Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazí karusel s tromi snímkami naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúca a Nasledujúca sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
Samoorganizujúce sa nervové organely predstavujú sľubnú platformu in vitro pre modelovanie ľudského vývoja a chorôb. Organoidom však chýba konektivita, ktorá existuje in vivo, čo obmedzuje dozrievanie a bráni integrácii s inými okruhmi, ktoré riadia správanie. V tejto práci ukazujeme, že kortikálne organoidy odvodené z ľudských kmeňových buniek transplantované do somatosenzorického kortexu novorodeneckých nahých potkanov vyvíjajú zrelé bunkové typy, ktoré sa integrujú do senzorických a motivačných okruhov. MRI odhalila rast organoidov po transplantácii u niekoľkých kmeňových bunkových línií a zvierat, zatiaľ čo analýza jedného jadra odhalila progresiu kortikogenézy a vznik transkripčného programu závislého od aktivity. Transplantované kortikálne neuróny skutočne vykazujú komplexnejšie morfologické, synaptické a vnútorné membránové vlastnosti ako ich in vitro náprotivky, čo umožňuje detekciu neuronálnych defektov u pacientov s Timothyho syndrómom. Anatomické a funkčné sledovanie ukázalo, že transplantované organely prijímajú talamokortikálne a kortikokortikálne vstupy a in vivo záznamy nervovej aktivity naznačujú, že tieto vstupy môžu generovať senzorické reakcie v ľudských bunkách. Nakoniec, kortikálne organoidy rozširujú axóny po celom mozgu potkana a ich optogenetická aktivácia vedie k správaniu zameranému na odmenu. Transplantované neuróny ľudskej kôry teda dozrievajú a podieľajú sa na obvodoch hostiteľa, ktoré riadia správanie. Očakávame, že tento prístup uľahčí detekciu fenotypov na úrovni vlákien v bunkách odvodených od pacienta, ktoré nie je možné detegovať inými spôsobmi.
Vyvíjajúci sa ľudský mozog je pozoruhodný samoorganizujúci sa proces, v ktorom bunky proliferujú, diferencujú sa, migrujú a spájajú sa, čím vytvárajú funkčné neurónové obvody, ktoré sa ďalej zdokonaľujú prostredníctvom senzorických skúseností. Kľúčovým problémom v pochopení vývoja ľudského mozgu, najmä v kontexte chorôb, je nedostatočný prístup k mozgovému tkanivu. Samoorganizujúce sa organely, vrátane organoidov ľudskej kôry (hCO; tiež známych ako sféra ľudskej kôry), môžu generovať 2, 3, 4, 5, 6. Niekoľko obmedzení však obmedzuje ich širšie uplatnenie na pochopenie vývoja a fungovania neurónových obvodov. Nie je jasné, či je dozrievanie hCO obmedzené absenciou určitých mikroprostredných a senzorických vstupov prítomných in vivo. Okrem toho, pretože hCO nie sú integrované do obvodov, ktoré môžu generovať behaviorálne výsledky, ich využitie pri modelovaní geneticky zložitých a behaviorálnych neuropsychiatrických porúch je v súčasnosti obmedzené.
Transplantácia hCO do intaktného živého mozgu môže tieto obmedzenia prekonať. Predchádzajúce štúdie ukázali, že ľudské neuróny transplantované do kôry hlodavcov sú schopné prežiť, premietať a komunikovať s bunkami hlodavcov7,8,9,10,11,12. Tieto experimenty sa však zvyčajne vykonávajú na dospelých zvieratách, čo môže obmedziť synaptickú a axonálnu integráciu. V tejto práci popisujeme transplantačnú paradigmu, v ktorej sme transplantovali 3D hCO odvodený z buniek hiPS do primárnej somatosenzorickej kôry (S1) imunodeficientných potkanov v ranom štádiu plastického vývoja. Transplantované neuróny hCO (t-hCO) prechádzajú podstatným dozrievaním, prijímajú talamokortikálne a kortikálno-kortikálne vstupy, ktoré vyvolávajú senzorické reakcie, a rozširujú axonálne projekcie do mozgu potkana, aby riadili správanie zamerané na hľadanie odmeny. Predĺžené dozrievanie t-hCO odhalilo neuronálne defekty u pacientov s Timothyho syndrómom (TS), čo je závažná genetická porucha spôsobená mutáciami v napäťovo citlivom vápnikovom kanáli CaV1.2 typu L (kódovanom CACNA1C).
Na štúdium ľudských kortikálnych neurónov v obvodoch in vivo sme stereotakticky transplantovali intaktný 3D hCO do S1 skorých postnatálnych atymických potkanov (3. – 7. deň po narodení) (obr. 1a a rozšírené údaje z obr. 1a-c). V tomto bode talamokortikálne a kortikokortikálne axonálne projekcie ešte nedokončili svoju inerváciu S1 (odkaz 13). Tento prístup je preto navrhnutý tak, aby maximalizoval integráciu t-hCO a zároveň minimalizoval vplyv na endogénne obvody. Na vizualizáciu umiestnenia t-hCO u živých zvierat sme vykonali T2-vážené MRI rekonštrukcie mozgu potkanov 2 – 3 mesiace po transplantácii (obr. 1b a rozšírené údaje, obr. 1d). t-hCO2 boli ľahko pozorovateľné a objemové merania t-hCO2 boli podobné tým, ktoré boli vypočítané z fixných rezov (rozšírené údaje, obr. 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 boli ľahko pozorovateľné a objemové merania t-hCO2 boli podobné tým, ktoré boli vypočítané z fixných rezov (rozšírené údaje, obr. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанонымирным срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 boli ľahko pozorovateľné a objemové merania t-hCO2 boli podobné meraniam vypočítaným pre pevné rezy (rozšírené údaje, obr. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO легко наблюдался срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 sa ľahko pozoroval a objemové merania t-hCO2 boli podobné meraniam vypočítaným pre pevné rezy (rozšírené údaje, obr. 1d, e; P > 0,05).U 81 % transplantovaných zvierat sme stanovili t-hCO2 približne 2 mesiace po transplantácii (n = 72 zvierat; hCO2 z 10 bunkových línií hiPS; bunkové línie hiPS sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1). Z nich sa 87 % nachádzalo v mozgovej kôre (obr. 1c). Vykonaním sériových MRI vyšetrení vo viacerých časových bodoch u toho istého transplantovaného potkana sme zistili deväťnásobné zvýšenie objemu t-hCO2 v priebehu 3 mesiacov (obr. 1d a rozšírené údaje, obr. 1f). Transplantované zvieratá mali vysokú mieru prežitia (74 %) 12 mesiacov po transplantácii (rozšírené údaje, obr. 1g a doplnková tabuľka 2) a nezistili sa žiadne zjavné motorické alebo pamäťové poruchy, glióza ani elektroencefalogram (EEG). Údaje (obr. 1g a doplnková tabuľka 2). 1h–m a 3e).
a, Schéma experimentálneho dizajnu. hCO2 odvodený z buniek hiPS bol transplantovaný do S1 novonarodených nahých potkanov v 30. – 60. deň diferenciácie. b, T2-vážené koronálne a horizontálne MRI snímky zobrazujúce t-hCO2 v S1 2 mesiace po transplantácii. Mierka, 2 mm. c, Kvantifikácia úspešnosti prihojenia zobrazená pre každú bunkovú líniu hiPS (n = 108, čísla v stĺpcoch označujú množstvo t-hCO2 na bunkovú líniu hIPS) a kortikálnu alebo subkortikálnu lokalizáciu (n = 88). d, MRI snímka koronárnej artérie (vľavo; mierka, 3 mm) a zodpovedajúca 3D volumetrická rekonštrukcia (mierka, 3 mm) ukazujúca zvýšenie t-hCO2 počas 3 mesiacov. e, Prehľad vzorcov t-hCO2 v mozgovej kôre potkanov. Mierka, 1 mm. f, Reprezentatívne imunocytochemické snímky t-hCO zobrazené zľava hore doprava (počas diferenciácie): PPP1R17 (4 mesiace starý), NeuN (8 mesiacov starý), SOX9 a GFAP (8 mesiacov starý), PDGFRα; (8 mesiacov), MAP2 (8 mesiacov) a IBA1 (8 mesiacov). Mierka, 20 µm. Koexpresia HNA označuje bunky ľudského pôvodu. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimenzionality reduction imagery všetkých vysokokvalitných jadier t-hCO po Seuratovej integrácii (n=3 vzorky t-hCO, n=2 bunkové línie hiPS). Astrocyty, bunky astrocytovej línie; cyc prog, cirkulujúce progenitory; GluN DL, hlboké glutamatergické neuróny; GluN DL/SP, hlboké a sublamelárne glutamatergické neuróny; GluN UL, glutamatergické neuróny hornej vrstvy; oligodendrocyty, oligodendrocyty; OPC, progenitorové bunky oligodendrocytov; RELN, reelínové neuróny. h, Analýza obohatenia termínov Gene Ontology (GO) génov významne upregulovaných (upravené P <0,05, násobná zmena > 2, exprimovaných v najmenej 10 % jadier) v t-hCO glutamatergických neurónoch v porovnaní s hCO glutamatergickými neurónmi. h, Analýza obohatenia termínov Gene Ontology (GO) génov významne upregulovaných (upravené P <0,05, násobná zmena > 2, exprimovaných v najmenej 10 % jadier) v t-hCO glutamatergických neurónoch v porovnaní s hCO glutamatergickými neurónmi. h, Анализ обогащения терминов Génová ontológia (GO) do для генов со значительной активацнией, <скор0р5вей кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергихоненскихонергичере по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Analýza obohatenia termínov Gene Ontology (GO) pre gény s významnou aktiváciou (upravené P <0,05, násobná zmena >2, expresia v najmenej 10 % jadier) v glutamátergických neurónoch t-hCO v porovnaní s glutamátergickými neurónmi hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（莃P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10 % 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语密集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 吼 上莃弼变化 变化> 2 ， 至少 10 % 的 核中 表达） 基因 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论 (GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность измеснениятспир 2 по крайней мере в 10% ядер) v глутаматергических нейронах t-hCO по сравнегтиртирес гилут нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, gény boli signifikantne upregulované (upravené P < 0,05, násobná zmena > 2, exprimované v najmenej 10 % jadier) v t-hCO glutamátergických neurónoch v porovnaní s hCO glutamátergickými neurónmi Ontologická (GO) analýza obohacujúceho termínu.Prerušovaná čiara označuje hodnotu aq 0,05. i, UMAP zobrazenie typov buniek GluN v t-hCO2 s použitím prenosu značiek z referenčného súboru údajov o motorickej kôre dospelých 22 snRNA-seq. CT – kortikotalamické bunky, ET – extracerebrálne bunky, IT – vnútorné telencefalické bunky, NP – projekcia do blízka.
Následne sme vyhodnotili cytoarchitektúru a celkové bunkové zloženie t-hCO. Farbenie protilátok endotelových buniek potkanov odhalilo vaskularizáciu s t-hCO, zatiaľ čo farbenie IBA1 odhalilo prítomnosť mikroglií potkanov v celom štepe (obr. 1f a rozšírené údaje, obr. 3c,d). Imunofarbenie odhalilo bunky pozitívne na ľudský nukleárny antigén (HNA) koexprimujúce PPP1R17 (kortikálne progenitory), NeuN (neuróny), SOX9 a GFAP (gliové bunky) alebo PDGFRα (oligodendrocytové progenitory) (obrázok 1f). Na štúdium bunkového zloženia t-hCO s rozlíšením jednotlivých buniek sme vykonali sekvenovanie single-core RNA (snRNA-seq) po približne 8 mesiacoch diferenciácie. Hromadná filtrácia a odstránenie jadier potkanov priniesli 21 500 vysokokvalitných ľudských mononukleárnych máp (obr. 1g a rozšírené údaje, obr. 4a,b). Expresné vzory typických markerov bunkového typu identifikovali zhluky hlavných tried kortikálnych buniek vrátane hlbokých a povrchových glutamatergických neurónov, cirkulujúcich progenitorov, oligodendrocytov a astrocytovej línie (obr. 1g, rozšírené údaje, obr. 4c a doplnková tabuľka 3). Imunofarbenie na SATB2 a CTIP2 ukázalo, že napriek prítomnosti kortikálnych podtypov t-hCO nevykazoval jasnú anatomickú stratifikáciu (rozšírené údaje, obr. 3a). hCO so zhodnou scinRNA-seq produkoval v podstate podobné bunkové triedy, s niekoľkými výnimkami, vrátane absencie oligodendrocytov a prítomnosti GABAergných neurónov, čo môže odrážať predtým hlásené priaznivé podmienky in vitro pre laterálne progenitorové bunky15 (rozšírené údaje, obr. 4f – i a doplnková tabuľka 4). Analýza diferenciálnej génovej expresie odhalila významné rozdiely v glutamatergických neurónoch medzi t-hCO a hCO (doplnková tabuľka 5), ​​vrátane aktivácie súborov génov spojených s neuronálnym dozrievaním, ako je synaptická signalizácia, dendritická lokalizácia a aktivita napäťovo riadených kanálov (obrázok 1h a doplnková tabuľka 5, tabuľka 6). V súlade s tým vykazovali kortikálne glutamatergické t-hCO neuróny zrýchlené transkripčné dozrievanie.
Aby sme objasnili, či tieto transkripčné zmeny v t-hCO súviseli s morfologickými rozdielmi medzi hCO in vitro a t-hCO in vivo, rekonštruovali sme štádium zhodné s biocytínom naplnené hCO a hCO v akútnych rezoch po 7–8 mesiacoch diferenciácie. hCO neuróny (Obr. 2a). t-hCO neuróny boli významne väčšie, mali 1,5-násobný priemer somy, dvakrát toľko dendritov a celkovo šesťnásobné zvýšenie celkovej dĺžky dendritov v porovnaní s in vitro hCO (Obr. 2b). Okrem toho sme pozorovali významne vyššiu hustotu dendritických tŕňov v t-hCO neurónoch ako v hCO neurónoch (Obr. 2c). To naznačuje, že t-hCO neuróny prechádzajú rozsiahlym predlžovaním a vetvením dendritov, čo v kombinácii s pokračujúcou proliferáciou buniek môže prispievať k intenzívnemu rastu t-hCO po transplantácii (Obr. 1d a rozšírené údaje Obr. 1f). To nás viedlo k skúmaniu elektrofyziologických vlastností. Membránová kapacita bola osemkrát vyššia (rozšírené údaje, obr. 8d), membránový potenciál v pokojovom stave bol viac hyperpolarizovaný (približne 20 mV) a prúdová injekcia indukovala vyššiu maximálnu rýchlosť excitácie v neurónoch t-hCO ako v neurónoch hCO. in vitro (obr. 2d), e), čo je v súlade s väčšími a komplexnejšími morfologickými znakmi t-hCO. Okrem toho bola frekvencia spontánnych excitačných postsynaptických prúdových udalostí (EPSC) významne vyššia v neurónoch t-hCO (obr. 2f), čo naznačuje, že zvýšená hustota dendritických tŕňov pozorovaná v neurónoch t-hCO bola spojená s funkčnou excitabilitou. sexuálna synapsia. Nezrelý charakter neurónov hCO sme potvrdili in vitro zaznamenaním značených glutamatergických neurónov (rozšírené údaje, obr. 6a-c).
a, 3D rekonštrukcia neurónov hCO a t-hCO naplnených biocytínom po 8 mesiacoch diferenciácie. b, Kvantifikácia morfologických znakov (n = 8 hCO neurónov, n = 6 t-hCO neurónov; **P = 0,0084, *P = 0,0179 a ***P < 0,0001). b, Kvantifikácia morfologických znakov (n = 8 hCO neurónov, n = 6 t-hCO neurónov; **P = 0,0084, *P = 0,0179 a ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов hCO, n = 6 нейронов, P = 0, P = 0, P = 0,00% 0,0179 a *** P <0,0001). b, kvantifikácia morfologických znakov (n=8 hCO neurónov, n=6 t-hCO neurónov; **P=0,0084, *P=0,0179 a ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084 <0084，1*P*** *** 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084 <0084，1*P*** *** 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов hCO, n = 6 нейронов, P = 0, P = 0, P = 0,00% 0,0179 a *** P <0,0001). b, kvantifikácia morfologických znakov (n=8 hCO neurónov, n=6 t-hCO neurónov; **P=0,0084, *P=0,0179 a ***P<0,0001).c, 3D rekonštrukcia dendritických vetiev hCO a t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie. Červené hviezdičky označujú predpokladané dendritické tŕne. Kvantifikácia hustoty dendritických tŕňov (n = 8 neurónov hCO, n = 6 neurónov t-hCO; **P = 0,0092). d, Kvantifikácia pokojového membránového potenciálu (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). d, Kvantifikácia pokojového membránového potenciálu (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов0;***t-0нон). d, kvantifikácia pokojového membránového potenciálu (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов0;***t-0нон). d, kvantifikácia pokojového membránového potenciálu (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). e, Opakované spustenie akčného potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvyšujúcimi sa prúdovými injekciami a kvantifikácia maximálnej rýchlosti spustenia (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). e, Opakované spustenie akčného potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvyšujúcimi sa prúdovými injekciami a kvantifikácia maximálnej rýchlosti spustenia (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO a t-hCO, вызванное увеличением теное оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0). e, opätovné spustenie akčného potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvýšením prúdu a kvantifikáciou maximálnej rýchlosti spustenia (n = 25 hCO neurónov, n = 16 t-hCO neurónov; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电5 大放电5 大放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夏叼 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO a t-hCO, вызванное увелитипокание количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов;йронов;й <0,0001). e, opakované spustenie akčných potenciálov hCO a t-hCO indukovaných zvýšeným prívodom prúdu a kvantifikáciou maximálnej rýchlosti spustenia (n = 25 neurónov hCO, n = 16 neurónov t-hCO; *** P < 0,0001). f, Spontánne EPSC (sEPSC) v neurónoch hCO a t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia frekvencie synaptických udalostí (n = 25 neurónov hCO, n = 17 neurónov t-hCO; ***P < 0,0001). f, Spontánne EPSC (sEPSC) v neurónoch hCO a t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia frekvencie synaptických udalostí (n = 25 neurónov hCO, n = 17 neurónov t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) v нейронах hCO a t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колионанестневене частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001) . f, Spontánne EPSC (sEPSC) v neurónoch hCO a t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia miery synaptických udalostí (n = 25 neurónov hCO, n = 17 neurónov t-hCO; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率皖2神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSC)，以及突触及突触庋件频率皼件频率皼飏5 Koncentrácia n = 25 hCO Koncentrácia n = 25 hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) v нейронах hCO a t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колионанестневене частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001). f, Spontánne EPSC (sEPSC) v neurónoch hCO a t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia miery synaptických udalostí (n = 25 neurónov hCO, n = 17 neurónov t-hCO; *** P < 0,0001).Pre bf boli hCO a t-hCO v línii 1208-2 odobraté z tej istej diferenciačnej šarže udržiavanej paralelne. g, Analýza obohatenia génovej sady (jednostranný Fisherov exaktný test) génov významne upregulovaných (upravené P < 0,05, násobná zmena > 2, exprimovaných v najmenej 10 % jadier) v glutamatergických neurónoch t-hCO v porovnaní s glutamatergickými neurónmi hCO s génovými sadami génov závislých od aktivity skorej (ERG) aj neskorej (LRG) aktivity identifikovaných z in vivo štúdie na myšiach16 a ľudsky špecifických LRG z in vitro neurónov17. g, Analýza obohatenia génovej sady (jednostranný Fisherov exaktný test) génov významne upregulovaných (upravené P < 0,05, násobná zmena > 2, exprimovaných v najmenej 10 % jadier) v glutamatergických neurónoch t-hCO v porovnaní s glutamatergickými neurónmi hCO s génovými sadami génov závislých od aktivity skorej (ERG) aj neskorej (LRG) aktivity identifikovaných z in vivo štúdie na myšiach16 a ľudsky špecifických LRG z in vitro neurónov17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генова со зновачиет aktивацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, эksпрессия по меньшерей 0% меньшерей веньшерей глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронамионернорная раннего (ERG), tak a позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированинысна ванининых мышах in vivo16, a специфических для человека LRG a нейронов in vitro17. g, analýza obohatenia génovej sady (jednostranný Fisherov exaktný test) génov s významnou aktiváciou (upravené P < 0,05, násobná zmena > 2, expresia v najmenej 10 % jadier) v t-hCO glutamatergických neurónoch v porovnaní so súbormi hCO glutamatergických neurónov génov závislých od aktivity skorých (ERG) aj neskorých (LRG) identifikovaných u myší in vivo16 a ľudsky špecifických LRG z neurónov in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10 %的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类秉G g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 p 元 舞经 元 舞经 元<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10 % 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （宕 （宕体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因咛 囌 儺6神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированкы по сравнениютиреселутирова нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10 % Аналигаѱобной генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) a potlačené ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 a нейронах in vitro человека. g, t-hCO glutamátergické neuróny boli signifikantne nadregulované v porovnaní s hCO glutamátergickými neurónmi (upravené P < 0,05, násobná zmena > 2, najmenej 10 % analýza obohatenia génov včasnej odpovede (ERG) a neskorej odpovede (jednostranný Fisherov exaktný test) gény závislé od aktivity odpovede (LRG) identifikované u myší in vivo16 a neurónov in vitro.17 Ľudské špecifické LRG.Prerušovaná čiara označuje Bonferroniho korigovanú hodnotu P 0,05. h-1, expresia génu GluN (pseudo-balík a škálovanie každého génu) bola významne zvýšená v replikách snRNA-seq génov LRG v t-hCO glutamatergických neurónoch. i, imunofarbenie ukazujúce expresiu SCG2 v t-hCO (horný) a hCO (dolný) neurónoch. Biele šípky ukazujú na bunky SCG2+. Mierka, 25 µm. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka.
Na základe zvýšenej aktivity t-hCO pozorovanej v ex vivo rezoch, snRNA-seq odhalila od aktivity závislú zvýšenú reguláciu génových transkriptov v t-hCO v porovnaní s hCO in vitro. Glutamatergné t-hCO neuróny exprimovali vyššie hladiny génov regulujúcich aktivitu neskorej odpovede (Obr. 2g,h), ktoré boli zistené v predchádzajúcich štúdiách na myších a ľudských neurónoch16,17. Napríklad BDNF18, SCG2 a OSTN, gén regulujúci aktivitu špecifický pre primáty, vykazovali zvýšenú expresiu v t-hCO neurónoch v porovnaní s hCO neurónmi (Obr. 2g-i). t-hCO neuróny teda vykazovali zlepšené charakteristiky dozrievania v porovnaní s hCO neurónmi podľa transkripčných, morfologických a funkčných analýz.
Aby sme ďalej vyhodnotili súvislosť dozrievania t-hCO s vývojom ľudského mozgu, vykonali sme transkriptomické porovnania fetálnych a dospelých typov kortikálnych buniek19,20 a dospelých21,22, ako aj rozsiahle údaje o expresii kortikálnych génov23 počas vývoja (rozšírené údaje, obr. 5). V predchádzajúcej práci24 je globálny stav dozrievania hCO a t-hCO transkriptómu v 7 – 8 mesiacoch diferenciácie vo všeobecnosti konzistentný s časom vývoja in vivo a najviac zodpovedá neskorému fetálnemu životu (rozšírené údaje, obr. 5a). Je pozoruhodné, že sme pozorovali zvýšenú zrelosť transkriptómu v t-hCO v porovnaní s vekovo zodpovedajúcim hCO, ako aj aktiváciu transkriptómu spojenú so synaptogenézou, astrogenézou a myelinizáciou (rozšírené údaje, obr. 5b-d). Na bunkovej úrovni sme zistili dôkazy o tenšom podtype kortexu v t-hCO, pričom zhluky glutamatergických neurónov sa prekrývajú s dospelými neurónmi podtypov L2/3, L5 a L6 (obrázok 1i). Naproti tomu prekrývanie zhlukov medzi glutamatergickými t-hCO neurónmi a fetálnymi kortikálnymi neurónmi bolo v polovici tehotenstva obmedzenejšie (rozšírené údaje, Obrázok 5e-j). Aby sme zistili, či sú t-hCO neuróny funkčne podobné ľudským postnatálnym neokortikálnym neurónom, vykonali sme elektrofyziologické záznamy a anatomické rekonštrukcie ľudských pyramídových neurónov L2/3 v ostrých rezoch ľudského postnatálneho kortexu (rozšírené údaje, Obr. 7a). Elektrofyziologické vlastnosti pyramídových neurónov L2/3 boli podobné vlastnostiam pyramídových neurónov t-hCO (rozšírené údaje, Obr. 7e). Morfologicky boli neuróny L2/3 z postnatálnych ľudských vzoriek podobnejšie t-hCO ako hCO, hoci bunky L2/3 boli dlhšie, celkovo obsahovali viac vetiev a mali vyššiu hustotu tŕňov (Obr. 3g a rozšírené údaje, Obr. 7b-). G).
a, transplantácia hCO produkovaného kontrolnými a TS hiPS bunkovými líniami do novorodených potkanov. b, 3D rekonštrukcia biocytínom vyplnených t-hCO neurónov po 8 mesiacoch diferenciácie. c, kvantifikácia priemernej dĺžky dendritov (n = 19 kontrolných neurónov, n = 21 TS neurónov; **P = 0,0041). d, 3D rekonštruované dendritické vetvy z kontroly a TS t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia hustoty dendritických tŕňov (n = 16 kontrolných neurónov, n = 21 TS neurónov, ***P < 0,0001). d, 3D rekonštruované dendritické vetvy z kontroly a TS t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia hustoty dendritických tŕňov (n = 16 kontrolných neurónov, n = 21 TS neurónov, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей a контроля a TS t-hCO через 8 mesiacov количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS, n = 21 ронов <0,0001). d, 3D rekonštrukcia dendritických vetiev z kontrolných a t-hCO TS neurónov po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia hustoty dendritických tŕňov (n=16 kontrolných neurónov, n=21 TS neurónov, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =16.个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 a do 及 树突棘 密刖 z 量 6神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p < 0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля a TS t-hCO через 8 месяцев дициереня количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS, n = 21 ронов <0,0001). d, 3D rekonštrukcia kontrolných dendritických vetiev a TS t-hCO po 8 mesiacoch diferenciácie a kvantifikácia hustoty dendritických tŕňov (n = 16 kontrolných neurónov, n = 21 TS neurónov, ***P < 0,0001).Červené hviezdičky označujú predpokladané dendritické tŕne. e, spontánne EPSC v kontrolných a TS t-hCO neurónoch po 8 mesiacoch diferenciácie. f, graf kumulatívnej frekvencie a kvantifikácia frekvencie a amplitúdy synaptických udalostí (n = 32 kontrolných neurónov, n = 26 TS neurónov; **P = 0,0076 a P = 0,8102). g, Scholl analýza TS a kontrolných neurónov v hCO a t-hCO. Prerušované čiary znázorňujú ľudské L2/3 postnatálne pyramídové neuróny pre porovnanie (n = 24 kontrolných t-hCO neurónov, n = 21 TS t-hCO neurónov, n = 8 kontrolných hCO neurónov a n = 7 TS hCO neurónov). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka.
Schopnosť t-hCO replikovať morfologické a funkčné vlastnosti neurónov ľudskej kôry na vysokej úrovni nás viedla k preskúmaniu, či by sa t-hCO dal použiť na detekciu fenotypov ochorení. Zamerali sme sa na TS, závažnú neurovývojovú poruchu spôsobenú mutáciami so ziskom funkcie v géne kódujúcom CaV1.2, ktorý iniciuje transkripciu génov závislú od aktivity v neurónoch. Získali sme hCO od troch pacientov s TS s najbežnejšou substitúciou (p.G406R) a troch kontrolných skupín (obr. 3a). Po transplantácii sme zistili, že morfológia dendritov bola v neurónoch TS zmenená v porovnaní s kontrolami (obr. 3b a rozšírené údaje, obr. 8a,b), s dvojnásobným nárastom počtu primárnych dendritov a celkovým nárastom priemernej a celkovej dĺžky dendritov (obr. 3c a rozšírené údaje, obr. 8c). Toto bolo spojené so zvýšenou hustotou tŕňov a zvýšenou frekvenciou spontánnych EPSC v TS v porovnaní s kontrolnými neurónmi (obr. 3d–f a rozšírené údaje, obr. 8g). Ďalšia analýza odhalila vzorce abnormálneho dendritického vetvenia v t-hCO TS v porovnaní s kontrolami, ale nie v in vitro TS hCO v podobnom štádiu diferenciácie (Obr. 3g). To je v súlade s našimi predchádzajúcimi správami o dendritickom zmenšovaní závislom od aktivity v TS a zdôrazňuje schopnosť tejto transplantačnej platformy detegovať fenotypy ochorenia in vivo.
Následne sme sa pýtali, do akej miery sú t-hCO bunky funkčne integrované do potkanieho S1. S1 u hlodavcov prijíma silné synaptické vstupy z ipsilaterálnych ventrálnych bazálnych a zadných talamických jadier, ako aj z ipsilaterálnych motorických a sekundárnych somatosenzorických kortexov a kontralaterálneho S1 (obr. 4a). Aby sme obnovili inervačný vzorec, infikovali sme hCO vírusom besnoty-dG-GFP/AAV-G a o 3 dni neskôr sme transplantovali hCO do potkana S1. Pozorovali sme hustú expresiu GFP v neurónoch ipsilaterálneho S1 a ventrálnych bazálnych ganglií 7–14 dní po transplantácii (obr. 4b, c). Okrem toho farbenie protilátok talamického markera netrínu G1 odhalilo prítomnosť talamických zakončení v t-hCO (obr. 4d, e). Aby sme vyhodnotili, či tieto aferentné projekcie môžu vyvolať synaptické odpovede v t-hCO bunkách, vykonali sme záznamy celých buniek z ľudských buniek v ostrých rezoch talamokortikálnej vrstvy. Elektrická stimulácia potkanieho S1, vnútornej kapsuly, bielej hmoty, vlákien v blízkosti t-hCO alebo optogenetická aktivácia talamických zakončení exprimujúcich opsín v t-hCO indukovala EPSC s krátkou latenciou v neurónoch t-hCO vystavených antagonistovi AMPA receptora NBQX. (Obr. 4f, g a rozšírené údaje, Obr. 9a–g). Tieto údaje ukazujú, že t-hCO je anatomicky integrovaný do mozgu potkana a je schopný byť aktivovaný hostiteľským tkanivom potkana.
a, Schematický diagram experimentu so sledovaním besnoty. b, Expresia GFP a ľudskej špecifickej STEM121 medzi t-hCO a mozgovou kôrou potkana (horný panel). Zobrazená je aj expresia GFP v ipsilaterálnom ventrálnom bazálnom jadre (VB) potkana (vľavo dole) a ipsilaterálnom S1 (vpravo dole). Mierka, 50 µm. Červené štvorce predstavujú oblasti mozgu, kde boli snímky zhotovené. c, kvantifikácia buniek exprimujúcich GFP (n = 4 potkany). d, e — Talamické zakončenia Netrínu G1+ v t-hCO. d zobrazuje koronálny rez obsahujúci jadrá t-hCO a VB. Mierka, 2 mm. e zobrazuje expresiu Netrínu G1 a STEM121 v neurónoch t-hCO (vľavo) a VB (vpravo). Mierka, 50 µm. Oranžová bodkovaná čiara označuje hranicu t-hCO. f, g, Prúdové stopy neurónov t-hCO po elektrickej stimulácii u potkana S1 (f) alebo vnútornej kapsuly (g), s (fialová) alebo bez (čierna) NBQX (vľavo). Amplitúdy EPSC s a bez NBQX (n = 6 neurónov S1, *P = 0,0119; a n = 6 neurónov vnútornej kapsuly, **P = 0,0022) (stred). Percento neurónov t-hCO vykazujúcich EPSC v reakcii na elektrickú stimuláciu potkana S1 (f) alebo vnútornej kapsuly (g) (vpravo). aCSF, umelý mozgovomiechový mok. h, schematický diagram zobrazovacieho experimentu 2P (vľavo). Expresia GCaMP6 v t-hCO (v strede). Mierka, 100 µm. Časový odstup fluorescencie GCaMP6 (vpravo). i, Z-skóre spontánnej aktivity fluorescencie. j, schematické znázornenie stimulácie fúzov. k, z-skóre trajektórií fluorescencie 2P v jednom pokuse, zarovnané s odchýlkou ​​fúzov v čase nula (prerušovaná čiara) v príkladových bunkách. l, populačne priemerované z-skóre odpovede všetkých buniek zarovnané s odchýlkou ​​fúzov v čase nula (prerušovaná čiara) (červená) alebo náhodne generované časové pečiatky (sivá). m. Schematický diagram experimentu s optickým značením. n, Nespracované krivky napätia z príkladovej bunky t-hCO počas stimulácie modrým laserom alebo vychýlenia fúzov. Červené šípky označujú prvé hroty spôsobené svetlom (hore) alebo spôsobené vychýlením fúzov (dole). Sivé tieňovanie označuje periódy vychýlenia fúzov. o, Vrcholové svetelné krivky a odpovede vychýlenia fúzov. p, hroty jedného pokusu, zarovnané s odchýlkou ​​fúzov v bunkách príkladu. 0 označuje odchýlku fúzov (prerušovaná čiara). q, populačne priemerovaná rýchlosť streľby z-skóre pre všetky fotocitlivé bunky, zarovnaná s odchýlkou ​​fúzov v čase nula (prerušovaná čiara) (červená) alebo náhodne generované časové pečiatky (sivá). r, Podiel fotosenzitívnych jednotiek významne modulovaných odchýlkou ​​fúzov (n = 3 potkany) (vľavo). Vrcholová latencia z-skóre (n = 3 potkany; n = 5 (svetlozelená), n = 4 (tmavozelená) a n = 4 (azúrová) modulačné jednotky odchýlky fúzov na potkana) (vpravo). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka
Následne sme sa pýtali, či by t-hCO mohol byť aktivovaný senzorickými stimulmi in vivo. Potkanom S1 sme transplantovali hCO exprimujúci geneticky kódované indikátory vápnika GCaMP6. Po 150 dňoch sme vykonali vláknovú fotometriu alebo dvojfotónové zobrazovanie vápnika (obr. 4h a rozšírené údaje, obr. 10a). Zistili sme, že bunky t-hCO vykazovali synchronizovanú rytmickú aktivitu (obrázok 4i, rozšírené údaje, obrázok 10b a doplnkové video 1). Na charakterizáciu maximálnej aktivity t-hCO sme vykonali extracelulárne elektrofyziologické záznamy u anestetizovaných transplantovaných potkanov (rozšírené údaje, obr. 10c-f). Z MRI snímok sme vygenerovali stereotaktické súradnice; tieto zaznamenané jednotky teda predstavujú predpokladané ľudské neuróny, hoci samotná elektrofyziológia neumožňuje určiť druhový pôvod. Pozorovali sme synchronizované záblesky aktivity (rozšírené údaje, obr. 10d). Záblesky trvali približne 460 ms a boli oddelené obdobiami ticha približne 2 s (rozšírené údaje, obr. 10d, e). Jednotlivé jednotky vypálili v priemere približne tri výstrely na dávku, čo predstavuje približne 73 % registrovaných jednotiek na dávku. Aktivity jednotlivých jednotiek boli vysoko korelované a tieto korelácie boli vyššie ako u jednotiek identifikovaných u neočkovaných zvierat zaznamenaných za rovnakých podmienok (rozšírené údaje, obr. 10f). Pre ďalšiu charakterizáciu hrotových reakcií identifikovaných neurónov ľudského pôvodu sme vykonali experimenty so svetelným značením na anestetizovaných potkanoch transplantovaných hCO exprimujúcim svetlocitlivý katiónový kanál rodopsín 2 (hChR2), prostredníctvom ktorého t-hCO neuróny rozpoznávajú s krátkou latenciou (menej ako 10 ms) v reakcii na stimuly modrého svetla (obr. 4m–o). t-hCO neuróny vykazovali výbuchy spontánnej aktivity s frekvenciami podobnými tým, ktoré sa pozorujú pri zobrazovaní vápnikom, ako aj elektrofyziologické záznamy vykonané v t-hCO bez svetelného značenia (rozšírené údaje, obr. 10c-g). V zodpovedajúcich štádiách hCO zaznamenaných in vitro nebola pozorovaná žiadna spontánna aktivita. Aby sme zistili, či by t-hCO mohol byť aktivovaný senzorickými stimulmi, krátko sme odklonili fúzy potkana od t-hCO (obr. 4j, m a rozšírené údaje, obr. 10h, k). Podľa predchádzajúcich štúdií8,10 podskupina buniek t-hCO vykazovala zvýšenú aktivitu v reakcii na vychýlenie fúzov, čo sa nepozorovalo pri porovnaní údajov s náhodnými časovými pečiatkami (obr. 4k–q a rozšírené údaje, obr. 10h–q). V skutočnosti približne 54 % opto-značených jednotlivých jednotiek vykazovalo významne zvýšenú mieru buenia po stimulácii fúzov, ktorá dosiahla vrchol približne pri 650 ms (obr. 4r). Tieto údaje spolu naznačujú, že t-hCO prijíma vhodné funkčné vstupy a môže byť aktivovaný environmentálnymi stimulmi.
Následne sme skúmali, či t-hCO môže aktivovať obvody u potkanov na kontrolu správania. Najprv sme skúmali, či axóny neurónov t-hCO presahujú do okolitých tkanív potkana. Infikovali sme hCO lentivírusom kódujúcim hChR2 fúzovaný s EYFP (hChR2-EYFP). Po 110 dňoch sme pozorovali expresiu EYFP v ipsilaterálnych kortikálnych oblastiach vrátane sluchovej, motorickej a somatosenzorickej kôry, ako aj v subkortikálnych oblastiach vrátane striata, hipokampu a talamu (Obr. 5a). Aby sme posúdili, či tieto eferentné projekcie môžu vyvolať synaptické reakcie v bunkách potkanov, opticky sme aktivovali bunky t-hCO exprimujúce hChR2-EYFP zaznamenávaním buniek mozgovej kôry potkanov v ostrých rezoch mozgu. Aktivácia axónov t-hCO modrým svetlom indukovala krátkodobé EPSC v neurónoch pyramídovej kôry potkanov, ktoré boli blokované NBQX (Obr. 5b–g). Okrem toho, tieto reakcie mohli byť blokované tetrodotoxínom (TTX) a obnovené 4-aminopyridínom (4-AP), čo naznačuje, že boli spôsobené monosynaptickými spojeniami (Obr. 5e).
a, Schematický diagram sledovania axónov (vľavo). Expresia t-hCO EYFP (vpravo). Mierka, 100 µm. A1, sluchová kôra, ACC, predná cingulárna kôra, d. striatum, dorzálne striatum, HPC, hipokampus; Bránica, laterálna septa, mPFC, mediálna prefrontálna kôra, piri, piriformná kôra, v. striatum, ventrálne striatum, VPM, ventropostomediálne jadro talamu, VTA, ventrálna tegmentálna oblasť. Červené štvorce predstavujú oblasti mozgu, kde boli snímky nasnímané. b, Schematický diagram stimulačného experimentu. c, d, Príklady odozvy fotoprúdu indukovaného modrým svetlom (hore) a napätia (dole) v ľudských (c) EYFP+ t-hCO alebo potkaních (d) EYFP- bunkách. e, f, Aktuálne stopy neurónov potkanov po stimulácii axónov t-hCO modrým svetlom s TTX a 4-AR (zelená), TTX (sivá) alebo aCSF (čierna) (e), s (fialová) alebo bez (čierna) ) ) NBQX (e). g, latencia odpovedí vyvolaných modrým svetlom v bunkách potkanov (n = 16 buniek); vodorovné stĺpce označujú priemernú latenciu (7,13 ms) (vľavo). Amplitúda svetlom vyvolaných EPSC zaznamenaných s NBQX alebo bez neho (n = 7 buniek; ***P < 0,0001) (v strede). Amplitúda svetlom vyvolaných EPSC zaznamenaných s NBQX alebo bez neho (n = 7 buniek; ***P < 0,0001) (v strede). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***1) <0,000). Amplitúda svetlom indukovaných EPSC zaznamenaných s NBQX alebo bez neho (n = 7 buniek; ***P < 0,0001) (stred).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）　使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）　 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***1) <0,000). Amplitúda svetlom indukovaných EPSC zaznamenaných s NBQX alebo bez neho (n = 7 buniek; ***P < 0,0001) (stred).Percento potkaních buniek vykazujúcich EPSC, ktoré reagujú na modré svetlo (vpravo). h, Schematický diagram behaviorálnej úlohy. d0, deň 0. i. Výkonnosť príkladných zvierat v 1. deň (vľavo) alebo 15. deň (vpravo) tréningu. Priemerný počet olizovaní vykonaných v 1. deň (vľavo) alebo 15. deň (vpravo v strede) (n = 150 pokusov s modrým svetlom, n = 150 pokusov s červeným svetlom; ***P < 0,0001). Priemerný počet olizovaní vykonaných v 1. deň (vľavo) alebo 15. deň (vpravo v strede) (n = 150 pokusov s modrým svetlom, n = 150 pokusov s červeným svetlom; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) или день 15 (в центре 150 слева испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Priemerný počet olizovaní vykonaných v 1. deň (vľavo) alebo 15. deň (vpravo v strede) (n = 150 pokusov s modrým svetlom, n = 150 pokusov s červeným svetlom; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 n次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) или день 15 (в центре 150 слева испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Priemerný počet olizovaní vykonaných v 1. deň (vľavo) alebo 15. deň (vpravo v strede) (n = 150 pokusov s modrým svetlom, n = 150 pokusov s červeným svetlom; ***P < 0,0001).Kumulatívne olizovania pre skúšky s červeným a modrým svetlom v 1. deň (vľavo v strede) alebo v 15. deň (vpravo). NS, nevýznamné. j, k, Behaviorálne charakteristiky všetkých zvierat transplantovaných s t-hCO exprimujúcim hChR2-EYFP (j) alebo kontrolným fluoroforom (k) v 1. alebo 15. deň (hChR2-EYFP: n = 9 potkanov, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Vývoj preferenčného skóre (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Vývoj preferenčného skóre (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,000). l, Vývoj preferenčného skóre (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Vývoj preferenčných skóre (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expresia FOS ako odpoveď na optogenetickú aktiváciu t-hCO v S1. Zobrazené sú obrázky expresie FOS (vľavo) a kvantifikácie (n = 3 na skupinu; *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001) (vpravo). Zobrazené sú obrázky expresie FOS (vľavo) a kvantifikácie (n = 3 na skupinu; *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001) (vpravo). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) a количественного определения, * <0 на **, 5 Pуру <0,01 a *** P <0,001) (справа). Obrázky expresie FOS (vľavo) a kvantifikácie (n = 3 na skupinu; *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001) sú zobrazené (vpravo).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001＃倉：儾倛）倾倛显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001＃倉：儾倛）倾倛 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) a количественного определения, * <0 на **, 5 Pуру <0,01 a *** P <0,001) (справа). Obrázky expresie FOS (vľavo) a kvantifikácie (n = 3 na skupinu; *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001) sú zobrazené (vpravo).Mierka, 100 µm. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba BLA, bazolaterálnej tonzily, MDT, dorzomediálneho talamického jadra, PAG, periakveduktálnej sivej.
Nakoniec sme sa opýtali, či t-hCO môže modulovať správanie potkanov. Aby sme to otestovali, transplantovali sme hCO exprimujúci hChR2-EYFP do S1 a o 90 dní neskôr sme do t-hCO implantovali optické vlákna na dodávanie svetla. Potkany sme potom trénovali modifikovanou paradigmou operantného podmieňovania (obr. 5h). Zvieratá sme umiestnili do behaviorálnej testovacej komory a náhodne sme aplikovali 5-sekundové modré (473 nm) a červené (635 nm) laserové stimuly. Zvieratá dostali odmenu vo forme vody, ak si počas stimulácie modrým svetlom olizovali, ale počas stimulácie červeným svetlom nie. V prvý deň tréningu zvieratá nevykazovali žiadny rozdiel v olizovaní pri stimulácii modrým alebo červeným svetlom. Avšak na 15. deň zvieratá s transplantovaným hCO exprimujúcim hChR2-EYFP vykazovali aktívnejšie olizovanie pri stimulácii modrým svetlom v porovnaní so stimuláciou červeným svetlom. Tieto zmeny v správaní sa pri olizovaní neboli pozorované u kontrolných zvierat, ktorým bol transplantovaný hCO exprimujúci kontrolný fluorofor (miera úspešnosti učenia: hChR2 89 %, EYFP 0 %, obrázok 5i-1 a doplnkové video 2). Tieto údaje naznačujú, že t-hCO bunky môžu aktivovať neuróny potkanov a stimulovať správanie zamerané na hľadanie odmeny. Aby sme zistili, ktoré nervové okruhy t-hCO potkanov by mohli byť zapojené do týchto zmien správania, optogeneticky sme aktivovali t-hCO u trénovaných zvierat a o 90 minút neskôr sme odobrali tkanivá. Imunohistochémia odhalila expresiu proteínu FOS závislého od aktivity v niekoľkých oblastiach mozgu zapojených do motivovaného správania, vrátane mediálneho prefrontálneho kortexu, mediálneho talamu a periakveduktálnej sivej hmoty, ktorá bola exprimovaná buď u nestimulovaných kontrolných zvierat, alebo u zvierat. 5m). Tieto údaje spoločne naznačujú, že t-hCO môže modulovať neuronálnu aktivitu potkanov a riadiť správanie.
Neurálne organoidy predstavujú sľubný systém na štúdium ľudského vývoja a ochorení in vitro, ale sú obmedzené nedostatkom prepojení medzi okruhmi, ktoré existujú in vivo. Vyvinuli sme novú platformu, v ktorej sme transplantovali hCO do S1 imunokompromitovaných skorých postnatálnych potkanov, aby sme študovali vývoj a funkciu ľudských buniek in vivo. Ukázali sme, že t-hCO vyvíja zrelé bunkové typy, ktoré neboli pozorované in vitro28, a že t-hCO je anatomicky a funkčne integrovaný do mozgu hlodavcov. Integrácia t-hCO do nervových okruhov hlodavcov nám umožnila preukázať súvislosť medzi aktivitou ľudských buniek a správaním študovaných zvierat, čo ukazuje, že neuróny t-hCO môžu modulovať neuronálnu aktivitu potkanov a riadiť tak behaviorálne reakcie.
Platforma, ktorú popisujeme, má oproti predchádzajúcemu výskumu transplantácie ľudských buniek do mozgov hlodavcov niekoľko výhod. Po prvé, transplantovali sme hCO do vyvíjajúcej sa kôry potkanov v ranom postnatálnom štádiu, čo môže uľahčiť anatomickú a funkčnú integráciu. Po druhé, monitorovanie t-hCO2 pomocou MRI nám umožnilo študovať polohu a rast štepu u živých zvierat, čo nám umožnilo vykonávať dlhodobé štúdie na viacerých zvieratách a stanoviť spoľahlivosť niekoľkých bunkových línií hiPS. Nakoniec sme transplantovali intaktné organoidy namiesto izolovaných suspenzií jednotlivých buniek, ktoré sú menej deštruktívne pre ľudské bunky a môžu podporovať integráciu a tvorbu neurónov ľudskej kôry v mozgoch potkanov.
Uznávame, že napriek pokrokom v tejto platforme, časové, priestorové a medzidruhové obmedzenia bránia tvorbe ľudských neurónových obvodov s vysokou vernosťou, a to aj po transplantácii v ranom štádiu vývoja. Napríklad nie je jasné, či spontánna aktivita pozorovaná v t-hCO predstavuje vývojový fenotyp podobný rytmickej aktivite pozorovanej počas kortikálneho vývoja, alebo či je spôsobená absenciou supresívnych typov buniek prítomných v t-hCO. Podobne nie je jasné, do akej miery absencia laminácie v t-hCO ovplyvňuje konektivitu reťazca30. Budúca práca sa zameria na integráciu iných typov buniek, ako sú ľudské mikroglie, ľudské endotelové bunky a rôzne podiely GABAergných interneurónov, ako je ukázané pomocou zostavy 6 in vitro, ako aj na pochopenie toho, ako môže dôjsť k nervovej integrácii a spracovaniu v zmenených transkripčných, synaptických a behaviorálnych úrovniach t-hCO v bunkách získaných od pacientov.
Celkovo táto in vivo platforma predstavuje silný zdroj, ktorý môže doplniť in vitro vývoj ľudského mozgu a výskum chorôb. Očakávame, že táto platforma nám umožní objaviť nové fenotypy na úrovni vlákien v inak ťažko dostupných bunkách odvodených od pacientov a testovať nové terapeutické stratégie.
Z buniek HiPS sme vytvorili hCO2,5 podľa predtým opísaného postupu. Na iniciovanie produkcie hCO z buniek hiPS kultivovaných na výživných vrstvách boli intaktné kolónie buniek hiPS odstránené z kultivačných misiek pomocou dispázy (0,35 mg/ml) a prenesené do plastových kultúr s ultranízkou adhéziou obsahujúcich misky s kultivačným médiom pre bunky hiPS (Corning) doplneným o dva inhibítory SMAD, dorsomorfín (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) a SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) a inhibítor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Počas prvých 5 dní sa médium pre bunky hiPS denne menilo a pridával sa dorsomorfín a SB-431542. Na šiesty deň v suspenzii boli nervové sféroidy prenesené do nervového média obsahujúceho neurobazál-A (10888, Life Technologies), doplnok B-27 bez vitamínu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilín a streptomycín (1:100, Life Technologies) a doplnené epidermálnym rastovým faktorom (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a fibroblastovým rastovým faktorom 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) až do 24. dňa. Od 25. do 42. dňa bolo médium doplnené neurotrofickým faktorom odvodeným z mozgu (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a neurotrofínom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) so zmenami média každý druhý deň. Na šiesty deň v suspenzii boli nervové sféroidy prenesené do nervového média obsahujúceho neurobazál-A (10888, Life Technologies), doplnok B-27 bez vitamínu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilín a streptomycín (1:100, Life Technologies) a doplnené epidermálnym rastovým faktorom (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a fibroblastovým rastovým faktorom 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) až do 24. dňa. Od 25. do 42. dňa bolo médium doplnené neurotrofickým faktorom odvodeným z mozgu (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a neurotrofínom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) so zmenami média každý druhý deň.Na šiesty deň v suspenzii boli nervové sféroidy prenesené do nervového média obsahujúceho Neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplnok B-27 bez vitamínu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) a penicilín.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нгт/молма) R; роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) do 24-го дня. a streptomycín (1:100, Life Technologies) a doplnený epidermálnym rastovým faktorom (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) a fibroblastovým rastovým faktorom 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24. dňa.Od 25. do 42. dňa sa do média pridával neurotrofický faktor odvodený z mozgu (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a neurotrofín 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), pričom sa médium menilo každý druhý deň.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）瀁不含维生素A补充剂（12587，Life Technologies）,GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉养基中和链霉和链霉和链霉和链霉和，Life Technológie）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2：R Systémy）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神 经 球 体 转 移 含 有 含 有 的 第 第 （ 10888 ， Life Technologies Ｋ 不b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 埉 中 链頼 中 链頼， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（；20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R Systémy）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую незарой (88, Life Technologies незароs добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализовантиней: 10цтинеп: 10. Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) a факторат ростар (FGF2; 20 nг μl-1) 1; Na 6. deň boli suspenzie neurosfér prepnuté na doplnok obsahujúci neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplnok B-27 bez vitamínu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycín neutralizovaný penicilínom (1:100, Life Technologies) doplnený epidermálnym rastovým faktorom (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) a fibroblastovým rastovým faktorom 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) do 24. dňa. Systémy výskumu a vývoja) do 24. dňa.Od 25. do 42. dňa sa do kultivačného média každý druhý deň pridával neurotrofický faktor odvodený z mozgu (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a neurotrofický faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). Médium sa vymenilo raz.Od 43. dňa sa hCO2 udržiaval v nedoplnenom neurobazálnom A médiu (NM; 1088022, Thermo Fisher) s výmenou média každé 4–6 dní. Na získanie hCO2 z buniek hiPS kultivovaných v bezkŕmnych podmienkach sa bunky hiPS inkubovali s Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) pri teplote 37 °C počas 7 minút, disociovali sa na jednotlivé bunky a naniesli sa na platne AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) v hustote 3 × 106 jednotlivých buniek na jamku v médiu Essential 8 doplnenom o inhibítor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Po 24 hodinách sa médiá v jamkách pipetou preniesli hore a dole do média obsahujúceho médium Essential 6 (A1516401, Life Technologies) doplnené o dorzomorfín (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) a SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Od 2. do 6. dňa sa médium Essential 6 denne nahrádzalo dorzomorfínom a doplnkom SB-431542. Od šiesteho dňa sa suspenzie neurosfér preniesli do neurobazálneho média a udržiavali sa podľa vyššie uvedeného postupu.
Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre starostlivosť o zvieratá schválenými Správnym výborom pre starostlivosť o laboratórne zvieratá Stanfordskej univerzity (APLAC). Gravidné eutymické potkany RNU (rnu/+) boli zakúpené (Charles River Laboratories) alebo ustajnené. Zvieratá boli chované v 12-hodinovom cykle svetlo-tma s potravou a vodou ad libitum. Mláďatá nahých potkanov (FOXN1–/–) vo veku tri až sedem dní boli identifikované podľa rastu nezrelých fúzov pred utratením. Šteniatka (samce a samice) boli anestetizované 2-3 % izofluránom a umiestnené na stereotaktický rám. Bola vykonaná trepanácia lebky s priemerom približne 2-3 mm nad S1, pričom sa zachovala integrita dura mater. Potom sa pomocou ihly 30-G (približne 0,3 mm) tesne mimo kraniotomie prepichla dura mater. Potom sa na tenký parafilm s rozmermi 3 × 3 cm aplikuje HCO3 a prebytočné médium sa odstráni. Pomocou Hamiltonovej striekačky pripojenej k ihle 23 G, 45°, jemne natiahnite hCO₃ do najdistálnejšieho konca ihly. Potom nainštalujte striekačku na injekčnú pumpu pripojenú k stereotaktickému zariadeniu. Potom umiestnite hrot ihly cez predtým vytvorený 0,3 mm široký otvor v tvrdej plene (z = 0 mm) a zúžte striekačku o 1–2 mm (z = približne –1,5 mm), kým sa ihla nedostane medzi dura mater A. Nevytvorí sa husté utesnenie. Potom zdvihnite striekačku do stredu kortikálneho povrchu pri z = -0,5 mm a vstrekujte hCO₃ rýchlosťou 1 – 2 µl za minútu. Po dokončení injekcie hCO₃ sa ihla vytiahne rýchlosťou 0,2 – 0,5 mm za minútu, koža sa zašije a šteniatko sa okamžite umiestni na teplú vyhrievaciu podložku až do úplného uzdravenia. Niektorým zvieratám boli transplantované bilaterálne.
Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre starostlivosť o zvieratá schválenými Stanfordskou univerzitou APLAC. Potkany (staršie ako 60 dní po transplantácii) boli anestézované 5 % izofluránom a počas zobrazovania boli anestetizované 1 – 3 % izofluránom. Na vizualizáciu bol použitý 7 Tesla aktívne tienený horizontálny vrtný skener Bruker (Bruker Corp.) s gradientným pohonom od International Electric Company (IECO), tienená gradientová vložka s vnútorným priemerom 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) s použitím AVANCE.III, osemkanálovej viaccievkovej RF a viacjadrových funkcií a sprievodnej platformy Paravision 6.0.1. Záznam sa vykonával pomocou aktívne oddelenej volumetrickej RF cievky s vnútorným priemerom 86 mm a štvorkanálovej kryogénne chladenej RF cievky iba na príjem. Axiálny 2D Turbo-RARE (čas opakovania = 2500 ms, čas ozveny = 33 ms, 2 priemery) so 16 zachyteniami rezov, hrúbka rezu 0,6–0,8 mm, obsahujúci 256 × 256 vzoriek. Signály boli prijímané pomocou kvadratúrnej transceiverovej volumetrickej RF cievky s vnútorným priemerom 2 cm (Rapid MR International, LLC). Nakoniec boli použité vstavané funkcie odhadu povrchu Imaris (BitPlane) pre 3D vykresľovanie a objemovú analýzu. Úspešná transplantácia bola definovaná ako transplantácia, pri ktorej sa v transplantovanej hemisfére vytvorili oblasti kontinuálneho T2-váženého MRI signálu. Odmietnutie štepu bolo definované ako štep, ktorý v transplantovanej hemisfére nevytvoril oblasti kontinuálneho T2-váženého MRI signálu. Subkortikálny t-hCO3 bol z následnej analýzy vylúčený.
Na stabilnú expresiu GCaMP6 v hCO pre dvojfotónové zobrazovanie vápnika boli bunky hiPS infikované pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, po čom nasledovala selekcia antibiotík. Stručne povedané, bunky boli disociované s EDTA a suspendované v 1 ml média Essential 8 v hustote približne 300 000 buniek v prítomnosti polybrénu (5 μg/ml) a 15 μl vírusu. Bunky boli potom inkubované v suspenzii počas 60 minút a vysiate v hustote 50 000 buniek na jamku. Po konfluencii boli bunky ošetrené 5-10 μg ml-1 puromycínu počas 5-10 dní alebo kým sa neobjavili stabilné kolónie. Akútna infekcia hCO bola vykonaná podľa predchádzajúceho opisu5 s niekoľkými úpravami. Stručne povedané, hCO sa preniesol na 30.-45. deň do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek Eppendorf obsahujúcich 100 µl nervového média. Potom sa odoberie približne 90 µl média, do skúmavky sa pridá 3 – 6 µl lentivírusu s vysokým titrom (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109) a hCO3 sa na 30 minút prenesie do inkubátora. Potom sa do každej skúmavky pridá 90 – 100 µl média a skúmavky sa cez noc vráťte do inkubátora. Nasledujúci deň sa hCO3 prenesie do čerstvého nervového média v platniach s nízkou väzbou. Po 7 dňoch sa hCO3 prenesie na 24-jamkové platne so skleneným dnom na vizualizáciu a vyhodnotenie kvality infekcie. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE a pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE boli vytvorené pomocou VectorBuilderu. Lentivírus sa používa vo väčšine experimentov, pretože je integrovaný do hostiteľského genómu, čo umožňuje expresiu reportérového génu v infikovaných bunkových líniách. Na sledovanie besnoty bol hCO v 30. – 45. deň koinfikovaný vakcínou proti besnote ΔG-eGFP a AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid č. 67528, Addgene), dôkladne premytý počas 3 dní a transplantovaný do potkanov v S1 a udržiavaný in vivo počas 7 – 14 dní.
Na imunocytochémiu boli zvieratá anestetizované a transkardiálne perfundované PBS a následne 4% paraformaldehydom (PFA v PBS; Electron Microscopy Sciences). Mozgy boli fixované v 4% PFA počas 2 hodín alebo cez noc pri 4 °C, kryokonzervované v 30% sacharóze v PBS počas 48 – 72 hodín a zaliate do zmesi 1:1, 30% sacharózy:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) a koronálne rezy boli vyrobené s hrúbkou 30 µm pomocou kryostatu (Leica). Na imunohistochémiu hrubých rezov boli zvieratá perfundované PBS a mozog bol preparovaný a koronálne narezaný s hrúbkou 300 – 400 µm pomocou vibratómu (Leica) a rezy boli fixované 4% PFA počas 30 minút. Kryorezy alebo hrubé rezy boli potom premyté PBS, blokované 1 hodinu pri izbovej teplote (10 % normálne oslie sérum (NDS) a 0,3 % Triton X-100 zriedené v PBS) a blokované blokovacím roztokom pri 4 °C. – Inkubácia Kryorezy boli inkubované cez noc a hrubé rezy boli inkubované 5 dní. Primárne použité protilátky boli: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (potkan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králik, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kura, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králik, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Primárne použité protilátky boli: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (potkan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králik, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kura, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králik, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, ab104224, ab104224, ab104224, ab104224, abcam- CT2анитир. 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970 (GeneTex), натимы), анти-GFP; 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта),-Крунта), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (крол-1ик,50, , , Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEMши20и;мы:мы Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) a анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Primárne použité protilátky boli: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (potkan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králik, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kura, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774), abcam), anti-SCG2 (králik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrín G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králik, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam））抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako））,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970；GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81,abcam）））,抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore））,抗PDGFRA(兔，, 1:200；sc-338；Santa Cruz）），抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech）））抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）））Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121＠小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam））,抗GFAP（兔；1:1000；Z0334，Dako））抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔！抗1: 200；sc-338；Santa Cruz））,抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819, Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）；Netrin G1a（山羊；D60！D 1:100, R&, 1:100 Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králik, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Primárne použité protilátky boli: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (potkan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králik, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kuracie, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králik, 1:200; HPA047819, protilátka Atlas), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králik), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), а12:2и -STEM,12:2и -0; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) a (анти, 1:100) аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králik, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Rezy boli potom premyté PBS a inkubované so sekundárnou protilátkou počas 1 hodiny pri izbovej teplote (zmrazené rezy) alebo cez noc pri 4 °C (hrubé rezy). Bola použitá sekundárna protilátka Alexa Fluor (Life Technologies) zriedená 1:1000 v blokovacom roztoku. Po premytí PBS boli jadrá vizualizované pomocou Hoechst 33258 (Life Technologies). Nakoniec boli sklíčka umiestnené na mikroskop s krycími sklíčkami (Fisher Scientific) s použitím Aquamount (Polysciences) a analyzované na fluorescenčnom mikroskope Keyence (analyzátor BZ-X) alebo konfokálnom mikroskope Leica TCS SP8 (Las-X) na snímke. Snímky boli spracované pomocou programu ImageJ (Fiji). Na kvantifikáciu podielu ľudských neurónov v t-hCO a mozgovej kôre potkana boli zhotovené obdĺžnikové snímky so šírkou 387,5 μm v strede t-hCO, na okraji mozgovej kôry potkana alebo v jeho blízkosti. Okraje štepu boli stanovené posúdením zmien v priehľadnosti tkaniva, jadrách HNA+ a/alebo prítomnosti autofluorescencie tkaniva. V každom obrázku bol celkový počet buniek NeuN+ a HNA+ vydelený celkovým počtom buniek NeuN+ v rovnakej oblasti. Aby sa zabezpečilo, že sa započítajú iba bunky s jadrami v rovine obrazu, do výpočtu sú zahrnuté iba bunky, ktoré sú zároveň Hoechst+. Na zníženie štatistickej chyby boli spriemerované dva obrázky vzdialené od seba aspoň 1 mm.
Jeden týždeň pred odberom vzoriek sa zvieratá s transplantovaným hCO (približne 8 mesiacov diferenciácie) umiestnili do tmavej miestnosti s ostrihanými fúzikmi, aby sa minimalizovala senzorická stimulácia. Izolácia jadier sa uskutočnila podľa predtým opísaného postupu s niekoľkými úpravami. Stručne povedané, t-hCO a hCO boli zničené pomocou detergentno-mechanickej lýzy buniek a 2 ml skleneného tkanivového drviča (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Surové jadrá sa potom odfiltrovali pomocou 40 µm filtra a centrifugovali sa pri 320 g počas 10 minút pri 4 °C pred vykonaním gradientu hustoty sacharózy. Po kroku centrifugácie (320 g počas 20 minút pri 4 °C) sa vzorky resuspendovali v 0,04 % BSA/PBS s pridaním 0,2 jednotiek µl-1 inhibítora RNázy (40 u µl-1, AM2682, Ambion) a prefiltrovali sa cez 40 µm prietokový filter. Disociované jadrá boli potom resuspendované v PBS obsahujúcom 0,02 % BSA a nanesené na čip Chromium Single Cell 3′ (odhadovaná výťažnosť 8 000 buniek na dráhu). Knižnice snRNA-seq boli pripravené pomocou súpravy Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knižnice snRNA-seq boli pripravené pomocou súpravy Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knižnice snRNA-seq boli pripravené s použitím súpravy Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knižnica snRNA-seq bola pripravená s použitím súpravy Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Knižnice z rôznych vzoriek boli zlúčené a sekvenované pomocou systému Admera Health na NovaSeq S4 (Illumina).
Hladiny génovej expresie pre každý predpokladaný jadrový čiarový kód boli kvantifikované pomocou analytického softvérového balíka 10x Genomics CellRanger (verzia 6.1.2). Konkrétne boli namerané hodnoty porovnané s kombináciou referenčných genómov človeka (GRCh38, Ensemble, verzia 98) a potkana (Rnor_6.0, Ensemble, verzia 100) vytvorených príkazom mkref a použitím príkazu count s príkazom –include-introns=TRUE na kvantifikáciu vrátane nameraných hodnôt mapovaných na oblasti intrónov. Pre vzorky t-hCO boli ľudské jadrá identifikované na základe konzervatívnej požiadavky, aby aspoň 95 % všetkých mapovaných nameraných hodnôt zodpovedalo ľudskému genómu. Všetky následné analýzy boli vykonané na filtrovanom výstupe poľa čiarových kódov z CellRanger pomocou balíka R (verzia 4.1.2) Seurat (verzia 4.1.1)32.
Aby sa zabezpečilo, že do následnej analýzy budú zahrnuté iba jadrá vysokej kvality, pre každú vzorku bol implementovaný iteračný proces filtrovania. Najprv sa identifikujú a odstránia jadrá nízkej kvality s menej ako 1 000 nájdenými unikátnymi génmi a viac ako 20 % celkových mitochondrií. Následne bola matica počtu surových génov normalizovaná regularizovanou negatívnou binomickou regresiou s použitím funkcie sctransform(vst.flavor=”v2″), ktorá tiež identifikovala 3000 najvariabilnejších génov s použitím predvolených parametrov. Redukcia dimenzie bola vykonaná na horných variabilných génoch pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA) s predvolenými parametrami s použitím dimenzie dátovej sady 30 (dims = 30 bola zvolená na základe vizuálnej kontroly miest kolien a použitá pre všetky vzorky a analýzy súborov). Následne sme vykonali niekoľko kôl iteračného zhlukovania (rozlíšenie = 1) na klasifikáciu génov na základe abnormálne nízkeho počtu génov (medián pod 10. percentilom), abnormálne vysokého počtu mitochondriálnych génov (medián nad 95. percentilom) na identifikáciu a odstránenie predpokladaných buniek nízkej kvality, zhlukov a/alebo vysokého podielu podozrivých dvojčiat identifikovaných pomocou balíka DoubletFinder33 (priemerné skóre DoubletFinder nad 95. percentilom). Vzorky t-hCO (n=3) a vzorky hCO (n=3) boli integrované samostatne s použitím funkcie IntegrateData s vyššie uvedenými parametrami. Potom Ďalšie kolo kvalitatívneho filtrovania integrovaného súboru údajov bolo vykonané podľa vyššie uvedeného popisu.
Po odstránení nízkokvalitných jadier bol integrovaný súbor údajov zoskupený (rozlíšenie = 0,5) a vložený na účely vizualizácie UMAP34. Markerové gény pre každý klaster boli určené pomocou funkcie FindMarkers s predvolenými parametrami vypočítanými z normalizovaných údajov o génovej expresii. Hlavné bunkové triedy identifikujeme a klasifikujeme kombináciou referenčných súborov údajov z fetálnej a dospelej kôry s expresiou markerových génov 19, 20, 21, 35 a anotáciou. Cirkulujúce prekurzory boli identifikované najmä expresiou MKI67 a TOP2A. Progenitorové klastre boli definované absenciou mitotických transkriptov, vysokým prekrytím s multipotentnými gliálnymi progenitorovými klastrami opísanými v neskorej metafáze fetálnej kôry a expresiou EGFR a OLIG1. Termín astrocyt používame na zahrnutie niekoľkých stavov diferenciácie astrocytov, od neskorej radiálnej glie až po dozrievanie astrocytov. Astrocytové klastre exprimujú vysoké hladiny SLC1A3 a AQP4 a bolo preukázané, že mapujú s podtypmi fetálnej radiálnej glie a/alebo dospelých astrocytov. OPC exprimujú PDGFRA a SOX10, zatiaľ čo oligodendrocyty exprimujú myelinačné markery (MOG a MYRF). Glutamatergné neuróny boli identifikované prítomnosťou neuronálnych transkriptov (SYT1 a SNAP25), absenciou GABAergných markerov (GAD2) a expresiou NEUROD6, SLC17A7, BCL11B alebo SATB2. GluN neuróny boli ďalej rozdelené do vyšších (expresia SATB2 a strata BCL11B) a hlbokých (expresia BCL11B) podtried. Predpokladané neuróny podplatničiek (SP) exprimujú okrem hlbokých GluN markerov aj známe markery SP18, ako sú ST18 a SORCS1. Bunky podobné choroidálnemu plexu boli identifikované expresiou TTR a meningeálne bunky exprimovali gény asociované s fibroblastmi a mapovali piálne/vaskulárne bunky z referenčného súboru údajov.
Diferenciálna analýza génovej expresie medzi podtriedami t-hCO a hCO bola vykonaná pomocou novovyvinutej pseudo-dávkovej metódy reprodukovanej vo vzorkách implementovaných pomocou balíka Libra R (verzia 1.0.0). Konkrétne boli pre skupiny vykonané log-pravdepodobnostné testy edgeR (verzia 3.36.0, balík R) sčítaním počtu génov v bunkách pre danú bunkovú triedu pre každú replikáciu vzorky. Pre vizualizáciu tepelnej mapy boli normalizované hodnoty na milión (CPM) vypočítané pomocou edgeR (funkcia cpm()) a škálované (na dosiahnutie priemeru = 0, štandardnej odchýlky = 1). Bola vykonaná analýza obohatenia Gene Ontology (GO) signifikantne upregulovaných génov t-hCO GluN (hodnota P korigovaná Benjaminim-Hochbergom menšia ako 0,05 exprimovaná v najmenej 10 % buniek t-hCO GluN a násobok zmeny bol najmenej 2-násobný) pomocou balíka ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Používame aplikáciu ToppFun s predvolenými parametrami a uvádzame P-hodnoty korigované podľa Benjaminiho-Hochberga vypočítané z hypergeometrických testov anotovaných GO.
Aby sme porovnali naše zhluky snRNA-seq s anotovanými bunkovými zhlukmi z referenčných štúdií primárnej jednobunkovej RNA-seq alebo dospelých snRNA-seq19,20,21,22, použili sme prístup integrácie párových súborov údajov. Na integráciu a porovnanie prekrytí zhlukov medzi súbormi údajov sme použili normalizačný pracovný postup SCTransform (v2) v programe Seurat (s použitím rovnakých parametrov ako vyššie). Jednotlivé súbory údajov boli pre výpočtovú efektívnosť náhodne rozdelené do podmnožín až do 500 buniek alebo jadier na pôvodný klaster. Použitím podobného prístupu, ako je opísaný predtým, bolo prekrytie zhlukov definované ako podiel buniek alebo jadier v každom združenom klastri, ktoré sa prekrývali s označením referenčného klastra. Na ďalšiu klasifikáciu GluN sme použili pracovný postup TransferData v programe Seurat pre údaje o podmnožinách GluN na priradenie označení referenčných súborov údajov k našim GluN bunkám.
Na posúdenie stavu dozrievania globálneho transkriptómu vzoriek t-hCO a hCO sme porovnali naše pseudo-hromadné vzorky s programom BrainSpan/psychENCODE23, ktorý pozostáva z rozsiahlej sekvencie RNA zahŕňajúcej vývoj ľudského mozgu. Vykonali sme PCA na kombinovanej matrici génovej expresie normalizovanej na základe vzoru z kortikálnych vzoriek 10 týždňov po počatí a neskôr v 5567 génoch (spolu s našimi údajmi), ktoré boli predtým identifikované ako aktívne v kortikálnych vzorkách BrainSpan (definované ako viac ako 50 % vo vývojovej variancii vysvetlenej vekom pomocou kubického modelu)38. Okrem toho sme odvodili gény spojené s hlavnými transkriptómovými podpismi neurovývoja pomocou nenegatívnej maticovej faktorizácie, ako bolo opísané predtým. Váhy vzoriek vypočítané pomocou postupu nenegatívnej maticovej faktorizácie sú znázornené na obr. 5b s rozšírenými údajmi pre každý z piatich podpisov opísaných Zhu a kol.38. Opäť, transkripčné markery závislé od aktivity boli odvodené z predtým publikovaných štúdií. Najmä ERG a LRG boli významne nadregulované v glutamatergických neurónoch identifikovaných zberom snRNA-seq z vizuálnej kôry myši po vizuálnej stimulácii z doplnkovej tabuľky 3 Hrvatin a kol.16. LRG obohatené o človeka boli získané z kultúr ľudského fetálneho mozgu aktivovaných KCl a zozbierané 6 hodín po stimulácii a filtrované gény boli významne nadregulované u ľudí, ale nie u hlodavcov (doplnková tabuľka 4). Analýza obohatenia génových súborov pomocou týchto génových súborov bola vykonaná pomocou jednosmerného Fisherovho exaktného testu.
Potkany sa anestetizujú izofluránom, mozgy sa odoberú a umiestnia sa do studeného (približne 4 °C) okysličeného (95 % O2 a 5 % CO2) roztoku sacharózy pre rezy obsahujúce: 234 mM sacharózy, 11 mM glukózy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 a 0,5 mM CaCl2 (približne 310 mOsm). Koronálne rezy mozgu potkanov (300 – 400 µm) obsahujúce t-hCO2 sa vyrobili pomocou vibratómu Leica VT1200, ako bolo opísané predtým39. Rezy sa potom preniesli do sekčnej komory s kontinuálnou oxygenáciou pri izbovej teplote obsahujúcej aCSF pripravený z: 10 mM glukózy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 a 126 mM NaCl (298 mOsm). najmenej 45 minút pred záznamom. Rezy boli zaznamenané v ponorenej komore, kde boli kontinuálne perfundované aCSF (95 % O2 a 5 % CO2 v liekovke). Všetky údaje boli zaznamenané pri izbovej teplote. t-hCO neuróny boli ukončené pipetou z borosilikátového skla naplnenou roztokom obsahujúcim 127 mM glukonátu draselného, ​​8 mM NaCl, 4 mM ATP horčíka, 0,3 mM GTP sodného, ​​10 mM HEPES a 0,6 mM EGTA, pH 7,2, vnútorný roztok upravený KOH (290 mOsm). Na regeneráciu bol do záznamového roztoku pridaný biocytín (0,2 %).
Dáta boli získané pomocou zosilňovača MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digitalizátora Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrované dolnopriepustnou filtráciou pri 2 kHz, digitalizované pri 20 kHz a analyzované pomocou Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) a vlastných funkcií MATLABu (Mathworks). Potenciál prechodu bol vypočítaný pomocou JPCalc a vstupy boli upravené na vypočítanú hodnotu -14 mV. Operácia IV pozostáva zo série prúdových krokov v krokoch 10 – 25 pA, od -250 do 750 pA.
Talamus, biela hmota a aferentné nervy S1 boli elektricky stimulované v talamokortikálnych rezoch počas patch-clamp záznamu neurónov hCO, ako bolo opísané predtým. Stručne povedané, mozog bol umiestnený na 3D tlačiarenský stôl naklonený v uhle 10° a predná časť mozgu bola odrezaná v uhle 35°. Mozog bol potom prilepený na odrezaný povrch a narezaný, pričom sa zachovali talamokortikálne vyčnievajúce axóny. Bipolárne volfrámové elektródy (0,5 MΩ) boli namontované na druhom mikromanipulátore a strategicky umiestnené tak, aby stimulovali štyri oblasti na bunku (vnútorná kapsula, biela hmota, S1 a hCO). Zaznamenajte synaptické odpovede po fázovej stimulácii 300 µA pri frekvencii 0,03–0,1 Hz.
Neuróny hChR2 exprimujúce hCO boli aktivované pri 480 nm a svetelné impulzy generované LED diódou (Prizmatix) boli aplikované cez objektív ×40 (0,9 NA; Olympus) na zaznamenanie expresie hChR2 v blízkosti buniek. Priemer osvetleného poľa je približne 0,5 mm a celkový výkon je 10 – 20 mW. Šírka impulzu bola nastavená na 10 ms, čo zodpovedá impulzu vydávanému počas experimentu s behaviorálnym učením. Boli použité rôzne stimulačné frekvencie, od 1 do 20 Hz, ale na kvantifikáciu bol použitý iba prvý impulz zo série. Intervaly medzi sériami sú zvyčajne dlhšie ako 30 s, aby sa minimalizoval vplyv na synaptické inhibičné alebo facilitačné dráhy. Aby sme otestovali, či je odpoveď hChR2 monosynaptická, aplikovali sme do kúpeľa TTX (1 μM), kým reakcia EPSC nezmizla, a potom sme aplikovali 4-aminopyridín (4-AP; 100 μM). Odpoveď sa zvyčajne vráti v priebehu niekoľkých minút, s mierne dlhším oneskorením medzi spustením LED diódy a generovaním EPSC. Na testovanie, či je odpoveď riadená AMPA receptormi, sa použil NBQX (10 μM).
Ostré rezy hCO boli vytvorené podľa predchádzajúceho opisu. Stručne povedané, rezy hCO boli zaliate do 4% agarózy a prenesené do buniek obsahujúcich 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 a 10 mM d-(+)-glukózy. Rezy boli narezané na hrúbku 200–300 µm pri izbovej teplote pomocou vibrátora Leica VT1200 a uskladnené v ASF pri izbovej teplote. Potom bol na rezoch hCO pod priamym mikroskopom SliceScope (Scientifica) vykonaný patch-camp záznam celých buniek. Rezy boli perfundované aCSF (95% O2 a 5% CO2) a bunkové signály boli zaznamenávané pri izbovej teplote. Neuróny hCO boli aplikované pomocou borosilikátovej sklenenej pipety naplnenej roztokom obsahujúcim 127 mM glukonátu draselného, ​​8 mM NaCl, 4 mM ATP horčíka, 0,3 mM GTP sodného, ​​10 mM HEPES a 0,6 mM EGTA, vnútorné pH 7,2, upravené KOH (osmolarita 290). Na účely regenerácie sa do vnútorného roztoku pridalo 0,2 % biocytínu.
Dáta boli získané softvérom Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) s použitím zosilňovača MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digitalizátora Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrované dolnopriepustnou filtráciou pri 2 kHz, digitalizované pri 20 kHz a analyzované pomocou Clampfit (verzia 10.6) pre analýzu (Molecular Devices) a vlastných funkcií MATLABu (MATLAB 2019b, Mathworks). Potenciál spoja bol vypočítaný pomocou JPCalc a vstupy boli upravené na vypočítaný potenciál spoja -14 mV. Operácia IV pozostáva zo série prúdových krokov v krokoch 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Na morfologickú rekonštrukciu stlačených neurónov sa do vnútorného roztoku pridalo 0,2 % biocytínu (Sigma-Aldrich). Bunky sa po prerušení aktivujú aspoň 15 minút. Pipeta sa potom pomaly vťahuje 1 – 2 minúty, kým sa registrovaná membrána úplne neutesní. Po fyziologickom postupe rezov sa rezy fixovali cez noc pri 4 °C v 4 % PFA, premyli sa PBS X3 a zriedili sa v pomere 1:1000 so streptavidínom konjugovaným DyLight 549 alebo DyLight 405 (Vector Labs). Bunky naplnené biocytínom (2 %; Sigma-Aldrich) sa označili počas záznamu pomocou patch clamp pri izbovej teplote počas 2 hodín. Rezy sa potom umiestnili na mikroskopické podložné sklíčka pomocou Aquamount (Thermo Scientific) a vizualizovali sa nasledujúci deň na konfokálnom mikroskope Leica TCS SP8 s použitím olejového imerzného objektívu s numerickou apertúrou ×40 1,3, zväčšením ×0,9 – 1,0, xy. Vzorkovacia frekvencia je približne 7 pixelov na mikrón. Z-stacky v intervaloch 1 µm boli získané sériovo a na pokrytie celého dendritického stromu každého neurónu boli vykonané z-stack mozaiky a automatické spájanie založené na Leica. Neuróny boli potom sledované polomanuálne pomocou rozhrania neuTube 40 a boli vygenerované súbory SWC. Súbory boli potom nahrané do pluginu SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, verzia 2.1.0; NIH).
Ľudské kortikálne tkanivo bolo získané s informovaným súhlasom podľa protokolu schváleného Inštitucionálnou etické komisiou Stanfordskej univerzity. Dve vzorky ľudského popôrodného tkaniva (vo veku 3 a 18 rokov) boli získané resekciou frontálneho kortexu (stredný frontálny gyrus) ako súčasť chirurgického zákroku pre refraktérnu epilepsiu. Po resekcii bolo tkanivo odobraté v ľadovo studenom NMDG-aCSF obsahujúcom: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukózy, 2 mM tiomočoviny, 5 mM askorbátu sodného, ​​3 mM pyruvátu sodného, ​​0,5 mM CaCl2.4H2O a 10 mM MgSO4.7H2O. Titrujte na pH 7,3 – 7,4 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Tkanivá boli doručené do laboratória do 30 minút a koronálne rezy boli odobraté podľa vyššie opísaného postupu.
Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre starostlivosť o zvieratá schválenými Stanfordskou univerzitou APLAC. Potkany (staršie ako 140 dní po transplantácii) boli anestézované 5 % izofluránom a intraoperačne anestetizované 1 – 3 % izofluránom. Zvieratá boli umiestnené do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánne im bol injekčne podaný buprenorfín s predĺženým uvoľňovaním (SR). Lebka bola odkrytá, vyčistená a bolo do nej zavedených 3 – 5 kostných skrutiek. Na zacielenie t-hCO₂ sme z MRI snímok vygenerovali stereotaktické súradnice. V mieste záujmu bol vyvŕtaný otvor a vlákna (priemer 400 µm, NA 0,48, Doric) boli spustené 100 µm pod povrch hCO₂ a upevnené k lebke pomocou UV vytvrditeľného zubného cementu (Relyx).
Záznamy z optických vlákien sa uskutočnili podľa predtým opísaného postupu42. Na zaznamenanie spontánnej aktivity sa potkany umiestnili do čistej klietky a k implantovanému optickému káblu sa pripojil optický patch kábel (Doric) s priemerom 400 µm pripojený k systému na zber údajov z optických vlákien. Počas 10-minútového zaznamenávania motorickej aktivity mohli zvieratá voľne skúmať klietku. Na zaznamenanie evokovanej aktivity sa potkany (viac ako 140 dní po transplantácii) anestetizovali 5 % izofluránom na indukciu a 1 – 3 % izofluránom na udržiavanie. Zviera sa umiestnilo do stereotaktického rámu (Kopf) a fúzy na opačnej strane t-hCO₂ sa zastrihli na približne 2 cm a pretiahli cez sieťku pripojenú k piezoelektrickému aktuátoru (PI). K implantovanému vláknu a k systému na zber údajov sa pripojil optický patch kábel (Doric) s priemerom 400 µm. Vlákna na opačnej strane t-hCO2 boli potom 50-krát (2 mm pri 20 Hz, 2 s na prezentáciu) v náhodných časoch vychýlené piezoelektrickým pohonom počas 20-minútového záznamového obdobia. Na riadenie času vychýlenia pomocou vlastného kódu MATLAB použite balík podpory Arduino MATLAB. Udalosti sú synchronizované so softvérom na zber údajov pomocou impulzov tranzistor-tranzistorovej logiky (TTL).
Potkany (staršie ako 140 dní po transplantácii) boli anestézované 5 % izofluránom a intraoperačne anestetizované 1 – 3 % izofluránom. Zvieratá boli umiestnené do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánne im bol injekčne podaný buprenorfín SR a dexametazón. Lebka bola odkrytá, vyčistená a bolo do nej zavedených 3 – 5 kostných skrutiek. Na zacielenie t-hCO₂ sme z MRI snímok vygenerovali stereotaktické súradnice. Kruhová kraniotomia (s priemerom približne 1 cm) bola vykonaná vysokorýchlostnou vŕtačkou priamo nad transplantovaným hCO₂. Keď je kosť čo najtenšia, ale pred prevŕtaním celej kosti, pomocou klieští odstránili zostávajúci neporušený panvový disk, aby sa odhalil pod ním ležiaci t-hCO₂. Kraniotomia bola naplnená sterilným fyziologickým roztokom a k lebke bolo pomocou UV vytvrdeného zubného cementu (Relyx) pripevnené krycie sklíčko a špeciálny hlavový kolík.
Dvojfotónové zobrazovanie sa uskutočnilo pomocou multifotónového mikroskopu Bruker s objektívom Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Zobrazovanie GCaMP6 sa uskutočnilo pri 920 nm s 1,4-násobným zväčšením v jednej rovine z a 8-násobným priemerom 7,5 fps. Potkany boli indukované 5% izofluránovou anestéziou a udržiavané 1-3% izofluránom. Potkany boli umiestnené do na mieru vyrobeného hlavového upínacieho zariadenia a umiestnené pod šošovkou. Bol získaný 3-minútový záznam motorickej aktivity na pozadí. Počas 20 minút záznamu bolo pomocou pikospriceru náhodne dodaných 50 vdýchnutí (každá prezentácia s dĺžkou 100 ms) na fúzovú podložku oproti t-hCO₂. Na riadenie času dávkového snímania pomocou vlastného kódu MATLAB použite balík podpory Arduino MATLAB. Synchronizujte udalosti so softvérom na zber údajov (PrairieView 5.5) pomocou TTL impulzov. Na analýzu boli snímky korigované na pohyb xy pomocou afinnej korekcie v programe MoCo spustenom na Fidži. Extrakcia fluorescenčných stôp z jednotlivých buniek pomocou CNMF-E43. Fluorescencia bola extrahovaná pre každú oblasť záujmu, prevedená na krivky dF/F a potom prevedená na z-skóre.
Potkany (staršie ako 140 dní po transplantácii) boli anestézované 5 % izofluránom a intraoperačne anestetizované 1 – 3 % izofluránom. Zvieratá boli umiestnené do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánne im bol injekčne podaný buprenorfín SR a dexametazón. Fúzy na opačnej strane t-hCO boli odrezané na približne 2 cm a prevlečené cez sieťku pripojenú k piezoelektrickému aktuátoru. Lebka bola odkrytá a vyčistená. K lebke bola pripevnená zemniaca skrutka z nehrdzavejúcej ocele. Na zacielenie t-hCO sme z MRI snímok vygenerovali stereotaktické súradnice. Vykonajte kruhovú kraniotomiu (s priemerom približne 1 cm) pomocou vysokorýchlostnej vŕtačky tesne nad t-hCO. Keď je kosť čo najtenšia, ale pred prevŕtaním celej kosti, pomocou klieští odstráňte zostávajúci neporušený panvový disk, aby ste odhalili pod ňou ležiaci t-hCO. Jednotlivé bunky boli zaznamenávané pomocou 32-kanálových alebo 64-kanálových kremíkových sond s vysokou hustotou (Cambridge Neurotech) uzemnených na uzemňovacie skrutky a predamplifikovaných RHD zosilňovačmi (Intan). Pomocou manipulátora sa elektródy spustili do cieľového miesta cez kraniotomiu, ktorá je naplnená sterilným fyziologickým roztokom. Zber údajov sa vykonával pri frekvencii 30 kHz pomocou systému zberu údajov Open Ephys. Záznam pokračoval až vtedy, keď sme zistili vysoko korelovanú rytmickú spontánnu aktivitu vo viac ako 10 kanáloch, čo naznačuje, že elektródy sa nachádzali v štepe (na základe údajov z dvojfotónového zobrazovania vápnika). Získal sa 10-minútový záznam motorickej aktivity na pozadí. Fúzy na opačnej strane t-hCO2 boli potom 50-krát (2 mm pri 20 Hz, 2 s na prezentáciu) v náhodných časoch vychýlené piezoelektrickým pohonom počas 20 minútového záznamového obdobia. Pomocou balíka MATLAB Support Package pre Arduino (MATLAB 2019b) sa riadi čas vychýlenia pomocou vlastného kódu MATLAB. Na synchronizáciu udalostí so softvérom na zber údajov sa použili TTL impulzy.
Pre experimenty s optickým značením bol 200 µm optický patchcord (Doric) pripojený k 473 nm laseru (Omicron) pripojený k 200 µm optickému vláknu umiestnenému nad kraniotomiou. Bezprostredne pred tým bol výkon prepojky nastavený na 20 mW. Pomocou manipulátora spustite elektródy do cieľového miesta cez kraniotomiu, ktorá je naplnená sterilným fyziologickým roztokom. Na začiatku záznamu bolo emitovaných desať svetelných impulzov 473 nm (frekvencia 2 Hz, trvanie impulzu 10 ms). Fotosenzitívne bunky boli definované ako bunky, ktoré vykazovali hrotovú odozvu do 10 ms svetla v 70 % alebo viac pokusov.