප්‍රතිකාරවල සංයෝජනය සංස්කෘතිය තුළ හෘද කොටස්වල හෘද ව්‍යුහය ඵලදායී ලෙස ආරක්ෂා කරන බවයි.
troponin-T (කොළ), connexin 43 (රතු) සහ DAPI (නිල්) හි නියෝජිත ප්‍රතිශක්තිකරණ රූප නැවුම් හුදකලා හෘද කොටස්වල (D0) හෝ හෘද කොටස් හතරේම සංස්කෘතික තත්ත්වයන් තුළ (පරිමාණ තීරුව = 100 µm) දින 12 ක් වගා කෙරේ.) හෘද පටක ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව (n = 7 (D0 සහ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC සහ D12 MT) කෘත්‍රිම බුද්ධිය ප්‍රමාණ කිරීම විවිධ ඌරන්ගෙන් පෙති/කණ්ඩායම, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; ####p <0.0001 සමඟ සසඳන විට 0.0001. ed සිට D12 Ctrl දක්වා). හෘද පටක ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාවයේ කෘතිම බුද්ධි ප්‍රමාණනය (n = 7 (D0 සහ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC සහ D12 MT) පෙති/කණ්ඩායම් විවිධ ඌරන්ගෙන්, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරනු ලැබේ; #### p <0.0001 සමඟ සසඳන විට 0.0001. ed සිට D12 Ctrl දක්වා). Количественная оценка strukturnoy целостности ткани сердца с помощью искуственного (Dldl =7) 12 TD, D12 MC සහ D12 MT) срезов/grouppu от разных свиней, проведен однофакторный TEST ANOVA; #### p <0,0001 5 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). කෘතිම බුද්ධිය (n = 7 (D0 සහ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC සහ D12 MT) විවිධ ඌරන්ගෙන් කොටස්/කණ්ඩායම් භාවිතා කරමින් හෘද පටකවල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණ කිරීම, එක්-මාර්ග ANOVA පරීක්ෂණය සිදු කරන ලදී; #### p <0.0001 D0 ට සාපේක්ෂව D0 සහ <0. 2 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 艇D12人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比,或****p <0.05 相比,或****p <0.00对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 n = 7 (d0 和 d12 ctrl） （5 × d12 td × d12 mc工 向rl 相比).විවිධ ඌරන් (n = 7 (D0 සහ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC සහ D12 MT) අංශ/කණ්ඩායම්) ANOVA පරීක්ෂණයකින් කෘත්‍රිම බුද්ධිය භාවිතයෙන් හෘද පටකවල ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණ කිරීම;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 හා සසඳන විට සහ *p <0.05 හෝ ****p <0.0001 D12 Ctrl හා සසඳන විට). b Masson's trichrome stain (පරිමාණ තීරුව = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, සහ D12 MC), 9 (D12 MT) 9 (D12 MT) වලින් වර්ණාලේප කර ඇති හෘද පෙති සඳහා නියෝජන රූප සහ ප්‍රමාණ කිරීම, 9 (D12 MT) වෙනස් වේ. 001 D0 සහ ***p <0.001, හෝ ****p <0.0001 D12 Ctrl හා සසඳන විට). b Masson's trichrome stain (පරිමාණ තීරුව = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, සහ D12 MC), 9 (D12 MT) 9 (D12 MT) වලින් වර්ණාලේප කර ඇති හෘද පෙති සඳහා නියෝජන රූප සහ ප්‍රමාණ කිරීම, 9 (D12 MT) වෙනස් වේ. 001 D0 සහ ***p <0.001, හෝ ****p <0.0001 D12 Ctrl හා සසඳන විට). b රෙප්‍රෙසන්ටාටිව්න් ය සොබ්‍රජන් සහ කොලිචෙස්ට්වෙන්නා ඔෂෙන්කා සර්ඩ්සා, ඔක්‍රෂෙන්ස් ට්‍රයික්‍රම්ස් бная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MC), 9 (D12 MT) ප්‍රමාණය т ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් පැල්ලම (පරිමාණ තීරුව = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MC), 9 (D12 MT) වලින් වර්ණාලේප කර ඇති හෘද කොටස්වල නියෝජිත රූප සහ ප්‍රමාණ කිරීම, 9 (D12 MT) කොටස්/කණ්ඩායම v#0 pigs, v #0-0 VA වෙතින් සිදු කෙරේ. 0 සහ ***p <0.001 හෝ ****p <0.0001 එදිරිව D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µd（D10D TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 මෙ.ටොන්. 001, 或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比㾋 尺 尺 剼 = 500 µd ctrl , d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差, 1#0.0 ***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b විශ්වාසභංගය 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- <#P0010, ию с D0, ***p <0,001 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson ගේ ට්‍රයික්‍රෝම් (පරිමාණ තීරුව = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD සහ D12 MC), 9 (D12 MT) වලින් වර්ණාලේප කර ඇති හෘද කොටස්වල නියෝජිත රූප සහ ප්‍රමාණ කිරීම, විවිධ ඌරන්/කණ්ඩායම සිට 9 (D12 MT) දක්වා විවිධ ඌරන්/කණ්ඩායම, #0 VA00 දක්වා සංසන්දනාත්මක කොටස්, #0 VA00 දක්වා < 0.001 හෝ ****p < 0.0001 D12 Ctrl ට සාපේක්ෂව).දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
අවසාන වශයෙන්, CTCM හි හෘද අධි රුධිර පීඩනය අනුකරණය කිරීමට ඇති හැකියාව හෘද පටක දිගුව වැඩි කිරීම මගින් තක්සේරු කරන ලදී.CTCM හි, උපරිම වායු කුටීර පීඩනය 80 mmHg සිට 80 mmHg දක්වා වැඩි විය.කලාව.(සාමාන්‍ය දිගුව) 140 mmHg කලාව දක්වා.(රූපය 6a).මෙය 32% ක දිගකින් වැඩි වීමකට අනුරූප වේ (රූපය 6b), එය මීට පෙර පෙන්නුම් කරන ලද්දේ හෘද කොටස් සඳහා අධි රුධිරාණුවල දක්නට ලැබෙන සාර්කොමියර් දිගක් ලබා ගැනීමට අවශ්‍ය අනුරූප ප්‍රතිශතය ලෙස ය.සංකෝචනය සහ ලිහිල් කිරීමේදී හෘද පටක වල දිගු කිරීම සහ ප්‍රවේගය සංස්කෘතියේ දින හයක් තුළ නියතව පැවතුනි (රූපය 6c).MT තත්ත්වයන්ගෙන් හෘද පටක දින හයක් සඳහා සාමාන්‍ය දිගු (MT (සාමාන්‍ය)) හෝ අධික ලෙස දිගු කිරීමේ තත්වයන්ට (MT (OS)) යටත් විය.දැනටමත් සංස්කෘතියේ දින හතරකට පසුව, MT (සාමාන්ය) තත්ත්වයන් (රූපය 7a) ට සාපේක්ෂව MT (OS) තත්ත්වයන් යටතේ අතිධ්වනි ජෛව මාර්කර් NT-ProBNP සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇත.මීට අමතරව, දින හයක සංස්කෘතියෙන් පසුව, MT (OS) හි සෛල ප්රමාණය (රූපය 7b) MT හෘදයේ (සාමාන්ය) කොටස් වලට සාපේක්ෂව සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය.මීට අමතරව, NFATC4 න්‍යෂ්ටික පරිවර්ථනය අධික ලෙස දිගු වූ පටක වල සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 7c).මෙම ප්‍රතිඵල මගින් අධි විස්ථාපනයෙන් පසු ව්‍යාධික ප්‍රතිනිර්මාණයේ ප්‍රගතිශීලී වර්ධනය පෙන්නුම් කරන අතර දිගු ප්‍රේරිත හෘද අධි රුධිර සංඥා අධ්‍යයනය සඳහා වේදිකාවක් ලෙස CTCM උපාංගය භාවිතා කළ හැකිය යන සංකල්පයට සහාය වේ.
වායු කුටීර පීඩනය, තරල කුටීර පීඩනය සහ පටක චලන මිනුම්වල නියෝජිත අංශු මගින් කුටීර පීඩනය තරල කුටීර පීඩනය වෙනස් වන අතර පටක පෙත්තෙහි අනුරූප චලනය ඇති කරන බව තහවුරු කරයි.b සාමාන්‍යයෙන් දික් වූ (තැඹිලි) සහ අධික (නිල්) පටක කොටස් සඳහා නියෝජිත දිගු ප්‍රතිශතය සහ ස්ට්‍රෙච් රේට් වක්‍ර.c තීරු ප්‍රස්ථාරය පෙන්වන චක්‍ර කාලය (එක් කණ්ඩායමකට පෙති 19, විවිධ ඌරන්ගෙන්), හැකිලීමේ කාලය (එක් කණ්ඩායමකට n = 18-19 පෙති, විවිධ ඌරන්ගෙන්), විවේක කාලය (එක් කණ්ඩායමකට පෙති 19, විවිධ ඌරන්ගෙන්) ), පටක චලනයේ විස්තාරය (n = 14 පෙති/කණ්ඩායම, විවිධ ඌරන්ගේ උච්චතම කොටස්, 1/කණ්ඩායම, විවිධ ඌරන්ගෙන්) සහ විවිධ ඌරන්ගෙන් උපරිම ලිහිල් කිරීමේ අනුපාතය (n = 14 (D0), 15 (D6) ) කොටස්/කණ්ඩායම්), ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්‍ෂණය කිසිදු පරාමිතියක සැලකිය යුතු වෙනසක් පෙන්නුම් නොකළ අතර, මෙම පරාමිතීන් අධි වෝල්ටීයතාවයෙන් යුත් සංස්කෘතියේ දින 6 තුළ නියතව පැවති බව පෙන්නුම් කරයි.දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
MT සාමාන්‍ය දිගු (Norm) හෝ overstretching (OS) තත්ව යටතේ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, සහ D4 MTOS) පෙති/කණ්ඩායමක්/කණ්ඩායම් දෙකක්/විවිධ ඌරන් සිට සංසන්දනය කරන ලද හෘද පෙති වලින් සංස්කෘතික මාධ්‍යවල NT-ProBNP සාන්ද්‍රණයේ තීරු ප්‍රස්ථාර ප්‍රමාණනය කිරීම. හෘද ස්පන්දන (සම්මතය) හෝ අධික ලෙස උල්ලං ory ෝෂාකාරී (සාමාන්ය විචල්ය), ද්වි-මාර්ග ANOVA වෙතින් SLECTS / GRONS), ද්වි-මාර්ග ANOVA හි (d2 mtnorm) සංස්කෘතික මාධ්යවල (n = 4 (d4 (d4 (d4 (d4 (d4 (d4 (d4 (d4 (d4)NT-ProBNP සාන්ද්‍රණයේ ප්‍රමාණාත්මක හිස්ටෝග්‍රම් සාමාන්‍ය MT ස්ට්‍රෙච් (සම්මත) හෝ ඕවර්ස්ට්‍රෙච් (ඕඑස්) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, සහ D4) තත්ව යටතේ වගා කරන ලද හදවත් පෙති වලින් සංස්කෘතික මාධ්‍යයේ සාන්ද්‍රණයේ ප්‍රමාණාත්මක හිස්ටෝග්‍රෑම්.**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 සාමාන්‍ය දිගට සාපේක්ෂව). a 在MT 正常拉伸(සම්මත) = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS ,p <0.01). MT සාමාන්‍ය දිගු (Norm) හෝ overstretch (OS) තත්ව යටතේ (n= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) විවිධ 猪的切疌喌廏喌廏喌廏/疌廏/疌廏/疌廏/疇/疇/的廏/疌/的的切則/疇/疇/疇/的廏/疇/疇/疇/疇/疅/发动; ** සාමාන්‍ය දිගු කිරීම හා සසඳන විට, p <0.01).හිස්ටෝග්‍රෑම් සාමාන්‍ය MT ස්ට්‍රෙච් (සම්මතය) හෝ ඕවර්ස්ට්‍රෙච් (ඕඑස්) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) සහ D4 MTOS) විවිධ ඌරන්ගෙන් පෙති/කණ්ඩායමක් යටතේ වගා කරන ලද හෘද පෙතිවල NT-ProBNP සාන්ද්‍රණය ප්‍රමාණ කිරීම, විවිධ වර්ගවල විචල්‍ය විශ්ලේෂණය;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 සාමාන්‍ය දිගට සාපේක්ෂව). b troponin-T සහ WGA (වමේ) සහ සෛල ප්‍රමාණයේ ප්‍රමාණකරණය (දකුණ) සහිත හෘද පෙති සඳහා නියෝජිත රූප (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) සෛල/කණ්ඩායම විවිධ ඌරන්ගේ සිට විවිධ පෙති 10 කින්, ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයා t.***p 1 දක්වා සාමාන්‍ය 1 සිට ටේල්ඩ් 0 දක්වා විහිදේ. b ට්‍රොපොනින්-ටී සහ ඩබ්ලිව්ජීඒ (වමේ) සහ සෛල ප්‍රමාණයේ ප්‍රමාණකරණය (දකුණට) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) සෛල/කණ්ඩායම් විවිධ ඌරන්ගෙන් වර්ණ ගැන්වූ හෘද පෙති සඳහා විවිධ ඌරන්ගෙන් විවිධ පෙති 10 කින් සමන්විත වන අතර, Two- *tailed Student 0 ට සාමාන්‍ය 0 සිට 00 දක්වා දික් කරන ලද 0.00 දක්වා දිගු වේ. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных troponinom-Ta සහ АЗП (sleva) и голова ඇසිමේරා ක්ලෙටොක් (ස්ප්‍රවා) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ой t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b troponin-T සහ AZP (වමේ) සහ සෛල ප්‍රමාණයේ ප්‍රමාණය (දකුණ) වලින් වර්ණාලේප කර ඇති හෘද කොටස්වල නියෝජිත රූප (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) සෛල/කණ්ඩායම විවිධ ඌරන්ගෙන් විවිධ කොටස් 10 කින්, සාමාන්‍ය ටේල්ඩ් ශිෂ්‍යයාගේ 0 සිට සාමාන්‍ය 0 සිට 0 දක්වා සිදු කරන ලදී. ආ ）, 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生，与检检p <0.0001). b calcarein-T සහ WGA (වමේ) සහ සෛල ප්‍රමාණය (දකුණ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 විවිධ පෙති 10 කින් (D6 MTNorm)) වර්ණ ගැන්වූ හෘද පෙති වල නියෝජිත පින්තූර 0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных ට්රොපොනොම්-ටී සහ ඇම්ප්ට් (ස්ලේවා) සහ කෝලම් клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней клетки/групупс, юдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b troponin-T සහ AZP (වමේ) පැල්ලම් සහිත හෘද කොටස්වල නියෝජිත රූප සහ සෛල ප්‍රමාණය (දකුණ) ප්‍රමාණකරණය (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) විවිධ ඌරන්ගෙන් විවිධ කොටස් 10 කින්) සෛල/කණ්ඩායම, ද්වි-වලිග නිර්ණායක;****p <0.0001 සාමාන්‍ය වික්‍රියාවට සාපේක්ෂව). c troponin-T සහ NFATC4 සඳහා immunolabeled 0 සහ දින 6 MTOS හෘද පෙති සඳහා නියෝජිත රූප සහ CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) පෙති/කණ්ඩායම විවිධ ඌරන්ගෙන් සිදු කෙරේ. c ට්‍රොපොනින්-ටී සහ NFATC4 සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණය කරන ලද 0 සහ දින 6 MTOS හෘද පෙති සඳහා නියෝජිත රූප සහ CMs හි න්‍යෂ්ටීන් වෙත NFATC4 මාරු කිරීම ප්‍රමාණ කිරීම (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) පෙති/කණ්ඩායමක් විවිධ ඌරන්ගෙන් සිදු කෙරේ. ඇ ценка translokatsyi NFATC4 в yadra кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ශ්‍රේණිගත කිරීම්/සංස්කරණයෙන් පසු ий t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c 0 සහ 6 දින MTOS හි හෘද කොටස් සඳහා නියෝජිත රූප, troponin-T සහ NFATC4 සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ ලේබල් කර ඇති අතර, ගුහා සෛලවල න්‍යෂ්ටියේ NFATC4 ප්‍රතිවර්තනය ප්‍රමාණ කිරීම (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) පෙති/කණ්ඩායම් දෙකක් විවිධ ඌරන්ගේ වලිග වලින් සිදු කෙරේ.*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 NFATC4 c calcanin-T සහ NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS හෘද පෙති වල නියෝජිත රූප, සහ NFATC4 විවිධ NFATC4 易位至CM සෛල න්‍යෂ්ටිය 的quantity化的quantity化的 (n = 4 (D0 TO),间双尾学生et 电影；*p <0.05). c රෙප්‍රෙසන්ටාටිව්නි යිසොබ්‍රජෙනියා සර්ඩ්ස් එම්ටීඕඑස් දින 0 සහ 6 දක්වා ඉම්මූනොමාර්කිරොව්කි ට්‍රොපොනික් නාම-4 ценка translokaции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/grouppa, два- хвостатий; ,05). c විවිධ ඌරන්ගෙන් CM හි න්‍යෂ්ටිය තුළ troponin-T සහ NFATC4 immunolabeling සහ NFATC4 translocation ප්‍රමාණ කිරීම සඳහා 0 සහ 6 වන දින MTOS හෘද පෙතිවල නියෝජිත රූප (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) පෙති/කණ්ඩායම, 2-වලිග සහිත 5.0).දෝෂ තීරු මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.
පරිවර්තන හෘද වාහිනී පර්යේෂණ සඳහා හෘද පරිසරය නිවැරදිව ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කරන සෛලීය ආකෘති අවශ්‍ය වේ.මෙම අධ්‍යයනයේ දී, හෘදයේ අල්ට්‍රාතින් කොටස් උත්තේජනය කළ හැකි CTCM උපාංගයක් සංවර්ධනය කර සංලක්ෂිත විය.CTCM පද්ධතියට භෞතික විද්‍යාත්මකව සමමුහුර්ත කරන ලද විද්‍යුත් යාන්ත්‍රික උත්තේජනය සහ T3 සහ ඩෙක්ස් තරල පොහොසත් කිරීම ඇතුළත් වේ.පෝර්සීන් හෘද කොටස් මෙම සාධකවලට නිරාවරණය වූ විට, ඔවුන්ගේ ශක්‍යතාව, ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව, පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරකම් සහ පිටපත් කිරීමේ ප්‍රකාශනය සංස්කෘතියෙන් දින 12 කට පසුව නැවුම් හෘද පටක වල මෙන් ම පැවතුනි.මීට අමතරව, හෘද පටක අධික ලෙස දිගු කිරීම, අධි රුධිර පීඩනය හේතුවෙන් හෘදයේ අධි රුධිර පීඩනය ඇති විය හැක.සමස්තයක් වශයෙන්, මෙම ප්‍රතිඵල සාමාන්‍ය හෘද සංසිද්ධියක් පවත්වා ගැනීමේදී කායික සංස්කෘතික තත්ත්වයන්ගේ තීරණාත්මක කාර්යභාරයට සහය වන අතර මත්ද්‍රව්‍ය පරීක්ෂාව සඳහා වේදිකාවක් සපයයි.
හෘද සෛලවල ක්‍රියාකාරිත්වය සහ පැවැත්ම සඳහා ප්‍රශස්ත පරිසරයක් නිර්මාණය කිරීමට බොහෝ සාධක දායක වේ.මෙම සාධකවලින් වඩාත් පැහැදිලිව පෙනෙන්නේ (1) අන්තර් සෛල අන්තර්ක්‍රියා, (2) විද්‍යුත් යාන්ත්‍රික උත්තේජනය, (3) හාස්‍යජනක සාධක සහ (4) පරිවෘත්තීය උපස්ථරවලට සම්බන්ධ වේ.කායික සෛල-සෛල අන්තර්ක්‍රියා සඳහා බාහිර සෛල අනුකෘතියක් මඟින් සහාය දක්වන බහු සෛල වර්ගවල සංකීර්ණ ත්‍රිමාන ජාල අවශ්‍ය වේ.එවැනි සංකීර්ණ සෛලීය අන්තර්ක්‍රියා තනි සෛල වර්ගවල සම-සංස්කෘතිය මගින් vitro තුළ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම අපහසු නමුත් හෘද අංශවල organotypic ස්වභාවය භාවිතයෙන් පහසුවෙන් සාක්ෂාත් කරගත හැකිය.
හෘද ෆීනෝටයිප් 33,34,35 පවත්වා ගැනීම සඳහා හෘද සෛලවල යාන්ත්‍රික දිගු කිරීම සහ විද්‍යුත් උත්තේජනය ඉතා වැදගත් වේ.hiPSC-CM සමීකරණය සහ පරිණත වීම සඳහා යාන්ත්‍රික උත්තේජනය බහුලව භාවිතා වී ඇති අතර, අලංකාර අධ්‍යයනයන් කිහිපයක් මෑතදී ඒකීය ආක්‍රමණය භාවිතා කරමින් සංස්කෘතිය තුළ හෘද පෙති යාන්ත්‍රික උත්තේජනය කිරීමට උත්සාහ කර ඇත.මෙම අධ්‍යයනවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ 2D ඒකීය යාන්ත්‍රික පැටවීම සංස්කෘතිය තුළ හදවතේ ෆීනෝටයිප් කෙරෙහි ධනාත්මක බලපෑමක් ඇති කරන බවයි.මෙම අධ්‍යයනයන්හි දී, හෘදයේ කොටස් සමමිතික ආතන්‍ය බල17, රේඛීය auxotonic loading18, හෝ හෘද චක්‍රය බල පරිවර්තක ප්‍රතිපෝෂණ සහ ආතති ධාවකයන් භාවිතයෙන් ප්‍රතිනිර්මාණය කර ඇත.කෙසේ වෙතත්, මෙම ක්‍රම මගින් පාරිසරික ප්‍රශස්තකරණයකින් තොරව ඒක අක්ෂීය පටක දිගුවක් භාවිතා කරන අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස බොහෝ හෘද ජාන යටපත් කිරීම හෝ අසාමාන්‍ය දිගු ප්‍රතිචාර හා සම්බන්ධ ජාන අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම සිදුවේ.මෙහි විස්තර කර ඇති CTCM චක්‍ර කාලය සහ භෞතික විද්‍යාත්මක දිගුව (25% දිගු කිරීම, 40% සිස්ටෝල්, 60% ඩයස්ටෝල් සහ විනාඩියකට බීට් 72) අනුව ස්වාභාවික හෘද චක්‍රය අනුකරණය කරන ත්‍රිමාණ විද්‍යුත් යාන්ත්‍රික උත්තේජනයක් සපයයි.පටක අඛණ්ඩතාව පවත්වා ගැනීමට මෙම ත්‍රිමාණ යාන්ත්‍රික උත්තේජනය පමණක් ප්‍රමාණවත් නොවුවද, පටක ශක්‍යතාව, ක්‍රියාකාරීත්වය සහ අඛණ්ඩතාව ප්‍රමාණවත් ලෙස පවත්වා ගැනීම සඳහා T3/Dex භාවිතා කරන හාස්‍යජනක සහ යාන්ත්‍රික උත්තේජනයේ එකතුවක් අවශ්‍ය වේ.
වැඩිහිටි හෘද සංසිද්ධිය වෙනස් කිරීමේදී හාස්‍යජනක සාධක වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.සෛල මේරීම වේගවත් කිරීම සඳහා සංස්කෘතික මාධ්‍ය වෙත T3 සහ Dex එකතු කරන ලද HiPS-CM අධ්‍යයනයන්හි මෙය ඉස්මතු විය.T3 සෛල පටල හරහා ඇමයිනෝ අම්ල, සීනි සහ කැල්සියම් ප්‍රවාහනයට බලපෑම් කළ හැක36.මීට අමතරව, T3 MHC-α ප්‍රකාශනය සහ MHC-β අඩු කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරයි, භ්‍රෑණ CM හි මන්දගාමී twitch myofibrils හා සසඳන විට පරිණත හෘද සෛලවල වේගවත් twitch myofibrils ගොඩනැගීම ප්‍රවර්ධනය කරයි.තයිරොයිඩ් ග්‍රන්ථියේ සිටින රෝගීන්ගේ T3 ඌනතාවයෙන් myofibrillar පටි නැති වී තානය වර්ධනය වීමේ වේගය අඩු වේ37.ඩෙක්ස් ග්ලූකෝකෝටිකොයිඩ් ප්‍රතිග්‍රාහක මත ක්‍රියා කරන අතර හුදකලා පර්ෆියූස් හදවත්වල හෘද සංකෝචනය වැඩි කරන බව පෙන්වා දී ඇත;38 මෙම වැඩිදියුණු කිරීම කැල්සියම් තැන්පතු-ධාවනය ප්‍රවේශය (SOCE) 39,40 මත බලපෑමට සම්බන්ධ යැයි සැලකේ.ඊට අමතරව, ඩෙක්ස් එහි ප්‍රතිග්‍රාහක සමඟ බන්ධනය වන අතර එමඟින් ප්‍රතිශක්තිකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය සහ දැවිල්ල මර්දනය කරන පුළුල් අන්තර් සෛල ප්‍රතිචාරයක් ඇති කරයි.
අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ Ctrl හා සසඳන විට භෞතික යාන්ත්‍රික උත්තේජනය (MS) සමස්ත සංස්කෘතික ක්‍රියාකාරිත්වය වැඩිදියුණු කළ නමුත් සංස්කෘතිය තුළ දින 12ක් පුරා ශක්‍යතාව, ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සහ හෘද ප්‍රකාශනය පවත්වා ගැනීමට අපොහොසත් වූ බවයි.Ctrl හා සසඳන විට, CTCM (MT) සංස්කෘතීන්ට T3 සහ Dex එකතු කිරීම ශක්‍යතාව වැඩිදියුණු කළ අතර දින 12 ක් සඳහා නැවුම් හෘද පටක සමග සමාන පිටපත් කිරීමේ පැතිකඩ, ව්‍යුහාත්මක අඛණ්ඩතාව සහ පරිවෘත්තීය ක්‍රියාකාරකම් පවත්වා ගෙන ගියේය.මීට අමතරව, පටක දිග හැරීමේ මට්ටම පාලනය කිරීම මගින්, STCM පද්ධතියේ බහුකාර්යතාව නිදර්ශනය කරමින්, STCM භාවිතා කරමින් අධි දිගු-ප්‍රේරිත හෘද හයිපර්ට්‍රොෆි ආකෘතියක් නිර්මාණය කරන ලදී.හෘද ප්‍රතිනිර්මාණය සහ ෆයිබ්‍රෝසිස් සාමාන්‍යයෙන් සංසරණ සෛලවලට සුදුසු සයිටොකයින් මෙන්ම ෆාගෝසයිටෝසිස් සහ වෙනත් ප්‍රතිනිර්මාණ සාධක සැපයිය හැකි නොවෙනස්ව පවතින අවයව ඇතුළත් වුවද, හෘදයේ කොටස් තවමත් ආතතියට හා කම්පනයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් ෆයිබ්‍රොටික් ක්‍රියාවලිය අනුකරණය කළ හැකි බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.myofibroblasts බවට.මෙය මීට පෙර මෙම හෘද පෙති ආකෘතියෙන් ඇගයීමට ලක් කර ඇත.ටායිචාර්ඩියා, බ්‍රැඩිකාර්ඩියා සහ යාන්ත්‍රික සංසරණ ආධාරක (යාන්ත්‍රික ගොඩ නොගත් හදවත) වැනි බොහෝ තත්වයන් අනුකරණය කිරීම සඳහා පීඩනය/විද්‍යුත් විස්තාරය සහ සංඛ්‍යාතය වෙනස් කිරීම මගින් CTCM පරාමිතීන් වෙනස් කළ හැකි බව සටහන් කළ යුතුය.මෙම පද්ධතිය ඖෂධ පරීක්ෂාව සඳහා මධ්‍යම ප්‍රතිදානයක් බවට පත් කරයි.CTCM හි අධි වෙහෙස නිසා ඇතිවන හෘද අධි රුධිර පීඩනය ආදර්ශනය කිරීමට ඇති හැකියාව පුද්ගලාරෝපිත චිකිත්සාව සඳහා මෙම පද්ධතිය පරීක්ෂා කිරීමට මග පාදයි.අවසාන වශයෙන්, වර්තමාන අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ හෘද පටක කොටස්වල සංස්කෘතිය පවත්වා ගැනීම සඳහා යාන්ත්‍රික දිගු කිරීම සහ හාස්‍ය උත්තේජනය ඉතා වැදගත් බවයි.
මෙහි ඉදිරිපත් කර ඇති දත්ත මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ CTCM නොවෙනස්ව myocardium ආකෘතිකරණය සඳහා ඉතා හොඳ වේදිකාවක් වන නමුත්, මෙම සංස්කෘතික ක්‍රමයට යම් සීමාවන් ඇත.CTCM සංස්කෘතියේ ප්‍රධාන සීමාව වන්නේ එය පෙති මත අඛණ්ඩ ගතික යාන්ත්‍රික ආතතීන් පැනවීමයි, එමඟින් එක් එක් චක්‍රය තුළ හෘද පෙති හැකිලීම් ක්‍රියාකාරීව නිරීක්ෂණය කිරීමේ හැකියාව වළක්වයි.මීට අමතරව, හෘද අංශවල කුඩා ප්‍රමාණය (මි.මී. 7) නිසා, සම්ප්‍රදායික බල සංවේදක භාවිතයෙන් සංස්කෘතික පද්ධතිවලින් පිටත සිස්ටලික් ක්‍රියාකාරිත්වය ඇගයීමට ඇති හැකියාව සීමිතය.වත්මන් අත්පිටපතෙහි, අපි කොන්ත්‍රාත් ක්‍රියාකාරිත්වයේ දර්ශකයක් ලෙස දෘශ්‍ය වෝල්ටීයතාව ඇගයීමෙන් මෙම සීමාව අර්ධ වශයෙන් ජය ගනිමු.කෙසේ වෙතත්, මෙම සීමාව තවදුරටත් වැඩ කිරීමට අවශ්‍ය වන අතර අනාගතයේදී කැල්සියම් සහ වෝල්ටීයතා සංවේදී ඩයි වර්ග භාවිතයෙන් දෘශ්‍ය සිතියම්කරණය වැනි සංස්කෘතිය තුළ හෘද පෙති වල ක්‍රියාකාරිත්වය දෘශ්‍ය අධීක්ෂණය සඳහා ක්‍රම හඳුන්වා දීමෙන් විසඳිය හැකිය.CTCM හි තවත් සීමාවක් වන්නේ වැඩ කරන ආකෘතිය කායික ආතතිය (පූර්ව පැටවීම සහ පසු පැටවීම) හසුරුවා නොගැනීමයි.CTCM හි, ඉතා විශාල පටක වල ඩයස්ටෝල් (සම්පූර්ණ දිගු) සහ සිස්ටෝල් (විද්‍යුත් උත්තේජනය අතරතුර හැකිලීමේ දිග) 25% කායික දිගු ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ප්‍රතිවිරුද්ධ දිශාවලට පීඩනය ඇති කරන ලදී.මෙම සීමාව අනාගත CTCM සැලසුම් වලදී දෙපස සිට හෘද පටක මත ප්‍රමාණවත් පීඩනයක් මගින් සහ හෘදයේ කුටීර තුළ සිදුවන නිශ්චිත පීඩන-පරිමා සම්බන්ධතා යෙදීමෙන් ඉවත් කළ යුතුය.
මෙම අත්පිටපතෙහි වාර්තා කර ඇති අධික ලෙස දිගු කරන ලද ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම අධිප්‍රත්‍යක්ෂ අධි ස්ට්‍රෙච් සංඥා අනුකරණය කිරීමට සීමා වේ.මේ අනුව, හාස්‍යජනක හෝ ස්නායුක සාධක (මෙම පද්ධතියේ නොපවතින) අවශ්‍යතාවයකින් තොරව දිගු-ප්‍රේරිත අධි මානසික සංඥා අධ්‍යයනයට මෙම ආකෘතිය උපකාර විය හැක.CTCM හි ගුණත්වය වැඩි කිරීම සඳහා වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ, නිදසුනක් ලෙස, ප්‍රතිශක්තිකරණ සෛල සමඟ සම-සංස්කෘත කිරීම, ප්ලාස්මා හාස්‍යජනක සාධක සංසරණය කිරීම සහ නියුරෝන සෛල සමඟ සම-සංස්කරණය කිරීමේදී නවෝත්පාදනය CTCM සමඟ රෝග ආකෘති නිර්මාණය කිරීමේ හැකියාව වැඩි දියුණු කරයි.
මෙම අධ්‍යයනය සඳහා ඌරන් දහතුනක් යොදාගෙන ඇත.සියලුම සත්ව ක්‍රියා පටිපාටි ආයතනික මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සිදු කරන ලද අතර ලුයිස්විල් විශ්ව විද්‍යාලයේ ආයතනික සත්ව ආරක්ෂණ සහ භාවිත කමිටුව විසින් අනුමත කරන ලදී.aortic ආරුක්කුව තද කර ඇති අතර හෘදය 1 L වන්ධ්‍යා හෘද රෝග (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH දක්වා 7.4 දක්වා) පර්ෆියුස් කර ඇත; සාමාන්‍යයෙන් මිනිත්තු 10 ක් පමණ වන අයිස් මත රසායනාගාරයට ප්‍රවාහනය කරන තෙක් හදවත් අයිස්-සීතල හෘද රෝග ද්‍රාවණයක තබා ඇත. සාමාන්‍යයෙන් මිනිත්තු 10 ක් පමණ වන අයිස් මත රසායනාගාරයට ප්‍රවාහනය කරන තෙක් හදවත් අයිස්-සීතල හෘද රෝග ද්‍රාවණයක තබා ඇත. සෙර්ඩියා ක්‍රෑනිලි වෝ ලෙඩියානෝම් කාර්ඩියෝප්ලගිචෙස්කොම් රෙස්ට්වෝර් ඩෝ ට්‍රෑන්ස්පෝර්ටිරොව්කි වර් ලැබෝරටෝරිෂූන් චක්‍රම්, . සාමාන්‍යයෙන් මිනිත්තු 10ක් ගතවන අයිස් මත රසායනාගාරයට ප්‍රවාහනය කරන තෙක් හදවත් අයිස්-සීතල හෘද රෝග ද්‍රාවණයක ගබඩා කර ඇත.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. අයිස් මත රසායනාගාරයට ප්‍රවාහනය කරන තෙක් හදවත් අයිස් හෘද රෝග මත තබා ගන්න, සාමාන්‍යයෙන් මිනිත්තු 10 යි.
CTCM උපාංගය SolidWorks පරිගණක ආධාරක සැලසුම් (CAD) මෘදුකාංගයෙන් සංවර්ධනය කරන ලදී.සංස්කෘතික කුටි, බෙදුම්කරුවන් සහ වායු කුටි CNC පැහැදිලි ඇක්‍රිලික් ප්ලාස්ටික් වලින් සාදා ඇත.මිලිමීටර් 7 ක විශ්කම්භයකින් යුත් උපස්ථ මුද්ද මධ්‍යයේ ඇති ඉහළ ඝනත්ව පොලිඑතිලීන් (HDPE) වලින් සාදා ඇති අතර මාධ්‍ය යට මුද්‍රා තැබීමට භාවිතා කරන සිලිකොන් ඕ-මුදුව සඳහා o-ring වලල්ලක් ඇත.තුනී සිලිකා පටලයක් සංස්කෘතික කුටිය වෙන් කිරීමේ තහඩුවෙන් වෙන් කරයි.සිලිකොන් පටලය 0.02″ ඝන සිලිකොන් පත්‍රයකින් ලේසර් කපා ඇති අතර එහි දෘඪතාව 35A වේ.පහළ සහ ඉහළ සිලිකොන් ගෑස්කට් 1/16″ ඝන සිලිකොන් පත්‍රයකින් ලේසර් කපා ඇති අතර 50A දෘඩතාවයකින් යුක්ත වේ.316L මල නොබැඳෙන වානේ ඉස්කුරුප්පු සහ පියාපත් ඇට වර්ග බ්ලොක් එක සවි කිරීම සහ වාතය රහිත මුද්‍රාවක් නිර්මාණය කිරීම සඳහා යොදා ගනී.
කැපවූ මුද්‍රිත පරිපථ පුවරුවක් (PCB) C-PACE-EM පද්ධතිය සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීමට සැලසුම් කර ඇත.PCB හි ඇති ස්විස් යන්ත්‍ර සම්බන්ධක සොකට් රිදී ආලේපිත තඹ වයර් සහ ලෝකඩ 0-60 ඉස්කුරුප්පු මගින් ඉලෙක්ට්‍රෝඩවලට ඉස්කුරුප්පු කරන ලද ග්‍රැෆයිට් ඉලෙක්ට්‍රෝඩවලට සම්බන්ධ කර ඇත.මුද්රිත පරිපථ පුවරුව 3D මුද්රණ යන්ත්රයේ කවරයේ තබා ඇත.
CTCM උපාංගය හෘද චක්‍රයකට සමාන පාලිත සංසරණ පීඩනයක් ඇති කරන ක්‍රමලේඛගත වායු ක්‍රියාකාරකයක් (PPD) මගින් පාලනය වේ.වායු කුටීරය තුළ පීඩනය වැඩි වන විට, නම්‍යශීලී සිලිකොන් පටලය ඉහළට ප්‍රසාරණය වන අතර, පටක අඩවියට යටින් මාධ්‍යය බල කරයි.ඩයස්ටෝල් අතරතුර හෘදයේ භෞතික විද්‍යාත්මක ප්‍රසාරණය අනුකරණය කරමින් මෙම තරලය බැහැර කිරීම මගින් පටක ප්‍රදේශය දිගු වේ.ලිහිල් කිරීමේ උච්චතම අවස්ථාවෙහිදී, ග්‍රැෆයිට් ඉලෙක්ට්‍රෝඩ හරහා විද්‍යුත් උත්තේජනයක් යොදන ලද අතර එමඟින් වායු කුටියේ පීඩනය අඩු වී පටක කොටස් හැකිලීමට හේතු විය.පයිප්ප ඇතුළත වායු පද්ධතියේ පීඩනය හඳුනා ගැනීම සඳහා පීඩන සංවේදකයක් සහිත රක්තපාත කපාටයක් ඇත.පීඩන සංවේදකය මගින් දැනෙන පීඩනය ලැප්ටොප් පරිගණකයට සම්බන්ධ දත්ත එකතු කරන්නකුට යොදනු ලැබේ.මෙය ගෑස් කුටිය තුළ පීඩනය අඛණ්ඩව නිරීක්ෂණය කිරීමට ඉඩ සලසයි.උපරිම කුටීර පීඩනය (සම්මත 80 mmHg, 140 mmHg OS) ළඟා වූ විට, දත්ත ලබා ගැනීමේ උපකරණය C-PACE-EM පද්ධතියට 2 ms සඳහා ද්විපාර්ශ්වික වෝල්ටීයතා සංඥාවක් උත්පාදනය කිරීම සඳහා සංඥාවක් යැවීමට නියෝග කරන ලදී, 4 V ලෙස සකසා ඇත.
හෘද කොටස් ලබා ගන්නා ලද අතර ළිං 6 ක සංස්කෘතික තත්ත්වයන් පහත පරිදි සිදු කරන ලදී: අස්වනු නෙළන ලද හදවත් මාරු කිරීමේ භාජනයේ සිට සීතල (4 ° C.) හෘද රෝග අඩංගු තැටියකට මාරු කරන්න.වම් කශේරුකාව වඳ තලයකින් හුදකලා කර 1-2 cm3 කැබලිවලට කපා ඇත.මෙම පටක කුට්ටි පටක මැලියම් සහිත පටක ආධාරකවලට සම්බන්ධ කර ඇති අතර ටයිරෝඩ් ද්‍රාවණය අඩංගු කම්පන මයික්‍රොටෝම් පටක ස්නානයක තබා අඛණ්ඩව ඔක්සිජන් කරන ලද (3 g/L 2,3-බියුටනේඩියෝන් මොනොක්සිම් (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.18 gM1 gmse), 6 mM KCl (0.44 m1 gMse) HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M විසඳුම), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M විසඳුම), 1 L ddH2O දක්වා).කම්පන මයික්‍රෝටෝමය 300 µm ඝන පෙති කපා 80 Hz සංඛ්‍යාතයකින්, තිරස් කම්පන විස්තාරය 2 mm සහ අත්තිකාරම් අනුපාතය 0.03 mm/s ලෙස සකසා ඇත.ද්‍රාවණය සිසිල්ව තබා ගැනීම සඳහා පටක ස්නානය අයිස්වලින් වට කර ඇති අතර උෂ්ණත්වය සෙල්සියස් අංශක 4 ක මට්ටමක පවත්වා ගෙන යන ලදී.එක් වගා තහඩුවක් සඳහා ප්‍රමාණවත් කොටස් ලබා ගන්නා තෙක් මයික්‍රෝටෝම් ස්නානයේ සිට අයිස් මත අඛණ්ඩව ඔක්සිජන් කරන ලද ටයිරෝඩ් ද්‍රාවණය අඩංගු ඉන්කියුබේෂන් බාත් වෙත පටක කොටස් මාරු කරන්න.ට්‍රාන්ස්වෙල් සංස්කෘතීන් සඳහා, පටක කොටස් වඳ 6 mm පළල පොලියුරේතන් ආධාරකවලට සම්බන්ධ කර ප්‍රශස්ත මාධ්‍ය 6 ml (199 මධ්‍යම, 1x ITS අතිරේක, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-ක්ෂාරීය සහ 2X ප්‍රතිජීවක-ifungal-anti-anti-if) 6ක් තුළ තැන්පත් කර ඇත.C-Pace හරහා පටක කොටස් වෙත විද්යුත් උත්තේජනය (10 V, සංඛ්යාත 1.2 Hz) යොදන ලදී.TD තත්ත්‍වයන් සඳහා, එක් එක් මධ්‍යම වෙනසකදී නැවුම් T3 සහ Dex 100 nM සහ 1 μM එකතු කරන ලදී.දිනකට 3 වතාවක් ප්රතිස්ථාපනය කිරීමට පෙර මාධ්යය ඔක්සිජන් සමඟ සංතෘප්ත වේ.පටක කොටස් 37 ° C සහ 5% CO2 හි ඉන්කියුබේටරයක වගා කරන ලදී.
CTCM සංස්කෘතීන් සඳහා, පටක කොටස් වෙනස් කරන ලද Tyrode ද්‍රාවණය අඩංගු Petri තැටියක අභිරුචි-සාදන ලද ත්‍රිමාණ මුද්‍රණ යන්ත්‍රයක් මත තබා ඇත.උපාංගය නිර්මාණය කර ඇත්තේ ආධාරක වළල්ලේ ප්රදේශයෙන් 25% කින් හදවතේ පෙත්තෙහි ප්රමාණය වැඩි කිරීම සඳහාය.මෙය සිදු කරනු ලබන්නේ ටයිරෝඩ් ද්‍රාවණයෙන් මාධ්‍යයට මාරු කිරීමෙන් පසු සහ ඩයස්ටෝල් අතරතුර හෘදයේ කොටස් දිගු නොවන පරිදි ය.හිස්ටොඇක්‍රිලික් මැලියම් භාවිතයෙන්, මිලිමීටර් 7 ක විෂ්කම්භයක් සහිත ආධාරක වළල්ලක් මත 300 µm ඝන කොටස් සවි කර ඇත.ආධාරක වළල්ලට පටක කොටස් ඇමිණීමෙන් පසු, අතිරික්ත පටක කොටස් කපා, එක් උපාංගයක් සඳහා ප්‍රමාණවත් කොටස් සකස් කර ඇති තෙක් අමුණා ඇති පටක කොටස් නැවත අයිස් (4 ° C) මත ටයිරෝඩ් ද්‍රාවණයේ ස්නානය තුළට දමන්න.සියලුම උපාංග සඳහා සම්පූර්ණ සැකසුම් කාලය පැය 2 නොඉක්මවිය යුතුය.පටක කොටස් 6 ක් ඔවුන්ගේ ආධාරක වළලුවලට සම්බන්ධ කිරීමෙන් පසුව, CTCM උපාංගය එකලස් කර ඇත.CTCM සංස්කෘතික කුටිය 21 ml පූර්ව ඔක්සිජන් සහිත මාධ්‍යයකින් පුරවා ඇත.පටක කොටස් සංස්කෘතික කුටියට මාරු කර පයිපට් එකකින් වායු බුබුලු ප්‍රවේශමෙන් ඉවත් කරන්න.එවිට පටක කොටස කුහරය තුලට යොමු කර මෘදු ලෙස තද කර ඇත.අවසාන වශයෙන්, උපාංගය මත ඉලෙක්ට්රෝඩ පියන තබා උපාංගය ඉන්කියුබේටරය වෙත මාරු කරන්න.ඉන්පසු CTCM වායු නලයට සහ C-PACE-EM පද්ධතියට සම්බන්ධ කරන්න.වායුමය ක්‍රියාකාරකය විවෘත වන අතර වායු කපාටය CTCM විවෘත කරයි.C-PACE-EM පද්ධතිය ද්විපාර්ශ්වික වේගය 2 ms සඳහා 1.2 Hz දී 4 V ලබා දීමට වින්‍යාස කර ඇත.දිනකට දෙවරක් මාධ්යය වෙනස් කරන ලද අතර ඉලෙක්ට්රෝඩ මත මිනිරන් සමුච්චය වීම වැළැක්වීම සඳහා දිනකට එක් වරක් ඉලෙක්ට්රෝඩ වෙනස් කරන ලදී.අවශ්‍ය නම්, පටක කොටස් ඒවායේ සංස්කෘතික ළිංවලින් ඉවත් කර ඒවාට යටින් වැටී ඇති වායු බුබුලු ඉවත් කළ හැකිය.MT ප්‍රතිකාර තත්ත්වයන් සඳහා, 100 nM T3 සහ 1 μM ඩෙක්ස් සමඟ එක් එක් මධ්‍යම වෙනස සමඟ T3/Dex නැවුම් ලෙස එකතු කරන ලදී.CTCM උපාංග 37 ° C සහ 5% CO2 හි ඉන්කියුබේටරයක වගා කරන ලදී.
හෘද පෙති වල දිගු වූ ගමන් මාර්ග ලබා ගැනීම සඳහා විශේෂ කැමරා පද්ධතියක් සංවර්ධනය කරන ලදී.SLR කැමරාවක් (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA) සමඟ භාවිතා කරන ලදී.නැවුම් මාධ්යය සමඟ මාධ්යය ප්රතිස්ථාපනය කිරීමෙන් පසු කාමර උෂ්ණත්වයේ දී දෘශ්යකරණය සිදු කරන ලදී.කැමරාව 51° කෝණයක ස්ථානගත කර ඇති අතර තත්පරයකට රාමු 30 බැගින් වීඩියෝ පටිගත කෙරේ.පළමුව, විවෘත කේත මෘදුකාංගය (MUSCLEMOTION43) හෘද පෙති වල චලනය ගණනය කිරීම සඳහා Image-J සමඟ භාවිතා කරන ලදී.මෙම වෙස් මුහුණ නිර්මාණය කර ඇත්තේ MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) භාවිතයෙන් ශබ්දය වළක්වා ගැනීම සඳහා හෘද පෙති වලට පහර දීම සඳහා උනන්දුවක් දක්වන කලාප නිර්වචනය කිරීම සඳහා ය.අතින් ඛණ්ඩනය කරන ලද වෙස් මුහුණු රාමු අනුපිළිවෙලක සියලුම රූප සඳහා යොදනු ලබන අතර පසුව MUSCLEMOTION ප්ලග්-ඉන් වෙත යවනු ලැබේ.මාංශ පේශි චලිතය සමුද්දේශ රාමුවට සාපේක්ෂව එහි චලනය ප්‍රමාණ කිරීමට එක් එක් රාමුවේ පික්සෙල් වල සාමාන්‍ය තීව්‍රතාවය භාවිතා කරයි.දත්ත සටහන් කර, පෙරීමට සහ චක්‍ර කාලය ප්‍රමාණ කිරීමට සහ හෘද චක්‍රය තුළ පටක දිගුව තක්සේරු කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.පටිගත කරන ලද වීඩියෝව පළමු-ඇණවුම ශුන්‍ය-අදියර ඩිජිටල් පෙරහන භාවිතයෙන් පසු-සකසන ලදී.පටක දිගුව (උච්ච-උච්ච) ප්‍රමාණ කිරීම සඳහා, වාර්තාගත සංඥාවේ උච්ච සහ අගල අතර වෙනස හඳුනා ගැනීම සඳහා උච්ච-උච්ච විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.මීට අමතරව, සංඥා ප්ලාවිතය තුරන් කිරීම සඳහා 6 වන අනුපිළිවෙල බහුපදයක් භාවිතා කරමින් detrending සිදු කරනු ලැබේ.ගෝලීය පටක චලිතය, චක්‍ර කාලය, විවේක කාලය සහ හැකිලීමේ කාලය තීරණය කිරීම සඳහා MATLAB හි වැඩසටහන් කේතය සංවර්ධනය කරන ලදී (පරිපූරක වැඩසටහන් කේතය 44).
වික්‍රියා විශ්ලේෂණය සඳහා, යාන්ත්‍රික දිගු තක්සේරුව සඳහා නිර්මාණය කරන ලද වීඩියෝ භාවිතා කරමින්, අපි මුලින්ම MUSCLEMOTION මෘදුකාංගයට අනුව චලන ශිඛර (ඉහළ (ඉහළ) සහ පහළම (පහළ) චලිත ලක්ෂ්‍ය) නියෝජනය කරන රූප දෙකක් සොයා ගත්තෙමු.පසුව අපි පටක කලාප ඛණ්ඩනය කර ඛණ්ඩිත පටක වලට සෙවන ඇල්ගොරිතමයක් යොදන්නෙමු (පරිපූරක Fig. 2a).ඛණ්ඩනය කරන ලද පටක උප මතුපිට දහයකට බෙදා ඇති අතර, එක් එක් පෘෂ්ඨයේ ආතතිය පහත සමීකරණය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, එහිදී Sup සහ Sdown යනු පිළිවෙලින් රෙදිපිළිවල ඉහළ සහ පහළ සෙවනැලි වලින් හැඩයේ දුර වේ (පරිපූරක Fig. .2b).
හෘද කොටස් පැය 48 ක් සඳහා 4% paraformaldehyde හි සවි කර ඇත.ස්ථාවර පටක පැය 1 ක් සඳහා 10% සහ 20% සුක්‍රෝස් වලින් විජලනය කරන ලදී, පසුව 30% සුක්‍රෝස් එක රැයකින්.කොටස් පසුව ප්‍රශස්ත කැපුම් උෂ්ණත්ව සංයෝගයක (OCT සංයෝගය) තැන්පත් කර ක්‍රමයෙන් අයිසොපෙන්ටේන්/වියළි අයිස් ස්නානයක ශීත කළ.OCT කාවැද්දීම කුට්ටි -80 °C දී වෙන් වන තෙක් ගබඩා කරන්න.ස්ලයිඩ 8 μm ඝණකම සහිත කොටස් ලෙස සකස් කර ඇත.
හෘද කොටස් වලින් OCT ඉවත් කිරීම සඳහා, විනාඩි 5 ක් සඳහා 95 ° C දී තාපන කුට්ටියක ස්ලයිඩ රත් කරන්න.සෑම ස්ලයිඩයකටම මිලිලීටර් 1ක් PBS එකතු කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30ක් ඉන්කිබියුට් කරන්න, ඉන්පසු කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 15ක් PBS හි 0.1% ට්‍රයිටන්-එක්ස් සැකසීමෙන් කොටස් විනිවිද යන්න.විශේෂිත නොවන ප්‍රතිදේහ නියැදියට බැඳීම වැළැක්වීම සඳහා, ස්ලයිඩවලට 3% BSA ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 1 ක් එකතු කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් පුර්වාංගගත කරන්න.පසුව BSA ඉවත් කරන ලද අතර ස්ලයිඩ PBS සමඟ සෝදා ඇත.සෑම සාම්පලයක්ම පැන්සලකින් සලකුණු කරන්න.ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ (1% BSA හි 1:200 තනුක කර ඇත) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) සහ troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) පසුව තත්පර 90 ට වැඩි ප්‍රතිදේහ (BSA:12960) ප්‍රතිදේහ 90 කින් එකතු කරන ලදී. මූසිකයට එරෙහිව Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), හාවාට එරෙහිව Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) විනාඩි 90ක් PBS සමඟ 3 වතාවක් සෝදා, ඉලක්කගත පැල්ලම් පසුබිමෙන් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට, අපි අවසානයේ න්‍යෂ්ටික ප්‍රතිදේහයක් ලෙස භාවිතා කළේ න්‍යෂ්ටික ප්‍රතිදේහයක් ලෙසයි. ield (Vector Laboratories) සහ නිය ආලේපන වලින් මුද්‍රා කර ඇත -x විශාලනය) සහ 40x විශාලනය සහිත Keyence අන්වීක්ෂය.
PBS හි 5 μg/ml හි WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA පැල්ලම් සඳහා භාවිතා කරන ලද අතර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් සඳහා ස්ථාවර කොටස් සඳහා යොදන ලදී.ස්ලයිඩ පසුව PBS වලින් සෝදාගත් අතර සෑම ස්ලයිඩයකටම සුඩාන කළු එකතු කර විනාඩි 30 ක් පුර්ව කථනය කරන ලදී.පසුව විනිවිදක PBS සමඟ සෝදාගත් අතර vectshield කාවැද්දීමේ මාධ්‍යය එකතු කරන ලදී.ස්ලයිඩ 40x විශාලනයකදී Keyence අන්වීක්ෂයකින් දර්ශනය විය.
OCT ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි සාම්පල වලින් ඉවත් කරන ලදී.OCT ඉවත් කිරීමෙන් පසු, ස්ලයිඩ එක රැයකින් Bouin විසඳුමේ ගිල්වන්න.ස්ලයිඩ පසුව පැය 1 ක් සඳහා ආස්රැත ජලයෙන් සෝදා, පසුව විනාඩි 10 ක් සඳහා Bibrich කෝමාරිකා අම්ලය fuchsin ද්රාවණයක තබා ඇත.එවිට ස්ලයිඩ ආස්රැත ජලයෙන් සෝදා විනාඩි 10 ක් සඳහා 5% ෆොස්ෆොමොලිබ්ඩිනම් / 5% ෆොස්ෆොටුන්ස්ටික් අම්ලය ද්රාවණයක තබා ඇත.සේදීමකින් තොරව, මිනිත්තු 15 ක් සඳහා ඇනිලීන් නිල් ද්රාවණයට විනිවිදක සෘජුවම මාරු කරන්න.එවිට ස්ලයිඩ ආස්රැත ජලයෙන් සෝදා, විනාඩි 2 ක් සඳහා 1% ඇසිටික් අම්ල ද්රාවණයක තබා ඇත.ස්ලයිඩ 200 N එතනෝල් වලින් වියලන ලද අතර සයිලීන් වෙත මාරු කරන ලදී.10x අරමුණක් සහිත Keyence අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් පැල්ලම් සහිත විනිවිදක දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.ෆයිබ්‍රොසිස් ප්‍රදේශයේ ප්‍රතිශතය Keyence Analyzer මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), නාමාවලිය අංක V13154, නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව සමහර වෙනස් කිරීම්.විශේෂයෙන්ම, MTT විශ්ලේෂණය අතරතුර ඒකාකාර පටක ප්රමාණය සහතික කිරීම සඳහා 6 mm විෂ්කම්භයක් සහිත ශල්ය පන්ච් භාවිතා කරන ලදී.නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව MTT උපස්ථරයක් අඩංගු ළිං 12 තහඩුවක ළිං තුළට පටක තනි තනිව ආලේප කර ඇත.මෙම කොටස් පැය 3ක් සඳහා 37° C. උෂ්ණත්වයේ තැන්පත් කර ඇති අතර සජීවී පටක MTT උපස්ථරය පරිවෘත්තීය කර දම් පැහැති formazan සංයෝගයක් සාදයි.MTT ද්‍රාවණය 1 ml DMSO සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කර 37 °C දී විනාඩි 15ක් පුරවා හෘද කොටස් වලින් දම්පාට formazan නිස්සාරණය කරන්න.නියැදි 1:10 DMSO හි 96-ළිං පැහැදිලි පහළ තහඩු සහ දම් වර්ණ තීව්‍රතාවය 570 nm දී Cytation plate reader (BioTek) භාවිතා කර තනුක කර ඇත.හදවතේ සෑම පෙත්තකම බරට කියවීම සාමාන්‍යකරණය කර ඇත.
හෘද පෙති මාධ්‍ය 1 μCi/ml [5-3H]-ග්ලූකෝස් (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) අඩංගු මාධ්‍ය සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද්දේ පෙර විස්තර කර ඇති පරිදි ග්ලූකෝස් උපයෝගිතා විශ්ලේෂණය සඳහා ය.ඉන්කියුබේෂන් පැය 4 කට පසු, 0.2 N HCl 100 µl අඩංගු විවෘත ක්ෂුද්‍ර කේන්ද්‍රාපසාරී නලයකට මධ්‍යම 100 µl එකතු කරන්න.ඉන්පසුව 37°C උෂ්ණත්වයකදී පැය 72ක් [3H]2O වාෂ්ප වීම සඳහා 500 μl dH2O අඩංගු සින්ටිලේෂන් බටයක බටය තබන ලදී.ඉන්පසු සින්ටිලේෂන් බටයෙන් ක්ෂුද්‍ර කේන්ද්‍රාපසාරී බටය ඉවත් කර සින්ටිලේෂන් තරල මිලි ලීටර් 10 ක් එකතු කරන්න.ට්‍රයි-කාබ් 2900TR ද්‍රව සින්ටිලේෂන් ඇනලයිසර් (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) භාවිතයෙන් Scintillation ගණන් සිදු කරන ලදී.පසුව ග්ලූකෝස් භාවිතය [5-3H]-ග්ලූකෝස් නිශ්චිත ක්‍රියාකාරකම්, අසම්පූර්ණ සමතුලිතතාවය සහ පසුබිම, [5-3H]-ලේබල් නොකළ ග්ලූකෝස් වෙත තනුක කිරීම සහ සින්ටිලේෂන් කවුන්ටරයේ කාර්යක්ෂමතාව සැලකිල්ලට ගනිමින් ගණනය කරන ලදී.දත්ත හෘදයේ කොටස් ස්කන්ධයට සාමාන්‍යකරණය කර ඇත.
ට්‍රයිසෝල් හි පටක සමජාතීයකරණයෙන් පසුව, නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 භාවිතයෙන් RNA හෘද කොටස් වලින් හුදකලා විය.RNAsec පුස්තකාලය සකස් කිරීම, අනුක්‍රමණය කිරීම සහ දත්ත විශ්ලේෂණය පහත පරිදි සිදු කරන ලදී:
RNA පුස්තකාලය සකස් කිරීම සඳහා ආරම්භක ද්‍රව්‍ය ලෙස නියැදියකට 1 μg RNA භාවිතා කරන ලදී.නිෂ්පාදකයාගේ නිර්දේශ අනුව Illumina (NEB, USA) සඳහා NEBNext UltraTM RNA පුස්තකාල සූදානම් කිරීමේ කට්ටලය භාවිතයෙන් අනුක්‍රමික පුස්තකාල උත්පාදනය කරන ලද අතර, එක් එක් නියැදිය සඳහා ගුණාංග අනුපිළිවෙලට දර්ශක කේත එක් කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, බහු-ටී ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ සමඟ අමුණා ඇති චුම්බක පබළු භාවිතයෙන් mRNA සම්පූර්ණ RNA වලින් පිරිසිදු කරන ලදී.NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) හි ඉහළ උෂ්ණත්වයකදී divalent කැටායන භාවිතයෙන් ඛණ්ඩනය සිදු කෙරේ.සසම්භාවී හෙක්සැමර් ප්‍රයිමර් සහ M-MuLV ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් (RNase H-) භාවිතයෙන් පළමු strand cDNA සංස්ලේෂණය කරන ලදී.දෙවන කෙඳි cDNA පසුව DNA පොලිමරේස් I සහ RNase H භාවිතයෙන් සංස්ලේෂණය කරනු ලැබේ. ඉතිරි උඩින් ඇති කොටස් exonuclease/polymerase ක්‍රියාකාරකම් මගින් මොට කෙළවර බවට පරිවර්තනය වේ.DNA ඛණ්ඩයේ 3′ අන්තයේ adenylation පසු, දෙමුහුන් කිරීම සඳහා එය සූදානම් කිරීම සඳහා hairpin loop ව්යුහයක් සහිත NEBNext ඇඩැප්ටරයක් ​​එයට සම්බන්ධ කර ඇත.කැමති දිග 150-200 bp cDNA කොටස් තෝරාගැනීම සඳහා.AMPure XP පද්ධතිය භාවිතයෙන් පුස්තකාල කොටස් පිරිසිදු කරන ලදී (Beckman Coulter, Beverly, USA).ඉන්පසුව, 3 μl පරිශීලක එන්සයිම (NEB, USA) ප්‍රමාණයෙන් තෝරාගත් cDNA ඇඩැප්ටරයක් ​​සමඟ බන්ධනය කර විනාඩි 15 ක් 37 ° C දී සහ පසුව PCR ට පෙර 95 ° C දී විනාඩි 5 ක් භාවිතා කරන ලදී.PCR පසුව Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR ප්‍රයිමර් සහ Index (X) ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.අවසාන වශයෙන්, PCR නිෂ්පාදන පිරිසිදු කරන ලදී (AMPure XP පද්ධතිය) සහ Agilent Bioanalyzer 2100 පද්ධතියක් මත පුස්තකාලයේ ගුණාත්මකභාවය තක්සේරු කරන ලදී.cDNA පුස්තකාලය Novaseq අනුක්‍රමයක් භාවිතයෙන් අනුක්‍රමණය කරන ලදී.Illumina වෙතින් අමු රූප ගොනු CASAVA Base Calling භාවිතයෙන් අමු කියවීම් බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.අමු දත්ත FASTQ(fq) ආකෘති ගොනු වල ගබඩා කර ඇති අතර ඒවා කියවීමේ අනුපිළිවෙල සහ අනුරූප මූලික ගුණාංග අඩංගු වේ.Sscrofa11.1 යොමු ජෙනෝමය වෙත පෙරන ලද අනුක්‍රමික කියවීම් ගැලපීමට HISAT2 තෝරන්න.සාමාන්‍යයෙන්, HISAT2 පදනම් බිලියන 4කට වඩා විශාල ජෙනෝම ඇතුළු ඕනෑම ප්‍රමාණයක ජෙනෝම සඳහා සහය දක්වයි, සහ බොහෝ පරාමිති සඳහා පෙරනිමි අගයන් සකසා ඇත.අනෙකුත් ඕනෑම ක්‍රමයකට වඩා සමාන හෝ වඩා හොඳ නිරවද්‍යතාවයකින් දැනට පවතින වේගවත්ම පද්ධතිය වන HISAT2 භාවිතයෙන් RNA Seq දත්තවල කියවීම් කාර්යක්ෂමව පෙළගැස්විය හැක.
පිටපත් වල බහුලත්වය ජාන ප්‍රකාශනයේ මට්ටම කෙලින්ම පිළිබිඹු කරයි.ජාන ප්‍රකාශන මට්ටම් තක්සේරු කරනු ලබන්නේ ජෙනෝමය හෝ එක්සෝන හා සම්බන්ධ පිටපත් (අනුක්‍රමික ගණන) බහුලත්වය මගිනි.කියවීම් ගණන ජාන ප්‍රකාශන මට්ටම්, ජාන දිග සහ අනුක්‍රමික ගැඹුරට සමානුපාතික වේ.FPKM (පාදක යුගල මිලියනයකට අනුපිළිවෙලින් අනුපිළිවෙලින් පිටපත් පාදක යුගල දහසකට කොටස්) ගණනය කරන ලද අතර DESeq2 පැකේජය භාවිතයෙන් අවකල ප්‍රකාශනයේ P-අගය තීරණය කරන ලදී.අපි පසුව එක් එක් P අගය සඳහා ව්‍යාජ සොයාගැනීම් අනුපාතය (FDR) ගණනය කළේ බෙන්ජමිනි-හොච්බර්ග් ක්‍රමය9 භාවිතා කර ගොඩනගා ඇති R-function "p.adjust" මත පදනම්වය.
Thermo (Thermo, cat. no. 11756050) වෙතින් SuperScript IV Vilo Master මිශ්‍රණය භාවිතයෙන් හෘද කොටස්වලින් වෙන් කරන ලද RNA 200 ng/μl සාන්ද්‍රණයකින් cDNA බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.ප්‍රමාණාත්මක RT-PCR සිදු කරන ලද්දේ ව්‍යවහාරික ජෛව පද්ධති Endura Plate Microamp 384-හොඳින් විනිවිද පෙනෙන ප්‍රතික්‍රියා තහඩුවක් (Thermo, cat. no. 4483319) සහ microamp දෘශ්‍ය මැලියම් (Thermo, cat. අංක 4311971) භාවිතා කරමිනි.ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය 5 µl Taqman Fast Advanced Master මිශ්‍රණය (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer සහ 3.5 µl H2O මිශ්‍ර ළිඳකින් සමන්විත විය.සම්මත qPCR චක්‍ර ක්‍රියාත්මක කරන ලද අතර CT අගයන් මනිනු ලැබුවේ ව්‍යවහාරික ජෛව පද්ධති Quantstudio 5 තත්‍ය කාලීන PCR උපකරණයක් (384-ළිං මොඩියුලය; නිෂ්පාදන # A28135) භාවිතා කරමිනි.Taqman ප්‍රයිමර් Thermo වෙතින් මිලදී ගෙන ඇත (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S801801), 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss0424 ට සාම්පල සියලු සාම්පලවල සාමාන්‍ය අගය 588425 දක්වා) ජාන GAPDH.
NT-ProBNP හි මාධ්‍ය නිකුතුව නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව NT-ProBNP කට්ටලය (ඌරු) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) භාවිතයෙන් තක්සේරු කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, එක් එක් සාම්පලයේ සහ ප්‍රමිතියෙන් 250 µl බැගින් සෑම ළිඳකටම අනුපිටපත් ලෙස එක් කරන ලදී.නියැදිය එකතු කළ විගසම එක් එක් ළිඳට Assay Reagent A 50 µl එකතු කරන්න.තහඩුව මෘදු ලෙස සොලවන්න සහ සීලන්ට් සමඟ මුද්රා කරන්න.ඉන්පසු පෙති පැය 1 ක් සඳහා 37 ° C උෂ්ණත්වයේ තබා ඇත.ඉන්පසු ද්‍රාවණය උරාගෙන ළිං 350 µl 1X වොෂ් ද්‍රාවණයකින් 4 වරක් සෝදන්න, සෑම අවස්ථාවකදීම වොෂ් ද්‍රාවණය විනාඩි 1-2ක් පුර්වාගත කරන්න.ඉන්පසු ළිඳකට Assay Reagent B 100 µl එකතු කර තහඩු සීලන්ට් එකකින් මුද්‍රා කරන්න.ටැබ්ලට් එක මෘදු ලෙස සොලවා විනාඩි 30 ක් සඳහා 37 ° C උෂ්ණත්වයකදී ඉන්කියුටේට් කර ඇත.ද්‍රාවණය උද්දීපනය කර ළිං 350 µl 1X සේදුම් ද්‍රාවණයකින් 5 වරක් සෝදන්න.සෑම ළිඳකටම උපස්ථර ද්‍රාවණ 90 µl එකතු කර තහඩුව මුද්‍රා කරන්න.මිනිත්තු 10-20 ක් සඳහා 37 ° C දී තහඩුව පුර්ව ගන්වන්න.සෑම ළිඳකටම 50 µl Stop Solution එක් කරන්න.450 nm හි ඇති Cytation (BioTek) තහඩු කියවනය භාවිතයෙන් තහඩුව වහාම මනිනු ලැබීය.
5% I Type I දෝෂ අනුපාතයක් සමඟ පරාමිතියෙහි 10% නිරපේක්ෂ වෙනසක් හඳුනා ගැනීමට > 80% බලය සපයන කණ්ඩායම් ප්‍රමාණ තෝරා ගැනීමට බල විශ්ලේෂණ සිදු කරන ලදී. 5% I Type I දෝෂ අනුපාතයක් සමඟ පරාමිතියෙහි 10% නිරපේක්ෂ වෙනසක් හඳුනා ගැනීමට > 80% බලය සපයන කණ්ඩායම් ප්‍රමාණ තෝරා ගැනීමට බල විශ්ලේෂණ සිදු කරන ලදී. ඇනලිස් මොස්නොස්ටි බ්ලයිල් වයිපොල්නෙන් ඩයිල් වයිබොරා රැස්මෙරොව් ග්‍රප්ප්, කොටෝර්ස් ඔබෙස්පෙචට්>80% මොස්නොස්ටි %100 5% ක්‍ෂෙටෝටෝයි ඔෂිබොක් ටිපා අයි. 5% Type I දෝෂ අනුපාතයක් සමඟින් 10% නිරපේක්ෂ පරාමිති වෙනසක් හඳුනා ගැනීමට > 80% බලය සපයන කණ්ඩායම් ප්‍රමාණ තෝරා ගැනීමට බල විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5 බිල් ප්‍රොවෙඩන් ඇනලිස් මොස්නොස්ටි ඩයිල් වයිබෝරා රෙස්මේරා ග්‍රප්පි, කෝටර් ඔබෙස්පෙචිල් බී > 80% මොස්නොස්ටි %01 ного изменения параметров සහ 5% චස්ටෝට් ඔෂිබොක් ටිපා අයි. 10% නිරපේක්ෂ පරාමිති වෙනස් වීම සහ 5% වර්ගයේ I දෝෂ අනුපාතය හඳුනා ගැනීමට >80% බලය සපයන කණ්ඩායම් ප්‍රමාණය තේරීම සඳහා බල විශ්ලේෂණයක් සිදු කරන ලදී.පරීක්ෂණයට පෙර පටක කොටස් අහඹු ලෙස තෝරා ගන්නා ලදී.සියලුම විශ්ලේෂණ තත්ත්ව අන්ධ වූ අතර සාම්පල විකේතනය කරනු ලැබුවේ සියලු දත්ත විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් පසුව පමණි.සියලුම සංඛ්‍යාන විශ්ලේෂණ සිදු කිරීමට GraphPad Prism මෘදුකාංගය (San Diego, CA) භාවිතා කරන ලදී. සියලුම සංඛ්‍යාලේඛන සඳහා, p-අගය <0.05 අගයන්හිදී සැලකිය යුතු ලෙස සලකනු ලැබේ. සියලුම සංඛ්‍යාලේඛන සඳහා, p-අගය <0.05 අගයන්හිදී සැලකිය යුතු ලෙස සලකනු ලැබේ. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. සියලුම සංඛ්‍යාලේඛන සඳහා, p-අගය <0.05 අගයන්හිදී සැලකිය යුතු ලෙස සලකනු ලැබේ.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. සියලුම සංඛ්‍යාලේඛන සඳහා, p-අගය <0.05 අගයන්හිදී සැලකිය යුතු ලෙස සලකනු ලැබේ.ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයාගේ ටී-පරීක්‍ෂණය දත්ත මත සිදු කරන ලද්දේ සැසඳීම් 2ක් පමණි.බහු කණ්ඩායම් අතර වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා එක්-මාර්ග හෝ ද්වි-මාර්ග ANOVA භාවිතා කරන ලදී.පශ්චාත් hoc පරීක්ෂණ සිදු කරන විට, බහු සංසන්දනය සඳහා ටුකේගේ නිවැරදි කිරීම අදාළ විය.RNAsec දත්ත FDR ගණනය කිරීමේදී විශේෂ සංඛ්‍යානමය සලකා බැලීම් සහ ක්‍රම කොටසේ විස්තර කර ඇති p.adjust ඇත.
අධ්‍යයන සැලසුම් පිළිබඳ වැඩි විස්තර සඳහා, මෙම ලිපියට සම්බන්ධ කර ඇති ස්වභාව පර්යේෂණ වාර්තාව සාරාංශය බලන්න.