Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Evolúcia mikrobiálnych parazitov zahŕňa protiklad medzi prirodzeným výberom, ktorý spôsobuje zlepšenie parazitov, a genetickým driftom, ktorý spôsobuje, že parazity strácajú gény a hromadia škodlivé mutácie.Aby sme pochopili, ako k tejto protiakcii dochádza v rozsahu jednej makromolekuly, opisujeme kryo-EM štruktúru ribozómu Encephalitozoon cuniculi, eukaryotického organizmu s jedným z najmenších genómov v prírode.Extrémna redukcia rRNA v ribozómoch E. cuniculi je sprevádzaná bezprecedentnými štrukturálnymi zmenami, ako je vývoj predtým neznámych fúzovaných rRNA linkerov a rRNA bez vydutín.Okrem toho ribozóm E. cuniculi prežil stratu fragmentov a proteínov rRNA vyvinutím schopnosti používať malé molekuly ako štrukturálne napodobeniny degradovaných fragmentov a proteínov rRNA.Celkovo sme ukázali, že molekulárne štruktúry, o ktorých sa dlho predpokladá, že sú redukované, degenerované a podliehajú oslabujúcim mutáciám, majú množstvo kompenzačných mechanizmov, ktoré ich udržujú aktívne napriek extrémnym molekulárnym kontrakciám.
Pretože väčšina skupín mikrobiálnych parazitov má jedinečné molekulárne nástroje na využitie svojich hostiteľov, často musíme vyvinúť rôzne terapeutiká pre rôzne skupiny parazitov1,2.Nové dôkazy však naznačujú, že niektoré aspekty vývoja parazitov sú konvergentné a do značnej miery predvídateľné, čo naznačuje potenciálny základ pre široké terapeutické zásahy do mikrobiálnych parazitov3,4,5,6,7,8,9.
Predchádzajúca práca identifikovala spoločný evolučný trend v mikrobiálnych parazitoch nazývaný redukcia genómu alebo rozpad genómu10,11,12,13.Súčasný výskum ukazuje, že keď sa mikroorganizmy vzdajú svojho voľného životného štýlu a stanú sa vnútrobunkovými parazitmi (alebo endosymbiontmi), ich genómy prechádzajú pomalými, ale úžasnými metamorfózami počas miliónov rokov9,11.V procese známom ako rozpad genómu mikrobiálne parazity akumulujú škodlivé mutácie, ktoré menia mnohé predtým dôležité gény na pseudogény, čo vedie k postupnej strate génov a kolapsu mutácií14,15.Tento kolaps môže zničiť až 95 % génov v najstarších vnútrobunkových organizmoch v porovnaní s blízko príbuznými voľne žijúcimi druhmi.Evolúcia vnútrobunkových parazitov je teda ťahanicou medzi dvoma protichodnými silami: darwinovským prirodzeným výberom, ktorý vedie k zlepšeniu parazitov, a kolapsom genómu, uvrhujúcim parazity do zabudnutia.Ako sa parazitovi podarilo dostať sa z tohto preťahovania lanom a zachovať si aktivitu svojej molekulárnej štruktúry, zostáva nejasné.
Hoci mechanizmus rozpadu genómu nie je úplne objasnený, zdá sa, že k nemu dochádza najmä v dôsledku častého genetického posunu.Pretože parazity žijú v malých, asexuálnych a geneticky obmedzených populáciách, nemôžu účinne eliminovať škodlivé mutácie, ktoré sa niekedy vyskytujú počas replikácie DNA.To vedie k ireverzibilnej akumulácii škodlivých mutácií a redukcii genómu parazita.V dôsledku toho parazit stráca nielen gény, ktoré už nie sú potrebné na jeho prežitie vo vnútrobunkovom prostredí.Práve neschopnosť populácií parazitov účinne eliminovať sporadické škodlivé mutácie spôsobuje, že sa tieto mutácie hromadia v celom genóme, vrátane ich najdôležitejších génov.
Veľká časť nášho súčasného chápania redukcie genómu je založená výlučne na porovnávaní genómových sekvencií, pričom sa menej pozornosti venuje zmenám v skutočných molekulách, ktoré vykonávajú upratovacie funkcie a slúžia ako potenciálne ciele liekov.Porovnávacie štúdie ukázali, že zaťaženie škodlivými intracelulárnymi mikrobiálnymi mutáciami zrejme predisponuje proteíny a nukleové kyseliny k nesprávnemu poskladaniu a agregácii, čo ich robí viac závislými od chaperónu a precitlivelými na teplo19, 20, 21, 22, 23.Okrem toho rôzne parazity – nezávislý vývoj, od seba niekedy oddelený až 2,5 miliardami rokov – zažili podobnú stratu centier kontroly kvality pri syntéze proteínov5,6 a mechanizmoch opravy DNA24.Málo sa však vie o vplyve intracelulárneho životného štýlu na všetky ostatné vlastnosti bunkových makromolekúl, vrátane molekulárnej adaptácie na rastúcu záťaž škodlivých mutácií.
V tejto práci sme za účelom lepšieho pochopenia vývoja proteínov a nukleových kyselín intracelulárnych mikroorganizmov určili štruktúru ribozómov intracelulárneho parazita Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi je hubovitý organizmus patriaci do skupiny parazitických mikrosporídií, ktoré majú nezvyčajne malé eukaryotické genómy, a preto sa používajú ako modelové organizmy na štúdium rozpadu genómu25,26,27,28,29,30.Nedávno bola stanovená kryo-EM ribozómová štruktúra pre mierne redukované genómy Microsporidia, Paranosema locustae a Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genóm).Tieto štruktúry naznačujú, že určitá strata amplifikácie rRNA je kompenzovaná vývojom nových kontaktov medzi susednými ribozomálnymi proteínmi alebo získaním nových msL131,32 ribozomálnych proteínov.Druhy Encephalitozoon (genóm ~2,5 milióna bp) spolu s ich najbližšou príbuznou Ordospórou demonštrujú konečný stupeň redukcie genómu u eukaryotov – majú menej ako 2000 génov kódujúcich proteíny a očakáva sa, že ich ribozómy nielenže neobsahujú rRNA expanzie od fragmentov rRNA (niektoré rRNA ribotické fragmenty rozlišujú aj štyri ribozómové baktérie) proteíny kvôli ich nedostatku homológov v genóme E. cuniculi26,27,28.Preto sme dospeli k záveru, že ribozóm E. cuniculi môže odhaliť predtým neznáme stratégie molekulárnej adaptácie na rozpad genómu.
Naša kryo-EM štruktúra predstavuje najmenší eukaryotický cytoplazmatický ribozóm, ktorý sa má charakterizovať, a poskytuje pohľad na to, ako konečný stupeň redukcie genómu ovplyvňuje štruktúru, zostavenie a vývoj molekulárneho aparátu, ktorý je neoddeliteľnou súčasťou bunky.Zistili sme, že ribozóm E. cuniculi porušuje mnohé zo široko konzervovaných princípov skladania RNA a zostavovania ribozómov a objavili sme nový, predtým neznámy ribozomálny proteín.Celkom neočakávane sme ukázali, že ribozómy microsporidia vyvinuli schopnosť viazať malé molekuly a predpokladáme, že skrátenie v rRNA a proteínoch spúšťa evolučné inovácie, ktoré môžu v konečnom dôsledku poskytnúť užitočné vlastnosti ribozómu.
Aby sme zlepšili naše chápanie evolúcie proteínov a nukleových kyselín vo vnútrobunkových organizmoch, rozhodli sme sa izolovať spóry E. cuniculi z kultúr infikovaných buniek cicavcov, aby sme prečistili ich ribozómy a určili štruktúru týchto ribozómov.Je ťažké získať veľké množstvo parazitických mikrosporídií, pretože mikrosporídie nemožno kultivovať v živnom médiu.Namiesto toho rastú a rozmnožujú sa iba vo vnútri hostiteľskej bunky.Preto, aby sme získali biomasu E. cuniculi na čistenie ribozómov, infikovali sme bunkovú líniu RK13 cicavčích obličkových buniek spórami E. cuniculi a tieto infikované bunky sme kultivovali niekoľko týždňov, aby sme umožnili E. cuniculi rásť a množiť sa.Pomocou monovrstvy infikovaných buniek s rozlohou asi pol metra štvorcového sme dokázali vyčistiť asi 300 mg spór Microsporidia a použiť ich na izoláciu ribozómov.Potom sme prečistené spóry rozrušili sklenenými guľôčkami a izolovali surové ribozómy pomocou postupnej frakcionácie lyzátov polyetylénglykolom.To nám umožnilo získať približne 300 ug surových ribozómov E. cuniculi na štrukturálnu analýzu.
Potom sme zhromaždili kryo-EM obrázky pomocou výsledných vzoriek ribozómov a tieto obrázky sme spracovali pomocou masiek zodpovedajúcich veľkej ribozomálnej podjednotke, hlave malej podjednotky a malej podjednotke.Počas tohto procesu sme zhromaždili obrázky približne 108 000 ribozomálnych častíc a vypočítali kryo-EM obrázky s rozlíšením 2, 7 Å (doplnkové obrázky 1-3).Potom sme použili kryoEM snímky na modelovanie rRNA, ribozomálneho proteínu a hibernačného faktora Mdf1 spojeného s ribozómami E. cuniculi (obr. 1a, b).
a Štruktúra ribozómu E. cuniculi v komplexe s hibernačným faktorom Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa hibernačného faktora Mdf1 spojeného s ribozómom E. cuniculi.c Mapa sekundárnej štruktúry porovnávajúca získanú rRNA v druhoch Microsporidian so známymi ribozomálnymi štruktúrami.Panely znázorňujú umiestnenie amplifikovaných rRNA fragmentov (ES) a aktívnych miest ribozómov, vrátane dekódovacieho miesta (DC), sarcicínovej slučky (SRL) a centra peptidyl transferázy (PTC).d Elektrónová hustota zodpovedajúca peptidyltransferázovému centru ribozómu E. cuniculi naznačuje, že toto katalytické miesto má rovnakú štruktúru u parazita E. cuniculi a jeho hostiteľov, vrátane H. sapiens.e, f Zodpovedajúca elektrónová hustota dekódovacieho centra (e) a schematická štruktúra dekódovacieho centra (f) naznačujú, že E. cuniculi má zvyšky U1491 namiesto A1491 (číslovanie E. coli) v mnohých iných eukaryotoch.Táto zmena naznačuje, že E. cuniculi môže byť citlivý na antibiotiká, ktoré sa zameriavajú na toto aktívne miesto.
Na rozdiel od predtým vytvorených štruktúr ribozómov V. necatrix a P. locustae (obe štruktúry predstavujú rovnakú mikrosporídiovú čeľaď Nosematidae a sú si navzájom veľmi podobné), 31,32 ribozómy E. cuniculi podliehajú početným procesom fragmentácie rRNA a proteínov.Ďalšia denaturácia (doplnkové obrázky 4-6).V rRNA najvýraznejšie zmeny zahŕňali úplnú stratu amplifikovaného 25S rRNA fragmentu ES12L a čiastočnú degeneráciu h39, h41 a H18 helixov (obr. 1c, doplnkový obrázok 4).Medzi ribozomálnymi proteínmi najvýraznejšie zmeny zahŕňali úplnú stratu proteínu eS30 a skrátenie proteínov eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 a eS7 (doplnkové obrázky 4, 5).
Extrémna redukcia genómov druhov Encephalotozoon/Ordospora sa teda odráža v ich ribozómovej štruktúre: ribozómy E. cuniculi zažívajú najdramatickejšiu stratu obsahu proteínov v eukaryotických cytoplazmatických ribozómoch, ktoré podliehajú štruktúrnej charakterizácii, a dokonca nemajú ani tie rRNA a fragmenty proteínov, ktoré sú široko konzervované nielen v troch životoch.Štruktúra ribozómu E. cuniculi poskytuje prvý molekulárny model pre tieto zmeny a odhaľuje evolučné udalosti, ktoré boli prehliadané porovnávacou genomikou a štúdiami intracelulárnej biomolekulárnej štruktúry (doplnkový obrázok 7).Nižšie popisujeme každú z týchto udalostí spolu s ich pravdepodobným evolučným pôvodom a ich potenciálnym vplyvom na funkciu ribozómov.
Potom sme zistili, že okrem veľkých skrátení rRNA majú ribozómy E. cuniculi variácie rRNA na jednom zo svojich aktívnych miest.Hoci centrum peptidyl transferázy ribozómu E. cuniculi má rovnakú štruktúru ako iné eukaryotické ribozómy (obr. 1d), dekódovacie centrum sa líši v dôsledku sekvenčnej variácie na nukleotide 1491 (číslovanie E. coli, obr. 1e, f).Toto pozorovanie je dôležité, pretože dekódovacie miesto eukaryotických ribozómov typicky obsahuje zvyšky G1408 a A1491 v porovnaní so zvyškami A1408 a G1491 bakteriálneho typu.Táto variácia je základom odlišnej citlivosti bakteriálnych a eukaryotických ribozómov na aminoglykozidovú rodinu ribozomálnych antibiotík a iných malých molekúl, ktoré sa zameriavajú na dekódovacie miesto.Na dekódovacom mieste ribozómu E. cuniculi bol zvyšok A1491 nahradený U1491, čím sa potenciálne vytvorilo jedinečné väzbové rozhranie pre malé molekuly zacielené na toto aktívne miesto.Rovnaký variant A14901 je prítomný aj v iných mikrosporídiách, ako sú P. locustae a V. necatrix, čo naznačuje, že je rozšírený medzi druhmi mikrosporídií (obr. 1f).
Pretože naše vzorky ribozómov E. cuniculi boli izolované z metabolicky neaktívnych spór, testovali sme kryo-EM mapu E. cuniculi na už opísanú väzbu ribozómov v podmienkach stresu alebo hladovania.Hibernačné faktory 31,32,36,37, 38. Porovnali sme predtým stanovenú štruktúru hibernujúceho ribozómu s kryo-EM mapou ribozómu E. cuniculi.Na dokovanie boli použité ribozómy S. cerevisiae v komplexe s hibernačným faktorom Stm138, ribozómy kobylky v komplexe s faktorom Lso232 a ribozómy V. necatrix v komplexe s faktormi Mdf1 a Mdf231.Zároveň sme našli hustotu kryo-EM zodpovedajúcu faktoru pokoja Mdf1.Podobne ako väzba Mdf1 na ribozóm V. necatrix, aj Mdf1 sa viaže na ribozóm E. cuniculi, kde blokuje miesto E ribozómu, čo môže pomôcť sprístupniť ribozómy, keď sa spóry parazitov stanú metabolicky neaktívne po inaktivácii tela (obrázok 2).).
Mdf1 blokuje E miesto ribozómu, čo zrejme pomáha inaktivovať ribozóm, keď sa spóry parazitov stanú metabolicky neaktívnymi.V štruktúre ribozómu E. cuniculi sme zistili, že Mdf1 tvorí predtým neznámy kontakt s kmeňom ribozómu L1, časťou ribozómu, ktorá uľahčuje uvoľňovanie deacylovanej tRNA z ribozómu počas syntézy proteínov.Tieto kontakty naznačujú, že Mdf1 sa disociuje z ribozómu pomocou rovnakého mechanizmu ako deacetylovaná tRNA, čo poskytuje možné vysvetlenie toho, ako ribozóm odstraňuje Mdf1, aby reaktivoval syntézu proteínov.
Naša štruktúra však odhalila neznámy kontakt medzi Mdf1 a L1 ribozómovou nohou (časť ribozómu, ktorá pomáha uvoľňovať deacylovanú tRNA z ribozómu počas syntézy proteínov).Najmä Mdf1 používa rovnaké kontakty ako lakťový segment deacylovanej molekuly tRNA (obr. 2).Toto predtým neznáme molekulárne modelovanie ukázalo, že Mdf1 disociuje z ribozómu pomocou rovnakého mechanizmu ako deacetylovaná tRNA, čo vysvetľuje, ako ribozóm odstraňuje tento hibernačný faktor, aby reaktivoval syntézu proteínov.
Pri konštrukcii modelu rRNA sme zistili, že ribozóm E. cuniculi má abnormálne poskladané fragmenty rRNA, ktoré sme nazvali fúzovaná rRNA (obr. 3).V ribozómoch, ktoré pokrývajú tri domény života, sa rRNA skladá do štruktúr, v ktorých väčšina báz rRNA sa buď páruje a skladá sa navzájom, alebo interaguje s ribozomálnymi proteínmi38, 39, 40.Zdá sa však, že v ribozómoch E. cuniculi rRNA porušujú tento princíp skladania konvertovaním niektorých svojich helixov na rozvinuté oblasti rRNA.
Štruktúra helixu rRNA H18 25S v S. cerevisiae, V. necatrix a E. cuniculi.Typicky sa v ribozómoch pokrývajúcich tri životné domény tento linker zvinie do špirály RNA, ktorá obsahuje 24 až 34 zvyškov.V Microsporidia sa naopak tento rRNA linker postupne redukuje na dva jednovláknové linkery bohaté na uridín, ktoré obsahujú iba 12 zvyškov.Väčšina týchto zvyškov je vystavená pôsobeniu rozpúšťadiel.Obrázok ukazuje, že parazitické mikrosporídie zrejme porušujú všeobecné princípy skladania rRNA, kde sú bázy rRNA zvyčajne spojené s inými bázami alebo sa podieľajú na interakciách rRNA-proteín.V mikrosporídiách niektoré fragmenty rRNA nadobudnú nepriaznivý záhyb, v ktorom sa bývalá helix rRNA stáva jednovláknovým fragmentom pretiahnutým takmer v priamke.Prítomnosť týchto neobvyklých oblastí umožňuje mikrosporídiovej rRNA viazať vzdialené fragmenty rRNA s použitím minimálneho počtu báz RNA.
Najvýraznejší príklad tohto evolučného prechodu možno pozorovať na helixe rRNA H18 25S (obr. 3).U druhov od E. coli po človeka obsahujú základy tejto špirály rRNA 24-32 nukleotidov, ktoré tvoria mierne nepravidelnú špirálu.V predtým identifikovaných ribozomálnych štruktúrach z V. necatrix a P. locustae31,32 sú bázy helixu H18 čiastočne odvinuté, ale párovanie nukleotidových báz je zachované.Avšak v E. cuniculi sa tento fragment rRNA stáva najkratšími linkermi 228UUUGU232 a 301UUUUUUUUU307.Na rozdiel od typických fragmentov rRNA sa tieto linkery bohaté na uridín nezviňujú ani nevytvárajú rozsiahly kontakt s ribozomálnymi proteínmi.Namiesto toho prijímajú rozpúšťadlá otvorené a úplne rozvinuté štruktúry, v ktorých sú vlákna rRNA predĺžené takmer rovno.Táto natiahnutá konformácia vysvetľuje, ako E. cuniculi používa iba 12 báz RNA na vyplnenie medzery 33 Á medzi helixmi rRNA H16 a H18, zatiaľ čo iné druhy vyžadujú na vyplnenie medzery aspoň dvakrát toľko báz rRNA.
Môžeme teda preukázať, že prostredníctvom energeticky nepriaznivého skladania si parazitické mikrosporídie vyvinuli stratégiu na kontrakciu aj tých segmentov rRNA, ktoré zostávajú široko konzervované medzi druhmi v troch doménach života.Je zrejmé, že akumuláciou mutácií, ktoré transformujú helixy rRNA na krátke poly-U linkery, môže E. cuniculi vytvoriť nezvyčajné fragmenty rRNA obsahujúce čo najmenej nukleotidov na ligáciu distálnych fragmentov rRNA.To pomáha vysvetliť, ako mikrosporídie dosiahli dramatické zníženie svojej základnej molekulárnej štruktúry bez straty štrukturálnej a funkčnej integrity.
Ďalšou nezvyčajnou vlastnosťou rRNA E. cuniculi je vzhľad rRNA bez zhrubnutia (obr. 4).Vypukliny sú nukleotidy bez párov báz, ktoré sa krútia von zo špirály RNA namiesto toho, aby sa v nej skrývali.Väčšina výbežkov rRNA pôsobí ako molekulárne adhezíva, ktoré pomáhajú viazať susedné ribozomálne proteíny alebo iné fragmenty rRNA.Niektoré z vydutín fungujú ako pánty, čo umožňuje, aby sa špirála rRNA optimálne ohýbala a zložila pre produktívnu syntézu proteínov41.
a Výbežok rRNA (číslovanie S. cerevisiae) chýba v štruktúre ribozómov E. cuniculi, ale je prítomný vo väčšine ostatných eukaryotov b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens a vnútorné ribozómy E. cuniculi.parazitom chýba veľa starých, vysoko konzervovaných rRNA vydutín.Tieto zahustenia stabilizujú štruktúru ribozómov;preto ich absencia v mikrosporídiách indikuje zníženú stabilitu skladania rRNA u mikrosporídiových parazitov.Porovnanie s P stonkami (L7/L12 stonky v baktériách) ukazuje, že strata rRNA hrbolčekov sa niekedy zhoduje s objavením sa nových hrbolčekov vedľa stratených hrbolčekov.Helix H42 v 23S/28S rRNA má starodávnu vydutinu (U1206 v Saccharomyces cerevisiae), ktorá sa odhaduje na najmenej 3,5 miliardy rokov kvôli jej ochrane v troch oblastiach života.Pri mikrosporídiách je táto vydutina eliminovaná.Vedľa stratenej vydutiny sa však objavila nová vydutina (A1306 u E. cuniculi).
Prekvapivo sme zistili, že ribozómom E. cuniculi chýba väčšina vydutín rRNA nájdených u iných druhov, vrátane viac ako 30 vydutín konzervovaných v iných eukaryotoch (obr. 4a).Táto strata eliminuje mnoho kontaktov medzi ribozomálnymi podjednotkami a priľahlými rRNA helixmi, čo niekedy vytvára veľké duté dutiny v ribozóme, čím sa ribozóm E. cuniculi stáva poréznejším v porovnaní s tradičnejšími ribozómami (obr. 4b).Predovšetkým sme zistili, že väčšina týchto vydutín sa stratila aj v predtým identifikovaných ribozómových štruktúrach V. necatrix a P. locustae, ktoré predchádzajúce štrukturálne analýzy prehliadli31,32.
Niekedy je strata vydutín rRNA sprevádzaná vývojom nových vydutín vedľa stratenej vydutiny.Napríklad ribozomálny P-kmeň obsahuje vydutinu U1208 (v Saccharomyces cerevisiae), ktorá prežila z E. coli na človeka, a preto sa odhaduje na 3,5 miliardy rokov.Počas syntézy proteínov toto vydutie pomáha kmeňu P pohybovať sa medzi otvorenými a uzavretými konformáciami, takže ribozóm môže získavať translačné faktory a dodávať ich do aktívneho miesta.V ribozómoch E. cuniculi toto zhrubnutie chýba;avšak nové zhrubnutie (G883) umiestnené len v troch bázových pároch môže prispieť k obnoveniu optimálnej flexibility kmeňa P (obr. 4c).
Naše údaje o rRNA bez vydutín naznačujú, že minimalizácia rRNA nie je obmedzená na stratu prvkov rRNA na povrchu ribozómu, ale môže zahŕňať aj jadro ribozómu, čím vzniká molekulárny defekt špecifický pre parazita, ktorý nebol opísaný vo voľne žijúcich bunkách.pozorujú sa živé druhy.
Po modelovaní kanonických ribozomálnych proteínov a rRNA sme zistili, že konvenčné ribozomálne zložky nedokážu vysvetliť tri časti kryo-EM obrazu.Dva z týchto fragmentov majú veľkosť malých molekúl (obr. 5, doplnkový obrázok 8).Prvý segment je vložený medzi ribozomálne proteíny uL15 a eL18 v polohe zvyčajne obsadenej C-koncom eL18, ktorý je skrátený v E. cuniculi.Hoci nemôžeme určiť identitu tejto molekuly, veľkosť a tvar tohto ostrovčeka hustoty je dobre vysvetlený prítomnosťou molekúl spermidínu.Jeho väzba na ribozóm je stabilizovaná mutáciami špecifickými pre mikrosporídie v proteínoch uL15 (Asp51 a Arg56), ktoré zrejme zvyšujú afinitu ribozómu k tejto malej molekule, pretože umožňujú uL15 zabaliť malú molekulu do ribozomálnej štruktúry.Doplnkový obrázok 2).8, dodatočné údaje 1, 2).
Cryo-EM zobrazenie ukazujúce prítomnosť nukleotidov mimo ribózy viazanej na ribozóm E. cuniculi.V ribozóme E. cuniculi tento nukleotid zaberá rovnaké miesto ako nukleotid 25S rRNA A3186 (číslovanie Saccharomyces cerevisiae) vo väčšine ostatných eukaryotických ribozómov.b V ribozomálnej štruktúre E. cuniculi sa tento nukleotid nachádza medzi ribozomálnymi proteínmi uL9 a eL20, čím sa stabilizuje kontakt medzi týmito dvoma proteínmi.cd eL20 sekvenčná konzervačná analýza medzi druhmi mikrosporídií.Fylogenetický strom druhov Microsporidia (c) a viacnásobné zarovnanie sekvencií proteínu eL20 (d) ukazujú, že nukleotid-viažuce zvyšky F170 a K172 sú konzervované vo väčšine typických Microsporidia, s výnimkou S. lophii, s výnimkou včasného vetvenia Microsporidia, ktorá si zachovala predĺženie ES39L rRNA.e Tento obrázok ukazuje, že nukleotidové väzbové zvyšky F170 a K172 sú prítomné iba v eL20 vysoko redukovaného genómu mikrosporídií, ale nie v iných eukaryotoch.Celkovo tieto údaje naznačujú, že Microsporidian ribozómy vyvinuli nukleotidové väzbové miesto, ktoré zrejme viaže molekuly AMP a používa ich na stabilizáciu interakcií proteín-proteín v ribozomálnej štruktúre.Vysoká konzervácia tohto väzbového miesta v Microsporidia a jeho absencia v iných eukaryotoch naznačuje, že toto miesto môže poskytnúť selektívnu výhodu prežitia pre Microsporidia.Vrecúško viažuce nukleotidy v ribozóme mikrosporídie sa teda nezdá byť degenerovaným znakom alebo koncovou formou degradácie rRNA, ako bolo opísané vyššie, ale skôr užitočnou evolučnou inováciou, ktorá umožňuje ribozómu mikrosporídie priamo viazať malé molekuly a používať ich ako molekulárne stavebné bloky.stavebné bloky pre ribozómy.Tento objav robí z ribozómu microsporidia jediný známy ribozóm, ktorý používa jeden nukleotid ako svoj štrukturálny stavebný blok.f Hypotetická evolučná dráha odvodená od väzby nukleotidov.
Druhá hustota s nízkou molekulovou hmotnosťou sa nachádza na rozhraní medzi ribozomálnymi proteínmi uL9 a eL30 (obr. 5a).Toto rozhranie bolo predtým opísané v štruktúre ribozómu Saccharomyces cerevisiae ako väzbové miesto pre 25S nukleotid rRNA A3186 (časť predĺženia ES39L rRNA)38.Ukázalo sa, že v degenerovaných ribozómoch P. locustae ES39L toto rozhranie viaže neznámy jediný nukleotid 31 a predpokladá sa, že tento nukleotid je redukovanou konečnou formou rRNA, v ktorej je dĺžka rRNA ~130-230 báz.ES39L je redukovaný na jeden nukleotid 32.43.Naše kryo-EM snímky podporujú myšlienku, že hustotu možno vysvetliť nukleotidmi.Vyššie rozlíšenie našej štruktúry však ukázalo, že tento nukleotid je extraribozomálna molekula, pravdepodobne AMP (obr. 5a, b).
Potom sme sa opýtali, či sa nukleotidové väzbové miesto objavilo v ribozóme E. cuniculi alebo či existovalo už predtým.Pretože väzba nukleotidov je sprostredkovaná hlavne zvyškami Phe170 a Lys172 v ribozomálnom proteíne eL30, hodnotili sme konzerváciu týchto zvyškov v 4396 reprezentatívnych eukaryotoch.Ako v prípade uL15 vyššie, zistili sme, že zvyšky Phe170 a Lys172 sú vysoko konzervované iba v typických Microsporidia, ale chýbajú v iných eukaryotoch, vrátane atypických Microsporidia Mitosporidium a Amphiamblys, v ktorých nie je fragment rRNA ES39L redukovaný 44, 45, 46).-e).
Celkovo tieto údaje podporujú myšlienku, že E. cuniculi a možno aj iné kanonické mikrosporídie si vyvinuli schopnosť efektívne zachytávať veľké množstvo malých metabolitov v štruktúre ribozómov, aby kompenzovali pokles hladín rRNA a proteínov.Pritom si vyvinuli jedinečnú schopnosť viazať nukleotidy mimo ribozómu, čo ukazuje, že parazitické molekulárne štruktúry kompenzujú zachytením hojných malých metabolitov a ich použitím ako štrukturálnych napodobenín degradovanej RNA a proteínových fragmentov..
Tretia nesimulovaná časť našej kryo-EM mapy, ktorá sa nachádza vo veľkej ribozomálnej podjednotke.Relatívne vysoké rozlíšenie (2,6 Å) našej mapy naznačuje, že táto hustota patrí k proteínom s jedinečnými kombináciami veľkých zvyškov bočných reťazcov, čo nám umožnilo identifikovať túto hustotu ako predtým neznámy ribozomálny proteín, ktorý sme identifikovali ako msL2 (proteín L2 špecifický pre mikrosporídie) (metódy, obrázok 6).Naše vyhľadávanie homológie ukázalo, že msL2 je konzervovaný v klade Microsporidia rodu Encephaliter a Orosporidium, ale chýba u iných druhov, vrátane iných Microsporidia.V ribozomálnej štruktúre msL2 zaberá medzeru vytvorenú stratou rozšírenej ES31L rRNA.V tejto prázdnote pomáha msL2 stabilizovať skladanie rRNA a môže kompenzovať stratu ES31L (obrázok 6).
Elektrónová hustota a model ribozomálneho proteínu msL2 špecifického pre Microsporidia nachádzajúci sa v ribozómoch E. cuniculi.b Väčšina eukaryotických ribozómov, vrátane 80S ribozómu Saccharomyces cerevisiae, má stratu amplifikácie ES19L rRNA u väčšiny mikrosporidiánskych druhov.Predtým stanovená štruktúra ribozómu V. necatrix microsporidia naznačuje, že strata ES19L u týchto parazitov je kompenzovaná vývojom nového ribozomálneho proteínu msL1.V tejto štúdii sme zistili, že ribozóm E. cuniculi tiež vyvinul ďalší mimický proteín ribozomálnej RNA ako zjavnú kompenzáciu za stratu ES19L.Avšak msL2 (v súčasnosti označovaný ako hypotetický proteín ECU06_1135) a msL1 majú odlišný štrukturálny a evolučný pôvod.c Tento objav tvorby evolučne nesúvisiacich ribozomálnych proteínov msL1 a msL2 naznačuje, že ak ribozómy akumulujú škodlivé mutácie vo svojej rRNA, môžu dosiahnuť bezprecedentné úrovne kompozičnej diverzity dokonca aj v malej podskupine blízko príbuzných druhov.Tento objav by mohol pomôcť objasniť pôvod a vývoj mitochondriálneho ribozómu, ktorý je známy svojou vysoko zníženou rRNA a abnormálnou variabilitou v zložení proteínov medzi jednotlivými druhmi.
Potom sme porovnali proteín msL2 s predtým opísaným proteínom msL1, jediným známym ribozomálnym proteínom špecifickým pre mikrosporídie, ktorý sa nachádza v ribozóme V. necatrix.Chceli sme otestovať, či sú msL1 a msL2 evolučne príbuzné.Naša analýza ukázala, že msL1 a msL2 zaberajú rovnakú dutinu v ribozomálnej štruktúre, ale majú odlišné primárne a terciárne štruktúry, čo naznačuje ich nezávislý evolučný pôvod (obr. 6).Náš objav msL2 teda poskytuje dôkaz, že skupiny kompaktných eukaryotických druhov sa môžu nezávisle vyvinúť štrukturálne odlišné ribozomálne proteíny, aby kompenzovali stratu fragmentov rRNA.Toto zistenie je pozoruhodné tým, že väčšina cytoplazmatických eukaryotických ribozómov obsahuje invariantný proteín, vrátane rovnakej rodiny 81 ribozomálnych proteínov.Výskyt msL1 a msL2 v rôznych kladoch mikrosporídií v reakcii na stratu rozšírených segmentov rRNA naznačuje, že degradácia molekulárnej architektúry parazita spôsobuje, že parazity hľadajú kompenzačné mutácie, čo môže nakoniec viesť k ich získaniu v rôznych populáciách parazitov.štruktúry.
Nakoniec, keď bol náš model dokončený, porovnali sme zloženie ribozómu E. cuniculi so zložením predpovedaným zo sekvencie genómu.Predtým sa predpokladalo, že niekoľko ribozomálnych proteínov, vrátane eL14, eL38, eL41 a eS30, chýbalo v genóme E. cuniculi kvôli zjavnej absencii ich homológov v genóme E. cuniculi.Strata mnohých ribozomálnych proteínov sa tiež predpovedá u väčšiny ostatných vysoko redukovaných intracelulárnych parazitov a endosymbiontov.Napríklad, hoci väčšina voľne žijúcich baktérií obsahuje rovnakú rodinu 54 ribozomálnych proteínov, iba 11 z týchto proteínových rodín má detegovateľné homológy v každom analyzovanom genóme baktérií obmedzených na hostiteľa.Na podporu tejto predstavy bola experimentálne pozorovaná strata ribozomálnych proteínov u mikrosporídií V. necatrix a P. locustae, ktorým chýbajú proteíny eL38 a eL4131,32.
Naše štruktúry však ukazujú, že iba eL38, eL41 a eS30 sa v skutočnosti strácajú v ribozóme E. cuniculi.Proteín eL14 bol konzervovaný a naša štruktúra ukázala, prečo tento proteín nebolo možné nájsť pri hľadaní homológie (obr. 7).V ribozómoch E. cuniculi sa väčšina väzbového miesta eL14 stratí v dôsledku degradácie rRNA-amplifikovaného ES39L.V neprítomnosti ES39L stratil eL14 väčšinu svojej sekundárnej štruktúry a iba 18 % sekvencie eL14 bolo identických v E. cuniculi a S. cerevisiae.Toto slabé zachovanie sekvencie je pozoruhodné, pretože dokonca aj Saccharomyces cerevisiae a Homo sapiens - organizmy, ktoré sa vyvinuli 1, 5 miliardy rokov od seba - zdieľajú viac ako 51% rovnakých zvyškov v eL14.Táto anomálna strata konzervácie vysvetľuje, prečo sa E. cuniculi eL14 v súčasnosti označuje ako domnelý proteín M970_061160 a nie ako ribozomálny proteín eL1427.
a ribozóm Microsporidia stratil predĺženie ES39L rRNA, ktoré čiastočne eliminovalo väzbové miesto ribozomálneho proteínu eL14.V neprítomnosti ES39L mikrospórový proteín eL14 podlieha strate sekundárnej štruktúry, v ktorej bývalý a-helix viažuci rRNA degeneruje do slučky s minimálnou dĺžkou.b Viacnásobné zarovnanie sekvencií ukazuje, že proteín eL14 je vysoko konzervovaný v eukaryotických druhoch (57 % sekvenčná identita medzi kvasinkovými a ľudskými homológmi), ale slabo konzervovaný a divergentný v mikrosporídiách (v ktorých nie je viac ako 24 % zvyškov identických s homológom eL14).z S. cerevisiae alebo H. sapiens).Táto slabá konzervácia sekvencie a variabilita sekundárnej štruktúry vysvetľuje, prečo sa homológ eL14 nikdy nenašiel v E. cuniculi a prečo sa predpokladá, že tento proteín sa stratil v E. cuniculi.Na rozdiel od toho, E. cuniculi eL14 bol predtým anotovaný ako predpokladaný proteín M970_061160.Toto pozorovanie naznačuje, že diverzita genómu mikrosporídií je v súčasnosti preceňovaná: niektoré gény, o ktorých sa v súčasnosti predpokladá, že sú stratené v mikrosporídiách, sú v skutočnosti zachované, aj keď vo vysoko diferencovaných formách;namiesto toho sa predpokladá, že niektoré kódujú mikrosporídiové gény pre proteíny špecifické pre červy (napr. hypotetický proteín M970_061160) v skutočnosti kóduje veľmi rôznorodé proteíny nachádzajúce sa v iných eukaryotoch.
Toto zistenie naznačuje, že denaturácia rRNA môže viesť k dramatickej strate konzervácie sekvencie v susedných ribozomálnych proteínoch, čím sa tieto proteíny stávajú nedetegovateľnými pri hľadaní homológie.Môžeme teda preceňovať skutočný stupeň molekulárnej degradácie v organizmoch s malým genómom, pretože niektoré proteíny, o ktorých sa predpokladá, že sú stratené, skutočne pretrvávajú, aj keď vo vysoko zmenených formách.
Ako si môžu parazity zachovať funkciu svojich molekulárnych strojov v podmienkach extrémnej redukcie genómu?Naša štúdia odpovedá na túto otázku popisom komplexnej molekulárnej štruktúry (ribozómu) E. cuniculi, organizmu s jedným z najmenších eukaryotických genómov.
Už takmer dve desaťročia je známe, že molekuly proteínov a RNA u mikrobiálnych parazitov sa často líšia od svojich homológnych molekúl u voľne žijúcich druhov, pretože im chýbajú centrá kontroly kvality, u voľne žijúcich mikróbov sú zmenšené na 50 % svojej veľkosti atď.veľa oslabujúcich mutácií, ktoré zhoršujú skladanie a funkciu.Napríklad sa očakáva, že ribozómy malých genómových organizmov, vrátane mnohých intracelulárnych parazitov a endosymbiontov, budú postrádať niekoľko ribozomálnych proteínov a až jednu tretinu rRNA nukleotidov v porovnaní s voľne žijúcimi druhmi 27, 29, 30, 49. Spôsob, akým tieto molekuly fungujú v parazitoch, však zostáva do značnej miery záhadou.
Naša štúdia ukazuje, že štruktúra makromolekúl môže odhaliť mnohé aspekty evolúcie, ktoré je ťažké extrahovať z tradičných komparatívnych genómových štúdií intracelulárnych parazitov a iných organizmov s obmedzeným prístupom k hostiteľovi (doplnkový obrázok 7).Napríklad príklad proteínu eL14 ukazuje, že skutočný stupeň degradácie molekulárneho aparátu u parazitických druhov môžeme preceňovať.V súčasnosti sa predpokladá, že encefalitické parazity majú stovky génov špecifických pre mikrosporídie.Naše výsledky však ukazujú, že niektoré z týchto zdanlivo špecifických génov sú v skutočnosti len veľmi odlišné varianty génov, ktoré sú bežné u iných eukaryotov.Okrem toho príklad proteínu msL2 ukazuje, ako prehliadame nové ribozomálne proteíny a podceňujeme obsah parazitických molekulárnych strojov.Príklad malých molekúl ukazuje, ako môžeme prehliadať tie najdômyselnejšie inovácie v parazitických molekulárnych štruktúrach, ktoré im môžu poskytnúť novú biologickú aktivitu.
Celkovo tieto výsledky zlepšujú naše chápanie rozdielov medzi molekulárnymi štruktúrami organizmov s obmedzeným prístupom k hostiteľovi a ich náprotivkami vo voľne žijúcich organizmoch.Ukazujeme, že molekulárne stroje, o ktorých sa dlho predpokladalo, že sú redukované, degenerované a podliehajú rôznym oslabujúcim mutáciám, majú namiesto toho súbor systematicky prehliadaných neobvyklých štruktúrnych znakov.
Na druhej strane, neobjemné fragmenty rRNA a fúzované fragmenty, ktoré sme našli v ribozómoch E. cuniculi, naznačujú, že redukcia genómu môže zmeniť aj tie časti základného molekulárneho aparátu, ktoré sú zachované v troch doménach života – po takmer 3,5 miliardách rokov.nezávislý vývoj druhov.
Vo svetle predchádzajúcich štúdií molekúl RNA v endosymbiotických baktériách sú mimoriadne zaujímavé fragmenty rRNA bez vydutia a fúzované fragmenty v ribozómoch E. cuniculi.Napríklad u endosymbionta vošiek Buchnera aphidicola sa ukázalo, že molekuly rRNA a tRNA majú štruktúry citlivé na teplotu v dôsledku odchýlky zloženia A+T a vysokého podielu nekanonických párov báz20,50.V súčasnosti sa predpokladá, že tieto zmeny v RNA, ako aj zmeny v molekulách proteínov sú zodpovedné za nadmernú závislosť endosymbiontov od partnerov a neschopnosť endosymbiontov prenášať teplo 21, 23 .Hoci parazitická mikrosporídia rRNA má štrukturálne odlišné zmeny, povaha týchto zmien naznačuje, že znížená tepelná stabilita a vyššia závislosť od chaperónových proteínov môžu byť spoločnými znakmi molekúl RNA v organizmoch s redukovanými genómami.
Na druhej strane naše štruktúry ukazujú, že parazitické mikrosporídie si vyvinuli jedinečnú schopnosť odolávať široko konzervovaným rRNA a proteínovým fragmentom, čím sa vyvinula schopnosť používať hojné a ľahko dostupné malé metabolity ako štrukturálne napodobeniny degenerovaných rRNA a proteínových fragmentov.Degradácia molekulárnej štruktúry..Tento názor podporuje skutočnosť, že malé molekuly, ktoré kompenzujú stratu proteínových fragmentov v rRNA a ribozómoch E. cuniculi, sa viažu na zvyšky špecifické pre mikrosporídie v proteínoch uL15 a eL30.To naznačuje, že väzba malých molekúl na ribozómy môže byť produktom pozitívnej selekcie, v ktorej boli vybrané mutácie špecifické pre Microsporidia v ribozomálnych proteínoch pre ich schopnosť zvýšiť afinitu ribozómov k malým molekulám, čo môže viesť k efektívnejším ribozomálnym organizmom.Tento objav odhaľuje inteligentnú inováciu v molekulárnej štruktúre mikrobiálnych parazitov a umožňuje nám lepšie pochopiť, ako si molekulárne štruktúry parazitov zachovávajú svoju funkciu napriek redukčnému vývoju.
V súčasnosti zostáva identifikácia týchto malých molekúl nejasná.Nie je jasné, prečo sa vzhľad týchto malých molekúl v ribozomálnej štruktúre medzi jednotlivými druhmi mikrosporídií líši.Najmä nie je jasné, prečo sa nukleotidová väzba pozoruje v ribozómoch E. cuniculi a P. locustae, a nie v ribozómoch V. necatrix, napriek prítomnosti zvyšku F170 v proteínoch eL20 a K172 V. necatrix.Táto delécia môže byť spôsobená zvyškom 43 uL6 (umiestneným v blízkosti nukleotidovej väzbovej kapsy), čo je tyrozín vo V. necatrix a nie treonín v E. cuniculi a P. locustae.Objemný aromatický bočný reťazec Tyr43 môže interferovať s väzbou nukleotidov v dôsledku stérického prekrývania.Alternatívne môže byť zjavná nukleotidová delécia spôsobená nízkym rozlíšením kryo-EM zobrazovania, ktoré bráni modelovaniu ribozomálnych fragmentov V. necatrix.
Na druhej strane naša práca naznačuje, že proces rozpadu genómu môže byť vynaliezavou silou.Najmä štruktúra ribozómu E. cuniculi naznačuje, že strata rRNA a proteínových fragmentov v ribozóme mikrosporídií vytvára evolučný tlak, ktorý podporuje zmeny v štruktúre ribozómov.Tieto varianty sa vyskytujú ďaleko od aktívneho miesta ribozómu a zdá sa, že pomáhajú udržiavať (alebo obnovovať) optimálne zostavenie ribozómov, ktoré by inak bolo narušené zníženou rRNA.To naznačuje, že sa zdá, že veľká inovácia ribozómu microsporidia sa vyvinula do potreby vyrovnávať génový drift.
Azda najlepšie to ilustruje väzba nukleotidov, ktorá doteraz nebola nikdy pozorovaná u iných organizmov.Skutočnosť, že zvyšky viažuce nukleotidy sú prítomné v typických mikrosporídiách, ale nie v iných eukaryotoch, naznačuje, že miesta viažuce nukleotidy nie sú len relikvie, ktoré čakajú na zmiznutie, alebo konečné miesto, kde sa má rRNA obnoviť do podoby jednotlivých nukleotidov.Namiesto toho sa táto stránka javí ako užitočná funkcia, ktorá sa mohla vyvinúť počas niekoľkých kôl pozitívneho výberu.Väzbové miesta nukleotidov môžu byť vedľajším produktom prirodzeného výberu: akonáhle je ES39L degradovaný, mikrosporídie sú nútené hľadať kompenzáciu na obnovenie optimálnej biogenézy ribozómov v neprítomnosti ES39L.Keďže tento nukleotid môže napodobňovať molekulárne kontakty nukleotidu A3186 v ES39L, molekula nukleotidu sa stáva stavebným blokom ribozómu, ktorého väzba sa ďalej zlepšuje mutáciou sekvencie eL30.
Pokiaľ ide o molekulárnu evolúciu intracelulárnych parazitov, naša štúdia ukazuje, že sily darwinovského prirodzeného výberu a genetického driftu rozpadu genómu nepôsobia paralelne, ale oscilujú.Po prvé, genetický drift eliminuje dôležité vlastnosti biomolekúl, takže kompenzácia je veľmi potrebná.Iba keď parazity uspokoja túto potrebu prostredníctvom darwinovského prirodzeného výberu, budú mať ich makromolekuly šancu vyvinúť svoje najpôsobivejšie a najinovatívnejšie vlastnosti.Dôležité je, že vývoj väzbových miest nukleotidov v ribozóme E. cuniculi naznačuje, že tento model molekulárnej evolúcie so stratou a ziskom nielenže amortizuje škodlivé mutácie, ale niekedy udeľuje parazitickým makromolekulám úplne nové funkcie.
Táto myšlienka je v súlade s teóriou pohyblivej rovnováhy Sewella Wrighta, ktorá tvrdí, že prísny systém prirodzeného výberu obmedzuje schopnosť organizmov inovovať51,52,53.Ak však genetický drift naruší prirodzený výber, tieto drifty môžu spôsobiť zmeny, ktoré samy osebe nie sú adaptívne (alebo dokonca škodlivé), ale vedú k ďalším zmenám, ktoré poskytujú vyššiu kondíciu alebo novú biologickú aktivitu.Náš rámec podporuje túto myšlienku tým, že ilustruje, že rovnaký typ mutácie, ktorý znižuje záhyb a funkciu biomolekuly, sa zdá byť hlavným spúšťačom jej zlepšenia.V súlade s obojstranne výhodným evolučným modelom naša štúdia ukazuje, že rozpad genómu, ktorý sa tradične považuje za degeneratívny proces, je tiež hlavnou hnacou silou inovácie, ktorá niekedy a možno dokonca často umožňuje makromolekulám získať nové parazitické aktivity.môže ich použiť.