Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Tekutá biopsia (LB) je koncept, ktorý si rýchlo získava na popularite v biomedicínskej oblasti. Koncept je založený najmä na detekcii fragmentov cirkulujúcej extracelulárnej DNA (ccfDNA), ktoré sa uvoľňujú prevažne ako malé fragmenty po bunkovej smrti v rôznych tkanivách. Malá časť týchto fragmentov pochádza z cudzích (cudzích) tkanív alebo organizmov. V súčasnej práci sme tento koncept aplikovali na mušle, sentinelové druhy známe svojou vysokou filtračnou kapacitou morskej vody. Využívame schopnosť mušlí pôsobiť ako prirodzené filtre na zachytávanie fragmentov environmentálnej DNA z rôznych zdrojov, aby sme poskytli informácie o biodiverzite morských pobrežných ekosystémov. Naše výsledky ukazujú, že hemolymfa mušlí obsahuje fragmenty DNA, ktorých veľkosť sa značne líši, od 1 do 5 kb. Sekvenovanie brokovnicou ukázalo, že veľké množstvo fragmentov DNA je cudzieho mikrobiálneho pôvodu. Medzi nimi sme našli fragmenty DNA z baktérií, archeí a vírusov, vrátane vírusov, o ktorých je známe, že infikujú rôznych hostiteľov bežne sa vyskytujúcich v pobrežných morských ekosystémoch. Záverom, naša štúdia dokazuje, že koncept LB aplikovaný na mušle predstavuje bohatý, ale zatiaľ nepreskúmaný zdroj poznatkov o mikrobiálnej diverzite v morských pobrežných ekosystémoch.
Vplyv klimatických zmien (CC) na biodiverzitu morských ekosystémov je rýchlo rastúcou oblasťou výskumu. Globálne otepľovanie nielenže spôsobuje významné fyziologické stresy, ale posúva aj evolučné limity tepelnej stability morských organizmov, čo ovplyvňuje biotopy mnohých druhov a núti ich hľadať priaznivejšie podmienky [1, 2]. Okrem ovplyvňovania biodiverzity mnohobunkových organizmov CC narúša krehkú rovnováhu interakcií medzi hostiteľom a mikrobiálmi. Táto mikrobiálna dysbakterióza predstavuje vážnu hrozbu pre morské ekosystémy, pretože robí morské organizmy náchylnejšími na infekčné patogény [3, 4]. Predpokladá sa, že SS zohrávajú dôležitú úlohu pri hromadných úhynoch, čo je vážny problém pre manažment globálnych morských ekosystémov [5, 6]. Toto je dôležitá otázka vzhľadom na ekonomické, ekologické a nutričné ​​vplyvy mnohých morských druhov. Platí to najmä pre lastúrniky žijúce v polárnych oblastiach, kde sú účinky CK bezprostrednejšie a závažnejšie [6, 7]. V skutočnosti sa lastúrniky, ako napríklad Mytilus spp., široko používajú na monitorovanie účinkov CC na morské ekosystémy. Nie je prekvapujúce, že na monitorovanie ich zdravia bolo vyvinutých relatívne veľké množstvo biomarkerov, často s použitím dvojstupňového prístupu zahŕňajúceho funkčné biomarkery založené na enzymatickej aktivite alebo bunkových funkciách, ako je životaschopnosť buniek a fagocytová aktivita [8]. Tieto metódy zahŕňajú aj meranie koncentrácie špecifických tlakových indikátorov, ktoré sa akumulujú v mäkkých tkanivách po absorpcii veľkého množstva morskej vody. Vysoká filtračná kapacita a polootvorený obehový systém lastúrnikov však poskytujú príležitosť na vývoj nových biomarkerov hemolymfy s využitím konceptu tekutej biopsie (LB), čo je jednoduchý a minimálne invazívny prístup k manažmentu pacientov. V ľudských vzorkách krvi [9, 10] sa hoci v ľudskej LB možno nájsť niekoľko typov cirkulujúcich molekúl, tento koncept je primárne založený na analýze sekvenovania DNA cirkulujúcich extracelulárnych fragmentov DNA (ccfDNA) v plazme. V skutočnosti je prítomnosť cirkulujúcej DNA v ľudskej plazme známa už od polovice 20. storočia [11], ale až v posledných rokoch viedol príchod vysokovýkonných sekvenčných metód ku klinickej diagnostike založenej na ccfDNA. Prítomnosť týchto cirkulujúcich fragmentov DNA je čiastočne spôsobená pasívnym uvoľnením genomickej DNA (jadrovej a mitochondriálnej) po bunkovej smrti. U zdravých jedincov je koncentrácia ccfDNA normálne nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov trpiacich rôznymi patológiami alebo vystavených stresu sa môže 5 až 10-násobne zvýšiť, čo vedie k poškodeniu tkaniva. U zdravých jedincov je koncentrácia ccfDNA normálne nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov trpiacich rôznymi patológiami alebo vystavených stresu sa môže 5 až 10-násobne zvýšiť, čo vedie k poškodeniu tkaniva. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но можетшатовыт 5 у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящеЎовер ке тканей. U zdravých ľudí je koncentrácia cccDNA normálne nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov s rôznymi patológiami alebo v stresových situáciách, ktoré vedú k poškodeniu tkaniva, sa môže zvýšiť 5–10-krát.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而寻臍椼在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病 剎 戗 担 艎 戗 或 担中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤植伤伤植损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут бытиь уне пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканию тканию Koncentrácie ccfDNA sú u zdravých jedincov zvyčajne nízke (<10 ng/ml), ale u pacientov s rôznymi patológiami alebo stresom sa môžu zvýšiť 5 až 10-násobne, čo vedie k poškodeniu tkaniva.Veľkosť fragmentov ccfDNA sa značne líši, ale zvyčajne sa pohybuje od 150 do 200 bp. [12]. Analýza vlastnej ccfDNA, t. j. ccfDNA z normálnych alebo transformovaných hostiteľských buniek, sa môže použiť na detekciu genetických a epigenetických zmien prítomných v jadrovom a/alebo mitochondriálnom genóme, čím pomáha lekárom pri výbere špecifických molekulárne cielených terapií [13]. CcfDNA sa však môže získať aj z cudzích zdrojov, ako je ccfDNA z fetálnych buniek počas tehotenstva alebo z transplantovaných orgánov [14, 15, 16, 17]. ccfDNA je tiež dôležitým zdrojom informácií na detekciu prítomnosti nukleových kyselín infekčného agensu (cudzieho), čo umožňuje neinvazívnu detekciu rozsiahlych infekcií, ktoré neboli identifikované hemokultúrami, a tým sa zabráni invazívnej biopsii infikovaného tkaniva [18]. Nedávne štúdie skutočne ukázali, že ľudská krv obsahuje bohatý zdroj informácií, ktoré sa môžu použiť na identifikáciu vírusových a bakteriálnych patogénov, a že približne 1 % ccfDNA nachádzajúcej sa v ľudskej plazme je cudzieho pôvodu [19]. Tieto štúdie ukazujú, že biodiverzitu cirkulujúceho mikrobiómu organizmu možno posúdiť pomocou analýzy ccfDNA. Donedávna sa však tento koncept používal výlučne u ľudí a v menšej miere u iných stavovcov [20, 21].
V tejto práci využívame LB potenciál na analýzu ccfDNA Aulacomya atra, južného druhu bežne sa vyskytujúceho na subantarktických Kerguelenských ostrovoch, skupine ostrovov na vrchole veľkej náhornej plošiny, ktorá vznikla pred 35 miliónmi rokov po sopečnej erupcii. Pomocou in vitro experimentálneho systému sme zistili, že fragmenty DNA v morskej vode sú rýchlo absorbované slávkami a vstupujú do hemolymfového kompartmentu. Sekvenovanie brokovnicou ukázalo, že ccfDNA hemolymfy slávok obsahuje fragmenty DNA vlastného aj cudzieho pôvodu, vrátane symbiotických baktérií a fragmentov DNA z biómov typických pre studené sopečné morské pobrežné ekosystémy. CcfDNA hemolymfy tiež obsahuje vírusové sekvencie odvodené z vírusov s rôznymi hostiteľskými rozsahmi. Našli sme tiež fragmenty DNA z mnohobunkových živočíchov, ako sú kostnaté ryby, sasanky, riasy a hmyz. Záverom možno povedať, že naša štúdia dokazuje, že koncept LB možno úspešne aplikovať na morské bezstavovce na vytvorenie bohatého genomického repertoáru v morských ekosystémoch.
Dospelé jedince (55 – 70 mm dlhé) Mytilus platensis (M. platensis) a Aulacomya atra (A. atra) boli zozbierané z prílivových skalnatých brehov Port-au-France (049°21,235 j. š., 070°13,490 v. d.) na ostrovoch Kerguelen v decembri 2018. Ostatné dospelé modré slávky (Mytilus spp.) boli získané od komerčného dodávateľa (PEI Mussel King Inc., Ostrov princa Eduarda, Kanada) a umiestnené do prevzdušnenej nádrže s kontrolovanou teplotou (4 °C) obsahujúcej 10 – 20 l umelého slaného nálevu s koncentráciou 32 ‰ (umelá morská soľ Reef Crystal, Instant Ocean, Virgínia, USA). Pre každý experiment bola meraná dĺžka a hmotnosť jednotlivých ulitníkov.
Bezplatný protokol s otvoreným prístupom pre tento program je dostupný online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Stručne povedané, LB hemolymfa bola odobratá z abduktorových svalov podľa popisu [22]. Hemolymfa bola vyčírená centrifugáciou pri 1200×g počas 3 minút, supernatant bol zmrazený (-20 °C) až do použitia. Na izoláciu a purifikáciu cfDNA boli vzorky (1,5 – 2,0 ml) rozmrazené a spracované pomocou súpravy NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) podľa pokynov výrobcu. ccfDNA bola skladovaná pri teplote -80 °C až do ďalšej analýzy. V niektorých experimentoch bola ccfDNA izolovaná a purifikovaná pomocou súpravy QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Purifikovaná DNA bola kvantifikovaná pomocou štandardného testu PicoGreen. Distribúcia fragmentov izolovanej ccfDNA bola analyzovaná kapilárnou elektroforézou s použitím bioanalyzátora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) s použitím súpravy High Sensitivity DNA Kit. Test bol vykonaný s použitím 1 µl vzorky ccfDNA podľa pokynov výrobcu.
Na sekvenovanie fragmentov ccfDNA z hemolymfy pripravila spoločnosť Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) tzv. „shotgun“ knižnice s použitím súpravy Illumina DNA Mix zo súpravy Illumina MiSeq PE75. Použil sa štandardný adaptér (BioO). Súbory s nespracovanými údajmi sú dostupné v archíve čítaní sekvencií NCBI (SRR8924808 a SRR8924809). Základná kvalita čítania bola hodnotená pomocou FastQC [23]. Na orezávanie adaptérov a čítaní nízkej kvality bol použitý program Trimmomatic [24]. Čítania „shotgun“ s párovými koncami boli pomocou FLASH zlúčené do dlhších jednotlivých čítaní s minimálnym prekrytím 20 bp, aby sa predišlo nezhodám [25]. Zlúčené čítania boli anotované pomocou BLASTN s použitím databázy taxonómie NCBI pre lastúrniky (hodnota e < 1e−3 a 90 % homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou bolo vykonané pomocou DUST [26]. Zlúčené čítania boli anotované pomocou BLASTN s použitím databázy taxonómie NCBI pre lastúrniky (hodnota e < 1e−3 a 90 % homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou bolo vykonané pomocou DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием баззы даннованы двустворчатых моллюсков NCBI (значение < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовейтолед низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Združené čítania boli anotované pomocou BLASTN s použitím databázy taxonómie lastúrnikov NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90 % homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou bolo vykonané pomocou DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并稔合并稔合并的读涰 的读6数 的读6涰的读6进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读敹 ！ 读敹 ！进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩莔 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩莔 莩掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованией таксономичесономич данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 a 90 % гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Združené čítania boli anotované pomocou BLASTN s použitím taxonomickej databázy lastúrnikov NCBI (hodnota e <1e-3 a 90 % homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou bolo vykonané pomocou DUST [26].Čítania boli rozdelené do dvoch skupín: súvisiace so sekvenciami lastúrnikov (tu nazývané samočítania) a nesúvisiace (ne-samočítania). Dve skupiny boli samostatne zostavené pomocou MEGAHIT na generovanie kontigov [27]. Medzitým bolo taxonomické rozloženie čítaní cudzích mikrobiómov klasifikované pomocou Kraken2 [28] a graficky znázornené pomocou koláčového grafu Krona na Galaxy [29, 30]. Optimálne kmery boli na základe našich predbežných experimentov určené ako kmery-59. Samostatné kontigy boli potom identifikované zarovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homológia) pre konečnú anotáciu. Samostatné kontigy boli potom identifikované zarovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homológia) pre konečnú anotáciu. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база Ѕаннный двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60%) для окончательниой окончательниой Samostatné kontigy boli potom identifikované porovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia) pre konečnú anotáciu.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотацвимесиотацвим пиотацимеиотацимеионные BLASTN (predtým NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 a гомология 60%). Samostatné kontigy boli potom identifikované pre finálnu anotáciu porovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia). Súbežne boli kontigy nevlastných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homológia). Súbežne boli kontigy nevlastných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homológia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (базыхnt дантины значение e <1e-10 a гомология 60%). Súbežne boli kontigy zahraničných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza NT NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠组重叠组重叠组重参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠组重叠组重叠组重参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помой данных nt NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60%). Súbežne boli kontigy nevlastných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia). BLASTX sa uskutočnil aj na nevlastných kontigoch s použitím databáz nr a RefSeq proteínov NCBI (hodnota e < 1e−10 a 60% homológia). BLASTX sa uskutočnil aj na nevlastných kontigoch s použitím databáz nr a RefSeq proteínov NCBI (hodnota e < 1e−10 a 60% homológia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данне данне (значение e <1e-10 a гомология 60%). BLASTX sa vykonal aj na ne-vlastných kontigoch s použitím proteínových databáz nr a RefSeq NCBI (hodnota e < 1e-10 a 60 % homológia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данелых баз данелых n. (значение e <1e-10 a гомология 60%). BLASTX sa vykonal aj na ne-vlastných kontigoch s použitím proteínových databáz nr a RefSeq NCBI (hodnota e <1e-10 a 60% homológia).Skupiny BLASTN a BLASTX, ktoré nie sú vlastné kontigy, predstavujú konečné kontigy (pozri doplnkový súbor).
Priméry použité pre PCR sú uvedené v tabuľke S1. Na amplifikáciu cieľových génov ccfDNA bola použitá Taq DNA polymeráza (Bio Basic Canada, Markham, ON). Boli použité nasledujúce reakčné podmienky: denaturácia pri 95 °C počas 3 minút, 95 °C počas 1 minúty, nastavená teplota žíhania počas 1 minúty, elongácia pri 72 °C počas 1 minúty, 35 cyklov a nakoniec 72 °C počas 10 minút. . PCR produkty boli separované elektroforézou na agarózových géloch (1,5 %) obsahujúcich SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pri 95 V.
Slávky (Mytilus spp.) boli aklimatizované v 500 ml okysličenej morskej vody (32 PSU) počas 24 hodín pri teplote 4 °C. Plazmidová DNA obsahujúca inzert kódujúci sekvenciu cDNA ľudského galektínu-7 (prístupové číslo NCBI L07769) bola pridaná do liekovky v konečnej koncentrácii 190 μg/μl. Slávky inkubované za rovnakých podmienok bez pridania DNA slúžili ako kontrola. Tretia kontrolná nádrž obsahovala DNA bez slávok. Na monitorovanie kvality DNA v morskej vode boli z každej nádrže v uvedenom čase odobraté vzorky morskej vody (20 μl; tri opakovania). Pre sledovateľnosť plazmidovej DNA boli slávky LB zozbierané v uvedených časoch a analyzované pomocou qPCR a ddPCR. Vzhľadom na vysoký obsah soli v morskej vode boli alikvotné podiely pred všetkými PCR testami zriedené vo vode kvality PCR (1:10).
Digitálna kvapková PCR (ddPCR) sa uskutočnila s použitím protokolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Na určenie optimálnej teploty použite teplotný profil (Tabuľka S1). Kvapky sa generovali pomocou generátora kvapiek QX200 (BioRad). ddPCR sa uskutočnila nasledovne: 95 °C počas 5 minút, 50 cyklov pri 95 °C počas 30 sekúnd a danej teplote žíhania počas 1 minúty a 72 °C počas 30 sekúnd, 4 °C počas 5 minút a 90 °C do 5 minút. Počet kvapiek a pozitívnych reakcií (počet kópií/µl) sa merali pomocou čítačky kvapiek QX200 (BioRad). Vzorky s menej ako 10 000 kvapkami boli zamietnuté. Kontrola vzoru sa nevykonávala pri každom spustení ddPCR.
qPCR sa uskutočnila s použitím Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) a špecifických primerov LGALS7. Všetky kvantitatívne PCR sa uskutočnili v 20 µl s použitím súpravy QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR sa začala 15-minútovou inkubáciou pri 95 °C, po ktorej nasledovalo 40 cyklov pri 95 °C počas 10 sekúnd a pri 60 °C počas 60 sekúnd s jedným zberom údajov. Krivky topenia sa vytvorili pomocou postupných meraní pri 95 °C počas 5 sekúnd, 65 °C počas 60 sekúnd a 97 °C na konci qPCR. Každá qPCR sa uskutočnila v troch opakovaniach, s výnimkou kontrolných vzoriek.
Keďže slávky sú známe svojou vysokou rýchlosťou filtrácie, najprv sme skúmali, či dokážu filtrovať a zadržiavať fragmenty DNA prítomné v morskej vode. Zaujímalo nás tiež, či sa tieto fragmenty akumulujú v ich polootvorenom lymfatickom systéme. Túto otázku sme experimentálne vyriešili sledovaním osudu rozpustných fragmentov DNA pridaných do nádrží s modrými slávkami. Na uľahčenie sledovania fragmentov DNA sme použili cudziu (nie vlastnú) plazmidovú DNA obsahujúcu ľudský gén galektínu-7. ddPCR sleduje fragmenty plazmidovej DNA v morskej vode a slávkach. Naše výsledky ukazujú, že ak množstvo fragmentov DNA v morskej vode zostalo v neprítomnosti slávok relatívne konštantné v priebehu času (až 7 dní), potom v prítomnosti slávok táto hladina takmer úplne zmizla do 8 hodín (obr. 1a,b). Fragmenty exogénnej DNA boli ľahko detegovateľné do 15 minút v intravalvulárnej tekutine a hemolymfe (obr. 1c). Tieto fragmenty bolo možné detegovať až 4 hodiny po expozícii. Táto filtračná aktivita vzhľadom na fragmenty DNA je porovnateľná s filtračnou aktivitou baktérií a rias [31]. Tieto výsledky naznačujú, že mušle dokážu filtrovať a akumulovať cudziu DNA vo svojich tekutých kompartmentoch.
Relatívne koncentrácie plazmidovej DNA v morskej vode v prítomnosti (A) alebo neprítomnosti (B) slávok, merané pomocou ddPCR. V A sú výsledky vyjadrené v percentách, pričom okraje políčok predstavujú 75. a 25. percentil. Prispôsobená logaritmická krivka je zobrazená červenou farbou a plocha vytieňovaná sivou farbou predstavuje 95 % interval spoľahlivosti. V B červená čiara predstavuje priemer a modrá čiara predstavuje 95 % interval spoľahlivosti pre koncentráciu. C Akumulácia plazmidovej DNA v hemolymfe a chlopňovej tekutine slávok v rôznych časoch po pridaní plazmidovej DNA. Výsledky sú prezentované ako absolútny počet detekovaných kópií/ml (±SE).
Ďalej sme skúmali pôvod ccfDNA v slávkach zozbieraných z porastov slávok na ostrovoch Kerguelen, odľahlej skupine ostrovov s obmedzeným antropogénnym vplyvom. Na tento účel bola cccDNA z hemolymf slávok izolovaná a purifikovaná metódami bežne používanými na purifikáciu ľudskej cccDNA [32, 33]. Zistili sme, že priemerné koncentrácie ccfDNA v hemolymfe slávok sú v rozsahu nízkych mikrogramov na ml hemolymfy (pozri tabuľku S2, Doplňujúce informácie). Tento rozsah koncentrácií je oveľa väčší ako u zdravých ľudí (nízke nanogramy na mililiter), ale v zriedkavých prípadoch u pacientov s rakovinou môže hladina ccfDNA dosiahnuť niekoľko mikrogramov na mililiter [34, 35]. Analýza distribúcie veľkosti ccfDNA v hemolymfe ukázala, že tieto fragmenty sa značne líšia veľkosťou, od 1000 bp do 1000 bp až po 5000 bp (obr. 2). Podobné výsledky sa dosiahli použitím súpravy QIAamp Investigator Kit na báze oxidu kremičitého, čo je metóda bežne používaná vo forenznej vede na rýchlu izoláciu a purifikáciu genomickej DNA zo vzoriek DNA s nízkou koncentráciou vrátane ccfDNA [36].
Reprezentatívny elektroforegram ccfDNA hemolymfy slávok. Extrahované pomocou súpravy NucleoSnap Plasma Kit (hore) a súpravy QIAamp DNA Investigator Kit. B Violin graf znázorňujúci distribúciu koncentrácií ccfDNA hemolymfy (±SE) v slávkach. Čierna a červená čiara predstavujú medián a prvý a tretí kvartil.
Približne 1 % ccfDNA u ľudí a primátov má cudzí zdroj [21, 37]. Vzhľadom na polootvorený obehový systém lastúrnikov, morskú vodu bohatú na mikróby a distribúciu veľkosti ccfDNA slávok sme predpokladali, že ccfDNA hemolymfy slávok môže obsahovať bohatý a rozmanitý súbor mikrobiálnej DNA. Na overenie tejto hypotézy sme sekvenovali ccfDNA hemolymfy zo vzoriek Aulacomya atra odobratých z Kerguelenských ostrovov, čo viedlo k viac ako 10 miliónom odčítaní, z ktorých 97,6 % prešlo kontrolou kvality. Odčítania boli potom klasifikované podľa vlastných a cudzích zdrojov pomocou databáz lastúrnikov BLASTN a NCBI (obr. S1, Doplňujúce informácie).
U ľudí sa do krvného obehu môže uvoľňovať jadrová aj mitochondriálna DNA [38]. V tejto štúdii však nebolo možné podrobne opísať jadrovú genomickú DNA slávok, keďže genóm A. atra nebol sekvenovaný ani opísaný. Pomocou knižnice lastúrnikov sme však dokázali identifikovať niekoľko fragmentov ccfDNA nášho vlastného pôvodu (obr. S2, Doplňujúce informácie). Prítomnosť fragmentov DNA nášho vlastného pôvodu sme tiež potvrdili riadenou PCR amplifikáciou tých génov A. atra, ktoré boli sekvenované (obr. 3). Podobne, vzhľadom na to, že mitochondriálny genóm A. atra je dostupný vo verejných databázach, možno nájsť dôkazy o prítomnosti mitochondriálnych fragmentov ccfDNA v hemolymfe A. atra. Prítomnosť fragmentov mitochondriálnej DNA bola potvrdená PCR amplifikáciou (obr. 3).
V hemolymfe A. atra (červené bodky – skladové číslo: SRX5705969) a M. platensis (modré bodky – skladové číslo: SRX5705968) amplifikovanej pomocou PCR boli prítomné rôzne mitochondriálne gény. Obrázok adaptovaný z Breton et al., 2011 B Amplifikácia supernatantu hemolymfy z A. atra Uskladnené na papieri FTA. Na priame pridanie do PCR skúmavky obsahujúcej PCR zmes použite 3 mm dierovač.
Vzhľadom na bohatý mikrobiálny obsah v morskej vode sme sa spočiatku zamerali na charakterizáciu mikrobiálnych DNA sekvencií v hemolymfe. Na tento účel sme použili dve rôzne stratégie. Prvá stratégia použila Kraken2, algoritmický program na klasifikáciu sekvencií, ktorý dokáže identifikovať mikrobiálne sekvencie s presnosťou porovnateľnou s BLAST a inými nástrojmi [28]. Bolo zistených viac ako 6719 čítaní bakteriálneho pôvodu, zatiaľ čo 124 a 64 pochádzalo z archeí a vírusov (obr. 4). Najpočetnejšie bakteriálne fragmenty DNA boli Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) a Bacteroidetes (17 %) (obr. 4a). Toto rozdelenie je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami mikrobiómu morskej modrej slávky [39, 40]. Gammaproteobacteria boli hlavnou triedou Proteobacteria (44 %), vrátane mnohých Vibrionales (obr. 4b). Metóda ddPCR potvrdila prítomnosť fragmentov DNA Vibrio v ccfDNA hemolymfy A. atra (obr. 4c) [41]. Na získanie ďalších informácií o bakteriálnom pôvode ccfDNA bol použitý ďalší prístup (obr. S2, Doplňujúce informácie). V tomto prípade boli prekrývajúce sa čítania zostavené ako čítania s párovými koncami a boli klasifikované ako vlastné (lastúrniky) alebo nevlastného pôvodu pomocou BLASTN a hodnoty e 1e−3 a hraničnej hodnoty s homológiou > 90 %. V tomto prípade boli prekrývajúce sa čítania zostavené ako čítania s párovými koncami a boli klasifikované ako vlastné (lastúrniky) alebo nevlastného pôvodu pomocou BLASTN a hodnoty e 1e−3 a hraničnej hodnoty s homológiou > 90 %. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными конибибими классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхиожден использованием BLASTN a значения e 1e-3 a отсечения с гомологией> 90%. V tomto prípade boli prekrývajúce sa čítania zozbierané ako párové čítania a boli klasifikované ako natívne (lastúrniky) alebo neoriginálne pomocou BLASTN a hodnoty e 1e-3 a hraničnej hodnoty s >90% homológiou.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 嚄e > 值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使和3 blast值 和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными конигриманимия как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с исповель значений e BLASTN a 1e-3 a порога гомологии> 90%. V tomto prípade boli prekrývajúce sa čítania zozbierané ako párové čítania a klasifikované ako vlastné (lastúrniky) alebo neoriginálne pomocou hodnôt e BLASTN a 1e-3 ​​a prahu homológie > 90%.Keďže genóm A. atra ešte nebol sekvenovaný, použili sme stratégiu de novo zostavovania zostavovača MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Celkovo bolo identifikovaných 147 188 kontigov ako závislých (lastúrnikov) pôvodu. Tieto kontigy boli následne rozložené s e-hodnotami 1e-10 pomocou BLASTN a BLASTX. Táto stratégia nám umožnila identifikovať 482 fragmentov, ktoré nie sú lastúrniky, prítomných v ccfDNA A. atra. Viac ako polovica (57 %) týchto fragmentov DNA bola získaná z baktérií, najmä zo žiabrových symbiontov vrátane sulfotrofných symbiontov a zo žiabrových symbiontov Solemya velum (Obr. 5).
Relatívna abundancia na úrovni typu. B Mikrobiálna diverzita dvoch hlavných kmeňov (Firmicutes a Proteobacteria). Reprezentatívna amplifikácia ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenty génu 16S rRNA (modré) v troch atra hemolymfách.
Celkovo bolo analyzovaných 482 zozbieraných kontigov. Všeobecný profil taxonomického rozloženia metagenomických kontigových anotácií (prokaryoty a eukaryoty). B Podrobné rozloženie bakteriálnych fragmentov DNA identifikovaných pomocou BLASTN a BLASTX.
Analýza Kraken2 tiež ukázala, že ccfDNA slávok obsahovala fragmenty archaeálnej DNA, vrátane fragmentov DNA druhov Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) a Thaurmarcheota (11 %) (obr. 6a). Prítomnosť fragmentov DNA odvodených z druhov Euryarchaeota a Crenarchaeota, ktoré sa predtým nachádzali v mikrobiálnej komunite kalifornských slávok, by nemala byť prekvapením [42]. Hoci sa Euryarchaeota často spája s extrémnymi podmienkami, v súčasnosti sa uznáva, že Euryarchaeota aj Crenarcheota patria medzi najbežnejšie prokaryoty v morskom kryogénnom prostredí [43, 44]. Prítomnosť metanogénnych mikroorganizmov v slávkach nie je prekvapujúca vzhľadom na nedávne správy o rozsiahlych únikoch metánu z únikov na dne na Kerguelenskej plošine [45] a možnú mikrobiálnu produkciu metánu pozorovanú pri pobreží Kerguelenských ostrovov [46].
Naša pozornosť sa potom presunula na údaje z DNA vírusov. Podľa našich najlepších vedomostí ide o prvú mimocieľovú štúdiu obsahu vírusov v slávkach. Ako sme očakávali, našli sme fragmenty DNA bakteriofágov (Caudovirales) (obr. 6b). Najbežnejšia vírusová DNA však pochádza z kmeňa nukleocytovírusov, známeho aj ako veľký nukleárny cytoplazmatický DNA vírus (NCLDV), ktorý má najväčší genóm zo všetkých vírusov. V rámci tohto kmeňa patrí väčšina sekvencií DNA do čeľadí Mimimidoviridae (58 %) a Poxviridae (21 %), ktorých prirodzenými hostiteľmi sú stavovce a článkonožce, zatiaľ čo malá časť týchto sekvencií DNA patrí známym virologickým riasam. Infikuje morské eukaryotické riasy. Sekvencie boli získané aj z vírusu Pandora, obrovského vírusu s najväčšou veľkosťou genómu zo všetkých známych vírusových rodov. Je zaujímavé, že rozsah hostiteľov, o ktorých je známe, že sú infikovaní vírusom, ako bolo určené sekvenovaním ccfDNA hemolymfy, bol relatívne veľký (obrázok S3, Doplňujúce informácie). Zahŕňa vírusy, ktoré infikujú hmyz, ako sú Baculoviridae a Iridoviridae, ako aj vírusy, ktoré infikujú améby, riasy a stavovce. Našli sme tiež sekvencie zodpovedajúce genómu Pithovirus sibericum. Pitovírusy (známe aj ako „zombie vírusy“) boli prvýkrát izolované z 30 000 rokov starého permafrostu na Sibíri [47]. Naše výsledky sú teda v súlade s predchádzajúcimi správami, ktoré ukazujú, že nie všetky moderné druhy týchto vírusov vyhynuli [48] a že tieto vírusy môžu byť prítomné v odľahlých subarktických morských ekosystémoch.
Nakoniec sme otestovali, či dokážeme nájsť fragmenty DNA z iných mnohobunkových živočíchov. Celkovo sme pomocou BLASTN a BLASTX s knižnicami nt, nr a RefSeq (genomickými a proteínovými) identifikovali 482 cudzích kontigov. Naše výsledky ukazujú, že medzi cudzími fragmentmi ccfDNA mnohobunkových živočíchov prevláda DNA kostí (obr. 5). Našli sa aj fragmenty DNA z hmyzu a iných druhov. Relatívne veľká časť fragmentov DNA nebola identifikovaná, pravdepodobne kvôli nedostatočnému zastúpeniu veľkého počtu morských druhov v genomických databázach v porovnaní so suchozemskými druhmi [49].
V tejto práci aplikujeme koncept LB na slávky a tvrdíme, že sekvenovanie ccfDNA z hemolymfy môže poskytnúť prehľad o zložení morských pobrežných ekosystémov. Zistili sme najmä, že 1) hemolymfa slávky obsahuje relatívne vysoké koncentrácie (mikrogramové hladiny) relatívne veľkých (~1-5 kb) cirkulujúcich fragmentov DNA; 2) tieto fragmenty DNA sú nezávislé aj nezávislé; 3) Medzi cudzími zdrojmi týchto fragmentov DNA sme našli bakteriálnu, archaeálnu a vírusovú DNA, ako aj DNA iných mnohobunkových živočíchov; 4) Akumulácia týchto cudzích fragmentov ccfDNA v hemolymfe prebieha rýchlo a prispieva k vnútornej filtračnej aktivite slávok. Záverom naša štúdia dokazuje, že koncept LB, ktorý sa doteraz uplatňoval najmä v oblasti biomedicíny, kóduje bohatý, ale nepreskúmaný zdroj poznatkov, ktorý možno využiť na lepšie pochopenie interakcie medzi sentinelovými druhmi a ich prostredím.
Okrem primátov bola izolácia ccfDNA hlásená aj u cicavcov vrátane myší, psov, mačiek a koní [50, 51, 52]. Podľa našich vedomostí je však naša štúdia prvou, ktorá uvádza detekciu a sekvenovanie ccfDNA u morských druhov s otvoreným obehovým systémom. Táto anatomická vlastnosť a filtračná schopnosť slávok môže aspoň čiastočne vysvetliť odlišné veľkostné charakteristiky cirkulujúcich fragmentov DNA v porovnaní s inými druhmi. U ľudí je väčšina fragmentov DNA cirkulujúcich v krvi malé fragmenty s veľkosťou od 150 do 200 bp s maximálnym vrcholom 167 bp [34, 53]. Malá, ale významná časť fragmentov DNA má veľkosť medzi 300 a 500 bp a približne 5 % je dlhších ako 900 bp [54]. Dôvodom tohto rozdelenia veľkosti je, že hlavným zdrojom ccfDNA v plazme je bunková smrť, buď v dôsledku bunkovej smrti, alebo v dôsledku nekrózy cirkulujúcich hematopoetických buniek u zdravých jedincov, alebo v dôsledku apoptózy nádorových buniek u pacientov s rakovinou (známa ako cirkulujúca nádorová DNA). , ctDNA). Rozloženie veľkosti ccfDNA hemolymfy, ktoré sme našli v mušliach, sa pohybovalo od 1000 do 5000 bp, čo naznačuje, že ccfDNA mušlí má iný pôvod. Toto je logická hypotéza, pretože mušle majú polootvorený cievny systém a žijú v morskom vodnom prostredí obsahujúcom vysoké koncentrácie mikrobiálnej genomickej DNA. Naše laboratórne experimenty s použitím exogénnej DNA v skutočnosti ukázali, že mušle akumulujú fragmenty DNA v morskej vode, pričom po niekoľkých hodinách sú po bunkovom príjme degradované a/alebo uvoľnené a/alebo uskladnené v rôznych organizmoch. Vzhľadom na vzácnosť buniek (prokaryotických aj eukaryotických), použitie intravalvulárnych kompartmentov zníži množstvo ccfDNA z vlastných zdrojov, ako aj z cudzích zdrojov. Vzhľadom na dôležitosť vrodenej imunity lastúrnikov a veľký počet cirkulujúcich fagocytov sme ďalej predpokladali, že aj cudzia ccfDNA je obohatená v cirkulujúcich fagocytoch, ktoré akumulujú cudziu DNA po požití mikroorganizmov a/alebo bunkových zvyškov. Naše výsledky spoločne ukazujú, že ccfDNA hemolymfy lastúrnikov je jedinečným úložiskom molekulárnych informácií a posilňuje ich status sentinelového druhu.
Naše údaje naznačujú, že sekvenovanie a analýza fragmentov ccfDNA z hemolymfy odvodených z baktérií môže poskytnúť kľúčové informácie o flóre hostiteľských baktérií a baktériách prítomných v okolitom morskom ekosystéme. Techniky sekvenovania pomocou shot odhalili sekvencie komenzálnych baktérií A. atra v žiabrách, ktoré by boli prehliadnuté, ak by sa použili konvenčné metódy identifikácie 16S rRNA, čiastočne kvôli skresleniu referenčnej knižnice. V skutočnosti naše použitie údajov LB zozbieraných z M. platensis v tej istej vrstve slávok v Kerguelene ukázalo, že zloženie bakteriálnych symbiontov spojených so žiabrami bolo rovnaké pre oba druhy slávok (obr. S4, Doplňujúce informácie). Táto podobnosť dvoch geneticky odlišných slávok môže odrážať zloženie bakteriálnych spoločenstiev v chladných, sírnych a sopečných ložiskách Kerguelenu [55, 56, 57, 58]. Vyššie hladiny mikroorganizmov redukujúcich síru boli dobre opísané pri zbere slávok z bioturbovaných pobrežných oblastí [59], ako je pobrežie Port-au-France. Ďalšou možnosťou je, že flóra komenzálnych slávok môže byť ovplyvnená horizontálnym prenosom [60, 61]. Na určenie korelácie medzi morským prostredím, povrchom morského dna a zložením symbiotických baktérií v slávkach je potrebný ďalší výskum. Tieto štúdie v súčasnosti prebiehajú.
Dĺžka a koncentrácia ccfDNA hemolymfy, jej jednoduchosť čistenia a vysoká kvalita umožňujúca rýchle sekvenovanie metódou shotgun sú niektoré z mnohých výhod použitia ccfDNA slávok na posúdenie biodiverzity v morských pobrežných ekosystémoch. Tento prístup je obzvlášť účinný na charakterizáciu vírusových spoločenstiev (virómov) v danom ekosystéme [62, 63]. Na rozdiel od baktérií, archeí a eukaryotov, vírusové genómy neobsahujú fylogeneticky konzervované gény, ako sú sekvencie 16S. Naše výsledky naznačujú, že tekuté biopsie z indikátorových druhov, ako sú slávky, možno použiť na identifikáciu relatívne veľkého počtu fragmentov vírusu ccfDNA, o ktorých je známe, že infikujú hostiteľov, ktorí typicky obývajú pobrežné morské ekosystémy. Patria sem vírusy, o ktorých je známe, že infikujú prvoky, článkonožce, hmyz, rastliny a bakteriálne vírusy (napr. bakteriofágy). Podobné rozdelenie sa zistilo, keď sme skúmali vírus ccfDNA hemolymfy modrých slávok (M. platensis) zozbieraných v tej istej vrstve slávok v Kerguelen (tabuľka S2, doplňujúce informácie). Sekvenovanie ccfDNA metódou brokovnice je skutočne nový prístup, ktorý naberá na obrátkach v štúdiu vírusu ľudí alebo iných druhov [21, 37, 64]. Tento prístup je obzvlášť užitočný na štúdium dvojvláknových DNA vírusov, pretože medzi všetkými dvojvláknovými DNA vírusmi nie je konzervovaný žiadny samostatný gén, čo predstavuje najrozmanitejšiu a najširšiu triedu vírusov v Baltimore [65]. Hoci väčšina týchto vírusov zostáva neklasifikovaná a môže zahŕňať vírusy z úplne neznámej časti vírusového sveta [66], zistili sme, že vírusy a hostiteľské rozsahy slávok A. atra a M. platensis spadajú medzi tieto dva druhy podobne (pozri obrázok S3, ďalšie informácie). Táto podobnosť nie je prekvapujúca, pretože môže odrážať nedostatočnú selektivitu v príjme DNA prítomnej v prostredí. Na charakterizáciu RNA vírusu sú v súčasnosti potrebné ďalšie štúdie s použitím purifikovanej RNA.
V našej štúdii sme použili veľmi rigorózny postup adaptovaný z práce Kowarského a kolegov [37], ktorí použili dvojkrokové deléciu združených čítaní a kontigov pred a po zostavení natívnej ccfDNA, čo viedlo k vysokému podielu nemapovaných čítaní. Preto nemôžeme vylúčiť, že niektoré z týchto nemapovaných čítaní môžu mať stále svoj vlastný pôvod, predovšetkým preto, že pre tento druh slávky nemáme referenčný genóm. Tento postup sme použili aj preto, že sme sa obávali chimér medzi vlastnými a nevlastnými čítaniami a dĺžok čítaní generovaných systémom Illumina MiSeq PE75. Ďalším dôvodom pre väčšinu nezmapovaných čítaní je, že väčšina morských mikróbov, najmä v odľahlých oblastiach, ako je Kerguelen, nebola anotovaná. Použili sme Illumina MiSeq PE75 za predpokladu, že dĺžky fragmentov ccfDNA sú podobné ľudskej ccfDNA. Vzhľadom na naše výsledky, ktoré ukazujú, že ccfDNA hemolymfy má dlhšie čítania ako ľudia a/alebo cicavce, odporúčame pre budúce štúdie použiť sekvenčnú platformu vhodnejšiu pre dlhšie fragmenty ccfDNA. Táto prax výrazne uľahčí identifikáciu viacerých indikácií pre hlbšiu analýzu. Získanie momentálne nedostupnej kompletnej sekvencie jadrového genómu A. atra by tiež výrazne uľahčilo rozlíšenie ccfDNA z vlastných a cudzích zdrojov. Vzhľadom na to, že náš výskum sa zameral na možnosť aplikácie konceptu tekutej biopsie na slávky, dúfame, že s využitím tohto konceptu v budúcom výskume sa vyvinú nové nástroje a postupy na zvýšenie potenciálu tejto metódy na štúdium mikrobiálnej diverzity slávok. morský ekosystém.
Ako neinvazívny klinický biomarker sú zvýšené hladiny ccfDNA v ľudskej plazme spojené s rôznymi ochoreniami, poškodením tkaniva a stresovými stavmi [67, 68, 69]. Toto zvýšenie súvisí s uvoľnením fragmentov DNA vlastného pôvodu po poškodení tkaniva. Túto problematiku sme riešili pomocou akútneho tepelného stresu, pri ktorom boli slávky krátko vystavené teplote 30 °C. Túto analýzu sme vykonali na troch rôznych druhoch slávok v troch nezávislých experimentoch. Nezistili sme však žiadnu zmenu hladín ccfDNA po akútnom tepelnom strese (pozri obrázok S5, ďalšie informácie). Tento objav môže aspoň čiastočne vysvetliť skutočnosť, že slávky majú polootvorený obehový systém a akumulujú veľké množstvo cudzej DNA v dôsledku svojej vysokej filtračnej aktivity. Na druhej strane, slávky, podobne ako mnohé bezstavovce, môžu byť odolnejšie voči poškodeniu tkaniva vyvolanému stresom, čím obmedzujú uvoľňovanie ccfDNA v ich hemolymfe [70, 71].
Doteraz sa analýza DNA biodiverzity vo vodných ekosystémoch zameriavala najmä na metabarkódovanie environmentálnej DNA (eDNA). Táto metóda je však pri analýze biodiverzity zvyčajne obmedzená, keď sa používajú priméry. Použitie sekvenovania shotgun obchádza obmedzenia PCR a skreslený výber súborov primérov. Naša metóda je teda v istom zmysle bližšie k nedávno používanej vysokokapacitnej metóde sekvenovania eDNA shotgun, ktorá je schopná priamo sekvenovať fragmentovanú DNA a analyzovať takmer všetky organizmy [72, 73]. Existuje však niekoľko základných problémov, ktoré odlišujú LB od štandardných metód eDNA. Hlavným rozdielom medzi eDNA a LB je samozrejme použitie prirodzených filtračných hostiteľov. Použitie morských druhov, ako sú špongie a lastúrniky (Dresseina spp.), ako prirodzeného filtra na štúdium eDNA bolo hlásené [74, 75]. Dreissenaova štúdia však použila tkanivové biopsie, z ktorých bola DNA extrahovaná. Analýza ccfDNA z LB nevyžaduje tkanivovú biopsiu, špecializované a niekedy drahé vybavenie a logistiku spojenú s eDNA alebo tkanivovou biopsiou. V skutočnosti sme nedávno informovali o tom, že ccfDNA z LB sa dá skladovať a analyzovať s podporou FTA bez udržiavania chladiaceho reťazca, čo je hlavnou výzvou pre výskum v odľahlých oblastiach [76]. Extrakcia ccfDNA z tekutých biopsií je tiež jednoduchá a poskytuje vysoko kvalitnú DNA pre sekvenovanie metódou shotgun a PCR analýzu. To je veľká výhoda vzhľadom na niektoré technické obmedzenia spojené s analýzou eDNA [77]. Jednoduchosť a nízke náklady na metódu odberu vzoriek sú obzvlášť vhodné aj pre dlhodobé monitorovacie programy. Okrem ich vysokej filtračnej schopnosti je ďalšou známou vlastnosťou lastúrnikov chemické mukopolysacharidové zloženie ich hlienu, ktoré podporuje absorpciu vírusov [78, 79]. Vďaka tomu sú lastúrniky ideálnym prirodzeným filtrom na charakterizáciu biodiverzity a vplyvu klimatických zmien v danom vodnom ekosystéme. Hoci prítomnosť fragmentov DNA odvodených od hostiteľa možno považovať za obmedzenie metódy v porovnaní s eDNA, náklady spojené s takouto natívnou ccfDNA v porovnaní s eDNA sú zároveň pochopiteľné vzhľadom na obrovské množstvo informácií dostupných pre zdravotné štúdie. offset hostiteľa. Patria sem aj prítomnosti vírusových sekvencií integrovaných do genómu hostiteľa. Toto je obzvlášť dôležité pre slávky, vzhľadom na prítomnosť horizontálne prenášaných leukemických retrovírusov v lastúrnikoch [80, 81]. Ďalšou výhodou LB oproti eDNA je, že využíva fagocytárnu aktivitu cirkulujúcich krviniek v hemolymfe, ktoré pohlcujú mikroorganizmy (a ich genómy). Fagocytóza je hlavnou funkciou krviniek v lastúrnikoch [82]. Metóda nakoniec využíva vysokú filtračnú kapacitu slávok (priemerne 1,5 l/h morskej vody) a dvojdňovú cirkuláciu, čo zvyšuje miešanie rôznych vrstiev morskej vody, čo umožňuje zachytenie heterológnej eDNA. [83, 84]. Analýza ccfDNA slávok je teda zaujímavou cestou vzhľadom na nutričné, ekonomické a environmentálne vplyvy slávok. Podobne ako analýza LB odobratého od ľudí, aj táto metóda otvára možnosť merania genetických a epigenetických zmien v DNA hostiteľa v reakcii na exogénne látky. Napríklad je možné predpokladať sekvenčné technológie tretej generácie na vykonávanie celogenómovej metylačnej analýzy v natívnej ccfDNA pomocou nanopórového sekvenovania. Tento proces by mal byť uľahčený skutočnosťou, že dĺžka fragmentov ccfDNA slávok je ideálne kompatibilná s platformami pre sekvenovanie s dlhým čítaním, ktoré umožňujú celogenómovú metylačnú analýzu DNA z jedného sekvenčného cyklu bez potreby chemických transformácií.85,86] Toto je zaujímavá možnosť, pretože sa ukázalo, že vzorce metylácie DNA odrážajú reakciu na environmentálny stres a pretrvávajú počas mnohých generácií. Preto môže poskytnúť cenný pohľad na základné mechanizmy riadiace reakciu po vystavení zmene klímy alebo znečisťujúcim látkam [87]. Použitie LB však nie je bez obmedzení. Netreba dodávať, že si to vyžaduje prítomnosť indikátorových druhov v ekosystéme. Ako už bolo spomenuté vyššie, použitie LB na posúdenie biodiverzity daného ekosystému si tiež vyžaduje prísny bioinformatický postup, ktorý zohľadňuje prítomnosť fragmentov DNA zo zdroja. Ďalším hlavným problémom je dostupnosť referenčných genómov pre morské druhy. Dúfa sa, že iniciatívy ako Marine Mammal Genomes Project a nedávno založený projekt Fish10k [88] uľahčia takúto analýzu v budúcnosti. Aplikácia konceptu LB na morské organizmy žijúce filtráciou vody je tiež kompatibilná s najnovšími pokrokmi v technológii sekvenovania, vďaka čomu je vhodná na vývoj viacohmových biomarkerov, ktoré poskytujú dôležité informácie o zdraví morských biotopov v reakcii na environmentálny stres.
Dáta zo sekvenovania genómu boli uložené v archíve čítania sekvencií NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 v rámci Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Vplyv klimatických zmien na morský život a ekosystémy. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alppanidou V, Bevilacqua S a kol. Zvážte kombinované vplyvy klimatických zmien a iných lokálnych stresorov na morské prostredie. všeobecné vedecké prostredie. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P a kol. ). Veda prvého marca. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Znížená tolerancia tepla pri opakovaných tepelných stresových podmienkach vysvetľuje vysokú letnú úmrtnosť modrých slávok. Vedecká správa 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER a kol. Nedávne zmeny vo frekvencii, príčinách a rozsahu úhynov zvierat. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, a kol. Hromadnú úmrtnosť Pinna nobilis mohlo spôsobiť viacero druhovo nešpecifických patogénov. Život. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potenciálny vplyv zmeny klímy na arktické zoonotické choroby. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. a kol. Modré slávky (Mytilus edulis spp.) ako signálne organizmy v monitorovaní znečistenia pobrežia: prehľad. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrácia tekutej biopsie do liečby rakoviny. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C a kol. Zrenie tekutej biopsie: Umožňuje cirkuláciu nádorovej DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleové kyseliny v ľudskej plazme. Zápisnice zo zasadnutí dcérskych spoločností Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nová úloha bezbunkovej DNA ako molekulárneho markera pri liečbe rakoviny. Kvantifikácia biomolárnej analýzy. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekutá biopsia vstupuje do klinickej praxe – problémy s implementáciou a budúce výzvy. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW a ďalší. Fetálna DNA je prítomná v materskej plazme a sére. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Štúdia priebehu tehotenstva a jeho komplikácií s použitím cirkulujúcej extracelulárnej RNA v krvi žien počas tehotenstva. Dopediatria. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J a kol. Tekutá biopsia: DNA darcovských buniek bez DNA sa používa na detekciu alogénnych lézií v obličkovom štepe. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovácie v prenatálnej diagnostike: sekvenovanie genómu materskej plazmy. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D a kol. Rýchla detekcia patogénov pomocou metagenomického sekvenovania infikovaných telesných tekutín novej generácie. Nat Medicine. 2021;27:115-24.