Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Nekontrolované krvácanie je jednou z hlavných príčin úmrtí. Dosiahnutie rýchlej hemostázy zabezpečuje prežitie subjektu ako prvá pomoc počas boja, dopravných nehôd a operácií na zníženie úmrtnosti. Nanoporézne vláknom vystužené kompozitné lešenie (NFRCS) odvodené z jednoduchej hemostatickej filmotvornej kompozície (HFFC) ako kontinuálnej fázy môže spustiť a zlepšiť hemostázu. Vývoj NFRCS je založený na dizajne krídla vážky. Štruktúra krídla vážky pozostáva z priečnych a pozdĺžnych krídel a membrány krídel sú navzájom spojené, aby sa zachovala integrita mikroštruktúry. HFFC rovnomerne pokrýva povrch vlákna filmom s nanometrovou hrúbkou a spája náhodne rozloženú hrúbku bavlny (Ct) (disperzná fáza) za vzniku nanoporéznej štruktúry. Kombinácia kontinuálnej a disperznej fázy znižuje náklady na produkt desaťnásobne v porovnaní s komerčne dostupnými produktmi. Modifikované NFRCS (tampóny alebo náramky) sa môžu použiť v rôznych biomedicínskych aplikáciách. Štúdie in vivo dospeli k záveru, že vyvinuté Cp NFRCS spúšťa a zlepšuje proces koagulácie v mieste aplikácie. NFRCS dokáže modulovať mikroprostredie a pôsobiť na bunkovej úrovni vďaka svojej nanoporéznej štruktúre, čo vedie k lepšiemu hojeniu rán v modeli excíznej rany.
Nekontrolované krvácanie počas boja, intraoperačných a núdzových situácií môže predstavovať vážne ohrozenie života zraneného1. Tieto stavy ďalej vedú k celkovému zvýšeniu periférneho cievneho odporu, čo vedie k hemoragickému šoku. Vhodné opatrenia na kontrolu krvácania počas a po operácii sa považujú za potenciálne život ohrozujúce2,3. Poškodenie veľkých ciev vedie k masívnej strate krvi, čo má za následok úmrtnosť ≤ 50 % v boji a 31 % počas operácie1. Masívna strata krvi vedie k zníženiu telesného objemu, čo znižuje srdcový výdaj. Zvýšenie celkového periférneho cievneho odporu a progresívne zhoršenie mikrocirkulácie vedú k hypoxii v orgánoch podporujúcich život. Hemoragický šok sa môže vyskytnúť, ak stav pretrváva bez účinného zásahu1,4,5. Medzi ďalšie komplikácie patrí progresia hypotermie a metabolickej acidózy, ako aj porucha koagulácie, ktorá bráni procesu koagulácie. Závažný hemoragický šok je spojený s vyšším rizikom úmrtia6,7,8. Pri šoku III. stupňa (progresívny) je transfúzia krvi nevyhnutná pre prežitie pacienta počas intraoperačnej a pooperačnej morbidity a mortality. Aby sme prekonali všetky vyššie uvedené život ohrozujúce situácie, vyvinuli sme nanoporézny kompozitný lešenie vystužený vláknami (NFRCS), ktoré využíva minimálnu koncentráciu polyméru (0,5 %) s použitím kombinácie vo vode rozpustných hemostatických polymérov.
Použitím vláknitej výstuže je možné vyvinúť nákladovo efektívne produkty. Náhodne usporiadané vlákna pripomínajú štruktúru krídla vážky, vyváženú horizontálnymi a vertikálnymi pruhmi na krídlach. Priečne a pozdĺžne žily krídla komunikujú s membránou krídla (obr. 1). NFRCS pozostáva zo vystuženého Ct ako systému lešenia s lepšou fyzikálnou a mechanickou pevnosťou (obrázok 1). Vzhľadom na cenovú dostupnosť a remeselné spracovanie chirurgovia uprednostňujú používanie bavlnených nití (Ct) počas operácií a obväzov. Vzhľadom na jeho viacero výhod vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (ktorá prispieva k zlepšeniu hemostatickej aktivity) bol Ct použitý ako kostrový systém NFRCS9,10. Vzhľadom na jeho viacero výhod vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (ktorá prispieva k zlepšeniu hemostatickej aktivity) bol Ct použitý ako kostrový systém NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалле целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовалти в каче системы NFRCS9,10. Preto sa Ct, vzhľadom na jeho mnohé výhody vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (podieľajúcej sa na zvýšenej hemostatickej aktivite), použil ako kostrový systém NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增Ｚ滭血洼Ct滭血洴被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Preto sa Ct, vzhľadom na jeho mnohé výhody vrátane viac ako 90 % kryštalickej celulózy (pomáha zlepšiť hemostatickú aktivitu), použil ako lešenie pre NFRCS9,10.Ct bol povrchovo potiahnutý (pozorovala sa tvorba nanohrubého filmu) a prepojený s hemostatickou filmotvornou kompozíciou (HFFC). HFFC funguje ako matrigel, ktorý drží náhodne umiestnený Ct pohromade. Vyvinutý dizajn prenáša napätie v dispergovanej fáze (výstužné vlákna). Je ťažké získať nanoporézne štruktúry s dobrou mechanickou pevnosťou s použitím minimálnych koncentrácií polymérov. Okrem toho nie je jednoduché prispôsobiť rôzne formy pre rôzne biomedicínske aplikácie.
Obrázok znázorňuje schému návrhu NFRCS založenú na štruktúre krídla vážky (A). Tento obrázok zobrazuje porovnávaciu analógiu štruktúry krídla vážky (pretínajúce sa a pozdĺžne žily krídla sú vzájomne prepojené) a prierezovú mikrofotografiu Cp NFRCS (B). Schematické znázornenie NFRCS.
NFRC boli vyvinuté s použitím HFFC ako kontinuálnej fázy, aby sa riešili vyššie uvedené obmedzenia. HFFC sa skladá z rôznych filmotvorných hemostatických polymérov vrátane chitózanu (ako hlavného hemostatického polyméru) s metylcelulózou (MC), hydroxypropylmetylcelulózou (HPMC 50 cp) a polyvinylalkoholom (PVA) (125 kDa) ako nosným polymérom, ktorý podporuje tvorbu trombov. Pridanie polyvinylpyrolidínu K30 (PVP K30) zlepšilo schopnosť NFRCS absorbovať vlhkosť. Polyetylénglykol 400 (PEG 400) bol pridaný na zlepšenie zosieťovania polymérov vo viazaných polymérnych zmesiach. Na Ct boli aplikované tri rôzne hemostatické zloženia HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC a Cp HFFC), a to chitózan s MC (Cm), chitózan s HPMC (Ch) a chitózan s PVA (Cp). Rôzne charakterizačné štúdie in vitro a in vivo potvrdili hemostatickú aktivitu a aktivitu hojenia rán NFRCS. Kompozitné materiály ponúkané spoločnosťou NFRCS sa dajú použiť na prispôsobenie rôznych foriem lešenia tak, aby spĺňali špecifické potreby.
Okrem toho je možné NFRCS upraviť ako obväz alebo rolku na pokrytie celej poranenej oblasti dolných končatín a iných častí tela. Konkrétne pre poranenia končatín v boji je možné navrhnutý dizajn NFRCS zmeniť na polovicu ruky alebo celú nohu (doplnkový obrázok S11). Z NFRCS je možné vyrobiť náramok s tkanivovým lepidlom, ktorý sa dá použiť na zastavenie krvácania pri ťažkých samovražedných poraneniach zápästia. Naším hlavným cieľom je vyvinúť NFRCS s čo najmenším množstvom polyméru, ktorý je možné dodať veľkej populácii (pod hranicou chudoby) a ktorý je možné umiestniť do lekárničky. Vďaka jednoduchému, efektívnemu a ekonomickému dizajnu je NFRCS prospešný pre miestne komunity a môže mať globálny vplyv.
Chitosan (molekulová hmotnosť 80 kDa) a amarant boli zakúpené od spoločnosti Merck, India. Hydroxypropylmetylcelulóza 50 Cp, polyetylénglykol 400 a metylcelulóza boli zakúpené od spoločnosti Loba Chemie Pvt. LLC, Bombaj. Polyvinylalkohol (molekulová hmotnosť 125 kDa) (hydrolyzovaný 87 – 90 %) bol zakúpený od spoločnosti National Chemicals, Gudžarát. Polyvinylpyrolidín K30 bol zakúpený od spoločnosti Molychem, Bombaj, sterilné tampóny boli zakúpené od spoločnosti Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s vodou Milli Q (systém čistenia vody Direct-Q3, Merck, India) ako nosičom.
NFRCS bol vyvinutý pomocou lyofilizácie11,12. Všetky zloženia HFFC (Tabuľka 1) boli pripravené pomocou mechanického miešadla. Pripravte 0,5 % roztok chitosanu s použitím 1 % kyseliny octovej vo vode za stáleho miešania pri 800 ot./min. na mechanickom miešadle. Presná hmotnosť naplneného polyméru uvedená v tabuľke 1 bola pridaná do roztoku chitosanu a miešaná, kým sa nezískal číry polymérny roztok. Do výslednej zmesi boli pridané PVP K30 a PEG 400 v množstvách uvedených v tabuľke 1 a miešanie pokračovalo, kým sa nezískal číry viskózny polymérny roztok. Výsledný kúpeľ polymérneho roztoku bol sonikovaný počas 60 minút, aby sa z polymérnej zmesi odstránili zachytené vzduchové bubliny. Ako je znázornené na doplnkovom obrázku S1(b), Ct bol rovnomerne rozložený v každej jamke 6-jamkovej platne (formy) doplnenej o 5 ml HFFC.
Šesťjamková platňa bola sonikovaná 60 minút, aby sa dosiahlo rovnomerné zmáčanie a rozloženie HFFC v Ct sieti. Potom bola šesťjamková platňa zmrazená pri teplote -20 °C počas 8 – 12 hodín. Zmrazené platne boli lyofilizované 48 hodín, aby sa získali rôzne formulácie NFRCS. Rovnaký postup sa používa na výrobu rôznych tvarov a štruktúr, ako sú tampóny alebo valcové tampóny, alebo akýchkoľvek iných tvarov pre rôzne aplikácie.
Presne odvážený chitosán (80 kDa) (3 %) sa rozpustí v 1 % kyseline octovej pomocou magnetického miešadla. K výslednému roztoku chitosánu sa pridá 1 % PEG 400 a mieša sa 30 minút. Výsledný roztok sa naleje do štvorcovej alebo obdĺžnikovej nádoby a zmrazí sa pri teplote -80 °C počas 12 hodín. Zmrazené vzorky sa lyofilizujú počas 48 hodín, aby sa získal porézny Cs13.
Vyvinutý NFRCS bol podrobený experimentom s použitím infračervenej spektroskopie s Fourierovou transformáciou (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonsko) na potvrdenie chemickej kompatibility chitosanu s inými polymérmi14,15. FTIR spektrá (šírka spektrálneho rozsahu od 400 do 4000 cm-1) všetkých testovaných vzoriek boli získané vykonaním 32 skenov.
Rýchlosť absorpcie krvi (BAR) pre všetky formulácie bola vyhodnotená pomocou metódy opísanej Chenom a kol. 16 s miernymi úpravami. Vyvinuté NFRK všetkých zložení boli sušené vo vákuovej peci pri teplote 105 °C cez noc, aby sa odstránilo zvyškové rozpúšťadlo. 30 mg NFRCS (počiatočná hmotnosť vzorky – W0) a 30 mg Ct (pozitívna kontrola) bolo umiestnených do samostatných misiek obsahujúcich premix 3,8 % citrátu sodného. Vo vopred určených časových intervaloch, t. j. 5, 10, 20, 30, 40 a 60 sekúnd, boli NFRCS odstránené a ich povrchy boli očistené od neabsorbovanej krvi umiestnením vzoriek na Ct na 30 sekúnd. V každom časovom bode bola zohľadnená konečná hmotnosť krvi absorbovanej NFRCS 16 (W1). Vypočítajte percento BAR pomocou nasledujúceho vzorca:
Čas zrážania krvi (BCT) bol stanovený podľa údajov Wanga a kol. 17. Čas potrebný na zrážanie plnej krvi (krv potkanov vopred zmiešaná s 3,8 % citrátom sodným) v prítomnosti NFRCS bol vypočítaný ako BCT testovanej vzorky. Rôzne zložky NFRCS (30 mg) boli umiestnené do 10 ml liekoviek so skrutkovacím uzáverom a inkubované pri teplote 37 °C. Do liekovky bola pridaná krv (0,5 ml) a 0,3 ml 0,2 M CaCl2 na aktiváciu zrážania krvi. Nakoniec liekovku prevráťte každých 15 sekúnd (až o 180 °), kým sa nevytvorí pevná zrazenina. BCT vzorky sa odhaduje počtom preklopení liekoviek 17, 18. Na základe BCT boli pre ďalšie charakterizačné štúdie vybrané dve optimálne zloženia z NFRCS Cm, Ch a Cp.
BCT zložení Ch NFRCS a Cp NFRCS sa stanovila implementáciou metódy opísanej Li a kol. 19. 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs (pozitívna kontrola) sa umiestnilo do samostatných Petriho misiek (37 °C). Krv obsahujúca 3,8 % citrátu sodného sa zmiešala s 0,2 M CaCl2 v objemovom pomere 10:1, aby sa spustil proces zrážania krvi. Na povrch vzorky sa nanieslo 20 µl zmesi 0,2 M CaCl2 krvi potkanov a umiestnilo sa do prázdnej Petriho misky. Kontrolou bola krv naliata do prázdnych Petriho misiek bez Ct. V pevných intervaloch 0, 3 a 5 minút sa zrážanie zastavilo pridaním 10 ml deionizovanej (DI) vody do vzorky obsahujúcej misku bez narušenia zrazeniny. Nekoagulované erytrocyty (erytrocyty) podliehajú hemolýze v prítomnosti deionizovanej vody a uvoľňujú hemoglobín. Hemoglobín v rôznych časových bodoch (HA(t)) bol meraný pri 540 nm (λmax hemoglobín) pomocou UV-Vis spektrofotometra. Ako referenčný štandard bola použitá absolútna absorpcia hemoglobínu (AH(0)) v 0 minútach z 20 µl krvi v 10 ml deionizovanej vody. Relatívna absorpcia hemoglobínu (RHA) koagulovanej krvi bola vypočítaná z pomeru HA(t)/HA(0) s použitím rovnakej dávky krvi.
Pomocou analyzátora textúry (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) sa stanovili adhézne vlastnosti NFRK k poškodenému tkanivu. Na vnútornú stranu bravčovej kože (bez vrstvy tuku) sa pritlačila valcová miska s otvoreným dnom. Vzorky (Ch NFRCS a Cp NFRCS) sa aplikovali kanylou do valcových foriem, aby sa vytvorila adhézia ku koži ošípanej. Po 3-minútovej inkubácii pri izbovej teplote (RT) (25 °C) sa zaznamenala adhézna sila NFRCS konštantnou rýchlosťou 0,5 mm/s.
Hlavnou vlastnosťou chirurgických sealantov je zvýšenie zrážanlivosti krvi a zároveň zníženie krvných strát. Bezstratová koagulácia v NFRCS bola hodnotená pomocou predtým publikovanej metódy s miernymi úpravami 19. Vyrobte mikrocentrifugačnú skúmavku (2 ml) (vnútorný priemer 10 mm) s otvorom 8 × 5 mm2 na jednej strane centrifugačnej skúmavky (predstavujúcim otvorenú ranu). Na uzavretie otvoru sa použije NFRCS a na utesnenie vonkajších okrajov páska. Do mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej 3,8 % premix citrátu sodného sa pridá 20 µl 0,2 M CaCl2. Po 10 minútach sa mikrocentrifugačné skúmavky vybrali z misiek a zistil sa nárast hmotnosti misiek v dôsledku odtoku krvi z NFRK (n = 3). Strata krvi Ch NFRCS a Cp NFRCS sa porovnali s Cs.
Mokrá integrita NFRCS bola stanovená na základe metódy opísanej Mishra a Chaudhary21 s menšími úpravami. NFRCS sa umiestni do 100 ml Erlenmeyerovej banky s 50 ml vody a mieša sa 60 sekúnd bez vytvorenia vrchnej časti. Vizuálna kontrola a stanovenie priorít vzoriek z hľadiska fyzickej integrity na základe odberu.
Väzbová sila HFFC na Ct bola študovaná s použitím predtým publikovaných metód s menšími úpravami. Integrita povrchového povlaku bola hodnotená vystavením NFRK akustickým vlnám (vonkajší stimul) v prítomnosti vody milliQ (Ct). Vyvinuté NFRCS Ch NFRCS a Cp NFRCS boli umiestnené do kadičky naplnenej vodou a sonikované počas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 30 minút. Po vysušení bol percentuálny rozdiel medzi počiatočnou a konečnou hmotnosťou NFRCS použitý na výpočet percentuálnej straty materiálu (HFFC). BCT in vitro ďalej podporil väzbovú silu alebo stratu povrchových materiálov. Účinnosť väzby HFFC na Ct zabezpečuje koaguláciu krvi a elastický povlak na povrchu Ct22.
Homogenita vyvinutého NFRCS bola určená pomocou BCT vzoriek (30 mg) odobratých z náhodne vybraných všeobecných miest NFRCS. Na určenie súladu s NFRCS postupujte podľa vyššie uvedeného postupu BCT. Blízkosť medzi všetkými piatimi vzorkami zabezpečuje rovnomerné pokrytie povrchu a ukladanie HFFC v sieti Ct.
Nominálna kontaktná plocha krvi (NBCA) bola stanovená podľa predtým publikovaných postupov s niekoľkými úpravami. Krv sa zrážala zovretím 20 µl krvi medzi dva povrchy Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs. Po 1 hodine sa obe časti stentu oddelili a manuálne sa zmerala plocha zrazeniny. Priemerná hodnota z troch opakovaní bola považovaná za NBCA NFRCS19.
Na vyhodnotenie účinnosti NFRCS pri absorpcii vody z vonkajšieho prostredia alebo z miesta poranenia zodpovedného za iniciáciu koagulácie bola použitá analýza dynamickej sorpcie pár (DVS). DVS vyhodnocuje alebo zaznamenáva absorpciu a stratu pár vo vzorke gravimetricky pomocou ultracitlivých váh s hmotnostným rozlíšením ±0,1 µg. Parciálny tlak pár (relatívna vlhkosť) sa generuje elektronickým regulátorom hmotnostného prietoku okolo vzorky zmiešaním nasýtených a suchých nosných plynov. Podľa smerníc Európskeho liekopisu boli vzorky rozdelené do 4 kategórií na základe percenta absorpcie vlhkosti vzorkami (0 – 0,012 % hm./hm. – nehygroskopické, 0,2 – 2 % hm./hm. mierne hygroskopické, 2 – 15 % stredne hygroskopické a > 15 % veľmi hygroskopické)23. Podľa smerníc Európskeho liekopisu boli vzorky rozdelené do 4 kategórií na základe percenta absorpcie vlhkosti vzorkami (0 – 0,012 % hm./hm. – nehygroskopické, 0,2 – 2 % hm./hm. mierne hygroskopické, 2 – 15 % stredne hygroskopické a > 15 % veľmi hygroskopické)23.V súlade s odporúčaniami Európskeho liekopisu boli vzorky rozdelené do 4 kategórií v závislosti od percenta absorpcie vlhkosti (0 – 0,012 % hm./hm. – nehygroskopické, 0,2 – 2 % hm./hm. mierne hygroskopické, 2 – pätnásť %).% умеренно гигроскопичен и > 15 % очень гигроскопичен)23. % mierne hygroskopických a > 15 % veľmi hygroskopických)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012 % w/非吸湿性、0,2-2 % t/t 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 刻12% 爻02% 的W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸3㹿）2V súlade s odporúčaniami Európskeho liekopisu sú vzorky rozdelené do 4 tried v závislosti od percenta absorbovanej vlhkosti vzorkou (0 – 0,012 % hmotnostných – nehygroskopické, 0,2 – 2 % hmotnostné mierne hygroskopické, 2 – 15 % hmotnostných).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % mierne hygroskopické, > 15 % veľmi hygroskopické) 23.Hygroskopická účinnosť NFCS X NFCS a TsN NFCS bola stanovená na analyzátore DVS TA TGA Q5000 SA. Počas tohto procesu boli získané hodnoty času chodu, relatívnej vlhkosti (RH) a hmotnosti vzorky v reálnom čase pri teplote 25 °C24. Obsah vlhkosti sa vypočíta presnou hmotnostnou analýzou NFRCS pomocou nasledujúcej rovnice:
MC je vlhkosť NFRCS. m1 – suchá hmotnosť NSAID. m2 je hmotnosť NFRCS v reálnom čase pri danej relatívnej vlhkosti.
Celková povrchová plocha bola odhadnutá pomocou experimentu s adsorpciou dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri teplote 25 °C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr). Celková povrchová plocha bola odhadnutá pomocou experimentu s adsorpciou dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri teplote 25 °C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адисиорбиоц азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Celková povrchová plocha bola odhadnutá pomocou experimentu s adsorpciou dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri teplote 25 °C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов потиброадо адо жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 тор). Celková povrchová plocha bola odhadnutá pomocou experimentov s adsorpciou dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdňovaní vzoriek počas 10 hodín pri teplote 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Celková povrchová plocha, objem pórov a veľkosť pórov NFRCS boli stanovené pomocou prístroja Quantachrome od spoločnosti NOVA 1000e, Rakúsko, s použitím softvéru RS 232.
Z plnej krvi pripravte 5 % červených krviniek (s fyziologickým roztokom ako riedidlom). Potom preneste alikvotnú časť HFFC (0,25 ml) a 5 % hmotnosti červených krviniek (0,1 ml) na 96-jamkovú platňu. Zmes inkubujte pri teplote 37 °C počas 40 minút. Zmes červených krviniek a séra sa považovala za pozitívnu kontrolu a zmes fyziologického roztoku a červených krviniek za negatívnu kontrolu. Hemaglutinácia sa stanovila podľa Stajitzkyho stupnice. Navrhované stupnice sú nasledovné: + + + + husté granulované agregáty; + + + hladké spodné vankúšiky so zaoblenými okrajmi; + + hladké spodné vankúšiky s roztrhnutými okrajmi; + úzke červené krúžky okolo okrajov hladkých vankúšikov; – (negatívne) diskrétne červené tlačidlo 12 v strede spodnej jamky.
Hemokompatibilita NFRCS bola študovaná podľa metódy Medzinárodnej organizácie pre normalizáciu (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Gravimetrická metóda opísaná Singhem a kol. Boli vykonané menšie úpravy na posúdenie tvorby trombov v prítomnosti alebo na povrchu NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS bolo inkubovaných vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) počas 24 hodín pri teplote 37 °C. Po 24 hodinách bol PBS odstránený a NFRCS bol ošetrený 2 ml krvi obsahujúcej 3,8 % citrátu sodného. Na povrch NFRCS sa k inkubovaným vzorkám pridalo 0,04 ml 0,1 M CaCl2. Po 45 minútach sa pridalo 5 ml destilovanej vody na zastavenie koagulácie. Zrazená krv na povrchu NFRK bola ošetrená 36 – 38 % roztokom formaldehydu. Zrazeniny fixované formaldehydom boli vysušené a odvážené. Percento trombózy sa odhadlo výpočtom hmotnosti pohára bez krvi a vzorky (negatívna kontrola) a pohára s krvou (pozitívna kontrola).
Ako počiatočné potvrdenie boli vzorky vizualizované pod optickým mikroskopom, aby sa zistila schopnosť povrchového povlaku HFFC, prepojenia Ct a siete Ct tvoriť póry. Tenké rezy Ch a Cp z NFRCS boli orezané skalpelom. Výsledný rez bol umiestnený na podložné sklíčko, prikrytý krycím sklíčkom a okraje boli zafixované lepidlom. Pripravené sklíčka boli prezreté pod optickým mikroskopom a fotografie boli zhotovené pri rôznych zväčšeniach.
Depozícia polymérov v Ct sieťach bola vizualizovaná pomocou fluorescenčnej mikroskopie na základe metódy opísanej Riceom a kol.29. Zloženie HFFC použité na formuláciu bolo zmiešané s fluorescenčným farbivom (amarant) a NFRCS (Ch a Cp) boli pripravené podľa vyššie uvedeného postupu. Zloženie HFFC použité na formuláciu bolo zmiešané s fluorescenčným farbivom (amarant) a NFRCS (Ch a Cp) boli pripravené podľa vyššie uvedeného postupu.Zloženie HFFC použité na formuláciu bolo zmiešané s fluorescenčným farbivom (amarant) a NFRCS (Ch a Cp) bol získaný podľa predtým uvedenej metódy.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前提到到的方椼到的方椼Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前提到到的方椼到的方椼Cp).Zloženie HFFC použité vo formulácii bolo zmiešané s fluorescenčným farbivom (Amaranth) a prijaté NFRCS (Ch a Cp), ako bolo uvedené vyššie.Z získaných vzoriek boli narezané tenké rezy NFRK, umiestnené na podložné sklíčka a zakryté krycími sklíčkami. Pripravené sklíčka pozorujte pod fluorescenčným mikroskopom s použitím zeleného filtra (310 – 380 nm). Snímky boli zhotovené pri 4-násobnom zväčšení, aby sa pochopili vzťahy Ct a nadmerná depozícia polymérov v sieti Ct.
Povrchová topografia NFRCS Ch a Cp bola stanovená pomocou atómového silového mikroskopu (AFM) s ultra ostrou konzolou TESP v režime poklepávania: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Drsnosť povrchu bola stanovená pomocou strednej kvadratickej hodnoty (RMS) pomocou softvéru (Scanning Probe Image Processor). Rôzne polohy NFRCS boli vykreslené na 3D snímkach, aby sa skontrolovala rovnomernosť povrchu. Štandardná odchýlka skóre pre danú oblasť je definovaná ako drsnosť povrchu. Na kvantifikáciu drsnosti povrchu NFRCS31 bola použitá rovnica RMS.
Štúdie založené na FESEM sa uskutočnili s použitím FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, s cieľom pochopiť povrchovú morfológiu Ch NFRCS a Cp NFRCS, ktoré vykazovali lepšiu BCT ako Cm NFRCS. Štúdia FESEM sa uskutočnila podľa metódy opísanej Zhao et al.32 s menšími úpravami. NFRCS 20 až 30 mg Ch NFRCS a Cp NFRCS sa vopred zmiešalo s 20 µl 3,8 % citrátu sodného vopred zmiešaného s krvou potkana. Do vzoriek ošetrených krvou sa pridalo 20 μl 0,2 M CaCl2 na iniciáciu koagulácie a vzorky sa inkubovali pri izbovej teplote počas 10 minút. Okrem toho sa prebytočné erytrocyty odstránili z povrchu NFRCS opláchnutím fyziologickým roztokom.
Následné vzorky boli ošetrené 0,1 % glutaraldehydom a potom sušené v teplovzdušnej peci pri teplote 37 °C, aby sa odstránila vlhkosť. Vysušené vzorky boli potiahnuté a analyzované 32. Ďalšie snímky získané počas analýzy boli tvorba zrazeniny na povrchu jednotlivých bavlnených vlákien, ukladanie polyméru medzi Ct, morfológia (tvar) erytrocytov, integrita zrazeniny a morfológia erytrocytov v prítomnosti NFRCS. Neošetrené oblasti NFRCS a oblasti NFRCS ošetrené Ch a Cp inkubované s krvou boli skenované na prítomnosť elementárnych iónov (sodík, draslík, dusík, vápnik, horčík, zinok, meď a selén) 33. Porovnajte percentá elementárnych iónov medzi ošetrenými a neošetrenými vzorkami, aby ste pochopili akumuláciu elementárnych iónov počas tvorby zrazeniny a jej homogenitu.
Hrúbka povrchovej vrstvy Cp HFFC na povrchu Ct bola stanovená pomocou FESEM. Prierezy Cp NFRCS boli vyrezané z rámu a nanesené naprašovaním. Výsledné vzorky naprašovania boli pozorované pomocou FESEM a bola zmeraná hrúbka povrchovej vrstvy 34, 35, 36.
Röntgenové mikro-CT poskytuje 3D nedeštruktívne zobrazovanie s vysokým rozlíšením a umožňuje študovať vnútorné štrukturálne usporiadanie NFRK. Mikro-CT využíva röntgenový lúč prechádzajúci vzorkou na zaznamenanie lokálneho lineárneho koeficientu útlmu röntgenových lúčov vo vzorke, čo pomáha získať morfologické informácie. Vnútorné umiestnenie Ct v Cp NFRCS a Cp NFRCS ošetrených krvou bolo skúmané pomocou mikro-CT, aby sa pochopila účinnosť absorpcie a zrážanlivosť krvi v prítomnosti NFRCS37,38,39. 3D štruktúry vzoriek Cp NFRCS ošetrených a neošetrených krvi boli rekonštruované pomocou mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Nemecko). Pomocou softvéru VG STUDIO-MAX verzie 2.2 bolo zhotovených niekoľko röntgenových snímok z rôznych uhlov (ideálne s 360° pokrytím) na vytvorenie 3D snímok pre NFRCS. Zozbierané projekčné údaje boli rekonštruované do 3D volumetrických snímok pomocou zodpovedajúceho jednoduchého softvéru 3D ScanIP Academic.
Okrem toho, aby sa pochopilo rozloženie zrazeniny, do NFRCS sa pridalo 20 µl vopred zmiešanej citrátovej krvi a 20 µl 0,2 M CaCl2, aby sa iniciovalo zrážanie krvi. Pripravené vzorky sa nechali vytvrdnúť. Povrch NFRK sa ošetril 0,5 % glutaraldehydom a sušil sa v teplovzdušnej peci pri teplote 30 – 40 °C počas 30 minút. Krvná zrazenina vytvorená na NFRCS sa naskenovala, rekonštruovala a vizualizoval sa jej 3D obraz.
Antibakteriálne testy boli vykonané na Cp NFRCS (najlepšie porovnateľné s Ch NFRCS) s použitím predtým opísanej metódy s menšími úpravami. Antibakteriálna aktivita Cp NFRCS a Cp HFFC bola stanovená s použitím troch rôznych testovacích mikroorganizmov [S. aureus (grampozitívne baktérie), E. coli (gramnegatívne baktérie) a biela Candida (C. albicans)] rastúcich na agare v Petriho miskách v inkubátore. Rovnomerne naočkujte 50 ml zriedenej suspenzie bakteriálnej kultúry s koncentráciou 105-106 CFU ml-1 na agarové médium. Médium nalejte do Petriho misky a nechajte stuhnúť. Na povrchu agarovej platne boli vytvorené jamky na naplnenie HFFC (3 jamky pre HFFC a 1 pre negatívnu kontrolu). Do 3 jamiek pridajte 200 µl HFFC a do 4. jamky 200 µl PBS s pH 7,4. Na druhú stranu Petriho misky umiestnite 12 mm Cp NFRCS disk na stuhnutý agar a navlhčite ho PBS (pH 7,4). Tablety ciprofloxacínu, ampicilínu a flukonazolu sa považujú za referenčné štandardy pre Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans. Zónu inhibície zmerajte manuálne a urobte jej digitálny obraz.
Po schválení etickou komisiou inštitúcie sa štúdia uskutočnila na Kasturba Medical College of Education and Research v Manipale v Karnátake v južnej Indii. Experimentálny protokol in vitro TEG bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnou etickou komisiou Kasturba Medical College v Manipale v Karnátake (IEC: 674/2020). Subjekty boli vybraní z dobrovoľných darcov krvi (vo veku 18 až 55 rokov) z nemocničnej krvnej banky. Okrem toho bol od dobrovoľníkov získaný formulár informovaného súhlasu s odberom vzoriek krvi. Natívny TEG (N-TEG) ​​bol použitý na štúdium účinku formulácie Cp HFFC na plnú krv vopred zmiešanú s citrátom sodným. N-TEG je všeobecne uznávaný pre svoju úlohu v resuscitácii v mieste poskytovania starostlivosti, čo spôsobuje problémy lekárom kvôli možnému klinicky významnému oneskoreniu výsledkov (bežné koagulačné testy). Analýza N-TEG bola vykonaná s použitím plnej krvi. Od všetkých účastníkov bol získaný informovaný súhlas a podrobná anamnéza. Štúdia nezahŕňala účastníkov s hemostatickými alebo trombotickými komplikáciami, ako je tehotenstvo/pôrod alebo ochorenie pečene. Zo štúdie boli vylúčení aj subjekty užívajúce lieky, ktoré ovplyvňujú koagulačnú kaskádu. Všetkým účastníkom boli vykonané základné laboratórne testy (hemoglobín, protrombínový čas, aktivovaný tromboplastín a počet krvných doštičiek) podľa štandardných postupov. N-TEG určuje viskoelasticitu krvnej zrazeniny, počiatočnú štruktúru zrazeniny, interakciu častíc, spevnenie zrazeniny a lýzu zrazeniny. Analýza N-TEG poskytuje grafické a numerické údaje o kolektívnych účinkoch niekoľkých bunkových prvkov a plazmy. Analýza N-TEG sa vykonala na dvoch rôznych objemoch Cp HFFC (10 µl a 50 µl). V dôsledku toho sa k 10 μl Cp HFFC pridal 1 ml plnej krvi s kyselinou citrónovou. Do misky s TEG obsahujúcej 20 µl 0,2 M CaCl2 sa pridal 1 ml (Cp HFFC + citrátovaná krv) a 340 µl zmiešanej krvi. Následne boli TEG misky vložené do prístroja TEG® 5000, US, aby sa zmerali R, K, uhol alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY v 30 % vzoriek krvi v prítomnosti Cp HFFC41.
Protokol štúdie in vivo bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnou komisiou pre etiku zvierat (IAEC), Lekárskej fakulty Kasturba, Vysokoškolského inštitútu Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Všetky experimenty na zvieratách boli vykonané v súlade s odporúčaniami Výboru pre kontrolu a dohľad nad experimentmi na zvieratách (CPCSEA). Všetky štúdie NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) boli vykonané na samiciach potkanov Wistar (s hmotnosťou 200 až 250 g). Všetky zvieratá boli aklimatizované pri teplote 24 – 26 °C, zvieratá mali voľný prístup k štandardnej potrave a vode ad libitum. Všetky zvieratá boli náhodne rozdelené do rôznych skupín, pričom každá skupina pozostávala z troch zvierat. Všetky štúdie boli vykonané v súlade so Správou o experimentoch in vivo so štúdiami na zvieratách 43. Pred štúdiou boli zvieratá anestetizované intraperitoneálnym (ip) podaním zmesi 20 – 50 mg ketamínu (na 1 kg telesnej hmotnosti) a 2 – 10 mg xylazínu (na 1 kg telesnej hmotnosti). Po štúdii bol objem krvácania vypočítaný vyhodnotením rozdielu medzi počiatočnou a konečnou hmotnosťou vzoriek, pričom priemerná hodnota získaná z troch testov bola braná ako objem krvácania vzorky.
Na pochopenie potenciálu NFRCS modulovať krvácanie pri traume, boji alebo dopravnej nehode (model zranenia) bol implementovaný model amputácie chvosta potkana. 50 % chvosta sa odreže skalpelom a na 15 sekúnd sa umiestni na vzduch, aby sa zabezpečilo normálne krvácanie. Okrem toho sa na chvost potkana tlakom umiestnili testovacie vzorky (Ct, Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS). U testovaných vzoriek bolo hlásené krvácanie a PCT (n = 3)17,45.
Účinnosť kontroly tlaku NFRCS v boji bola skúmaná na modeli povrchovej femorálnej artérie. Femorálna artéria bola odkrytá, prepichnutá trokarom 24G a krvácanie bolo vykonané do 15 sekúnd. Po zistení nekontrolovaného krvácania bola testovaná vzorka umiestnená na miesto vpichu s aplikovaným tlakom. Ihneď po aplikácii testovanej vzorky bol zaznamenaný čas zrážania a hemostatická účinnosť bola sledovaná počas nasledujúcich 5 minút. Rovnaký postup bol opakovaný s Cs a Ct46.
Dowling a kol.47 navrhli model poškodenia pečene na posúdenie hemostatického potenciálu hemostatických materiálov v kontexte intraoperačného krvácania. BCT sa zaznamenala pre vzorky Ct (negatívna kontrola), Cs framework (pozitívna kontrola), Ch NFRCS a Cp NFRCS. Suprahepatálna vena cava potkana sa odkryla vykonaním mediánovej laparotómie. Potom sa distálna časť ľavého laloku vyrezala nožnicami. Skalpelom sa urobil rez do pečene a nechal sa niekoľko sekúnd krvácať. Presne odvážené testovacie vzorky Ch NFRCS a Cp NFRCS sa umiestnili na poškodený povrch bez akéhokoľvek pozitívneho tlaku a zaznamenala sa BCT. Kontrolná skupina (Ct) potom aplikovala tlak a následne Cs 30 s47 bez toho, aby sa poranenie prerušilo.
In vivo testy hojenia rán sa uskutočnili s použitím modelu excíznej rany na vyhodnotenie vlastností hojenia rán vyvinutých NFRCS na báze polymérov. Modely excíznych rán boli vybrané a vykonané podľa predtým publikovaných metód s menšími úpravami19,32,48. Všetky zvieratá boli anestetizované podľa predtým opísaného postupu. Na vytvorenie kruhového hlbokého rezu v koži chrbta sa použil bioptický razník (12 mm). Pripravené miesta rán boli ošetrované Cs (pozitívna kontrola), Ct (s vedomím, že vatové tampóny narúšajú hojenie), Ch NFRCS a Cp NFRCS (experimentálna skupina) a negatívna kontrola bez akejkoľvek liečby. Každý deň štúdie sa u všetkých potkanov merala plocha rany. Pomocou digitálneho fotoaparátu sa odfotila oblasť rany a naniesol sa nový obväz. Percento uzavretia rany sa meralo podľa nasledujúceho vzorca:
Na základe percenta uzavretia rany na 12. deň štúdie bola z potkanov najlepšej skupiny vyrezaná koža ((Cp NFRCS) a kontrolná skupina) a študovaná farbením H&E a Massonovým trichrómovým farbením. Na základe percenta uzavretia rany na 12. deň štúdie bola z potkanov najlepšej skupiny vyrezaná koža ((Cp NFRCS) a kontrolná skupina) a študovaná farbením H&E a Massonovým trichrómovým farbením.Na základe percenta uzavretia rany na 12. deň štúdie bola potkanom najlepšej skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolnej skupiny) odobratá koža a vyšetrená farbením hematoxylín-eozínom a Massonovým trichrómom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Potkany v najlepšej skupine ((Cp NFRCS) a kontrolnej skupine) boli vyrezané na farbenie hematoxylínom-eozínom a farbenie Massonovým trichrómom na základe percenta uzavretia rany na 12. deň štúdie.Implementovaný postup farbenia sa uskutočnil podľa predtým opísaných metód49,50. Stručne povedané, po fixácii v 10 % formalíne boli vzorky dehydratované pomocou série odstupňovaných alkoholov. Na získanie tenkých rezov (hrúbky 5 µm) vyrezaného tkaniva sa použil mikrotóm. Tenké sériové rezy kontrolných vzoriek a Cp NFRCS boli ošetrené hematoxylínom a eozínom na štúdium histopatologických zmien. Na detekciu tvorby kolagénových fibríl sa použilo Massonovo trichrómové farbenie. Získané výsledky boli slepo študované patológmi.
Stabilita vzoriek Cp NFRCS bola študovaná pri izbovej teplote (25 °C ± 2 °C/60 % relatívnej vlhkosti ± 5 %) počas 12 mesiacov51. Cp NFRCS (zmena farby povrchu a mikrobiálny rast) bola vizuálne skontrolovaná a testovaná na odolnosť voči opotrebovaniu v prehybe a BCT podľa vyššie uvedených metód uvedených v časti Materiály a metódy.
Škálovateľnosť a reprodukovateľnosť Cp NFRCS sa skúmala prípravou Cp NFRCS s rozmermi 15 × 15 cm2. Okrem toho sa z rôznych frakcií Cp NFRCS vyrezali vzorky s hmotnosťou 30 mg (n = 5) a BCT študovaných vzoriek sa vyhodnotil podľa postupu opísaného vyššie v časti Metódy.
Pokúsili sme sa vyvinúť rôzne tvary a štruktúry s použitím kompozícií Cp NFRCS pre rôzne biomedicínske aplikácie. Medzi takéto tvary alebo konfigurácie patria kužeľovité tampóny na krvácanie z nosa, zubné zákroky a valcové tampóny na vaginálne krvácanie.
Všetky súbory údajov sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka a boli analyzované pomocou ANOVA s použitím Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA), po čom nasledoval Bonferroniho test viacnásobného porovnania (*p<0,05).
Všetky postupy vykonané v štúdiách na ľuďoch boli v súlade so štandardmi inštitútu a Národnej rady pre výskum, ako aj s Helsinskou deklaráciou z roku 1964 a jej následnými dodatkami alebo podobnými etickými štandardmi. Všetci účastníci boli informovaní o charakteristikách štúdie a jej dobrovoľnej povahe. Údaje o účastníkoch zostávajú po zbere dôverné. Experimentálny protokol in vitro TEG bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnou etickou komisiou Lekárskej fakulty Kasturba v Manipale v Karnátake (IEC: 674/2020). Dobrovoľníci podpísali informovaný súhlas s odberom vzoriek krvi.
Všetky postupy vykonané v štúdiách na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi Lekárskej fakulty Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Všetky navrhnuté experimenty na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi Výboru pre kontrolu a dohľad nad experimentmi na zvieratách (CPCSEA). Všetci autori sa riadia pokynmi ARRIVE.
FTIR spektrá všetkých NFRCS boli analyzované a porovnané so spektrom chitosanu znázorneným na obrázku 2A. Charakteristické spektrálne píky chitosanu (zaznamenané) pri 3437 cm-1 (natiahnutie OH a NH, prekrytie), 2945 a 2897 cm-1 (natiahnutie CH), 1660 cm-1 (deformácia NH2), 1589 cm-1 (ohyb N–H), 1157 cm-1 (natiahnutie mostíka O-), 1067 cm-1 (natiahnutie C–O, sekundárny hydroxyl), 993 cm-1 (natiahnutie CO, Bo-OH) 52,53,54. Doplnková tabuľka S1 zobrazuje hodnoty absorpčného spektra FTIR NFRCS pre chitosan (reportér), čistý chitosan, Cm, Ch a Cp. FTIR spektrá všetkých NFRCS (Cm, Ch a Cp) vykazovali rovnaké charakteristické absorpčné pásy ako čistý chitosan bez akýchkoľvek významných zmien (obr. 2A). Výsledky FTIR potvrdili absenciu chemických alebo fyzikálnych interakcií medzi polymérmi použitými na vývoj NFRCS, čo naznačuje, že použité polyméry sú inertné.
In vitro charakterizácia Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs. (A) predstavuje kombinované FTIR spektrá zloženia chitosanu a Cm NFRCS, Ch NFRCS a Cp NFRCS pod tlakom. (B) a) Rýchlosť absorpcie Cm, Ch, Cp a Cg v plnej krvi pre NFRCS (n = 3); Vzorky Ct vykazovali vyššiu BAR, pretože vatový tampón má vyššiu absorpčnú účinnosť; b) Krv po absorpcii krvi. Ilustrácia absorbovanej vzorky. Grafické znázornenie BCT testovanej vzorky C (Cp NFRCS mal najlepšiu BCT (15 s, n = 3)). Údaje v C, D, E a G boli zobrazené ako priemer ± SD a chybové úsečky predstavujú SD, ***p < 0,0001. Údaje v C, D, E a G boli zobrazené ako priemer ± SD a chybové úsečky predstavujú SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E a G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки поЎтрейшностреднее стандартное отклонение, ***p <0,0001. Údaje v C, D, E a G sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka a chybové úsečky predstavujú štandardnú odchýlku, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E a G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрере представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Údaje v C, D, E a G sú zobrazené ako priemer ± štandardná odchýlka, chybové úsečky predstavujú štandardnú odchýlku, ***p<0,0001.