Niektoré témy riešenia problémov s LC nikdy nie sú zastarané, pretože v praxi LC existujú problémy, a to aj napriek tomu, že sa technológia prístrojov časom zlepšuje. Existuje mnoho spôsobov, ako môžu v systéme LC vzniknúť problémy a viesť k zlému tvaru píku. Keď sa vyskytnú problémy súvisiace s tvarom píku, krátky zoznam možných príčin týchto výsledkov pomáha zjednodušiť naše riešenie problémov.
Bolo zábavné písať tento stĺpček „Riešenie problémov s LC“ a premýšľať o témach každý mesiac, pretože niektoré témy nikdy nevyjdú z módy. Zatiaľ čo v oblasti výskumu chromatografie sa určité témy alebo myšlienky stávajú zastaranými, pretože sú nahradené novšími a lepšími nápadmi, v oblasti riešenia problémov, odkedy sa prvý článok o riešení problémov objavil v tomto časopise (v tom čase LC Journal), keďže niektoré témy sú stále relevantné) v roku 1983 (1). V posledných rokoch som sa v niekoľkých sekciách o riešení problémov s LC zameral na súčasné trendy ovplyvňujúce kvapalinovú chromatografiu (LC) (napríklad relatívne porovnanie nášho chápania vplyvu tlaku na retenciu [2] Nové pokroky), našu interpretáciu výsledkov LC a ako riešiť problémy s modernými LC prístrojmi. V tomto mesačnom pokračovaní pokračujem v mojej sérii (3), ktorá sa začala v decembri 2021 a ktorá sa zameriavala na niektoré „život a smrť“ dôležité témy riešenia problémov s LC – prvky, ktoré sú skvelé pre každého riešiteľa problémov, sú nevyhnutné bez ohľadu na vek systému, ktorý používame. Hlavná téma tejto série je veľmi relevantná pre slávnu nástennú tabuľku „Sprievodca riešením problémov s LC“ (4) od LCGC, ktorá visí v... mnohých laboratóriách. V tretej časti tejto série som sa rozhodol zamerať na problémy súvisiace s tvarom alebo charakteristikami píku. Je neuveriteľné, že nástenný graf uvádza 44 rôznych potenciálnych príčin zlého tvaru píku! V jednom článku nemôžeme podrobne zvážiť všetky tieto problémy, takže v tejto prvej časti na túto tému sa zameriam na niektoré z tých, s ktorými sa stretávam najčastejšie. Dúfam, že mladí aj starí používatelia LC nájdu užitočné tipy a pripomienky k tejto dôležitej téme.
Čoraz častejšie odpovedám na otázky týkajúce sa riešenia problémov slovami „všetko je možné“. Táto odpoveď sa môže zdať jednoduchá, keď berieme do úvahy pozorovania, ktoré je ťažké interpretovať, ale často ju považujem za vhodnú. Pri mnohých možných príčinách zlého tvaru píku je dôležité mať otvorenú myseľ pri zvažovaní, v čom by mohol byť problém, a byť schopný uprednostniť potenciálne príčiny, aby sme mohli začať s riešením problémov so zameraním na tie najčastejšie možnosti, čo je veľmi dôležité.
Kľúčovým krokom v každom riešení problémov – ale myslím si, že je podceňovaný – je rozpoznanie existencie problému, ktorý je potrebné vyriešiť. Rozpoznanie existencie problému často znamená rozpoznanie, že to, čo sa stane s nástrojom, sa líši od našich očakávaní, ktoré sú formované teóriou, empirickými poznatkami a skúsenosťami (5). „Tvar píku“, o ktorom sa tu hovorí, sa v skutočnosti nevzťahuje len na tvar píku (symetrický, asymetrický, hladký, nadýchaný, na nábežnej hrane, chvost atď.), ale aj na jeho šírku. Naše očakávania týkajúce sa skutočného tvaru píku sú jednoduché. Teória (6) dobre podporuje učebnicové očakávanie, že vo väčšine prípadov by chromatografické píky mali byť symetrické a zodpovedať tvaru Gaussovho rozdelenia, ako je znázornené na obrázku 1a. To, čo očakávame od šírky píkov, je zložitejšia otázka a túto tému budeme diskutovať v budúcom článku. Ostatné tvary píkov na obrázku 1 ukazujú niektoré z ďalších možností, ktoré by sa dali pozorovať – inými slovami, niektoré zo spôsobov, akými by sa veci mohli pokaziť. Vo zvyšku tejto časti sa budeme venovať diskusii o niektorých konkrétnych príkladoch situácií, ktoré môžu viesť k týmto typom tvarov.
Niekedy sa píky na chromatograme vôbec nepozorujú tam, kde sa očakáva ich eluácia. Vyššie uvedený nástenný graf naznačuje, že absencia píku (za predpokladu, že vzorka skutočne obsahuje cieľový analyt v koncentrácii, ktorá by mala zabezpečiť dostatočnú odozvu detektora na to, aby ho bolo možné vidieť nad šumom) zvyčajne súvisí s nejakým problémom s prístrojom alebo s nesprávnymi podmienkami mobilnej fázy (ak sa vôbec pozorujú). píky, zvyčajne príliš „slabé“). Stručný zoznam potenciálnych problémov a riešení v tejto kategórii možno nájsť v tabuľke I.
Ako už bolo spomenuté, otázka, aké veľké rozšírenie píku by malo byť tolerované predtým, ako sa mu začne venovať pozornosť a pokúsi sa ho opraviť, je zložitá téma, o ktorej budem diskutovať v budúcom článku. Moja skúsenosť je taká, že výrazné rozšírenie píku je často sprevádzané výraznou zmenou tvaru píku a chvostovanie píku je častejšie ako predpíkové obdobie alebo rozdelenie. Rozšírené sú však aj nominálne symetrické píky, čo môže byť spôsobené niekoľkými rôznymi dôvodmi:
Každý z týchto problémov bol podrobne prediskutovaný v predchádzajúcich vydaniach časopisu Troubleshooting LC a čitatelia, ktorí sa o tieto témy zaujímajú, sa môžu v týchto predchádzajúcich článkoch pozrieť na informácie o základných príčinách a možných riešeniach týchto problémov. Viac podrobností.
Chvostovanie píkov, predné línie píkov a štiepenie môžu byť spôsobené chemickými alebo fyzikálnymi javmi a zoznam možných riešení týchto problémov sa značne líši v závislosti od toho, či ide o chemický alebo fyzikálny problém. Porovnaním rôznych píkov v chromatograme často nájdete dôležité indície o tom, ktorý je vinníkom. Ak všetky píky v chromatograme vykazujú podobné tvary, príčina s najväčšou pravdepodobnosťou nie je fyzikálna. Ak je ovplyvnený iba jeden alebo niekoľko píkov, ale ostatné vyzerajú v poriadku, príčina je s najväčšou pravdepodobnosťou chemická.
Chemické príčiny chvostovania píkov sú príliš zložité na to, aby sme ich tu stručne rozobrali. Záujemcov o píky odkazujeme na nedávne vydanie časopisu „Riešenie problémov s LC“ pre podrobnejšiu diskusiu (10). Jednoduchým pokusom je však znížiť hmotnosť vstrekovaného analytu a zistiť, či sa tvar píku zlepší. Ak áno, je to dobrý signál, že problémom je „preťaženie hmotou“. V tomto prípade sa metóda musí obmedziť na vstrekovanie malých hmotností analytu alebo sa musia zmeniť chromatografické podmienky tak, aby sa dali dosiahnuť dobré tvary píkov aj pri vstrekovaných väčších hmotnostiach.
Existuje aj mnoho potenciálnych fyzikálnych príčin vzniku chvostov píkov. Čitateľov, ktorí majú záujem o podrobnú diskusiu o možnostiach, odkazujeme na ďalšie nedávne vydanie časopisu „Riešenie problémov s LC“ (11). Jednou z najbežnejších fyzikálnych príčin vzniku chvostov píkov je zlé spojenie v bode medzi injektorom a detektorom (12). Extrémny príklad je znázornený na obrázku 1d, ktorý som získal v mojom laboratóriu pred niekoľkými týždňami. V tomto prípade sme zostavili systém s novým vstrekovacím ventilom, ktorý sme predtým nepoužívali, a nainštalovali sme vstrekovaciu slučku s malým objemom s krúžkom, ktorý bol nalisovaný na kapiláru z nehrdzavejúcej ocele. Po niekoľkých počiatočných experimentoch s riešením problémov sme si uvedomili, že hĺbka portu v statore vstrekovacieho ventilu bola oveľa hlbšia, ako sme boli zvyknutí, čo viedlo k veľkému mŕtvemu objemu v spodnej časti portu. Tento problém sa dá ľahko vyriešiť nahradením vstrekovacej slučky inou trubicou, krúžok môžeme nastaviť do správnej polohy, aby sme eliminovali mŕtvy objem v spodnej časti portu.
Čelá píkov, ako sú tie znázornené na obrázku 1e, môžu byť tiež spôsobené fyzikálnymi alebo chemickými problémami. Bežnou fyzikálnou príčinou nábežnej hrany je, že lôžko častíc v kolóne nie je dobre zhutnené alebo že sa častice časom reorganizovali. Rovnako ako pri chvostovaní píkov spôsobenom týmto fyzikálnym javom, najlepším spôsobom, ako to vyriešiť, je vymeniť kolónu a pokračovať v práci. V podstate tvary píkov na nábežnej hrane chemického pôvodu často vznikajú z toho, čo nazývame „nelineárne“ retenčné podmienky. Za ideálnych (lineárnych) podmienok je množstvo analytu zadržaného stacionárnou fázou (teda retenčný faktor) lineárne úmerné koncentrácii analytu v kolóne. Chromatograficky to znamená, že so zvyšujúcou sa hmotnosťou analytu vstrekovaného do kolóny sa pík stáva vyšším, ale nie širším. Tento vzťah sa naruší, keď je retenčné správanie nelineárne a píky sa nielen stávajú vyššími, ale aj širšími, keď sa vstrekuje viac hmoty. Okrem toho nelineárne tvary určujú tvar chromatografických píkov, čo vedie k nábežným alebo zadným hranám. Rovnako ako pri preťažení hmotou, ktoré spôsobuje chvostovanie píkov (10), nábežanie píkov spôsobené Nelineárnu retenciu možno diagnostikovať aj znížením hmotnosti vstrekovaného analytu. Ak sa tvar píku zlepší, metóda sa musí upraviť tak, aby neprekročila kvalitu vstrekovania, ktorá spôsobuje nábežnú hranu, alebo sa musia zmeniť chromatografické podmienky, aby sa toto správanie minimalizovalo.
Niekedy pozorujeme niečo, čo sa javí ako „rozdelený“ pík, ako je znázornené na obrázku 1f. Prvým krokom pri riešení tohto problému je určiť, či je tvar píku spôsobený čiastočnou koeluciou (t. j. prítomnosťou dvoch odlišných, ale tesne eluujúcich zlúčenín). Ak v skutočnosti existujú dva rôzne analyty eluujúce blízko seba, potom ide o zlepšenie ich rozlíšenia (napríklad zvýšením selektivity, retencie alebo počtu platní) a zdanlivé „rozdelené“ píky súvisia s fyzikálnymi vlastnosťami. Výkonnosť nemá nič spoločné so samotnou kolónou. Často je najdôležitejšou indíciou pre toto rozhodnutie, či všetky píky v chromatograme vykazujú rozdelené tvary, alebo len jeden alebo dva. Ak je to len jeden alebo dva, pravdepodobne ide o problém s koeluciou; ak sú všetky píky rozdelené, pravdepodobne ide o fyzikálny problém, s najväčšou pravdepodobnosťou súvisiaci so samotnou kolónou.
Rozštiepené píky súvisiace s fyzikálnymi vlastnosťami samotnej kolóny sú zvyčajne spôsobené čiastočne zablokovanými vstupnými alebo výstupnými fritami alebo reorganizáciou častíc v kolóne, čo umožňuje mobilnej fáze prúdiť rýchlejšie ako mobilná fáza v určitých oblastiach formácie kanála kolóny v iných oblastiach (11). Čiastočne zanesenú fritu je niekedy možné odstrániť obrátením toku kolónou; podľa mojich skúseností je to však zvyčajne skôr krátkodobé ako dlhodobé riešenie. Pri moderných kolónach je to často fatálne, ak sa častice v kolóne rekombinujú. V tomto bode je najlepšie kolónu vymeniť a pokračovať.
Vrchol na obrázku 1g, tiež z nedávneho prípadu v mojom vlastnom laboratóriu, zvyčajne naznačuje, že signál je taký vysoký, že dosiahol hornú hranicu rozsahu odozvy. Pri optických absorbančných detektoroch (v tomto prípade UV-VIS), keď je koncentrácia analytu veľmi vysoká, analyt absorbuje väčšinu svetla prechádzajúceho prietokovou kyvetou detektora, pričom na detekciu zostáva len veľmi málo svetla. Za týchto podmienok je elektrický signál z fotodetektora silne ovplyvnený rôznymi zdrojmi šumu, ako je rozptýlené svetlo a „tmavý prúd“, čo spôsobuje, že signál vyzerá veľmi „rozmazane“ a je nezávislý od koncentrácie analytu. Keď sa to stane, problém sa dá často ľahko vyriešiť znížením objemu vstrekovaného analytu – znížením objemu vstrekovaného analytu, zriedením vzorky alebo oboma spôsobmi.
V škole chromatografie používame signál detektora (t. j. os y v chromatograme) ako indikátor koncentrácie analytu vo vzorke. Preto sa zdá zvláštne vidieť chromatogram so signálom pod nulou, pretože jednoduchá interpretácia je, že to naznačuje negatívnu koncentráciu analytu – čo samozrejme nie je fyzikálne možné. Podľa mojich skúseností sa negatívne píky najčastejšie pozorujú pri použití optických absorbančných detektorov (napr. UV-Vis).
V tomto prípade negatívny pík jednoducho znamená, že molekuly eluujúce z kolóny absorbujú menej svetla ako samotná mobilná fáza bezprostredne pred a po píku. Toto sa môže stať napríklad pri použití relatívne nízkych detekčných vlnových dĺžok (<230 nm) a prísad mobilnej fázy, ktoré absorbujú väčšinu svetla pri týchto vlnových dĺžkach. Takýmito prísadami môžu byť zložky rozpúšťadla mobilnej fázy, ako je metanol, alebo zložky pufrov, ako je acetát alebo mravčan. Negatívne píky je možné v skutočnosti použiť na prípravu kalibračnej krivky a získanie presných kvantitatívnych informácií, takže neexistuje žiadny zásadný dôvod, prečo sa im ako takým vyhýbať (táto metóda sa niekedy označuje ako „nepriama UV detekcia“) (13). Ak sa však chceme negatívnym píkom skutočne úplne vyhnúť, v prípade detekcie absorbancie je najlepším riešením použiť inú detekčnú vlnovú dĺžku, aby analyt absorboval viac ako mobilná fáza, alebo zmeniť zloženie mobilnej fázy tak, aby absorbovali menej svetla ako analyty.
Negatívne píky sa môžu objaviť aj pri použití detekcie indexu lomu (RI), keď sa index lomu iných zložiek ako analyt vo vzorke, ako je napríklad matrica rozpúšťadla, líši od indexu lomu mobilnej fázy. Toto sa stáva aj pri UV-VIS detekcii, ale tento efekt má tendenciu byť v porovnaní s detekciou RI zoslabený. V oboch prípadoch možno negatívne píky minimalizovať presnejším prispôsobením zloženia matrice vzorky zloženiu mobilnej fázy.
V tretej časti o základnej téme riešenia problémov s LC som rozoberal situácie, v ktorých sa pozorovaný tvar píku líši od očakávaného alebo normálneho tvaru píku. Efektívne riešenie problémov začína znalosťou očakávaných tvarov píku (na základe teórie alebo predchádzajúcich skúseností s existujúcimi metódami), takže odchýlky od týchto očakávaní sú zrejmé. Problémy s tvarom píku majú mnoho rôznych potenciálnych príčin (príliš široký, chvostovitý, nábežná hrana atď.). V tejto časti podrobne rozoberám niektoré z dôvodov, ktoré vidím najčastejšie. Znalosť týchto podrobností poskytuje dobrý východiskový bod pre začiatok riešenia problémov, ale nezahŕňa všetky možnosti. Čitatelia, ktorí majú záujem o podrobnejší zoznam príčin a riešení, sa môžu obrátiť na nástennú tabuľku LCGC „Sprievodca riešením problémov s LC“.
(4) Nástenná tabuľka „Sprievodca riešením problémov s LC“ od LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analýza dát a spracovanie signálu v chromatografii (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43 – 96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF a Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.