Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v Internet Exploreri). Aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu.
Porézne častice oxidu kremičitého boli pripravené sol-gélovou metódou s určitými modifikáciami na získanie makroporéznych častíc. Tieto častice boli derivatizované reverzibilnou adičnou fragmentáciou reťazcového prenosu (RAFT) polymerizáciou s N-fenylmaleimid-metylvinylizokyanátom (PMI) a styrénom na prípravu N-fenylmaleimidu interkaláciou polystyrénu (PMP) stacionárnou fázou 0 mm 0 x 1 stĺpec. balenie.Vyhodnotená PMP kolónová separácia peptidovej zmesi pozostávajúcej z piatich peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) chromatografický výkon2 a trypsínové štiepenie humánneho sérového albumínu optimálnych podmienok ako doštička HAS 8 teoretická elúcia ako počet platní. 000 platní/m². Pri porovnaní separačného výkonu vyvinutej kolóny s komerčnou kolónou Ascentis Express RP-Amide sa zistilo, že separačný výkon kolóny PMP bol lepší ako komerčná kolóna z hľadiska účinnosti separácie a rozlíšenia.
Biofarmaceutický priemysel sa v posledných rokoch stal expandujúcim globálnym trhom s podstatným nárastom podielu na trhu. S explozívnym rastom biofarmaceutického priemyslu1,2,3 je analýza peptidov a proteínov veľmi žiadaná. Okrem cieľového peptidu sa pri syntéze peptidov vytvára niekoľko nečistôt, preto je potrebné chromatografické čistenie na získanie peptidov požadovanej čistoty buniek, analýza veľkého množstva proteínov v telesnom tkanive a vďaka veľkému množstvu proteínového potenciálu v tele je úloha mimoriadne náročná. takmer detegovateľné druhy v jedinej vzorke. Aj keď je hmotnostná spektrometria účinným nástrojom na sekvenovanie peptidov a proteínov, ak sa takéto vzorky vstreknú do hmotnostného spektrometra v jednom prechode, separácia nebude ideálna. Tento problém možno zmierniť implementáciou separácií kvapalinovou chromatografiou (LC) pred MS analýzou, čo zníži počet analytov vstupujúcich do hmotnostného spektrometra, 5,6 v danom čase môže byť v danej fáze koncentrovaná separácia 4 fáz. Tieto analyty a zlepšenie citlivosti detekcie MS. Kvapalinová chromatografia (LC) výrazne pokročila za posledné desaťročie a stala sa populárnou technikou v proteomickej analýze7,8,9,10.
Kvapalinová chromatografia na reverznej fáze (RP-LC) je široko používaná na čistenie a separáciu peptidových zmesí s použitím oktadecyl-modifikovaného oxidu kremičitého (ODS) ako stacionárnej fázy11,12,13.Stacionárne fázy RP však nezabezpečujú dostatočnú separáciu peptidov a proteínov kvôli ich komplexnej štruktúre a amfifilnej povahe 14,15 sú potrebné špeciálne pre polárnu analýzu proteínov a proteínových staníc -polárne skupiny na interakciu s týmito analytmi a ich uchovanie16. Chromatografia v zmiešanom režime, ktorá poskytuje multimodálne interakcie, môže byť alternatívou k RP-LC na separáciu peptidov, proteínov a iných komplexných zmesí. Pripravilo sa niekoľko stacionárnych fáz so zmiešaným režimom a kolóny naplnené týmito fázami sa použili na separáciu peptidov a proteínov, separácie peptidov a proteínov,2RP-17,1 fáza LC, HILIC/RPLC, polárna interkalácia/RPLC) sú vhodné na separáciu peptidov a proteínov vďaka prítomnosti polárnych aj nepolárnych skupín22,23,24,25,26,27,28 .Podobne aj polárne interkalačné stacionárne fázy s kovalentne viazanými polárnymi skupinami vykazujú dobrú separačnú silu a jedinečnú selektivitu pre polárne a analytické interakcie ako separáciu medzi polárnou a nepolárnou fázou.Multimodálne interakcie 29, 30, 31, 32. Nedávno Zhang a kol.30 pripravila dodecyl-terminovanú polyamínovú stacionárnu fázu a úspešne oddelila uhľovodíky, antidepresíva, flavonoidy, nukleozidy, estrogény a niekoľko ďalších analytov. Polárny interkalátor má polárne aj nepolárne skupiny, takže ho možno použiť na separáciu peptidov a proteínov, ktoré majú hydrofóbne aj hydrofilné časti, dostupné pod obchodným názvom C8 amidový stĺpec Kolóny Ascentis Express RP-Amide, ale tieto kolóny sa používajú len na analýzu amínu 33.
V súčasnej štúdii sa pripravila a vyhodnotila polárna zabudovaná stacionárna fáza (polystyrén zapustený N-fenylmaleimidom) na separáciu peptidov a trypsínových digestov HSA. Stacionárna fáza bola pripravená s použitím nasledujúcej stratégie. Porézne častice oxidu kremičitého boli pripravené podľa postupu uvedeného v našej predchádzajúcej publikácii s určitými modifikáciami protokolu prípravy. Pomer močoviny, častice polyetylénglykolu, polyetylénglykolu, vody s veľkou veľkosťou kyseliny octovej a kyseliny TMOS. Ligand, fenylmaleimid-metylvinylizokyanát, bol syntetizovaný a použitý na derivatizáciu častíc oxidu kremičitého na prípravu polárnej zabudovanej stacionárnej fázy. Výsledná stacionárna fáza bola naplnená do kolóny z nehrdzavejúcej ocele (100 × 1,8 mm id) s použitím optimalizovanej schémy plnenia. Náplň kolóny je podporovaná mechanickými vibráciami, aby sa zabezpečilo vytvorenie homogénneho lôžka pozostávajúceho z piatich kolón naplnených peptidom.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucín enkefalín) a trypsínový digest ľudského sérového albumínu (HAS). Pozorovalo sa, že peptidová zmes a trypsínový digest HSA sa separovali s dobrým rozlíšením a účinnosťou. a pozorovalo sa, že proteíny sú dobre rozdelené a účinné na kolóne PMP, ktorá bola účinnejšia ako kolóna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyetylénglykol), močovina, kyselina octová, trimetoxyortokremičitan (TMOS), trimetylchlórsilán (TMCS), trypsín, ľudský sérový albumín (HSA), chlorid amónny, močovina, hexán metyldisilazán (HMDS), metakryloylchlorid (MC4), styrén-oxid TEM, BenPOoxy-oxidedr HPLC Acetonitril (ACN), metanol, 2-propanol a acetón zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Zmes močoviny (8 g), polyetylénglykolu (8 g) a 8 ml 0,01 N kyseliny octovej sa miešala 10 minút a potom sa pridalo 24 ml TMOS za ľadovo chladných podmienok. Reakčná zmes sa zahrievala pri 40 °C 6 hodín a potom pri 120 °C 8 hodín a zvyšok sa vylial do nerezovej ocele. Vysušená mäkká hmota bola hladko rozomletá v peci a kalcinovaná pri 550 °C počas 12 hodín. Pripravili sa tri šarže a charakterizovali sa na preskúmanie reprodukovateľnosti veľkosti častíc, veľkosti pórov a plochy povrchu.
Povrchovou modifikáciou častíc oxidu kremičitého predsyntetizovaným ligandom fenylmaleimid-metylvinylizokyanátom (PCMP) s následnou radiálnou polymerizáciou so styrénom bola pripravená zlúčenina obsahujúca polárnu skupinu.Stacionárna fáza pre agregáty a polystyrénové reťazce. Postup prípravy je opísaný nižšie.
N-fenylmaleimid (200 mg) a metylvinylizokyanát (100 mg) sa rozpustili v suchom toluéne a do reakčnej banky sa pridalo 0,1 ml 2,2'-azoizobutyronitrilu (AIBN), čím sa pripravil kopolymér fenylmaleimid-metylvinylizokyanát, kopolymér sa zahrieval na 4°C a sušil sa 3°C v sušiarni (PMCP) 60 hodín. na 3 hodiny.
Sušené častice oxidu kremičitého (2 g) sa dispergovali v suchom toluéne (100 ml), miešali a sonikovali v 500 ml banke s guľatým dnom počas 10 minút. PMCP (10 mg) sa rozpustilo v toluéne a pridalo sa po kvapkách do reakčnej banky pomocou kvapkacieho lievika. častice (100 g) sa rozpustili v toluéne (200 ml) a pridal sa 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) v prítomnosti 100 ul dibutylcíndilaurátu ako katalyzátora. Zmes sa miešala pri 50 °C 8 hodín, prefiltrovala sa a sušila sa pri 50 °C 3 hodiny.
Styrén (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a častice oxidu kremičitého s naviazaným TEMPO-PMCP (1,5 g) sa dispergovali v toluéne a prepláchli dusíkom. Polymerizácia styrénu sa uskutočňovala pri 100 °C počas 12 hodín. Výsledný produkt sa premyl metanolom a sušil pri 60 °C. Obrázok 1 znázorňuje celkovú reakčnú schému cez noc.
Vzorky boli odplynené pri 393 K počas 1 hodiny, aby sa získal zvyškový tlak nižší ako 10-3 Torr. Množstvo N2 adsorbovaného pri relatívnom tlaku P/P0 = 0,99 sa použilo na stanovenie celkového objemu pórov. Morfológia holých a ligandom viazaných častíc oxidu kremičitého sa skúmala skenovacou elektrónovou mikroskopiou (vzorky oxidu kremičitého Hitachi a oxidu kremičitého boli umiestnené Japan Highbone Bard Technologies). kolóna s použitím lepiacej uhlíkovej pásky. Na vzorky bolo nanesené zlato pomocou rozprašovacieho nanášacieho zariadenia Q150T a na vzorky bola nanesená 5 nm vrstva Au. To zlepšuje efektivitu procesu pri použití nízkych napätí a poskytuje jemnozrnné naprašovanie za studena. Na elementárnu analýzu sa použil elementárny analyzátor Flash EA1112 (na elementárnu analýzu bol použitý Master analyzátor častíc, veľkosť častíc bola použitá A Malvern) distribúcia veľkosti. Častice čistého oxidu kremičitého a častice oxidu kremičitého s viazaným ligandom (každá po 5 mg) boli dispergované v 5 ml izopropanolu, sonikované počas 10 minút, vortexované počas 5 minút a umiestnené na optickú lavicu Mastersizer. Termogravimetrická analýza bola uskutočňovaná rýchlosťou 5 °C za minútu v teplotnom rozsahu 30 až 800 °C.
Kolóny s úzkym otvorom z nehrdzavejúcej ocele vystlané sklom s rozmermi (100 x 1,8 mm vnútorný priemer) boli plnené s použitím metódy suspenzného plnenia, pričom sa použil rovnaký postup ako v Ref.31. Kolóna z nehrdzavejúcej ocele (vyložená sklom, vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) s výstupnou armatúrou obsahujúcou 1 µm fritu bola pripojená k plniču kalu (Alltech Deerfield, IL, USA). Pripravte suspenziu stacionárnej fázy suspendovaním 150 mg stacionárnej fázy v 1,2 ml metanolu, ako aj metanol. postupne použitím tlakov 100 MP na 10 minút, 80 MP na 15 minút a 60 MP na 30 minút. Počas plnenia sa aplikovali mechanické vibrácie pomocou dvoch trepačiek GC kolóny (Alltech, Deerfield, IL, USA), aby sa zabezpečilo rovnomerné naplnenie kolóny. systém LC na kontrolu jeho výkonu.
LC pumpa (10AD Shimadzu, Japonsko), injektor (Valco (USA) C14 W.05) s 50nL vstrekovacou slučkou, membránový odplyňovač (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilárne okienko bolo skonštruované Špeciálny detektor µLC zariadenia (UV-2075) a sklom vystlaná spojovacia kolóna veľmi úzky a skracujúci efekt mikrokolónky so širokým viečkom. ries (50 μm id 365 a redukčné spojovacie kapiláry (50 μm) boli inštalované na 1/16″ výstupe redukčnej spojky. Zber údajov a chromatografické spracovanie sa uskutočnilo pomocou softvéru Multichro 2000. Monitorovanie pri 254 nm Analyty boli testované na UV absorbanciu. Chromatografické údaje boli analyzované MAN OriginProton8).
Albumín z ľudského séra, lyofilizovaný prášok, ≥ 96 % (elektroforéza na agarózovom géli) 3 mg zmiešaný s trypsínom (1,5 mg), 4,0 M močovinou (1 ml) a 0,2 M hydrogénuhličitanom amónnym (1 ml). Roztok sa miešal 10 minút a potom sa udržiaval vo vodnom kúpeli pri 1% FA 37 °C počas 1 % roztok prefiltrujte a skladujte pri teplote do 4 °C.
Separácia peptidových zmesí a HSA trypsínové štiepenia boli hodnotené oddelene na PMP kolónach. Skontrolujte separáciu peptidovej zmesi a trypsínového štiepenia HSA pomocou PMP kolóny a porovnajte výsledky s Ascentis Express RP-Amidovou kolónou. Teoretické číslo platne sa vypočíta takto:
SEM snímky holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaného ligandom sú znázornené na obr.2. SEM snímky holých častíc oxidu kremičitého (A, B) ukazujú, že na rozdiel od našich predchádzajúcich štúdií sú tieto častice sférické, v ktorých sú častice predĺžené alebo majú nepravidelnú symetriu. Povrch častíc oxidu kremičitého s väzbou ligandu (C, D) je hladší ako povrch holých častíc oxidu kremičitého, čo môže byť spôsobené povlakom polystyrénových reťazcov na povrchu častíc oxidu kremičitého.
Snímky holých častíc oxidu kremičitého (A, B) a častíc oxidu kremičitého s viazanými ligandami (C, D) zo skenovacieho elektrónového mikroskopu.
Distribúcie veľkosti častíc holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého s ligandovou väzbou sú znázornené na obrázku 3(A). Krivky distribúcie veľkosti častíc založené na objeme ukázali, že veľkosť častíc oxidu kremičitého sa po chemickej modifikácii zväčšila (obr. 3A). Údaje o distribúcii veľkosti častíc častíc oxidu kremičitého z aktuálnej štúdie a predchádzajúcej štúdie sú porovnané v tabuľke 1(A). Veľkosť častíc na základe objemu, d(0,5 m) v našej predchádzajúcej štúdii, je v porovnaní s hodnotou P06 μm s ad.3 μm. 3,05 μm (častice oxidu kremičitého naviazaného na polystyrén)34.Táto šarža mala v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou užšiu distribúciu veľkosti častíc v dôsledku meniacich sa pomerov PEG, močoviny, TMOS a kyseliny octovej v reakčnej zmesi. Veľkosť častíc fázy PMP je o niečo väčšia ako veľkosť častíc polystyrénovej vrstvy oxidu kremičitého, ktorú sme predtým študovali. , zatiaľ čo vo fáze PMP bola hrúbka vrstvy 1,38 um.
Distribúcia veľkosti častíc (A) a distribúcia veľkosti pórov (B) holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého naviazaného na ligand.
Veľkosť pórov, objem pórov a povrchová plocha častíc oxidu kremičitého v súčasnej štúdii sú uvedené v tabuľke 1 (B). Profily PSD holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého s ligandovou väzbou sú znázornené na obrázku 3 (B). Výsledky sú porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou. Veľkosti pórov holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého s viazaným ligandom sú 310 a 241, čo naznačuje, že veľkosť pórov 16 (B je po zmene zobrazenej chemickej krivky znížená v tabuľke). znázornené na obr. 3(B). Podobne sa objem pórov častíc oxidu kremičitého po chemickej modifikácii zmenšil z 0,67 na 0,58 cm3/g. Špecifický povrch v súčasnosti študovaných častíc oxidu kremičitého je 116 m2/g, čo je porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou (124 m2/g). 05 m2/g po chemickej úprave.
Výsledky elementárnej analýzy stacionárnej fázy sú uvedené v tabuľke 2. Zaťaženie uhlíkom súčasnej stacionárnej fázy je 6,35 %, čo je nižšie ako zaťaženie uhlíkom v našej predchádzajúcej štúdii (častice oxidu kremičitého viazaného polystyrénom, 7,93 %35 a 10,21 %, v uvedenom poradí) 42. Zaťaženie uhlíkom súčasnej stacionárnej fázy je nízke, pretože pri príprave súčasného SPsren-metylového ligandu sa pridáva k súčasnému metyl- vinylizokyanát (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Hmotnostné percento dusíka v súčasnej stacionárnej fáze je 2,21 %, v porovnaní s 0,1735 a 0,85 % hmotnosti dusíka v predchádzajúcich štúdiách. To znamená, že hmotnostné % dusíka je vyššie v súčasnej stacionárnej fáze v dôsledku obsahu fenylmaleimidu. v uvedenom poradí, zatiaľ čo uhlíková náplň konečného produktu (6) bola 6,35 %, ako je uvedené v tabuľke 2. Strata hmotnosti bola kontrolovaná pomocou PMP stacionárnej fázy a krivka TGA je znázornená na obrázku 4. Krivka TGA ukazuje stratu hmotnosti 8,6 %, čo je v dobrej zhode s uhlíkovou náplňou (6,35 %), pretože ligandy obsahujú nielen C, ale aj N, O a
Na povrchovú modifikáciu častíc oxidu kremičitého bol vybraný fenylmaleimid-metylvinylizokyanátový ligand, pretože má polárne fenylmaleimidové skupiny a vinylizokyanátové skupiny. Vinylizokyanátové skupiny môžu ďalej reagovať so styrénom živou radikálovou polymerizáciou. Druhým dôvodom je vloženie skupiny, ktorá má miernu interakciu s analytom a nedochádza k silnej elektrostatickej interakcii medzi analytom a fenylimidom pri normálnej polárnej fáze pH. ary fáza môže byť riadená optimálnym množstvom styrénu a reakčným časom polymerizácie voľných radikálov. Posledný krok reakcie (polymerizácia voľných radikálov) je kritický a môže zmeniť polaritu stacionárnej fázy. Bola vykonaná elementárna analýza, aby sa skontrolovalo zaťaženie uhlíkom v týchto stacionárnych fázach. Zistilo sa, že zvýšenie množstva styrénu a reakčného času pripraveného zvýšilo zaťaženie uhlíka v stacionárnej fáze a rozdielne koncentrácie uhlíka v stacionárnej fáze. Naplňte tieto stacionárne fázy do kolón z nehrdzavejúcej ocele a skontrolujte ich chromatografickú výkonnosť (selektivitu, rozlíšenie, N hodnota atď.). Na základe týchto experimentov sa vybrala optimalizovaná formulácia na prípravu stacionárnej fázy PMP, aby sa zabezpečila riadená polarita a dobrá retencia analytu.
Päť peptidových zmesí (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) bolo tiež hodnotených pomocou PMP kolóny s použitím mobilnej fázy;60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1 % TFA) pri prietokovej rýchlosti 80 μl/min. Pri optimálnych elučných podmienkach je teoretický počet platní (N) na stĺpec (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) 20 000 ± 100 (200 000 uvedených chromatogramov pre stĺpec TMP² a uvedené tri P chromatické hodnoty 3 m2). na obrázku 5A. Rýchla analýza na PMP kolóne pri vysokej prietokovej rýchlosti (700 ul/min), päť peptidov sa eluovalo v priebehu jednej minúty, hodnoty N boli veľmi dobré, 13 500 ± 330 na stĺpec (100 × 1,8 mm id), Zodpovedá 135 000 doštičkám/m2 (obrázok 1 s) identické stĺpce (obrázok 15). ed s tromi rôznymi šaržami PMP stacionárnej fázy na kontrolu reprodukovateľnosti. Koncentrácia analytu pre každú kolónu bola zaznamenaná s použitím optimálnych elučných podmienok a počtu teoretických platní N a retenčného času na oddelenie rovnakej testovanej zmesi na každej kolóne. Údaje o reprodukovateľnosti pre PMP kolóny sú uvedené v tabuľke 4. Reprodukovateľnosť kolóny PMP dobre koreluje s veľmi nízkymi hodnotami %RSD.
Separácia zmesi peptidov na kolóne PMP (B) a kolóne Ascentis Express RP-Amide (A);mobilná fáza 60/40 ACN/H20 (TFA 0,1 %), rozmery PMP kolóny (100 x 1,8 mm vnútorný priemer);analytické Poradie elúcie zlúčenín: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (leucín) kyselina enkefalín)).
Stĺpec PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) bol hodnotený na separáciu tryptických štiepení ľudského sérového albumínu vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii. Chromatogram na obrázku 6 ukazuje, že vzorka je dobre separovaná a rozlíšenie je veľmi dobré. HSA štiepenie bolo analyzované s použitím prietoku 100 µL/min, mobilná fáza 70/30 zobrazená acetonitril a 60% TFA chromatogram. štiepenie HSA bolo rozdelené do 17 píkov zodpovedajúcich 17 peptidom. Vypočítala sa účinnosť separácie každého píku v štiepení HSA a hodnoty sú uvedené v tabuľke 5.
Tryptický štiepenie HSA (100 x 1,8 mm id) sa separovalo na PMP kolóne;prietoková rýchlosť (100 ul/min), mobilná fáza 60/40 acetonitril/voda s 0,1 % TFA.
kde L je dĺžka kolóny, η je viskozita mobilnej fázy, ΔP je spätný tlak kolóny a u je lineárna rýchlosť mobilnej fázy. Priepustnosť kolóny PMP bola 2,5 × 10-14 m2, prietok bol 25 μl/min a použila sa 60/40 obj./obj. kolóna 60/40 v/v. 10 mm permeabilita ACN/1 vody. podobná ako v našej predchádzajúcej štúdii Ref.34. Permeabilita kolóny naplnenej povrchovo poréznymi časticami je: 1,7 × 10-15 pre častice s veľkosťou 1,3 μm, 3,1 × 10-15 pre častice s veľkosťou 1,7 μm, 5,2 × 10-15 a 2,5 × 10-10-15 pre častice μ4 μm, pre častice s veľkosťou 1,3 μm. permeabilita PMP fázy je podobná ako pri 5 μm časticiach typu jadro-obal.
kde Wx je hmotnosť kolóny naplnenej chloroformom, Wy je hmotnosť kolóny naplnenej metanolom a ρ je hustota rozpúšťadla. Hustoty metanolu (ρ = 0,7866) a chloroformu (ρ = 1,484). Celková pórovitosť predtým študovaných kolón SILICA PARTICLES-C18 (100 mm1U a 3) bola 1,8 mm, 3 x 3. 0,63 a 0,55. To znamená, že prítomnosť močovinových ligandov znižuje permeabilitu stacionárnej fázy. Na druhej strane celková pórovitosť PMP kolóny (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) je 0,60. Permeabilita PMP kolón je nižšia ako pri kolónach naplnených časticami C18 v C8-väzbovej fáze s oxidom kremičitým s lineárnou väzbou. reťazce, zatiaľ čo v stacionárnych fázach polystyrénového typu sa okolo neho vytvorí relatívne hrubá polymérna vrstva. V typickom experimente sa pórovitosť kolóny vypočíta ako:
Obrázky 7A,B ukazujú kolónu PMP (100 x 1,8 mm vnútorný priemer) a kolónu Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm vnútorný priemer) s použitím rovnakých elučných podmienok (tj 60/40 ACN/H20 a 0,1 % TFA).) van Deemterovho pozemku.Vybrané zmesi peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) boli pripravené v 20 µL/ Minimálna prietoková rýchlosť pre obe kolóny je 800 µL/min. Minimálna prietoková rýchlosť 0 centov na kolóne HETP/min. Kolóna RP-Amide bola 2,6 µm a 3,9 µm. Hodnoty HETP naznačujú, že účinnosť separácie kolóny PMP (100 × 1,8 mm id) je oveľa lepšia ako komerčne dostupná kolóna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Hodnota van Deemter v porovnaní s predchádzajúcou štúdiou ukazuje vyšší prietok na obr. separačná účinnosť kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) v porovnaní s kolónou Ascentis Express RP-Amide je založená na zlepšeniach tvaru častíc, veľkosti a zložitých postupoch plnenia kolóny používaných v súčasnej práci34.
(A) van Deemterov graf (HETP verzus lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný pomocou PMP kolóny (100 x 1,8 mm vnútorný priemer) v 60/40 ACN/H2O s 0,1 % TFA. (B) van Deemterov graf (HETP verzus lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný s použitím kolóny Ascentis Express RP-Amid × 100 mm s 100 mm ACN. 0,1 % TFA.
Polystyrénová stacionárna fáza bola pripravená a vyhodnotená na separáciu syntetických peptidových zmesí a trypsínových digestov ľudského sérového albumínu (HAS) vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii. Chromatografický výkon PMP kolón pre peptidové zmesi je vynikajúci z hľadiska účinnosti separácie a rozlíšenia. Zlepšená separačná výkonnosť PMP kolón je spôsobená rôznymi dôvodmi, ako je veľkosť častíc a vysoká veľkosť pórov kolónovej separácie v zadnej kolóne a vysoká veľkosť pórov kolónovej separácie na zadnej kolóne. tlak pri vysokých prietokoch je ďalšou výhodou tejto stacionárnej fázy. PMP kolóny majú dobrú reprodukovateľnosť a možno ich použiť na analýzu peptidových zmesí a trypsínové štiepenie rôznych proteínov. Túto kolónu plánujeme použiť na separáciu prírodných produktov, bioaktívnych zlúčenín z liečivých rastlín a extraktov húb v kvapalinovej chromatografii. V budúcnosti budú PMP kolóny hodnotené aj na separáciu proteínov a monoklonových protilátok.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reverse Phase Chromatography Part I: Development of a Column Characterization Protocol.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Vylepšené aktívne peptidy určené na liečbu infekčných ochorení. Biotechnológia. Pokročilá. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: veda a trh.objavenie drog.15 (1-2) dnes, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.101009 (2009.101009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography. J.Chromatografia.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Pokročilá kvapalinová chromatografia-hmotnostná spektrometria umožňuje začlenenie široko cielenej metabolomiky a proteomiky.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Úloha UHPLC pri vývoji liekov.J.Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Základné a praktické aspekty ultravysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchle separácie. J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikácia ultra-vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie pri vývoji liečiv.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. a kol. Monolitické makroporézne hydrogély pripravené z emulzií olej-vo-vode s vysokou vnútornou fázou na účinné čistenie enterovírusov.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Objavujúce sa trendy v separáciách terapeutických peptidov a proteínov kvapalinovou chromatografiou na reverznej fáze: teória a aplikácie.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivová, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvojrozmerná separácia peptidov pomocou systému RP-RP-HPLC s použitím rôznych hodnôt pH v prvom a druhom separačnom rozmere.J.Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Boli skúmané charakteristiky prenosu hmoty a kinetická výkonnosť vysokoúčinných chromatografických kolón naplnených C18 sub-2 μm úplne a povrchovo poréznymi časticami. J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nedávne trendy a analytické výzvy v izolácii, identifikácii a validácii rastlinných bioaktívnych peptidov. anus.biologický anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-018-0852-).
Mueller, JB a kol. Proteomická krajina kráľovstva života. Príroda 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Následné spracovanie terapeutických peptidov preparatívnou kvapalinovou chromatografiou. Molekula (Bazilej, Švajčiarsko) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácia na biopolyméry. J.Chromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandy pre proteínovú chromatografiu v zmiešanom režime: princíp, charakterizácia a dizajn.J.Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).