Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazí karusel s tromi snímkami naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúca a Nasledujúca sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
Hematoencefalická bariéra a hematoencefalická bariéra bránia bioterapeutickým látkam dosiahnuť ich ciele v centrálnom nervovom systéme, čím bránia účinnej liečbe neurologických ochorení. Aby sme objavili nové mozgové transportéry in vivo, zaviedli sme knižnicu fágových peptidov T7 a sériovo sme odoberali krv a mozgovomiechový mok (CSF) pomocou kanulovaného modelu potkanov s veľkým poolom krvi pri vedomí. Špecifické fágové klony boli po štyroch kolách selekcie vysoko obohatené v CSF. Testovanie jednotlivých kandidátskych peptidov odhalilo viac ako 1000-násobné obohatenie v CSF. Bioaktivita peptidom sprostredkovaného dodávania do mozgu bola potvrdená 40 % znížením hladiny amyloidu-β v mozgovomiechovom moku pomocou inhibítora peptidu BACE1 spojeného s identifikovaným novým tranzitným peptidom. Tieto výsledky naznačujú, že peptidy identifikované metódami fágovej selekcie in vivo môžu byť užitočnými vehikulami pre systémové dodávanie makromolekúl do mozgu s terapeutickým účinkom.
Výskum cielenej terapie centrálneho nervového systému (CNS) sa vo veľkej miere zameral na identifikáciu optimalizovaných liekov a látok, ktoré vykazujú vlastnosti zamerané na CNS, s menším úsilím vynaloženým na objavovanie mechanizmov, ktoré riadia aktívne dodávanie liekov do mozgu. Toto sa teraz začína meniť, keďže dodávanie liekov, najmä veľkých molekúl, je neoddeliteľnou súčasťou vývoja liekov v modernej neurovede. Prostredie centrálneho nervového systému je dobre chránené cerebrovaskulárnym bariérovým systémom, ktorý pozostáva z hematoencefalickej bariéry (HEB) a hematoencefalickej bariéry (HMB)1, čo sťažuje dodávanie liekov do mozgu1,2. Odhaduje sa, že takmer všetky lieky s veľkými molekulami a viac ako 98 % liekov s malými molekulami sa z mozgu vylúči3. Preto je veľmi dôležité identifikovať nové transportné systémy mozgu, ktoré zabezpečujú efektívne a špecifické dodávanie terapeutických liekov do CNS4,5. HEB a HMB však tiež predstavujú vynikajúcu príležitosť na dodávanie liekov, pretože prenikajú a vstupujú do všetkých štruktúr mozgu cez jeho rozsiahlu vaskulatúru. Súčasné úsilie o využitie neinvazívnych metód dodávania do mozgu je teda do značnej miery založené na mechanizme transportu sprostredkovaného receptormi (PMT) s využitím endogénneho receptora BBB6. Napriek nedávnym kľúčovým pokrokom vo využívaní dráhy transferínového receptora7,8 je potrebný ďalší vývoj nových systémov dodávania so zlepšenými vlastnosťami. Na tento účel bolo naším cieľom identifikovať peptidy schopné sprostredkovať transport v mozgovomiechovom moku (CSF), pretože by sa v princípe mohli použiť na dodávanie makromolekúl do CNS alebo na otvorenie nových receptorových dráh. Najmä špecifické receptory a transportéry cerebrovaskulárneho systému (BBB a BSCFB) môžu slúžiť ako potenciálne ciele pre aktívne a špecifické dodávanie bioterapeutických liekov. Mozgovomiechový mok (CSF) je sekrečný produkt choroidálneho plexu (CS) a je v priamom kontakte s intersticiálnou tekutinou mozgu cez subarachnoidálny priestor a ventrikulárny priestor4. Nedávno sa ukázalo, že subarachnoidálny mozgovomiechový mok nadmerne difunduje do intersticiálneho moku9. Dúfame, že sa nám podarí dostať do parenchymálneho priestoru pomocou tohto subarachnoidálneho prítokového traktu alebo priamo cez hematoencefalickú bariéru (HBB). Na dosiahnutie tohto cieľa sme implementovali robustnú stratégiu in vivo fágovej selekcie, ktorá ideálne identifikuje peptidy transportované jednou z týchto dvoch odlišných dráh.
Teraz popisujeme sekvenčnú in vivo skríningovú metódu fágového displeja so vzorkovaním mozgovomiechového moku v spojení s vysokokapacitným sekvenovaním (HTS) na monitorovanie počiatočných selekčných kôl s najvyššou diverzitou knižnice. Skríning sa uskutočnil na bdelých potkanoch s permanentne implantovanou kanylou veľkej cisterny (CM), aby sa zabránilo kontaminácii krvi. Dôležité je, že tento prístup vyberá peptidy zamerané na mozog aj peptidy s transportnou aktivitou cez cerebrovaskulárnu bariéru. Použili sme fágy T7 kvôli ich malej veľkosti (~60 nm)10 a predpokladali sme, že sú vhodné na transport vezikúl, ktoré umožňujú transcelulárny prechod endotelovou a/alebo epitelovo-dreňovou bariérou. Po štyroch kolách panningu boli izolované fágové populácie, ktoré vykazovali silné in vivo obohatenie mozgovomiechového moku a asociáciu mozgových mikrociev. Dôležité je, že sme dokázali potvrdiť naše zistenia preukázaním, že preferované a chemicky syntetizované najlepšie kandidátske peptidy sú schopné transportovať proteínový náklad do mozgovomiechového moku. Najprv boli stanovené farmakodynamické účinky CNS kombináciou vedúceho tranzitného peptidu s inhibítorom peptidu BACE1. Okrem preukázania, že stratégie funkčného skríningu in vivo dokážu identifikovať nové peptidy transportu do mozgu ako účinné nosiče proteínového nákladu, očakávame, že podobné prístupy k funkčnému výberu sa stanú dôležitými aj pri identifikácii nových dráh transportu do mozgu.
Na základe jednotiek tvoriacich plaky (PFU) bola po kroku fágového balenia navrhnutá a vytvorená knižnica náhodných 12-mérnych lineárnych fágových peptidov T7 s diverzitou približne 109 (pozri Materiály a metódy). Je dôležité poznamenať, že túto knižnicu sme pred in vivo panningom starostlivo analyzovali. PCR amplifikácia vzoriek fágovej knižnice s použitím modifikovaných primerov generovala amplikóny, ktoré boli priamo aplikovateľné na HTS (doplnkový obrázok 1a). Kvôli a) chybám v sekvenovaní HTS11, b) vplyvu na kvalitu primerov (NNK)1-12 a c) prítomnosti fágu divokého typu (wt) (vložky kostry) v záložnej knižnici bol implementovaný postup filtrovania sekvencií na extrakciu iba overených informácií o sekvencii (doplnkový obrázok 1b). Tieto kroky filtrovania platia pre všetky sekvenčné knižnice HTS. Pre štandardnú knižnicu bolo získaných celkovo 233 868 čítaní, z ktorých 39 % splnilo kritériá filtrovania a bolo použitých na analýzu a výber knižnice pre nasledujúce kolá (doplnkový obrázok 1c–e). Čítania boli prevažne násobkami 3 párov báz s píkom pri 36 nukleotidoch (doplnkový obrázok 1c), čo potvrdzuje dizajn knižnice (NNK) 1-12. Je pozoruhodné, že približne 11 % členov knižnice obsahovalo 12-rozmerný inzert PAGISRELVDKL divokého typu (wt) a takmer polovica sekvencií (49 %) obsahovala inzercie alebo delécie. HTS knižnice potvrdil vysokú diverzitu peptidov v knižnici: viac ako 81 % peptidových sekvencií sa našlo iba raz a iba 1,5 % sa vyskytlo v ≥4 kópiách (doplnkový obrázok 2a). Frekvencie aminokyselín (aa) na všetkých 12 pozíciách v repertoári dobre korelovali s frekvenciami očakávanými pre počet kodónov generovaných degenerovaným repertoárom NKK (doplnkový obrázok 2b). Pozorovaná frekvencia zvyškov aa kódovaných týmito inzertmi dobre korelovala s vypočítanou frekvenciou (r = 0,893) (doplnkový obrázok 2c). Príprava fágových knižníc na injekciu zahŕňa kroky amplifikácie a odstránenia endotoxínu. Predtým sa ukázalo, že to potenciálne znižuje diverzitu fágových knižníc12,13. Preto sme sekvenovali fágovú knižnicu amplifikovanú na platniach, ktorá prešla odstránením endotoxínu, a porovnali sme ju s pôvodnou knižnicou, aby sme odhadli frekvenciu AA. Medzi pôvodným súborom a amplifikovaným a purifikovaným súborom bola pozorovaná silná korelácia (r = 0,995) (doplnkový obrázok 2d), čo naznačuje, že konkurencia medzi klonmi amplifikovanými na platniach s použitím fága T7 nespôsobila výrazné skreslenie. Toto porovnanie je založené na frekvencii tripeptidových motívov v každej knižnici, pretože diverzitu knižníc (~109) nemožno úplne zachytiť ani pomocou HTS. Frekvenčná analýza AA v každej pozícii odhalila malé skreslenie závislé od pozície v posledných troch pozíciách zadaného repertoáru (doplnkový obrázok 2e). Záverom sme dospeli k záveru, že kvalita a diverzita knižnice boli prijateľné a v dôsledku amplifikácie a prípravy fágových knižníc medzi niekoľkými kolami selekcie boli pozorované iba menšie zmeny v diverzite.
Sériový odber vzoriek mozgovomiechového moku sa môže vykonať chirurgickým implantovaním kanyly do mozgovomiechového moku bdelých potkanov, aby sa uľahčila identifikácia fágu T7 injekčne podaného intravenózne (iv) cez BBB a/alebo BCSFB (obr. 1a-b). V prvých troch kolách in vivo selekcie sme použili dve nezávislé selekčné ramená (ramená A a B) (obr. 1c). Postupne sme zvyšovali prísnosť selekcie znižovaním celkového množstva fágu zavedeného v prvých troch kolách selekcie. Pre štvrté kolo panningu sme skombinovali vzorky z vetiev A a B a vykonali tri ďalšie nezávislé selekcie. Na štúdium in vivo vlastností častíc fágu T7 v tomto modeli bol potkanom injekčne podaný fág divokého typu (hlavný inzert PAGISRELVDKL) cez chvostovú žilu. Získanie fágov z mozgovomiechového moku a krvi v rôznych časových bodoch ukázalo, že relatívne malé ikozaedrické fágy T7 mali rýchlu počiatočnú fázu vylučovania z krvného kompartmentu (doplnkový obrázok 3). Na základe podaných titrov a objemu krvi potkanov sme vypočítali, že 10 minút po intravenóznej injekcii bolo v krvi detegovaných iba približne 1 % hmotn. fágu z podanej dávky. Po tomto počiatočnom rýchlom poklese bol nameraný pomalší primárny klírens s polčasom rozpadu 27,7 minúty. Dôležité je, že z kompartmentu mozgovomiechového moku bolo získaných len veľmi málo fágov, čo naznačuje nízke pozadie pre migráciu fágov divokého typu do kompartmentu mozgovomiechového moku (doplnkový obrázok 3). V priemere sa v mozgovomiechovom moku počas celého obdobia odberu vzoriek (0 – 250 min) detegovalo v priemere iba približne 1 x 10⁻⁹ % titrov fágu T7 v krvi a 4 x 10⁻⁹ % pôvodne infundovaných fágov. Je pozoruhodné, že polčas rozpadu (25,7 min) fágu divokého typu v mozgovomiechovom moku bol podobný polčasu pozorovanému v krvi. Tieto údaje ukazujú, že bariéra oddeľujúca kompartment mozgovomiechového moku od krvi je u potkanov s kanylovanou kongenitálnou médiom (CM) neporušená, čo umožňuje in vivo selekciu fágových knižníc na identifikáciu klonov, ktoré sa ľahko transportujú z krvi do kompartmentu mozgovomiechového moku.
(a) Nastavenie metódy opätovného odberu vzoriek mozgovomiechového moku (CSF) z veľkého množstva. (b) Schéma znázorňujúca bunkovú lokalizáciu bariéry centrálneho nervového systému (CNS) a stratégiu výberu použitú na identifikáciu peptidov, ktoré prechádzajú hematoencefalickou bariérou (HEB) a hematoencefalickou bariérou. (c) Vývojový diagram fágového displeja in vivo. V každom kole výberu boli fágy (identifikátory zvierat vo vnútri šípok) injekčne podané intravenózne. Dve nezávislé alternatívne vetvy (A, B) sa uchovávajú oddelene až do 4. kola výberu. V 3. a 4. kole výberu bol každý fágový klon extrahovaný z CSF manuálne sekvenovaný. (d) Kinetika fágu izolovaného z krvi (červené krúžky) a mozgovomiechového moku (zelené trojuholníky) počas prvého kola výberu u dvoch kanylovaných potkanov po intravenóznej injekcii knižnice peptidov T7 (2 x 1012 fágov/zviera). Modré štvorce označujú priemernú počiatočnú koncentráciu fágu v krvi, vypočítanú z množstva injekčne podaného fágu, berúc do úvahy celkový objem krvi. Čierne štvorce označujú priesečník y-ovej priamky extrapolovanej z koncentrácií krvných fágov. (e, f) Uvádzajú relatívnu frekvenciu a distribúciu všetkých možných prekrývajúcich sa tripeptidových motívov nájdených v peptide. Je zobrazený počet motívov nájdených v 1000 meraniach. Signifikantne (p < 0,001) obohatené motívy sú označené červenými bodkami. (e) Korelačný bodový graf porovnávajúci relatívnu frekvenciu tripeptidového motívu injektovanej knižnice s fágom odvodeným z krvi od zvierat č. 1.1 a č. 1.2. (f) Korelačný bodový graf porovnávajúci relatívne frekvencie tripeptidových motívov živočíšnych fágov č. 1.1 a č. 1.2 izolovaných v krvi a mozgovomiechovom moku. (g, h) Znázornenie ID sekvencie fágu obohateného krvou (g) ​​oproti injektovaným knižniciam a fágu obohatenému mozgovomiechovým mokom (h) oproti krvi po kole selekcie in vivo u oboch zvierat. Veľkosť jednopísmenového kódu označuje, ako často sa daná aminokyselina vyskytuje v danej pozícii. Zelená = polárna, fialová = neutrálna, modrá = zásaditá, červená = kyslá a čierna = hydrofóbne aminokyseliny. Obrázok 1a, b navrhol a vyrobil Eduard Urich.
Dvom potkanom s chromozómovou kmeňovou chromozómovou kmeňovou chromozómovou kmeňovou peptidovou knižnicou (kmeň A a B) sme injekčne vstrekli fágovú peptidovú knižnicu a izolovali fág z mozgovomiechového moku a krvi (obrázok 1d). Počiatočný rýchly klírens knižnice bol menej výrazný v porovnaní s fágom divokého typu. Priemerný polčas rozpadu injekčne vstreknutej knižnice u oboch zvierat bol 24,8 minúty v krvi, podobne ako u fágu divokého typu, a 38,5 minúty v mozgovomiechovom moku. Vzorky fágov z krvi a mozgovomiechového moku od každého zvieraťa boli podrobené HTS a všetky identifikované peptidy boli analyzované na prítomnosť krátkeho tripeptidového motívu. Tripeptidové motívy boli vybrané, pretože poskytujú minimálny základ pre tvorbu štruktúry a interakcie peptid-proteín14,15. Zistili sme dobrú koreláciu v distribúcii motívov medzi injekčne vstreknutou fágovou knižnicou a klonmi extrahovanými z krvi oboch zvierat (obr. 1e). Údaje naznačujú, že zloženie knižnice je v krvnom kompartmente len okrajovo obohatené. Frekvencie aminokyselín a konsenzuálne sekvencie boli ďalej analyzované v každej pozícii pomocou adaptácie softvéru Weblogo16. Je zaujímavé, že sme zistili silné obohatenie krvi o glycínové zvyšky (obr. 1g). Pri porovnaní krvi s klonmi vybranými z mozgovomiechového moku (CSF) sa pozorovala silná selekcia a určitá deselekcia motívov (obr. 1f) a určité aminokyseliny boli prednostne prítomné na vopred určených pozíciách v 12-člennom reťazci (obr. 1h). Je pozoruhodné, že jednotlivé zvieratá sa významne líšili v mozgovomiechovom moku, zatiaľ čo obohatenie krvi o glycín sa pozorovalo u oboch zvierat (doplnkový obr. 4a–j). Po prísnej filtrácii sekvenčných údajov v mozgovomiechovom moku zvierat č. 1.1 a č. 1.2 sa získalo celkovo 964 a 420 unikátnych 12-mérnych peptidov (doplnkový obr. 1d–e). Izolované fágové klony boli amplifikované a podrobené druhému kolu selekcie in vivo. Fágy extrahované z druhého kola selekcie boli u každého zvieraťa podrobené HTS a všetky identifikované peptidy boli použité ako vstup do programu rozpoznávania motívov na analýzu výskytu tripeptidových motívov (obr. 2a, b, ef). V porovnaní s prvým cyklom fága získaného z mozgovomiechového moku (CSF) sme pozorovali ďalšiu selekciu a deselekciu mnohých motívov v CSF vo vetvách A a B (Obr. 2). Na určenie, či predstavujú rôzne vzory konzistentnej sekvencie, bol použitý algoritmus sieťovej identifikácie. Medzi 12-rozmernými sekvenciami získanými pomocou CSF v alternatívnom klade A (Obr. 2c, d) a klade B (Obr. 2g, h) bola pozorovaná jasná podobnosť. Súhrnná analýza v každej vetve odhalila odlišné selekčné profily pre 12-mérne peptidy (Doplnkový obr. 5c, d) a zvýšenie pomeru titrov CSF/krv v priebehu času pre združené klony po druhom kole selekcie v porovnaní s prvým kolom selekcie (Doplnkový obr. 5e).
Obohatenie motívov a peptidov v mozgovomiechovom moku dvoma po sebe idúcimi kolami in vivo funkčného fágového displeja.
Všetky fágy z mozgovomiechového moku získané z prvého kola každého zvieraťa (zvieratá č. 1.1 a č. 1.2) boli zlúčené, amplifikované, HT-sekvenované a reinjikované spoločne (2 x 1010 fágov/zviera) 2 SM kanylovaným potkanom (č. 1.1 → č.). 2.1 a 2.2, 1.2 → 2.3 a 2.4). (a, b, e, f) Korelačné bodové grafy porovnávajúce relatívnu frekvenciu tripeptidových motívov všetkých fágov odvodených z mozgovomiechového moku v prvom a druhom kole výberu. Relatívna frekvencia a distribúcia motívov predstavujúcich všetky možné prekrývajúce sa tripeptidy nájdené v peptidoch v oboch orientáciách. Je zobrazený počet motívov nájdených v 1000 odčítaniach. Motívy, ktoré boli signifikantne (p < 0,001) vybrané alebo vylúčené v jednej z porovnávaných knižníc, sú zvýraznené červenými bodkami. (c, d, g, h) Znázornenie loga sekvencie všetkých sekvencií bohatých na mozgovomiechový mok (CSF) s dĺžkou 12 aminokyselín na základe 2. a 1. kola selekcie in vivo. Veľkosť jednopísmenového kódu označuje, ako často sa daná aminokyselina vyskytuje v danej pozícii. Na znázornenie loga sa porovnáva frekvencia sekvencií CSF extrahovaných z jednotlivých zvierat medzi dvoma kolami selekcie a zobrazujú sa obohatené sekvencie v druhom kole: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4. Najobohatšie aminokyseliny v danej pozícii u (c, d) zvierat č. 2.1 a č. 2.2 alebo (g, h) u zvierat č. 2.3 a č. 2.4 sú zobrazené farebne. Zelená = polárna, fialová = neutrálna, modrá = zásaditá, červená = kyslá a čierna = hydrofóbne aminokyseliny.
Po treťom kole selekcie sme identifikovali 124 unikátnych peptidových sekvencií (#3.1 a #3.2) z 332 fágových klonov rekonštituovaných v mozgovomiechovom moku (CSF) izolovaných z dvoch zvierat (doplnkový obrázok 6a). Sekvencia LGSVS (18,7 %) mala najvyšší relatívny podiel, nasledovaná inzertmi divokého typu PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) a SARGSWREIVSLS (2,2 %). V poslednom štvrtom kole sme spojili dve nezávisle vybrané vetvy z troch samostatných zvierat (obr. 1c). Z 925 sekvenovaných fágových klonov získaných z CSF sme v štvrtom kole našli 64 unikátnych peptidových sekvencií (doplnkový obrázok 6b), medzi ktorými relatívny podiel fágu divokého typu klesol na 0,8 %. Najbežnejšie klony CSF v štvrtom kole boli LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) a RLSSVDSDLSGC (3,2 %). Rozsah dĺžky vybraných peptidov je spôsobený inzerciami/deléciami nukleotidov alebo predčasnými stop kodónmi v primeroch knižnice pri použití degenerovaných kodónov pre návrh knižnice NNK. Predčasné stop kodóny generujú kratšie peptidy a sú vybrané, pretože obsahujú priaznivý aminokyselinový motív. Dlhšie peptidy môžu byť výsledkom inzercií/delécií v primeroch syntetických knižníc. Toto umiestni navrhnutý stop kodón mimo rámca a číta ho, kým sa neobjaví nový stop kodón v smere toku. Vo všeobecnosti sme vypočítali faktory obohatenia pre všetky štyri výberové kolá porovnaním vstupných údajov s výstupnými údajmi vzorky. Pre prvé kolo skríningu sme použili titre fágov divokého typu ako nešpecifickú referenčnú hodnotu pozadia. Je zaujímavé, že negatívna fágová selekcia bola veľmi silná v prvom cykle CSF, ale nie v krvi (Obr. 3a), čo môže byť spôsobené nízkou pravdepodobnosťou pasívnej difúzie väčšiny členov peptidovej knižnice do kompartmentu CSF alebo relatívne fágy majú tendenciu byť efektívnejšie zadržiavané alebo odstraňované z krvného obehu ako bakteriofágy. Avšak v druhom kole panningu bola pozorovaná silná selekcia fágov v CSF v oboch kladoch, čo naznačuje, že predchádzajúce kolo bolo obohatené o fágy vykazujúce peptidy, ktoré podporujú absorpciu v CSF (Obr. 3a). Opäť bez významného obohatenia krvi. Aj v treťom a štvrtom kole boli fágové klony významne obohatené v CSF. Porovnaním relatívnej frekvencie každej jedinečnej peptidovej sekvencie medzi poslednými dvoma kolami selekcie sme zistili, že sekvencie boli ešte obohatené v štvrtom kole selekcie (Obr. 3b). Celkovo bolo zo všetkých 64 jedinečných peptidových sekvencií extrahovaných 931 tripeptidových motívov s použitím oboch peptidových orientácií. Najobohatšie motívy v štvrtom kole boli podrobnejšie skúmané z hľadiska ich profilov obohatenia vo všetkých kolách v porovnaní s injektovanou knižnicou (hranica: 10 % obohatenie) (doplnkový obrázok 6c). Všeobecné vzorce výberu ukázali, že väčšina študovaných motívov bola obohatená vo všetkých predchádzajúcich kolách oboch výberových vetiev. Niektoré motívy (napr. SGL, VSG, LGS GSV) však pochádzali prevažne z alternatívnej kladu A, zatiaľ čo iné (napr. FGW, RTN, WGF, NTR) boli obohatené o alternatívnu kladu B.
Validácia transportu fágovo obohatených peptidov zobrazených na fágoch v mozgovomiechovom moku a biotinylovaných vedúcich peptidov konjugovaných s užitočnými dátami streptavidínu v mozgovomiechovom moku.
(a) Pomery obohatenia vypočítané vo všetkých štyroch kolách (R1-R4) na základe titrov injektovaných (vstup = I) fágov (PFU) a stanovených titrov fágov v mozgovomiechovom moku (výstup = O). Faktory obohatenia pre posledné tri kolá (R2-R4) boli vypočítané porovnaním s predchádzajúcim kolom a prvým kolom (R1) s údajmi o hmotnosti. Otvorené stĺpce predstavujú mozgovomiechový mok, tieňované stĺpce predstavujú plazmu. (***p<0,001, na základe Studentovho t-testu). (b) Zoznam najpočetnejších fágových peptidov, zoradených podľa ich relatívneho podielu na všetkých fágoch zozbieraných v mozgovomiechovom moku po 4. kole selekcie. Šesť najbežnejších fágových klonov je zvýraznených farbou, očíslovaných a ich faktory obohatenia medzi 3. a 4. kolom selekcie (vložky). (c,d) Šesť najviac obohatených fágových klonov, prázdne fágy a rodičovské knižnice fágových peptidov zo 4. kola boli analyzované jednotlivo v modeli odberu vzoriek v mozgovomiechovom moku. Vzorky mozgovomiechového moku a krvi boli odobraté v uvedených časových bodoch. (c) Rovnaké množstvá 6 kandidátskych fágových klonov (2 x 1010 fágov/zvieratá), prázdnych fágov (#1779) (2 x 1010 fágov/zvieratá) a zásobných knižníc fágových peptidov (2 x 1012 fágov/zvieratá). Kanulovanému zvieraťu sa samostatne podajú injekčne najmenej 3 CM cez chvostovú žilu. Je znázornená farmakokinetika mozgovomiechového moku (CSF) každého injikovaného fágového klonu a knižnice fágových peptidov v priebehu času. (d) znázorňuje priemerný pomer CSF/krv pre všetky získané fágy/ml počas času odberu vzoriek. (e) Štyri syntetické vedúce peptidy a jeden premiešaný kontrolný peptid boli spojené s biotínom so streptavidínom cez ich N-terminálny koniec (tetramérový displej), po čom nasledovala injekcia (i.v. do chvostovej žily, 10 mg streptavidínu/kg). Najmenej tri intubované potkany (N = 3). Vzorky mozgovomiechového moku (CSF) boli odobraté v uvedených časových bodoch a koncentrácie streptavidínu boli merané pomocou ELISA testu proti streptavidínu v CSF (nd = nedetekované). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na základe ANOVA testu). (f) Porovnanie aminokyselinovej sekvencie najviac obohateného klonu fágového peptidu č. 2002 (fialová) s inými vybranými klonmi fágového peptidu zo 4. kola selekcie. Identické a podobné aminokyselinové fragmenty sú farebne odlíšené.
Zo všetkých obohatených fágov v štvrtom kole (obr. 3b) bolo šesť kandidátskych klonov vybraných na ďalšiu individuálnu analýzu v modeli odberu vzoriek mozgovomiechového moku (CSF). Rovnaké množstvá šiestich kandidátskych fágových, prázdnych fágových (bez inzertu) a profágových peptidových knižníc boli injekčne podané trom kanulovaným zvieratám s kongenitálnou mozgovomiechovou mutáciou (CM) a farmakokinetika bola stanovená v testoch CSF (obr. 3c) a krvi (doplnkový obr. 7). Všetky testované fágové klony cielili na kompartment CSF na úrovni 10 až 1 000-krát vyššej ako u prázdneho kontrolného fága (č. 1779). Napríklad klony č. 2020 a č. 2077 mali približne 1 000-krát vyššie titre v CSF ako kontrolný fág. Farmakokinetický profil každého vybraného peptidu je odlišný, ale všetky majú vysokú schopnosť homingu v CSF. U klonov č. 1903 a č. 2011 sme pozorovali konštantný pokles v priebehu času, zatiaľ čo u klonov č. 2077, č. 2002 a č. 2009 by nárast počas prvých 10 minút mohol naznačovať aktívny transport, ale je potrebné ho overiť. Klony č. 2020, č. 2002 a č. 2077 sa stabilizovali na vysokých úrovniach, zatiaľ čo koncentrácia klonu č. 2009 v mozgovomiechovom moku (CSF) sa po počiatočnom náraste pomaly znižovala. Následne sme porovnali relatívnu frekvenciu každého kandidáta v CSF s jeho koncentráciou v krvi (Obr. 3d). Korelácia priemerného titra každého kandidáta v CSF s jeho titrom v krvi vo všetkých časoch odberu vzoriek ukázala, že tri zo šiestich kandidátov boli významne obohatené o krvný CSF. Je zaujímavé, že klon č. 2077 vykazoval vyššiu stabilitu v krvi (Doplnkový obrázok 7). Aby sme potvrdili, že samotné peptidy sú schopné aktívne transportovať iný náklad ako fágové častice do kompartmentu CSF, syntetizovali sme štyri vedúce peptidy derivatizované biotínom na N-konci, kde sa peptidy viažu na fágovú časticu. Biotinylované peptidy (č. 2002, 2009, 2020 a 2077) boli konjugované so streptavidínom (SA), aby sa získali multimérne formy, ktoré do istej miery napodobňujú geometriu fágu. Tento formát nám tiež umožnil merať expozíciu SA v krvi a mozgovomiechovom moku ako proteínových peptidov transportujúcich náklad. Dôležité je, že údaje o fágoch sa často dali reprodukovať, keď sa syntetické peptidy podávali v tomto formáte konjugovanom so SA (obr. 3e). Zmiešané peptidy mali menšiu počiatočnú expozíciu a rýchlejšie vymizli z mozgovomiechového moku s nedetekovateľnými hladinami do 48 hodín. Aby sme získali prehľad o dráhach dodávania týchto peptidových fágových klonov do priestoru mozgovomiechového moku, analyzovali sme lokalizáciu jednotlivých zásahov fágových peptidov pomocou imunohistochémie (IHC) na priamu detekciu fágových častíc 1 hodinu po intravenóznej injekcii in vivo. Je pozoruhodné, že klony č. 2002, č. 2077 a č. 2009 bolo možné detegovať silným farbením v mozgových kapilárach, zatiaľ čo kontrolný fág (č. 1779) a klon č. 2020 neboli detegované (doplnkový obrázok 8). To naznačuje, že tieto peptidy prispievajú k účinku na mozog práve prechodom cez hematopoéznu bariéru (HBB). Na overenie tejto hypotézy je potrebná ďalšia podrobná analýza, pretože môže byť zapojená aj cesta BSCFB. Pri porovnaní aminokyselinovej sekvencie najviac obohateného klonu (č. 2002) s inými vybranými peptidmi sa zistilo, že niektoré z nich majú podobné aminokyselinové predĺženia, čo môže naznačovať podobný transportný mechanizmus (obr. 3f).
Vďaka svojmu jedinečnému plazmatickému profilu a významnému nárastu CSF v priebehu času bol fágový displejový klon #2077 ďalej skúmaný počas dlhšieho 48-hodinového obdobia a bol schopný reprodukovať rýchly nárast CSF pozorovaný v súvislosti s trvalými hladinami SA (Obr. 4a). Pokiaľ ide o ďalšie identifikované fágové klony, #2077 sa silne farbil na mozgové kapiláry a vykazoval významnú kolokalizáciu s kapilárnym markerom lektínom pri pozorovaní s vyšším rozlíšením a pravdepodobne aj určité farbenie v parenchymálnom priestore (Obrázok 4b). Aby sme zistili, či je možné dosiahnuť farmakologické účinky sprostredkované peptidmi v CNS, vykonali sme experiment, v ktorom boli biotinylované verzie i) tranzitného peptidu #2077 a ii) inhibítora BACE1 peptidu zmiešané so SA v dvoch rôznych pomeroch. Pre jednu kombináciu sme použili iba inhibítor peptidu BACE1 a pre druhú sme použili pomer 1:3 inhibítora peptidu BACE1 k peptidu #2077. Obe vzorky boli podané intravenózne a hladiny beta-amyloidného peptidu 40 (Abeta40) v krvi a mozgovomiechovom moku boli merané v priebehu času. Abeta40 sa merala v mozgovomiechovom moku (CSF), pretože odráža inhibíciu BACE1 v mozgovom parenchýme. Ako sa očakávalo, oba komplexy významne znížili hladiny Abeta40 v krvi (Obr. 4c, d). Avšak iba vzorky obsahujúce zmes peptidu č. 2077 a inhibítora peptidu BACE1 konjugovaného so SA spôsobili významný pokles Abeta40 v mozgovomiechovom moku (Obr. 4c). Údaje ukazujú, že peptid č. 2077 je schopný transportovať 60 kDa SA proteín do CNS a tiež indukuje farmakologické účinky s inhibítormi peptidu BACE1 konjugovanými so SA.
(a) Klonálna injekcia (2 × 10 fágov/zviera) fága T7 zobrazujúca dlhodobé farmakokinetické profily CSF peptidu č. 2077 (RLSSVDSDLSGC) a neinjikovaného kontrolného fága (č. 1779) u najmenej troch potkanov intubovaných pomocou CM. (b) Konfokálny mikroskopický obraz reprezentatívnych kortikálnych mikrociev u potkanov s injekciou fágu (2 × 1010 fágov/zviera) zobrazujúci kontrastné farbenie peptidu č. 2077 a ciev (lektín). Tieto fágové klony boli podané 3 potkanom a pred perfúziou im bola ponechaná cirkulácia 1 hodinu. Mozgy boli narezané a farbené polyklonálnymi protilátkami značenými FITC proti kapside fága T7. Desať minút pred perfúziou a následnou fixáciou bol intravenózne podaný lektín značený DyLight594. Fluorescenčné obrazy zobrazujúce farbenie lektínom (červená) luminálnej strany mikrociev a fágov (zelená) v lúmene kapilár a perivaskulárnom mozgovom tkanive. Mierka zodpovedá 10 µm. (c, d) Biotinylovaný inhibičný peptid BACE1 samotný alebo v kombinácii s biotinylovaným tranzitným peptidom #2077 bol naviazaný na streptavidín, po čom nasledovala intravenózna injekcia najmenej trom kanulovaným CM potkanom (10 mg streptavidínu/kg). Zníženie Aβ40 sprostredkované inhibítorom peptidu BACE1 bolo merané pomocou Aβ1-40 ELISA v krvi (červená) a mozgovomiechovom moku (oranžová) v uvedených časových bodoch. Pre lepšiu prehľadnosť je na grafe nakreslená bodkovaná čiara v mierke 100 %. (c) Percentuálne zníženie Aβ40 v krvi (červené trojuholníky) a mozgovomiechovom moku (oranžové trojuholníky) u potkanov liečených streptavidínom konjugovaným s tranzitným peptidom #2077 a inhibičným peptidom BACE1 v pomere 3:1. (d) Percentuálne zníženie Aβ40 v krvi (červené krúžky) a mozgovomiechovom moku (oranžové krúžky) u potkanov liečených streptavidínom naviazaným iba na inhibičný peptid BACE1. Koncentrácia Aβ v kontrole bola 420 pg/ml (štandardná odchýlka = 101 pg/ml).
Fágový displej sa úspešne aplikoval v niekoľkých oblastiach biomedicínskeho výskumu17. Táto metóda sa použila na štúdie vaskulárnej diverzity in vivo18,19, ako aj na štúdie zamerané na mozgové cievy20,21,22,23,24,25,26. V tejto štúdii sme rozšírili aplikáciu tejto selekčnej metódy nielen na priamu identifikáciu peptidov zameraných na mozgové cievy, ale aj na objav kandidátov s aktívnymi transportnými vlastnosťami na prechod hematoencefalickou bariérou. Teraz popisujeme vývoj selekčného postupu in vivo u potkanov intubovaných s KM a demonštrujeme jeho potenciál identifikovať peptidy s vlastnosťami navádzania do mozgovomiechového moku (CSF). Pomocou fágu T7 zobrazujúceho knižnicu 12-mérnych náhodných peptidov sme dokázali, že fág T7 je dostatočne malý (približne 60 nm v priemere)10 na to, aby sa adaptoval na hematoencefalickú bariéru, a tým priamo prechádzal hematoencefalickou bariérou alebo choroidálnym plexom. Zistili sme, že odber mozgovomiechového moku (CSF) z kanulovaných potkanov CM bol dobre kontrolovanou metódou funkčného skríningu in vivo a že extrahovaný fág sa nielen viaže na cievy, ale funguje aj ako transportér cez hematoencefalickú bariéru. Okrem toho sme súčasným odberom krvi a aplikáciou HTS na CSF a fágy odvodené z krvi potvrdili, že náš výber CSF nebol ovplyvnený obohatením krvi ani vhodnosťou na expanziu medzi kolami selekcie. Krvný kompartment je však súčasťou selekčného postupu, pretože fágy schopné dosiahnuť kompartment CSF musia prežiť a cirkulovať v krvnom obehu dostatočne dlho, aby sa obohatili v mozgu. Aby sme získali spoľahlivé informácie o sekvencii z nespracovaných údajov HTS, implementovali sme do analytického pracovného postupu filtre prispôsobené chybám sekvenovania špecifickým pre platformu. Začlenením kinetických parametrov do metódy skríningu sme potvrdili rýchlu farmakokinetiku fágov divokého typu T7 (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 a tiež sme stanovili ich polčas rozpadu v mozgovomiechovom moku (t½ ~ 26 min) za minútu. Napriek podobným farmakokinetickým profilom v krvi a mozgovomiechovom moku (CSF) bolo možné v CSF detegovať iba 0,001 % koncentrácie fágu v krvi, čo naznačuje nízku mobilitu fágu divokého typu T7 cez hematoencefalickú bariéru. Táto práca zdôrazňuje dôležitosť prvého kola selekcie pri použití stratégií panningu in vivo, najmä pre fágové systémy, ktoré sa rýchlo vylučujú z obehu, pretože len málo klonov je schopných dosiahnuť kompartment CNS. V prvom kole bolo teda zníženie diverzity knižnice veľmi veľké, pretože v tomto veľmi prísnom modeli CSF sa nakoniec zozbieral iba obmedzený počet klonov. Táto stratégia panningu in vivo zahŕňala niekoľko krokov selekcie, ako je aktívna akumulácia v kompartmente CSF, prežitie klonov v krvnom kompartmente a rýchle odstránenie klonov fágu T7 z krvi v priebehu prvých 10 minút (obr. 1d a doplnkový obr. 4M). Po prvom kole boli teda v CSF identifikované rôzne fágové klony, hoci pre jednotlivé zvieratá sa použil rovnaký počiatočný súbor. To naznačuje, že viacero krokov prísneho selekcie pre zdrojové knižnice s veľkým počtom členov knižnice vedie k významnému zníženiu diverzity. Preto sa náhodné udalosti stanú neoddeliteľnou súčasťou počiatočného selekčného procesu a výrazne ovplyvnia výsledok. Je pravdepodobné, že mnohé klony v pôvodnej knižnici mali veľmi podobný sklon k obohateniu mozgovomiechového moku (CSF). Avšak aj za rovnakých experimentálnych podmienok sa výsledky selekcie môžu líšiť v dôsledku malého počtu každého konkrétneho klonu v počiatočnom súbore.
Motívy obohatené v mozgovomiechovom moku sa líšia od motívov v krvi. Je zaujímavé, že sme zaznamenali prvý posun smerom k peptidom bohatým na glycín v krvi jednotlivých zvierat (obr. 1g, doplnkové obrázky 4e, 4f). Fágy obsahujúce glycínové peptidy môžu byť stabilnejšie a s menšou pravdepodobnosťou sa vylúčia z obehu. Tieto peptidy bohaté na glycín však neboli detegované vo vzorkách mozgovomiechového moku, čo naznačuje, že kurátorované knižnice prešli dvoma rôznymi krokmi selekcie: jeden v krvi a druhý sa nechal akumulovať v mozgovomiechovom moku. Klony obohatené o mozgovomiechový mok, ktoré boli výsledkom štvrtého kola selekcie, boli rozsiahlo testované. Bolo potvrdené, že takmer všetky individuálne testované klony sú obohatené o mozgovomiechový mok v porovnaní s kontrolným fágom slepej vzorky. Jeden peptidový zásah (č. 2077) bol skúmaný podrobnejšie. Vykazoval dlhší plazmatický polčas v porovnaní s inými zásahmi (obrázok 3d a doplnkový obrázok 7) a zaujímavé je, že tento peptid obsahoval cysteínový zvyšok na C-konci. Nedávno sa ukázalo, že pridanie cysteínu k peptidom môže zlepšiť ich farmakokinetické vlastnosti väzbou na albumín 29. Toto je v súčasnosti pre peptid č. 2077 neznáme a vyžaduje si ďalšie štúdium. Niektoré peptidy vykazovali valenčnú závislosť v obohatení mozgovomiechového moku (údaje nie sú uvedené), čo môže súvisieť so zobrazenou geometriou povrchu kapsidy T7. Systém T7, ktorý sme použili, vykazoval 5 – 15 kópií každého peptidu na fágovú časticu. IHC sa vykonala na kandidátskych vedúcich fágových klonoch injikovaných intravenózne do mozgovej kôry potkanov (doplnkový obrázok 8). Údaje ukázali, že najmenej tri klony (č. 2002, č. 2009 a č. 2077) interagovali s hematopoéznou bariérou (HBB). Zostáva určiť, či táto interakcia s HBB vedie k akumulácii CSF alebo k presunu týchto klonov priamo do BCSFB. Dôležité je, že sme ukázali, že vybrané peptidy si zachovávajú svoju transportnú kapacitu v CSF, keď sú syntetizované a viazané na proteínový náklad. Väzba N-terminálnych biotinylovaných peptidov na SA v podstate opakuje výsledky získané s ich príslušnými fágovými klonmi v krvi a mozgovomiechovom moku (Obr. 3e). Nakoniec ukazujeme, že vedúci peptid #2077 je schopný podporovať mozgový účinok biotinylovaného peptidového inhibítora BACE1 konjugovaného so SA, čo spôsobuje výrazné farmakodynamické účinky v CNS významným znížením hladín Abeta40 v mozgovomiechovom moku (Obr. 4). Nepodarilo sa nám identifikovať žiadne homológy v databáze vykonaním vyhľadávania homológie peptidových sekvencií vo všetkých zhodách. Je dôležité poznamenať, že veľkosť knižnice T7 je približne 109, zatiaľ čo teoretická veľkosť knižnice pre 12-méry je 4 x 1015. Preto sme vybrali iba malú časť priestoru diverzity knižnice 12-mérnych peptidov, čo môže znamenať, že optimalizovanejšie peptidy je možné identifikovať vyhodnotením susedného priestoru sekvencií týchto identifikovaných zhod. Hypoteticky môže byť jedným z dôvodov, prečo sme nenašli žiadne prirodzené homológy týchto peptidov, deselekcia počas evolúcie, aby sa zabránilo nekontrolovanému vstupu určitých peptidových motívov do mozgu.
Naše výsledky spoločne poskytujú základ pre budúcu prácu zameranú na podrobnejšiu identifikáciu a charakterizáciu transportných systémov cerebrovaskulárnej bariéry in vivo. Základné nastavenie tejto metódy je založené na stratégii funkčného výberu, ktorá nielen identifikuje klony s väzbovými vlastnosťami pre mozgové cievy, ale zahŕňa aj kritický krok, v ktorom úspešné klony majú vnútornú aktivitu prechádzať biologickými bariérami in vivo do kompartmentu CNS. Cieľom je objasniť mechanizmus transportu týchto peptidov a ich preferenciu väzby na mikrocirkuláciu špecifickú pre oblasť mozgu. To môže viesť k objavu nových dráh pre transport hematopoéznej bariéry (HEB) a receptorov. Očakávame, že identifikované peptidy sa môžu priamo viazať na cerebrovaskulárne receptory alebo na cirkulujúce ligandy transportované cez HBB alebo BCSFB. Peptidové vektory s transportnou aktivitou v CSF objavené v tejto práci budú ďalej skúmané. V súčasnosti skúmame mozgovú špecifickosť týchto peptidov z hľadiska ich schopnosti prechádzať cez HBB a/alebo BCSFB. Tieto nové peptidy budú mimoriadne cennými nástrojmi pre potenciálny objav nových receptorov alebo dráh a pre vývoj nových vysoko účinných platforiem na dodávanie makromolekúl, ako sú biologické liečivá, do mozgu.
Kanylujte veľkú cisternu (VC) pomocou modifikácie predtým opísanej metódy. Anestetizované potkany Wistar (200 – 350 g) boli umiestnené na stereotaktický prístroj a cez oholenú a asepticky pripravenú pokožku hlavy bol urobený stredný rez, aby sa odkryla lebka. V oblasti horného krídla boli vyvŕtané dva otvory a do otvorov boli upevnené fixačné skrutky. Ďalší otvor bol vyvŕtaný v laterálnom okcipitálnom hrebeni pre stereotaktické vedenie kanyly z nehrdzavejúcej ocele do VC. Okolo kanyly bol nanesený dentálny cement a zaistený skrutkami. Po fotopolymerácii a vytvrdnutí cementu bola kožná rana uzavretá supramidovým stehom 4/0. Správne umiestnenie kanyly sa potvrdzuje spontánnym únikom mozgovomiechového moku (CSF). Potkan bol vybratý zo stereotaktického prístroja, mal by dostať vhodnú pooperačnú starostlivosť a liečbu bolesti a mal by sa zotavovať aspoň jeden týždeň, kým sa v mozgovomiechovom moku neobjavia známky krvi. Potkany Wistar (Crl:WI/Han) boli získané od spoločnosti Charles River (Francúzsko). Všetky potkany boli chované v špecifických podmienkach bez patogénov. Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Veterinárnym úradom mesta Bazilej vo Švajčiarsku a boli vykonané v súlade s licenciou na zvieratá č. 2474 (Hodnotenie aktívneho transportu v mozgu meraním hladín terapeutických kandidátov v mozgovomiechovom moku a mozgu potkanov).
Jemne udržujte potkana pri vedomí s kanylou CM v ruke. Vyberte durman z kanyly a odoberte 10 µl spontánne tečúceho mozgovomiechového moku. Keďže priechodnosť kanyly bola nakoniec ohrozená, do tejto štúdie boli zahrnuté iba číre vzorky mozgovomiechového moku bez známok kontaminácie krvou alebo zmeny farby. Súbežne sa z malého rezu na špičke chvosta odobralo približne 10 – 20 μl krvi do skúmaviek s heparínom (Sigma-Aldrich). Mozgovomiechový mok a krv sa odoberali v rôznych časových bodoch po intravenóznej injekcii fága T7. Pred odberom každej vzorky mozgovomiechového moku sa vylialo približne 5 – 10 μl tekutiny, čo zodpovedá mŕtvemu objemu katétra.
Knižnice boli vytvorené pomocou vektora T7Select 10-3b, ako je opísané v manuáli systému T7Select (Novagen, Rosenberg a kol., InNovations 6, 1-6, 1996). Stručne povedané, náhodný 12-mérny DNA inzert bol syntetizovaný v nasledujúcom formáte:
Kodón NNK bol použitý na zabránenie dvojitých stop kodónov a nadmernej expresie aminokyselín vo vloženom inzerte. N je manuálne zmiešaný ekvimolárny pomer každého nukleotidu a K je manuálne zmiešaný ekvimolárny pomer adenínových a cytozínových nukleotidov. Jednovláknové oblasti boli prevedené na dvojvláknovú DNA ďalšou inkubáciou s dNTP (Novagen) a Klenowovým enzýmom (New England Biolabs) v Klenowovom pufri (New England Biolabs) počas 3 hodín pri teplote 37 °C. Po reakcii bola dvojvláknová DNA získaná precipitáciou EtOH. Výsledná DNA bola štiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a HindIII (oba od Roche). Rozštiepený a purifikovaný (QIAquick, Qiagen) inzert (T4 ligáza, New England Biolabs) bol potom ligovaný in-frame do vopred rozštiepeného vektora T7 za aminokyselinou 348 kapsidového génu 10B. Ligačné reakcie boli inkubované pri teplote 16 °C počas 18 hodín pred zabalením in vitro. Balenie fágov in vitro sa uskutočnilo podľa pokynov dodaných s klonovacou súpravou T7Select 10-3b (Novagen) a baliaci roztok sa raz amplifikoval do lýzy s použitím Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lyzáty sa centrifugovali, titrovali a zmrazili pri teplote -80 °C ako zásobný roztok glycerolu.
Priama PCR amplifikácia variabilných oblastí fágu amplifikovaných v bujóne alebo na platni s použitím patentovaných fúznych primerov 454/Roche-amplicon. Priamy fúzny primer obsahuje sekvencie lemujúce variabilnú oblasť (NNK) 12 (špecifická pre templát), GS FLX Titanium Adapter A a štvorbázovú kľúčovú sekvenciu knižnice (TCAG) (doplnkový obrázok 1a):
Primer pre reverznú fúziu obsahuje aj biotín pripojený k záchytným guľôčkam a titánový adaptér GS FLX B potrebný na klonálnu amplifikáciu počas emulznej PCR:
Amplikóny boli následne podrobené pyrosekvenovaniu 454/Roche podľa protokolu 454 GS-FLX Titanium. Pre manuálne Sangerovo sekvenovanie (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) bola DNA fága T7 amplifikovaná pomocou PCR a sekvenovaná s nasledujúcimi pármi primerov:
Vložky z jednotlivých plakov boli podrobené PCR amplifikácii s použitím súpravy Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (podľa pokynov výrobcu). Vykonajte horúci štart (10 minút pri 95 °C) a 35 boost cyklov (50 s pri 95 °C, 1 minúta pri 50 °C a 1 minúta pri 72 °C).
Fágy z knižníc, fágy divokého typu, fágy získané z mozgovomiechového moku a krvi alebo jednotlivé klony boli amplifikované v Escherichia coli BL5615 v TB bujóne (Sigma Aldrich) alebo v 500 cm2 miskách (Thermo Scientific) počas 4 hodín pri teplote 37 °C. Fágy boli extrahované z platní opláchnutím platní Tris-EDTA pufrom (Fluka Analytical) alebo zhromaždením plakov sterilnými pipetovacími špičkami. Fágy boli izolované z kultivačného supernatantu alebo extrakčného pufra jedným kolom precipitácie polyetylénglykolom (PEG 8000) (Promega) a resuspendované v Tris-EDTA pufri.
Amplifikovaný fág bol pred intravenóznou (IV) injekciou (500 μl/zviera) podrobený 2-3 kolám odstránenia endotoxínov pomocou guľôčok na odstránenie endotoxínov (Miltenyi Biotec). V prvom kole bolo zavedených 2×1012 fágov; v druhom kole 2×1010 fágov; v treťom a štvrtom selekčnom kole 2×109 fágov na zviera. Obsah fágov vo vzorkách mozgovomiechového moku a krvi odobratých v uvedených časových bodoch bol stanovený počítaním plakov podľa pokynov výrobcu (príručka k systému T7Select). Selekcia fágov sa uskutočnila intravenóznou injekciou purifikovaných knižníc do chvostovej žily alebo opätovnou injekciou fágu extrahovaného z mozgovomiechového moku z predchádzajúceho selekčného kola a následné odbery sa uskutočnili po 10 minútach, 30 minútach, 60 minútach, 90 minútach, 120 minútach, 180 minútach a 240 minútach vo vzorkách mozgovomiechového moku a krvi. Celkovo sa uskutočnili štyri kolá in vivo panningu, v ktorých sa dve vybrané vetvy samostatne uchovávali a analyzovali počas prvých troch kôl selekcie. Všetky fágové vložky extrahované z mozgovomiechového moku z prvých dvoch kôl selekcie boli podrobené pyrosekvenovaniu 454/Roche, zatiaľ čo všetky klony extrahované z mozgovomiechového moku z posledných dvoch kôl selekcie boli manuálne sekvenované. Všetky krvné fágy z prvého kola selekcie boli tiež podrobené pyrosekvenovaniu 454/Roche. Na injekciu fágových klonov boli vybrané fágy amplifikované v E. coli (BL5615) na 500 cm2 platniach pri teplote 37 °C počas 4 hodín. Jednotlivo vybrané a manuálne sekvenované klony boli množené v TB médiu. Po extrakcii fágov, purifikácii a odstránení endotoxínu (ako je opísané vyššie) sa intravenózne do jednej chvostovej žily injektovalo 2 × 1010 fágov/zviera v 300 μl.
Predspracovanie a kvalitatívne filtrovanie sekvenčných dát. Nespracované dáta 454/Roche boli konvertované z binárneho štandardného formátu stream map (sff) do Pearsonovho formátu čitateľného pre človeka (fasta) pomocou softvéru od dodávateľa. Ďalšie spracovanie nukleotidovej sekvencie bolo vykonané pomocou proprietárnych programov a skriptov v jazyku C (nevydaný softvérový balík), ako je opísané nižšie. Analýza primárnych dát zahŕňa prísne viacstupňové filtračné postupy. Na filtrovanie čítaní, ktoré neobsahovali platnú 12-mérnu inzertovanú sekvenciu DNA, boli čítania postupne zarovnané so štartovacou značkou (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop značkou (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) a inzertným pozadím (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) pomocou globálneho Needleman-Wunschovho testu. zarovnanie umožňujúce až 2 nekonzistentnosti na zarovnanie31. Preto boli z knižnice odstránené čítania bez štartovacích a stop značiek a čítania obsahujúce inzerty na pozadí, t. j. zarovnania, ktoré presahujú povolený počet nezhôd. Čo sa týka zostávajúcich čítaní, z pôvodnej čítanej sekvencie bola vyrezaná a ďalej spracovaná sekvencia N-mérovej DNA siahajúca od štartovacej značky a končiaca pred stop značkou (ďalej len „inzert“). Po translácii inzertu bola z inzertu odstránená časť za prvým stop kodónom na 5′ konci primeru. Okrem toho boli odstránené aj nukleotidy vedúce k neúplným kodónom na 3′ konci primeru. Na vylúčenie inzertov obsahujúcich iba pozadie sekvencií boli odstránené aj translatované inzerty začínajúce aminokyselinovým vzorom „PAG“. Z knižnice boli odstránené aj peptidy s posttranslačnou dĺžkou kratšou ako 3 aminokyseliny. Nakoniec bola odstránená redundancia v súbore inzertov a určená frekvencia každého jedinečného inzertu. Výsledky tejto analýzy zahŕňali zoznam nukleotidových sekvencií (inzertov) a ich (čítaných) frekvencií (doplnkové obrázky 1c a 2).
Zoskupenie N-mer DNA inzertov podľa sekvenčnej podobnosti: Aby sa eliminovali chyby sekvenovania špecifické pre 454/Roche (ako sú problémy so sekvenovaním homopolymérnych extenzií) a odstránili menej dôležité redundancie, predtým filtrované N-mer DNA sekvenčné inzerty (inzerty) sa zoradia podľa podobnosti. inzercie (povolené sú až 2 nezhodné bázy) pomocou iteračného algoritmu definovaného nasledovne: inzercie sa zoradia najprv podľa ich frekvencie (od najvyššej po najnižšiu) a ak sú rovnaké, podľa ich sekundárneho zoradenia podľa dĺžky (od najdlhšej po najkratšiu). Najčastejšie a najdlhšie inzercie teda definujú prvú „skupinu“. Frekvencia skupiny je nastavená na kľúčovú frekvenciu. Potom sa každá zostávajúca inzercia v zoradenom zozname pokúsila pridať do skupiny párovým Needleman-Wunschovým zarovnaním. Ak počet nezhôd, inzercií alebo delécií v zarovnaní nepresiahne prahovú hodnotu 2, do skupiny sa pridá inzercia a celková frekvencia skupiny sa zvýši o to, ako často bola inzercia pridaná. Inzerty pridané do skupiny sa označia ako použité a vylúčia sa z ďalšieho spracovania. Ak vloženú sekvenciu nemožno pridať do už existujúcej skupiny, vložená sekvencia sa použije na vytvorenie novej skupiny s príslušnou frekvenciou vloženia a označí sa ako použitá. Iterácia sa končí, keď sa každá vložená sekvencia buď použije na vytvorenie novej skupiny, alebo sa môže zahrnúť do už existujúcej skupiny. Zoskupené vložené sekvencie pozostávajúce z nukleotidov sa nakoniec preložia do peptidových sekvencií (peptidových knižníc). Výsledkom tejto analýzy je súbor vložených sekvencií a ich zodpovedajúcich frekvencií, ktoré tvoria počet po sebe nasledujúcich čítaní (doplnkový obrázok 2).
Generovanie motívov: Na základe zoznamu unikátnych peptidov bola vytvorená knižnica obsahujúca všetky možné aminokyselinové vzory (aa), ako je znázornené nižšie. Každý možný vzor s dĺžkou 3 bol extrahovaný z peptidu a jeho inverzný vzor bol pridaný spolu so spoločnou knižnicou motívov obsahujúcou všetky vzory (tripeptidy). Knižnice vysoko opakujúcich sa motívov boli sekvenované a redundancia bola odstránená. Potom sme pre každý tripeptid v knižnici motívov pomocou výpočtových nástrojov skontrolovali jeho prítomnosť v knižnici. V tomto prípade sa pridá frekvencia peptidu obsahujúceho nájdený motív tripeptidu a priradí sa k motívu v knižnici motívov („počet motívov“). Výsledkom generovania motívov je dvojrozmerné pole obsahujúce všetky výskyty tripeptidov (motívov) a ich príslušné hodnoty, čo je počet sekvenčných čítaní, ktoré vedú k zodpovedajúcemu motívu, keď sú čítania filtrované, zoskupené a preložené. Metriky, ako je podrobne opísané vyššie.
Normalizácia počtu motívov a zodpovedajúcich bodových grafov: Počet motívov pre každú vzorku bol normalizovaný pomocou
kde ni je počet čítaní obsahujúcich tému i. Vi teda predstavuje percentuálnu frekvenciu čítaní (alebo peptidov) obsahujúcich motív i vo vzorke. P-hodnoty pre nenormalizovaný počet motívov boli vypočítané pomocou Fisherovho exaktného testu. Pokiaľ ide o korelogramy počtu motívov, Spearmanove korelácie boli vypočítané pomocou normalizovaného počtu motívov s R.
Na vizualizáciu obsahu aminokyselín v každej pozícii v peptidovej knižnici boli vytvorené webové logogramy 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Najprv sa obsah aminokyselín v každej pozícii 12-mérneho peptidu uloží do matice 20×12. Potom sa vo formáte fasta-sequence vygeneruje sada 1000 peptidov obsahujúcich rovnaký relatívny obsah aminokyselín v každej pozícii a poskytne sa ako vstup do web-logo 3, ktorý generuje grafické znázornenie relatívneho obsahu aminokyselín v každej pozícii pre danú peptidovú knižnicu. Na vizualizáciu viacrozmerných súborov údajov boli vytvorené tepelné mapy pomocou interne vyvinutého nástroja v jazyku R (biosHeatmap, balík R, ktorý ešte nebol vydaný). Dendrogramy prezentované v tepelných mapách boli vypočítané pomocou Wardovej hierarchickej klastrovacej metódy s euklidovskou metrikou vzdialenosti. Pre štatistickú analýzu údajov o hodnotení motívov boli hodnoty P pre nenormalizované hodnotenie vypočítané pomocou Fisherovho exaktného testu. P-hodnoty pre ostatné súbory údajov boli vypočítané v R pomocou Studentovho t-testu alebo ANOVA.
Vybrané fágové klony a fágy bez inzertov boli injekčne podané intravenózne cez chvostovú žilu (2×1010 fágov/zviera v 300 μl PBS). Desať minút pred perfúziou a následnou fixáciou boli tie isté zvieratá intravenózne injekčne podané 100 μl lektínu značeného DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minút po injekcii fágu boli potkany perfundované cez srdce 50 ml PBS a následne 50 ml 4% PFA/PBS. Vzorky mozgu boli dodatočne fixované cez noc v 4% PFA/PBS a namočené cez noc v 30% sacharóze pri 4 °C. Vzorky boli rýchlo zmrazené v zmesi OCT. Imunohistochemická analýza zmrazených vzoriek bola vykonaná pri izbovej teplote na 30 µm kryorezoch blokovaných 1% BSA a inkubovaných s polyklonálnymi protilátkami značenými FITC proti fágu T7 (Novus NB 600-376A) pri 4 °C. Inkubujte cez noc. Nakoniec boli rezy trikrát premyté PBS a vyšetrené konfokálnym laserovým mikroskopom (Leica TCS SP5).
Všetky peptidy s minimálnou čistotou 98 % boli syntetizované spoločnosťou GenScript USA, biotinylované a lyofilizované. Biotín je viazaný prostredníctvom dodatočného trojitého glycínového medzerníka na N-konci. Všetky peptidy skontrolujte pomocou hmotnostnej spektrometrie.
Streptavidín (Sigma S0677) bol zmiešaný s 5-násobným ekvimolárnym nadbytkom biotinylovaného peptidu, biotinylovaného inhibičného peptidu BACE1 alebo kombináciou (pomer 3:1) biotinylovaného inhibičného peptidu BACE1 a inhibičného peptidu BACE1 v 5–10 % DMSO/inkubované v PBS. Pred injekciou sa 1 hodinu miešal pri izbovej teplote. Peptidy konjugované so streptavidínom boli injekčne podané intravenózne v dávke 10 mg/kg do jednej z chvostových žíl potkanov s mozgovou dutinou.
Koncentrácia komplexov streptavidín-peptid bola stanovená pomocou ELISA. Mikrotitračné platne Nunc Maxisorp (Sigma) boli cez noc pri 4 °C potiahnuté 1,5 μg/ml myšacou protilátkou proti streptavidínu (Thermo, MA1-20011). Po blokovaní (blokovací pufor: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatíny, 1 % BSA) pri izbovej teplote počas 2 hodín boli platne premyté 0,05 % Tween-20/PBS (premývací pufor) počas 3 sekúnd. Do jamiek boli pridané vzorky mozgovomiechového moku a plazmy zriedené blokovacím pufrom (plazma 1:10 000, mozgovomiechový mok 1:115). Platňa bola potom inkubovaná cez noc pri 4 °C s detekčnou protilátkou (1 μg/ml, anti-streptavidín-HRP, Novus NB120-7239). Po troch premytých krokoch bol streptavidín detegovaný inkubáciou v roztoku substrátu TMB (Roche) po dobu až 20 minút. Po zastavení vývoja farby pomocou 1M H2SO4 sa zmerala absorbancia pri 450 nm.
Funkcia komplexu streptavidín-peptid-inhibítor BACE1 bola hodnotená pomocou Aβ(1-40) ELISA podľa protokolu výrobcu (Wako, 294-64701). Stručne povedané, vzorky mozgovomiechového moku boli zriedené v štandardnom riedidle (1:23) a inkubované cez noc pri 4 °C v 96-jamkových platniach potiahnutých záchytnou protilátkou BNT77. Po piatich krokoch premytia bola pridaná HRP-konjugovaná protilátka BA27 a inkubovaná 2 hodiny pri 4 °C, po čom nasledovalo päť krokov premytia. Aβ(1–40) bol detegovaný inkubáciou v roztoku TMB počas 30 minút pri izbovej teplote. Po zastavení vývoja farby stop roztokom sa zmerala absorbancia pri 450 nm. Vzorky plazmy boli pred Aβ(1–40) ELISA podrobené extrakcii na pevnej fáze. Plazma bola pridaná k 0,2 % DEA (Sigma) v 96-jamkových platniach a inkubovaná pri izbovej teplote počas 30 minút. Po postupnom premytí SPE platní (Oasis, 186000679) vodou a 100 % metanolom boli na SPE platne pridané vzorky plazmy a všetka kvapalina bola odstránená. Vzorky boli premyté (najprv 5 % metanolom, potom 30 % metanolom) a eluované 2 % NH4OH/90 % metanolom. Po vysušení eluátu pri teplote 55 °C počas 99 minút pri konštantnom prúde N2 boli vzorky redukované v štandardných riedidlách a Aβ(1–40) bol meraný podľa vyššie uvedeného postupu.
Ako citovať tento článok: Urich, E. a kol. Doručovanie nákladu do mozgu pomocou tranzitných peptidov identifikovaných in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Dodávanie makromolekulárnych liečiv do mozgu pomocou cielenej terapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. a Martinez-Martinez, P. Dodávanie peptidových a proteínových liečiv cez hematoencefalickú bariéru. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoencefalická bariéra: úzke miesto vo vývoji liekov pre mozog. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG a Byrd, A. Perspektívy zlepšeného dodávania liekov a ich cielenia do mozgu prostredníctvom dráhy choroidálny plexus-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizácia biofarmaceutík s molekulárnymi trójskymi koňmi na ich doručenie do mozgu. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorom sprostredkovaný transport peptidov cez hematoencefalickú bariéru. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. a kol. Zvýšenie penetrácie mozgu a účinnosti terapeutických protilátok pomocou monovalentných molekulárnych kyvadlových vozidiel. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. a kol. Transport cez transferínový receptor (TfR) určuje vychytávanie afinitných variantov protilátok TfR v mozgu. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).