Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazuje karusel troch snímok naraz.Pomocou tlačidiel Predchádzajúci a Ďalší sa môžete pohybovať po troch snímkach naraz alebo pomocou posúvacích tlačidiel na konci môžete prechádzať tromi snímkami naraz.
Hematoencefalická bariéra a hematoencefalická bariéra bránia bioterapeutickým látkam dosiahnuť svoje ciele v centrálnom nervovom systéme, čím bránia účinnej liečbe neurologických ochorení.Na objavenie nových mozgových transportérov in vivo sme zaviedli knižnicu fágových peptidov T7 a sériovo odoberali krv a mozgovomiechový mok (CSF) pomocou kanylovaného modelu veľkého bazéna potkanov pri vedomí.Špecifické fágové klony boli vysoko obohatené v CSF po štyroch kolách selekcie.Testovanie jednotlivých kandidátskych peptidov odhalilo viac ako 1000-násobné obohatenie CSF.Bioaktivita peptidom sprostredkovaného dodania do mozgu bola potvrdená 40% znížením hladiny amyloidu-p v mozgovomiechovom moku pomocou BACE1 peptidového inhibítora spojeného s identifikovaným novým tranzitným peptidom.Tieto výsledky naznačujú, že peptidy identifikované metódami fágovej selekcie in vivo môžu byť užitočnými vehikulami na systémové dodávanie makromolekúl do mozgu s terapeutickým účinkom.
Výskum cielenej terapie na centrálny nervový systém (CNS) sa vo veľkej miere zameral na identifikáciu optimalizovaných liekov a činidiel, ktoré vykazujú vlastnosti zacielenia na CNS, s menším úsilím na objavenie mechanizmov, ktoré poháňajú aktívne dodávanie liekov do mozgu.To sa teraz začína meniť, pretože podávanie liekov, najmä veľkých molekúl, je neoddeliteľnou súčasťou moderného vývoja liekov v neurovede.Prostredie centrálneho nervového systému je dobre chránené cerebrovaskulárnym bariérovým systémom, ktorý pozostáva z hematoencefalickej bariéry (BBB) ​​a hematoencefalickej bariéry (BCBB)1, čo sťažuje dodávanie liekov do mozgu1,2.Odhaduje sa, že takmer všetky lieky s veľkou molekulou a viac ako 98 % liekov s malou molekulou sú z mozgu eliminované3.Preto je veľmi dôležité identifikovať nové mozgové transportné systémy, ktoré poskytujú účinné a špecifické dodávanie terapeutických liečiv do CNS 4,5.BBB a BCSFB však tiež predstavujú vynikajúcu príležitosť na dodávanie liekov, pretože prenikajú a vstupujú do všetkých štruktúr mozgu cez jeho rozsiahlu vaskulatúru.Súčasné snahy o použitie neinvazívnych metód dodania do mozgu sú teda z veľkej časti založené na mechanizme receptorom sprostredkovaného transportu (PMT) pomocou endogénneho receptora BBB6.Napriek nedávnym kľúčovým pokrokom využívajúcim dráhu transferínového receptora7,8 je potrebný ďalší vývoj nových dodávacích systémov so zlepšenými vlastnosťami.Na tento účel bolo naším cieľom identifikovať peptidy schopné sprostredkovať transport CSF, pretože by sa v princípe mohli použiť na dodanie makromolekúl do CNS alebo na otvorenie nových receptorových dráh.Konkrétne, špecifické receptory a transportéry cerebrovaskulárneho systému (BBB a BSCFB) môžu slúžiť ako potenciálne ciele pre aktívne a špecifické dodávanie bioterapeutických liečiv.Cerebrospinálny mok (CSF) je sekrečný produkt choroidálneho plexu (CS) a je v priamom kontakte s intersticiálnou tekutinou mozgu cez subarachnoidálny priestor a komorový priestor4.Nedávno sa ukázalo, že subarachnoidálny cerebrospinálny mok nadmerne difunduje do interstícia v mozgu9.Dúfame, že sa dostaneme do parenchymálneho priestoru pomocou tohto subarachnoidálneho prítokového traktu alebo priamo cez BBB.Aby sme to dosiahli, implementovali sme robustnú stratégiu výberu fágov in vivo, ktorá ideálne identifikuje peptidy transportované jednou z týchto dvoch odlišných dráh.
Teraz opisujeme sekvenčnú in vivo metódu skríningu na fágu s odberom vzoriek CSF spojeným s vysokovýkonným sekvenovaním (HTS) na monitorovanie počiatočných selekčných kôl s najvyššou diverzitou knižnice.Skríning sa uskutočnil na potkanoch pri vedomí pomocou permanentne implantovanej kanyly veľkej cisterny (CM), aby sa zabránilo kontaminácii krvi.Dôležité je, že tento prístup vyberá tak zacielenie na mozog, ako aj peptidy s transportnou aktivitou cez cerebrovaskulárnu bariéru.Použili sme fágy T7 kvôli ich malej veľkosti (~ 60 nm)10 a navrhli sme, že sú vhodné na transport vezikúl, ktoré umožňujú transcelulárny prechod endoteliálnou a/alebo epiteliálno-medulovou bariérou.Po štyroch kolách panorámovania sa izolovali fágové populácie, ktoré vykazovali silné in vivo obohatenie CSF a asociáciu cerebrálnych mikrociev.Dôležité je, že sme dokázali potvrdiť naše zistenia preukázaním, že preferované a chemicky syntetizované najlepšie kandidátske peptidy sú schopné transportovať proteínový náklad do cerebrospinálnej tekutiny.Po prvé, farmakodynamické účinky CNS boli stanovené kombináciou hlavného tranzitného peptidu s inhibítorom BACE1 peptidu.Okrem preukázania, že in vivo funkčné skríningové stratégie môžu identifikovať nové mozgové transportné peptidy ako účinné nosiče proteínového nákladu, očakávame, že podobné prístupy funkčného výberu sa stanú dôležitými aj pri identifikácii nových mozgových transportných dráh.
Na základe jednotiek tvoriacich plaky (PFU) bola po kroku balenia fágom navrhnutá a vytvorená knižnica náhodných 12-mérnych lineárnych T7 fágových peptidov s diverzitou približne 109 (pozri Materiály a metódy).Je dôležité poznamenať, že sme túto knižnicu starostlivo analyzovali pred in vivo panorámovaním.PCR amplifikácia vzoriek fágovej knižnice pomocou modifikovaných primérov generovala amplikóny, ktoré boli priamo aplikovateľné na HTS (doplnkový obrázok 1a).V dôsledku a) chýb sekvenovania HTS11, b) vplyvu na kvalitu primérov (NNK) 1-12 a c) prítomnosti fágu divokého typu (wt) (vložky kostry) v pohotovostnej knižnici bol implementovaný postup filtrovania sekvencií, aby sa extrahovali iba overené informácie o sekvencii (doplnkový obrázok 1b).Tieto kroky filtrovania sa vzťahujú na všetky sekvenčné knižnice HTS.Pre štandardnú knižnicu sa získalo celkom 233 868 čítaní, z ktorých 39% prešlo filtračnými kritériami a použilo sa na analýzu knižnice a výber pre nasledujúce kolá (doplnkový obrázok 1c – e).Čítania boli prevažne násobky dĺžky 3 párov báz s vrcholom pri 36 nukleotidoch (doplnkový obrázok 1c), čo potvrdzuje dizajn knižnice (NNK) 1-12.Je pozoruhodné, že približne 11 % členov knižnice obsahovalo 12-rozmerný inzert PAGISRELVDKL hlavného reťazca divokého typu (wt) a takmer polovica sekvencií (49 %) obsahovala inzercie alebo delécie.HTS knižnice knižnice potvrdila vysokú diverzitu peptidov v knižnici: viac ako 81 % peptidových sekvencií sa našlo iba raz a iba 1,5 % sa vyskytlo v ≥4 kópiách (doplnkový obrázok 2a).Frekvencie aminokyselín (aa) vo všetkých 12 pozíciách v repertoári dobre korelovali s frekvenciami očakávanými pre počet kodónov generovaných degenerovaným NKK repertoárom (doplnkový obrázok 2b).Pozorovaná frekvencia aa zvyškov kódovaných týmito vložkami dobre korelovala s vypočítanou frekvenciou (r = 0,893) (doplnkový obrázok 2c).Príprava fágových knižníc na injekciu zahŕňa kroky amplifikácie a odstránenia endotoxínu.Predtým sa ukázalo, že to potenciálne znižuje diverzitu fágových knižníc12, 13.Preto sme sekvenovali na platni amplifikovanú fágovú knižnicu, ktorá bola podrobená odstráneniu endotoxínu, a porovnali sme ju s pôvodnou knižnicou, aby sme odhadli frekvenciu AA.Pozorovala sa silná korelácia (r = 0,995) medzi pôvodným súborom a amplifikovaným a purifikovaným súborom (doplnkový obrázok 2d), čo naznačuje, že konkurencia medzi klonmi amplifikovanými na platniach s použitím fágu T7 nespôsobila veľké skreslenie.Toto porovnanie je založené na frekvencii tripeptidových motívov v každej knižnici, pretože rozmanitosť knižníc (~ 109) nemožno úplne zachytiť ani s HTS.Frekvenčná analýza aa v každej polohe odhalila malú odchýlku závislú od polohy v posledných troch pozíciách zadaného repertoáru (doplnkový obrázok 2e).Na záver sme dospeli k záveru, že kvalita a diverzita knižnice boli prijateľné a boli pozorované len malé zmeny v diverzite v dôsledku amplifikácie a prípravy fágových knižníc medzi niekoľkými kolami selekcie.
Sériový odber vzoriek mozgovomiechového moku sa môže uskutočniť chirurgickou implantáciou kanyly do CM potkanov pri vedomí, aby sa uľahčila identifikácia fága T7 injikovaného intravenózne (iv) cez BBB a/alebo BCSFB (obr. la-b).V prvých troch kolách selekcie in vivo sme použili dve nezávislé selekčné ramená (ramená A a B) (obr. 1c).Postupne sme zvyšovali prísnosť selekcie znižovaním celkového množstva fágov zavedených v prvých troch kolách selekcie.Pre štvrté kolo ryžovania sme skombinovali vzorky z vetiev A a B a vykonali sme tri ďalšie nezávislé výbery.Na štúdium in vivo vlastností fágových častíc T7 v tomto modeli sa potkanom cez chvostovú žilu injikoval fág divokého typu (hlavný inzert PAGISRELVDKL).Obnova fágov z mozgovomiechového moku a krvi v rôznych časových bodoch ukázala, že relatívne malé ikosaedrické fágy T7 mali rýchlu počiatočnú fázu odstraňovania z krvného kompartmentu (doplnkový obrázok 3).Na základe podávaných titrov a objemu krvi potkanov sme vypočítali, že iba približne 1 % hm.fág z podanej dávky bol detegovaný v krvi 10 minút po intravenóznej injekcii.Po tomto počiatočnom rýchlom poklese sa nameral pomalší primárny klírens s polčasom 27,7 minúty.Dôležité je, že z kompartmentu CSF sa získalo len veľmi málo fágov, čo naznačuje nízke pozadie migrácie fágov divokého typu do kompartmentu CSF (doplnkový obrázok 3).V priemere sa v mozgovomiechovom moku za celé obdobie odberu vzoriek (0-250 min) detegovalo len asi 1 x 10-3 % titrov fágu T7 v krvi a 4 x 10-8 % pôvodne infúznych fágov.Je pozoruhodné, že polčas (25,7 min) fágu divokého typu v cerebrospinálnej tekutine bol podobný ako polčas pozorovaný v krvi.Tieto údaje ukazujú, že bariéra oddeľujúca kompartment CSF od krvi je neporušená u potkanov s CM-kanyláciou, čo umožňuje in vivo selekciu fágových knižníc na identifikáciu klonov, ktoré sa ľahko transportujú z krvi do kompartmentu CSF.
a) Stanovenie metódy opätovného odberu vzoriek mozgovomiechového moku (CSF) z veľkého fondu.(b) Diagram znázorňujúci bunkové umiestnenie bariéry centrálneho nervového systému (CNS) a selekčnú stratégiu použitú na identifikáciu peptidov, ktoré prechádzajú hematoencefalickou bariérou (BBB) ​​a hematoencefalickou bariérou.(c) Vývojový diagram skríningu fágového displeja in vivo.V každom kole selekcie boli intravenózne injikované fágy (identifikátory zvierat vo vnútri šípok).Dve nezávislé alternatívne vetvy (A, B) sú ponechané oddelene až do 4. kola výberu.Pre selekčné kolá 3 a 4 bol každý fágový klon extrahovaný z CSF manuálne sekvenovaný.(d) Kinetika fága izolovaného z krvi (červené krúžky) a mozgovomiechového moku (zelené trojuholníky) počas prvého kola selekcie u dvoch potkanov s kanyláciou po intravenóznej injekcii T7 peptidovej knižnice (2 x 1012 fágov/zviera).Modré štvorce označujú priemernú počiatočnú koncentráciu fágu v krvi, vypočítanú z množstva injikovaného fágu, berúc do úvahy celkový objem krvi.Čierne štvorce označujú priesečník čiary y extrapolovanej z koncentrácií fágov v krvi.(e, f) Prezentujte relatívnu frekvenciu a distribúciu všetkých možných prekrývajúcich sa tripeptidových motívov nachádzajúcich sa v peptide.Je zobrazený počet nájdených motívov pri 1000 čítaniach.Výrazne (p < 0,001) obohatené motívy sú označené červenými bodkami.(e) Korelačný bodový graf porovnávajúci relatívnu frekvenciu tripeptidového motívu injikovanej knižnice s fágmi získanými z krvi zo zvierat #1.1 a #1.2.(f) Korelačný rozptylový graf porovnávajúci relatívne frekvencie zvieracích fágových tripeptidových motívov #1.1 a #1.2 izolovaných v krvi a mozgovomiechovom moku.(g, h) Reprezentácia ID sekvencie fága obohateného v krvi (g) oproti injikovaným knižniciam a fágu obohatenému o CSF ​​(h) oproti krvi po kole selekcie in vivo u oboch zvierat.Veľkosť jednopísmenového kódu udáva, ako často sa aminokyselina vyskytuje na danej pozícii.Zelená = polárna, fialová = neutrálna, modrá = zásaditá, červená = kyslá a čierna = hydrofóbne aminokyseliny.Obrázok 1a, b navrhol a vyrobil Eduard Urich.
Injikovali sme knižnicu fágových peptidov do dvoch prístrojových potkanov CM (klad A a B) a izolovali sme fág z cerebrospinálnej tekutiny a krvi (obrázok 1d).Počiatočný rýchly klírens knižnice bol menej výrazný v porovnaní s fágom divokého typu.Priemerný polčas injikovanej knižnice u oboch zvierat bol 24,8 minút v krvi, podobne ako u fágov divokého typu, a 38,5 minút v CSF.Vzorky fágov krvi a mozgovomiechového moku z každého zvieraťa sa podrobili HTS a všetky identifikované peptidy sa analyzovali na prítomnosť krátkeho tripeptidového motívu.Tripeptidové motívy boli vybrané, pretože poskytujú minimálny základ pre tvorbu štruktúry a interakcie peptid-proteín14,15.Zistili sme dobrú koreláciu v distribúcii motívov medzi injikovanou fágovou knižnicou a klonmi extrahovanými z krvi oboch zvierat (obr. 1e).Údaje naznačujú, že zloženie knižnice je len okrajovo obohatené v krvnom kompartmente.Aminokyselinové frekvencie a konsenzuálne sekvencie sa ďalej analyzovali v každej polohe pomocou adaptácie softvéru Weblogo16.Je zaujímavé, že sme zistili silné obohatenie zvyškov glycínu v krvi (obr. 1g).Keď sa krv porovnala s klonmi vybranými z CSF, pozorovala sa silná selekcia a určitá deselekcia motívov (obr. lf) a určité aminokyseliny boli prednostne prítomné na vopred určených pozíciách v 12-člennej skupine (obr. 1h).Je pozoruhodné, že jednotlivé zvieratá sa významne líšili v mozgovomiechovom moku, zatiaľ čo obohatenie krvného glycínu bolo pozorované u oboch zvierat (doplnkový obrázok 4a – j).Po prísnom filtrovaní sekvenčných údajov v mozgovomiechovom moku zvierat #1.1 a #1.2 sa získalo celkom 964 a 420 jedinečných 12-mérnych peptidov (doplnkový obrázok 1d – e).Izolované fágové klony sa amplifikovali a podrobili sa druhému kolu selekcie in vivo.Fág extrahovaný z druhého kola selekcie bol podrobený HTS u každého zvieraťa a všetky identifikované peptidy boli použité ako vstup do programu rozpoznávania motívov na analýzu výskytu tripeptidových motívov (obr. 2a, b, ef).V porovnaní s prvým cyklom fágu získaného z CSF sme pozorovali ďalšiu selekciu a deselekciu mnohých motívov v CSF vo vetvách A a B (obr. 2).Algoritmus identifikácie siete sa použil na určenie, či predstavujú rôzne vzory konzistentnej sekvencie.Jasná podobnosť bola pozorovaná medzi 12-rozmernými sekvenciami získanými CSF v alternatívnom klade A (obr. 2c, d) a klade B (obr. 2g, h).Súhrnná analýza v každej vetve odhalila rôzne profily selekcie pre 12-mérne peptidy (doplnkový obrázok 5c, d) a zvýšenie pomeru CSF/krv v priebehu času pre spojené klony po druhom kole selekcie v porovnaní s prvým kolom selekcie (doplnkový obrázok 5e).).
Obohatenie motívov a peptidov v cerebrospinálnej tekutine dvoma po sebe nasledujúcimi kolami in vivo funkčného fágového displeja.
Všetky fágy mozgovomiechového moku získané z prvého kola každého zvieraťa (zvieratá č. 1.1 a č. 1.2) boli spojené, amplifikované, HT-sekvenované a reinjektované spolu (2 x 1010 fágov/zviera) 2 SM kanylovaným potkanom (č. 1.1 → #).2.1 a 2.2, 1.2 -> 2.3 a 2.4).(a, b, e, f) Korelačné rozptylové grafy porovnávajúce relatívnu frekvenciu tripeptidových motívov všetkých fágov odvodených z CSF v prvom a druhom selekčnom kole.Relatívna frekvencia a distribúcia motívov reprezentujúcich všetky možné prekrývajúce sa tripeptidy nachádzajúce sa v peptidoch v oboch orientáciách.Je zobrazený počet nájdených motívov pri 1000 čítaniach.Motívy, ktoré boli významne (p < 0,001) vybrané alebo vylúčené v jednej z porovnávaných knižníc, sú zvýraznené červenými bodkami.(c, d, g, h) Reprezentácia loga sekvencie všetkých sekvencií dlhých 12 aminokyselín bohatých na CSF na základe kôl 2 a 1 selekcie in vivo.Veľkosť jednopísmenového kódu udáva, ako často sa aminokyselina vyskytuje na danej pozícii.Na znázornenie loga sa porovnáva frekvencia CSF sekvencií extrahovaných z jednotlivých zvierat medzi dvoma selekčnými kolami a sú zobrazené obohatené sekvencie v druhom kole: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4.Najviac obohatené aminokyseliny na danej pozícii u (c, d) zvierat č.2.1 a č.2.2 alebo (g, h) u zvierat č.2.3 a č.2.4 sú zobrazené farebne.Zelená = polárna, fialová = neutrálna, modrá = zásaditá, červená = kyslá a čierna = hydrofóbne aminokyseliny.
Po treťom kole selekcie sme identifikovali 124 jedinečných peptidových sekvencií (#3.1 a #3.2) z 332 CSF-rekonštituovaných fágových klonov izolovaných z dvoch zvierat (doplnkový obrázok 6a).Najvyšší relatívny podiel mala sekvencia LGSVS (18,7 %), po ktorej nasledovali inzerty divokého typu PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) a SARGSWREIVSLS (2,2 %).V poslednom štvrtom kole sme spojili dve nezávisle vybrané vetvy z troch samostatných zvierat (obr. 1c).Z 925 sekvenovaných fágových klonov získaných z CSF sme vo štvrtom kole našli 64 jedinečných peptidových sekvencií (doplnkový obrázok 6b), medzi ktorými relatívny podiel fágu divokého typu klesol na 0,8 %.Najbežnejšie klony CSF vo štvrtom kole boli LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) a RLSSVDSDLSGC (3, 2).%)).Rozsah dĺžky vybraných peptidov je spôsobený nukleotidovými inzerciami/deléciami alebo predčasnými stop kodónmi v priméroch knižnice, keď sa na návrh knižnice NNK používajú degenerované kodóny.Predčasné stop kodóny generujú kratšie peptidy a sú vybrané, pretože obsahujú priaznivý aa motív.Dlhšie peptidy môžu byť výsledkom inzercií/delécií v priméroch syntetických knižníc.Toto umiestni navrhnutý stop kodón mimo rámca a číta ho, kým sa v smere toku neobjaví nový stop kodón.Vo všeobecnosti sme vypočítali faktory obohatenia pre všetky štyri výberové kolá porovnaním vstupných údajov so vzorovými výstupnými údajmi.Pre prvé kolo skríningu sme použili titre fágov divokého typu ako nešpecifickú referenciu na pozadie.Je zaujímavé, že negatívna selekcia fágov bola veľmi silná v prvom cykle CSF, ale nie v krvi (obr. 3a), čo môže byť spôsobené nízkou pravdepodobnosťou pasívnej difúzie väčšiny členov peptidovej knižnice do kompartmentu CSF alebo relatívne fágy majú tendenciu byť účinnejšie zadržané alebo odstránené z krvného obehu ako bakteriofágy.Avšak v druhom kole panningu bola pozorovaná silná selekcia fágov v CSF v oboch kladoch, čo naznačuje, že predchádzajúce kolo bolo obohatené o fágy vykazujúce peptidy, ktoré podporujú vychytávanie CSF (obr. 3a).Opäť bez výrazného obohatenia krvi.Aj v treťom a štvrtom kole boli fágové klony významne obohatené o CSF.Porovnaním relatívnej frekvencie každej unikátnej peptidovej sekvencie medzi poslednými dvoma kolami selekcie sme zistili, že sekvencie boli ešte viac obohatené v štvrtom kole selekcie (obr. 3b).Celkovo bolo extrahovaných 931 tripeptidových motívov zo všetkých 64 jedinečných peptidových sekvencií s použitím oboch peptidových orientácií.Najviac obohatené motívy vo štvrtom kole boli podrobnejšie skúmané z hľadiska ich profilov obohatenia vo všetkých kolách v porovnaní s injikovanou knižnicou (hranica: 10% obohatenie) (doplnkový obrázok 6c).Všeobecné vzorce výberu ukázali, že väčšina skúmaných motívov bola obohatená vo všetkých predchádzajúcich kolách oboch výberových odvetví.Niektoré motívy (napr. SGL, VSG, LGS GSV) však boli prevažne z alternatívneho kladu A, zatiaľ čo iné (napr. FGW, RTN, WGF, NTR) boli obohatené o alternatívny klad B.
Validácia CSF transportu CSF obohatených peptidov vystavených na fágu a biotinylovaných vedúcich peptidov konjugovaných s nákladmi streptavidínu.
(a) Pomery obohatenia vypočítané vo všetkých štyroch kolách (R1-R4) na základe vstreknutých (vstup = I) fágových (PFU) titrov a určených fágových titrov CSF (výstup = O).Faktory obohatenia pre posledné tri kolá (R2-R4) boli vypočítané porovnaním s predchádzajúcim kolom a prvým kolom (R1) s údajmi o hmotnosti.Otvorené stĺpce sú cerebrospinálny mok, tieňované stĺpce sú plazma.(***p<0,001, na základe Studentovho t-testu).(b) Zoznam najhojnejších fágových peptidov zoradených podľa ich relatívneho pomeru ku všetkým fágom zozbieraným v CSF po 4. kole selekcie.Šesť najbežnejších fágových klonov je zvýraznených farebne, očíslovaných a ich obohacovacích faktorov medzi 3. a 4. kolom selekcie (vložky).(c, d) Šesť najviac obohatených fágových klonov, prázdnych fágových a rodičovských fágových peptidových knižníc zo 4. kola sa analyzovalo individuálne v modeli odberu vzoriek CSF.Vzorky CSF a krvi sa odoberali v uvedených časových bodoch.(c) Rovnaké množstvá 6 kandidátskych fágových klonov (2 x 1010 fágov/zvieratá), prázdnych fágov (#1779) (2 x 1010 fágov/zvieratá) a zásobných knižníc fágových peptidov (2 x 1012 fágov/zvieratá) Injikujte aspoň 3 kanylované CM oddelene do chvosta.Je ukázaná farmakokinetika CSF každého injikovaného fágového klonu a knižnice fágových peptidov v priebehu času.(d) ukazuje priemerný pomer CSF/krv pre všetky získané fágy/ml počas doby odberu vzoriek.(e) Štyri syntetické vedúce peptidy a jedna zmiešaná kontrola boli spojené s biotínom so streptavidínom prostredníctvom ich N-konca (tetramérový displej), po čom nasledovala injekcia (chvostová žila iv, 10 mg streptavidínu/kg).Aspoň tri intubované potkany (N = 3).).Vzorky CSF sa odobrali v uvedených časových bodoch a koncentrácie streptavidínu sa merali pomocou CSF anti-streptavidínu ELISA (nd = nedetegované).(*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001, na základe testu ANOVA).(f) Porovnanie aminokyselinovej sekvencie najviac obohateného fágového peptidového klonu #2002 (fialový) s inými vybranými fágovými peptidovými klonmi zo 4. kola selekcie.Identické a podobné fragmenty aminokyselín sú farebne odlíšené.
Zo všetkých obohatených fágov vo štvrtom kole (obr. 3b) sa vybralo šesť kandidátskych klonov na ďalšiu individuálnu analýzu v modeli odberu vzoriek CSF.Rovnaké množstvá šiestich kandidátskych fágových, prázdnych fágových (bez inzertu) a profágových peptidových knižníc sa injikovali do troch kanylovaných CM zvierat a farmakokinetika sa stanovila v CSF (obr. 3c) a krvných (doplnkový obrázok 7) testoch.Všetky testované fágové klony cielili na kompartment CSF na úrovni 10-1000-krát vyššej ako hladina prázdneho kontrolného fágu (č. 1779).Napríklad klony #2020 a #2077 mali asi 1000-krát vyššie titre CSF ako kontrolný fág.Farmakokinetický profil každého vybraného peptidu je odlišný, ale všetky majú vysokú schopnosť navádzania do CSF.Pozorovali sme konštantný pokles v priebehu času pre klony #1903 a #2011, zatiaľ čo pre klony #2077, #2002 a #2009 môže nárast počas prvých 10 minút naznačovať aktívny transport, ale je potrebné ho overiť.Klony #2020, #2002 a #2077 sa stabilizovali na vysokých hladinách, zatiaľ čo koncentrácia CSF klonu #2009 po počiatočnom zvýšení pomaly klesala.Potom sme porovnali relatívnu frekvenciu každého kandidáta CSF s jeho koncentráciou v krvi (obr. 3d).Korelácia priemerného titra každého kandidáta CSF s jeho krvným titrom vo všetkých časoch odberu vzoriek ukázala, že traja zo šiestich kandidátov boli významne obohatení o krvný CSF.Je zaujímavé, že klon # 2077 vykazoval vyššiu stabilitu krvi (doplnkový obrázok 7).Aby sme potvrdili, že samotné peptidy sú schopné aktívne transportovať náklad iný ako fágové častice do CSF ​​kompartmentu, syntetizovali sme štyri vedúce peptidy derivatizované biotínom na N-konci, kde sa peptidy viažu na fágovú časticu.Biotinylované peptidy (č. 2002, 2009, 2020 a 2077) sa konjugovali so streptavidínom (SA), aby sa získali multimérne formy trochu napodobňujúce geometriu fágov.Tento formát nám tiež umožnil zmerať expozíciu SA v krvi a cerebrospinálnej tekutine ako proteínové peptidy na prepravu nákladu.Dôležité je, že fágové dáta mohli byť často reprodukované, keď sa syntetické peptidy podávali v tomto SA-konjugovanom formáte (obr. 3e).Miešané peptidy mali menšiu počiatočnú expozíciu a rýchlejší klírens CSF s nedetegovateľnými hladinami do 48 hodín.Aby sme získali prehľad o dráhach dodávania týchto peptidových fágových klonov do priestoru CSF, analyzovali sme lokalizáciu jednotlivých fágových peptidových zásahov pomocou imunohistochémie (IHC) na priamu detekciu fágových častíc 1 hodinu po intravenóznej injekcii in vivo.Najmä klony #2002, #2077 a #2009 bolo možné detegovať silným farbením v mozgových kapilárach, zatiaľ čo kontrolný fág (#1779) a klon #2020 neboli detegované (doplnkový obrázok 8).To naznačuje, že tieto peptidy prispievajú k účinku na mozog práve tým, že prechádzajú cez BBB.Na testovanie tejto hypotézy je potrebná ďalšia podrobná analýza, pretože môže byť zapojená aj cesta BSCFB.Pri porovnaní aminokyselinovej sekvencie najviac obohateného klonu (#2002) s inými vybranými peptidmi sa zistilo, že niektoré z nich majú podobné predĺženia aminokyselín, čo môže naznačovať podobný transportný mechanizmus (obr. 3f).
Vďaka svojmu jedinečnému plazmatickému profilu a významnému zvýšeniu CSF v priebehu času bol klon fágového displeja #2077 ďalej skúmaný počas dlhšieho 48-hodinového obdobia a bol schopný reprodukovať rýchle zvýšenie CSF pozorované v spojení s trvalými hladinami SA (obr. 4a).Čo sa týka iných identifikovaných fágových klonov, #2077 sa silne farbil na mozgové kapiláry a vykazoval významnú kolokalizáciu s kapilárnym markerovým lektínom pri pohľade pri vyššom rozlíšení a možno aj určité farbenie v parenchýmovom priestore (obrázok 4b).Aby sme zistili, či je možné získať farmakologické účinky sprostredkované peptidom v CNS, uskutočnili sme experiment, v ktorom sa biotinylované verzie i) tranzitného peptidu č. 2077 a ii) inhibičného peptidu BACE1 zmiešali so SA v dvoch rôznych pomeroch.Pre jednu kombináciu sme použili iba BACE1 peptidový inhibítor a pre druhú sme použili pomer 1:3 BACE1 peptidového inhibítora k #2077 peptidu.Obidve vzorky sa podávali intravenózne a v priebehu času sa merali hladiny beta-amyloidného peptidu 40 (Abeta40) v krvi a cerebrospinálnom moku.Abeta40 sa meral v CSF, pretože odráža inhibíciu BACE1 v mozgovom parenchýme.Ako sa očakávalo, oba komplexy významne znížili hladiny Abeta40 v krvi (obr. 4c, d).Avšak iba vzorky obsahujúce zmes peptidu č.2077 a inhibítor peptidu BACE1 konjugovaný s SA spôsobil významný pokles Abeta40 v cerebrospinálnej tekutine (obr. 4c).Údaje ukazujú, že peptid č.2077 je schopný transportovať 60 kDa SA proteín do CNS a tiež indukuje farmakologické účinky s SA-konjugovanými inhibítormi BACE1 peptidu.
( a ) Klonálna injekcia (2 x 10 fágov/zviera) fágu T7 vykazujúca dlhodobé farmakokinetické profily CSF peptidu # 2077 (RLSSVDSDLSGC) a neinjikovaného kontrolného fága (# 1779) aspoň u troch CM-intubovaných potkanov.(b) Konfokálny mikroskopický obraz reprezentatívnych kortikálnych mikrociev u potkanov s injekciou fágu (2 x 1010 fágov/zviera), ktorý ukazuje kontrastné farbenie peptidu #2077 a ciev (lektín).Tieto fágové klony sa podávali 3 potkanom a pred perfúziou sa nechali cirkulovať 1 hodinu.Mozgy boli narezané a zafarbené polyklonálnymi FITC-značenými protilátkami proti T7 fágovej kapside.Desať minút pred perfúziou a následnou fixáciou bol intravenózne podaný lektín značený DyLight594.Fluorescenčné obrázky zobrazujúce farbenie lektínom (červená) luminálnej strany mikrociev a fágov (zelená) v lúmene kapilár a perivaskulárneho mozgového tkaniva.Mierka zodpovedá 10 µm.(c, d) Biotinylovaný BACE1 inhibičný peptid samotný alebo v kombinácii s biotinylovaným tranzitným peptidom #2077 bol spojený so streptavidínom, po čom nasledovala intravenózna injekcia aspoň trom kanylovaným CM potkanom (10 mg streptavidínu/kg).BACE1 peptidovým inhibítorom sprostredkované zníženie Ap40 bolo merané pomocou Ap1-40 ELISA v krvi (červená) a cerebrospinálnej tekutine (oranžová) v uvedených časových bodoch.Pre lepšiu prehľadnosť je na grafe nakreslená bodkovaná čiara v mierke 100 %.(c) Percentuálne zníženie Ap40 v krvi (červené trojuholníky) a cerebrospinálnej tekutine (oranžové trojuholníky) u potkanov liečených streptavidínom konjugovaným s tranzitným peptidom #2077 a inhibičným peptidom BACE1 v pomere 3:1.(d) Percentuálne zníženie krvného Ap40 (červené krúžky) a mozgovomiechového moku (oranžové krúžky) potkanov liečených streptavidínom spojeným iba s BACE1 inhibičným peptidom.Koncentrácia Ap v kontrole bola 420 pg/ml (štandardná odchýlka = 101 pg/ml).
Fágový displej sa úspešne aplikoval v niekoľkých oblastiach biomedicínskeho výskumu17.Táto metóda sa použila na štúdie vaskulárnej diverzity in vivo18,19, ako aj na štúdie zamerané na mozgové cievy20,21,22,23,24,25,26.V tejto štúdii sme aplikáciu tejto selekčnej metódy rozšírili nielen na priamu identifikáciu peptidov zacielených na mozgové cievy, ale aj na objavenie kandidátov s aktívnymi transportnými vlastnosťami na prechod cez hematoencefalickú bariéru.Teraz opisujeme vývoj in vivo selekčného postupu u potkanov intubovaných CM a demonštrujeme jeho potenciál identifikovať peptidy s navádzacími vlastnosťami CSF.Pomocou fágu T7 zobrazujúceho knižnicu 12-mérnych náhodných peptidov sme dokázali preukázať, že fág T7 je dostatočne malý (približne 60 nm v priemere)10 na to, aby sa prispôsobil hematoencefalickej bariére, čím priamo prechádza hematoencefalickou bariérou alebo cievnatkovým plexom.Pozorovali sme, že odber CSF z kanylovaných potkanov CM bol dobre kontrolovanou in vivo funkčnou skríningovou metódou a že extrahovaný fág sa nielen viazal na vaskulatúru, ale fungoval aj ako transportér cez hematoencefalickú bariéru.Okrem toho súčasným odberom krvi a aplikáciou HTS na CSF ​​a fágy odvodené z krvi sme potvrdili, že náš výber CSF nebol ovplyvnený obohatením krvi alebo vhodnosťou na expanziu medzi kolami výberu.Krvný kompartment je však súčasťou selekčného postupu, pretože fágy schopné dostať sa do CSF ​​kompartmentu musia prežiť a cirkulovať v krvnom obehu dostatočne dlho, aby sa obohatili v mozgu.Aby sme získali spoľahlivé informácie o sekvencii z nespracovaných údajov HTS, implementovali sme filtre prispôsobené chybám sekvenovania špecifickým pre platformu v pracovnom postupe analýzy.Začlenením kinetických parametrov do skríningovej metódy sme potvrdili rýchlu farmakokinetiku fágov T7 divokého typu (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 a tiež sme určili ich polčas rozpadu v cerebrospinálnej tekutine (t½ ~ 26 min) za minútu.Napriek podobným farmakokinetickým profilom v krvi a CSF bolo možné v CSF detegovať iba 0,001 % koncentrácie fágu v krvi, čo naznačuje nízku mobilitu pozadia fágu T7 divokého typu cez hematoencefalickú bariéru.Táto práca zdôrazňuje dôležitosť prvého kola selekcie pri použití stratégií panningu in vivo, najmä pre fágové systémy, ktoré sú rýchlo odstránené z obehu, pretože len málo klonov je schopných dosiahnuť kompartment CNS.Takže v prvom kole bolo zníženie diverzity knižnice veľmi veľké, pretože v tomto veľmi prísnom modeli CSF sa nakoniec zhromaždil iba obmedzený počet klonov.Táto stratégia in vivo panningu zahŕňala niekoľko selekčných krokov, ako je aktívna akumulácia v CSF kompartmente, prežitie klonov v krvnom kompartmente a rýchle odstránenie T7 fágových klonov z krvi počas prvých 10 minút (obr. 1d a doplnkový obrázok 4M).).Po prvom kole sa teda v CSF identifikovali rôzne fágové klony, hoci pre jednotlivé zvieratá sa použil rovnaký počiatočný súbor.To naznačuje, že viaceré kroky prísneho výberu zdrojových knižníc s veľkým počtom členov knižnice vedú k významnému zníženiu diverzity.Preto sa náhodné udalosti stanú neoddeliteľnou súčasťou počiatočného výberového procesu, čo výrazne ovplyvní výsledok.Je pravdepodobné, že mnohé z klonov v pôvodnej knižnici mali veľmi podobný sklon k obohateniu CSF.Avšak aj za rovnakých experimentálnych podmienok sa výsledky selekcie môžu líšiť v dôsledku malého počtu každého konkrétneho klonu v počiatočnom súbore.
Motívy obohatené o CSF ​​sa líšia od motívov v krvi.Je zaujímavé, že sme zaznamenali prvý posun smerom k peptidom bohatým na glycín v krvi jednotlivých zvierat.(Obr. 1g, doplnkové obrázky 4e, 4f).Fág obsahujúci glycínové peptidy môže byť stabilnejší a menej pravdepodobné, že bude odstránený z obehu.Tieto peptidy bohaté na glycín však neboli detegované vo vzorkách mozgovomiechového moku, čo naznačuje, že kurátorské knižnice prešli dvoma rôznymi selekčnými krokmi: jeden v krvi a ďalší sa nechal akumulovať v mozgovomiechovom moku.Klony obohatené CSF pochádzajúce zo štvrtého kola selekcie boli dôkladne testované.Potvrdilo sa, že takmer všetky individuálne testované klony sú obohatené o CSF ​​v porovnaní so slepým kontrolným fágom.Jeden peptidový zásah (#2077) sa skúmal podrobnejšie.Vykázal dlhší plazmatický polčas v porovnaní s inými zásahmi (obrázok 3d a doplnkový obrázok 7) a zaujímavé je, že tento peptid obsahoval cysteínový zvyšok na C-konci.Nedávno sa ukázalo, že pridanie cysteínu k peptidom môže zlepšiť ich farmakokinetické vlastnosti väzbou na albumín29.Toto je v súčasnosti neznáme pre peptid #2077 a vyžaduje si ďalšiu štúdiu.Niektoré peptidy vykazovali valenčnú závislosť v obohatení CSF (údaje nie sú uvedené), čo môže súvisieť so zobrazenou povrchovou geometriou kapsidy T7.Systém T7, ktorý sme použili, ukázal 5-15 kópií každého peptidu na fágovú časticu.IHC sa uskutočnilo na kandidátskych vedúcich fágových klonoch injikovaných intravenózne do mozgovej kôry potkanov (doplnkový obrázok 8).Údaje ukázali, že najmenej tri klony (č. 2002, č. 2009 a č. 2077) interagovali s BBB.Zostáva určiť, či táto interakcia BBB vedie k akumulácii CSF alebo pohybu týchto klonov priamo do BCSFB.Dôležité je, že sme ukázali, že vybrané peptidy si zachovávajú svoju transportnú kapacitu CSF, keď sú syntetizované a viazané na proteínový náklad.Väzba N-terminálnych biotinylovaných peptidov na SA v podstate opakuje výsledky získané s ich príslušnými fágovými klonmi v krvi a cerebrospinálnej tekutine (obr. 3e).Nakoniec sme ukázali, že vedúci peptid #2077 je schopný podporovať mozgový účinok biotinylovaného peptidového inhibítora BACE1 konjugovaného s SA, čo spôsobuje výrazné farmakodynamické účinky v CNS výrazným znížením hladín Abeta40 v CSF (obr. 4).Neboli sme schopní identifikovať žiadne homológy v databáze vykonaním vyhľadávania homológie peptidovej sekvencie všetkých zásahov.Je dôležité poznamenať, že veľkosť knižnice T7 je približne 109, zatiaľ čo teoretická veľkosť knižnice pre 12-méry je 4 x 1015. Preto sme vybrali iba malú časť priestoru diverzity 12-mérovej peptidovej knižnice, čo môže znamenať, že vyhodnotením priestoru susednej sekvencie týchto identifikovaných zásahov možno identifikovať viac optimalizovaných peptidov.Hypoteticky jedným z dôvodov, prečo sme nenašli žiadne prirodzené homológy týchto peptidov, môže byť deselekcia počas evolúcie, aby sa zabránilo nekontrolovanému vstupu určitých peptidových motívov do mozgu.
Celkovo naše výsledky poskytujú základ pre budúcu prácu na podrobnejšie identifikáciu a charakterizáciu transportných systémov cerebrovaskulárnej bariéry in vivo.Základné nastavenie tejto metódy je založené na stratégii funkčnej selekcie, ktorá nielen identifikuje klony s cerebrálnymi vaskulárnymi väzbovými vlastnosťami, ale zahŕňa aj kritický krok, v ktorom úspešné klony majú vnútornú aktivitu prechádzať cez biologické bariéry in vivo do kompartmentu CNS.je objasniť mechanizmus transportu týchto peptidov a ich preferencie pre väzbu na mikrovaskulatúru špecifickú pre oblasť mozgu.To môže viesť k objaveniu nových ciest pre transport BBB a receptorov.Očakávame, že identifikované peptidy sa môžu priamo viazať na cerebrovaskulárne receptory alebo na cirkulujúce ligandy transportované cez BBB alebo BCSFB.Peptidové vektory s CSF transportnou aktivitou objavené v tejto práci budú ďalej skúmané.V súčasnosti skúmame mozgovú špecifickosť týchto peptidov z hľadiska ich schopnosti prechádzať cez BBB a/alebo BCSFB.Tieto nové peptidy budú mimoriadne cennými nástrojmi pre potenciálne objavovanie nových receptorov alebo dráh a pre vývoj nových vysoko účinných platforiem na dodávanie makromolekúl, ako sú biologické látky, do mozgu.
Kanylujte veľkú cisternu (CM) s použitím modifikácie vyššie opísaného spôsobu.Anestetizované potkany Wistar (200-350 g) sa umiestnili na stereotaxický prístroj a cez oholenú a asepticky pripravenú pokožku hlavy sa urobil stredný rez, aby sa odhalila lebka.V oblasti horného krídla vyvŕtajte dva otvory a do otvorov upevnite upevňovacie skrutky.Do laterálneho okcipitálneho hrebeňa bol vyvŕtaný ďalší otvor na stereotaktické vedenie kanyly z nehrdzavejúcej ocele do CM.Naneste dentálny cement okolo kanyly a zaistite skrutkami.Po vytvrdnutí svetlom a vytvrdnutí cementu bola kožná rana uzavretá supramidovým stehom 4/0.Správne umiestnenie kanyly je potvrdené spontánnym únikom cerebrospinálnej tekutiny (CSF).Vyberte potkana zo stereotaxického prístroja, získajte primeranú pooperačnú starostlivosť a zvládnutie bolesti a nechajte ho zotaviť sa aspoň jeden týždeň, kým sa v mozgovomiechovom moku nepozorujú známky krvi.Potkany Wistar (Crl:WI/Han) boli získané od Charles River (Francúzsko).Všetky potkany boli držané v špecifických podmienkach bez patogénov.Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Veterinárnym úradom mesta Bazilej vo Švajčiarsku a boli vykonané v súlade s licenciou zvierat č. 2474 (Hodnotenie aktívneho transportu mozgu meraním hladín terapeutických kandidátov v mozgovomiechovom moku a mozgu potkanov).
Jemne udržujte potkana pri vedomí s CM kanylou v ruke.Vyberte Daturu z kanyly a odoberte 10 µl spontánne vytekajúceho cerebrospinálneho moku.Keďže priechodnosť kanyly bola nakoniec ohrozená, do tejto štúdie boli zahrnuté iba vzorky číreho cerebrospinálneho moku bez dôkazu kontaminácie krvi alebo zmeny farby.Paralelne sa odobralo približne 10–20 μl krvi z malého rezu na špičke chvosta do skúmaviek s heparínom (Sigma-Aldrich).CSF a krv sa odobrali v rôznych časových bodoch po intravenóznej injekcii fágu T7.Pred odberom každej vzorky CSF sa zlikvidovalo približne 5–10 μl tekutiny, čo zodpovedá mŕtvemu objemu katétra.
Knižnice boli vytvorené pomocou vektora T7Select 10-3b, ako je opísané v príručke systému T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Stručne, náhodný 12-mérny DNA inzert bol syntetizovaný v nasledujúcom formáte:
Kodón NNK sa použil na zabránenie dvojitým stop kodónom a nadmernej expresii aminokyselín v inzerte.N je manuálne zmiešaný ekvimolárny pomer každého nukleotidu a K je manuálne zmiešaný ekvimolárny pomer adenínových a cytozínových nukleotidov.Jednovláknové oblasti sa premenili na dvojvláknovú DNA ďalšou inkubáciou s dNTP (Novagen) a Klenowovým enzýmom (New England Biolabs) v Klenowovom pufri (New England Biolabs) počas 3 hodín pri 37 °C.Po reakcii sa dvojvláknová DNA izolovala zrážaním EtOH.Výsledná DNA bola štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a HindIII (oba od Roche).Odštiepený a purifikovaný (QIAquick, Qiagen) inzert (T4 ligáza, New England Biolabs) sa potom ligoval v rámci do vopred štiepeného vektora T7 po aminokyseline 348 10B kapsidového génu.Ligačné reakcie boli inkubované pri 16 °C počas 18 hodín pred balením in vitro.Fágové balenie in vitro sa uskutočnilo podľa inštrukcií dodaných s klonovacím kitom T7Select 10-3b (Novagen) a baliaci roztok sa raz amplifikoval na lýzu s použitím Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lyzáty sa odstredili, titrovali a zmrazili pri -80 °C ako zásobný roztok glycerolu.
Priama PCR amplifikácia fágových variabilných oblastí amplifikovaných v bujóne alebo na platni s použitím proprietárnych fúznych primérov 454/Roche-amplicon.Dopredný fúzny primér obsahuje sekvencie lemujúce variabilnú oblasť (NNK) 12 (špecifické pre šablónu), GS FLX titánový adaptér A a kľúčovú sekvenciu štvorbázovej knižnice (TCAG) (doplnkový obrázok 1a):
Primér reverznej fúzie tiež obsahuje biotín pripojený na zachytávanie guľôčok a GS FLX titánový adaptér B potrebný na klonálnu amplifikáciu počas emulznej PCR:
Amplikóny sa potom podrobili pyrosekvenovaniu 454/Roche podľa protokolu 454 GS-FLX Titanium.Pre manuálne Sangerove sekvenovanie (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) bola T7 fágová DNA amplifikovaná pomocou PCR a sekvenovaná s nasledujúcimi pármi primérov:
Inzerty z jednotlivých plakov sa podrobili PCR amplifikácii pomocou súpravy Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (podľa pokynov výrobcu).Vykonajte horúci štart (10 minút pri 95 °C) a 35 posilňovacích cyklov (50 s pri 95 °C, 1 minútu pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C).
Fág z knižníc, fág divokého typu, fág zachránený z CSF a krvi alebo jednotlivé klony boli amplifikované v Escherichia coli BL5615 v TB bujóne (Sigma Aldrich) alebo v 500 cm2 miskách (Thermo Scientific) počas 4 hodín pri 37 °C.Fágy sa extrahovali z doštičiek opláchnutím doštičiek pufrom Tris-EDTA (Fluka Analytical) alebo zozbieraním plakov pomocou sterilných špičiek pipiet.Fágy boli izolované z kultivačného supernatantu alebo extrakčného pufra jedným cyklom zrážania polyetylénglykolom (PEG 8000) (Promega) a resuspendované v Tris-EDTA pufri.
Amplifikovaný fág sa pred intravenóznou (IV) injekciou (500 ul/zviera) podrobil 2-3 cyklom odstraňovania endotoxínu pomocou guľôčok na odstránenie endotoxínu (Miltenyi Biotec).V prvom kole sa zaviedlo 2x1012 fágov;v druhom, 2 x 1010 fágov;v treťom a štvrtom selekčnom kole 2x109 fágov na zviera.Obsah fágov vo vzorkách CSF a krvi odobratých v uvedených časových bodoch bol stanovený počítaním plakov podľa pokynov výrobcu (manuál systému T7Select).Fágová selekcia sa uskutočňovala intravenóznou injekciou purifikovaných knižníc do chvostovej žily alebo opätovnou injekciou fágu extrahovaného z CSF z predchádzajúceho selekčného kola a následné zbery sa uskutočnili po 10 minútach, 30 minútach, 60 minútach, 90 minútach, 120 minútach, 180 minútach a 240 minútach, v uvedenom poradí, CSF a vzorky krvi.Uskutočnili sa celkovo štyri kolá panorámovania in vivo, v ktorých sa dve vybrané vetvy oddelene uchovávali a analyzovali počas prvých troch kôl selekcie.Všetky fágové inzerty extrahované z CSF z prvých dvoch kôl selekcie sa podrobili pyrosekvenovaniu 454/Roche, zatiaľ čo všetky klony extrahované z CSF z posledných dvoch kôl selekcie sa manuálne sekvenovali.Všetky krvné fágy z prvého kola selekcie sa tiež podrobili pyrosekvenovaniu 454/Roche.Na injekciu fágových klonov sa vybrané fágy amplifikovali v E. coli (BL5615) na 500 cm2 platniach pri 37 °C počas 4 hodín.Individuálne vybrané a manuálne sekvenované klony boli propagované v TB médiu.Po extrakcii fágov, purifikácii a odstránení endotoxínu (ako je opísané vyššie) sa 2 x 1010 fágov/zviera v 300 ul intravenózne injikovalo do jednej chvostovej žily.
Predspracovanie a kvalitatívne filtrovanie sekvenčných dát.Raw 454/Roche dáta boli konvertované z binárneho štandardného formátu streamovej mapy (sff) do Pearsonovho formátu čitateľného pre človeka (fasta) pomocou softvéru dodávateľa.Ďalšie spracovanie nukleotidovej sekvencie sa uskutočnilo s použitím proprietárnych C programov a skriptov (nevydaný softvérový balík), ako je opísané nižšie.Analýza primárnych údajov zahŕňa prísne viacstupňové postupy filtrovania.Aby sa odfiltrovali čítania, ktoré neobsahovali platnú 12-mérnu inzertovú DNA sekvenciu, čítania boli postupne zarovnané so štartovacou značkou (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stopovou značkou (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) a podkladovou inzerciou (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) pomocou globálneho testu.zarovnanie umožňujúce až 2 nezrovnalosti na zarovnanie31.Preto boli z knižnice odstránené čítania bez značiek štart a stop a čítania obsahujúce vložky na pozadí, tj zarovnania, ktoré presahujú povolený počet nezhôd.Pokiaľ ide o zostávajúce čítania, sekvencia N-mer DNA siahajúca od počiatočnej značky a končiaca pred značkou zastavenia bola vyrezaná z pôvodnej čítanej sekvencie a ďalej spracovaná (ďalej len „vloženie“).Po translácii inzertu sa z inzertu odstráni časť za prvým stop kodónom na 5' konci priméru.Okrem toho boli odstránené aj nukleotidy vedúce k neúplným kodónom na 3' konci priméru.Aby sa vylúčili inzerty obsahujúce iba sekvencie pozadia, odstránili sa aj preložené inzerty začínajúce vzorom aminokyselín „PAG“.Peptidy s posttranslačnou dĺžkou menšou ako 3 aminokyseliny boli z knižnice odstránené.Nakoniec odstráňte redundanciu v oblasti vložiek a určite frekvenciu každej jedinečnej vložky.Výsledky tejto analýzy zahŕňali zoznam nukleotidových sekvencií (vložiek) a ich (čítaných) frekvencií (doplnkové obrázky 1c a 2).
Zoskupenie inzertov N-mér DNA podľa podobnosti sekvencií: Aby sa eliminovali chyby sekvenovania špecifické pre 454/Roche (ako sú problémy so sekvenovaním predĺžení homopolymérov) a odstránili sa menej dôležité redundancie, predtým filtrované inzerty sekvencie N-mér DNA (vložky) sa triedia podľa podobnosti.vloženia (povolené sú až 2 nezhodné bázy) pomocou iteratívneho algoritmu definovaného takto: vloženia sa zoradia najskôr podľa ich frekvencie (od najvyššej po najnižšiu) a ak sú rovnaké, podľa sekundárneho zoradenia podľa dĺžky (od najdlhšej po najkratšiu) ).Prvú „skupinu“ teda definujú najčastejšie a najdlhšie vloženia.Frekvencia skupiny je nastavená na kľúčovú frekvenciu.Potom sa každé vloženie, ktoré zostalo v triedenom zozname, pokúsilo pridať do skupiny pomocou párového zarovnania Needleman-Wunsch.Ak počet nezhôd, inzercií alebo delécií v zoradení nepresiahne prah 2, do skupiny sa pridá vloženie a celková frekvencia skupiny sa zvýši o to, ako často sa vloženie pridávalo.Prílohy pridané do skupiny sú označené ako použité a vylúčené z ďalšieho spracovania.Ak inzertná sekvencia nemôže byť pridaná do už existujúcej skupiny, inzertná sekvencia sa použije na vytvorenie novej skupiny s príslušnou inzertnou frekvenciou a označí sa ako použitá.Iterácia končí, keď bola každá sekvencia inzercie buď použitá na vytvorenie novej skupiny, alebo môže byť zahrnutá do už existujúcej skupiny.Koniec koncov, zoskupené inzerty pozostávajúce z nukleotidov sú nakoniec preložené do peptidových sekvencií (peptidových knižníc).Výsledkom tejto analýzy je súbor inzercií a ich zodpovedajúcich frekvencií, ktoré tvoria počet po sebe idúcich čítaní (doplnkový obrázok 2).
Generovanie motívov: Na základe zoznamu jedinečných peptidov bola vytvorená knižnica obsahujúca všetky možné aminokyselinové vzory (aa), ako je uvedené nižšie.Každý možný vzor dĺžky 3 bol extrahovaný z peptidu a jeho inverzný vzor bol pridaný spolu so spoločnou knižnicou motívov obsahujúcou všetky vzory (tripeptidy).Knižnice vysoko sa opakujúcich motívov boli sekvenované a nadbytočnosť bola odstránená.Potom sme pre každý tripeptid v knižnici motívov skontrolovali jeho prítomnosť v knižnici pomocou výpočtových nástrojov.V tomto prípade sa frekvencia peptidu obsahujúceho nájdený motívový tripeptid pridá a priradí motívu v knižnici motívov („počet motívov“).Výsledkom generovania motívu je dvojrozmerné pole obsahujúce všetky výskyty tripeptidov (motívov) a ich príslušné hodnoty, čo je počet sekvenčných čítaní, ktorých výsledkom je zodpovedajúci motív, keď sú čítané údaje filtrované, zoskupené a preložené.Metriky, ako je podrobne opísané vyššie.
Normalizácia počtu motívov a zodpovedajúcich rozptylových grafov: Počet motívov pre každú vzorku bol normalizovaný pomocou
kde ni je počet prečítaní obsahujúcich tému i.Takže vi predstavuje percentuálnu frekvenciu čítaní (alebo peptidov) obsahujúcich motív i vo vzorke.P-hodnoty pre nenormalizovaný počet motívov sa vypočítali pomocou Fisherovho presného testu.Čo sa týka korelogramov počtu motívov, Spearmanove korelácie boli vypočítané pomocou normalizovaného počtu motívov s R.
Na vizualizáciu obsahu aminokyselín na každej pozícii v peptidovej knižnici boli vytvorené webové logogramy 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Po prvé, obsah aminokyselín v každej polohe 12-mérneho peptidu je uložený v matrici 20 x 12.Potom sa vytvorí súbor 1000 peptidov obsahujúcich rovnaký relatívny obsah aminokyselín v každej polohe vo formáte rýchlej sekvencie a poskytne sa ako vstup do webového loga 3, ktoré generuje grafické znázornenie relatívneho obsahu aminokyselín v každej polohe.pre danú knižnicu peptidov.Na vizualizáciu viacrozmerných súborov údajov boli vytvorené tepelné mapy pomocou interne vyvinutého nástroja v R (biosHeatmap, zatiaľ nevydaný balík R).Dendrogramy prezentované v tepelných mapách boli vypočítané pomocou Wardovej hierarchickej zhlukovej metódy s euklidovskou metrikou vzdialenosti.Na štatistickú analýzu údajov o bodovaní motívov sa vypočítali hodnoty P pre nenormalizované bodovanie pomocou Fisherovho presného testu.P-hodnoty pre iné súbory údajov sa vypočítali v R pomocou Studentovho t-testu alebo ANOVA.
Vybrané fágové klony a fágy bez inzertov boli injikované intravenózne cez chvostovú žilu (2 x 1010 fágov/zviera v 300 ul PBS).Desať minút pred perfúziou a následnou fixáciou sa tým istým zvieratám intravenózne injikovalo 100 ul lektínu značeného DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minút po injekcii fágu boli potkany perfundované cez srdce 50 ml PBS a následne 50 ml 4% PFA/PBS.Vzorky mozgu boli dodatočne fixované cez noc v 4% PFA/PBS a namočené v 30% sacharóze cez noc pri 4 °C.Vzorky sa bleskovo zmrazia v zmesi OCT.Imunohistochemická analýza zmrazených vzoriek sa uskutočnila pri teplote miestnosti na 30 um kryorezoch blokovaných 1 % BSA a inkubovaných s polyklonálnymi FITC-značenými protilátkami proti T7 fágu (Novus NB 600-376A) pri 4 °C.Inkubujte cez noc.Nakoniec boli rezy premyté 3-krát PBS a skúmané konfokálnym laserovým mikroskopom (Leica TCS SP5).
Všetky peptidy s minimálnou čistotou 98 % boli syntetizované GenScript USA, biotinylované a lyofilizované.Biotín je viazaný prostredníctvom ďalšieho trojitého glycínového spacera na N-konci.Skontrolujte všetky peptidy pomocou hmotnostnej spektrometrie.
Streptavidín (Sigma S0677) sa zmiešal s 5-násobným ekvimolárnym nadbytkom biotinylovaného peptidu, biotinylovaného inhibičného peptidu BACE1 alebo s kombináciou (pomer 3:1) biotinylovaného inhibičného peptidu BACE1 a inhibičného peptidu BACE1 v 5–10 % DMSO/inkubované v PBS.1 hodinu pri izbovej teplote pred injekciou.Peptidy konjugované so streptavidínom boli intravenózne injikované v dávke 10 mg/kg do jednej z chvostových žíl potkanov s cerebrálnou dutinou.
Koncentrácia komplexov streptavidín-peptid sa hodnotila pomocou ELISA.Mikrotitračné doštičky Nunc Maxisorp (Sigma) boli potiahnuté cez noc pri 4 °C s 1,5 ug/ml myšacej anti-streptavidínové protilátky (Thermo, MA1-20011).Po blokovaní (blokovací pufor: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatína, 1 % BSA) pri izbovej teplote počas 2 hodín premyte doštičku 0,05 % Tween-20/PBS (premývací pufor) počas 3 sekúnd, do jamiek CSF a plazmového pufra sa pridali vzorky plazmy CSF 00 a tlmivý roztok CSF 01 zriedený 1:115).Doštička sa potom inkubovala cez noc pri 4 °C s detekčnou protilátkou (1 ug/ml, anti-streptavidín-HRP, Novus NB120-7239).Po troch premývacích krokoch sa streptavidín detegoval inkubáciou v roztoku substrátu TMB (Roche) počas až 20 minút.Po zastavení vývoja farby pomocou 1M H2SO4 zmerajte absorbanciu pri 450 nm.
Funkcia komplexu streptavidín-peptid-BACE1 inhibítor sa hodnotila pomocou Ap(1-40) ELISA podľa protokolu výrobcu (Wako, 294-64701).Stručne, vzorky CSF sa zriedili v štandardnom riedidle (1:23) a inkubovali sa cez noc pri 4 °C v 96-jamkových doštičkách potiahnutých zachytávacou protilátkou BNT77.Po piatich premývacích krokoch sa pridala HRP-konjugovaná BA27 protilátka a inkubovala sa 2 hodiny pri 4 °C, nasledovalo päť premývacích krokov.Aβ(1–40) sa detegoval inkubáciou v roztoku TMB počas 30 minút pri teplote miestnosti.Po zastavení vývoja farby pomocou zastavovacieho roztoku zmerajte absorbanciu pri 450 nm.Vzorky plazmy boli podrobené extrakcii na pevnej fáze pred Aβ(1–40) ELISA.Plazma sa pridala do 0,2 % DEA (Sigma) v 96-jamkových doštičkách a inkubovala sa pri teplote miestnosti 30 minút.Po postupnom premytí platní SPE (Oasis, 186000679) vodou a 100 % metanolom sa na platne SPE pridali vzorky plazmy a všetka kvapalina sa odstránila.Vzorky sa premyli (najprv 5 % metanolom, potom 30 % metanolom) a eluovali sa 2 % NH40H/90 % metanol.Po vysušení eluátu pri 55 °C počas 99 minút pri konštantnom prúde N2 sa vzorky redukovali v štandardných riedidlách a meral sa Ap(1–40), ako je opísané vyššie.
Ako citovať tento článok: Urich, E. et al.Doručenie nákladu do mozgu pomocou tranzitných peptidov identifikovaných in vivo.veda.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Dodávanie makromolekulárnych liečiv do mozgu pomocou cielenej terapie.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. a Martinez-Martinez, P. Dodávanie peptidových a proteínových liečiv cez hematoencefalickú bariéru.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoencefalická bariéra: prekážka vo vývoji mozgových liekov.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG a Byrd, A. Vyhliadky na zlepšené podávanie liečiva a zacielenie do mozgu cestou choroidálneho plexu-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizácia biofarmaceutík s molekulárnymi trójskymi koňmi na dodávanie mozgu.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorom sprostredkovaný transport peptidov cez hematoencefalickú bariéru.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. a kol.Zvýšte penetráciu do mozgu a účinnosť terapeutických protilátok pomocou monovalentných molekulárnych raketoplánov.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. a kol.Transport transferínového receptora (TfR) určuje vychytávanie afinitných variantov TfR protilátok v mozgu.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).