Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Plodnosť vtákov závisí od ich schopnosti uchovávať dostatok životaschopných spermií na dlhší čas v tubuloch na ukladanie spermií (SST).Presný mechanizmus, ktorým spermie vstupujú, zdržiavajú sa v ňom a opúšťajú SST, zostáva kontroverzný.Spermie sliepok sharkasi vykazovali vysokú tendenciu k aglutinácii, pričom vytvárali pohyblivé vláknité zväzky obsahujúce veľa buniek.Kvôli ťažkostiam s pozorovaním motility a správania spermií v nepriehľadnej vajíčkovode sme na štúdium aglutinácie a motility spermií použili mikrofluidné zariadenie s mikrokanálovým prierezom podobným prierezu spermií.Táto štúdia diskutuje o tom, ako sa tvoria zväzky spermií, ako sa pohybujú a ich možnú úlohu pri rozširovaní pobytu spermií v SST.Skúmali sme rýchlosť spermií a reologické správanie, keď bol prietok tekutiny generovaný v mikrofluidnom kanáli hydrostatickým tlakom (prietok = 33 µm/s).Spermie majú tendenciu plávať proti prúdu (pozitívna reológia) a rýchlosť zväzku spermií je výrazne znížená v porovnaní s jednotlivými spermiami.Bolo pozorované, že zväzky spermií sa pohybujú v špirále a zväčšujú sa v dĺžke a hrúbke, keď sa získava viac samostatných spermií. Pozorovali sa zväzky spermií, ktoré sa približovali k bočným stenám mikrofluidných kanálov a priľnuli k nim, aby sa zabránilo ich zmietaniu rýchlosťou prúdenia tekutiny > 33 µm/s. Pozorovali sa zväzky spermií, ktoré sa približovali k bočným stenám mikrofluidných kanálov a priľnuli k nim, aby sa zabránilo ich zmietaniu rýchlosťou prúdenia tekutiny > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостиковынм х каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Bolo pozorované, že zväzky spermií sa približujú k bočným stenám mikrofluidných kanálikov a priľnú k nim, aby sa zabránilo ich zmietnutiu pri prietoku tekutiny > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流佫赁速> 33 怟流速> s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостововынм ого канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Bolo pozorované, že zväzky spermií sa približujú k bočným stenám mikrofluidného kanála a priľnú k nim, aby sa zabránilo ich zmietnutiu prúdom tekutiny rýchlosťou > 33 µm/s.Skenovacia a transmisná elektrónová mikroskopia odhalila, že zväzky spermií boli podporované bohatým hustým materiálom.Získané údaje demonštrujú jedinečnú mobilitu kuracích spermií Sharkazi, ako aj schopnosť spermií aglutinovať a vytvárať mobilné zväzky, čo prispieva k lepšiemu pochopeniu dlhodobého skladovania spermií v SMT.
Na dosiahnutie oplodnenia u ľudí a väčšiny zvierat musia spermie a vajíčka doraziť na miesto oplodnenia v správnom čase.Preto k páreniu musí dôjsť pred alebo v čase ovulácie.Na druhej strane niektoré cicavce, ako sú psy, ako aj necicavčie druhy, ako je hmyz, ryby, plazy a vtáky, uchovávajú spermie vo svojich reprodukčných orgánoch dlhší čas, kým ich vajíčka nie sú pripravené na oplodnenie (asynchrónne oplodnenie 1 ).Vtáky sú schopné udržať životaschopnosť spermií schopných oplodniť vajíčka 2-10 týždňov2.
Ide o unikátnu vlastnosť, ktorá odlišuje vtáky od iných zvierat, pretože poskytuje vysokú pravdepodobnosť oplodnenia po jednej inseminácii počas niekoľkých týždňov bez súčasného párenia a ovulácie.Hlavný skladovací orgán spermií, nazývaný tubul na ukladanie spermií (SST), sa nachádza vo vnútorných záhyboch sliznice na uterovaginálnom spojení.Doteraz nie sú úplne pochopené mechanizmy, ktorými spermie vstupujú, zdržiavajú sa a opúšťajú spermie.Na základe predchádzajúcich štúdií bolo predložených veľa hypotéz, ale žiadna z nich sa nepotvrdila.
Forman4 predpokladal, že spermie si zachovávajú svoju rezidenciu v dutine SST prostredníctvom nepretržitého oscilačného pohybu proti smeru toku tekutiny cez proteínové kanály umiestnené na epiteliálnych bunkách SST (reológia).ATP je vyčerpaný v dôsledku neustálej bičíkovej aktivity potrebnej na udržanie spermií v lúmene SST a motilita nakoniec klesá, kým sa spermie nevynesú zo spermatickej banky prúdom tekutiny a nezačnú novú cestu nadol vzostupným vajíčkovodom, aby spermie oplodnili.Vajíčko (Forman4).Tento model skladovania spermií je podporovaný imunocytochemickou detekciou akvaporínov 2, 3 a 9 prítomných v epitelových bunkách SST.Doteraz chýbajú štúdie o reológii kuracieho semena a jeho úlohe pri skladovaní SST, selekcii vaginálnych spermií a konkurencii spermií.U kurčiat sa spermie dostávajú do vagíny po prirodzenom párení, ale viac ako 80 % spermií sa z vagíny vylúči krátko po párení.To naznačuje, že vagína je primárnym miestom na selekciu spermií u vtákov.Okrem toho sa uvádza, že menej ako 1 % spermií oplodnených vo vagíne končí v SST2.Pri umelej inseminácii kurčiat vo vagíne má počet spermií dosahujúcich SST tendenciu zvyšovať sa 24 hodín po inseminácii.Mechanizmus selekcie spermií počas tohto procesu je zatiaľ nejasný a motilita spermií môže hrať dôležitú úlohu pri vychytávaní spermií SST.Kvôli hrubým a nepriehľadným stenám vajíčkovodov je ťažké priamo sledovať pohyblivosť spermií vo vajíčkovodoch vtákov.Preto nám chýbajú základné vedomosti o tom, ako spermie po oplodnení prechádzajú na SST.
Reológia bola nedávno uznaná ako dôležitý faktor kontrolujúci transport spermií v genitáliách cicavcov.Na základe schopnosti pohyblivých spermií migrovať protiprúdne Zaferani et al8 použili mikrofluidný systém corra na pasívnu izoláciu pohyblivých spermií zo vzoriek spermy.Tento typ triedenia spermy je nevyhnutný pre lekársku liečbu neplodnosti a klinický výskum a uprednostňuje sa pred tradičnými metódami, ktoré sú náročné na čas a prácu a môžu ohroziť morfológiu spermií a štrukturálnu integritu.Doteraz sa však neuskutočnili žiadne štúdie o vplyve sekrétov z pohlavných orgánov kurčiat na pohyblivosť spermií.
Bez ohľadu na mechanizmus, ktorý udržiava spermie uložené v SST, mnohí výskumníci pozorovali, že rezidentné spermie aglutinujú hlava-nehlava v SST kurčiat 9, 10, prepelíc 2 a moriek 11 za vzniku aglutinovaných zväzkov spermií.Autori naznačujú, že existuje spojenie medzi touto aglutináciou a dlhodobým skladovaním spermií v SST.
Tingari a Lake12 uviedli silnú súvislosť medzi spermiami v žľaze kurčaťa prijímajúcou spermie a spochybnili, či vtáčie spermie aglutinujú rovnakým spôsobom ako spermie cicavcov.Domnievajú sa, že hlboké spojenie medzi spermiami v semenných chlopniach môže byť spôsobené stresom spôsobeným prítomnosťou veľkého počtu spermií na malom priestore.
Pri hodnotení správania spermií na čerstvých visiacich podložných sklíčkach možno pozorovať prechodné známky aglutinácie, najmä na okrajoch kvapôčok semena.Aglutinácia však bola často narušená rotačným pôsobením spojeným s nepretržitým pohybom, čo vysvetľuje prechodný charakter tohto javu.Vedci si tiež všimli, že keď sa do spermy pridalo riedidlo, objavili sa predĺžené „vláknité“ bunkové agregáty.
Skoré pokusy napodobniť spermie sa robili odstránením tenkého drôtu z visiacej kvapky, čo viedlo k tomu, že z kvapky semena vyčnieval predĺžený vezikul podobný spermiám.Spermie sa okamžite zoradili paralelným spôsobom vo vezikule, ale celá jednotka rýchlo zmizla v dôsledku 3D obmedzenia.Preto je na štúdium aglutinácie spermií potrebné sledovať pohyblivosť a správanie spermií priamo v izolovaných tubuloch na uskladnenie spermií, čo je ťažké dosiahnuť.Preto je potrebné vyvinúť nástroj, ktorý napodobňuje spermie na podporu štúdií motility spermií a aglutinačného správania.Brillard et al13 uviedli, že priemerná dĺžka tubulov na skladovanie spermií u dospelých kurčiat je 400 – 600 µm, ale niektoré SST môžu byť dlhé až 2 000 µm.Mero a Ogasawara14 rozdelili semenné žľazy na zväčšené a nezväčšené tubuly na skladovanie spermií, pričom obe mali rovnakú dĺžku (~ 500 µm) a šírku krku (~ 38 µm), ale stredný priemer lúmenu tubulov bol 56,6 a 56,6 µm.., respektíve 11,2 μm, resp.V súčasnej štúdii sme použili mikrofluidné zariadenie s veľkosťou kanála 200 μm × 20 μm (W × V), ktorého prierez je trochu blízky prierezu amplifikovaného SST.Okrem toho sme skúmali motilitu spermií a aglutinačné správanie v prúdiacej tekutine, čo je v súlade s Foremanovou hypotézou, že tekutina produkovaná epitelovými bunkami SST udržuje spermie v lúmene v protiprúdovom (reologickom) smere.
Cieľom tejto štúdie bolo prekonať problémy s pozorovaním pohyblivosti spermií vo vajíčkovode a vyhnúť sa ťažkostiam pri štúdiu reológie a správania spermií v dynamickom prostredí.Použilo sa mikrofluidné zariadenie, ktoré vytvára hydrostatický tlak na simuláciu motility spermií v genitáliách kurčaťa.
Keď bola kvapka zriedenej vzorky spermií (1:40) vložená do mikrokanálového zariadenia, mohli byť identifikované dva typy pohyblivosti spermií (izolované spermie a naviazané spermie).Okrem toho spermie mali tendenciu plávať proti prúdu (pozitívna reológia; video 1, 2). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako osamelé spermie (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako osamelé spermie (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных стоперм), <br>0,00 увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реаотаксис (p < 0). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako jednotlivé spermie (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加们增加们增加了搚秤恾倘精子的速度（p < 0,001分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 罆 增加 了 显癀 阆 显社昀分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов, 0,010, 0,010 али процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Hoci rýchlosť zväzkov spermií bola nižšia ako rýchlosť jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšili percento spermií s pozitívnou reológiou (p < 0,001; tabuľka 2).Pozitívna reológia jednotlivých spermií a trsov sa odhaduje na približne 53 % a 85 %.
Bolo pozorované, že spermie kurčiat sharkasi bezprostredne po ejakulácii tvoria lineárne zväzky pozostávajúce z desiatok jedincov.Tieto chumáče sa časom zväčšujú do dĺžky a hrúbky a môžu zostať in vitro niekoľko hodín, kým sa rozplynú (video 3).Tieto vláknité zväzky majú tvar spermií echidny, ktoré sa tvoria na konci nadsemenníka.Zistilo sa, že sperma sliepky Sharkashi má vysokú tendenciu k aglutinácii a vytváraniu sieťového zväzku za menej ako jednu minútu po odbere.Tieto trámy sú dynamické a dokážu sa prilepiť na akékoľvek blízke steny alebo statické predmety.Hoci zväzky spermií znižujú rýchlosť spermií, je jasné, že makroskopicky zvyšujú ich linearitu.Dĺžka zväzkov sa líši v závislosti od počtu spermií zozbieraných vo zväzkoch.Izolovali sa dve časti zväzku: počiatočná časť vrátane voľnej hlavičky aglutinovanej spermie a terminálna časť vrátane chvosta a celého distálneho konca spermie.Pomocou vysokorýchlostnej kamery (950 fps) boli v počiatočnej časti zväzku pozorované voľné hlavičky aglutinovaných spermií, ktoré sú zodpovedné za pohyb zväzku v dôsledku ich oscilačného pohybu, pričom zostávajúce vťahujú špirálovitým pohybom do zväzku (Video 4).Pri dlhých chumáčoch však bolo pozorované, že niektoré voľné hlavičky spermií priľnuli k telu a koncová časť chumáča pôsobila ako lopatky, ktoré pomáhajú chumáč poháňať.
Pri pomalom prúdení tekutiny sa zväzky spermií pohybujú paralelne k sebe, no začnú sa prekrývať a lepiť na všetko, čo je nehybné, aby pri zvyšovaní rýchlosti prúdenia neboli odplavené prúdom prúdu.Zväzky sa vytvoria, keď sa k sebe priblíži hŕstka spermií, začnú sa synchronizovane pohybovať a ovíjať sa okolo seba a potom sa prilepia na lepkavú látku.Obrázky 1 a 2 ukazujú, ako sa spermie približujú k sebe a vytvárajú spojenie, keď sa chvosty navzájom obtočia.
Výskumníci použili hydrostatický tlak na vytvorenie prietoku tekutiny v mikrokanáli na štúdium reológie spermií.Použil sa mikrokanál s veľkosťou 200 um × 20 um (Š × V) a dĺžkou 3,6 um.Použite mikrokanály medzi nádobami s injekčnými striekačkami pripevnenými na koncoch.Na zviditeľnenie kanálov sa použilo potravinárske farbivo.
Pripevnite prepojovacie káble a príslušenstvo k stene.Video bolo urobené mikroskopom s fázovým kontrastom.S každým obrázkom je prezentovaná mikroskopia s fázovým kontrastom a mapovacie obrázky.(A) Spojenie medzi dvoma prúdmi odoláva toku v dôsledku špirálového pohybu (červená šípka).(B) Spojenie medzi zväzkom rúr a stenou kanála (červené šípky), súčasne sú spojené s dvoma ďalšími zväzkami (žlté šípky).(C) Zväzky spermií v mikrofluidnom kanáli sa začínajú navzájom spájať (červené šípky) a vytvárajú sieť zväzkov spermií.(D) Vytvorenie siete zväzkov spermií.
Keď sa do mikrofluidného zariadenia vložila kvapka zriedenej spermie a vytvoril sa tok, pozorovalo sa, že lúč spermií sa pohybuje proti smeru toku.Zväzky tesne priliehajú k stenám mikrokanálov a voľné hlavy v počiatočnej časti zväzkov k nim tesne priliehajú (video 5).Tiež sa prilepia na akékoľvek stacionárne častice v ich ceste, ako sú úlomky, aby odolali tomu, aby ich strhol prúd.Postupom času sa z týchto chumáčov stanú dlhé vlákna zachytávajúce ďalšie jednotlivé spermie a kratšie chumáče (Video 6).Keď sa prietok začne spomaľovať, dlhé línie spermií začnú vytvárať sieť spermií (Video 7; Obrázok 2).
Pri vysokej rýchlosti prúdenia (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby závitov zväčšujú ako pokus o zachytenie mnohých jednotlivých zväzkov spermií, ktoré lepšie odolávajú driftujúcej sile toku. Pri vysokej rýchlosti prúdenia (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby závitov zväčšujú ako pokus o zachytenie mnohých jednotlivých zväzkov spermií, ktoré lepšie odolávajú driftujúcej sile toku. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиьливаютосико, я поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, котворьные луфучки, котворсторех ющей силе потока. Pri vysokých rýchlostiach prietoku (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby prameňov zväčšujú, pretože sa pokúšajú zachytiť veľa jednotlivých spermií tvoriacich zväzky, ktoré sú schopné lepšie odolávať driftujúcej sile toku.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成杌祚岢的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成杌祚岢的螺旋运动增加－地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形刐 杌仟 卻华 杀伟 卻更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увелитычиваетсохев увелитычиваетсое множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротива taka. Pri vysokých prietokových rýchlostiach (V > 33 µm/s) sa špirálový pohyb filamentov zvyšuje v snahe zachytiť mnoho individuálnych spermií tvoriacich zväzky, aby lepšie odolávali driftovým silám toku.Skúšali tiež pripevniť mikrokanály na bočné steny.
Zväzky spermií boli identifikované ako zhluky hlavičiek spermií a stočených chvostov pomocou svetelnej mikroskopie (LM).Zväzky spermií s rôznymi agregátmi boli tiež identifikované ako skrútené hlavy a bičíkové agregáty, viacnásobné fúzované chvosty spermií, hlavy spermií pripojené k chvostu a hlavy spermií s ohnutými jadrami ako viacnásobné spojené jadrá.transmisná elektrónová mikroskopia (TEM).Skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) ukázala, že zväzky spermií boli obalené agregáty hláv spermií a agregáty spermií vykazovali pripojenú sieť obalených chvostov.
Morfológia a ultraštruktúra spermií, tvorba zväzkov spermií bola študovaná pomocou svetelnej mikroskopie (polovičný rez), rastrovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) a transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM), spermie boli zafarbené akridínovou oranžou a skúmané pomocou epifluorescenčnej mikroskopie.
Farbenie spermiového náteru akridínovou oranžou (obr. 3B) ukázalo, že hlavy spermií boli zlepené a pokryté sekrečným materiálom, čo viedlo k vytvoreniu veľkých chumáčov (obr. 3D).Zväzky spermií pozostávali z agregátov spermií so sieťou pripojených chvostov (obr. 4A-C).Zväzky spermií sú zložené z chvostov mnohých spermií zlepených k sebe (obr. 4D).Tajomstvá (obr. 4E, F) pokrývali hlavy zväzkov spermií.
Vytvorenie zväzku spermií Pomocou mikroskopie s fázovým kontrastom a sterov spermií zafarbených akridínovou oranžou sa ukázalo, že hlavičky spermií sa zlepujú.(A) Včasná tvorba chumáčov spermií začína spermiou (biely kruh) a tromi spermiami (žltý kruh), pričom špirála začína pri chvoste a končí pri hlave.(B) Mikrofotografia spermiového náteru zafarbeného akridínovou oranžou zobrazujúca priľnuté hlavičky spermií (šípky).Výtok pokrýva hlavu (hlavy).Zväčšenie × 1000. (C) Vývoj veľkého lúča transportovaného prúdením v mikrofluidnom kanáli (pomocou vysokorýchlostnej kamery pri 950 fps).(D) Mikrosnímka rozteru spermií zafarbeného akridínovou oranžou ukazujúca veľké chumáče (šípky).Zväčšenie: × 200.
Skenovacia elektrónová mikrofotografie lúča spermií a spermiového náteru zafarbeného akridínovou oranžou.(A, B, D, E) sú digitálne farebné skenovacie elektrónové mikrofotografie spermií a C a F sú mikrofotografie spermií zafarbených akridínovou oranžou, ktoré ukazujú pripojenie viacerých spermií obaľujúcich kaudálnu sieť.(AC) Agregáty spermií sú zobrazené ako sieť pripojených chvostov (šípky).(D) Priľnutie niekoľkých spermií (s lepiacou substanciou, ružový obrys, šípka) ovíjajúcich sa okolo chvosta.(E a F) Agregáty hlavičiek spermií (ukazovatele) pokryté adhezívnym materiálom (ukazovatele).Spermie tvorili zväzky s niekoľkými vírovitými štruktúrami (F).(C) × 400 a (F) × 200 zväčšenie.
Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie sme zistili, že zväzky spermií mali pripevnené chvostíky (obr. 6A, C), hlavy pripevnené k chvostíkom (obr. 6B) alebo hlavy pripevnené k chvostíkom (obr. 6D).Hlavičky spermií vo zväzku sú zakrivené a v reze predstavujú dve jadrové oblasti (obr. 6D).V reznom zväzku mali spermie skrútenú hlavu s dvoma jadrovými oblasťami a viacerými bičíkovými oblasťami (obr. 5A).
Digitálny farebný elektrónový mikrosnímok zobrazujúci spojovacie chvostíky vo zväzku spermií a aglutinačný materiál spájajúci hlavičky spermií.(A) Pripojený chvost veľkého počtu spermií.Všimnite si, ako chvost vyzerá pri projekcii na výšku (šípka) aj na šírku (šípka).(B) Hlava (šípka) spermie je spojená s chvostom (šípka).(C) Je pripojených niekoľko chvostov spermií (šípky).(D) Aglutinačný materiál (AS, modrý) spája štyri hlavičky spermií (fialové).
Skenovacia elektrónová mikroskopia sa použila na detekciu hlavičiek spermií vo zväzkoch spermií pokrytých sekrétmi alebo membránami (obrázok 6B), čo naznačuje, že zväzky spermií boli ukotvené extracelulárnym materiálom.Aglutinovaný materiál sa koncentroval v hlavičke spermie (zostava podobná hlave medúzy; obr. 5B) a expandoval distálne, čím sa získal žiarivo žltý vzhľad pod fluorescenčnou mikroskopiou, keď bol zafarbený akridínovou oranžou (obr. 6C).Táto látka je jasne viditeľná pod skenovacím mikroskopom a považuje sa za spojivo.Polotenké rezy (obr. 5C) a stery spermií zafarbené akridínovou oranžou vykazovali zväzky spermií obsahujúce husto zbalené hlavy a stočené chvosty (obr. 5D).
Rôzne mikrofotografie zobrazujúce agregáciu hláv spermií a zložených chvostov pomocou rôznych metód.(A) Prierezová digitálna farebná transmisná elektrónová mikrofotografia zväzku spermií zobrazujúca stočenú hlavičku spermie s dvojdielnym jadrom (modrá) a niekoľkými bičíkovými časťami (zelená).(B) Digitálna farebná skenovacia elektrónová mikrofotografie zobrazujúca zhluk hláv spermií podobných medúzam (šípky), ktoré sa zdajú byť zakryté.(C) Polotenký rez zobrazujúci agregované hlavy spermií (šípky) a stočené chvosty (šípky).(D) Mikrosnímka spermiového náteru zafarbeného akridínovou oranžou zobrazujúca agregáty hláv spermií (šípky) a stočené priľnavé chvosty (šípky).Všimnite si, že lepkavá látka (S) pokrýva hlavu spermie.(D) x 1000 zväčšenie.
Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (obr. 7A) sa tiež zistilo, že hlavičky spermií boli skrútené a jadrá mali špirálovitý tvar, čo potvrdili stery spermií zafarbené akridínovou oranžou a skúmané pomocou fluorescenčnej mikroskopie (obr. 7B).
(A) Digitálny farebný transmisný elektrónový mikrosnímok a (B) ster spermií zafarbený akridínovou oranžou zobrazujúci stočené hlavy a pripojenie hlavičiek a chvostov spermií (šípky).(B) x 1000 zväčšenie.
Zaujímavým zistením je, že Sharkaziho spermie sa zhlukujú a vytvárajú pohyblivé vláknité zväzky.Vlastnosti týchto zväzkov nám umožňujú pochopiť ich možnú úlohu pri absorpcii a skladovaní spermií v SST.
Po párení spermie vstupujú do vagíny a podstupujú intenzívny selekčný proces, výsledkom čoho je, že do SST15,16 vstupuje len obmedzený počet spermií.Mechanizmy, ktorými spermie vstupujú a opúšťajú SST, sú doteraz nejasné.U hydiny sa spermie uchovávajú v SST na predĺžené obdobie 2 až 10 týždňov, v závislosti od druhu6.Kontroverzia zostáva o stave spermy počas skladovania v SST.Sú v pohybe alebo v pokoji?Inými slovami, ako si spermie udržia svoju pozíciu v SST tak dlho?
Forman4 navrhol, že pobyt a ejekciu SST možno vysvetliť z hľadiska motility spermií.Autori predpokladajú, že spermie si udržiavajú svoju polohu plávaním proti prúdu tekutiny vytvorenému epitelom SST a že spermie sú z SST vyvrhnuté, keď ich rýchlosť klesne pod bod, v ktorom sa začnú pohybovať dozadu v dôsledku nedostatku energie.Zaniboni5 potvrdila prítomnosť akvaporínov 2, 3 a 9 v apikálnej časti epitelových buniek SST, čo môže nepriamo podporovať Foremanov model skladovania spermií.V súčasnej štúdii sme zistili, že takmer polovica Sharkashiho spermií vykazuje pozitívnu reológiu v prúdiacej tekutine a že aglutinované zväzky spermií zvyšujú počet spermií vykazujúcich pozitívnu reológiu, hoci aglutinácia ich spomaľuje.Nie je úplne pochopené, ako spermie putujú vajíčkovodom vtáka do miesta oplodnenia.U cicavcov folikulárna tekutina chemopriťahuje spermie.Predpokladá sa však, že chemoatraktanty nasmerujú spermie na veľké vzdialenosti7.Preto sú za transport spermií zodpovedné iné mechanizmy.Schopnosť spermií orientovať sa a prúdiť proti tekutine vajcovodov uvoľnenej po párení sa uvádza ako hlavný faktor pri zacielení na spermie u myší.Parker 17 navrhol, že spermie prechádzajú cez vajcovody plávaním proti ciliárnemu prúdu u vtákov a plazov.Hoci to nebolo experimentálne preukázané u vtákov, Adolphi18 bol prvý, kto zistil, že vtáčie spermie dávajú pozitívne výsledky, keď sa medzi krycím sklíčkom a podložným sklíčkom vytvorí tenká vrstva tekutiny pomocou prúžku filtračného papiera.Reológia.Hino a Yanagimachi [19] umiestnili komplex myších vaječníkov, vajcovodov a maternice do perfúzneho krúžku a vstrekli 1 µl atramentu do isthmu na vizualizáciu prietoku tekutiny vo vajíčkovodoch.Všimli si veľmi aktívny pohyb kontrakcie a relaxácie vo vajíčkovode, v ktorom sa všetky atramentové guľôčky neustále pohybovali smerom k ampulke vajíčkovodu.Autori zdôrazňujú dôležitosť prietoku tubulárnej tekutiny z dolných do horných vajcovodov pre vyzdvihnutie spermií a oplodnenie.Brillard20 uviedol, že u kurčiat a moriek migrujú spermie aktívnym pohybom z vaginálneho vchodu, kde sú uložené, do uterovaginálneho spojenia, kde sú uložené.Tento pohyb však nie je potrebný medzi uterovaginálnym spojením a infundibulom, pretože spermie sú transportované pasívnym premiestňovaním.Po znalosti týchto predchádzajúcich odporúčaní a výsledkov získaných v súčasnej štúdii možno predpokladať, že schopnosť spermií pohybovať sa proti prúdu (reológia) je jednou z vlastností, na ktorých je založený proces výberu.To určuje prechod spermií cez vagínu a ich vstup do CCT na uskladnenie.Ako navrhol Forman4, môže to tiež uľahčiť proces vstupu spermií do SST a jeho biotopu na určitý čas a potom výstup, keď sa ich rýchlosť začne spomaľovať.
Na druhej strane, Matsuzaki a Sasanami 21 navrhli, že vtáčie spermie podliehajú zmenám motility z dormancie na pohyblivosť v mužských a ženských reprodukčných traktoch.Inhibícia rezidentnej motility spermií v SST bola navrhnutá na vysvetlenie dlhého času skladovania spermií a následného omladenia po opustení SST.V hypoxických podmienkach Matsuzaki et al.1 uvádzal vysokú produkciu a uvoľňovanie laktátu v SST, čo môže viesť k inhibícii rezidentnej motility spermií.V tomto prípade sa dôležitosť reológie spermií odráža vo výbere a absorpcii spermií, a nie v ich skladovaní.
Vzor aglutinácie spermií sa považuje za pravdepodobné vysvetlenie dlhého obdobia skladovania spermií v SST, pretože ide o bežný vzor retencie spermií u hydiny2,22,23.Bakst a kol.2 pozorovali, že väčšina spermií k sebe priľnula a vytvárala fascikulárne agregáty a jednotlivé spermie sa v CCM prepelíc našli len zriedka.Na druhej strane Wen a spol.24 pozorovali viac rozptýlených spermií a menej chumáčov spermií v lúmene SST u kurčiat.Na základe týchto pozorovaní možno predpokladať, že sklon k aglutinácii spermií sa líši medzi vtákmi a medzi spermiami v rovnakom ejakuláte.Okrem toho Van Krey a spol.9 naznačuje, že náhodná disociácia aglutinovaných spermií je zodpovedná za postupné prenikanie spermií do lúmenu vajcovodu.Podľa tejto hypotézy by sa z SST mali najskôr vylúčiť spermie s nižšou aglutinačnou kapacitou.V tomto kontexte môže byť schopnosť spermií aglutinovať faktorom ovplyvňujúcim výsledok konkurencie spermií u špinavých vtákov.Navyše, čím dlhšie sa aglutinované spermie disociujú, tým dlhšie sa zachováva plodnosť.
Hoci agregácia spermií a agregácia do zväzkov boli pozorované v niekoľkých štúdiách2,22,24, neboli podrobne opísané kvôli zložitosti ich kinematického pozorovania v rámci SST.Uskutočnilo sa niekoľko pokusov študovať aglutináciu spermií in vitro.Rozsiahla, ale prechodná agregácia bola pozorovaná, keď bol tenký drôt odstránený z visiacej kvapky semena.To vedie k tomu, že z kvapky vyčnieva predĺžená bublina, ktorá napodobňuje semennú žľazu.Kvôli 3D obmedzeniam a krátkym časom odkvapkávania celý blok rýchlo schátral9.V súčasnej štúdii sme pomocou kurčiat Sharkashi a mikrofluidných čipov dokázali opísať, ako sa tieto chumáče tvoria a ako sa pohybujú.Zväzky spermií sa vytvorili ihneď po odbere spermy a zistilo sa, že sa pohybujú špirálovito, pričom vykazujú pozitívnu reológiu, keď sú prítomné v toku.Okrem toho sa pri makroskopickom pohľade pozorovalo, že zväzky spermií zvyšujú linearitu motility v porovnaní s izolovanými spermiami.To naznačuje, že aglutinácia spermií sa môže vyskytnúť pred penetráciou SST a že produkcia spermií nie je obmedzená na malú oblasť v dôsledku stresu, ako sa predtým navrhovalo (Tingari a Lake12).Počas tvorby chumáčov spermie synchrónne plávajú, až kým nevytvoria spojenie, potom sa ich chvosty omotajú okolo seba a hlavička spermie zostane voľná, ale chvost a distálna časť spermie sa zlepia lepivou látkou.Preto je za pohyb zodpovedná voľná hlava väziva, ktorá ťahá zvyšok väzu.Skenovacia elektrónová mikroskopia zväzkov spermií ukázala pripojené hlavičky spermií pokryté množstvom lepkavého materiálu, čo naznačuje, že hlavičky spermií boli pripevnené v pokojových zväzkoch, čo sa mohlo vyskytnúť po dosiahnutí miesta uloženia (SST).
Keď je spermiový náter zafarbený akridínovou oranžou, pod fluorescenčným mikroskopom je možné vidieť extracelulárny adhezívny materiál okolo spermií.Táto látka umožňuje zväzkom spermií priľnúť a priľnúť k okolitým povrchom alebo časticiam tak, aby sa neunášali s okolitým tokom.Naše pozorovania teda ukazujú úlohu adhézie spermií vo forme mobilných zväzkov.Ich schopnosť plávať proti prúdu a držať sa blízkych povrchov umožňuje spermiám zostať dlhšie v SST.
Rothschild25 použil hemocytometrickú kameru na štúdium plávajúcej distribúcie semena hovädzieho dobytka v kvapke suspenzie, pričom urobil mikrofotografie cez kameru s vertikálnou aj horizontálnou optickou osou mikroskopu.Výsledky ukázali, že spermie boli priťahované k povrchu komôrky.Autori naznačujú, že medzi spermiami a povrchom môžu existovať hydrodynamické interakcie.Ak to vezmeme do úvahy, spolu so schopnosťou spermy kurčiat Sharkashi vytvárať lepkavé chumáče, môže to zvýšiť pravdepodobnosť, že sperma priľne k stene SST a bude skladovaná na dlhé časové obdobia.
Bccetti a Afzeliu26 uviedli, že glykokalyx spermií je potrebný na rozpoznávanie a aglutináciu gamét.Forman10 pozoroval, že hydrolýza a-glykozidových väzieb v glykoproteín-glykolipidových povlakoch ošetrením vtáčieho semena neuraminidázou viedla k zníženiu plodnosti bez ovplyvnenia motility spermií.Autori predpokladajú, že účinok neuraminidázy na glykokalyxu zhoršuje sekvestráciu spermií na uterovaginálnom spojení, čím sa znižuje plodnosť.Ich pozorovania nemôžu ignorovať možnosť, že liečba neuraminidázou môže znížiť rozpoznávanie spermií a oocytov.Forman a Engel10 zistili, že plodnosť sa znížila, keď boli sliepky intravaginálne inseminované spermou ošetrenou neuraminidázou.Avšak IVF so spermiami ošetrenými neuraminidázou neovplyvnilo fertilitu v porovnaní s kontrolnými kurčatami.Autori dospeli k záveru, že zmeny v glykoproteín-glykolipidovom obale okolo membrány spermií znížili schopnosť spermií oplodniť sa zhoršením sekvestrácie spermií v uterovaginálnom spojení, čo následne zvýšilo stratu spermií v dôsledku rýchlosti uterovaginálneho spojenia, ale neovplyvnilo rozpoznávanie spermií a vajíčok.
U moriek Bakst a Bauchan 11 našli malé vezikuly a fragmenty membrány v lúmene SST a pozorovali, že niektoré z týchto granúl fúzovali so spermiovou membránou.Autori naznačujú, že tieto vzťahy môžu prispieť k dlhodobému skladovaniu spermií pri SST.Vedci však nešpecifikovali zdroj týchto častíc, či sú vylučované CCT epitelovými bunkami, produkované a vylučované mužským reprodukčným systémom, alebo produkované samotnými spermiami.Tieto častice sú tiež zodpovedné za aglutináciu.Grützner et al27 uviedli, že epididymálne epitelové bunky produkujú a vylučujú špecifický proteín, ktorý je potrebný na tvorbu semenných traktov s jedným pórom.Autori tiež uvádzajú, že disperzia týchto zväzkov závisí od interakcie epididymálnych proteínov.Nixon et al28 zistili, že adnexa vylučujú proteín, kyslý osteonektín bohatý na cysteín;SPARC sa podieľa na tvorbe chumáčov spermií u echidnas a platypusov s krátkym zobákom.Rozptyl týchto lúčov je spojený so stratou tohto proteínu.
V súčasnej štúdii ultraštrukturálna analýza pomocou elektrónovej mikroskopie ukázala, že spermie priľnuli k veľkému množstvu hustého materiálu.Predpokladá sa, že tieto látky sú zodpovedné za aglutináciu, ktorá kondenzuje medzi a okolo priľnutých hláv, ale v nižších koncentráciách v oblasti chvosta.Predpokladáme, že táto aglutinačná látka sa vylučuje z mužského reprodukčného systému (epididymis alebo vas deferens) spolu so semenom, pretože často pozorujeme oddelenie semena od lymfy a semennej plazmy počas ejakulácie.Uvádza sa, že keď vtáčie spermie prechádzajú cez nadsemenníky a vas deferens, podliehajú zmenám súvisiacim s dozrievaním, ktoré podporujú ich schopnosť viazať proteíny a získavať glykoproteíny spojené s plazmatickou lemou.Pretrvávanie týchto proteínov na rezidentných membránach spermií v SST naznačuje, že tieto proteíny môžu ovplyvniť získanie stability membrány spermií30 a určiť ich plodnosť31.Ahammad et al32 uviedli, že spermie získané z rôznych častí mužského reprodukčného systému (od semenníkov po distálny vas deferens) vykazovali progresívny nárast životaschopnosti v podmienkach skladovania v kvapaline bez ohľadu na teplotu skladovania a životaschopnosť u kurčiat sa tiež zvyšuje vo vajíčkovodoch po umelej inseminácii.
Trsy kuracích spermií Sharkashi majú odlišné vlastnosti a funkcie ako iné druhy, ako sú echidny, ptakopysky, myšiaky lesné, jelene potkany a morčatá.U kurčiat sharkasi tvorba zväzkov spermií znížila rýchlosť ich plávania v porovnaní s jednotlivými spermiami.Tieto zväzky však zvýšili percento reologicky pozitívnych spermií a zvýšili schopnosť spermií stabilizovať sa v dynamickom prostredí.Naše výsledky teda potvrdzujú predchádzajúci návrh, že aglutinácia spermií pri SST je spojená s dlhodobým skladovaním spermií.Tiež predpokladáme, že sklon spermií vytvárať chumáče môže kontrolovať rýchlosť straty spermií pri SST, čo môže zmeniť výsledok konkurencie spermií.Podľa tohto predpokladu spermie s nízkou aglutinačnou kapacitou uvoľňujú najskôr SST, zatiaľ čo spermie s vysokou aglutinačnou kapacitou produkujú väčšinu potomstva.Tvorba jednopórových zväzkov spermií je prospešná a ovplyvňuje pomer rodič-dieťa, ale využíva iný mechanizmus.U echidnas a platypusov sú spermie usporiadané paralelne navzájom, aby sa zvýšila rýchlosť lúča dopredu.Zväzky echidnas sa pohybujú asi trikrát rýchlejšie ako jednotlivé spermie.Predpokladá sa, že tvorba takýchto chumáčov spermií v echidnach je evolučnou adaptáciou na udržanie dominancie, pretože samice sú promiskuitné a zvyčajne sa pária s niekoľkými samcami.Preto spermie z rôznych ejakulátov tvrdo súťažia o oplodnenie vajíčka.
Aglutinované spermie kurčiat sharkasi sa dajú ľahko vizualizovať pomocou mikroskopie s fázovým kontrastom, čo sa považuje za výhodné, pretože umožňuje ľahké štúdium správania spermií in vitro.Mechanizmus, ktorým tvorba chumáčov spermií podporuje reprodukciu u kurčiat sharkasi, sa tiež líši od mechanizmu pozorovaného u niektorých placentárnych cicavcov, ktoré predstavujú kooperatívne správanie spermií, ako sú myšie lesné, kde sa niektoré spermie dostanú k vajíčkam, čím pomáhajú iným príbuzným jedincom dosiahnuť a poškodiť ich vajíčka.dokázať sa.altruistické správanie.Samooplodnenie 34. Ďalší príklad kooperatívneho správania u spermií bol nájdený u jeleních myší, kde spermie boli schopné identifikovať a spojiť sa s geneticky najpríbuznejšími spermiami a vytvoriť kooperatívne skupiny, aby sa zvýšila ich rýchlosť v porovnaní s nepríbuznými spermiami35.
Výsledky získané v tejto štúdii nie sú v rozpore s Fomanovou teóriou o dlhodobom skladovaní spermií v SWS.Výskumníci uvádzajú, že spermie pokračujú v pohybe v prúde epitelových buniek lemujúcich SST po dlhšiu dobu a po určitom čase sa zásoby energie spermií vyčerpajú, čo vedie k zníženiu rýchlosti, čo umožňuje vypudenie látok s nízkou molekulovou hmotnosťou.energie spermií s prietokom tekutiny z lúmenu SST Dutina vajcovodu.V súčasnej štúdii sme pozorovali, že polovica jednotlivých spermií vykazovala schopnosť plávať proti prúdiacim tekutinám a ich adhézia vo zväzku zvýšila ich schopnosť vykazovať pozitívnu reológiu.Okrem toho sú naše údaje v súlade s údajmi Matsuzakiho a kol.1, ktorý uviedol, že zvýšená sekrécia laktátu pri SST môže inhibovať rezidentnú pohyblivosť spermií.Naše výsledky však opisujú tvorbu pohyblivých väzov spermií a ich reologické správanie v prítomnosti dynamického prostredia v mikrokanáli v snahe objasniť ich správanie v SST.Budúci výskum sa môže zamerať na určenie chemického zloženia a pôvodu aglutinačného činidla, čo nepochybne pomôže výskumníkom vyvinúť nové spôsoby skladovania tekutého semena a predĺženia trvania plodnosti.
V štúdii bolo ako darcov spermií vybratých 15 30-týždňových samcov šarkasi s holým krkom (homozygotný dominantný; Na Na).Vtáky boli chované na Výskumnej hydinárskej farme Poľnohospodárskej fakulty Univerzity v Ašite, guvernorát Ašit, Egypt.Vtáky boli umiestnené v individuálnych klietkach (30 x 40 x 40 cm), podrobené svetelnému programu (16 hodín svetlo a 8 hodín tma) a kŕmené potravou obsahujúcou 160 g surových bielkovín, 2800 kcal metabolizovateľnej energie, 35 g vápnika.5 gramov dostupného fosforu na kilogram stravy.
Podľa údajov 36, ​​37 sa sperma odoberala od mužov masážou brucha.Počas 3 dní bolo odobraných celkom 45 vzoriek spermy od 15 mužov.Sperma (n = 15/deň) bola okamžite zriedená v pomere 1:1 (v:v) s Belsville Poultry Semen Diluent, ktorý obsahuje difosforečnan draselný (1,27 g), monohydrát glutamátu sodného (0,867 g), fruktózu (0,5 d) bezvodý sodík.acetát (0,43 g), tris(hydroxymetyl)aminometán (0,195 g), monohydrát citranu draselného (0,064 g), monofosforečnan draselný (0,065 g), chlorid horečnatý (0,034 g) a H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarita 333 mOsm/kg38.Zriedené vzorky spermy sa najprv skúmali pod svetelným mikroskopom, aby sa zabezpečila dobrá kvalita spermy (vlhkosť), a potom sa uskladnili vo vodnom kúpeli pri 37 °C až do použitia do pol hodiny po odbere.
Kinematika a reológia spermií sú opísané pomocou systému mikrofluidných zariadení.Vzorky spermy sa ďalej zriedili na 1:40 v Beltsville Avian Semen Diluent, vložili sa do mikrofluidného zariadenia (pozri nižšie) a kinetické parametre sa určili pomocou systému počítačovej analýzy spermií (CASA), ktorý bol predtým vyvinutý na mikrofluidnú charakterizáciu.o mobilite spermií v tekutých médiách (Katedra strojárstva, Technická fakulta, Assiut University, Egypt).Doplnok si môžete stiahnuť na adrese: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Merala sa krivková rýchlosť (VCL, μm/s), lineárna rýchlosť (VSL, μm/s) a priemerná rýchlosť trajektórie (VAP, μm/s).Videá spermií boli urobené pomocou invertovaného mikroskopu Optika XDS-3 s fázovým kontrastom (so 40x objektívom) pripojeného ku kamere Tucson ISH1000 pri 30 fps po dobu 3 s.Použite softvér CASA na štúdium najmenej troch oblastí a 500 trajektórií spermií na vzorku.Nahraté video bolo spracované pomocou domácej CASA.Definícia motility v zásuvnom module CASA je založená na rýchlosti plávania spermií v porovnaní s rýchlosťou prietoku a nezahŕňa ďalšie parametre, ako je pohyb zo strany na stranu, pretože sa zistilo, že je to spoľahlivejšie v prúdení tekutín.Reologický pohyb je opísaný ako pohyb spermií proti smeru toku tekutiny.Spermie s reologickými vlastnosťami sa vydelili počtom pohyblivých spermií;spermie, ktoré boli v pokoji a konvektívne sa pohybujúce spermie boli vylúčené z počítania.
Všetky použité chemikálie boli získané od Elgomhoria Pharmaceuticals (Káhira, Egypt), pokiaľ nie je uvedené inak.Zariadenie bolo vyrobené tak, ako je opísané v El-sherry et al.40 s niekoľkými úpravami.Materiály použité na výrobu mikrokanálov zahŕňali sklenené platne (Howard Glass, Worcester, MA), negatívny rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetónalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Nemecko) a polyacetón.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanály sa vyrábajú pomocou mäkkej litografie.Najprv sa na tlačiarni s vysokým rozlíšením (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) vytlačila číra ochranná maska ​​na tvár s požadovaným dizajnom mikrokanálov.Predlohy boli vyrobené pomocou sklenených platní ako substrátov.Doštičky sa vyčistili v acetóne, izopropanole a deionizovanej vode a potom sa potiahli 20 um vrstvou SU8-25 rotačným nanášaním (3000 ot./min., 1 min.).Vrstvy SU-8 sa potom jemne vysušili (65 °C, 2 minúty a 95 °C, 10 minút) a vystavili sa UV žiareniu na 50 s.Postexpozičné vypálenie pri 65 °C a 95 °C počas 1 minúty a 4 minút na zosieťovanie exponovaných vrstiev SU-8, po čom nasleduje vyvíjanie v diacetónovom alkohole počas 6,5 minúty.Vafle pečieme natvrdo (200°C 15 min.), aby vrstva SU-8 ešte viac stuhla.
PDMS bol pripravený zmiešaním monoméru a tvrdidla v hmotnostnom pomere 10:1, potom odplynený vo vákuovom exsikátore a naliaty na hlavný rám SU-8.PDMS sa vytvrdil v peci (120 °C, 30 minút), potom sa kanály vyrezali, oddelili od predlohy a perforovali, aby sa umožnilo pripojenie rúrok na vstupe a výstupe mikrokanála.Nakoniec boli mikrokanály PDMS trvalo pripojené k mikroskopickým sklíčkam pomocou prenosného korónového procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL), ako je opísané inde.Mikrokanál použitý v tejto štúdii meria 200 μm × 20 μm (Š × V) a je dlhý 3,6 cm.
Prietok tekutiny vyvolaný hydrostatickým tlakom vo vnútri mikrokanála sa dosahuje udržiavaním hladiny tekutiny vo vstupnom zásobníku nad výškovým rozdielom Δh39 vo výstupnom zásobníku (obr. 1).
kde f je koeficient trenia definovaný ako f = C/Re pre laminárne prúdenie v pravouhlom kanáli, kde C je konštanta v závislosti od pomeru strán kanála, L je dĺžka mikrokanála, Vav je priemerná rýchlosť vo vnútri mikrokanála, Dh je hydraulický priemer kanála, g – gravitačné zrýchlenie.Pomocou tejto rovnice možno vypočítať priemernú rýchlosť kanála pomocou nasledujúcej rovnice: