Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Tekutá biopsia (LB) je pojem, ktorý si rýchlo získava na popularite v biomedicínskej oblasti.Koncept je založený najmä na detekcii fragmentov cirkulujúcej extracelulárnej DNA (ccfDNA), ktoré sa uvoľňujú najmä ako malé fragmenty po smrti buniek v rôznych tkanivách.Malá časť týchto fragmentov pochádza z cudzích (cudzích) tkanív alebo organizmov.V súčasnej práci sme tento koncept aplikovali na lastúrniky, strážny druh známy svojou vysokou filtračnou kapacitou morskej vody.Využívame schopnosť mušlí pôsobiť ako prirodzené filtre na zachytávanie environmentálnych fragmentov DNA z rôznych zdrojov, aby sme poskytli informácie o biodiverzite morských pobrežných ekosystémov.Naše výsledky ukazujú, že hemolymfa mušlí obsahuje fragmenty DNA, ktoré sa veľmi líšia veľkosťou, od 1 do 5 kb.Sekvenovanie pomocou brokovnice ukázalo, že veľké množstvo fragmentov DNA je cudzieho mikrobiálneho pôvodu.Medzi nimi sme našli fragmenty DNA z baktérií, archaea a vírusov, vrátane vírusov, o ktorých je známe, že infikujú rôznych hostiteľov bežne sa vyskytujúcich v pobrežných morských ekosystémoch.Na záver, naša štúdia ukazuje, že koncept LB aplikovaný na mušle predstavuje bohatý, ale zatiaľ nepreskúmaný zdroj vedomostí o mikrobiálnej diverzite v morských pobrežných ekosystémoch.
Vplyv klimatických zmien (CC) na biodiverzitu morských ekosystémov je rýchlo rastúcou oblasťou výskumu.Globálne otepľovanie spôsobuje nielen dôležité fyziologické stresy, ale posúva aj evolučné limity tepelnej stability morských organizmov, čo ovplyvňuje biotopy mnohých druhov, čo ich vedie k hľadaniu priaznivejších podmienok [1, 2].Okrem ovplyvnenia biodiverzity metazoánov CC narúša jemnú rovnováhu medzi hostiteľsko-mikrobiálnymi interakciami.Táto mikrobiálna dysbakterióza predstavuje vážnu hrozbu pre morské ekosystémy, pretože spôsobuje, že morské organizmy sú náchylnejšie na infekčné patogény [3, 4].Predpokladá sa, že SS zohrávajú dôležitú úlohu pri hromadných úmrtiach, čo je vážny problém pre riadenie globálnych morských ekosystémov [5, 6].Toto je dôležitá otázka vzhľadom na ekonomický, ekologický a nutričný vplyv mnohých morských druhov.Platí to najmä pre lastúrniky žijúce v polárnych oblastiach, kde sú účinky CK bezprostrednejšie a závažnejšie [6, 7].V skutočnosti lastúrniky ako Mytilus spp.sa široko používajú na monitorovanie účinkov CC na morské ekosystémy.Niet divu, že na monitorovanie ich zdravia bolo vyvinutých relatívne veľké množstvo biomarkerov, často s použitím dvojstupňového prístupu zahŕňajúci funkčné biomarkery založené na enzymatickej aktivite alebo bunkových funkciách, ako je životaschopnosť buniek a fagocytová aktivita [8].Tieto metódy zahŕňajú aj meranie koncentrácie špecifických tlakových indikátorov, ktoré sa hromadia v mäkkých tkanivách po absorpcii veľkého množstva morskej vody.Vysoká filtračná kapacita a polootvorený obehový systém lastúrnikov však poskytujú príležitosť na vývoj nových hemolymfových biomarkerov pomocou koncepcie kvapalinovej biopsie (LB), jednoduchého a minimálne invazívneho prístupu k liečbe pacientov.vzorky krvi [9, 10].Aj keď v ľudskom LB sa nachádza niekoľko typov cirkulujúcich molekúl, tento koncept je primárne založený na analýze sekvenovania DNA fragmentov cirkulujúcej extracelulárnej DNA (CCFDNA) v plazme.V skutočnosti je prítomnosť cirkulujúcej DNA v ľudskej plazme známa od polovice 20. storočia [11], ale v posledných rokoch však príchod vysoko výkonných metód sekvenovania viedol k klinickej diagnostike založenej na CCFDNA.Prítomnosť týchto cirkulujúcich fragmentov DNA je čiastočne spôsobená pasívnym uvoľňovaním genómovej DNA (jadrovej a mitochondriálnej) po bunkovej smrti. U zdravých jedincov je koncentrácia ccfDNA normálne nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov trpiacich rôznymi patologickými stavmi alebo vystavených stresu, čo vedie k poškodeniu tkaniva, sa môže zvýšiť 5–10-krát. U zdravých jedincov je koncentrácia ccfDNA normálne nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov trpiacich rôznymi patologickými stavmi alebo vystavených stresu, čo vedie k poškodeniu tkaniva, sa môže zvýšiť 5–10-krát. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но можетшат пово ольных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящейте к пеновре U zdravých ľudí je koncentrácia cccDNA za normálnych okolností nízka (<10 ng/ml), ale u pacientov s rôznymi patológiami alebo pod stresom, ktorý vedie k poškodeniu tkaniva, sa môže zvýšiť 5–10 krát.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml），但在患有各种病琚或承儚季办丢帛或承囏或承常较低）加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病 囂 戗 或 担 琿 戗 或 或 手可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伟 损伤伤伤损伤伤伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут бытичаѿыбытипеневе 1 иентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Koncentrácie ccfDNA sú zvyčajne nízke (<10 ng/ml) u zdravých jedincov, ale môžu sa zvýšiť 5-10-násobne u pacientov s rôznymi patológiami alebo stresom, čo vedie k poškodeniu tkaniva.Veľkosť fragmentov ccfDNA sa veľmi líši, ale zvyčajne sa pohybuje od 150 do 200 bp.[12].Analýza vlastnej ccfDNA, tj ccfDNA z normálnych alebo transformovaných hostiteľských buniek, sa môže použiť na detekciu genetických a epigenetických zmien prítomných v jadrovom a/alebo mitochondriálnom genóme, čím pomáha lekárom pri výbere špecifických molekulárne cielených terapií [13].ccfDNA však možno získať z cudzích zdrojov, ako je ccfDNA z fetálnych buniek počas tehotenstva alebo z transplantovaných orgánov [14,15,16,17].ccfDNA je tiež dôležitým zdrojom informácií na detekciu prítomnosti nukleových kyselín infekčného agens (cudzieho), čo umožňuje neinvazívnu detekciu rozšírených infekcií neidentifikovaných hemokultúrami, čím sa vyhne invazívnej biopsii infikovaného tkaniva [18].Nedávne štúdie skutočne ukázali, že ľudská krv obsahuje bohatý zdroj informácií, ktoré možno použiť na identifikáciu vírusových a bakteriálnych patogénov, a že asi 1 % ccfDNA nájdenej v ľudskej plazme je cudzieho pôvodu [19].Tieto štúdie ukazujú, že biodiverzitu cirkulujúceho mikrobiómu organizmu možno hodnotiť pomocou analýzy ccfDNA.Tento koncept sa však donedávna používal výlučne u ľudí a v menšej miere aj u iných stavovcov [20, 21].
V tomto článku využívame LB potenciál na analýzu CCFDNA Aulacomya Atra, južného druhu, ktorý sa bežne vyskytuje na ostrovoch Subantarktic Kerguelen, skupine ostrovov na vrchole veľkej náhornej plošiny, ktorá tvorila pred 35 miliónmi rokov.sopečná erupcia.Pomocou experimentálneho systému in vitro sme zistili, že fragmenty DNA v morskej vode sa rýchlo zaberajú mušľami a vstupujú do hemolymfového priestoru.Sekvenovanie brokovnice ukázalo, že hemolymfová ccfDNA s mušľou obsahuje fragmenty DNA svojho vlastného a ne-efového pôvodu, vrátane symbiotických baktérií a fragmentov DNA z biomov typických pre studené sopečné morské pobrežné ekosystémy.Hemolymfa ccfDNA tiež obsahuje vírusové sekvencie odvodené z vírusov s rôznymi rozsahmi hostiteľov.Našli sme tiež fragmenty DNA z mnohobunkových živočíchov, ako sú kostnaté ryby, morské sasanky, riasy a hmyz.Záverom je, že naša štúdia demonštruje, že koncept LB sa dá úspešne aplikovať na morské bezstavovce na vytvorenie bohatého genomického repertoáru v morských ekosystémoch.
Dospelí (55-70 mm dlhé) Mytilus Platensis (M. platensis) a Aulacomya atra (A. atra) sa zbierali z prístavných skalnatých brehov Port-au-France (049 ° 21,235 s, 070 ° 13,490 e.).Ostrovy Kerguelen v decembri 2018. Ďalšie dospelé modré mušle (Mytilus spp.) Boli získané od komerčného dodávateľa (Pei Mussel King Inc., Island Edward Island, Kanada) a umiestnené do teploty kontrolovanej (4 ° C) AERAD Tank obsahujúca 10–20 L z 32 kedy.(umelá morská soľ Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Pre každý experiment sa merala dĺžka a hmotnosť jednotlivých mušlí.
Bezplatný protokol otvoreného prístupu pre tento program je dostupný online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Stručne povedané, hemolymfa LB bola odobratá z abduktorových svalov, ako je opísané [22].Hemolymfa sa vyčistila centrifugáciou pri 1200 x g počas 3 minút, supernatant sa zmrazil (-20 °C) až do použitia.Na izoláciu a purifikáciu cfDNA boli vzorky (1,5-2,0 ml) rozmrazené a spracované pomocou súpravy NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) podľa pokynov výrobcu.ccfDNA sa skladovala pri -80 °C až do ďalšej analýzy.V niektorých experimentoch bola ccfDNA izolovaná a purifikovaná pomocou QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Purifikovaná DNA sa kvantifikovala použitím štandardného testu PicoGreen.Distribúcia fragmentov izolovanej ccfDNA sa analyzovala kapilárnou elektroforézou s použitím bioanalyzátora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) s použitím súpravy High Sensitivity DNA Kit.Test sa uskutočnil s použitím 1 ul vzorky ccfDNA podľa pokynov výrobcu.
Na sekvenovanie fragmentov ccfDNA hemolymfy pripravil Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) knižnice brokovníc pomocou súpravy Illumina DNA Mix súpravy Illumina MiSeq PE75.Bol použitý štandardný adaptér (BioO).Súbory s nespracovanými údajmi sú dostupné v NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 a SRR8924809).Základná kvalita čítania bola hodnotená pomocou FastQC [23].Trimmomatic [24] sa používa na orezávanie adaptérov a nekvalitné čítanie.Čítania brokovnicou so spárovanými koncami boli FLASH zlúčené do dlhších samostatných čítaní s minimálnym prekrytím 20 bp, aby sa predišlo nezhodám [25]. Zlúčené čítania boli anotované pomocou BLASTN pomocou databázy taxonomie lastúrnikov NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90% homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou sa uskutočnilo pomocou DUST [26]. Zlúčené čítania boli anotované pomocou BLASTN pomocou databázy taxonomie lastúrnikov NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90% homológia) a maskovanie sekvencií s nízkou komplexnosťou sa uskutočnilo pomocou DUST [26]. Объединенные чтения ыыли аннотированы с пощщю Blastn с иполиозованием базы дан д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д д т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т nisku т т т т т т nisku к т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т т тisku. ние e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последователельнностей низзй сзззззззззз [ Združené čítania boli anotované pomocou BLASTN s použitím databázy taxonómie lastúrnikov NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90% homológia) a maskovanie sekvencie s nízkou komplexnosťou sa uskutočnilo pomocou DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并的合并的读6乶 的读6 俽 的读 数 迼囡低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读敹6 ｡ 读敹 ！ 读敹复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩莔 蔽 掩莔 蔽 掩莔 蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения ыыли аннотированы с пощщ ю ч и иполизованием танаюаланем rekиччем д кiччем д д д д д к кiлюлаюалалsky ncI. значение e <1e-3 и 90% гомоarkогии), а маскирование последовательнностей низ сажжложыловловловло ло ло ло ло н istý н 5 нлпжыыыло п н нппжжыыло п н нал 26жжжжности. Zhromaždené čítania sa anotovali s BLASTN s použitím taxonomickej databázy NCBI BIVALVE (E HODNOTA <1E-3 a 90% homológia) a maskovanie sekvencie nízkej zložitosti sa uskutočňovalo pomocou prachu [26].Čítania boli rozdelené do dvoch skupín: súvisiace so sekvenciami lastúrnikov (tu sa nazývajú samočítanie) a nesúvisiace (nečítané).Dve skupiny boli oddelene zostavené pomocou MEGAHIT na vytvorenie kontigov [27].Medzitým bola taxonomická distribúcia čítaní mimozemských mikrobiómov klasifikovaná pomocou Kraken2 [28] a graficky znázornená koláčovým grafom Krona na galaxii [29, 30].Optimálne kmery boli určené ako kmery-59 z našich predbežných experimentov. Vlastné kontigy sa potom identifikovali porovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e < 1e-10 a 60% homológia) na konečnú anotáciu. Vlastné kontigy sa potom identifikovali porovnaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e < 1e-10 a 60% homológia) na konečnú anotáciu. Samokontigy sa potom identifikovali porovnávaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia) na konečnú anotáciu.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）对黍黐据库别 进行切迏行躤䥫切过类识切迏術，e 值< 1e-10最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотацвсLAST пиотацвсLAST пиопутеве аза данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 a гомология 60%). Samokontigy sa potom identifikovali na konečnú anotáciu porovnávaním s BLASTN (databáza lastúrnikov NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homológia). Paralelne boli kontigy iných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, hodnota e < 1e-10 a 60% homológia). Paralelne boli kontigy iných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, hodnota e < 1e-10 a 60% homológia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (базенач ненBI) 1e-10 a гомология 60%). Paralelne boli kontigy cudzích skupín anotované pomocou BLASTN (databáza NT NCBI, e hodnota <1e-10 a 60% homológia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠组重叠组重叠组重参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠组重叠组重叠组重参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с поманы с помой nt NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60 %). Paralelne boli kontigy iných skupín anotované pomocou BLASTN (databáza nt NCBI, e hodnota <1e-10 a 60% homológia). BLASTX sa uskutočňoval aj na non-self kontigoch s použitím databáz NCBI proteínov nr a RefSeq (hodnota e < 1e-10 a 60% homológia). BLASTX sa uskutočňoval aj na non-self kontigoch s použitím databáz NCBI proteínov nr a RefSeq (hodnota e < 1e-10 a 60% homológia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данене на даненных чение e <1e-10 a гомология 60%). BLASTX sa tiež uskutočnil na non-self kontigoch s použitím nr a RefSeq NCBI proteínových databáz (hodnota e < le-10 a 60% homológia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз даненыкинзSennыкинз незованием е e <1e-10 a гомология 60 %). BLASTX sa tiež uskutočnil na non-self kontigoch s použitím nr a RefSeq NCBI proteínových databáz (hodnota e < 1e-10 a 60% homológia).Súbory BLASTN a BLASTX nesamostatných kontigov predstavujú konečné kontigy (pozri doplnkový súbor).
Priméry použité pre PCR sú uvedené v tabuľke S1.Na amplifikáciu cieľových génov ccfDNA sa použila Taq DNA polymeráza (Bio Basic Canada, Markham, ON).Boli použité nasledujúce reakčné podmienky: denaturácia pri 95 °C počas 3 minút, 95 °C počas 1 minúty, nastavená teplota žíhania na 1 minútu, predĺženie pri 72 °C počas 1 minúty, 35 cyklov a nakoniec 72 °C počas 10 minút..Produkty PCR boli separované elektroforézou v agarózových géloch (1,5 %) obsahujúcich SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pri 95 V.
Mušle (Mytilus spp.) sa aklimatizovali v 500 ml okysličenej morskej vody (32 PSU) počas 24 hodín pri 4 °C.Plazmidová DNA obsahujúca inzert kódujúci sekvenciu cDNA ľudského galektínu-7 (prírastkové číslo NCBI L07769) sa pridala do fľaštičky v konečnej koncentrácii 190 ug/ul.Kontrolou boli mušle inkubované za rovnakých podmienok bez pridania DNA.Tretia kontrolná nádrž obsahovala DNA bez mušlí.Na monitorovanie kvality DNA v morskej vode boli v uvedenom čase z každej nádrže odobraté vzorky morskej vody (20 μl; tri opakovania).Na vysledovateľnosť plazmidovej DNA sa mušle LB zozbierali v uvedených časoch a analyzovali sa pomocou qPCR a ddPCR.Kvôli vysokému obsahu soli v morskej vode sa alikvóty pred všetkými testami PCR zriedili vo vode s kvalitou PCR (1:10).
Digitálna kvapôčková PCR (ddPCR) sa uskutočnila s použitím protokolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Na určenie optimálnej teploty použite teplotný profil (tabuľka S1).Kvapky boli generované pomocou generátora kvapiek QX200 (BioRad).ddPCR sa uskutočnilo nasledovne: 95 °C počas 5 minút, 50 cyklov 95 °C počas 30 s a daná teplota žíhania počas 1 minúty a 72 °C počas 30 s, 4 °C počas 5 minút a 90 °C počas 5 minút.Počet kvapiek a pozitívnych reakcií (počet kópií/ul) sa meral pomocou čítačky kvapiek QX200 (BioRad).Vzorky s menej ako 10 000 kvapôčkami boli odmietnuté.Kontrola vzoru sa neuskutočnila pri každom spustení ddPCR.
qPCR sa uskutočnilo s použitím Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) a LGALS7 špecifických primerov.Všetky kvantitatívne PCR sa uskutočnili v 20 ul s použitím súpravy QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR sa začala 15 minútovou inkubáciou pri 95 °C, po ktorej nasledovalo 40 cyklov pri 95 °C počas 10 sekúnd a pri 60 °C počas 60 sekúnd s jedným zberom údajov.Krivky topenia sa vytvorili pomocou postupných meraní pri 95 °C počas 5 s, 65 °C počas 60 s a 97 °C na konci qPCR.Každá qPCR sa uskutočnila trojmo, s výnimkou kontrolných vzoriek.
Keďže mušle sú známe svojou vysokou rýchlosťou filtrácie, najprv sme skúmali, či dokážu filtrovať a zachovať fragmenty DNA prítomné v morskej vode.Zaujímalo nás aj to, či sa tieto úlomky hromadia v ich polootvorenom lymfatickom systéme.Tento problém sme vyriešili experimentálne sledovaním osudu rozpustných fragmentov DNA pridaných do nádrží s modrými mušľami.Na uľahčenie sledovania fragmentov DNA sme použili cudziu (nie vlastnú) plazmidovú DNA obsahujúcu ľudský gén galektín-7.ddPCR sleduje fragmenty plazmidovej DNA v morskej vode a lastúrach.Naše výsledky ukazujú, že ak množstvo fragmentov DNA v morskej vode zostalo relatívne konštantné v priebehu času (až 7 dní) v neprítomnosti lastúrnikov, potom v prítomnosti lastúrnikov táto hladina takmer úplne zmizla do 8 hodín (obr. 1a,b).Fragmenty exogénnej DNA boli ľahko detegované do 15 minút v intravalvulárnej tekutine a hemolymfe (obr. 1c).Tieto fragmenty bolo možné detegovať až 4 hodiny po expozícii.Táto filtračná aktivita vzhľadom na fragmenty DNA je porovnateľná s filtračnou aktivitou baktérií a rias [31].Tieto výsledky naznačujú, že mušle môžu filtrovať a akumulovať cudziu DNA vo svojich tekutinových kompartmentoch.
Relatívne koncentrácie plazmidovej DNA v morskej vode v prítomnosti (A) alebo neprítomnosti (B) lastúrnikov, merané pomocou ddPCR.V A sú výsledky vyjadrené v percentách, pričom okraje políčok predstavujú 75. a 25. percentil.Preložená logaritmická krivka je znázornená červenou farbou a oblasť vytieňovaná sivou farbou predstavuje 95 % interval spoľahlivosti.V B červená čiara predstavuje priemer a modrá čiara predstavuje 95 % interval spoľahlivosti pre koncentráciu.C Akumulácia plazmidovej DNA v hemolymfe a chlopňovej tekutine lastúrnikov v rôznych časoch po pridaní plazmidovej DNA.Výsledky sú prezentované ako absolútne detegované kópie/ml (± SE).
Ďalej sme skúmali pôvod ccfDNA v lastúrach zozbieraných z lastúr na Kerguelenských ostrovoch, vzdialenej skupine ostrovov s obmedzeným antropogénnym vplyvom.Na tento účel bola izolovaná a purifikovaná cccDNA z hemolymf lastúrnikov metódami bežne používanými na purifikáciu ľudskej cccDNA [32, 33].Zistili sme, že priemerné koncentrácie ccfDNA hemolymfy v lastúrach sú v rozsahu nízkych mikrogramov na ml hemolymfy (pozri tabuľku S2, Doplnkové informácie).Tento rozsah koncentrácií je oveľa väčší ako u zdravých ľudí (nízke nanogramy na mililiter), ale v zriedkavých prípadoch u pacientov s rakovinou môže hladina ccfDNA dosiahnuť niekoľko mikrogramov na mililiter [34, 35].Analýza distribúcie veľkosti hemolymfy ccfDNA ukázala, že tieto fragmenty sa veľmi líšia veľkosťou v rozsahu od 1000 bp do 1000 bp.až 5000 bp (obr. 2).Podobné výsledky boli získané pomocou súpravy QIAamp Investigator Kit na báze oxidu kremičitého, čo je metóda bežne používaná vo forenznej vede na rýchlu izoláciu a purifikáciu genómovej DNA zo vzoriek DNA s nízkou koncentráciou, vrátane ccfDNA [36].
Reprezentatívny ccfDNA elektroforegram mušľovej hemolymfy.Extrahované pomocou súpravy NucleoSnap Plasma Kit (hore) a súpravy QIAamp DNA Investigator Kit.B Husľový graf znázorňujúci distribúciu koncentrácií ccfDNA hemolymfy (±SE) v lastúrach.Čierna a červená čiara predstavujú medián a prvý a tretí kvartil.
Približne 1 % ccfDNA u ľudí a primátov má cudzí zdroj [21, 37].Vzhľadom na polootvorený obehový systém lastúrnikov, morskú vodu bohatú na mikroorganizmy a distribúciu veľkosti ccfDNA mušlí sme predpokladali, že hemolymfa mušlí ccfDNA môže obsahovať bohatý a rôznorodý súbor mikrobiálnej DNA.Na otestovanie tejto hypotézy sme sekvenovali ccfDNA hemolymfy zo vzoriek Aulacomya atra zozbieraných z Kerguelenských ostrovov, čím sme získali viac ako 10 miliónov čítaní, z ktorých 97, 6% prešlo kontrolou kvality.Hodnoty sa potom klasifikovali podľa vlastných a iných zdrojov pomocou databáz lastúrnikov BLASTN a NCBI (obr. S1, doplnkové informácie).
U ľudí môže byť jadrová aj mitochondriálna DNA uvoľnená do krvného obehu [38].V tejto štúdii však nebolo možné podrobne opísať jadrovú genómovú DNA lastúrnikov, keďže genóm A. atra nebol sekvenovaný ani opísaný.Pomocou knižnice lastúrnikov sa nám však podarilo identifikovať množstvo fragmentov ccfDNA nášho vlastného pôvodu (obr. S2, doplnkové informácie).Prítomnosť fragmentov DNA nášho vlastného pôvodu sme tiež potvrdili riadenou PCR amplifikáciou tých génov A. atra, ktoré boli sekvenované (obr. 3).Podobne, vzhľadom na to, že mitochondriálny genóm A. atra je dostupný vo verejných databázach, je možné nájsť dôkaz o prítomnosti mitochondriálnych fragmentov ccfDNA v hemolymfe A. atra.Prítomnosť fragmentov mitochondriálnej DNA bola potvrdená PCR amplifikáciou (obr. 3).
Rôzne mitochondriálne gény boli prítomné v hemolymfe A. atra (červené bodky – skladové číslo: SRX5705969) a M. platensis (modré bodky – skladové číslo: SRX5705968) amplifikovanej pomocou PCR.Obrázok upravený podľa Breton et al., 2011 B Amplifikácia supernatantu hemolymfy z A. atra Uložené na papieri FTA.Použite 3 mm dierovač na pridanie priamo do skúmavky PCR obsahujúcej zmes PCR.
Vzhľadom na bohatý mikrobiálny obsah v morskej vode sme sa spočiatku zamerali na charakterizáciu sekvencií mikrobiálnej DNA v hemolymfe.Na tento účel používame dve rôzne stratégie.Prvá stratégia používala Kraken2, program na klasifikáciu sekvencií založený na algoritme, ktorý dokáže identifikovať mikrobiálne sekvencie s presnosťou porovnateľnou s BLAST a inými nástrojmi [28].Zistilo sa, že viac ako 6719 čítaní je bakteriálneho pôvodu, pričom 124 a 64 bolo z archaea a vírusov (obr. 4).Najpočetnejšími fragmentmi bakteriálnej DNA boli Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) a Bacteroidetes (17 %) (obr. 4a).Táto distribúcia je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami mikrobiómu slávky modrej [39, 40].Gammaproteobaktérie boli hlavnou triedou proteobaktérií (44 %), vrátane mnohých Vibrionales (obr. 4b).Metóda ddPCR potvrdila prítomnosť fragmentov Vibrio DNA v ccfDNA hemolymfy A. atra (obr. 4c) [41].Na získanie ďalších informácií o bakteriálnom pôvode ccfDNA sa použil ďalší prístup (obr. S2, doplnkové informácie). V tomto prípade boli čítania, ktoré sa prekrývali, zhromaždené ako čítania na párovom konci a boli klasifikované ako vlastné (bivalky) alebo cudzieho pôvodu pomocou BLASTN a hodnoty e 1e-3 a medznej hodnoty s > 90% homológiou. V tomto prípade boli čítania, ktoré sa prekrývali, zhromaždené ako čítania na párovom konci a boli klasifikované ako vlastné (bivalky) alebo cudzieho pôvodu pomocou BLASTN a hodnoty e 1e-3 a medznej hodnoty s > 90% homológiou. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными кониринабинамия ы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с испольиезо1ния e-3 a отсечения с гомологией> 90 %. V tomto prípade sa prekrývajúce sa čítania zozbierali ako čítania s párovým zakončením a klasifikovali sa ako natívne (dvojchlopňové) alebo nepôvodné pomocou BLASTN a hodnoty e 1e-3 a medznej hodnoty s > 90 % homológiou.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 暐e 歰组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 暐e 止%琚嚒数孢琚嚒数孢值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 彿和3 blast和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтеникае с парными кониргамамия собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с исполюензона 1e-3 a порога гомологии> 90 %. V tomto prípade sa prekrývajúce sa čítania zozbierali ako čítania s párovým zakončením a klasifikovali sa ako vlastné (bivalky) alebo nepôvodné pomocou hodnôt e BLASTN a 1e-3 a prahu homológie > 90 %.Keďže genóm A. atra ešte nebol sekvenovaný, použili sme de novo zostavovaciu stratégiu zostavovacieho nástroja MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Celkovo bolo identifikovaných 147 188 kontigov ako závislých (lasičkov) pôvodu.Tieto kontigy boli potom rozložené s e-hodnotami 1e-10 pomocou BLASTN a BLASTX.Táto stratégia nám umožnila identifikovať 482 nedvojchlopňových fragmentov prítomných v ccfDNA A. atra.Viac ako polovica (57 %) týchto fragmentov DNA bola získaná z baktérií, najmä zo žiabrových symbiontov vrátane sulfotrofných symbiontov a zo žiabrových symbiontov Solemya velum (obr. 5).
Relatívna hojnosť na úrovni typu.B Mikrobiálna diverzita dvoch hlavných kmeňov (Firmicutes a Proteobacteria).Reprezentatívna amplifikácia ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenty génu 16S rRNA (modré) v troch atra hemolymfách.
Celkovo sa analyzovalo 482 zozbieraných kontigov.Všeobecný profil taxonomickej distribúcie metagenomických kontigových anotácií (prokaryoty a eukaryoty).B Podrobná distribúcia fragmentov bakteriálnej DNA identifikovaných pomocou BLASTN a BLASTX.
Analýza Kraken2 tiež ukázala, že ccfDNA lastúrnikov obsahovala fragmenty archaálnej DNA, vrátane fragmentov DNA Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) a Thaurmarcheota (11 %) (obr. 6a).Prítomnosť fragmentov DNA odvodených z Euryarchaeota a Crenarchaeota, ktoré sa predtým našli v mikrobiálnej komunite kalifornských mušlí, by nemala byť prekvapením [42].Aj keď sa Euryarchaeota často spája s extrémnymi podmienkami, v súčasnosti sa uznáva, že Euryarchaeota aj Crenarcheota patria medzi najbežnejšie prokaryoty v morskom kryogénnom prostredí [43, 44].Prítomnosť metanogénnych mikroorganizmov v lastúrach nie je prekvapujúca vzhľadom na nedávne správy o rozsiahlych únikoch metánu z priesakov dna na Kerguelenskej plošine [45] a možnú mikrobiálnu produkciu metánu pozorovanú pri pobreží Kerguelenských ostrovov [46].
Naša pozornosť sa potom presunula na hodnoty z DNA vírusov.Podľa našich najlepších vedomostí ide o prvú mimocieľovú štúdiu o obsahu vírusov v lastúrach.Podľa očakávania sme našli fragmenty DNA bakteriofágov (Caudovirales) (obr. 6b).Najbežnejšia vírusová DNA však pochádza z kmeňa nukleocytovírusov, známych aj ako nukleárny cytoplazmatický veľký DNA vírus (NCLDV), ktorý má najväčší genóm zo všetkých vírusov.V rámci tohto kmeňa väčšina sekvencií DNA patrí do čeľadí Mimimidoviridae (58 %) a Poxviridae (21 %), ktorých prirodzenými hostiteľmi sú stavovce a článkonožce, pričom malá časť týchto sekvencií DNA patrí medzi známe virologické riasy.Infikuje morské eukaryotické riasy.Sekvencie boli tiež získané z vírusu Pandora, obrovského vírusu s najväčšou veľkosťou genómu zo všetkých známych vírusových rodov.Je zaujímavé, že rozsah hostiteľov, o ktorých je známe, že sú infikovaní vírusom, ako bolo určené sekvenovaním hemolymfy ccfDNA, bol relatívne veľký (obrázok S3, doplnkové informácie).Zahŕňa vírusy, ktoré infikujú hmyz, ako sú Baculoviridae a Iridoviridae, ako aj vírusy, ktoré infikujú améby, riasy a stavovce.Našli sme tiež sekvencie zodpovedajúce genómu Pithovirus sibericum.Pitovírusy (tiež známe ako „zombie vírusy“) boli prvýkrát izolované z 30 000 rokov starého permafrostu na Sibíri [47].Naše výsledky sú teda v súlade s predchádzajúcimi správami, ktoré ukazujú, že nie všetky moderné druhy týchto vírusov vyhynuli [48] a že tieto vírusy môžu byť prítomné vo vzdialených subarktických morských ekosystémoch.
Nakoniec sme otestovali, či dokážeme nájsť fragmenty DNA z iných mnohobunkových živočíchov.Celkovo 482 cudzích kontigov bolo identifikovaných pomocou BLASTN a BLASTX s knižnicami nt, nr a RefSeq (genomické a proteínové).Naše výsledky ukazujú, že medzi cudzími fragmentmi ccfDNA mnohobunkových zvierat prevažuje DNA kostných kostí (obr. 5).Našli sa aj fragmenty DNA hmyzu a iných druhov.Pomerne veľká časť fragmentov DNA nebola identifikovaná, pravdepodobne v dôsledku nedostatočného zastúpenia veľkého počtu morských druhov v genómových databázach v porovnaní so suchozemskými [49].
V tomto článku aplikujeme koncept LB na mušle a tvrdíme, že sekvenovanie výstrelov hemolymfy ccfDNA môže poskytnúť pohľad na zloženie morských pobrežných ekosystémov.Konkrétne sme zistili, že 1) hemolymfa mušlí obsahuje relatívne vysoké koncentrácie (hladiny mikrogramov) relatívne veľkých (~1-5 kb) cirkulujúcich fragmentov DNA;2) tieto fragmenty DNA sú nezávislé aj nesamostatné 3) Medzi cudzími zdrojmi týchto fragmentov DNA sme našli bakteriálnu, archaálnu a vírusovú DNA, ako aj DNA iných mnohobunkových živočíchov;4) Akumulácia týchto cudzích fragmentov ccfDNA v hemolymfe prebieha rýchlo a prispieva k vnútornej filtračnej aktivite lastúrnikov.Na záver naša štúdia demonštruje, že koncept LB, ktorý bol doteraz aplikovaný najmä v oblasti biomedicíny, v sebe kóduje bohatý, no neprebádaný zdroj poznatkov, ktorý možno využiť na lepšie pochopenie interakcie medzi sentinelovými druhmi a ich prostredím.
Okrem primátov bola izolácia ccfDNA hlásená aj u cicavcov, vrátane myší, psov, mačiek a koní [50, 51, 52].Podľa našich vedomostí je však naša štúdia prvou, ktorá uvádza detekciu a sekvenovanie ccfDNA u morských druhov s otvoreným obehovým systémom.Táto anatomická vlastnosť a filtračná schopnosť mušlí môže aspoň čiastočne vysvetliť rozdielne veľkostné charakteristiky cirkulujúcich fragmentov DNA v porovnaní s inými druhmi.U ľudí väčšina fragmentov DNA cirkulujúcich v krvi sú malé fragmenty s veľkosťou od 150 do 200 bp.s maximálnym vrcholom 167 bp [34, 53].Malá, ale významná časť fragmentov DNA má veľkosť medzi 300 a 500 bp a približne 5 % je dlhších ako 900 bp.[54].Dôvodom tejto distribúcie veľkosti je, že hlavný zdroj ccfDNA v plazme sa vyskytuje v dôsledku bunkovej smrti, buď v dôsledku bunkovej smrti alebo v dôsledku nekrózy cirkulujúcich hematopoetických buniek u zdravých jedincov alebo v dôsledku apoptózy nádorových buniek u pacientov s rakovinou (známa ako cirkulujúca nádorová DNA).ctDNA).Distribúcia veľkosti ccfDNA hemolymfy, ktorú sme našli v lastúrach, sa pohybovala od 1 000 do 5 000 bp, čo naznačuje, že ccfDNA lastúrnikov má iný pôvod.Ide o logickú hypotézu, keďže lastúrniky majú polootvorený cievny systém a žijú v morskom vodnom prostredí obsahujúcom vysoké koncentrácie mikrobiálnej genómovej DNA.V skutočnosti naše laboratórne experimenty s použitím exogénnej DNA ukázali, že mušle akumulujú fragmenty DNA v morskej vode, prinajmenšom po niekoľkých hodinách sú po absorpcii bunkami degradované a/alebo uvoľnené a/alebo uložené v rôznych organizáciách.Vzhľadom na vzácnosť buniek (prokaryotických aj eukaryotických) použitie intravalvulárnych kompartmentov zníži množstvo ccfDNA z vlastných zdrojov, ako aj z cudzích zdrojov.Vzhľadom na dôležitosť vrodenej imunity lastúrnikov a veľký počet cirkulujúcich fagocytov sme ďalej predpokladali, že aj cudzia ccfDNA je obohatená o cirkulujúce fagocyty, ktoré akumulujú cudziu DNA po požití mikroorganizmov a / alebo bunkových zvyškov.Celkovo naše výsledky ukazujú, že lastúrniková hemolymfa ccfDNA je jedinečným úložiskom molekulárnych informácií a posilňuje ich status sentinelového druhu.
Naše údaje naznačujú, že sekvenovanie a analýza fragmentov ccfDNA hemolymfy odvodených od baktérií môže poskytnúť kľúčové informácie o hostiteľskej bakteriálnej flóre a baktériách prítomných v okolitom morskom ekosystéme.Techniky sekvenovania záberov odhalili sekvencie komenzálnych baktérií A. atra gill, ktoré by boli vynechané, ak by sa použili konvenčné metódy identifikácie 16S rRNA, čiastočne kvôli zaujatosti referenčnej knižnice.V skutočnosti naše použitie údajov LB zozbieraných z M. platensis v rovnakej vrstve mušlí v Kerguelen ukázalo, že zloženie bakteriálnych symbiontov spojených so žiabrami bolo rovnaké pre oba druhy mušlí (obr. S4, doplnkové informácie).Táto podobnosť dvoch geneticky odlišných lastúrnikov môže odrážať zloženie bakteriálnych spoločenstiev v chladných, sírnatých a vulkanických ložiskách Kerguelenu [55, 56, 57, 58].Vyššie hladiny mikroorganizmov redukujúcich síru boli dobre opísané pri zbere mušlí z bioturbovaných pobrežných oblastí [59], ako je pobrežie Port-au-France.Ďalšou možnosťou je, že flóra mušlí môže byť ovplyvnená horizontálnym prenosom [60, 61].Na určenie korelácie medzi morským prostredím, povrchom morského dna a zložením symbiotických baktérií v lastúrach je potrebný ďalší výskum.Tieto štúdie v súčasnosti prebiehajú.
Dĺžka a koncentrácia ccfDNA hemolymfy, jej jednoduché čistenie a vysoká kvalita umožňujúca rýchle sekvenovanie brokovnice sú niektoré z mnohých výhod použitia ccfDNA mušlí na hodnotenie biodiverzity v morských pobrežných ekosystémoch.Tento prístup je účinný najmä pri charakterizácii vírusových spoločenstiev (virómov) v danom ekosystéme [62, 63].Na rozdiel od baktérií, archeí a eukaryotov vírusové genómy neobsahujú fylogeneticky konzervované gény, ako sú sekvencie 16S.Naše výsledky naznačujú, že tekuté biopsie z indikátorových druhov, ako sú mušle, sa môžu použiť na identifikáciu relatívne veľkého počtu fragmentov vírusu ccfDNA, o ktorých je známe, že infikujú hostiteľov, ktorí zvyčajne obývajú pobrežné morské ekosystémy.Patria sem vírusy, o ktorých je známe, že infikujú prvoky, článkonožce, hmyz, rastliny a bakteriálne vírusy (napr. bakteriofágy).Podobná distribúcia sa zistila, keď sme skúmali vírus ccfDNA hemolymfy modrých mušlí (M. platensis) zhromaždených v rovnakej vrstve mušlí v Kerguelen (tabuľka S2, doplnkové informácie).Sekvenovanie ccfDNA pomocou brokovnice je skutočne novým prístupom, ktorý naberá na sile pri štúdiu vírusu ľudí alebo iných druhov [21, 37, 64].Tento prístup je obzvlášť užitočný na štúdium vírusov s dvojvláknovou DNA, pretože medzi všetkými vírusmi s dvojvláknovou DNA, ktoré predstavujú najrozmanitejšiu a najširšiu triedu vírusov v Baltimore, nie je konzervovaný žiadny jediný gén [65].Hoci väčšina týchto vírusov zostáva neklasifikovaná a môžu zahŕňať vírusy z úplne neznámej časti vírusového sveta [66], zistili sme, že virómy a hostiteľské rozsahy lastúrnikov A. atra a M. platensis patria medzi tieto dva druhy.podobne (pozri obrázok S3, dodatočné informácie).Táto podobnosť nie je prekvapujúca, pretože môže odrážať nedostatok selektivity pri prijímaní DNA prítomnej v prostredí.Na charakterizáciu RNA virómu sú v súčasnosti potrebné budúce štúdie využívajúce purifikovanú RNA.
V našej štúdii sme použili veľmi rigorózny kanál upravený z práce Kowarského a kolegov [37], ktorí použili dvojkrokové vymazanie združených čítaní a kontigov pred a po zostavení natívnej ccfDNA, čo viedlo k vysokému podielu nezmapovaných čítaní.Preto nemôžeme vylúčiť, že niektoré z týchto nezmapovaných údajov môžu mať stále svoj vlastný pôvod, predovšetkým preto, že nemáme referenčný genóm pre tento druh mušlí.Tento kanál sme tiež použili, pretože sme sa obávali chimér medzi vlastným a nevlastným čítaním a čítacími dĺžkami generovanými Illumina MiSeq PE75.Ďalším dôvodom väčšiny nezmapovaných údajov je, že veľa morských mikróbov, najmä v odľahlých oblastiach, ako je Kerguelen, nebolo anotovaných.Použili sme Illumina MiSeq PE75 za predpokladu, že dĺžky fragmentov ccfDNA sú podobné ľudskej ccfDNA.Pre budúce štúdie, vzhľadom na naše výsledky, ktoré ukazujú, že hemolymfa ccfDNA má dlhšie hodnoty ako ľudia a/alebo cicavce, odporúčame použiť sekvenčnú platformu vhodnejšiu pre dlhšie fragmenty ccfDNA.Tento postup výrazne uľahčí identifikáciu viacerých indikácií pre hlbšiu analýzu.Získanie v súčasnosti nedostupnej kompletnej sekvencie jadrového genómu A. atra by tiež značne uľahčilo rozlíšenie ccfDNA z vlastných a iných zdrojov.Vzhľadom na to, že náš výskum sa zameral na možnosť aplikácie konceptu tekutej biopsie na lastúrniky, dúfame, že keďže sa tento koncept bude využívať v budúcom výskume, budú vyvinuté nové nástroje a potrubia na zvýšenie potenciálu tejto metódy na štúdium mikrobiálnej diverzity mušlí.morský ekosystém.
Ako neinvazívny klinický biomarker sú zvýšené hladiny ccfDNA v ľudskej plazme spojené s rôznymi chorobami, poškodením tkaniva a stresovými stavmi [67,68,69].Toto zvýšenie je spojené s uvoľnením fragmentov DNA vlastného pôvodu po poškodení tkaniva.Túto problematiku sme riešili pomocou akútneho tepelného stresu, pri ktorom boli mušle krátkodobo vystavené teplote 30 °C.Túto analýzu sme vykonali na troch rôznych typoch mušlí v troch nezávislých experimentoch.Nezistili sme však žiadnu zmenu hladín ccfDNA po akútnom tepelnom strese (pozri obrázok S5, ďalšie informácie).Tento objav môže aspoň čiastočne vysvetliť skutočnosť, že mušle majú polootvorený obehový systém a vďaka svojej vysokej filtračnej aktivite akumulujú veľké množstvo cudzej DNA.Na druhej strane mušle, podobne ako mnohé bezstavovce, môžu byť odolnejšie voči poškodeniu tkaniva vyvolanému stresom, čím sa obmedzuje uvoľňovanie ccfDNA v ich hemolymfe [70, 71].
K dnešnému dňu sa analýza biodiverzity DNA vo vodných ekosystémoch zameriavala najmä na metabarkódovanie environmentálnej DNA (eDNA).Táto metóda je však zvyčajne obmedzená pri analýze biodiverzity, keď sa používajú priméry.Použitie brokovnicového sekvenovania obchádza obmedzenia PCR a neobjektívny výber súborov primérov.Naša metóda je teda v istom zmysle bližšia nedávno používanej vysokovýkonnej sekvenačnej metóde eDNA Shotgun, ktorá je schopná priamo sekvenovať fragmentovanú DNA a analyzovať takmer všetky organizmy [72, 73].Existuje však niekoľko základných problémov, ktoré odlišujú LB od štandardných metód eDNA.Samozrejme, hlavným rozdielom medzi eDNA a LB je použitie prirodzených hostiteľov filtra.Bolo hlásené použitie morských druhov, ako sú huby a lastúrniky (Dresseina spp.) ako prirodzeného filtra na štúdium eDNA [74, 75].Štúdia Dreissena však využívala tkanivové biopsie, z ktorých bola extrahovaná DNA.Analýza ccfDNA z LB nevyžaduje biopsiu tkaniva, špecializované a niekedy drahé vybavenie a logistiku spojenú s eDNA alebo biopsiou tkaniva.V skutočnosti sme nedávno uviedli, že ccfDNA z LB možno uchovávať a analyzovať s podporou FTA bez udržiavania chladiaceho reťazca, čo je hlavnou výzvou pre výskum v odľahlých oblastiach [76].Extrakcia ccfDNA z tekutých biopsií je tiež jednoduchá a poskytuje vysokokvalitnú DNA na sekvenovanie brokovnicou a analýzu PCR.Je to veľká výhoda vzhľadom na niektoré technické obmedzenia spojené s analýzou eDNA [77].Jednoduchosť a nízka cena metódy odberu vzoriek je mimoriadne vhodná aj pre dlhodobé monitorovacie programy.Okrem vysokej filtračnej schopnosti je ďalšou známou vlastnosťou lastúrnikov chemické mukopolysacharidové zloženie ich hlienu, ktoré podporuje vstrebávanie vírusov [78, 79].Vďaka tomu sú lastúrniky ideálnym prírodným filtrom na charakterizáciu biodiverzity a vplyvu klimatických zmien v danom vodnom ekosystéme.Hoci prítomnosť fragmentov DNA odvodených od hostiteľa možno považovať za obmedzenie metódy v porovnaní s eDNA, náklady spojené s takouto natívnou ccfDNA v porovnaní s eDNA sú súčasne pochopiteľné pre obrovské množstvo informácií dostupných pre zdravotné štúdie.offsetový hostiteľ.To zahŕňa prítomnosť vírusových sekvencií integrovaných do genómu hostiteľského hostiteľa.Toto je obzvlášť dôležité pre lastúrniky, vzhľadom na prítomnosť horizontálne prenášaných leukemických retrovírusov u lastúrnikov [80, 81].Ďalšou výhodou LB oproti eDNA je, že využíva fagocytárnu aktivitu cirkulujúcich krviniek v hemolymfe, ktorá pohlcuje mikroorganizmy (a ich genómy).Fagocytóza je hlavnou funkciou krvných buniek lastúrnikov [82].Nakoniec metóda využíva vysokú filtračnú kapacitu mušlí (priemerne 1,5 l/h morskej vody) a dvojdňovú cirkuláciu, ktoré zvyšujú premiešavanie rôznych vrstiev morskej vody, čo umožňuje zachytávanie heterológnej eDNA.[83, 84].Analýza ccfDNA mušlí je teda zaujímavou cestou vzhľadom na nutričné, ekonomické a environmentálne vplyvy mušlí.Podobne ako analýza LB odobratých od ľudí, táto metóda tiež otvára možnosť merania genetických a epigenetických zmien v hostiteľskej DNA v reakcii na exogénne látky.Napríklad možno uvažovať o technológiách sekvenovania tretej generácie na vykonanie metylačnej analýzy v celom genóme v natívnej ccfDNA pomocou sekvenovania nanopórov.Tento proces by mal byť uľahčený skutočnosťou, že dĺžka fragmentov ccfDNA mušlí je ideálne kompatibilná so sekvenčnými platformami s dlhým čítaním, ktoré umožňujú analýzu metylácie DNA v celom genóme z jedného sekvenčného cyklu bez potreby chemických transformácií.85,86] Toto je zaujímavá možnosť, pretože sa ukázalo, že vzory metylácie DNA odrážajú reakciu na stres prostredia a pretrvávajú počas mnohých generácií.Preto môže poskytnúť cenný pohľad na základné mechanizmy, ktorými sa riadi reakcia po vystavení klimatickým zmenám alebo znečisťujúcim látkam [87].Použitie LB však nie je bez obmedzení.Netreba dodávať, že si to vyžaduje prítomnosť indikačných druhov v ekosystéme.Ako už bolo spomenuté vyššie, použitie LB na posúdenie biodiverzity daného ekosystému si vyžaduje aj prísny bioinformatický kanál, ktorý zohľadňuje prítomnosť fragmentov DNA zo zdroja.Ďalším veľkým problémom je dostupnosť referenčných genómov pre morské druhy.Dúfame, že iniciatívy ako Marine Mammal Genomes Project a nedávno založený projekt Fish10k [88] uľahčia takúto analýzu v budúcnosti.Aplikácia konceptu LB na morské organizmy kŕmiace filtrom je tiež kompatibilná s najnovšími pokrokmi v technológii sekvenovania, vďaka čomu je vhodná na vývoj multi-ohmových biomarkerov, ktoré poskytujú dôležité informácie o zdraví morských biotopov v reakcii na environmentálny stres.
Údaje o sekvenovaní genómu boli uložené v NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Vplyv klimatických zmien na morský život a ekosystémy.Cole Biology.2009;19: P602 – P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, a kol.Zvážte kombinované vplyvy zmeny klímy a iných miestnych stresorov na morské prostredie.všeobecné vedecké prostredie.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P a kol.).Veda prvého marca.2020;7:48.
Seront L, Nicastro ČR, Zardi GI, Goberville E. Znížená tolerancia tepla v podmienkach opakovaného tepelného stresu vysvetľuje vysokú letnú úmrtnosť mušlí modrých.Vedecká správa 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER a kol.Nedávne zmeny vo frekvencii, príčinách a rozsahu úhynu zvierat.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, a kol.Hromadnú úmrtnosť Pinna nobilis mohlo spôsobiť viacero druhovo nešpecifických patogénov.Život.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potenciálny vplyv zmeny klímy na arktické zoonotické choroby.Int J Cirkumpolárne zdravie.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. a kol.Modré mušle (Mytilus edulis spp.) ako signálne organizmy pri monitorovaní znečistenia pobrežia: prehľad.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrácia tekutej biopsie pri liečbe rakoviny.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, a kol.Zrenie tekutej biopsie: Umožňuje cirkuláciu nádorovej DNA.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleové kyseliny v ľudskej plazme.Zápisy zo stretnutí dcérskych spoločností Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nová úloha pre bezbunkovú DNA ako molekulárny marker na liečbu rakoviny.Kvantifikácia biomolárnej analýzy.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Kvapalná biopsia vstupuje na kliniku – problémy s implementáciou a budúce výzvy.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW a ďalší.Fetálna DNA je prítomná v materskej plazme a sére.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Štúdia priebehu tehotenstva a jeho komplikácií pomocou cirkulujúcej extracelulárnej RNA v krvi žien počas tehotenstva.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Tekutá biopsia: DNA bez darcovských buniek sa používa na detekciu alogénnych lézií v obličkovom štepe.Nat Rev Nephrol.2021;17:591-603.
Juan FC, Lo YM Inovácie v prenatálnej diagnostike: sekvenovanie materského plazmatického genómu.Anna MUDr.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D a kol.Rýchla detekcia patogénov s metagenomickým sekvenovaním novej generácie infikovaných telesných tekutín.Nat Medicine.2021;27:115-24.