Získavanie a distribúcia živín integruje hľadanie potravy hmyzom a znaky životného cyklu. Aby hmyz kompenzoval nedostatok špecifických živín v rôznych životných štádiách, môže tieto živiny získavať doplnkovým kŕmením, napríklad kŕmením sa sekrétmi stavovcov procesom známym ako mláky. Komár Anopheles arabiani sa javí ako podvyživený, a preto potrebuje živiny pre metabolizmus aj reprodukciu. Cieľom tejto štúdie bolo posúdiť, či agitácia An. arabiensis na kravskom moči za účelom získavania živín zlepšuje charakteristiky životného cyklu.
Uistite sa, že je to bezpečné. Arabiensis priťahoval zápach čerstvého, 24-hodinového, 72-hodinového a 168-hodinového kravského moču a samice hľadajúce hostiteľa a kŕmené krvou (48 hodín po krvnom múčke) boli merané v olfaktometre s Y-trubicou a gravidné samice boli hodnotené na test trenia. Na identifikáciu bioaktívnych zlúčenín v kravskom moči vo všetkých štyroch vekových kategóriách bola potom použitá kombinovaná chemická a elektrofyziologická analýza. Syntetické zmesi bioaktívnych zlúčenín boli hodnotené v pokusoch s Y-trubicou a poľných pokusoch. Na preskúmanie kravského moču a jeho hlavnej zlúčeniny obsahujúcej dusík, močoviny, ako potenciálnej doplnkovej stravy pre prenášače malárie, boli merané parametre kŕmenia a charakteristiky životného cyklu. Bol hodnotený podiel samíc komárov a množstvo absorbovaného kravského moču a močoviny. Po kŕmení boli samice hodnotené z hľadiska prežitia, letu na viazanom páse a reprodukcie.
Hľadajú krv a výživu hostiteľa. V laboratórnych a terénnych štúdiách Arabov priťahovala prirodzená a syntetická vôňa čerstvého a starnúceho kravského moču. Gravidné samice boli ľahostajné k reakciám kravského moču na miestach neresenia. Samice hľadajúce hostiteľa a cicajúce krv aktívne absorbujú kravský moč a močovinu a rozdeľujú tieto zdroje podľa kompromisov v životnom štýle ako funkciu fyziologického stavu pre let, prežitie alebo reprodukciu.
Zbieranie a distribúcia kravského moču druhom Anopheles arabinis pre zlepšenie charakteristík životného cyklu. Doplnkové kŕmenie kravským močom priamo ovplyvňuje kapacitu vektorov zvýšením denného prežitia a hustoty vektorov a nepriamo zmenou letovej aktivity, a preto by sa malo zohľadniť v budúcich modeloch.
Získavanie a distribúcia živín integruje charakteristiky hľadania potravy hmyzom a jeho životného cyklu [1, 2, 3]. Hmyz je schopný vyberať a získavať potravu a vykonávať kompenzačné kŕmenie na základe dostupnosti potravy a požiadaviek na živiny [1, 3]. Distribúcia živín závisí od životného cyklu a môže viesť k rôznym požiadavkám na kvalitu a kvantitu stravy v rôznych životných štádiách hmyzu [1, 2]. Aby hmyz kompenzoval nedostatky v špecifických živinách, môže tieto živiny získavať doplnkovým kŕmením, napríklad bahnom, rôznymi exkrementmi a sekrétmi stavovcov a zdochlinami, čo je proces známy ako mláky [2]. Hoci je primárne opísaných množstvo druhov motýľov a molí, napájadlá sa vyskytujú aj v iných radoch hmyzu a príťažlivosť k týmto typom zdrojov a kŕmenie sa nimi môže mať významný vplyv na zdravie a ďalšie znaky životného cyklu [2, 4, 5, 6], 7]. Malarický komár Anopheles gambiae sensu lato (sl) sa objavuje ako „podvyživený“ dospelý jedinec [8], takže zalievanie môže hrať dôležitú úlohu v jeho životných charakteristikách, ale toto správanie bolo doteraz zanedbávané. Používanie agitácie ako prostriedku na zvýšenie príjmu živín v tomto dôležitom nástroji si zaslúži pozornosť, pretože môže mať dôležité epidemiologické dôsledky.
Príjem dusíka u dospelých samíc komárov rodu Anopheles je obmedzený kvôli nízkym kalorickým rezervám, ktoré si prenášajú z larválneho štádia, a neefektívnemu využívaniu krvnej múčky [9]. Samice Ann.gambiae sl to zvyčajne kompenzujú dopĺňaním krvnej múčky [10, 11], čím vystavujú viac ľudí riziku nákazy chorobou a komáre väčšiemu riziku predácie. Alternatívne môžu komáre využívať doplnkové kŕmenie výkalmi stavovcov na získavanie dusíkatých zlúčenín, ktoré zlepšujú adaptáciu a letovú manévrovateľnosť, ako to demonštruje iný hmyz [2]. V tomto ohľade je zaujímavá silná a zreteľná príťažlivosť jedného z príbuzných druhov v rámci gambijského druhového komplexu An.Anopheles arabinis, čerstvého a starnúceho kravského moču [12, 13, 14]. Anopheles arabinis je oportunistický vo svojich preferenciách hostiteľa a je známe, že sa spája s dobytkom a živí sa ním. Kravský moč je zdroj bohatý na dusíkaté zlúčeniny, pričom močovina tvorí 50 – 95 % celkového dusíka v čerstvom moči [15, 16]. Ako kravský moč starne, Mikroorganizmy využívajú tieto zdroje na zníženie komplexnosti dusíkatých zlúčenín v priebehu 24 hodín [15]. S rýchlym nárastom amoniaku, ktorý je spojený s poklesom organického dusíka, sa darí alkalofilným mikroorganizmom (z ktorých mnohé produkujú zlúčeniny toxické pre komáre) [15], čo môže byť spôsobené tým, že samičky Ann.arabiensis sú prednostne priťahované močom starým 24 hodín alebo menej [13, 14].
V tejto štúdii sa hľadali hostiteľské a krvou kŕmené An. Počas prvého cyklu gonadotropínov bol arabiensis hodnotený na získavanie dusíkatých zlúčenín vrátane močoviny miešaním moču. Následne sa uskutočnila séria experimentov s cieľom posúdiť, ako samice komárov alokujú tento potenciálny zdroj živín pre lepšie prežitie, reprodukciu a ďalšie hľadanie potravy. Nakoniec sa hodnotil zápach čerstvého a starého kravského moču, aby sa zistilo, či poskytujú spoľahlivé vodítka pre hostiteľa a krvou kŕmené An. Pri hľadaní tohto potenciálneho zdroja výživy objavil arabiensis chemické korelácie, ktoré stoja za pozorovanou rozdielnou atraktivitou. Syntetické zmesi pachov prchavých organických zlúčenín (VOC) identifikované v 24-hodinovom moči boli ďalej hodnotené v poľných podmienkach, čím sa rozšírili výsledky získané v laboratórnych podmienkach a preukázal vplyv zápachu hovädzieho moču na rôzne fyziologické stavy. Príťažlivosť komárov. Získané výsledky potvrdzujú, že An. arabiensis získava a distribuuje dusíkaté zlúčeniny nachádzajúce sa v moči stavovcov, aby ovplyvnil charakteristiky životného cyklu. Tieto výsledky sú diskutované v kontexte potenciálnych epidemiologických dôsledkov a toho, ako ich možno použiť na sledovanie a kontrolu vektorov.
Kmeň Anopheles arabicans (kmeň Dongola) sa udržiaval pri teplote 25 ± 2 °C, relatívnej vlhkosti 65 ± 5 % a cykle svetlo:tma 12:12 h. Larvy sa chovali v plastových miskách (20 cm × 18 cm × 7 cm) naplnených destilovanou vodou a kŕmili sa krmivom pre ryby Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Nemecko). Kukly sa zozbierali do 30 ml pohárov (Nolato Hertila, Åstorp, Švédsko) a potom sa preniesli do klietok Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan), aby sa umožnilo vyliahnutie dospelých jedincov. Dospelé jedince dostávali 10 % roztok sacharózy ad libitum až do 4 dní po vyliahnutí (dpe), kedy sa samiciam hľadajúcim hostiteľa bezprostredne pred experimentom ponúkla strava alebo sa pred experimentom nechali cez noc hladovať s destilovanou vodou, ako je opísané nižšie. Samice použité na experimenty s letovou trubicou hladovali iba 4 – 6 dní. hodiny s vodou ad libitum. Na prípravu krvosajúcich komárov na následné biologické testy boli 4 samiciam dpe poskytnuté defibrotické ovčie krvi (Håtunalab, Bro, SE) pomocou membránového kŕmneho systému (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Spojené kráľovstvo). Úplne prekrvené samice boli potom premiestnené do jednotlivých klietok a bola im priamo poskytnutá strava, ako je opísané nižšie, alebo 10% sacharóza ad libitum počas 3 dní pred experimentmi opísanými nižšie. Tieto samice boli použité na biologické testy v letovej trubici a prenesené do laboratória a potom im bola 4-6 hodín pred experimentom podávaná destilovaná voda ad libitum.
Na kvantifikáciu spotreby moču a močoviny u dospelých samíc An.Arab sa použili kŕmne testy. Samice hľadajúce hostiteľa a kŕmené krvou dostávali počas 48 hodín diétu obsahujúcu 1 % zriedeného čerstvého a starého kravského moču, rôzne koncentrácie močoviny a dve kontroly (10 % sacharóza a voda). Okrem toho sa do diéty pridalo potravinárske farbivo (1 mg ml-1 xylénkyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) a podávalo sa v matrici 4 × 4 v 250 µl mikrocentrifugačných skúmavkách (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; obrázok 1A) naplnených po okraj (~300 µl). Aby sa predišlo konkurencii medzi komármi a potenciálnym účinkom farbiva, umiestnite 10 komárov do veľkej Petriho misky (s priemerom 12 cm a výškou 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; obrázok 1A) v úplnej tme pri teplote 25 ± 2 cm °C a relatívnej vlhkosti 65 ± 5 %. Tieto experimenty sa opakovali 5 až 10-krát. Po vystavení potrave boli komáre umiestnené do teploty -20 °C až do ďalšej analýzy.
Hľadajte hovädzí moč a močovinu absorbované hostiteľom a krv sajúcou samičkou Anopheles arabianus. V kŕmnej skúške (A) boli samičkám komárov poskytnutá strava pozostávajúca z čerstvého a starnutého kravského moču, rôznych koncentrácií močoviny, sacharózy (10 %) a destilovanej vody (H2O). Samice hľadajúce hostiteľa (B) a krv sajúce (C) absorbovali viac sacharózy ako akákoľvek iná testovaná strava. Všimnite si, že samice hľadajúce hostiteľa absorbovali 72-hodinový kravský moč menej ako 168-hodinový kravský moč (B). Priemerný celkový obsah dusíka (± štandardná odchýlka) v moči je znázornený vo vložke. Samice hľadajúce hostiteľa (D, F) a krv sajúce (E, G) prijímajú močovinu spôsobom závislým od dávky. Priemerné inhalované objemy (D, E) s rôznymi písmenovými názvami sa od seba významne líšili (jednosmerná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu priemeru (BE). Prerušovaná čiara predstavuje logaritmickú regresnú priamku (F, G).
Na uvoľnenie absorbovanej potravy boli komáre jednotlivo umiestnené do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek obsahujúcich 230 µl destilovanej vody a tkanivo bolo rozrušené pomocou jednorazovej tĺčikovej paličky a bezdrôtového motora (VWR International, Lund, SE), po čom nasledovala centrifugácia pri 10 krpm počas 10 minút. Supernatant (200 µl) bol prenesený na 96-jamkovú mikroplatničku (Sigma-Aldrich) a absorbancia (λ620) bola stanovená pomocou čítačky mikroplatničiek na báze spektrofotometra (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) [2 nm]. Alternatívne boli komáre rozomleté ​​v 1 ml destilovanej vody, z ktorej 900 µl bolo prenesených do kyvety na spektrofotometrickú analýzu (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE]. Na kvantifikáciu príjmu potravy bola pripravená štandardná krivka sériovým riedením, čím sa získalo 0,2 µl až 2,4 µl 1 mg ml-1 xylénu. kyanid. Následne sa na určenie množstva potravy, ktorú každý komár skonzumoval, použila optická hustota známych koncentrácií farbív.
Údaje o objeme boli analyzované pomocou jednofaktorovej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledovalo Tukeyho post hoc párové porovnanie (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineárne regresné analýzy opisovali príjem močoviny závislý od koncentrácie a porovnávali reakcie medzi komármi vyhľadávajúcimi hostiteľa a krv cicajúcimi komármi (GraphPad Prism v8.0.0 pre Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Približne 20 µl vzoriek moču z každej vekovej skupiny bolo naviazaných na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) a zapuzdrených do cínových kapsúl (8 mm × 5 mm). Kapsuly boli vložené do spaľovacej komory analyzátora CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) na stanovenie obsahu dusíka v čerstvom a starnutom moči podľa protokolu výrobcu. Celkový dusík (g N l-1) bol kvantifikovaný na základe známych koncentrácií močoviny použitých ako štandard.
Na posúdenie vplyvu stravy na prežitie samičiek vyhľadávajúcich hostiteľa a cicajúcich krv boli komáre jednotlivo umiestnené do veľkých Petriho misiek (s priemerom 12 cm a výškou 6 cm; Semadeni) s otvorom vo veku pokrytým sieťkou (priemer 3 cm) s otvormi na vetranie a zásobovanie potravou. Strava bola poskytnutá priamo po 4 dňoch od podania a obsahovala 1 % zriedeného čerstvého a starého kravského moču, štyri koncentrácie močoviny a dve kontroly, 10 % sacharózy a vody. Každá strava bola pipetou nanesená na zubný tampón (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) vložený do 5 ml striekačky (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), piest bol odstránený a umiestnený na vrch Petriho misky (obrázok 1).1A). Meňte stravu každý deň. Udržiavajte laboratórium podľa vyššie uvedeného postupu. Prežívajúce komáre boli počítané dvakrát denne, zatiaľ čo mŕtve komáre boli vyhadzované, kým neuhynul posledný komár (n = 40 na ošetrenie). Prežitie komárov kŕmených rôznymi stravami bolo štatisticky analyzované pomocou Kaplan-Meyerových kriviek prežitia a log-rank testov. porovnať rozdelenie prežitia medzi diétami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Lietajúci mlyn na komáre na mieru podľa Attisana a kol. [17], vyrobený z 5 mm hrubých priehľadných akrylových panelov (šírka 10 cm x dĺžka 10 cm x výška 10 cm) bez predného a zadného panelu (obr. 3: hore). Otočná zostava so zvislou trubicou vyrobenou z plynovej chromatografickej kolóny (vnútorný priemer 0,25 mm; dĺžka 7,5 cm) s koncami prilepenými k ihle proti hmyzu zavesenej medzi dvojicou neodýmových magnetov vzdialených od seba 9 cm. Horizontálna trubica vyrobená z rovnakého materiálu (dĺžka 6,5 ​​cm) rozdeľovala zvislú trubicu a tvorila pripútané rameno a rameno, ktoré nieslo malý kúsok hliníkovej fólie ako signál prerušujúci svetlo.
Samice, ktoré boli 24 hodín hladované, dostávali vyššie uvedenú diétu 30 minút pred znehybnením. Plne kŕmené samičky komárov boli potom jednotlivo anestetizované na ľade počas 2-3 minút a pripevnené na hmyzie špendlíky pomocou včelieho vosku (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) a potom priviazané k ramenám horizontálnych trubíc. Lietajúci mlyn. Otáčky za let boli zaznamenávané pomocou špeciálne vyrobeného záznamníka údajov, potom uložené a zobrazené pomocou softvéru PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Lietajúci mlyn bol umiestnený v miestnosti s regulovanou klímou (12 h:12 h, svetlo:tma, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relatívnej vlhkosti).
Na vizualizáciu vzorca letovej aktivity sa vypočítala celková preletená vzdialenosť (m) a celkový počet po sebe nasledujúcich letových aktivít za hodinu počas 24-hodinového obdobia. Okrem toho sa porovnali priemerné vzdialenosti preletené jednotlivými samicami medzi jednotlivými ošetreniami a analyzovali sa pomocou jednofaktorovej ANOVA a Tukeyho post hoc analýzy (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kde priemerná vzdialenosť sa považovala za závislú premennú, zatiaľ čo ošetrenie je nezávislý faktor. Priemerný počet kôl sa navyše vypočítava v 10-minútových intervaloch.
Na posúdenie vplyvu stravy na reprodukčnú výkonnosť An.arabiensis bolo šesť samíc (4 dpe) po odbere krvi premiestnených priamo do klietok Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) a potom im bola poskytnutá experimentálna strava na 48 hodín, ako je opísané vyššie. Strava bola potom odstránená a na tretí deň boli na 48 hodín poskytnuté trecie poháriky (30 ml; Nolato Hertila) naplnené 20 ml destilovanej vody, ktoré sa menili každých 24 hodín. Každý diétny režim opakujte 20 – 50-krát. Vajíčka boli spočítané a zaznamenané pre každú experimentálnu klietku. Podvzorky vajíčok boli použité na posúdenie priemernej veľkosti a dĺžkovej variácie jednotlivých vajíčok (n ≥ 200 na stravu) pomocou mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Nemecko) vybaveného kamerou Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Nemecko). Zvyšné vajíčka sa uchovávali v klimatizovanej miestnosti za štandardných chovných podmienok počas 24 hodín a podvzorka nedávno vyliahnutých lariev 1. instaru (n ≥ 200 na kŕmnu dávku) sa merala podľa vyššie uvedeného postupu. Počet vajíčok a veľkosť vajíčok a lariev sa porovnávali medzi jednotlivými ošetreniami pomocou jednofaktorovej ANOVA a Tukeyho post hoc analýzy (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Z vzoriek odobratých od dobytka plemena Zebu a plemena Arsi boli odobraté prchavé látky z čerstvého moču (1 hodinu po odbere), moču starého 24 hodín, 72 hodín a 168 hodín. Pre uľahčenie boli vzorky moču odobraté skoro ráno, kým boli kravy ešte v stajni. Vzorky moču boli odobraté od 10 jedincov a 100 – 200 ml z každej vzorky bolo prenesených do jednotlivých polyamidových vreciek na pečenie (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Nemecko) v 3-litrových polyamidových vreckách s vekom vo vinylchloridových plastových sudoch. Prchavé látky z každej vzorky hovädzieho moču boli odobraté buď priamo (čerstvé), alebo po zrení pri izbovej teplote počas 24 hodín, 72 hodín a 168 hodín, t. j. každá vzorka moču bola reprezentatívna pre každú vekovú skupinu.
Na zber prchavých látok z headspace sa použil uzavretý systém na cirkuláciu prúdu plynu filtrovaného cez aktívne uhlie (100 ml min-1) cez polyamidové vrecko do adsorpčnej kolóny počas 2,5 hodiny pomocou membránovej vákuovej pumpy (KNF Neuberger, Freiburg, Nemecko). Ako kontrola sa zber z headspace uskutočňoval z prázdneho polyamidového vrecka. Adsorpčná kolóna bola vyrobená z teflónovej trubice (5,5 cm x 3 mm vnútorný priemer) obsahujúcej 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) medzi zátkami zo sklenenej vaty. Pred použitím sa kolóna prepláchla 1 ml redestilovaného n-hexánu (Merck, Darmstadt, Nemecko) a 1 ml pentánu (99,0 % čisté rozpúšťadlo, GC kvalita, Sigma Aldrich). Adsorbované prchavé látky sa eluovali 400 μl pentánu. Zbery z headspace sa spojili a potom sa skladovali pri teplote -20 °C až do použitia na ďalšiu analýzu.
Behaviorálne reakcie komárov An hľadajúcich hostiteľa a konzumujúcich krv. Prchavé extrakty z headspace odobraté z čerstvého, 24-hodinového, 72-hodinového a 168-hodinového moču boli analyzované na prchavé extrakty z komárov Arabidopsis pomocou rovnej sklenenej trubice olfaktometra [18]. Experimenty sa uskutočnili počas ZT 13-15, čo je vrcholné obdobie aktivity komárov An hľadajúcich hostiteľa. Arab [19]. Sklenená trubica olfaktometra (80 cm × 9,5 cm vnútorný priemer) bola osvetlená 3 ± 1 lx červeného svetla zhora. Prúd vzduchu filtrovaný cez aktívne uhlie a zvlhčený (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relatívna vlhkosť) prešiel biotestom pri rýchlosti 30 cm s-1. Vzduch prechádzal cez sériu sít z nehrdzavejúcej ocele, čím sa vytvoril laminárny tok a rovnomerná štruktúra oblaku. Dávkovač dentálnych tampónov (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), zavesený na 5 cm cievke na náveternom konci olfaktometrom so zmenou stimulátora každých 5 minút. Na analýzu sa ako stimul použilo 10 μl každého extraktu z headspace, zriedeného 1:10. Ako kontrola sa použilo rovnaké množstvo pentánu. Jednotlivé komáre hľadajúce hostiteľa alebo cicajúce krv boli umiestnené do jednotlivých klietok na uvoľnenie 2-3 hodiny pred začiatkom experimentu. Klietka na uvoľnenie bola umiestnená na náveternú stranu olfaktometra a komáre sa nechali aklimatizovať 1 minútu, potom sa otvoril motýlí ventil klietky, aby sa uvoľnili. Prilákanie k ošetreniu alebo kontrole sa analyzovalo ako podiel komárov, ktoré prišli do kontaktu so zdrojom do 5 minút od uvoľnenia. Každý prchavý extrakt z headspace a kontrola sa replikovali najmenej 30-krát a aby sa predišlo účinkom ktoréhokoľvek dňa, v každý experimentálny deň sa testoval rovnaký počet ošetrení a kontrol. Reakcie Seek od hostiteľa a krvou kŕmených Ans. Arabské verzus headspace sa analyzovali pomocou nominálnej logistickej regresie, po ktorej nasledovalo párové porovnanie pomerov nepárnych znakov (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Anova reakcia na trenie. Extrakty z voľného priestoru nad krvou z čerstvého a starnúceho kravského moču boli analyzované v klietkach Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastové poháriky (30 ml; Nolato Hertila) naplnené 20 ml destilovanej vody slúžili ako substrát na trenie a boli umiestnené v protiľahlých rohoch klietky, vzdialené od seba 24 cm. Extrahované poháriky boli upravené s 10 μl každého extraktu z voľného priestoru nad krvou v riedení 1:10. Na úpravu kontrolného pohára bolo použité rovnaké množstvo pentánu. Extrahované a kontrolné poháriky boli medzi jednotlivými experimentmi vymenené na kontrolu vplyvu polohy. Desať krvou kŕmených samíc bolo vypustených do experimentálnych klietok v čase ZT 9-11 a vajíčka v pohároch boli spočítané o 24 hodín neskôr. Vzorec na výpočet indexu trenia je: (počet vajíčok nakladených do extraktového pohára – počet vajíčok nakladených do kontrolného pohára) / (celkový počet vajíčok nakladených). Každá liečba bola opakovaná 8-krát.
Analýza samičiek An.arabiensis pomocou plynovej chromatografie a detekcie elektrónového anténneho vzoru (GC-EAD) bola vykonaná podľa predtým opísaného postupu [20]. Stručne povedané, čerstvé prchavé extrakty z headspace boli separované pomocou Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) vybaveného kolónou HP-5 (30 m × 0,25 mm vnútorný priemer, hrúbka filmu 0,25 μm, Agilent Technologies). a starnúci moč. Ako mobilná fáza sa použil vodík s priemerným lineárnym prietokom 45 cm s-1. Každá vzorka (2 μl) sa vstrekovala počas 30 sekúnd v bezdeliacom režime so vstupnou teplotou 225 °C. Teplota plynového chromatografu (GC) bola naprogramovaná od 35 °C (3 minúty výdrže) do 300 °C (10 minút výdrže) pri 10 °C min-1. Do deliča výtoku z GC sa pridal dusík pod tlakom 4 psi a rozdelil sa v pomere 1:1 v nízkoobjemovom krížovom prístroji Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) medzi plameňový ionizačný detektor a EAD. Kapilára výtoku z GC pre EAD prešla cez prenosovú linku Gerstel ODP-2, ktorá sleduje teplotu GC pece plus 5 °C, do sklenenej trubice (10 cm × 8 mm), kde sa zmiešala s uhlíkom filtrovaným, zvlhčeným vzduchom (1,5 l min-1). Anténa bola umiestnená 0,5 cm od výstup skúmavky. Každý jednotlivý komár predstavoval jeden replikát a pre komáre hľadajúce hostiteľa sa vykonali najmenej tri replikáty na vzorkách moču každého veku.
Identifikácia bioaktívnych zlúčenín v kolekciách čerstvého a starnúceho hovädzieho moču v headspace vzorkách pomocou kombinovaného plynového chromatografu (GC-MS; 6890 GC a 5975 MS; Agilent Technologies) na vyvolanie anténnych odpovedí v GC-EAD analýze, pracujúcej v režime ionizácie elektrónovým nárazom pri 70 eV. GC bol vybavený kapilárnou kolónou z taveného oxidu kremičitého s povlakom HP-5MS UI (vnútorný priemer 60 m × 0,25 mm, hrúbka filmu 0,25 μm) s použitím hélia ako mobilnej fázy s priemerným lineárnym prietokom 35 cm s-1. Vzorka s objemom 2 μl bola vstreknutá s použitím rovnakých nastavení vstrekovača a teploty pece ako pri GC-EAD analýze. Zlúčeniny boli identifikované na základe ich retenčného času (Kovátov index) a hmotnostných spektier v porovnaní s vlastnou knižnicou a knižnicou NIST14 (Agilent). Identifikované zlúčeniny boli potvrdené vstreknutím autentických štandardov (Doplnkový súbor 1: Tabuľka S2). Na kvantifikáciu bol použitý heptylacetát (10 ng, Ako externý štandard sa vstrekol roztok (99,8 % chemická čistota, Aldrich).
Vyhodnotenie účinnosti syntetickej zmesi pachov pozostávajúcej z bioaktívnych zlúčenín identifikovaných v čerstvom a starnutom moči na prilákanie hostiteľa vyhľadávajúceho a krv sajúceho Ans.arabiensis s použitím rovnakého olfaktometra a protokolu ako vyššie. Syntetické zmesi napodobňovali zloženie a pomery zlúčenín v zmesových prchavých extraktoch z čerstvého, 24-hodinového, 48-hodinového, 72-hodinového a 168-hodinového moču (obrázok 5D-G; Doplnkový súbor 1: Tabuľka S2). Na analýzu sa použilo 10 μl plne syntetickej zmesi v riedení 1:100 s celkovou rýchlosťou uvoľňovania v rozmedzí približne 140 – 2400 ng h-1 na posúdenie atraktívnosti pre hostiteľa a krv sajúce komáre. Následne sa test vykonal na kompletných zmesiach, v ktorých sa odstránili subtraktívne zmesi jednotlivých zlúčenín kompletnej zmesi. Reakcie na vyhľadávanie od hostiteľa a krvou kŕmeného Ans. Arab verzus syntetické a subtraktívne zmesi sa analyzovali pomocou nominálnej logistickej regresie, po ktorej nasledovalo párové porovnanie pomerov nepárnosti (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby sa posúdilo, či by kravský moč mohol slúžiť ako signál pre hostiteľské prostredie pre komáre spôsobujúce maláriu, čerstvý a starý kravský moč, zozbieraný podľa vyššie uvedeného postupu, a voda boli umiestnené do sieťovaných 3-litrových vedier (100 ml) a umiestnené do pascí s návnadou na hostiteľa. (verzia BG-HDT; BioGents, Regensburg, Nemecko). Desať pascí bolo umiestnených 50 m od seba na pastvinách, 400 m od dedinskej komunity (Silay, Etiópia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) a bez dobytka, na trvalých miestach rozmnožovania a v dedinách. Päť pascí bolo vyhrievaných, aby sa simulovala prítomnosť hostiteľa, zatiaľ čo päť pascí zostalo nevyhrievaných. Každé miesto ošetrenia sa striedalo každú noc celkovo päť nocí. Počty komárov zachytených v pasciach s návnadou na moč rôzneho veku boli porovnané pomocou logistickej regresie s beta binomickým rozdelením (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
V dedine s endemickým výskytom malárie neďaleko mesta Maki v regióne Oromia v Etiópii (8° 11′ 08″ s. š., 38° 81′ 70″ v. d.; obrázok 6A). Štúdia sa uskutočnila medzi polovicou augusta a polovicou septembra pred každoročným postrekom reziduálnou látkou v interiéri, spolu s dlhým obdobím dažďov. Na štúdiu bolo vybraných päť párov domov (vzdialených 20 – 50 m) nachádzajúcich sa na okraji dediny (obr. 6A). Kritériá použité na výber domov boli: v dome neboli povolené žiadne zvieratá, žiadne varenie v interiéri (ťažba palivového dreva alebo dreveného uhlia) (aspoň počas skúšobného obdobia) a domy s maximálne dvoma obyvateľmi, ktoré spali v neinsekticídnych priestoroch. pod ošetrenou moskytiérou. Etické schválenie udelila Inštitucionálna komisia pre etickú revíziu výskumu (IRB/022/2016) Fakulty prírodných vied (CNS-IRB) Univerzity v Addis Abebe v súlade s usmerneniami stanovenými Helsinskou deklaráciou Svetovej lekárskej asociácie. Súhlas od každej hlavy domácnosti bol získaný s pomocou pracovníkov zdravotníckeho poradenstva. Celý proces schvaľujú miestne samosprávy na úrovni okresu a obvodu („kebele“). Experimentálny dizajn sa riadil latinským štvorcom 2 × 2, v ktorom boli syntetické zmesi a kontroly pridelené párovým domom v prvú noc a v nasledujúcu experimentálnu noc sa vymieňali medzi domami. Tento proces sa opakoval desaťkrát. Okrem toho, na odhad aktivity komárov vo vybraných domoch boli pasce CDC nastavené tak, aby bežali päť po sebe nasledujúcich nocí na začiatku, v strede a na konci poľného pokusu v rovnakom čase dňa.
Syntetická zmes obsahujúca šesť bioaktívnych zlúčenín bola rozpustená v heptáne (97,0 % rozpúšťadlo, stupeň GC, Sigma Aldrich) a uvoľňovaná rýchlosťou 140 ng h-1 pomocou dávkovača s bavlneným knôtom [20]. Dávkovač s knôtom umožňoval uvoľňovanie všetkých zlúčenín v konštantnom pomere počas 12-hodinového experimentu. Heptán bol použitý ako kontrola. Ampulka bola zavesená vedľa vstupného bodu svetelnej pasce Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Obrázok 6A). Pasce boli zavesené 0,8 – 1 m nad zemou, blízko nohou postele, a dobrovoľník spal pod neošetrenou moskytiérou a bol v prevádzke medzi 18:00 a 06:30. Komáre odchytené podľa pohlavia a fyziologického stavu (nekŕmené, kŕmené, pologravidné a gravidné [21]) boli následne skrínované pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) na identifikáciu druhu morfologicky identifikovaného ako A. gambiae sl. Členovia komplexu [23]. V teréne V štúdii bolo zachytávanie párových domov analyzované pomocou nominálneho logistického modelu prispôsobenia, kde príťažlivosť bola závislou premennou a liečba (syntetická zmes vs. kontrola) bola fixným efektom (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Tu uvádzame hodnoty χ2 a p z testu pomeru pravdepodobnosti.
Zhodnoťte, či je to bezpečné. Arabiensis bol schopný získať moč, svoj hlavný zdroj dusíka, močovinu, priamym kŕmením, do 48 hodín od podania počas 4 dní po (dpe) pokusoch s kŕmením samíc hľadajúcich hostiteľa a kŕmených krvou (obr. 1A). Samice hľadajúce hostiteľa aj samice cicajúce krv absorbovali významne viac sacharózy ako akúkoľvek inú stravu alebo vodu (F(5 426) = 20,15, p < 0,0001 a F(5 299) = 56,00, p < 0,0001; obr. 1B,C). Okrem toho samice hľadajúce hostiteľa zjedli menej moču po 72 hodinách v porovnaní s močom po 168 hodinách (obr. 1B). Keď im bola ponúknutá strava obsahujúca močovinu, samice hľadajúce hostiteľa absorbovali významne väčšie množstvo močoviny pri 2,69 mM v porovnaní so všetkými ostatnými koncentráciami a vodou, pričom boli nerozoznateľné od 10 % sacharózy (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; Obrázok 1D). Toto bolo v kontraste s reakciou samíc kŕmených krvou, ktoré typicky absorbovali výrazne viac diéty obsahujúcej močovinu ako vody, aj keď výrazne menej ako 10 % sacharózy (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; Obrázok 1).1E). Okrem toho, pri porovnaní dvoch fyziologických stavov, flebotomizované samice absorbovali viac močoviny ako samice hľadajúce hostiteľa pri najnižších koncentráciách a tieto samice absorbovali podobné množstvá močoviny pri vyšších koncentráciách (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; Obr. 1F, G). Zatiaľ čo príjem zo diéty obsahujúcej močovinu mal optimálne hodnoty (Obr. 1D, E), samice v oboch fyziologických stavoch boli schopné modulovať množstvo absorbovanej močoviny v celom rozsahu koncentrácií močoviny logaritmicky lineárnym spôsobom (Obr. 1F, G). ). Podobne sa zdá, že komáre kontrolujú príjem dusíka reguláciou množstva absorbovaného moču, pretože množstvo dusíka v moči sa odráža v absorbovanom množstve (obrázky 1B, C a B).
Na posúdenie vplyvu moču a močoviny na prežitie komárov vyhľadávajúcich hostiteľa a krv cicajúcich, boli samice kŕmené močom všetkých štyroch vekových kategórií (čerstvý, 24 hodín, 72 hodín a 168 hodín po depozícii) a rozsah koncentrácií močoviny, ako aj destilovaná voda a 10 % sacharóza slúžili ako kontrola (obrázok 2A). Táto analýza prežitia ukázala, že strava mala významný vplyv na celkové prežitie u samíc vyhľadávajúcich hostiteľa (moč: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; močovina: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; obr. 2B, C) a samíc kŕmených krvou (moč: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; močovina: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Obrázok 2D,E). Vo všetkých experimentoch mali samice kŕmené diétou pozostávajúcou z moču, močoviny a vody výrazne nižšiu mieru prežitia v porovnaní so samicami kŕmenými sacharózovou diétou (obrázok 2B-E). Samice hľadajúce hostiteľa kŕmené čerstvým a starým močom vykazovali odlišnú mieru prežitia, pričom samice kŕmené 72-hodinovým starým močom (p = 0,016) mali najnižšiu pravdepodobnosť prežitia (obr. 2B). Okrem toho samice hľadajúce hostiteľa kŕmené 135 mM močovinou prežili dlhšie ako kontrolná skupina s vodou (p < 0,04) (obr. 2C). V porovnaní s vodou prežili ženy kŕmené čerstvým močom a 24-hodinovým močom dlhšie (p = 0,001 a p = 0,012; obrázok 2D), zatiaľ čo ženy kŕmené 72-hodinovým močom prežili dlhšie ako tie, ktoré dostávali krátky čerstvý moč a 24-hodinový moč (p < 0,0001 a p = 0,013; obrázok 2D). Pri kŕmení 135 mM močovinou, Samice kŕmené krvou prežili dlhšie ako všetky ostatné koncentrácie močoviny a vody (p < 0,013; obrázok 2E).
Prežitie hostiteľa a krv cicajúcich samičiek Anopheles arabinis, ktoré sa živili kravským močom a močovinou. V biologickej analýze (A) dostávali samičky komárov diétu pozostávajúcu z čerstvého a starnutého kravského moču, rôznych koncentrácií močoviny, sacharózy (10 %) a destilovanej vody (H2O). Prežitie komárov hľadajúcich hostiteľa (B, C) a krv cicajúcich (D, E) komárov sa zaznamenávalo každých 12 hodín, kým všetky samičky kŕmené močom (B, D) a močovinou (C, E) a kontrolné samičky, sacharóza a voda, neuhynuli.
Celková vzdialenosť a počet kôl stanovených v teste letového mlyna počas 24-hodinového obdobia sa líšili medzi komármi hľadajúcimi hostiteľa a komármi cicajúcimi krv, ktoré vykazovali celkovo menšiu letovú aktivitu (obr. 3). Komáre hľadajúce hostiteľa, ktoré poskytovali čerstvý a vyzretý moč alebo sacharózu a vodu, vykazovali odlišné letové vzorce (obr. 3), pričom samice kŕmené čerstvým močom boli aktívnejšie za úsvitu, zatiaľ čo tie, ktoré kŕmili 24- a 168-hodinovým močom. Komáre, ktoré sa živili močom, vykazovali odlišné letové vzorce a boli prevažne denné. Samice komárov, ktoré poskytovali sacharózu alebo 72-hodinový moč, vykazovali aktivitu počas celého 24-hodinového obdobia, zatiaľ čo samice, ktoré poskytovali vodu, boli aktívnejšie v polovici obdobia. Komáre kŕmené sacharózou vykazovali najvyššiu úroveň aktivity neskoro v noci a skoro ráno, zatiaľ čo tie, ktoré konzumovali 72-hodinový moč, zaznamenali stabilný pokles aktivity počas 24 hodín (obrázok 3).
Letový výkon samice Anopheles arabinis, ktorá hľadá poľovníkov a živí sa kravským močom a močovinou. V teste letového mlyna boli samice komárov, ktoré sa živili čerstvým a starým kravským močom, rôznymi koncentráciami močoviny, sacharózy (10 %) a destilovanou vodou (H2O), priviazané k horizontálnym, voľne rotujúcim ramenám (hore). U samíc, ktoré hľadajú hostiteľa (vľavo) a cicajú krv (vpravo), sa zaznamenala celková vzdialenosť a počet letov za hodinu pre každú stravu počas 24-hodinového obdobia (tmavá: sivá; svetlá: biela). Priemerná vzdialenosť a priemerný počet letov sú zobrazené napravo od grafu cirkadiánnej aktivity. Chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu priemeru. Štatistická analýza, pozri text
Vo všeobecnosti celková letová aktivita samíc hľadajúcich hostiteľa sledovala vzorec podobný ako letová vzdialenosť počas 24-hodinového obdobia. Priemerná letová vzdialenosť bola významne ovplyvnená prijatou stravou (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001) a samice hľadajúce hostiteľa, ktoré prijali 72 hodín moču, preleteli výrazne dlhšie vzdialenosti v porovnaní so všetkými ostatnými druhmi stravy (p < 0,0001) a komáre kŕmené sacharózou lietali dlhšie ako komáre kŕmené čerstvým (p = 0,022) a 24 hodín starým močom (p = 0,022). Na rozdiel od vzorca letovej aktivity opísaného stravou s močom, samice hľadajúce hostiteľa kŕmené močovinou vykazovali pretrvávajúcu letovú aktivitu počas 24-hodinového obdobia, ktorá vrcholila v druhej polovici fázy tmy (obr. 3). Hoci vzorce aktivity boli podobné, samice hľadajúce hostiteľa kŕmené močovinou významne zvýšili priemernú letovú vzdialenosť v závislosti od absorbovanej koncentrácie (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice hľadajúce hostiteľa kŕmené akoukoľvek koncentráciou močoviny lietali dlhšie ako samice kŕmené buď vodou, alebo sacharózou (p < 0,03).
Celková letová aktivita krvosajúcich komárov bola stabilná a trvalá počas 24 hodín vo všetkých druhoch stravy, so zvýšenou aktivitou moču počas druhej polovice obdobia tmy u samíc kŕmených vodou, ako aj u samíc kŕmených čerstvou vodou a 24 hodín starou vodou (obrázok 3). Zatiaľ čo močová strava významne ovplyvnila priemernú letovú vzdialenosť u samíc kŕmených krvou (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), močovinová strava to neovplyvnila (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) v porovnaní s iným močom a kontrolnou stravou (čerstvá, p = 0,0091; 72 hodín, p = 0,0022; 168 hodín, p = 0,001; sacharóza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Vplyv kŕmenia močom a močovinou na reprodukčné parametre bol hodnotený v biologických testoch kladenia vajec (obrázok 4A) a skúmal sa podľa počtu vajec nakladených každou samicou, veľkosti vajec a novovyliahnutých lariev v prvom instare. Počet nakladených vajec. Arabské samice kŕmené močom sa líšili v závislosti od stravy (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; obr. 4B). Samice kŕmené 24-hodinovým močom a krvnou múčkou nakládli výrazne viac vajec ako samice kŕmené inou močovou stravou a boli podobné ako tie, ktoré dostávali sacharózu (obr. 4B). Podobne sa veľkosť vajec nakladených samicami kŕmenými močom líšila v závislosti od stravy (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), pričom samice kŕmené 24-hodinovým močom a sacharózou kládli výrazne väčšie vajíčka ako samice kŕmené vodou, zatiaľ čo vajíčka samíc kŕmených 168 hodinami moču boli výrazne menšie (obr. 4C). Okrem toho močová strava významne ovplyvnila veľkosť lariev (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), pričom z vajíčok nakladených 24- a 72-hodinovými samicami kŕmenými močom sa vyliahli výrazne väčšie larvy ako z vajíčok nakladených larvami vajíčok. Samice kŕmené vodou a 168-hodinové samice kŕmené močom (obrázok 4D).
Reprodukčný výkon samíc Anopheles arabinis, ktoré sa živili kravským močom a močovinou. Krvné samičky komárov boli kŕmené diétou pozostávajúcou z čerstvého a starého kravského moču, rôznych koncentrácií močoviny, sacharózy (10 %) a destilovanej vody (H2O) počas 48 hodín pred umiestnením do biologických testov a získaním substrátov na kladenie vajíčok (A). Počet vajíčok (B, E), veľkosť vajíčok (C, F) a veľkosť lariev (D, G) boli významne ovplyvnené poskytnutou diétou (kravský moč: BD; močovina: EG). Priemery pre každý parameter meraný pomocou rôznych písmenových názvov sa od seba významne líšili (jednosmerná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu priemeru.
Ako hlavná dusíkatá zložka moču, močovina, keď bola podávaná ako potrava samiciam kŕmeným krvou, významne ovplyvnila reprodukčné parametre vo všetkých štúdiách. Počet vajíčok nakladených samicami kŕmenými močovinou po krvnom príjme v závislosti od koncentrácie močoviny (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice kŕmené koncentráciami močoviny medzi 134 µM a 1,34 mM nakládli viac vajíčok (obrázok 4E). Samice kŕmené koncentráciami močoviny 134 µM alebo vyššími kládli väčšie vajíčka ako samice kŕmené vodou (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; obrázok 4F) a veľkosť lariev, hoci bola ovplyvnená podobnými koncentráciami močoviny u matiek (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), bola variabilnejšia (obr. 4G).
Celková atraktivita pre prchavé extrakty z voľne žijúcich hovädzích zvierat hľadajúcich hostiteľa. U druhu Arabiensis hodnoteného v olfaktometre so sklenenou trubicou (obr. 5A) mal významný vplyv vek moču (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; obr. 5B). Post hoc analýza ukázala, že zápach zatuchnutého moču po 24 hodinách spôsobil výrazne vyššiu úroveň atraktivity v porovnaní so všetkými ostatnými ošetreniami (72 hodín: p = 0,0060, 168 hodín: p = 0,012, pentán: p = 0,00070), s výnimkou vône čerstvého moču (p = 0,13; obrázok 5B). Hoci celková príťažlivosť komárov cicajúcich krv k zápachu moču nebola významne odlišná (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; obr. 5C), zistilo sa, že tieto samice boli výrazne atraktívnejšie pre prchavé extrakty z voľne žijúcich hovädzích zvierat v porovnaní s močom starnutým 72 hodín v porovnaní s kontrolami (p = 0,0066; Obrázok 5C).
Behaviorálne reakcie na pachy prírodného a syntetického kravského moču pri hľadaní hostiteľa a komárov kŕmených krvou Anopheles arabianus. Schéma olfaktometra so sklenenou trubicou (A). Priťahovanie prchavých extraktov z voľného priestoru (headspace) z čerstvého a starého kravského moču na hostiteľa (B) a komáre sajúce krv (C). Nájdite chápadlovú reakciu Lorda An. Zobrazené sú extrakty z voľného priestoru izolované z čerstvého (D), 24-hodinového (E), 72-hodinového (F) a 168-hodinového (G) kravského moču. Stopy detekcie elektrónovou anténou (EAD) ukazujú zmeny napätia v reakcii na bioaktívne zlúčeniny v voľnom priestore eluované z plynového chromatografu a detegované plameňovým ionizačným detektorom (FID). Mierka predstavuje amplitúdu odozvy (mV) oproti retenčnému času (s). Zobrazené sú vlastnosti a rýchlosti uvoľňovania (µg h-1) biologicky aktívnych zlúčenín. Jedna hviezdička (*) označuje konzistentnú odozvu s nízkou amplitúdou. Dvojité hviezdičky (**) označujú nereprodukovateľné reakcie. Nájdite hostiteľa (H) a komára sajúceho krv. (I) An.arabiensis má odlišnú atraktivitu pre syntetické zmesi pachov čerstvého a starého kravského moču. Priemerné podiely komárov priťahovaných rôznymi písmenovými názvami sa od seba významne líšili (jednosmerná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu stupnice.
Samica Ann.arabiensis, 72 hodín a 120 hodín po krvnej múčke, počas trenia, nepreukázala žiadnu preferenciu pre prchavé extrakty z čerstvého a starnúceho kravského moču z priestoru nad krvou v porovnaní s kontrolami s pentánom (χ2 = 3,07, p > 0,05; Doplnkový súbor 1: Obr. S1).
U samičiek Ann.arabiensis analýzy GC-EAD a GC-MS identifikovali osem, šesť, tri a tri bioaktívne zlúčeniny (obrázok 5D-G). Hoci sa pozorovali rozdiely v počte zlúčenín, ktoré vyvolali elektrofyziologické reakcie, väčšina týchto zlúčenín bola prítomná v každom prchavom extrakte z priestoru nad zemou odobratom z čerstvého a starnúceho moču. Preto boli do ďalších analýz pre každý extrakt zahrnuté iba zlúčeniny, ktoré vyvolali fyziologickú reakciu samičích tykadiel nad prahovou hodnotou.
Celková rýchlosť uvoľňovania prchavých bioaktívnych zlúčenín v headspace kolekcii sa zvýšila z 29 µg h-1 v čerstvom moči na 242 µg h-1 v 168-hodinovom moči, najmä v dôsledku p-krezolu a m-formaldehydu. Zvyšuje sa aj obsah fenolu, ako aj obsahu fenolu. Naopak, rýchlosti uvoľňovania iných zlúčenín, ako je 2-cyklohexén-1-ón a dekanal, sa so zvyšujúcim sa vekom moču znižovali, čo korelovalo s pozorovaným poklesom intenzity (množstva) signálu v chromatograme (obr. 5D)-G ľavý panel) a fyziologickými reakciami na tieto zlúčeniny (obr. 5D-G pravý panel).
Celkovo mala syntetická zmes podobný prirodzený pomer bioaktívnych zlúčenín identifikovaných v prchavých extraktoch z čerstvého a starnúceho moču (obr. 5D–G) a nezdalo sa, že by vyvolávala významnú príťažlivosť pri hľadaní hostiteľa (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; obr. 5H) alebo komárov cicajúcich krv (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; obr. 5I). Avšak post hoc párové porovnania medzi liečbami ukázali, že komáre hľadajúce hostiteľa boli významne atraktívne pre syntetickú zmes 24-hodinového moču v porovnaní s kontrolami s pentánom (p = 0,0086; obrázok 5H).
Na posúdenie úlohy jednotlivých zložiek v syntetických zmesiach moču starnutého 24 hodín bolo v Y-trubicovom teste hodnotených šesť subtrakčných zmesí oproti kompletným zmesiam, v ktorých boli jednotlivé zlúčeniny odstránené. U komárov hľadajúcich hostiteľa malo odčítanie jednotlivých zlúčenín z kompletnej zmesi významný vplyv na behaviorálne reakcie (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Doplnkový súbor 1: Obrázok S2A), pričom všetky subtrakčné zmesi boli atraktívnejšie ako plne zmiešané. Naproti tomu odstránenie jednotlivých zlúčenín z plne syntetickej zmesi neovplyvnilo behaviorálne reakcie komárov cicajúcich krv (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s výnimkou dekanalu, ktorý viedol k nižším úrovniam príťažlivosti v porovnaní s kompletnou zmesou (p = 0,022; Doplnkový súbor 1: Obrázok S2B).
V dedine v Etiópii s endemickým výskytom malárie sa počas desiatich nocí hodnotila účinnosť syntetickej zmesi 24-hodinového kravského moču pri prilákaní komárov v poľných podmienkach (obr. 6A). Celkovo bolo odchytených a identifikovaných 4 861 komárov, z ktorých 45,7 % tvorili Anthropus.gambiae sl, 18,9 % Anopheles pharoensis a 35,4 % Culex spp. (Doplnkový súbor 1: Tabuľka S1). Anopheles arabinis je jediný člen druhového komplexu An.Gambiae identifikovaný pomocou PCR analýzy. V priemere bolo odchytených 320 komárov za noc, pričom počas tohto obdobia pasce so zmesou návnad chytili viac komárov ako párové pasce bez zmesi (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pasce bez návnady boli umiestnené počas každej z piatich kontrolných nocí na začiatku, v strede a na konci pokusu. V každom páre pascí bol odchytený podobný počet komárov, čo naznačuje... žiadna odchýlka medzi domami (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) a žiadny pokles populácie počas sledovaného obdobia. V porovnaní s kontrolnými pascami sa počet komárov odchytených v pasciach obsahujúcich syntetickú zmes výrazne zvýšil: hľadanie hostiteľa (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedávne kŕmenie sa krvou (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) a gravidita (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Doplnkový súbor 1: Tabuľka S1). Toto sa odráža aj v celkovom počte odchytených komárov: hľadanie hostiteľa > cicanie krvi > gravidné > pologravidné > samce.
Terénne hodnotenie účinnosti 24-hodinovej syntetickej zmesi zápachu kravského moču. Terénne pokusy sa uskutočnili v juho-centrálnej Etiópii (mapa), neďaleko mesta Maki (vložka), s použitím svetelnej pasce Centra pre kontrolu chorôb (CDC) (vpravo) v párových domoch s latinským štvorcovým dizajnom (letecký snímok) (A). Syntetické fotopasce CDC s pachovou návnadou priťahujú a zachytávajú samičky Anopheles arabesques (B), ale nie Anopheles farroes (C), iným spôsobom, čo je efekt závislý od fyziologického stavu. Okrem toho tieto pasce zachytili výrazne zvýšený počet hostiteľských komárov Culex. (D) V porovnaní s kontrolou. Stĺpce vľavo predstavujú priemerný selekčný index komárov chytených v pároch pascí s odorantovou návnadou (zelená) a kontrolných (otvorených) pascí (N = 10), zatiaľ čo stĺpce vpravo predstavujú priemerný selekčný index v pároch kontrolných pascí (otvorené; N = 5). Hviezdičky označujú úrovne štatistickej významnosti (*p = 0,01 a ***p < 0,0001).
Tri druhy boli odchytené odlišne v pasciach obsahujúcich syntetické zmesi. Pri hľadaní hostiteľa (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), kŕmení krvou (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) a gravidite (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) bol .arabiensis odchytený v pasci, ktorá uvoľňovala syntetickú zmes (Obr. 6B), zatiaľ čo množstvo An sa nelíšilo. Boli nájdené komáre Pharaoensis v rôznych fyziologických stavoch (Obr. 6C). V prípade Culexu sa zistil iba významný nárast počtu komárov hľadajúcich hostiteľa v pasciach s návnadou zo syntetickej zmesi (χ2(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004; Obr. 6D) v porovnaní s kontrolnými pascami.
Na posúdenie, či komáre malárie používajú zápach kravského moču ako signál pre hostiteľské prostredie, boli použité pasce s návnadou na hostiteľa umiestnené mimo potenciálnych hostiteľov medzi miestami rozmnožovania a vidieckymi komunitami v Etiópii. V neprítomnosti signálov hostiteľa, tepla a s prítomnosťou alebo bez prítomnosti zápachu kravského moču neboli odchytené žiadne komáre (Doplnkový súbor 1: Obrázok S3). Avšak v prítomnosti vysokej teploty a zápachu kravského moču boli samice komárov malárie prilákané a odchytené, aj keď v malom počte, nezávisle od veku moču (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Doplnkový súbor 1: Obrázok S3). Naproti tomu kontrolné vzorky s vodou nezachytili komáre malárie pri vysokých teplotách (Doplnkový súbor 1: Obrázok S3).
Komáre spôsobujúce maláriu získavajú a distribuujú zlúčeniny obsahujúce dusík kompenzačným kŕmením sa kravským močom (t. j. mlákami), aby sa zlepšili znaky životného cyklu, podobne ako u iného hmyzu [2, 4, 24, 25, 26]. Kravský moč je ľahko dostupný obnoviteľný zdroj úzko spojený s miestami odpočinku prenášačov malárie, ako sú maštale a vysoká vegetácia v blízkosti vidieckych domov a miest neresenia. Samičky komárov lokalizujú tento zdroj čuchom a sú schopné regulovať príjem dusíkatých zlúčenín v moči, vrátane močoviny, hlavnej dusíkatej zložky v moči [15, 16]. V závislosti od fyziologického stavu samičky komára sa živiny v moči prideľujú na zvýšenie letovej aktivity a prežitia samičiek komárov hľadajúcich hostiteľa, ako aj na prežitie a reprodukčné charakteristiky jedincov kŕmených krvou počas prvého gonadotropného cyklu. Preto miešanie moču zohráva dôležitú nutričnú úlohu pre prenášače malárie, ktoré sú uzavreté ako podvyživené dospelé jedince [8], pretože poskytuje samičkám komárov schopnosť získavať dôležité dusíkaté zlúčeniny zapojením sa do kŕmenia s nízkym rizikom. Toto zistenie má významné epidemiologické dôsledky, pretože samičky zvyšujú svoju dĺžku života, aktivita a reprodukčný výkon, čo všetko ovplyvňuje kapacitu vektorov. Okrem toho môže byť toto správanie cieľom budúcich programov manažmentu vektorov.