Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Morfogenéza ľudského čreva vytvára kryptovo-klkové vlastnosti 3D epitelovej mikroarchitektúry a priestorovej organizácie. Táto jedinečná štruktúra je potrebná na udržanie homeostázy čreva ochranou výklenku kmeňových buniek v bazálnej krypte pred exogénnymi mikrobiálnymi antigénmi a ich metabolitmi. Okrem toho črevné klky a vylučujúci hlien predstavujú funkčne diferencované epitelové bunky s ochrannou bariérou na povrchu črevnej sliznice. Preto je obnovenie 3D epitelových štruktúr kľúčové pre konštrukciu in vitro modelov čreva. Je pozoruhodné, že organické mimetické črevo na čipe môže indukovať spontánnu 3D morfogenézu črevného epitelu so zlepšenými fyziologickými funkciami a biomechanikou. Tu poskytujeme reprodukovateľný protokol na robustnú indukciu črevnej morfogenézy v čreve na mikrofluidnom čipe, ako aj na vloženom hybridnom čipe Transwell. Opisujeme podrobné metódy výroby zariadení, kultivácie Caco-2 alebo črevných organoidných epitelových buniek v konvenčných prostrediach, ako aj na mikrofluidnej platforme, indukcie 3D morfogenézy a charakterizácie vytvoreného 3D epitelu pomocou viacerých zobrazovacích modalít. Tento protokol dosahuje regeneráciu funkčnej črevnej mikroarchitektúry riadením bazolaterálneho prietoku tekutiny počas 5 dní. Naša metóda morfogenézy in vitro využíva fyziologicky relevantné šmykové napätie a mechanický pohyb a nevyžaduje zložité bunkové inžinierstvo alebo manipuláciu, čo môže prekonať iné existujúce techniky. Predpokladáme, že náš navrhovaný protokol by mohol mať široké dôsledky pre biomedicínsku výskumnú komunitu a poskytnúť metódu regenerácie 3D vrstiev črevného epitelu in vitro pre biomedicínske, klinické a farmaceutické aplikácie.
Experimenty ukazujú, že črevné epitelové bunky Caco-2 kultivované v zariadeniach typu „gut-on-a-chip“1,2,3,4,5 alebo v dvojvrstvových mikrofluidných zariadeniach6,7 môžu podstúpiť spontánnu 3D morfogenézu in vitro bez jasného pochopenia základného mechanizmu. V našej nedávnej štúdii sme zistili, že odstránenie bazolaterálne sekretovaných antagonistov morfogénu z kultivačných zariadení je nevyhnutné a dostatočné na vyvolanie 3D epitelovej morfogenézy in vitro, čo bolo preukázané pomocou Caco-2 a črevných organoidov odvodených od pacienta. Epitelové bunky boli validované. V tejto štúdii sme sa špecificky zamerali na produkciu buniek a distribúciu koncentrácie silného Wnt antagonistu, Dickkopf-1 (DKK-1), v črevách na čipe a modifikovaných mikrofluidných zariadeniach obsahujúcich vložky Transwell, nazývaných „hybridný čip“. Preukázali sme, že pridanie exogénnych Wnt antagonistov (ako je DKK-1, Wnt represor 1, sekretovaný proteín frizzled-related protein 1 alebo Soggy-1) do čreva na čipe inhibuje morfogenézu alebo narúša predštruktúrovanú 3D epitelovú vrstvu, čo naznačuje, že antagonistický stres počas kultivácie je zodpovedný za črevnú morfogenézu in vitro. Preto praktickým prístupom k dosiahnutiu robustnej morfogenézy na epitelovom rozhraní je odstránenie alebo minimálne udržanie hladín Wnt antagonistov v bazolaterálnom kompartmente aktívnym preplachovaním (napr. v platformách gut-on-a-chip alebo hybrid-on-a-chip) alebo difúziou v bazolaterálnych médiách (napr. z vložiek Transwell do veľkých bazolaterálnych rezervoárov v jamkách).
V tomto protokole poskytujeme podrobný postup výroby mikrozariadení typu „črevo na čipe“ a hybridných čipov vložiteľných do Transwell (kroky 1 – 5) na kultiváciu črevných epitelových buniek na poréznych membránach na báze polydimetylsiloxánu (PDMS) (kroky 6A, 7A, 8, 9) alebo polyesterových membránach vložiek Transwell (kroky 6B, 7B, 8, 9) a indukciu 3D morfogenézy in vitro (krok 10). Identifikovali sme aj bunkové a molekulárne znaky indikujúce tkanivovo špecifickú histogenézu a bunkovú diferenciáciu závislú od línie použitím viacerých zobrazovacích modalít (kroky 11 – 24). Morfogenézu indukujeme pomocou ľudských črevných epitelových buniek, ako je Caco-2 alebo črevné organoidy, v dvoch kultivačných formátoch s technickými detailmi vrátane modifikácie povrchu poréznych membrán, vytvorenia 2D monovrstiev a črevnej biochemickej a reprodukčnej aktivity biomechanického mikroprostredia in vitro. Na indukciu 3D morfogenézy z 2D epitelových monovrstiev sme odstránili antagonistov morfogénov v oboch kultivovaných formách prúdením... médium do bazolaterálneho kompartmentu kultúry. Nakoniec poskytujeme znázornenie užitočnosti regenerovateľnej 3D epitelovej vrstvy, ktorú možno použiť na modelovanie rastu epitelu závislého od morfogénu, longitudinálnych kokultúr hostiteľa a mikrobiómu, infekcie patogénmi, zápalového poškodenia, dysfunkcie epitelovej bariéry a terapií založených na probiotikách. Príklad vplyvov.
Náš protokol môže byť užitočný pre široké spektrum vedcov v základnom (napr. biológia črevnej sliznice, biológia kmeňových buniek a vývojová biológia) a aplikovanom výskume (napr. predklinické testovanie liekov, modelovanie chorôb, tkanivové inžinierstvo a gastroenterológia) so širokým dosahom. Vzhľadom na reprodukovateľnosť a robustnosť nášho protokolu na indukciu 3D morfogenézy črevného epitelu in vitro predpokladáme, že našu technickú stratégiu možno šíriť medzi publikum, ktoré študuje dynamiku bunkovej signalizácie počas vývoja, regenerácie alebo homeostázy čriev. Okrem toho je náš protokol užitočný na skúmanie infekcie spôsobenej rôznymi infekčnými agensmi, ako je Norovírus 8, koronavírus 2 spôsobujúci závažný akútny respiračný syndróm (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 alebo Vibrio cholerae. Užitočné sú aj cieľové skupiny patológie a patogenézy ochorení. Použitie systému črevnej mikrofyziológie na čipe môže umožniť longitudinálnu kokultiváciu 10 a následné posúdenie obranyschopnosti hostiteľa, imunitných odpovedí a opravy poranení súvisiacich s patogénmi v gastrointestinálnom (GI) trakte 11. Ďalšie poruchy GI spojené so syndrómom deravého čreva, celiakiou, Crohnovou chorobou, ulceróznou kolitídou, pouchitídou alebo syndrómom dráždivého čreva je možné simulovať, keď sa 3D črevné epitelové vrstvy pripravia s použitím 3D črevných epitelových vrstiev pacienta. Medzi tieto ochorenia patrí atrofia klkov, skrátenie krypty, poškodenie sliznice alebo zhoršená epitelová bariéra. Biopsia alebo črevné organoidy odvodené z kmeňových buniek 12,13. Pre lepšie modelovanie vyššej komplexnosti prostredia ochorenia môžu čitatelia zvážiť pridanie typov buniek relevantných pre ochorenie, ako sú napríklad mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) pacienta, do modelov obsahujúcich 3D mikroarchitektúry črevných klkov a krypt. tkanivovo špecifické imunitné bunky, 5.
Keďže 3D epitelovú mikroštruktúru je možné fixovať a vizualizovať bez procesu rezania, diváci pracujúci na priestorovej transkriptomike a zobrazovaní s vysokým alebo superrozlíšením by mohli mať záujem o naše mapovanie časopriestorovej dynamiky génov a proteínov na epitelových výklenkoch. Záujem o technológie. Reakcia na mikrobiálne alebo imunitné podnety. Okrem toho, longitudinálne presluchy hostiteľa a mikrobiómu 10, 14, ktoré koordinujú homeostázu čreva, je možné vytvoriť v 3D vrstve črevnej sliznice spoločnou kultiváciou rôznych mikrobiálnych druhov, mikrobiálnych spoločenstiev alebo fekálnej mikrobioty, najmä v čreve na čipe. na platforme.Tento prístup je obzvlášť atraktívny pre publikum študujúce mukóznu imunológiu, gastroenterológiu, ľudský mikrobióm, kulturomiku a klinickú mikrobiológiu, ktoré sa snaží kultivovať doteraz nekultivovanú črevnú mikrobiotu v laboratóriu.Ak sa náš protokol morfogenézy in vitro dá prispôsobiť škálovateľným kultivačným formátom, ako sú napríklad viacjamkové vložky v 24-, 96- alebo 384-jamkových platniach, ktoré kontinuálne dopĺňajú bazolaterálne kompartmenty, protokol sa môže šíriť aj medzi tých, ktorí vyvíjajú farmaceutické, biomedicínske alebo vysokovýkonné skríningové alebo validačné platformy pre potravinársky priemysel.Ako dôkaz princípu sme nedávno preukázali uskutočniteľnosť multiplexného vysokovýkonného systému morfogenézy škálovateľného na 24-jamkový formát platne.Okrem toho boli komerčne dostupné viaceré produkty typu organ-on-a-chip16,17,18.Validáciu našej metódy morfogenézy in vitro preto môžu urýchliť a potenciálne ju môžu prijať mnohé výskumné laboratóriá, priemysel alebo vládne a regulačné agentúry, aby pochopili bunkové preprogramovanie črevnej morfogenézy in vitro na transkriptomickej úrovni na testovanie liekov alebo bioterapeutík. Absorpcia a Transport kandidátov na liečivá bol hodnotený pomocou 3D črevných náhrad alebo pomocou vlastných alebo komerčných modelov orgánov na čipe na posúdenie reprodukovateľnosti procesu morfogenézy čriev.
Na štúdium morfogenézy črevného epitelu sa použil obmedzený počet experimentálnych modelov relevantných pre človeka, najmä kvôli nedostatku implementovateľných protokolov na indukciu 3D morfogenézy in vitro. V skutočnosti je veľká časť súčasných poznatkov o morfogenéze čriev založená na štúdiách na zvieratách (napr. zebričky20, myši21 alebo kurčatá22). Sú však náročné na pracovnú silu a náklady, môžu byť eticky otázne a čo je najdôležitejšie, presne neurčujú procesy ľudského vývoja. Tieto modely sú tiež veľmi obmedzené v ich schopnosti testovať sa viacstranne škálovateľným spôsobom. Preto náš protokol na regeneráciu 3D tkanivových štruktúr in vitro prekonáva zvieracie modely in vivo, ako aj iné tradičné statické 2D modely bunkových kultúr. Ako už bolo opísané, využitie 3D epitelových štruktúr nám umožnilo skúmať priestorovú lokalizáciu diferencovaných buniek v osi krypta-klky v reakcii na rôzne slizničné alebo imunitné stimuly. 3D epitelové vrstvy môžu poskytnúť priestor na štúdium toho, ako mikrobiálne bunky súťažia o vytvorenie priestorových výklenkov a ekologického vývoja v reakcii na faktory hostiteľa (napr. vnútorné verzus vonkajšie vrstvy hlienu, sekréciu IgA a antimikrobiálne peptidy). Okrem toho nám 3D epitelová morfológia umožňuje pochopiť, ako črevná mikrobiota štruktúruje svoje spoločenstvá a synergicky produkuje mikrobiálne metabolity (napr. mastné kyseliny s krátkym reťazcom), ktoré formujú bunkovú organizáciu a výklenky kmeňových buniek v bazálnych kryptách. Tieto vlastnosti je možné preukázať iba vtedy, keď sú 3D epitelové vrstvy vytvorené in vitro.
Okrem našej metódy vytvárania 3D štruktúr črevného epitelu existuje niekoľko metód in vitro. Kultúra črevných organoidov je najmodernejšia technika tkanivového inžinierstva založená na kultivácii črevných kmeňových buniek za špecifických morfogénnych podmienok23,24,25. Použitie 3D modelov organoidov na analýzu transportu alebo kokultúry hostiteľa a mikrobiómu je však často náročné, pretože črevný lúmen je uzavretý v organoide, a preto je zavedenie luminálnych zložiek, ako sú mikrobiálne bunky alebo exogénne antigény, obmedzené. Prístup k lúmenom organoidov je možné zlepšiť pomocou mikroinjektora26,27, ale táto metóda je invazívna a prácna a vyžaduje si špecializované znalosti. Okrem toho tradičné kultúry organoidov udržiavané v hydrogélových lešeniach za statických podmienok presne neodrážajú aktívnu biomechaniku in vivo.
Iné prístupy používané niekoľkými výskumnými skupinami využívajú predštruktúrované 3D hydrogélové lešenia na napodobnenie štruktúry črevného epitelu kultiváciou izolovaných ľudských črevných buniek na povrchu gélu. Vyrobte hydrogélové lešenia pomocou 3D tlačených, mikrofrézovaných alebo litograficky vyrobených foriem. Táto metóda ukazuje samoorganizované usporiadanie izolovaných epitelových buniek in vitro s fyziologicky relevantnými gradientmi morfogénov, čím sa vytvára epitelová štruktúra s vysokým pomerom strán a presluch stroma-epitel zahrnutím stromálnych buniek do lešenia. Povaha predštruktúrovaných lešení však môže brániť zobrazeniu samotného spontánneho morfogenetického procesu. Tieto modely tiež neposkytujú dynamický luminálny alebo intersticiálny tok, chýba im šmykové napätie tekutiny, ktoré črevné bunky potrebujú na to, aby prešli morfogenézou a získali fyziologickú funkciu. Ďalšia nedávna štúdia použila hydrogélové lešenia v mikrofluidickej platforme a vzorované črevné epitelové štruktúry pomocou techník laserového leptania. Myšie črevné organoidy sledujú leptané vzory a vytvárajú črevné tubulárne štruktúry a intraluminálny tok tekutiny je možné rekapitulovať pomocou mikrofluidického modulu. Tento model však nevykazuje ani spontánny... morfogenetické procesy ani nezahŕňa mechanobiologické pohyby čriev. Techniky 3D tlače z tej istej skupiny dokázali vytvoriť miniatúrne črevné trubice so spontánnymi morfogenetickými procesmi. Napriek komplexnej výrobe rôznych segmentov čreva v trubici tomuto modelu chýba aj tok luminálnej tekutiny a mechanická deformácia. Okrem toho môže byť funkčnosť modelu obmedzená, najmä po dokončení procesu biotlače, čo narúša experimentálne podmienky alebo interakcie medzi bunkami. Namiesto toho náš navrhovaný protokol poskytuje spontánnu morfogenézu čriev, fyziologicky relevantné šmykové napätie, biomechaniku, ktorá napodobňuje motilitu čriev, dostupnosť nezávislých apikálnych a bazolaterálnych kompartmentov a obnovu komplexných biologických mikroprostredí modularity. Preto môže náš protokol 3D morfogenézy in vitro poskytnúť doplnkový prístup k prekonaniu výziev existujúcich metód.
Náš protokol je úplne zameraný na 3D epitelovú morfogenézu, pričom v kultúre sú iba epitelové bunky a žiadne iné typy okolitých buniek, ako sú mezenchymálne bunky, endotelové bunky a imunitné bunky. Ako už bolo opísané, jadrom nášho protokolu je indukcia epitelovej morfogenézy odstránením inhibítorov morfogénov vylučovaných na bazolaterálnej strane zavedeného média. Zatiaľ čo robustná modularita nášho čreva na čipe a hybridu na čipe nám umožňuje znovu vytvoriť zvlnenú 3D epitelovú vrstvu, ďalšie biologické zložitosti, ako sú epitelovo-mezenchymálne interakcie33,34, ukladanie extracelulárnej matrice (ECM)35 a v našom modeli aj vlastnosti krypty a klkov, ktoré prenášajú výklenky kmeňových buniek v bazálnych kryptách, je potrebné ďalej zvážiť. Stromálne bunky (napr. fibroblasty) v mezenchýme hrajú kľúčovú úlohu v produkcii proteínov ECM a regulácii črevnej morfogenézy in vivo35,37,38. Pridanie mezenchymálnych buniek do nášho modelu zlepšilo morfogenetický proces a pripojenie buniek. účinnosť. Endotelová vrstva (t. j. kapiláry alebo lymfatické cievy) hrá dôležitú úlohu v regulácii molekulárneho transportu39 a náboru imunitných buniek40 v črevnom mikroprostredí. Okrem toho sú vaskulatúrne komponenty, ktoré je možné prepojiť medzi tkanivovými modelmi, nevyhnutným predpokladom, keď sú tkanivové modely navrhnuté tak, aby demonštrovali interakcie medzi viacerými orgánmi. Preto môže byť potrebné zahrnúť endotelové bunky, aby sa modelovali presnejšie fyziologické vlastnosti s rozlíšením na úrovni orgánov. Imunitné bunky odvodené od pacienta sú tiež nevyhnutné na zobrazenie vrodených imunitných odpovedí, prezentácie antigénov, vrodeného adaptívneho imunitného presluchu a tkanivovo špecifickej imunity v kontexte napodobňovania črevného ochorenia.
Použitie hybridných čipov je jednoduchšie ako použitie metódy „črevo na čipe“, pretože nastavenie zariadenia je jednoduchšie a použitie vložiek Transwell umožňuje škálovateľnú kultiváciu črevného epitelu. Komerčne dostupné vložky Transwell s polyesterovými membránami však nie sú elastické a nedokážu simulovať peristaltické pohyby. Okrem toho apikálny kompartment vložky Transwell umiestnenej v hybridnom čipe zostal stacionárny bez šmykového napätia na apikálnej strane. Statické vlastnosti apikálneho kompartmentu jednoznačne len zriedka umožňujú dlhodobú bakteriálnu kokultiváciu v hybridných čipoch. Hoci pri použití hybridných čipov dokážeme robustne indukovať 3D morfogenézu vo vložkách Transwell, nedostatok fyziologicky relevantnej biomechaniky a apikálneho toku tekutiny môže obmedziť uskutočniteľnosť hybridných čipových platforiem pre potenciálne aplikácie.
Úplné rekonštrukcie osi ľudskej krypty a klkov v kultúrach typu „črevo na čipe“ a „hybrid na čipe“ neboli úplne preukázané. Keďže morfogenéza začína z epitelovej monovrstvy, 3D mikroarchitektúry nemusia nevyhnutne poskytovať morfologickú podobnosť s kryptami in vivo. Hoci sme charakterizovali proliferujúcu bunkovú populáciu v blízkosti bazálnej domény krypty v mikroinžinierskom 3D epiteli, oblasti krypty a klkov neboli jasne vymedzené. Hoci vyššie horné kanály na čipe vedú k zvýšenej výške mikroinžinierskeho epitelu, maximálna výška je stále obmedzená na ~300–400 µm. Skutočná hĺbka ľudských črevných krypt v tenkom a hrubom čreve je ~135 µm a ~400 µm a výška klkov tenkého čreva je ~600 µm41.
Z hľadiska zobrazovania môže byť in situ zobrazovanie 3D mikroarchitektúr s vysokým rozlíšením obmedzené na črevo na čipe, pretože požadovaná pracovná vzdialenosť od objektívu k epitelovej vrstve je rádovo niekoľko milimetrov. Na prekonanie tohto problému môže byť potrebný vzdialený objektív. Okrem toho je výroba tenkých rezov na prípravu zobrazovacích vzoriek náročná kvôli vysokej elasticite PDMS. Okrem toho, keďže mikrofabrikácia čreva po vrstvách na čipe zahŕňa trvalú adhéziu medzi jednotlivými vrstvami, je mimoriadne náročné otvoriť alebo odstrániť hornú vrstvu na preskúmanie povrchovej štruktúry epitelovej vrstvy. Napríklad pomocou skenovacieho elektrónového mikroskopu (SEM).
Hydrofóbnosť PDMS bola limitujúcim faktorom v štúdiách založených na mikrofluidných metódach zaoberajúcich sa hydrofóbnymi malými molekulami, pretože PDMS dokáže nešpecificky adsorbovať takéto hydrofóbne molekuly. Alternatívy k PDMS možno zvážiť s inými polymérnymi materiálmi. Alternatívne možno zvážiť povrchovú modifikáciu PDMS (napr. potiahnutie lipofilnými materiálmi 42 alebo poly(etylénglykolom) 43), aby sa minimalizovala adsorpcia hydrofóbnych molekúl.
Naša metóda nakoniec nebola dobre charakterizovaná z hľadiska poskytovania vysokokapacitného skríningu alebo univerzálnej experimentálnej platformy, ktorá by bola užívateľsky prívetivá. Súčasný protokol vyžaduje injekčnú pumpu na mikrozariadenie, čo zaberá miesto v CO2 inkubátore a bráni rozsiahlym experimentom. Toto obmedzenie možno výrazne zlepšiť škálovateľnosťou inovatívnych kultivačných formátov (napr. 24-jamkové, 96-jamkové alebo 384-jamkové porézne vložky, ktoré umožňujú kontinuálne dopĺňanie a odstraňovanie bazolaterálneho média).
Na indukciu 3D morfogenézy ľudského črevného epitelu in vitro sme použili mikrofluidné čipové črevné zariadenie obsahujúce dva paralelné mikrokanály a elastickú pórovitú membránu medzi nimi na vytvorenie rozhrania lúmen-kapilára. Taktiež demonštrujeme použitie jednokanálového mikrofluidného zariadenia (hybridného čipu), ktoré zabezpečuje kontinuálny bazolaterálny tok pod polarizovanými epitelovými vrstvami pestovanými na vložkách Transwell. Na oboch platformách je možné demonštrovať morfogenézu rôznych ľudských črevných epitelových buniek aplikáciou smerovej manipulácie toku na odstránenie antagonistov morfogénov z bazolaterálneho kompartmentu. Celý experimentálny postup (obrázok 1) pozostáva z piatich častí: (i) mikrofabrikácia črevného čipu alebo vložiteľného hybridného čipu Transwell (kroky 1-5; rámček 1), (ii) príprava črevných epitelových buniek (bunky Caco-2) alebo ľudských črevných organoidov; rámčeky 2-5), (iii) kultivácia črevných epitelových buniek na črevných čipoch alebo hybridných čipoch (kroky 6-9), (iv) indukcia 3D morfogenézy in vitro (krok 10) a (v)) na charakterizáciu 3D epitelovej mikroštruktúry (kroky 11-24). Nakoniec bola navrhnutá vhodná kontrolná skupina (ďalej diskutovaná nižšie) na overenie účinnosti in vitro morfogenézy porovnaním epitelovej morfogenézy s priestorovými, časovými, podmienenými alebo procedurálnymi kontrolami.
Použili sme dve rôzne kultivačné platformy: črevo na čipe s priamymi kanálmi alebo nelineárnymi konvolučnými kanálmi alebo hybridné čipy obsahujúce vložky Transwell (TW) v mikrofluidnom zariadení, vyrobené podľa popisu v rámčeku 1 a krok 1-5. „Výroba zariadenia“ zobrazuje hlavné kroky pri výrobe jedného čipu alebo hybridného čipu. „Kultúra ľudských črevných epitelových buniek“ vysvetľuje zdroj buniek (Caco-2 alebo ľudské črevné organoidy) a kultivačný postup použitý v tomto protokole. „Morfogenéza in vitro“ zobrazuje celkové kroky, v ktorých sa epitelové bunky odvodené z Caco-2 alebo organoidov kultivujú na črevnom čipe alebo na vložkách Transwell hybridného čipu, po čom nasleduje indukcia 3D morfogenézy a tvorba charakterizovanej epitelovej štruktúry. Číslo kroku programu alebo číslo políčka sa zobrazuje pod každou šípkou. Aplikácia poskytuje príklady toho, ako možno použiť zavedené črevné epitelové vrstvy, napríklad pri charakterizácii bunkovej diferenciácie, štúdiách črevnej fyziológie, vytváraní ekosystémov hostiteľ-mikrobióm a modelovaní chorôb. Imunofluorescenčné snímky v časti „Diferenciácia buniek“. zobrazujúce jadrá, F-aktín a MUC2 exprimované v 3D epitelovej vrstve Caco-2 vytvorenej na črevnom čipe. Signalizácia MUC2 je prítomná v pohárikových bunkách a hliene vylučovanom z povrchov slizníc. Fluorescenčné obrazy v Gut Physiology zobrazujú hlien produkovaný farbením na zvyšky kyseliny sialovej a N-acetylglukozamínu pomocou fluorescenčného aglutinínu z pšeničných klíčkov. Dva prekrývajúce sa obrazy v „Host-Microbe Co-Cultures“ zobrazujú reprezentatívne kokultúry hostiteľa a mikrobiómu v čreve na čipe. Ľavý panel zobrazuje kokultúru E. coli exprimujúcej zelený fluorescenčný proteín (GFP) s mikroinžiniersky upravenými 3D epitelovými bunkami Caco-2. Pravý panel zobrazuje lokalizáciu GFP E. coli kokultivovaného s 3D epitelovými bunkami Caco-2, po ktorej nasleduje imunofluorescenčné farbenie s F-aktínom (červená) a jadrami (modrá). Modelovanie ochorenia ilustruje zdravé verzus deravé črevo v čipoch so zápalom čriev pri fyziologickej expozícii bakteriálnymi antigénmi (napr. lipopolysacharid, LPS) a imunitnými bunkami (napr. PBMC; zelená). Bunky Caco-2 boli kultivované za účelom vytvorenia 3D epitelovej vrstvy. Mierka, 50 µm. Obrázky v dolnom riadku: „Diferenciácia buniek“ adaptované s povolením z odkazu.2. Oxford University Press; Reprodukované s povolením z odkazu.5. NAS; „Kokultivácia hostiteľa a mikróbu“ adaptované s povolením z odkazu.3. NAS; „Modelovanie chorôb“ adaptované s povolením z odkazu.5. NAS.
Čipy typu „gut-on-chip“ aj hybridné čipy boli vyrobené s použitím PDMS replík, ktoré boli vybraté z kremíkových foriem mäkkou litografiou1,44 a vzorované pomocou SU-8. Dizajn mikrokanálov v každom čipe je určený s ohľadom na hydrodynamiku, ako je šmykové napätie a hydrodynamický tlak1,4,12. Pôvodný dizajn „gut-on-a-chip“ (rozšírené údaje, obr. 1a), ktorý pozostával z dvoch vedľa seba umiestnených paralelných rovných mikrokanálov, sa vyvinul do komplexného „gut-on-a-chip“ (rozšírené údaje, obr. 1b), ktorý obsahuje dvojicu zakrivených mikrokanálov na vyvolanie zvýšeného času zotrvania tekutiny, nelineárnych vzorcov prúdenia a multiaxiálnej deformácie kultivovaných buniek (obr. 2a–f)12. Keď je potrebné znovu vytvoriť zložitejšiu biomechaniku čriev, je možné zvoliť komplexné „gut-on-a-chip“. Preukázali sme, že komplikovaný Gut-Chip tiež silne indukuje 3D morfogenézu v podobnom časovom rámci s podobným stupňom rastu epitelu v porovnaní s pôvodným Gut-Chip. bez ohľadu na typ kultivovaných buniek. Preto sú na vyvolanie 3D morfogenézy lineárne a komplexné návrhy čreva na čipe zameniteľné. Repliky PDMS vytvrdené na silikónových formách so vzormi SU-8 poskytli po vytvorení negatívne vlastnosti (obr. 2a). Na výrobu čreva na čipe bola pripravená horná vrstva PDMS postupne spojená s poréznym filmom PDMS a potom zarovnaná so spodnou vrstvou PDMS ireverzibilným spojením pomocou korónového ošetrenia (obr. 2b–f). Na výrobu hybridných čipov boli vytvrdené repliky PDMS spojené so sklenenými podložnými sklíčkami, aby sa vytvorili jednokanálové mikrofluidné zariadenia, ktoré by mohli pojať vložky Transwell (obr. 2h a rozšírené údaje obr. 2). Proces spájania sa vykonáva ošetrením povrchov repliky PDMS a skla kyslíkovou plazmou alebo korónovým ošetrením. Po sterilizácii mikrofabrikovaného zariadenia pripojeného k silikónovej trubici bolo zariadenie pripravené na vykonanie 3D morfogenézy črevného epitelu (obrázok 2g).
a, Schematické znázornenie prípravy PDMS dielov zo silikónových foriem so vzorom SU-8. Nevytvrdený roztok PDMS sa nalial na silikónovú formu (vľavo), vytvrdil sa pri teplote 60 °C (v strede) a vybral sa z formy (vpravo). Vybratý PDMS sa narezal na kusy a vyčistil na ďalšie použitie.b, Fotografia silikónovej formy použitej na prípravu hornej vrstvy PDMS.c, Fotografia silikónovej formy použitej na výrobu poréznej membrány PDMS.d, Séria fotografií horných a dolných komponentov PDMS a zostaveného črevného zariadenia na čipe.e, Schéma zarovnania horných, membránových a dolných komponentov PDMS. Každá vrstva je nenávratne spojená plazmovým alebo korónovým spracovaním.f, Schéma vyrobeného zariadenia „črevo na čipe“ s prekrývajúcimi sa stočenými mikrokanálikmi a vákuovými komorami.g, Nastavenie zariadenia „črevo na čipe“ pre mikrofluidnú bunkovú kultúru. Vyrobené „črevo na čipe“ zostavené so silikónovou trubicou a striekačkou sa umiestnilo na krycie sklíčko. Čipové zariadenie sa umiestnilo na viečko 150 mm Petriho skúmavky. miska na spracovanie. Spojivo sa používa na uzavretie silikónovej trubice.h, Vizuálne snímky výroby hybridného čipu a 3D morfogenézy s použitím hybridných čipov. Vložky Transwell pripravené nezávisle na kultiváciu 2D monovrstiev črevných epitelových buniek boli vložené do hybridného čipu na indukciu črevnej 3D morfogenézy. Médium sa perfunduje cez mikrokanáliky pod bunkovou vrstvou vytvorenou na vložke Transwell. Mierka, 1 cm.h Pretlačené s povolením z odkazu.4. Elsevier.
V tomto protokole sa ako epitelové zdroje použila bunková línia Caco-2 a črevné organoidy (obr. 3a). Oba typy buniek sa kultivovali nezávisle (rámček 2 a rámček 5) a použili sa na naočkovanie mikrokanálov potiahnutých ECM v črevách na čipe alebo vložených do Transwell vložiek. Keď sú bunky konfluentné (>95% pokrytie v bankách), rutinne kultivované bunky Caco-2 (medzi pasážami 10 a 50) v T-bankách sa zozbierajú na prípravu disociovaných bunkových suspenzií trypsinizačnou tekutinou (rámček 2). Ľudské črevné organoidy z črevných biopsií alebo chirurgických resekcií sa kultivovali v Matrigelových lešenárskych kupolách v 24-jamkových platniach na podporu štrukturálneho mikroprostredia. Médium obsahujúce esenciálne morfogény (ako napríklad Wnt, R-spondín a Noggin) a rastové faktory pripravené podľa popisu v rámčeku 3 sa dopĺňalo každý druhý deň, kým organoidy nedosiahli priemer ~500 µm. Plne vypestované organoidy sa zozbierajú a disociujú na jednotlivé bunky na naočkovanie na črevo alebo Vložky Transwell na čipe (rámček 5). Ako sme už uviedli, možno ho rozlíšiť podľa typu ochorenia12,13 (napr. ulcerózna kolitída, Crohnova choroba, kolorektálny karcinóm alebo normálny darca), miesta lézie (napr. lézia verzus nepostihnutá oblasť) a gastrointestinálnej lokalizácie v trakte (napr. dvanástnik, jejunum, ileum, slepé črevo, hrubé črevo alebo konečník). V rámčeku 5 uvádzame optimalizovaný protokol na kultiváciu organoidov hrubého čreva (koloidov), ktoré zvyčajne vyžadujú vyššie koncentrácie morfogénov ako organoidy tenkého čreva.
a, Pracovný postup pre indukciu črevnej morfogenézy v črevnom čipe. V tomto protokole sa na demonštráciu 3D morfogenézy používa ľudský črevný epitel Caco-2 a črevné organoidy. Izolované epitelové bunky boli nasadené do pripraveného zariadenia typu „črevo na čipe“ (príprava čipu). Po nasadení buniek (nasadení) a pripojení (pripojení) k pórovitej membráne PDMS v deň 0 (D0) sa iniciuje apikálny (AP) tok a udržiava sa počas prvých 2 dní (tok, AP, D0-D2). Bazolaterálny (BL) tok sa tiež iniciuje spolu s cyklickými naťahovacími pohybmi (natiahnutie, tok, AP a BL), keď sa vytvorí kompletná 2D monovrstva. Črevná 3D morfogenéza prebehla spontánne po 5 dňoch mikrofluidnej kultúry (morfogenéza, D5). Fázovo kontrastné obrázky zobrazujú reprezentatívnu morfológiu buniek Caco-2 v každom experimentálnom kroku alebo časovom bode (stĺpcový graf, 100 µm). Štyri schematické diagramy ilustrujúce zodpovedajúce kaskády črevnej morfogenézy (vpravo hore). Prerušované šípky. Schematický diagram znázorňuje smer prúdenia tekutiny.b, SEM snímka znázorňujúca topológiu povrchu vytvoreného 3D epitelu Caco-2 (vľavo).Vložka zvýrazňujúca zväčšenú oblasť (biely prerušovaný rámček) zobrazuje regenerované mikroklky na vrstve 3D Caco-2 (vpravo).c, Horizontálny čelný pohľad na vytvorené 3D Caco-2, klaudín (ZO-1, červená) a súvislé membrány s kefkovým okrajom označené F-aktínom (zelená) a jadrá (modrá). Imunofluorescenčná konfokálna vizualizácia epitelových buniek na črevných čipoch. Šípky smerujúce do strednej schémy označujú umiestnenie ohniskovej roviny pre každý konfokálny pohľad.d, Časový priebeh morfologických zmien v organoidoch kultivovaných na čipe získaných fázovo kontrastnou mikroskopiou v 3., 7., 9., 11. a 13. deň.Vložka (vpravo hore) zobrazuje vysoké zväčšenie poskytnutého obrázka.e, DIC mikrofotografia organoidného 3D epitelu vytvoreného v čreve na reze zhotovenom 7. deň.f, Prekryté imunofluorescenčné snímky zobrazujúce markery pre kmeňové bunky. (LGR5; purpurová), pohárikovité bunky (MUC2; zelená), F-aktín (sivý) a jadrá (azúrové) pestované na črevných čipoch počas 3 dní (vľavo) a 13-dňových (stredných) organoidov na epitelovej vrstve. Pozri tiež Obrázok 3 s rozšírenými údajmi, ktorý zvýrazňuje signalizáciu LGR5 bez signalizácie MUC2. Fluorescenčné snímky znázorňujúce epitelovú mikroštruktúru (vpravo) 3D organoidného epitelu vytvoreného v čreve na čipe farbením plazmatickej membrány farbivom CellMask (vpravo) na 13. deň kultivácie. Mierka je 50 μm, pokiaľ nie je uvedené inak.b Pretlačené s povolením z referencie.2. Oxford University Press; c Adaptované s povolením z referencie.2. Oxford University Press; e a f adaptované s povolením odkazom.12 Pod licenciou Creative Commons CC BY 4.0.
V čreve na čipe je potrebné modifikovať hydrofóbny povrch pórovitej membrány PDMS pre úspešné potiahnutie ECM. V tomto protokole aplikujeme dve rôzne metódy na modifikáciu hydrofóbnosti membrán PDMS. Na kultiváciu buniek Caco-2 bola povrchová aktivácia samotnou UV/ozónovou úpravou postačujúca na zníženie hydrofóbnosti povrchu PDMS, potiahnutie ECM a pripojenie buniek Caco-2 k membráne PDMS. Mikrofluidná kultúra organoidného epitelu však vyžaduje chemickú povrchovú funkcionalizáciu, aby sa dosiahla účinná depozícia proteínov ECM postupným nanášaním polyetylénimínu (PEI) a glutaraldehydu na mikrokanály PDMS. Po modifikácii povrchu boli proteíny ECM nanesené tak, aby pokryli funkcionalizovaný povrch PDMS, a potom boli zavedené do izolovaného organoidného epitelu. Po pripojení buniek sa mikrofluidná bunková kultúra začína perfúziou iba média do horného mikrokanála, kým bunky nevytvoria kompletnú monovrstvu, zatiaľ čo spodný mikrokanál udržiava statické podmienky. Táto optimalizovaná metóda pre povrchovú aktiváciu a potiahnutie ECM umožňuje pripojenie organoidného epitelu na indukciu 3D morfogenézy na povrchu PDMS.
Kultúry Transwell tiež vyžadujú povlak ECM pred nasiatím buniek; kultúry Transwell však nevyžadujú zložité kroky predúpravy na aktiváciu povrchu poréznych vložiek. Pri pestovaní buniek Caco-2 na vložkách Transwell urýchľuje povlak ECM na poréznych vložkách pripojenie disociovaných buniek Caco-2 (<1 hodina) a tvorbu tesnej bariéry (<1-2 dni). Na kultiváciu organoidov na vložkách Transwell sa izolované organoidy nasadia na vložky potiahnuté ECM, pripevnia sa k povrchu membrány (<3 hodiny) a udržiavajú sa, kým organoidy nevytvoria kompletnú monovrstvu s integritou bariéry. Kultúry Transwell sa vykonávajú na 24-jamkových platniach bez použitia hybridných čipov.
In vitro 3D morfogenéza sa môže iniciovať aplikáciou toku tekutiny na bazolaterálny aspekt etablovanej epitelovej vrstvy. V čreve na čipe sa epiteliálna morfogenéza začala, keď bolo médium perfundované do horného a dolného mikrokanála (obr. 3a). Ako už bolo opísané, je nevyhnutné zaviesť tok tekutiny do dolného (bazolaterálneho) kompartmentu pre kontinuálne odstraňovanie smerovo vylučovaných inhibítorov morfogénu. Aby sa bunkám viazaným na pórovité membrány poskytlo dostatok živín a séra a aby sa vytvorilo šmykové napätie v lumine, zvyčajne aplikujeme v čreve na čipe dvojitý tok. V hybridných čipoch sa do hybridných čipov vložili vložky Transwell obsahujúce epitelové monovrstvy. Potom sa médium aplikovalo pod bazolaterálnu stranu pórovitej vložky Transwell cez mikrokanál. Črevná morfogenéza nastala 3-5 dní po začatí bazolaterálneho toku v oboch kultivačných platformách.
Morfologické znaky mikroinžinierskych 3D epitelových vrstiev možno analyzovať použitím rôznych zobrazovacích modalít, vrátane fázovo-kontrastnej mikroskopie, mikroskopie s diferenciálnym interferenčným kontrastom (DIC), SEM alebo imunofluorescenčnej konfokálnej mikroskopie (obrázky 3 a 4). Fázovo-kontrastné alebo DIC zobrazovanie sa dá ľahko vykonať kedykoľvek počas kultivácie na monitorovanie tvaru a výčnelkov 3D epitelových vrstiev. Vďaka optickej priehľadnosti PDMS a polyesterových filmov môžu platformy gut-on-a-chip aj hybridné čipy poskytovať zobrazovanie in situ v reálnom čase bez nutnosti rezania alebo demontáže zariadenia. Pri vykonávaní imunofluorescenčného zobrazovania (obrázky 1, 3c, f a 4b, c) sa bunky typicky fixujú 4% (hm./obj.) paraformaldehydom (PFA), potom Tritonom X-100 a 2% (hm./obj.) hovädzím sérovým albumínom (BSA) v danom poradí. V závislosti od typu bunky sa môžu použiť rôzne fixačné látky, permeabilizátory a blokovacie činidlá. Primárne protilátky zamerané na bunku alebo oblasť závislú od línie. Markery sa používajú na zvýraznenie buniek imobilizovaných in situ na čipe, po ktorých nasledujú sekundárne protilátky spolu s kontrastným farbivom zameraným buď na jadro (napr. 4',6-diamidino-2-fenylén)indol, DAPI) alebo F-aktín (napr. fluorescenčne značený faloidín). Živé zobrazovanie založené na fluorescencii sa môže vykonávať aj in situ na detekciu produkcie hlienu (obr. 1, „Diferenciácia buniek“ a „Fyziológia čriev“), náhodnej kolonizácie mikrobiálnych buniek (obr. 1, „Kokultivácia hostiteľa a mikróbov“), náboru imunitných buniek (obr. 1, „Modelovanie chorôb“) alebo kontúr 3D epitelovej morfológie (obr. 3c, f a 4b, c). Pri modifikácii čreva na čipe na oddelenie hornej vrstvy od spodnej vrstvy mikrokanálov, ako je opísané v odkaze. Ako je znázornené na obr. 2, 3D epitelovú morfológiu, ako aj mikroklky na apikálnom kefkovom leme, je možné vizualizovať pomocou SEM (obr. 3b). Expresia Diferenciačné markery je možné stanoviť vykonaním kvantitatívnej PCR5 alebo sekvenovaním RNA jednotlivých buniek. V tomto prípade sa 3D vrstvy epitelových buniek pestovaných v črevných čipoch alebo hybridných čipoch zozbierajú trypsinizáciou a potom sa použijú na molekulárnu alebo genetickú analýzu.
a, Pracovný postup pre indukciu črevnej morfogenézy v hybridnom čipe. Caco-2 a črevné organoidy sa v tomto protokole používajú na demonštráciu 3D morfogenézy v hybridnej čipovej platforme. Disociované epitelové bunky boli nasadené do pripravených vložiek Transwell (TW prep; pozri obrázok nižšie). Po nasadení buniek (seeded) a pripojení k polyesterovým membránam vo vložkách Transwell boli všetky bunky kultivované za statických podmienok (TW culture). Po 7 dňoch bola jedna vložka Transwell obsahujúca 2D monovrstvu epitelových buniek integrovaná do hybridného čipu, aby sa zaviedol bazolaterálny tok (Flow, BL), čo nakoniec viedlo k vytvoreniu 3D epitelovej vrstvy (morfogenéza). Fázovo kontrastné mikrofotografie zobrazujúce morfologické znaky ľudských orgánových epitelových buniek odvodených od normálneho darcu (línia C103) vzostupného hrubého čreva v každom experimentálnom kroku alebo časovom bode. Schémy v horných vrstvách ilustrujú experimentálnu konfiguráciu pre každý krok. b, Hybridné čipy (ľavá schéma) môžu viesť k 3D morfogenéze organoidných epitelových buniek s pohľadmi zhora nadol zhotovenými konfokálnou mikroskopiou v rôznych Pozície Z (horná, stredná a dolná; pozri schému vpravo a zodpovedajúce bodkované čiary). vykazovali zjavné morfologické charakteristiky. F-aktín (azúrová), jadro (sivé).c, Fluorescenčné konfokálne mikrofotografie (3D uhlový pohľad) epitelových buniek odvodených z organoidov kultivovaných v statickom Transwell (TW; vložka v bielom prerušovanom rámčeku) oproti hybridnému čipu (najväčší celkový záber) porovnávajúce 2D a 3D morfológiu. Dvojica 2D vertikálnych priečnych rezov (vložka v pravom hornom rohu; „XZ“) tiež zobrazuje 2D a 3D prvky. Mierka, 100 µm.c Pretlačené s povolením z referencie.4. Elsevier.
Kontroly sa môžu pripraviť kultiváciou rovnakých buniek (Caco-2 alebo črevných organoidných epitelových buniek) do dvojrozmerných monovrstiev za konvenčných statických kultivačných podmienok. Je potrebné poznamenať, že vyčerpanie živín môže byť dôsledkom obmedzenej objemovej kapacity mikrokanálov (t. j. ~4 µl v hornom kanáli na pôvodnom dizajne črevného čipu). Preto je možné porovnať aj morfológiu epitelu pred a po aplikácii bazolaterálneho prietoku.
Proces mäkkej litografie by sa mal vykonávať v čistej miestnosti. Pre každú vrstvu na čipe (horná a dolná vrstva a membrány) a hybridných čipoch boli použité rôzne fotomasky a vyrobené na samostatných kremíkových doštičkách, pretože výšky mikrokanálov boli rôzne. Cieľové výšky horných a dolných mikrokanálov čreva na čipe sú 500 µm a 200 µm. Cieľová výška kanála hybridného čipu je 200 µm.
Vložte 3-palcový kremíkový plátok do misky s acetónom. Jemne vírte plátok 30 sekúnd a potom plátok osušte na vzduchu. Preneste plátok na platňu s IPA a potom platňu 30 sekúnd otáčajte, aby sa vyčistila.
Na maximalizáciu odstránenia organických zvyškov z povrchu kremíkového plátku je možné voliteľne použiť roztok piraní (zmes peroxidu vodíka a koncentrovanej kyseliny sírovej, 1:3 (obj./obj.)).
Roztok Pirane je extrémne korozívny a vytvára teplo. Sú potrebné ďalšie bezpečnostné opatrenia. Pri likvidácii odpadu nechajte roztok vychladnúť a prelejte ho do čistej a suchej nádoby na odpad. Použite sekundárne nádoby a nádoby na odpad riadne označte. Podrobnejšie postupy nájdete v bezpečnostných pokynoch zariadenia.
Oblátky dehydratujte umiestnením na platňu s teplotou 200 °C na 10 minút. Po dehydratácii sa oblátka päťkrát pretrepala na vzduchu, aby sa ochladila.
Nalejte ~10 g fotorezistu SU-8 2100 do stredu vyčisteného kremíkového plátku. Na rovnomerné rozotretie fotorezistu na plátku použite pinzetu. Občas plátok umiestnite na horúcu platňu s teplotou 65 °C, aby bol fotorezist menej lepivý a ľahšie sa rozotiera. Neumiestňujte plátok priamo na horúcu platňu.
SU-8 bol rovnomerne rozložený na doštičke spustením rotačného nanášania. Naprogramujte prichádzajúcu rotáciu SU-8 na 5–10 sekúnd tak, aby sa šírila rýchlosťou 500 ot./min. a zrýchlením 100 ot./min. Nastavte hlavnú rotáciu pre vzorovanie s hrúbkou 200 µm pri 1 500 ot./min. alebo dosiahnite hrúbku 250 µm (s výškou 500 µm pre hornú vrstvu čreva na čipe; pozri „Dôležité kroky“ nižšie) a nastavte zrýchlenie 300 ot./min./s počas 30 sekúnd pri 1 200 ot./min.
Hlavnú rýchlosť odstreďovania je možné nastaviť podľa cieľovej hrúbky vzoru SU-8 na kremíkovom plátku.
Na výrobu vzorov SU-8 s výškou 500 µm pre hornú vrstvu čreva na čipe sa postupne opakovali kroky nanášania odstreďovaním a mäkkého vypaľovania v tejto krabici (kroky 7 a 8) (pozri krok 9), čím sa vytvorili dve vrstvy SU-8 s hrúbkou 250 µm, ktoré je možné vrstviť a spájať UV žiarením v kroku 12 tejto krabice, čím sa vytvorí vrstva s výškou 500 µm.
Oblátky potiahnuté SU-8 opatrne upečte na mäkko tak, že ich opatrne umiestnite na horúcu platňu s teplotou 65 °C na 5 minút, potom prepnite nastavenie na 95 °C a inkubujte ďalších 40 minút.
Na dosiahnutie výšky vzoru SU-8 500 μm v hornom mikrokanáli zopakujte kroky 7 a 8, aby ste vytvorili dve vrstvy SU-8 s hrúbkou 250 μm.
Pomocou zariadenia na zarovnávanie UV masky vykonajte test lampy podľa pokynov výrobcu na výpočet expozičného času doštičky. (expozičný čas, ms) = (expozičná dávka, mJ/cm2) / (výkon lampy, mW/cm2).
Po určení času expozície umiestnite fotomasku na držiak masky zarovnávača UV masky a umiestnite fotomasku na doštičku potiahnutú SU-8.
Potlačený povrch fotomasky umiestnite priamo na stranu kremíkového plátku potiahnutú SU-8, aby ste minimalizovali rozptyl UV žiarenia.
Vystavte doštičku a fotomasku potiahnutú SU-8 vertikálne UV svetlu s intenzitou 260 mJ/cm2 počas vopred stanoveného času expozície (pozri krok 10 v tomto rámčeku).
Po vystavení UV žiareniu boli kremíkové doštičky potiahnuté SU-8 vypálené pri teplote 65 °C počas 5 minút a pri teplote 95 °C počas 15 minút na každej horúcej platni, aby sa vyrobili vzory s výškou 200 μm. Čas po vypálení pri teplote 95 °C sa predĺžil na 30 minút, aby sa vyrobili vzory s výškou 500 µm.
Vývojka sa naleje do sklenenej misky a upečená oblátka sa umiestni do misky. Objem vývojky SU-8 sa môže líšiť v závislosti od veľkosti sklenenej platne. Uistite sa, že použijete dostatok vývojky SU-8 na úplné odstránenie neexponovanej SU-8. Napríklad, ak používate sklenenú misku s priemerom 150 mm a objemom 1 l, použite ~300 ml vývojky SU-8. Vyvolávajte formu 25 minút s občasným jemným otáčaním.
Vyvolanú formu opláchnite približne 10 ml čerstvej vývojky a potom IPA nastriekaním roztoku pipetou.
Vložte doštičku do plazmového čističa a vystavte ju kyslíkovej plazme (atmosférický plyn, cieľový tlak 1 × 10−5 Torr, výkon 125 W) počas 1,5 minúty.
Vložte doštičku do vákuového exsikátora s podložným sklíčkom vo vnútri. Doštičky a podložné sklíčka je možné umiestniť vedľa seba. Ak je vákuový exsikátor rozdelený na niekoľko vrstiev platňou, umiestnite podložné sklíčka do spodnej komory a doštičky do hornej komory. Na podložné sklíčko nakvapkajte 100 μl roztoku trichlór(1H, 1H, 2H, 2H-perfluóroktyl)silánu a aplikujte vákuum na silanizáciu.
Rozmrazte ampulku so zmrazenými bunkami Caco-2 vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C a potom rozmrazené bunky preneste do banky T75 obsahujúcej 15 ml média Caco-2 predhriateho na 37 °C.
Pre kultiváciu buniek Caco-2 pri ~90 % konfluencii najskôr zohrejte médium Caco-2, PBS a 0,25 % trypsínu/1 mM EDTA vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C.
Médium odsajte vákuovou aspiráciou. Bunky dvakrát premyte 5 ml teplého PBS opakovaním vákuovej aspirácie a pridaním čerstvého PBS.