Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Nekontrolované krvácanie je jednou z hlavných príčin smrti.Dosiahnutie rýchlej hemostázy zabezpečuje prežitie subjektu ako prvá pomoc počas boja, dopravných nehôd a operácií na zníženie úmrtnosti.Nanoporézne vláknom vystužené kompozitné lešenie (NFRCS) odvodené z jednoduchej hemostatickej filmotvornej kompozície (HFFC) ako kontinuálna fáza môže spustiť a zvýšiť hemostázu.Vývoj NFRCS je založený na návrhu krídla vážky.Štruktúra krídel vážky pozostáva z priečnych a pozdĺžnych krídel a krídlové membrány sú navzájom spojené, aby sa zachovala integrita mikroštruktúry.HFFC rovnomerne pokrýva povrch vlákna filmom s hrúbkou nanometrov a spája náhodne rozloženú hrúbku bavlny (Ct) (dispergovaná fáza) za vzniku nanoporéznej štruktúry.Kombinácia kontinuálnych a dispergovaných fáz znižuje cenu produktu desaťnásobne v porovnaní s komerčne dostupnými produktmi.Modifikované NFRCS (tampóny alebo náramky) možno použiť v rôznych biomedicínskych aplikáciách.Štúdie in vivo dospeli k záveru, že vyvinutý Cp NFRCS spúšťa a zvyšuje koagulačný proces v mieste aplikácie.NFRCS môže modulovať mikroprostredie a pôsobiť na bunkovej úrovni vďaka svojej nanoporéznej štruktúre, čo vedie k lepšiemu hojeniu rán v modeli excíznych rán.
Nekontrolované krvácanie počas bojových, intraoperačných a núdzových situácií môže predstavovať vážnu hrozbu pre život ranených1.Tieto stavy ďalej vedú k celkovému zvýšeniu periférnej vaskulárnej rezistencie, čo vedie ku hemoragickému šoku.Vhodné opatrenia na kontrolu krvácania počas a po operácii sa považujú za potenciálne život ohrozujúce2,3.Poškodenie veľkých ciev vedie k masívnej strate krvi, čo má za následok úmrtnosť ≤ 50 % v boji a 31 % počas operácie1.Masívna strata krvi vedie k zníženiu objemu tela, čo znižuje srdcový výdaj.Zvýšenie celkovej periférnej vaskulárnej rezistencie a progresívne zhoršenie mikrocirkulácie vedie k hypoxii životne dôležitých orgánov.Hemoragický šok môže nastať, ak stav pokračuje bez účinnej intervencie1,4,5.Medzi ďalšie komplikácie patrí progresia hypotermie a metabolickej acidózy, ako aj porucha koagulácie, ktorá bráni procesu koagulácie.Ťažký hemoragický šok je spojený s vyšším rizikom úmrtia6,7,8.Pri šoku stupňa III (progresívnom) je transfúzia krvi nevyhnutná pre prežitie pacienta počas intraoperačnej a pooperačnej morbidity a mortality.Na prekonanie všetkých vyššie uvedených život ohrozujúcich situácií sme vyvinuli nanoporézny kompozitný skelet vystužený vláknami (NFRCS), ktorý využíva minimálnu koncentráciu polyméru (0,5 %) pomocou kombinácie vo vode rozpustných hemostatických polymérov.
S použitím vláknitej výstuže je možné vyvinúť cenovo výhodné produkty.Náhodne usporiadané vlákna pripomínajú štruktúru krídla vážky, vyvážené horizontálnymi a vertikálnymi pruhmi na krídlach.Priečna a pozdĺžna žilnatina krídla komunikuje s membránou krídla (obr. 1).NFRCS pozostáva zo zosilneného Ct ako systému lešenia s lepšou fyzikálnou a mechanickou pevnosťou (obrázok 1).Kvôli cenovej dostupnosti a remeselnému spracovaniu chirurgovia pri operáciách a preväzoch uprednostňujú používanie meradiel na bavlnenú niť (Ct). Preto, berúc do úvahy jeho viaceré výhody, vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (prispieva k zvýšeniu hemostatickej aktivity), Ct sa použil ako kostrový systém NFRCS9,10. Preto, berúc do úvahy jeho viaceré výhody, vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (prispieva k zvýšeniu hemostatickej aktivity), Ct sa použil ako kostrový systém NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% крисленталолце частвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали, в качестве скелетнойCS9. Preto, vzhľadom na jeho mnohé výhody, vrátane > 90 % kryštalickej celulózy (zúčastnenej na zvýšenej hemostatickej aktivite), bol Ct použitý ako NFRCS kostrový systém9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于墫9牺滜血洴稔NF ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Preto vzhľadom na jeho mnohé výhody, vrátane viac ako 90 % kryštalickej celulózy (pomáha zvyšovať hemostatickú aktivitu), bol Ct použitý ako skelet pre NFRCS9,10.Ct bol povrchovo potiahnutý (bola pozorovaná tvorba nano-hrubého filmu) a prepojený s hemostatickou filmotvornou kompozíciou (HFFC).HFFC pôsobí ako matrigél, ktorý drží náhodne umiestnené Ct pohromade.Vyvinutý dizajn prenáša napätie v rámci rozptýlenej fázy (výstužné vlákna).Je ťažké získať nanoporézne štruktúry s dobrou mechanickou pevnosťou pri použití minimálnych koncentrácií polyméru.Okrem toho nie je ľahké prispôsobiť rôzne formy pre rôzne biomedicínske aplikácie.
Na obrázku je znázornená schéma návrhu NFRCS na základe štruktúry krídla vážky (A).Tento obrázok ukazuje porovnávaciu analógiu štruktúry krídel vážky (pretínajúce sa a pozdĺžne žily krídla sú prepojené) a prierezovú fotomikrografiu Cp NFRCS (B).Schematické znázornenie NFRCS.
NFRC boli vyvinuté s použitím HFFC ako kontinuálnej fázy na riešenie vyššie uvedených obmedzení.HFFC sa skladá z rôznych hemostatických polymérov tvoriacich film vrátane chitosanu (ako hlavného hemostatického polyméru) s metylcelulózou (MC), hydroxypropylmetylcelulózou (HPMC 50 cp) a polyvinylalkoholom (PVA)) (125 kDa) ako podporným polymérom, ktorý podporuje tvorbu trombu.tvorenie.Pridanie polyvinylpyrolidínu K30 (PVP K30) zlepšilo schopnosť NFRCS absorbovať vlhkosť.Polyetylénglykol 400 (PEG 400) bol pridaný na zlepšenie zosieťovania polyméru do viazaných polymérnych zmesí.Na Ct boli aplikované tri rôzne hemostatické kompozície HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC a Cp HFFC), konkrétne chitosan s MC (Cm), chitosan s HPMC (Ch) a chitosan s PVA (Cp).Rôzne in vitro a in vivo charakterizačné štúdie potvrdili hemostatickú aktivitu a aktivitu NFRCS na hojenie rán.Kompozitné materiály ponúkané NFRCS možno použiť na prispôsobenie rôznych foriem lešenia tak, aby vyhovovali špecifickým potrebám.
Okrem toho môže byť NFRCS modifikovaný ako obväz alebo rolka na pokrytie celej oblasti poranenia dolných končatín a iných častí tela.Špeciálne pre bojové zranenia končatín možno navrhnutý dizajn NFRCS zmeniť na polovičnú ruku alebo celú nohu (doplnkový obrázok S11).Z NFRCS možno vyrobiť náramok s tkanivovým lepidlom, ktorý možno použiť na zastavenie krvácania pri ťažkých samovražedných poraneniach zápästia.Naším hlavným cieľom je vyvinúť NFRCS s čo najmenším množstvom polyméru, ktorý možno dodať veľkej populácii (pod hranicou chudoby) a ktorý možno umiestniť do súpravy prvej pomoci.Jednoduchý, efektívny a ekonomický dizajn, NFRCS prospieva miestnym komunitám a môže mať globálny vplyv.
Chitosan (molekulová hmotnosť 80 kDa) a amarant boli zakúpené od spoločnosti Merck, India.Hydroxypropylmetylcelulóza 50 Cp, polyetylénglykol 400 a metylcelulóza boli zakúpené od Loba Chemie Pvt.LLC, Bombaj.Polyvinylalkohol (molekulová hmotnosť 125 kDa) (87-90 % hydrolyzovaný) bol zakúpený od National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrolidín K30 bol zakúpený od Molychem, Mumbai, sterilné tampóny boli zakúpené od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s vodou Milli Q (systém na čistenie vody Direct-Q3, Merck, India) ako nosičom.
NFRCS bol vyvinutý pomocou lyofilizačnej metódy11,12.Všetky kompozície HFFC (tabuľka 1) sa pripravili pomocou mechanického miešadla.Pripravte 0,5 % roztok chitosanu s použitím 1 % kyseliny octovej vo vode nepretržitým miešaním pri 800 otáčkach za minútu na mechanickom miešadle.K roztoku chitosanu sa pridala presná hmotnosť naneseného polyméru uvedená v tabuľke 1 a zmes sa miešala, kým sa nezískal číry roztok polyméru.K výslednej zmesi sa pridali PVP K30 a PEG 400 v množstvách uvedených v tabuľke 1 a miešanie pokračovalo, kým sa nezískal číry roztok viskózneho polyméru.Výsledný kúpeľ roztoku polyméru bol sonikovaný počas 60 minút, aby sa odstránili zachytené vzduchové bubliny z polymérnej zmesi.Ako je znázornené na doplnkovom obrázku S1 (b), Ct bol rovnomerne distribuovaný v každej jamke 6-jamkovej platne (formy) doplnenej 5 ml HFFC.
Šesťjamková platňa bola sonikovaná počas 60 minút, aby sa dosiahlo rovnomerné zvlhčenie a distribúcia HFFC v sieti Ct.Potom zmrazte šesťjamkovú platňu pri -20 °C na 8-12 hodín.Zmrazovacie platne boli lyofilizované počas 48 hodín, aby sa získali rôzne formulácie NFRCS.Rovnaký postup sa používa na výrobu rôznych tvarov a štruktúr, ako sú tampóny alebo valcové tampóny, alebo akýkoľvek iný tvar pre rôzne aplikácie.
Presne navážený chitosan (80 kDa) (3 %) sa rozpustí v 1 % kyseline octovej pomocou magnetického miešadla.K výslednému roztoku chitosanu sa pridal 1 % PEG 400 a zmes sa miešala 30 minút.Výsledný roztok nalejte do štvorcovej alebo obdĺžnikovej nádoby a zmrazte pri -80°C na 12 hodín.Zmrazené vzorky boli lyofilizované počas 48 hodín, aby sa získal porézny Cs13.
Vyvinutý NFRCS bol podrobený experimentom s použitím Fourierovej transformačnej infračervenej spektroskopie (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonsko), aby sa potvrdila chemická kompatibilita chitosanu s inými polymérmi14,15.FTIR spektrá (šírka spektrálneho rozsahu od 400 do 4000 cm-1) všetkých testovaných vzoriek boli získané vykonaním 32 skenov.
Rýchlosť absorpcie v krvi (BAR) pre všetky formulácie sa vyhodnotila použitím metódy opísanej Chen a kol.16 s miernymi úpravami.Vyvinuté NFRK všetkých kompozícií sa vysušili vo vákuovej sušiarni pri 105 °C cez noc, aby sa odstránilo zvyškové rozpúšťadlo.30 mg NFRCS (počiatočná hmotnosť vzorky – W0) a 30 mg Ct (pozitívna kontrola) sa umiestnilo do samostatných misiek obsahujúcich premix 3,8 % citrátu sodného.Vo vopred určených časových intervaloch, tj 5, 10, 20, 30, 40 a 60 sekúnd, boli NFRCS odstránené a ich povrchy očistené od neabsorbovanej krvi umiestnením vzoriek na Ct na 30 sekúnd.Konečná hmotnosť krvi absorbovanej NFRCS 16 bola braná do úvahy (W1) v každom časovom bode.Vypočítajte percento BAR pomocou nasledujúceho vzorca:
Čas zrážania krvi (BCT) bol stanovený ako uvádza Wang et al.17.Čas potrebný na zrážanie plnej krvi (krv potkanov vopred zmiešanej s 3,8 % citrátom sodným) v prítomnosti NFRCS sa vypočítal ako BCT testovanej vzorky.Rôzne zložky NFRCS (30 mg) sa umiestnili do 10 ml liekoviek so skrutkovacím uzáverom a inkubovali sa pri 37 °C.Krv (0,5 ml) sa pridala do liekovky a pridalo sa 0,3 ml 0,2 M CaCl2 na aktiváciu zrážania krvi.Nakoniec injekčnú liekovku prevráťte každých 15 sekúnd (do 180°), kým sa nevytvorí pevná zrazenina.BCT vzorky sa odhaduje podľa počtu prehodení17,18.Na základe BCT sa pre ďalšie charakterizačné štúdie vybrali dve optimálne kompozície z NFRCS Cm, Ch a Cp.
BCT kompozícií Ch NFRCS a Cp NFRCS sa určila implementáciou metódy opísanej v Li et al.19.Vložte 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs (pozitívna kontrola) do samostatných Petriho misiek (37 °C).Krv obsahujúca 3,8 % citrátu sodného sa zmiešala s 0,2 M CaCl2 v objemovom pomere 10:1, aby sa začal proces zrážania krvi.Na povrch vzorky sa aplikovalo 20 ul 0,2 M CaCl2 krvnej zmesi potkanov a umiestnilo sa do prázdnej Petriho misky.Kontrolou bola krv naliata do prázdnych Petriho misiek bez Ct.V pevných intervaloch 0, 3 a 5 minút zastavte zrážanie pridaním 10 ml deionizovanej (DI) vody do vzorky obsahujúcej misku bez narušenia zrazeniny.Nezrážané erytrocyty (erytrocyty) podliehajú hemolýze v prítomnosti deionizovanej vody a uvoľňujú hemoglobín.Hemoglobín v rôznych časových bodoch (HA(t)) sa meral pri 540 nm (Amax hemoglobín) s použitím UV-Vis spektrofotometra.Ako referenčný štandard bola braná absolútna absorpcia hemoglobínu (AH(0)) za 0 minút 20 ul krvi v 10 ml deionizovanej vody.Relatívna absorpcia hemoglobínu (RHA) koagulovanej krvi sa vypočítala z pomeru HA(t)/HA(0) s použitím rovnakej dávky krvi.
Pomocou analyzátora textúry (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) sa stanovili adhézne vlastnosti NFRK k poškodenému tkanivu.Na vnútornú stranu bravčovej kože (bez vrstvy tuku) pritlačte valcovú misku s otvoreným dnom.Vzorky (Ch NFRCS a Cp NFRCS) sa aplikovali pomocou kanyly do valcových foriem, aby sa vytvorila adhézia na kožu ošípanej.Po 3 minútach inkubácie pri izbovej teplote (RT) (25 °C) sa NFRCS adhézna sila zaznamenávala konštantnou rýchlosťou 0,5 mm/s.
Hlavnou črtou chirurgických tmelov je zvýšenie zrážanlivosti krvi a zároveň zníženie straty krvi.Bezstratová koagulácia pri NFRCS bola hodnotená pomocou predtým publikovanej metódy s miernymi úpravami19.Vytvorte mikrocentrifúgovú skúmavku (2 ml) (vnútorný priemer 10 mm) s otvorom 8 × 5 mm2 na jednej strane centrifugačnej skúmavky (predstavuje otvorenú ranu).NFRCS sa používa na uzavretie otvoru a páska sa používa na utesnenie vonkajších okrajov.Pridajte 20 µl 0,2 M CaCl2 do mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej predzmes 3,8 % citrátu sodného.Po 10 minútach boli mikrocentrifugačné skúmavky odstránené z misiek a bolo stanovené zvýšenie hmotnosti misiek v dôsledku odtoku krvi z NFRK (n = 3).Strata krvi Ch NFRCS a Cp NFRCS sa porovnávali s Cs.
Mokrá integrita NFRCS sa určila na základe metódy opísanej Mishrou a Chaudharym21 s malými modifikáciami.NFRCS sa umiestni do 100 ml Erlenmeyerovej banky s 50 ml vody a víri sa 60 s bez vytvorenia vrchu.Vizuálna kontrola a stanovenie priorít vzoriek z hľadiska fyzickej integrity na základe odberu.
Väzbová sila HFFC k Ct bola študovaná pomocou predtým publikovaných metód s malými modifikáciami.Integrita povrchového povlaku bola hodnotená vystavením NFRK akustickým vlnám (vonkajší stimul) v prítomnosti milliQ vody (Ct).Vyvinuté NFRCS Ch NFRCS a Cp NFRCS sa umiestnili do kadičky naplnenej vodou a sonikovali sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 30 minút, v tomto poradí.Po vysušení sa percentuálny rozdiel medzi počiatočnou a konečnou hmotnosťou NFRCS použil na výpočet percentuálnej straty materiálu (HFFC).In vitro BCT ďalej podporovala väzbovú silu alebo stratu povrchových materiálov.Účinnosť väzby HFFC na Ct zabezpečuje zrážanie krvi a elastický povlak na povrchu Ct22.
Homogenita vyvinutého NFRCS bola stanovená pomocou BCT vzoriek (30 mg) odobratých z náhodne vybraných všeobecných miest NFRCS.Na určenie zhody NFRCS postupujte podľa vyššie uvedeného postupu BCT.Blízkosť medzi všetkými piatimi vzorkami zaisťuje rovnomerné pokrytie povrchu a ukladanie HFFC do siete Ct.
Nominálna oblasť kontaktu s krvou (NBCA) sa určila tak, ako už bolo uvedené, s určitými úpravami.Koagulujte krv upnutím 20 µl krvi medzi dva povrchy Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs.Po 1 hodine sa obe časti stentu oddelili a manuálne sa zmerala plocha zrazeniny.Priemerná hodnota troch opakovaní bola považovaná za NBCA NFRCS19.
Analýza dynamickej sorpcie pár (DVS) sa použila na vyhodnotenie účinnosti NFRCS absorbovať vodu z vonkajšieho prostredia alebo z miesta poranenia zodpovedného za spustenie koagulácie.DVS vyhodnocuje alebo zaznamenáva absorpciu a stratu pár vo vzorke gravimetricky pomocou ultracitlivých váh s hmotnostným rozlíšením ±0,1 µg.Čiastočný tlak pár (relatívna vlhkosť) je generovaný elektronickým regulátorom hmotnostného prietoku okolo vzorky zmiešaním nasýtených a suchých nosných plynov. Podľa smerníc Európskeho liekopisu boli vzorky na základe percenta absorpcie vlhkosti vzorkami kategorizované do 4 kategórií (0–0,012 % w/w – nehygroskopické, 0,2 – 2 % w/w mierne hygroskopické, 2 – 15 % mierne hygroskopické a > 15 % veľmi hygroskopické)23. Podľa smerníc Európskeho liekopisu boli vzorky na základe percenta absorpcie vlhkosti vzorkami kategorizované do 4 kategórií (0–0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm. mierne hygroskopické, 2–15 % mierne hygroskopické a > 15 % veľmi hygroskopické)23.V súlade s odporúčaniami Európskeho liekopisu, v závislosti od percenta absorpcie vlhkosti vzorkami, boli vzorky rozdelené do 4 kategórií (0–0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm. mierne hygroskopické, 2– pätnásť %).% умеренно гигроскопичен и > 15 % очень гигроскопичен)23. % mierne hygroskopických a > 15 % veľmi hygroskopických)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,-2% w/y /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分︺ 分︺ 刻 丼 W.0 刻 丼 W.0 刻 丼 0 W.湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。V súlade s odporúčaniami Európskeho liekopisu sú vzorky rozdelené do 4 tried v závislosti od percenta vlhkosti absorbovanej vzorkou (0-0,012 % hmotnosti – nehygroskopické, 0,2-2 % hmotnosti mierne hygroskopické, 2 – 15 % hmotnosti).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % mierne hygroskopické, > 15 % veľmi hygroskopické) 23.Hygroskopická účinnosť NFCS X NFCS a TsN NFCS bola stanovená na analyzátore DVS TA TGA Q5000 SA.Počas tohto procesu sa získal čas spracovania, relatívna vlhkosť (RH) a hmotnosť vzorky v reálnom čase pri 25 °C24.Obsah vlhkosti sa vypočíta presnou hmotnostnou analýzou NFRCS pomocou nasledujúcej rovnice:
MC je vlhkosť NFRCS.m1 – suchá hmotnosť NSAID.m2 je hmotnosť NFRCS v reálnom čase pri danej relatívnej vlhkosti.
Celková plocha povrchu sa odhadla pomocou experimentu adsorpcie dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri 25 ° C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr). Celková plocha povrchu sa odhadla pomocou experimentu adsorpcie dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri 25 ° C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента пот адисорбоца м после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Celková plocha povrchu sa odhadla pomocou experimentu adsorpcie dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek pri 25 °C počas 10 hodín (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов потироадо ам Stredná sezóna počas noci 10 stupňov pred 25°C (< 7 × 10-3 tôr). Celková plocha povrchu sa odhadla pomocou experimentov adsorpcie dusíka s kvapalným dusíkom po vyprázdnení vzoriek počas 10 hodín pri 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Celková plocha povrchu, objem pórov a veľkosť pórov NFRCS boli stanovené pomocou Quantachrome od NOVA 1000e, Rakúsko s použitím softvéru RS 232.
Pripravte 5 % červených krviniek (fyziologický roztok ako riedidlo) z plnej krvi.Potom preneste alikvotnú časť HFFC (0,25 ml) na 96-jamkovú doštičku a 5 % hmoty červených krviniek (0,1 ml).Zmes sa inkubuje pri teplote 37 °C počas 40 minút.Zmes červených krviniek a séra sa považovala za pozitívnu kontrolu a zmes fyziologického roztoku a červených krviniek za negatívnu kontrolu.Hemaglutinácia bola stanovená podľa Stajitzkého stupnice.Navrhované váhy sú nasledovné: + + + + husté zrnité kamenivo;+ + + hladké spodné podložky so zakrivenými okrajmi;+ + hladké spodné podložky s roztrhnutými okrajmi;+ úzke červené krúžky okolo okrajov hladkých podložiek;– (záporné) diskrétne červené tlačidlo 12 v strede spodnej priehradky.
Hemokompatibilita NFRCS bola študovaná podľa metódy Medzinárodnej organizácie pre štandardizáciu (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Gravimetrická metóda opísaná Singhom a kol.Vykonali sa menšie úpravy na vyhodnotenie tvorby trombu v prítomnosti alebo na povrchu NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS sa inkubovalo vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) počas 24 hodín pri 37 °C.Po 24 hodinách sa PBS odstránil a na NFRCS sa pôsobilo 2 ml krvi obsahujúcej 3,8 % citrát sodný.Na povrch NFRCS pridajte k inkubovaným vzorkám 0,04 ml 0,1 M CaCl2.Po 45 minútach sa pridalo 5 ml destilovanej vody, aby sa zastavila koagulácia.Koagulovaná krv na povrchu NFRK bola ošetrená 36-38% roztokom formaldehydu.Zrazeniny fixované formaldehydom sa vysušili a odvážili.Percento trombózy sa odhadlo výpočtom hmotnosti pohára bez krvi a vzorky (negatívna kontrola) a pohára s krvou (pozitívna kontrola).
Ako počiatočné potvrdenie boli vzorky vizualizované pod optickým mikroskopom, aby sa pochopila schopnosť povrchového povlaku HFFC, prepojeného Ct a siete Ct vytvárať póry.Tenké rezy Ch a Cp z NFRCS boli orezané čepeľou skalpelu.Výsledný rez sa umiestnil na podložné sklíčko, prikryl sa krycím sklíčkom a okraje sa zafixovali lepidlom.Pripravené sklíčka sa prezerali pod optickým mikroskopom a fotografovali sa pri rôznych zväčšeniach.
Depozícia polyméru v Ct sieťach bola vizualizovaná pomocou fluorescenčnej mikroskopie založenej na metóde opísanej v Rice et al.29. Kompozícia HFFC použitá na formuláciu sa zmiešala s fluorescenčným farbivom (amaranth) a NFRCS (Ch & Cp) sa pripravili podľa vyššie uvedeného spôsobu. Kompozícia HFFC použitá na formuláciu sa zmiešala s fluorescenčným farbivom (amaranth) a NFRCS (Ch & Cp) sa pripravili podľa vyššie uvedeného spôsobu.Kompozícia HFFC použitá na formuláciu sa zmiešala s fluorescenčným farbivom (amaranth) a NFRCS (Ch a Cp) sa získal podľa vyššie uvedeného spôsobu.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方椼到的方椼到的方将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方椼到的方椼到的方Kompozícia HFFC použitá vo formulácii bola zmiešaná s fluorescenčným farbivom (Amaranth) a dostala NFRCS (Ch a Cp), ako bolo uvedené vyššie.Zo získaných vzoriek boli narezané tenké rezy NFRK, umiestnené na podložné sklíčka a pokryté krycími sklíčkami.Pripravené sklíčka pozorujte pod fluorescenčným mikroskopom so zeleným filtrom (310-380 nm).Snímky boli urobené pri 4-násobnom zväčšení, aby sa pochopili vzťahy Ct a nadmerné ukladanie polymérov v sieti Ct.
Povrchová topografia NFRCS Ch a Cp bola stanovená pomocou mikroskopu atómovej sily (AFM) s ultra ostrým TESP konzolou v režime poklepu: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Drsnosť povrchu sa určila pomocou stredného štvorca (RMS) pomocou softvéru (Scanning Probe Image Processor).Rôzne miesta NFRCS boli vykreslené na 3D obrázkoch, aby sa skontrolovala rovnomernosť povrchu.Smerodajná odchýlka skóre pre danú oblasť je definovaná ako drsnosť povrchu.Na kvantifikáciu drsnosti povrchu NFRCS31 sa použila rovnica RMS.
Štúdie založené na FESEM sa uskutočnili s použitím FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, aby sa pochopila povrchová morfológia Ch NFRCS a Cp NFRCS, ktoré vykazovali lepšie BCT ako Cm NFRCS.Štúdia FESEM sa uskutočnila podľa metódy opísanej Zhao et al.32 s malými úpravami.NFRCS 20 až 30 mg Ch NFRCS a Cp NFRCS sa vopred zmiešalo s 20 ul 3,8 % citrátu sodného vopred zmiešaného s krvou potkanov.Do vzoriek ošetrených krvou sa pridalo 20 ul 0,2 M CaCl2, aby sa iniciovala koagulácia a vzorky sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 10 minút.Okrem toho sa z povrchu NFRCS odstránili prebytočné erytrocyty opláchnutím fyziologickým roztokom.
Nasledujúce vzorky boli ošetrené 0,1 % glutaraldehydom a potom vysušené v teplovzdušnej sušiarni pri 37 °C, aby sa odstránila vlhkosť.Vysušené vzorky boli potiahnuté a analyzované32.Ďalšie obrázky získané počas analýzy boli tvorba zrazeniny na povrchu jednotlivých bavlnených vlákien, ukladanie polyméru medzi Ct, morfológia erytrocytov (tvar), integrita zrazeniny a morfológia erytrocytov v prítomnosti NFRCS.Neošetrené oblasti NFRCS a oblasti NFRCS ošetrené Ch a Cp inkubované s krvou boli skenované na elementárne ióny (sodík, draslík, dusík, vápnik, horčík, zinok, meď a selén)33.Porovnajte percentá elementárnych iónov medzi ošetrenými a neošetrenými vzorkami, aby ste pochopili akumuláciu elementárnych iónov počas tvorby zrazeniny a homogenitu zrazeniny.
Hrúbka povrchového povlaku Cp HFFC na povrchu Ct bola stanovená pomocou FESEM.Prierezy Cp NFRCS boli vyrezané z konštrukcie a potiahnuté rozprašovaním.Výsledné vzorky naprašovacieho povlaku boli pozorované pomocou FESEM a bola zmeraná hrúbka povrchového povlaku 34 , 35 , 36 um.
Röntgenové mikro-CT poskytuje 3D nedeštruktívne zobrazovanie s vysokým rozlíšením a umožňuje študovať vnútorné štruktúrne usporiadanie NFRK.Micro-CT využíva röntgenový lúč prechádzajúci cez vzorku na zaznamenanie lokálneho koeficientu lineárneho útlmu röntgenových lúčov vo vzorke, čo pomáha získať morfologické informácie.Vnútorné umiestnenie Ct v Cp NFRCS a krvne ošetrenom Cp NFRCS sa skúmalo pomocou mikro-CT, aby sa pochopila účinnosť absorpcie a zrážanie krvi v prítomnosti NFRCS37,38,39.3D štruktúry vzoriek Cp NFRCS ošetrených krvou a neošetrených vzoriek boli rekonštruované pomocou micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Nemecko).Pomocou softvéru VG STUDIO-MAX verzie 2.2 bolo urobených niekoľko röntgenových snímok z rôznych uhlov (ideálne 360° pokrytie), aby sa vytvorili 3D snímky pre NFRCS.Zozbierané projekčné dáta boli zrekonštruované do 3D objemových obrazov pomocou zodpovedajúceho jednoduchého 3D ScanIP Academic softvéru.
Okrem toho, na pochopenie distribúcie zrazeniny, sa do NFRCS pridalo 20 ul vopred zmiešanej citrátovej krvi a 20 ul 0,2 M CaCl2, aby sa iniciovalo zrážanie krvi.Pripravené vzorky sa nechajú vytvrdnúť.Povrch NFRK bol ošetrený 0,5% glutaraldehydom a sušený v teplovzdušnej sušiarni pri 30–40 °C počas 30 minút.Krvná zrazenina vytvorená na NFRCS bola naskenovaná, zrekonštruovaná a bol vizualizovaný 3D obraz krvnej zrazeniny.
Antibakteriálne testy sa uskutočňovali na Cp NFRCS (najlepšie v porovnaní s Ch NFRCS) s použitím vyššie opísanej metódy s malými modifikáciami.Antibakteriálna aktivita Cp NFRCS a Cp HFFC bola stanovená pomocou troch rôznych testovacích mikroorganizmov [S.aureus (gram-pozitívne baktérie), E. coli (gram-negatívne baktérie) a biela Candida (C.albicans)] rastúcich na agare v Petriho miskách v inkubátore.Rovnomerne naočkujte 50 ml zriedenej suspenzie bakteriálnej kultúry s koncentráciou 105-106 CFU ml-1 na agarové médium.Médium nalejeme do Petriho misky a necháme stuhnúť.Na povrchu agarovej platne boli vytvorené jamky na naplnenie HFFC (3 jamky pre HFFC a 1 pre negatívnu kontrolu).Pridajte 200 ul HFFC do 3 jamiek a 200 ul pH 7,4 PBS do 4. jamky.Na druhú stranu Petriho misky položte 12 mm Cp NFRCS disk na stuhnutý agar a navlhčite PBS (pH 7,4).Tablety ciprofloxacínu, ampicilínu a flukonazolu sa považujú za referenčné štandardy pre Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans.Zmerajte zónu inhibície ručne a urobte digitálny obraz zóny inhibície.
Po inštitucionálnom etickom schválení sa štúdia uskutočnila na Kasturba Medical College of Education and Research v Manipal, Karnataka, v južnej Indii.Experimentálny protokol TEG in vitro bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnym etickým výborom Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subjekty boli získané z dobrovoľných darcov krvi (vo veku 18 až 55 rokov) z nemocničnej krvnej banky.Okrem toho bol od dobrovoľníkov získaný informovaný súhlas na odber vzoriek krvi.Natívny TEG (N-TEG) ​​bol použitý na štúdium účinku formulácie Cp HFFC na celú krv vopred zmiešanú s citrátom sodným.N-TEG je široko uznávaný pre svoju úlohu pri resuscitácii v mieste starostlivosti, čo spôsobuje problémy lekárom kvôli možnosti klinicky významného oneskorenia výsledkov (rutinné koagulačné testy).N-TEG analýza sa uskutočnila s použitím plnej krvi.Od všetkých účastníkov bol získaný informovaný súhlas a podrobná anamnéza.Štúdia nezahŕňala účastníkov s hemostatickými alebo trombotickými komplikáciami, ako je tehotenstvo / popôrodné obdobie alebo ochorenie pečene.Zo štúdie boli vylúčení aj jedinci užívajúci lieky, ktoré ovplyvňujú koagulačnú kaskádu.Základné laboratórne testy (hemoglobín, protrombínový čas, aktivovaný tromboplastín a počet trombocytov) boli vykonané u všetkých účastníkov podľa štandardných postupov.N-TEG určuje viskoelasticitu krvnej zrazeniny, počiatočnú štruktúru zrazeniny, interakciu častíc, spevnenie zrazeniny a lýzu zrazeniny.Analýza N-TEG poskytuje grafické a numerické údaje o spoločných účinkoch niekoľkých bunkových prvkov a plazmy.N-TEG analýza sa uskutočnila na dvoch rôznych objemoch Cp HFFC (10 ul a 50 ul).Výsledkom bolo pridanie 1 ml plnej krvi s kyselinou citrónovou k 10 μl Cp HFFC.Pridajte 1 ml (Cp HFFC + citrátovaná krv), 340 ul zmiešanej krvi do 20 ul 0,2 M CaCl2 obsahujúcej TEG misky.Potom sa misky TEG vložili do TEG® 5000, USA na meranie R, K, alfa uhla, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % vzoriek krvi v prítomnosti Cp HFFC41.
Protokol štúdie in vivo bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnym výborom pre etiku zvierat (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Všetky pokusy na zvieratách boli uskutočnené v súlade s odporúčaniami Výboru pre kontrolu a dohľad nad pokusmi na zvieratách (CPCSEA).Všetky in vivo štúdie NFRCS (2 x 2 cm2) sa uskutočnili na samiciach potkanov Wistar (s hmotnosťou 200 až 250 g).Všetky zvieratá sa aklimatizovali pri teplote 24-26 °C, zvieratá mali voľný prístup k štandardnej potrave a vode ad libitum.Všetky zvieratá boli náhodne rozdelené do rôznych skupín, každá skupina pozostávala z troch zvierat.Všetky štúdie sa uskutočnili v súlade so Štúdiami na zvieratách: Správa o experimentoch in vivo43.Pred štúdiou boli zvieratá anestetizované intraperitoneálnym (ip) podaním zmesi 20-50 mg ketamínu (na 1 kg telesnej hmotnosti) a 2-10 mg xylazínu (na 1 kg telesnej hmotnosti).Po štúdii bol objem krvácania vypočítaný vyhodnotením rozdielu medzi počiatočnou a konečnou hmotnosťou vzoriek, ako objem krvácania vzorky bola braná priemerná hodnota získaná z troch testov.
Model amputácie potkanieho chvosta bol implementovaný na pochopenie potenciálu NFRCS modulovať krvácanie pri traume, boji alebo dopravnej nehode (model zranenia).Skalpelom odrežte 50 % chvosta a umiestnite na vzduch na 15 s, aby ste zabezpečili normálne krvácanie.Okrem toho sa testované vzorky umiestnili na chvost potkana použitím tlaku (Ct, Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS).Krvácanie a PCT boli hlásené pre testované vzorky (n ​​= 3)17,45.
Účinnosť kontroly tlaku NFRCS v boji bola skúmaná na modeli povrchovej femorálnej artérie.Femorálna artéria sa obnaží, prepichne sa 24G trokarom a do 15 sekúnd sa vykrváca.Po spozorovaní nekontrolovaného krvácania sa skúšobná vzorka umiestni na miesto vpichu s aplikovaným tlakom.Ihneď po aplikácii testovanej vzorky sa zaznamenal čas zrážania a počas nasledujúcich 5 minút sa pozorovala hemostatická účinnosť.Rovnaký postup sa zopakoval s Cs a Ct46.
Dowling a kol.47 navrhol model poškodenia pečene na posúdenie hemostatického potenciálu hemostatických materiálov v kontexte intraoperačného krvácania.BCT bola zaznamenaná pre vzorky Ct (negatívna kontrola), rámec Cs (pozitívna kontrola), vzorky Ch NFRCS a vzorky Cp NFRCS.Suprahepatická dutá žila potkana sa obnažila vykonaním strednej laparotómie.Potom bola distálna časť ľavého laloka vyrezaná nožnicami.Skalpelom urobte rez do pečene a nechajte niekoľko sekúnd krvácať.Presne odvážené skúšobné vzorky Ch NFRCS a Cp NFRCS sa umiestnili na poškodený povrch bez akéhokoľvek pozitívneho tlaku a zaznamenala sa BCT.Kontrolná skupina (Ct) potom aplikovala tlak a následne Cs 30 s47 bez poškodenia poranenia.
Testy hojenia rán in vivo sa uskutočňovali s použitím modelu excíznej rany na vyhodnotenie vlastností hojenia rán vyvinutých NFRCS na báze polyméru.Modely excíznych rán sa vybrali a vykonali podľa predtým publikovaných metód s malými úpravami19, 32, 48.Všetky zvieratá boli anestetizované, ako bolo opísané vyššie.Pomocou bioptického razidla (12 mm) urobte hlboký kruhový rez na koži chrbta.Pripravené miesta rany sa obviazali Cs (pozitívna kontrola), Ct (rozpoznalo sa, že vatové tampóny interferujú s hojením), Ch NFRCS a Cp NFRCS (experimentálna skupina) a negatívna kontrola bez akéhokoľvek ošetrenia.Každý deň štúdie sa merala plocha rany u všetkých potkanov.Pomocou digitálneho fotoaparátu odfoťte oblasť rany a nasaďte si nový obväz.Percento uzavretia rany sa meralo podľa nasledujúceho vzorca:
Na základe percenta uzatvorenia rany v 12. deň štúdie sa vyrezala koža potkana z najlepšej skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolná skupina) a študovala sa farbením H&E a farbením Massonovým trichrómom. Na základe percenta uzatvorenia rany v 12. deň štúdie sa vyrezala koža potkana z najlepšej skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolná skupina) a študovala sa farbením H&E a farbením Massonovým trichrómom.Na základe percenta uzavretia rany v 12. deň štúdie bola koža potkanov z najlepšej skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolná skupina) vyrezaná a skúmaná farbením hematoxylínom-eozínom a Massonovým trichrómom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的塥组口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的塥蒛 的大鼤皮蛤蛤三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的塥组) 的塥组 的夂鼤 皮褂茤眳组)Potkany v najlepšej skupine ((Cp NFRCS) a kontrolné skupiny) boli vyrezané na farbenie hematoxylín-eozín a farbenie Massonovým trichrómom na základe percenta uzavretia rany v deň 12 štúdie.Implementovaný postup farbenia sa uskutočnil podľa predtým opísaných metód49, 50.Stručne, po fixácii v 10% formalíne boli vzorky dehydratované s použitím série odstupňovaných alkoholov.Pomocou mikrotómu získajte tenké rezy (hrúbka 5 µm) vyrezaného tkaniva.Tenké sériové rezy kontrol a Cp NFRCS boli ošetrené hematoxylínom a eozínom na štúdium histopatologických zmien.Na detekciu tvorby kolagénových fibríl sa použilo Massonovo trichrómové farbenie.Získané výsledky slepo študovali patológovia.
Stabilita vzoriek Cp NFRCS sa skúmala pri teplote miestnosti (25 °C ± 2 °C/60 % relatívnej vlhkosti ± 5 %) počas 12 mesiacov51.Cp NFRCS (povrchová zmena farby a mikrobiálny rast) sa vizuálne skontroloval a testoval na odolnosť proti opotrebeniu a BCT podľa vyššie uvedených metód uvedených v časti Materiály a metódy.
Škálovateľnosť a reprodukovateľnosť Cp NFRCS sa skúmala prípravou Cp NFRCS s veľkosťou 15 x 15 cm2.Okrem toho sa 30 mg vzorky (n = 5) vyrezali z rôznych frakcií Cp NFRCS a vyhodnotila sa BCT študovaných vzoriek, ako je opísané skôr v časti Metódy.
Pokúsili sme sa vyvinúť rôzne tvary a štruktúry pomocou kompozícií Cp NFRCS pre rôzne biomedicínske aplikácie.Takéto tvary alebo konfigurácie zahŕňajú kónické tampóny na krvácanie z nosa, zubné zákroky a valcové tampóny na vaginálne krvácanie.
Všetky súbory údajov sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka a boli analyzované pomocou ANOVA s použitím Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA), po čom nasledoval Bonferroniho viacnásobný porovnávací test (*p<0,05).
Všetky postupy vykonávané pri štúdiách na ľuďoch boli v súlade s normami inštitútu a Národnej výskumnej rady, ako aj Helsinskou deklaráciou z roku 1964 a jej následnými dodatkami, prípadne podobnými etickými normami.Všetci účastníci boli informovaní o vlastnostiach štúdie a jej dobrovoľnosti.Údaje o účastníkovi zostanú po zhromaždení dôverné.Experimentálny protokol TEG in vitro bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnym etickým výborom Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Dobrovoľníci podpísali informovaný súhlas na odber vzoriek krvi.
Všetky postupy vykonané v štúdiách na zvieratách boli vykonané v súlade s Lekárskou fakultou Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Všetky navrhnuté pokusy na zvieratách sa uskutočnili v súlade s usmerneniami Výboru pre kontrolu a dohľad nad pokusmi na zvieratách (CPCSEA).Všetci autori sa riadia pokynmi ARRIVE.
FTIR spektrá všetkých NFRCS boli analyzované a porovnané so spektrom chitosanu znázorneným na obrázku 2A.Charakteristické spektrálne píky chitosanu (zaznamenané) pri 3437 cm-1 (natiahnutie OH a NH, prekrytie), 2945 a 2897 cm-1 (natiahnutie CH), 1660 cm-1 (natiahnutie NH2), 1589 cm-1 (ohyb N-H), 1157 cm-1 (ohyb Ostrech-10), sekundárne roztiahnutie 0strech-10 cm-1 (most 0strech-10) 993 cm-1 (natiahnutie CO, Bo-OH) 52,53,54.Doplnková tabuľka S1 ukazuje hodnoty absorpčného spektra FTIR NFRCS pre chitosan (reportér), čistý chitosan, Cm, Ch a Cp.FTIR spektrá všetkých NFRCS (Cm, Ch a Cp) vykazovali rovnaké charakteristické absorpčné pásy ako čistý chitosan bez akýchkoľvek významných zmien (obr. 2A).Výsledky FTIR potvrdili absenciu chemických alebo fyzikálnych interakcií medzi polymérmi použitými na vývoj NFRCS, čo naznačuje, že použité polyméry sú inertné.
In vitro charakterizácia Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs.(A) predstavuje kombinované FTIR spektrá kompozícií chitosanu a Cm NFRCS, Ch NFRCS a Cp NFRCS pod tlakom.(B) a) Rýchlosť absorpcie NFRCS Cm, Ch, Cp a Cg plnou krvou (n = 3);Vzorky Ct vykazovali vyššiu BAR, pretože vatový tampón má vyššiu absorpčnú účinnosť;b) Krv po absorpcii krvi Ilustrácia absorbovanej vzorky.Grafické znázornenie BCT testovanej vzorky C (Cp NFRCS mal najlepšiu BCT (15 s, n = 3)). Údaje v C, D, E a G boli uvedené ako priemer ± SD a chybové stĺpce predstavujú SD, ***p < 0,0001. Údaje v C, D, E a G boli uvedené ako priemer ± SD a chybové stĺpce predstavujú SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E a G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки поЎтрейнос дартное отклонение, ***p <0,0001. Údaje v C, D, E a G sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka a chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku,***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E a G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки поЎетрех стандартное отклонение, ***p <0,0001. Údaje v C, D, E a G sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka, chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku,***p<0,0001.