Niektoré témy riešenia problémov s LC nie sú nikdy zastarané, pretože v praxi LC existujú problémy, aj keď sa technológia prístroja časom zlepšuje. Existuje mnoho spôsobov, ako môžu problémy v systéme LC nastať a skončiť v zlom tvare špičky. Keď sa vyskytnú problémy súvisiace s tvarom špičky, krátky zoznam možných príčin týchto výsledkov nám pomôže zjednodušiť naše skúsenosti s riešením problémov.
Bolo zábavné písať túto rubriku „Riešenie problémov LC“ a každý mesiac premýšľať o témach, pretože niektoré témy nikdy nevyjdú z módy. Zatiaľ čo v oblasti chromatografického výskumu sa určité témy alebo nápady stanú zastaranými, pretože sú nahradené novšími a lepšími nápadmi, v oblasti odstraňovania problémov, odkedy sa v tomto časopise objavil prvý článok o riešení problémov (v tom čase LC Journal), sa venujem niekoľko posledných rokov, stále som sa tomu venoval niekoľko posledných rokov. popis sekcií o súčasných trendoch ovplyvňujúcich kvapalinovú chromatografiu (LC) (napríklad relatívne porovnanie nášho chápania vplyvu tlaku na retenciu [2] New Advances) Naša interpretácia výsledkov LC a ako riešiť problémy s modernými LC prístrojmi. V tomto mesiaci pokračujem vo svojej sérii (3), ktorá sa začala v decembri 2021 a ktorá sa zameriava na niektoré z tém, ktoré sú dôležité pre problémy so životom a smrťou. systému, ktorý používame. Hlavná téma tejto série je vysoko relevantná pre slávnu nástennú schému LCGC „LC Troubleshooting Guide“ (4), ktorá visí v mnohých laboratóriách. Pre tretiu časť tejto série som sa rozhodol zamerať na problémy súvisiace s tvarom špičiek alebo charakteristikami špičiek. Je neuveriteľné, že nástenná tabuľka uvádza 44 rôznych možných príčin zlého tvaru špičky, takže nemôžeme podrobne zvážiť všetky tieto problémy pri inštalácii. tie, ktoré vidím najčastejšie. Dúfam, že mladí a starí používatelia LC nájdu niekoľko užitočných tipov a pripomienok na túto dôležitú tému.
Stále častejšie odpovedám na otázky týkajúce sa riešenia problémov „všetko je možné“. Táto odpoveď sa môže zdať jednoduchá, keď vezmeme do úvahy pozorovania, ktoré sa ťažko interpretujú, ale často ju považujem za vhodnú. Vzhľadom na mnohé možné príčiny zlého tvaru vrcholu je dôležité zachovať si otvorenú myseľ pri zvažovaní toho, o aký problém môže ísť, a aby sme mohli uprednostniť potenciálne príčiny, aby sme mohli začať s riešením problémov so zameraním na tie najbežnejšie možnosti, tento bod je veľmi dôležitý.
Kľúčovým krokom v akomkoľvek cvičení na riešenie problémov – ale ten, ktorý je podľa mňa podceňovaný – je uvedomenie si, že existuje problém, ktorý treba vyriešiť. Uznanie, že existuje problém, často znamená uznať, že to, čo sa stane s nástrojom, sa líši od našich očakávaní, ktoré sú formované teóriou, empirickými znalosťami a skúsenosťami (5). „Tvar vrcholu“, ktorý sa tu uvádza, v skutočnosti odkazuje nielen na tvar vrcholu, asymetrický, symetrický, hladký atď. šírka. Naše očakávania pre skutočný tvar píkov sú jednoduché. Teória (6) dobre podporuje učebnicové očakávanie, že vo väčšine prípadov by chromatografické píky mali byť symetrické a mali by zodpovedať tvaru gaussovskej distribúcie, ako je znázornené na obrázku 1a. To, čo očakávame od šírky píkov, je zložitejší problém a o tejto téme budeme diskutovať v budúcom článku. Iné slová z iných pozorovaných tvarov na obrázku 1 môžu zostať nesprávne. tejto časti strávime čas diskusiou o niektorých konkrétnych príkladoch situácií, ktoré môžu viesť k týmto typom tvarov.
Niekedy sa vrcholy vôbec nepozorujú na chromatograme, kde sa očakáva, že budú eluované. Hore uvedený nástenný graf naznačuje, že neprítomnosť vrcholu (za predpokladu, že vzorka skutočne obsahuje cieľový analyt v koncentrácii, ktorá by mala zabezpečiť, aby bola odozva detektora dostatočná na to, aby ho bolo možné vidieť nad šumom) zvyčajne súvisí s nejakým problémom s prístrojom alebo nesprávnymi podmienkami mobilnej fázy (ak sa vôbec pozorujú).vrcholy, zvyčajne príliš „slabé“). Krátky zoznam potenciálnych problémov a riešení v tejto kategórii nájdete v tabuľke I.
Ako už bolo spomenuté vyššie, otázka, do akej miery by sa malo tolerovať rozšírenie vrcholu, než tomu venujem pozornosť a snažím sa to napraviť, je zložitá téma, o ktorej budem diskutovať v budúcom článku. Moja skúsenosť je taká, že výrazné rozšírenie vrcholu je často sprevádzané významnou zmenou tvaru vrcholu a zúženie vrcholu je bežnejšie ako pred vrcholom alebo rozdelenie. Nominálne symetrické vrcholy sú však tiež rozšírené, čo môže byť spôsobené niekoľkými rôznymi dôvodmi:
Každý z týchto problémov bol podrobne prediskutovaný v predchádzajúcich vydaniach Troubleshooting LC a čitatelia, ktorí sa zaujímajú o tieto témy, si môžu prečítať tieto predchádzajúce články, kde nájdete informácie o základných príčinách a možných riešeniach týchto problémov.Viac informácií.
Okraj píkov, fronting píkov a rozdelenie môžu byť spôsobené chemickými alebo fyzikálnymi javmi a zoznam možných riešení týchto problémov sa značne líši v závislosti od toho, či máme do činenia s chemickým alebo fyzikálnym problémom. Porovnaním rôznych píkov v chromatograme môžete často nájsť dôležité vodítka o tom, ktorý je vinníkom. Ak všetky píky na chromatograme majú s najväčšou pravdepodobnosťou podobné tvary, zvyšok z nich nevykazuje fyzikálne tvary. Príčina je s najväčšou pravdepodobnosťou chemická.
Chemické príčiny chvostovania píkov sú príliš zložité na to, aby sme ich tu stručne rozoberali. Čitateľ, ktorý má záujem, sa odvoláva na nedávne vydanie „LC Troubleshooting“ pre hlbšiu diskusiu (10). Je však ľahké skúsiť znížiť hmotnosť vstrekovaného analytu a zistiť, či sa tvar piku zlepší. Ak áno, potom je to dobrá stopa, že problém je v tomto prípade problém „pri malom prípade, musí ísť o metódu chromatogramu, preťaženie hmotnosti“. musia byť zmenené tak, aby bolo možné dosiahnuť dobré tvary vrcholov aj pri väčších vstrekovaných hmotách.
Existuje aj mnoho potenciálnych fyzikálnych dôvodov pre vrcholový tailing. Čitatelia, ktorí sa zaujímajú o podrobnú diskusiu o možnostiach, sa odvolávajú na ďalšie nedávne vydanie „LC Troubleshooting“ (11). Jednou z najbežnejších fyzikálnych príčin vrcholového tailingu je zlé spojenie v bode medzi injektorom a detektorom (12). objemová injekčná slučka s objímkou, ktorá bola nalisovaná na kapiláru z nehrdzavejúcej ocele. Po niekoľkých počiatočných pokusoch o odstraňovanie problémov sme si uvedomili, že hĺbka otvoru v statore vstrekovacieho ventilu bola oveľa hlbšia, ako sme boli zvyknutí, čo viedlo k veľkému mŕtvemu objemu na dne otvoru. Tento problém sa dá ľahko vyriešiť výmenou vstrekovacej slučky za inú hadičku, objímku môžeme nastaviť do správnej polohy, aby sme eliminovali mŕtvy objem otvoru v spodnej časti.
Čelá píkov, ako sú zobrazené na obrázku 1e, môžu byť tiež spôsobené fyzikálnymi alebo chemickými problémami. Bežnou fyzikálnou príčinou nábežnej hrany je, že lôžko častíc v kolóne nie je dobre naplnené, alebo že častice sa časom reorganizovali. Rovnako ako v prípade maximálneho tailingu spôsobeného týmto fyzikálnym javom, najlepším spôsobom, ako to vyriešiť, je vymeniť kolónu a pokračovať v chode. analyt zadržaný stacionárnou fázou (teda retenčný faktor) je lineárne úmerný koncentrácii analytu v kolóne. Chromatograficky to znamená, že keď sa hmotnosť analytu vstreknutého do kolóny zvyšuje, pík sa stáva vyšším, ale nie širším. Tento vzťah sa preruší, keď je retenčné správanie nelineárne a píky sa nielen zväčšujú, ale aj rozširujú, čím je výsledný tvar píku viac, výsledný tvar píku je nelineárny. .Tak ako pri preťažení hmoty, ktoré spôsobuje chvostovanie vrcholov (10), predstih vrcholov spôsobený nelineárnou retenciou možno diagnostikovať aj znížením hmotnosti vstreknutého analytu. Ak sa tvar vrcholu zlepší, metóda sa musí upraviť tak, aby neprekročila kvalitu vstrekovania, ktorá spôsobuje predchádzajúcu hranu, alebo sa musia zmeniť chromatografické podmienky, aby sa toto správanie minimalizovalo.
Niekedy pozorujeme niečo, čo sa javí ako „rozdelený“ pík, ako je znázornené na obrázku 1f. Prvým krokom pri riešení tohto problému je určiť, či je tvar píku spôsobený čiastočnou koelúciou (tj prítomnosťou dvoch odlišných, ale tesne eluujúcich zlúčenín). Ak v skutočnosti existujú dva rozdielne analyty, ktoré sa eluujú tesne vedľa seba, potom ide o zlepšenie ich rozlíšenia (napríklad zvýšením selektivity, samotnej fyzikálnej retencie alebo počtu doštičiek). sk, najdôležitejším vodítkom pre toto rozhodnutie je, či všetky píky v chromatograme vykazujú rozdelené tvary, alebo len jeden alebo dva. Ak je to len jeden alebo dva, ide pravdepodobne o problém spoločnej elúcie;ak sú všetky píky rozdelené, ide pravdepodobne o fyzický problém, ktorý s najväčšou pravdepodobnosťou súvisí so samotným stĺpcom.
Rozštiepené píky súvisiace s fyzikálnymi vlastnosťami samotnej kolóny sú zvyčajne spôsobené čiastočne zablokovanými vstupnými alebo výstupnými fritami alebo reorganizáciou častíc v kolóne, čo umožňuje, aby mobilná fáza v určitých oblastiach tvorby kanálov kolóny prúdila rýchlejšie ako mobilná fáza. v iných oblastiach (11). Čiastočne upchatú fritu možno niekedy vyčistiť reverzným tokom cez kolónu;avšak podľa mojich skúseností je to zvyčajne skôr krátkodobé ako dlhodobé riešenie. Toto je pri moderných kolónach často fatálne, ak sa častice v kolóne rekombinujú. V tomto bode je najlepšie kolónu vymeniť a pokračovať.
Vrchol na obrázku 1g, tiež z nedávneho prípadu v mojom vlastnom laboratóriu, zvyčajne naznačuje, že signál je taký vysoký, že dosiahol hornú hranicu rozsahu odozvy. V prípade detektorov s optickou absorbanciou (v tomto prípade UV-vis), keď je koncentrácia analytu veľmi vysoká, analyt absorbuje väčšinu svetla prechádzajúceho cez prietokovú kyvetu detektora, pričom zanecháva veľmi málo svetla, ktoré je silne ovplyvňované rôznymi zdrojmi svetla, ako je elektrický signál. prúdu, vďaka čomu je signál veľmi „rozmazaný“ a nezávislý od koncentrácie analytu.Keď k tomu dôjde, problém sa dá často ľahko vyriešiť znížením vstrekovaného objemu analytu – znížením vstrekovacieho objemu, zriedením vzorky alebo oboje.
V chromatografickej škole používame signál detektora (t.j. os y v chromatograme) ako indikátor koncentrácie analytu vo vzorke. Zdá sa nám teda zvláštne vidieť chromatogram so signálom pod nulou, pretože jednoduchá interpretácia je taká, že ide o negatívnu koncentráciu analytu – čo samozrejme nie je fyzikálne možné. Podľa mojich skúseností sú negatívne píky najčastejšie pozorované pri použití detektorov s UV absorbanciou (napr.).
V tomto prípade negatívny pík jednoducho znamená, že molekuly eluujúce z kolóny absorbujú menej svetla ako samotná mobilná fáza bezprostredne pred a po píku. Môže k tomu dôjsť napríklad pri použití relatívne nízkych detekčných vlnových dĺžok (<230 nm) a aditív mobilnej fázy, ktoré absorbujú väčšinu svetla pri týchto vlnových dĺžkach. Takýmito aditívami môžu byť zložky rozpúšťadla mobilnej fázy, ako je metanol alebo tlmiace zložky, ako je napríklad acetát alebo mravčan, pomocou ktorých je možné získať presnú informáciu o kvantite kalibrácie. žiadny zásadný dôvod sa im vyhýbať samy osebe (táto metóda sa niekedy označuje ako „nepriama UV detekcia“) (13). Ak sa však naozaj chceme úplne vyhnúť negatívnym vrcholom, v prípade detekcie absorbancie je najlepším riešením použiť inú vlnovú dĺžku detekcie, aby analyt absorboval viac ako mobilná fáza, alebo zmeniť zloženie mobilnej fázy tak, aby absorbovali menej svetla ako analyty.
Negatívne vrcholy sa môžu objaviť aj pri použití detekcie indexu lomu (RI), keď sa index lomu zložiek iných ako analyt vo vzorke, ako je matrica rozpúšťadla, líši od indexu lomu mobilnej fázy. Stáva sa to aj pri UV-vis detekcii, ale tento efekt má tendenciu byť zoslabený v porovnaní s detekciou RI. V oboch prípadoch možno negatívne píky minimalizovať tým, že sa zladenie matrice viac zhoduje so vzorkou.
V tretej časti o základnej téme riešenia problémov s LC som rozoberal situácie, v ktorých sa pozorovaný tvar vrcholu líši od očakávaného alebo normálneho tvaru vrcholu. Efektívne riešenie takýchto problémov začína znalosťou očakávaných tvarov vrcholov (na základe teórie alebo predchádzajúcich skúseností s existujúcimi metódami), takže odchýlky od týchto očakávaní sú zrejmé. Problémy s tvarom vrcholov majú veľa rôznych možných príčin (príliš široký, chvost, nábežná hrana atď.). Čitatelia, ktorí sa zaujímajú o podrobnejší zoznam príčin a riešení, si môžu pozrieť nástennú tabuľku LCGC „LC Troubleshooting Guide“.
(4) Nástenná tabuľka LCGC „LC Troubleshooting Guide“.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF a Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.