Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Nedávno bola vyvinutá bezchemická antimikrobiálna platforma založená na nanotechnológii s použitím umelých vodných nanostruktúr (EWNS). EWNS majú vysoký povrchový náboj a sú bohaté na reaktívne formy kyslíka (ROS), ktoré môžu interagovať s množstvom mikroorganizmov vrátane patogénov prenášaných potravinami a inaktivovať ich. Tu sa ukazuje, že ich vlastnosti počas syntézy je možné jemne doladiť a optimalizovať, aby sa ďalej zvýšil ich antibakteriálny potenciál. Laboratórna platforma EWNS bola navrhnutá tak, aby doladila vlastnosti EWNS zmenou parametrov syntézy. Charakterizácia vlastností EWNS (náboj, veľkosť a obsah ROS) sa vykonala pomocou moderných analytických metód. Okrem toho boli na povrch organických hroznových paradajok naočkované potravinárske mikroorganizmy, ako napríklad Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum a Saccharomyces cerevisiae, aby sa vyhodnotil ich potenciál mikrobiálnej inaktivácie. Výsledky prezentované v tomto dokumente ukazujú, že vlastnosti EWNS je možné jemne doladiť počas syntézy, čo vedie k exponenciálnemu zvýšeniu účinnosti inaktivácie. Najmä povrchový náboj sa zvýšil štvornásobne a zvýšil sa aj obsah ROS. Rýchlosť odstraňovania mikróbov bola mikrobiálne závislá a pohybovala sa od 1,0 do 3,8 log po 45 minútach expozície dávke aerosólu 40 000 #/cm3 EWNS.
Mikrobiálna kontaminácia je hlavnou príčinou ochorení prenášaných potravinami spôsobených požitím patogénov alebo ich toxínov. Choroby prenášané potravinami sú len v Spojených štátoch zodpovedné za približne 76 miliónov ochorení, 325 000 hospitalizácií a 5 000 úmrtí ročne1. Okrem toho Ministerstvo poľnohospodárstva Spojených štátov (USDA) odhaduje, že zvýšená konzumácia čerstvých produktov je zodpovedná za 48 percent všetkých ochorení prenášaných potravinami hlásených v Spojených štátoch2. Náklady na choroby a úmrtia v dôsledku patogénov prenášaných potravinami v Spojených štátoch sú veľmi vysoké, Centrá pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) ich odhadujú na viac ako 15,6 miliardy USD ročne3.
V súčasnosti sa chemické4, radiačné5 a tepelné6 antimikrobiálne intervencie na zaistenie bezpečnosti potravín vykonávajú prevažne v obmedzených kritických kontrolných bodoch (CCP) vo výrobnom reťazci (zvyčajne po zbere úrody a/alebo počas balenia), a nie sú implementované nepretržite takým spôsobom, že čerstvé produkty sú vystavené krížovej kontaminácii7. Antimikrobiálne intervencie sú potrebné na lepšiu kontrolu chorôb prenášaných potravinami a kazenia potravín a majú potenciál uplatňovať sa v celom procese „od farmy až po stôl“. Menší vplyv a náklady.
Nedávno bola vyvinutá nanotechnologická antimikrobiálna platforma bez chemikálií na inaktiváciu baktérií na povrchoch a vo vzduchu pomocou umelých vodných nanostruktúr (EWNS). Na syntézu EVNS sa použili dva paralelné procesy: elektrosprej a ionizácia vody (obr. 1a). Už skôr sa preukázalo, že EWNS majú jedinečný súbor fyzikálnych a biologických vlastností8,9,10. EWNS má v priemere 10 elektrónov na štruktúru a priemernú nanometrovú veľkosť 25 nm (obr. 1b,c)8,9,10. Okrem toho elektrónová spinová rezonancia (ESR) ukázala, že EWNS obsahujú veľké množstvo reaktívnych foriem kyslíka (ROS), najmä hydroxylových (OH•) a superoxidových (O2-) radikálov (obr. 1c)8. EWNS zotrvávali vo vzduchu dlhý čas a mohli sa zrážať s mikróbmi suspendovanými vo vzduchu a prítomnými na povrchoch, čím dodávali svoje užitočné zaťaženie ROS a spôsobovali mikrobiálnu inaktiváciu (obr. 1d). Tieto skoršie štúdie tiež ukázali, že EWNS môžu interagovať s rôznymi gramnegatívnymi a grampozitívnymi baktériami verejného zdravia vrátane mykobaktérií a inaktivovať ich na povrchoch a vo vzduchu8,9. Transmisná elektrónová mikroskopia ukázala, že inaktivácia bola spôsobená narušením bunkovej membrány. Okrem toho štúdie akútnej inhalácie ukázali, že vysoké dávky EWNS nespôsobujú poškodenie pľúc ani zápal8.
(a) Elektrosprej nastáva, keď sa medzi kapiláru obsahujúcu kvapalinu a protielektródu aplikuje vysoké napätie. (b) Aplikácia vysokého napätia vedie k dvom rôznym javom: (i) elektrospreju vody a (ii) tvorbe reaktívnych foriem kyslíka (iónov) zachytených v EWNS. (c) Unikátna štruktúra EWNS. (d) EWNS sú vysoko mobilné vďaka svojej nanorozmernej povahe a môžu interagovať s patogénmi prenášanými vzduchom.
Nedávno bola preukázaná aj schopnosť antimikrobiálnej platformy EWNS inaktivovať mikroorganizmy prenášané potravinami na povrchu čerstvých potravín. Ukázalo sa tiež, že povrchový náboj EWNS sa môže použiť v kombinácii s elektrickým poľom na cielené dodávanie. A čo je dôležitejšie, sľubný počiatočný výsledok približne 1,4 logaritmického zníženia aktivity organických paradajok proti rôznym potravinárskym mikroorganizmom, ako sú E. coli a Listeria, bol pozorovaný v priebehu 90 minút po vystavení EWNS pri koncentrácii približne 50 000#/cm311. Okrem toho predbežné organoleptické hodnotiace testy nepreukázali žiadny organoleptický účinok v porovnaní s kontrolnými paradajkami. Hoci tieto počiatočné výsledky inaktivácie sľubujú bezpečnosť potravín aj pri veľmi nízkych dávkach EWNS 50 000#/cm3, je zrejmé, že vyšší inaktivačný potenciál by bol prospešnejší na ďalšie zníženie rizika infekcie a kazenia.
V tejto práci sa zameriame na výskum vývoja platformy na generovanie EWNS s cieľom doladiť parametre syntézy a optimalizovať fyzikálno-chemické vlastnosti EWNS s cieľom zvýšiť ich antibakteriálny potenciál. Optimalizácia sa zamerala najmä na zvýšenie ich povrchového náboja (na zlepšenie cieleného dodávania) a obsahu ROS (na zlepšenie účinnosti inaktivácie). Charakterizácia optimalizovaných fyzikálno-chemických vlastností (veľkosť, náboj a obsah ROS) s použitím moderných analytických metód a s použitím bežných potravinárskych mikroorganizmov, ako sú E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae a M. parafortuitum.
EVNS bol syntetizovaný súčasným elektrorozprašovaním a ionizáciou vysoko čistej vody (18 MΩ cm–1). Elektrický atomizér 12 sa typicky používa na atomizáciu kvapalín a syntetických polymérnych a keramických častíc 13 a vlákien 14 s kontrolovanou veľkosťou.
Ako je podrobne opísané v predchádzajúcich publikáciách 8, 9, 10, 11, v typickom experimente sa medzi kovovú kapiláru a uzemnenú protielektródu aplikuje vysoké napätie. Počas tohto procesu dochádza k dvom rôznym javom: 1) elektrosprej a 2) ionizácia vody. Silné elektrické pole medzi dvoma elektródami spôsobuje hromadenie záporných nábojov na povrchu kondenzovanej vody, čo vedie k tvorbe Taylorových kužeľov. V dôsledku toho sa tvoria vysoko nabité kvapôčky vody, ktoré sa podľa Rayleighovej teórie16 ďalej rozpadajú na menšie častice. Zároveň silné elektrické pole spôsobuje štiepenie niektorých molekúl vody a odštiepenie elektrónov (ionizácia), čím sa generuje veľké množstvo reaktívnych foriem kyslíka (ROS)17. Súčasne generované pakety ROS18 boli zapuzdrené v EWNS (obr. 1c).
Na obr. 2a je znázornený systém generovania EWNS vyvinutý a použitý pri syntéze EWNS v tejto štúdii. Čistená voda uložená v uzavretej fľaši bola privádzaná cez teflónovú trubicu (vnútorný priemer 2 mm) do ihly z nehrdzavejúcej ocele 30G (kovová kapilára). Ako je znázornené na obrázku 2b, prietok vody je riadený tlakom vzduchu vo vnútri fľaše. Ihla je pripevnená k teflónovej konzole, ktorú je možné manuálne nastaviť do určitej vzdialenosti od protielektródy. Protielektróda je leštený hliníkový disk s otvorom v strede na odber vzoriek. Pod protielektródou sa nachádza hliníkový odberový lievik, ktorý je pripojený k zvyšku experimentálneho zariadenia cez odberový port (obr. 2b). Všetky komponenty vzorkovača sú elektricky uzemnené, aby sa zabránilo hromadeniu náboja, ktorý by mohol zhoršiť odber vzoriek častíc.
(a) Systém na generovanie nanostruktúr vody (EWNS). (b) Prierez vzorkovača a elektrosprejovej jednotky zobrazujúci najdôležitejšie parametre. (c) Experimentálne usporiadanie na inaktiváciu baktérií.
Systém generovania EWNS opísaný vyššie je schopný meniť kľúčové prevádzkové parametre, aby sa uľahčilo jemné doladenie vlastností EWNS. Upravte aplikované napätie (V), vzdialenosť medzi ihlou a protielektródou (L) a prietok vody (φ) cez kapiláru, aby ste jemne doladili charakteristiky EWNS. Symboly [V (kV), L (cm)] sa používajú na označenie rôznych kombinácií. Upravte prietok vody tak, aby ste dosiahli stabilný Taylorov kužeľ určitej sady [V, L]. Pre účely tejto štúdie bola apertúra protielektródy (D) nastavená na 0,5 palca (1,29 cm).
Vzhľadom na obmedzenú geometriu a asymetriu nie je možné vypočítať intenzitu elektrického poľa z prvých princípov. Namiesto toho bol na výpočet elektrického poľa použitý softvér QuickField™ (Svendborg, Dánsko)19. Elektrické pole nie je rovnomerné, takže hodnota elektrického poľa na hrote kapiláry bola použitá ako referenčná hodnota pre rôzne konfigurácie.
Počas štúdie bolo hodnotených niekoľko kombinácií napätia a vzdialenosti medzi ihlou a protielektródou z hľadiska tvorby Taylorovho kužeľa, stability Taylorovho kužeľa, stability produkcie EWNS a reprodukovateľnosti. Rôzne kombinácie sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.
Výstup generátora EWNS bol priamo pripojený k meraču veľkosti častíc Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) na meranie koncentrácie počtu častíc a bol použitý s Faradayovým aerosólovým elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, USA). (MN) na meranie prietokov aerosólov, ako je opísané v našej predchádzajúcej publikácii9. SMPS aj aerosólový elektrometer odoberali vzorky pri prietoku 0,5 l/min (celkový prietok vzorky 1 l/min). Koncentrácie častíc a toky aerosólov sa merali 120 sekúnd. Meranie sa opakuje 30-krát. Celkový náboj aerosólu sa vypočíta z meraní prúdu a priemerný náboj EWNS sa odhaduje z celkového počtu odobratých častíc EWNS. Priemerné náklady na EWNS možno vypočítať pomocou rovnice (1):
kde IEl je nameraný prúd, NSMPS je číselná koncentrácia meraná pomocou SMPS a φEl je prietok do elektrometra.
Keďže relatívna vlhkosť (RH) ovplyvňuje povrchový náboj, teplota a (RH) sa počas experimentu udržiavali konštantné na 21 °C a 45 %.
Na meranie veľkosti a životnosti EWNS sa použila mikroskopia atómových síl (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) a sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonsko). Frekvencia skenovania AFM je 1 Hz a plocha skenovania je 5 µm × 5 µm s 256 skenovacími riadkami. Všetky snímky boli podrobené zarovnaniu obrazu prvého rádu pomocou softvéru Asylum (maska ​​s rozsahom 100 nm a prahom 100 pm).
Odstráňte odberový lievik a umiestnite povrch sľudy do vzdialenosti 2,0 cm od protielektródy na priemerný čas 120 s, aby ste zabránili koalescencii častíc a tvorbe nepravidelných kvapôčok na povrchu sľudy. EWNS sa aplikovalo priamo na čerstvo narezané povrchy sľudy (Ted Pella, Redding, CA). Ihneď po naprašovaní sa povrch sľudy vizualizoval pomocou AFM. Kontaktný uhol povrchu čerstvo narezanej nemodifikovanej sľudy je blízky 0°, takže EWNS sa šíri po povrchu sľudy v kupolovitom tvare20. Priemer (a) a výška (h) difúznych kvapôčok sa merali priamo z topografie AFM a použili sa na výpočet kupolovitého difúzneho objemu EWNS pomocou našej predtým validovanej metódy8. Za predpokladu, že integrovaný EVNS má rovnaký objem, ekvivalentný priemer sa dá vypočítať z rovnice (2):
V súlade s našou predtým vyvinutou metódou bola na detekciu prítomnosti krátkodobých radikálových medziproduktov v EWNS použitá spinová pasca s elektrónovou spinovou rezonanciou (ESR). Aerosóly boli preháňané roztokom obsahujúcim 235 mM DEPMPO (5-(dietoxyfosforyl)-5-metyl-1-pyrolín-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Všetky EPR merania boli vykonané pomocou spektrometra Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) a plochých celových polí. Na zber a analýzu údajov bol použitý softvér Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). Charakterizácia ROS bola vykonaná iba pre súbor prevádzkových podmienok [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentrácie EWNS boli merané pomocou SMPS po zohľadnení straty EWNS v impaktore.
Hladiny ozónu boli monitorované pomocou dvojlúčového ozónového monitora 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pre všetky vlastnosti EWNS je nameraná hodnota priemerom meraní a chyba merania je štandardná odchýlka. Na porovnanie hodnoty optimalizovaného atribútu EWNS so zodpovedajúcou hodnotou základného EWNS bol vykonaný t-test.
Obrázok 2c zobrazuje predtým vyvinutý a charakterizovaný systém elektrostatického precipitačného priechodu (EPES), ktorý možno použiť na zacielenie EWNS11 na povrchy. EPES využíva náboj EWNS v kombinácii so silným elektrickým poľom na priame „nasmerovanie“ na povrch cieľa. Podrobnosti o systéme EPES sú prezentované v nedávnej publikácii Pyrgiotakisa a kol.11. EPES teda pozostáva z 3D tlačenej PVC komory so zúženými koncami, ktorá obsahuje dve rovnobežné kovové dosky z nehrdzavejúcej ocele (nehrdzavejúca oceľ 304, zrkadlovo leštená) uprostred vzdialené od seba 15,24 cm. Dosky boli pripojené k externému zdroju vysokého napätia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodná doska bola vždy kladná a vrchná doska bola vždy uzemnená (plávajúca). Steny komory sú pokryté hliníkovou fóliou, ktorá je elektricky uzemnená, aby sa zabránilo strate častíc. Komora má utesnené predné plniace dvierka, ktoré umožňujú umiestniť testovacie povrchy na plastové stojany a zdvihnúť ich zo spodnej kovovej dosky, aby sa predišlo rušeniu vysokým napätím.
Účinnosť depozície EWNS v EPES bola vypočítaná podľa predtým vyvinutého protokolu podrobne opísaného v doplnkovom obrázku S111.
Ako riadiaca komora je druhý prúd cez valcovú komoru zapojený do série so systémom EPES pomocou medziľahlého HEPA filtra na odstránenie EWNS. Ako je znázornené na obr. 2c, aerosól EWNS bol čerpaný cez dve komory zapojené do série. Filter medzi riadiacou miestnosťou a EPES odstraňuje všetky zostávajúce EWNS, čo vedie k rovnakej teplote (T), relatívnej vlhkosti (RH) a hladine ozónu.
Zistilo sa, že dôležité mikroorganizmy prenášané potravinami kontaminujú čerstvé produkty, ako napríklad Escherichia coli (ATCC #27325), indikátor výkalov, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogén prenášaný potravinami, Listeria innocua (ATCC #33090), alternatíva k patogénnej Listeria monocytogenes. Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ako alternatíva ku kvasinkám spôsobujúcim kazenie produktov a Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) ako odolnejšie živé baktérie boli zakúpené od spoločnosti ATCC (Manassas, Virgínia).
Náhodne si kúpte krabice bio hroznových paradajok z miestneho trhu a uchovávajte ich v chladničke pri teplote 4 °C až do spotreby (maximálne 3 dni). Vyberte si paradajky na experimentovanie jednej veľkosti s priemerom približne 1,25 cm.
Protokoly pre inkubáciu, inokuláciu, expozíciu a počítanie kolónií boli podrobne opísané v našich predchádzajúcich publikáciách a podrobne vysvetlené v doplnkových údajoch 11. Výkonnosť EWNS bola hodnotená vystavením inokulovaných paradajok 40 000 #/cm3 počas 45 minút. Stručne povedané, v čase t = 0 min boli tri paradajky použité na vyhodnotenie prežívajúcich mikroorganizmov. Tri paradajky boli umiestnené do EPES a vystavené EWNS v koncentrácii 40 000 #/cm3 (paradajky vystavené EWNS) a tri ďalšie boli umiestnené do kontrolnej komory (kontrolné paradajky). Žiadna zo skupín paradajok nebola podrobená ďalšiemu spracovaniu. Paradajky vystavené EWNS a kontrolné skupiny boli po 45 minútach odstránené, aby sa vyhodnotil účinok EWNS.
Každý experiment sa uskutočnil v troch opakovaniach. Analýza údajov sa vykonala podľa protokolu opísaného v doplnkových údajoch.
Vzorky baktérií E. coli, Enterobacter a L. innocua vystavené EWNS (45 min, koncentrácia aerosólu EWNS 40 000 #/cm3) a neexponované boli peletované na posúdenie mechanizmov inaktivácie. Precipitát bol fixovaný počas 2 hodín pri izbovej teplote v 0,1 M roztoku kakodylátu sodného (pH 7,4) s fixatívom 2,5 % glutaraldehydu, 1,25 % paraformaldehydu a 0,03 % kyseliny pikrovej. Po premytí boli fixované 1 % roztokom oxidu osmia (OsO4)/1,5 % ferokyanidu draselného (KFeCN6) počas 2 hodín, 3-krát premyté vodou a inkubované v 1 % uranylacetátu počas 1 hodiny, potom dvakrát premyté vodou. Následná dehydratácia 10 minút 50 %, 70 %, 90 % a 100 % alkoholom. Vzorky boli potom umiestnené na 1 hodinu do propylénoxidu a impregnované zmesou propylénoxidu a TAAP Eponu v pomere 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Vzorky boli zaliate do TAAB Eponu a polymerizované pri teplote 60 °C počas 48 hodín. Vytvrdená granulovaná živica bola narezaná a vizualizovaná pomocou TEM s použitím JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonsko), konvenčného transmisného elektrónového mikroskopu vybaveného CCD kamerou AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Pre každý časový bod boli bakteriálne výplachy nanesené v troch opakovaniach, čo viedlo k celkovému počtu deviatich dátových bodov na bod, ktorých priemer bol použitý ako bakteriálna koncentrácia pre daný organizmus. Štandardná odchýlka bola použitá ako chyba merania. Počítajú sa všetky body.
Logaritmus poklesu koncentrácie baktérií v porovnaní s t = 0 min bol vypočítaný pomocou nasledujúceho vzorca:
kde C0 je koncentrácia baktérií v kontrolnej vzorke v čase 0 (t. j. po vysušení povrchu, ale pred umiestnením do komory) a Cn je koncentrácia baktérií na povrchu po n minútach expozície.
Aby sa zohľadnila prirodzená degradácia baktérií počas 45-minútového expozičného obdobia, vypočítala sa aj logaritmická redukcia v porovnaní s kontrolnou skupinou po 45 minútach takto:
Kde Cn je koncentrácia baktérií v kontrolnej vzorke v čase n a Cn-Control je koncentrácia kontrolných baktérií v čase n. Údaje sú prezentované ako logaritmické zníženie v porovnaní s kontrolnou skupinou (bez expozície EWNS).
Počas štúdie bolo hodnotených niekoľko kombinácií napätia a vzdialenosti medzi ihlou a protielektródou z hľadiska tvorby Taylorovho kužeľa, stability Taylorovho kužeľa, stability produkcie EWNS a reprodukovateľnosti. Rôzne kombinácie sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. Pre kompletnú štúdiu boli vybrané dva prípady, ktoré preukázali stabilné a reprodukovateľné vlastnosti (Taylorov kužeľ, produkcia EWNS a stabilita v čase). Na obr. 3 sú znázornené výsledky týkajúce sa náboja, veľkosti a obsahu ROS pre dva prípady. Výsledky sú tiež zhrnuté v tabuľke 1. Pre porovnanie, obrázok 3 a tabuľka 1 zahŕňajú vlastnosti predtým syntetizovaných neoptimalizovaných EWNS8, 9, 10, 11 (základný stav-EWNS). Výpočty štatistickej významnosti s použitím obojstranného t-testu sú znovu publikované v doplnkovej tabuľke S2. Okrem toho ďalšie údaje zahŕňajú štúdie o vplyve priemeru vzorkovacieho otvoru protielektródy (D) a vzdialenosti medzi uzemňovacou elektródou a hrotom ihly (L) (doplnkové obrázky S2 a S3).
(a–c) Distribúcia veľkosti AFM. (d–f) Charakteristika povrchového náboja. (g) Charakterizácia ROS a ESR.
Je tiež dôležité poznamenať, že pre všetky vyššie uvedené podmienky boli namerané ionizačné prúdy v rozsahu 2 – 6 µA a napätia v rozsahu -3,8 až -6,5 kV, čo malo za následok spotrebu energie tohto jednopólového generátorového modulu EWNS menšiu ako 50 mW. Hoci bol EWNS syntetizovaný za vysokého tlaku, hladiny ozónu boli veľmi nízke a nikdy nepresiahli 60 ppb.
Doplnkový obrázok S4 zobrazuje simulované elektrické polia pre scenáre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Polia podľa scenárov [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] sú vypočítané ako 2 × 10⁶ V/m a 4,7 × 10⁶ V/m. To sa dá očakávať, pretože pomer napätia k vzdialenosti je v druhom prípade oveľa vyšší.
Na obr. 3a,b je znázornený priemer EWNS meraný pomocou AFM8. Priemerné priemery EWNS pre scenáre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] boli vypočítané ako 27 nm a 19 nm. Geometrické štandardné odchýlky rozdelení pre prípady [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] sú 1,41 a 1,45, čo naznačuje úzke rozdelenie veľkosti. Priemerná veľkosť aj geometrická štandardná odchýlka sú veľmi blízke základnej hodnote EWNS a sú 25 nm a 1,41. Na obr. 3c je znázornené rozdelenie veľkosti základnej hodnoty EWNS merané rovnakou metódou za rovnakých podmienok.
Na obr. 3d,e sú znázornené výsledky charakterizácie náboja. Údaje predstavujú priemerné merania z 30 simultánnych meraní koncentrácie (#/cm3) a prúdu (I). Analýza ukazuje, že priemerný náboj na EWNS je 22 ± 6 e- a 44 ± 6 e- pre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] v uvedenom poradí. V porovnaní so základným EWNS (10 ± 2 e-) je ich povrchový náboj výrazne vyšší, dvojnásobok oproti scenáru [-6,5 kV, 4,0 cm] a štvornásobok oproti scenáru [-3,8 kV, 0,5 cm]. Obr. 3f zobrazuje základné údaje o platbách EWNS.
Z máp koncentrácie počtu častíc EWNS (doplnkové obrázky S5 a S6) je zrejmé, že scéna [-6,5 kV, 4,0 cm] má výrazne vyšší počet častíc ako scéna [-3,8 kV, 0,5 cm]. Treba tiež poznamenať, že koncentrácie počtu častíc EWNS boli monitorované až 4 hodiny (doplnkové obrázky S5 a S6), pričom stabilita generácie EWNS vykazovala v oboch prípadoch rovnaké úrovne koncentrácie počtu častíc.
Obrázok 3g zobrazuje EPR spektrum po odčítaní kontroly (pozadia) pre optimalizované EWNS pri [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektrum je tiež porovnané so základnou líniou EWNS v predtým publikovanej práci. Vypočítaný počet EWNS reagujúcich so spinovou pascou je 7,5 × 104 EWNS/s, čo je podobné predtým publikovanej základnej línii-EWNS8. EPR spektrá jasne naznačovali prítomnosť dvoch typov ROS, kde prevládal O2-, zatiaľ čo OH• bol prítomný v menšom množstve. Okrem toho priame porovnanie intenzít píkov ukázalo, že optimalizované EWNS mali výrazne vyšší obsah ROS v porovnaní so základnou líniou EWNS.
Na obr. 4 je znázornená účinnosť depozície EWNS v EPES. Údaje sú tiež zhrnuté v tabuľke I a porovnané s pôvodnými údajmi EWNS. V oboch prípadoch EUNS bola depozícia blízka 100 % aj pri nízkom napätí 3,0 kV. Typicky je 3,0 kV dostatočné na dosiahnutie 100 % depozície bez ohľadu na zmenu povrchového náboja. Za rovnakých podmienok bola účinnosť depozície Baseline-EWNS iba 56 % v dôsledku nižšieho náboja (priemerne 10 elektrónov na EWNS).
Obrázok 5 a tabuľka 2 sumarizujú stupeň inaktivácie mikroorganizmov naočkovaných na povrchu paradajok po expozícii približne 40 000 #/cm3 EWNS počas 45 minút za optimálneho scenára [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulované E. coli a L. innocua vykazovali významné zníženie o 3,8 log po 45 minútach expozície. Za rovnakých podmienok vykazovala S. enterica nižšie zníženie logaritmu o 2,2 log, zatiaľ čo S. cerevisiae a M. parafortuitum vykazovali zníženie o 1,0 log.
Elektrónové mikrofotografie (obrázok 6) znázorňujúce fyzikálne zmeny vyvolané EWNS v bunkách E. coli, Salmonella enterica a L. innocua, ktoré viedli k inaktivácii. Kontrolné baktérie vykazovali neporušené bunkové membrány, zatiaľ čo exponované baktérie mali poškodené vonkajšie membrány.
Elektrónovo-mikroskopické zobrazenie kontrolných a exponovaných baktérií odhalilo poškodenie membrány.
Údaje o fyzikálno-chemických vlastnostiach optimalizovaných EWNS spoločne ukazujú, že vlastnosti EWNS (povrchový náboj a obsah ROS) sa výrazne zlepšili v porovnaní s predtým publikovanými základnými údajmi EWNS8,9,10,11. Na druhej strane, ich veľkosť zostala v nanometrovom rozsahu, čo je veľmi podobné predtým publikovaným výsledkom, čo im umožňuje zostať vo vzduchu dlhší čas. Pozorovanú polydisperzitu možno vysvetliť zmenami povrchového náboja, ktoré určujú veľkosť Rayleighovho efektu, náhodnosti a potenciálneho zlúčenia EWNS. Ako však podrobne uviedli Nielsen a kol.22, vysoký povrchový náboj znižuje odparovanie účinným zvýšením povrchovej energie/napätia kvapky vody. Táto teória bola experimentálne potvrdená pre mikrokvapky22 a EWNS v našej predchádzajúcej publikácii8. Strata času môže tiež ovplyvniť veľkosť a prispieť k pozorovanému rozloženiu veľkosti.
Okrem toho je náboj na štruktúru približne 22 – 44 e-, v závislosti od okolností, čo je výrazne viac v porovnaní so základným EWNS, ktorý má priemerný náboj 10 ± 2 elektrónov na štruktúru. Treba však poznamenať, že ide o priemerný náboj EWNS. Seto a kol. Ukázalo sa, že náboj nie je rovnomerný a sleduje logaritmicky normálne rozdelenie21. V porovnaní s našou predchádzajúcou prácou zdvojnásobenie povrchového náboja zdvojnásobuje účinnosť depozície v systéme EPES na takmer 100 %11.