Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazí karusel s tromi snímkami naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúca a Nasledujúca sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
Pórovité častice oxidu kremičitého boli pripravené sol-gelovou metódou s niekoľkými modifikáciami na získanie častíc so širokými pórmi. Tieto častice boli derivatizované s N-fenylmaleimid-metylvinylizokyanátom (PMI) a styrénom prostredníctvom polymerizácie s reverzným prenosom reťazca a fragmentáciou (RAFT) za vzniku polyamidov interkalovaných N-fenylmaleimidom. Stacionárna fáza styrén (PMP). Úzke kolóny z nehrdzavejúcej ocele (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) boli naplnené suspenznou náplňou. Chromatografický výkon kolóny PMP bol vyhodnotený na oddelenie zmesi syntetických peptidov pozostávajúcej z piatich peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokyselina enkefalín) a tryptického hydrolyzátu ľudského sérového albumínu (HAS). Za optimálnych elučných podmienok dosiahol teoretický počet platní so zmesou peptidov 280 000 platní/m². Pri porovnaní separačného výkonu vyvinutej kolóny s komerčnou kolónou Ascentis Express RP-Amide sa zistilo, že separačná účinnosť kolóny PMP bola lepšia ako u komerčnej kolóny z hľadiska separačnej účinnosti a rozlíšenia.
Biofarmaceutický priemysel sa v posledných rokoch stal rozširujúcim sa globálnym trhom s výrazným nárastom podielu na trhu. S explozívnym rastom biofarmaceutického priemyslu1,2,3 existuje veľká potreba analýzy peptidov a proteínov. Okrem cieľového peptidu sa počas syntézy peptidov tvoria rôzne nečistoty, takže na dosiahnutie požadovanej čistoty peptidu je potrebné chromatografické čistenie. Analýza a charakterizácia proteínov v telesných tekutinách, tkanivách a bunkách je mimoriadne náročná úloha kvôli veľkému počtu potenciálne detekovateľných druhov prítomných v jednej vzorke. Hoci hmotnostná spektrometria je účinným nástrojom na sekvenovanie peptidov a proteínov, ak sa takéto vzorky priamo zavedú do hmotnostného spektrometra, separácia bude neuspokojivá. Tento problém sa dá vyriešiť vykonaním kvapalinovej chromatografie (LC) pred MS analýzou, čo zníži množstvo analytov vstupujúcich do hmotnostného spektrometra v danom čase4,5,6. Okrem toho sa analyty môžu počas separácie v kvapalnej fáze koncentrovať v úzkej oblasti, čím sa tieto analyty koncentrujú a zvyšuje sa citlivosť MS detekcie. Kvapalinová chromatografia (LC) za posledné desaťročie výrazne pokročila a stala sa široko používanou metódou proteomickej analýzy7,8,9,10.
Reverzná fázová kvapalinová chromatografia (RP-LC) sa široko používa na čistenie a separáciu zmesí peptidov s použitím oktadecyl-modifikovaného oxidu kremičitého (ODS) ako stacionárnej fázy11,12,13. Avšak kvôli ich komplexnej štruktúre a amfotérnej povahe14,15 stacionárne fázy RP nemôžu poskytnúť uspokojivú separáciu peptidov a proteínov. Preto analýza peptidov a proteínov s polárnymi a nepolárnymi fragmentmi vyžaduje špeciálne navrhnuté stacionárne fázy na interakciu a zadržanie týchto analytov16. Zmiešaná chromatografia, ktorá ponúka multimodálne interakcie, môže byť alternatívou k RP-LC na separáciu peptidov, proteínov a iných komplexných zmesí. Bolo pripravených niekoľko stacionárnych fáz zmiešaného typu a kolóny naplnené týmito stacionárnymi fázami boli použité na separáciu peptidov a proteínov17,18,19,20,21. Vzhľadom na prítomnosť polárnych a nepolárnych skupín sú na separáciu peptidov a proteínov vhodné zmiešané stacionárne fázy (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polárna interkalácia/RPLC)22,23,24,25,26,27,28. Polárne interkalované stacionárne fázy s kovalentne viazanými polárnymi skupinami vykazujú dobré separačné schopnosti a jedinečnú selektivitu pre polárne a nepolárne analyty, pretože separácia závisí od interakcie medzi analytom a stacionárnou fázou. Multimodálne interakcie 29,30,31,32. Nedávno Zhang a kol. 30 získali behenyl-terminované stacionárne fázy polyamínov a úspešne separovali uhľovodíky, antidepresíva, flavonoidy, nukleozidy, estrogény a niektoré ďalšie analyty. Polárny vložený stacionárny materiál má polárne aj nepolárne skupiny, takže sa môže použiť na separáciu peptidov a proteínov na hydrofóbne a hydrofilné časti. Polárne inline kolóny (napr. kolóny C18 s amidovým inline) sú dostupné pod obchodným názvom kolóny Ascentis Express RP-Amide, ale tieto kolóny sa používajú iba na analýzu amínu 33.
V tejto štúdii bola pripravená polárna vložená stacionárna fáza (N-fenylmaleimid, vložený polystyrén) a vyhodnotená na separáciu peptidov a tryptické štiepenie HSA. Na prípravu stacionárnej fázy bola použitá nasledujúca stratégia. Pórovité častice oxidu kremičitého boli pripravené podľa postupov opísaných v našich predchádzajúcich publikáciách s niekoľkými zmenami v schémach prípravy 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Pomery močoviny, polyetylénglykolu (PEG), TMOS a vodného roztoku kyseliny octovej boli upravené tak, aby sa získali častice oxidu kremičitého s veľkými pórmi. Po druhé, bol syntetizovaný nový ligand fenylmaleimid-metylvinylizokyanátu a jeho derivatizované častice oxidu kremičitého boli použité na prípravu polárne vložených stacionárnych fáz. Získaná stacionárna fáza bola naplnená do kolóny z nehrdzavejúcej ocele (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) podľa optimalizovanej schémy plnenia. Plnenie kolóny je podporované mechanickými vibráciami, aby sa zabezpečila rovnomerná vrstva v kolóne. Náplňová kolóna bola hodnotená na separáciu zmesi peptidov pozostávajúcej z piatich peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín-enkefalínový peptid) a tryptických hydrolyzátov ľudského sérového albumínu (HSA). Bolo pozorované, že zmes peptidov a tryptický štiep HSA sa separovali s dobrým rozlíšením a účinnosťou. Separačná účinnosť kolóny PMP bola porovnaná s účinnosťou kolóny Ascentis Express RP-Amide. Bolo pozorované, že peptidy a proteíny majú dobré rozlíšenie a vysokú separačnú účinnosť na kolóne PMP a separačná účinnosť kolóny PMP je vyššia ako účinnosť kolóny Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyetylénglykol), močovina, kyselina octová, trimetoxyortosilikát (TMOS), trimetylchlórsilán (TMCS), trypsín, ľudský sérový albumín (HSA), chlorid amónny, močovina, hexametylmetakryloyldisilazán (HMDS), metakryloylchlorid (MC), styrén, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) pre HPLC, metanol, 2-propanol a acetón. Spoločnosť Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Zmes močoviny (8 g), polyetylénglykolu (8 g) a 8 ml 0,01 N kyseliny octovej sa miešala 10 minút a za chladenia ľadom sa pridalo 24 ml TMOS. Reakčná zmes sa zahrievala pri teplote 40 °C počas 6 hodín a potom pri teplote 120 °C počas 8 hodín v autokláve z nehrdzavejúcej ocele. Voda sa dekantovala a zvyšok sa sušil pri teplote 70 °C počas 12 hodín. Vysušené mäkké bloky sa hladko rozomleli a kalcinovali v peci pri teplote 550 °C počas 12 hodín. Boli pripravené a charakterizované tri šarže na testovanie reprodukovateľnosti veľkostí častíc, veľkosti pórov a povrchovej plochy.
Polárna skupina a stacionárna fáza pre polystyrénové reťazce. Postup prípravy je opísaný nižšie.
N-fenylmaleimid (200 mg) a metylvinylizokyanát (100 mg) sa rozpustili v bezvodom toluéne a potom sa do reakčnej banky pridalo 0,1 ml 2,2'-azoizobutyronitrilu (AIBN), čím sa získal kopolymér fenylmaleimidu a metylvinylizokyanátu (PMCP). Zmes sa zahrievala pri teplote 60 °C počas 3 hodín, prefiltrovala sa a sušila sa v peci pri teplote 40 °C počas 3 hodín.
Vysušené častice oxidu kremičitého (2 g) boli dispergované v suchom toluéne (100 ml), miešané a sonikované počas 10 minút v 500 ml banke s okrúhlym dnom. PMCP (10 mg) bol rozpustený v toluéne a po kvapkách pridaný do reakčnej banky pomocou prikvapkávacieho lievika. Zmes bola refluxovaná pri 100 °C počas 8 hodín, prefiltrovaná, premytá acetónom a sušená pri 60 °C počas 3 hodín. Potom boli častice oxidu kremičitého spojené s PMCP (100 g) rozpustené v toluéne (200 ml) a k tomu bol pridaný 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) v prítomnosti 100 μl dibutylcíndilaurátu ako katalyzátora. Zmes bola miešaná pri 50 °C počas 8 hodín, prefiltrovaná a sušená pri 50 °C počas 3 hodín.
Styrén (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a častice oxidu kremičitého pripojené k TEMPO-PMCP (1,5 g) boli dispergované v toluéne a prepláchnuté dusíkom. Polymerizácia styrénu sa uskutočňovala pri teplote 100 °C počas 12 hodín. Výsledný produkt sa premyl metanolom a sušil cez noc pri teplote 60 °C. Všeobecná schéma reakcie je znázornená na obr. jedna.
Vzorky boli odplyňované pri teplote 393 K počas 1 hodiny, kým sa nedosiahol zvyškový tlak menší ako 10–3 Torr. Na stanovenie celkového objemu pórov sa použilo množstvo N2 adsorbovaného pri relatívnom tlaku P/P0 = 0,99. Morfológia čistých a ligandmi viazaných častíc oxidu kremičitého bola skúmaná pomocou rastrovacieho elektrónového mikroskopu (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonsko). Suché vzorky (čistý oxid kremičitý a ligandmi viazané častice oxidu kremičitého) boli umiestnené na hliníkové tyče pomocou uhlíkovej pásky. Zlato bolo nanesené na vzorku pomocou naprašovacieho zariadenia Q150T a na vzorku bola nanesená 5 nm hrubá vrstva Au. To zlepšuje účinnosť nízkonapäťového procesu a zabezpečuje jemné striekanie za studena. Elementárna analýza sa vykonala pomocou analyzátora elementárneho zloženia Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Na získanie distribúcie veľkosti častíc bol použitý analyzátor veľkosti častíc Malvern (Worcestershire, Spojené kráľovstvo) Mastersizer 2000. Nepotiahnuté častice oxidu kremičitého a častice oxidu kremičitého viazaného na ligand (každá 5 mg) boli dispergované v 5 ml izopropanolu, sonikované 10 minút, miešané 5 minút a umiestnené na optickú lavicu Mastersizer. Termogravimetrická analýza sa vykonáva rýchlosťou 5 °C za minútu v teplotnom rozsahu od 30 do 800 °C.
Nerezové kolóny s úzkym otvorom a výstelkou zo sklenených vlákien s rozmermi (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) boli naplnené metódou plnenia suspenziou podľa rovnakého postupu ako v odkaze 31. Nerezová oceľová kolóna (s výstelkou zo sklenených vlákien, vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) a výstup obsahujúci fritu s veľkosťou 1 µm boli pripojené k baliacemu stroju na suspenziu (Alltech Deerfield, IL, USA). Suspenziu stacionárnej fázy pripravte suspendovaním 150 mg stacionárnej fázy v 1,2 ml metanolu a jej privedením do rezervoárovej kolóny. Ako rozpúšťadlo suspenzie a kontrolné rozpúšťadlo bol použitý metanol. Kolónu naplňte aplikáciou tlakovej sekvencie 100 MP počas 10 minút, 80 MP počas 15 minút a 60 MP počas 30 minút. V procese plnenia sa použili dva vibrátory kolóny pre plynovú chromatografiu (Alltech, Deerfield, IL, USA) na mechanické vibrovanie, aby sa zabezpečilo rovnomerné naplnenie kolóny. Zatvorte baliaci ventil suspenzie a pomaly uvoľňujte tlak, aby ste predišli poškodeniu kolóny. Kolóna bola odpojená od kalovej trysky a k vstupu bola pripojená ďalšia armatúra a pripojená k systému LC, aby sa otestovala jej činnosť.
Vlastná MLC bola skonštruovaná s použitím LC pumpy (10AD Shimadzu, Japonsko), vzorkovača s 50 nL injekčnou slučkou (Valco (USA) C14 W.05), membránového odplyňovača (Shimadzu DGU-14A) a UV-VIS kapilárneho okna. Detektorové zariadenie (UV-2075) a smaltovaná mikrokolóna. Použite veľmi úzke a krátke spojovacie trubice, aby sa minimalizoval vplyv dodatočnej expanzie kolóny. Po naplnení kolóny nainštalujte kapiláru (50 µm vnútorná priemer 365) na výstup z redukčného spoja 1/16″ a nainštalujte kapiláru (50 µm) redukčného spoja. Zber údajov a spracovanie chromatogramu sa vykonávajú pomocou softvéru Multichro 2000. Pri 254 nm sa monitorovala UV absorbancia analytov pri 0. Chromatografické údaje sa analyzovali pomocou OriginPro8 (Northampton, MA).
Ľudský sérový albumín, lyofilizovaný prášok, ≥ 96 % (elektroforéza na agarózovom géli) 3 mg zmiešaný s trypsínom (1,5 mg), 4,0 M močovinou (1 ml) a 0,2 M hydrogenuhličitanom amónnym (1 ml). Roztok sa miešal 10 minút a udržiaval sa vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C počas 6 hodín, potom sa reakcia zastavila pridaním 1 ml 0,1 % TFA. Roztok sa prefiltroval a uchovával pri teplote do 4 °C.
Separácia zmesi peptidov a trypticky štiepenej HSA na PMP kolóne bola hodnotená samostatne. Skontrolujte tryptickú hydrolýzu zmesi peptidov a HSA oddelených PMP kolónou a porovnajte výsledky s kolónou Ascentis Express RP-Amide. Počet teoretických etáž sa vypočíta pomocou nasledujúcej rovnice:
SEM snímky čistých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaných na ligand sú znázornené na obrázku 2. SEM snímky čistých častíc oxidu kremičitého (A, B) vykazujú guľovitý tvar, v ktorom sú častice predĺžené alebo majú nepravidelnú symetriu v porovnaní s našimi predchádzajúcimi štúdiami. Povrch častíc oxidu kremičitého viazaných na ligand (C, D) je hladší ako povrch čistých častíc oxidu kremičitého, čo môže byť spôsobené polystyrénovými reťazcami pokrývajúcimi povrch častíc oxidu kremičitého.
Skenovacie elektrónové mikrofotografie čistých častíc oxidu kremičitého (A, B) a častíc oxidu kremičitého viazaného na ligand (C, D).
Distribúcia veľkosti častíc čistého oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaného na ligand je znázornená na obr. 2.3(A). Krivky objemovej distribúcie veľkosti častíc ukázali, že veľkosť častíc oxidu kremičitého sa po chemickej modifikácii zvýšila (obr. 3A). Údaje o distribúcii veľkosti častíc oxidu kremičitého zo súčasnej štúdie a predchádzajúcej štúdie sú porovnané v tabuľke 1(A). Objemová veľkosť častíc d(0,5) PMP bola 3,36 µm v porovnaní s hodnotou ad(0,5) 3,05 µm v našej predchádzajúcej štúdii (častice oxidu kremičitého viazané na polystyrén)34. V dôsledku zmeny pomeru PEG, močoviny, TMOS a kyseliny octovej v reakčnej zmesi bola distribúcia veľkosti častíc tejto šarže užšia v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou. Veľkosť častíc fázy PMP je o niečo väčšia ako veľkosť častíc fázy oxidu kremičitého viazaného na polystyrén, ktorú sme študovali skôr. To znamená, že povrchová funkcionalizácia častíc oxidu kremičitého styrénom uložila na povrch oxidu kremičitého iba vrstvu polystyrénu (0,97 µm), zatiaľ čo vo fáze PMP bola hrúbka vrstvy 1,38 µm.
Distribúcia veľkosti častíc (A) a distribúcia veľkosti pórov (B) čistých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaného na ligand.
Veľkosť pórov, objem pórov a povrchová plocha častíc oxidu kremičitého použitých v tejto štúdii sú uvedené v tabuľke 1 (B). Profily PSD čistých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaného na ligand sú znázornené na obr. 3 (B). Výsledky boli porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou34. Veľkosti pórov čistých a ligandmi viazaných častíc oxidu kremičitého boli 310 Å a 241 Å, čo naznačuje, že po chemickej modifikácii sa veľkosť pórov znížila o 69 Å, ako je uvedené v tabuľke 1 (B), a krivka posunu je znázornená na obr. Špecifická povrchová plocha častíc oxidu kremičitého v súčasnej štúdii je 116 m2/g, čo je porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou (124 m2/g). Ako je uvedené v tabuľke 1 (B), povrchová plocha (m2/g) častíc oxidu kremičitého po chemickej modifikácii sa tiež znížila zo 116 m2/g na 105 m2/g.
Výsledky elementárnej analýzy stacionárnej fázy sú uvedené v tabuľke 2. Obsah uhlíka v súčasnej stacionárnej fáze je 6,35 %, čo je menej ako v našej predchádzajúcej štúdii (častice oxidu kremičitého spojené s polystyrénom, 7,93 %35 a 10,21 %)42. Obsah uhlíka v súčasnej stacionárnej fáze je nižší, pretože pri príprave SP sa okrem styrénu použili aj niektoré polárne ligandy, ako napríklad fenylmaleimid, metylvinylizokyanát (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Hmotnostné percento dusíka v súčasnej stacionárnej fáze je 2,21 % v porovnaní s 0,1735 a 0,85 % v predchádzajúcich štúdiách42. To znamená, že súčasná stacionárna fáza má vysoké hmotnostné percento dusíka v dôsledku fenylmaleimidu. Podobne produkty (4) a (5) majú obsah uhlíka 2,7 % a 2,9 %, zatiaľ čo konečný produkt (6) má obsah uhlíka 6,35 %, ako je uvedené v tabuľke 2. Na testovanie úbytku hmotnosti bola použitá termogravimetrická analýza (TGA) na stacionárnej fáze PMP a krivka TGA je znázornená na obrázku 4. Krivka TGA ukazuje úbytok hmotnosti 8,6 %, čo je v dobrej zhode s obsahom uhlíka (6,35 %), pretože ligandy obsahujú nielen C, ale aj N, O a H.
Na modifikáciu povrchu častíc oxidu kremičitého bol zvolený ligand fenylmaleimid-metylvinylizokyanát kvôli jeho polárnym fenylmaleimidovým a vinylizokyanátovým skupinám. Vinylmaleimidové skupiny môžu ďalej reagovať so styrénom živou radikálovou polymerizáciou. Druhým dôvodom je vloženie skupiny, ktorá má mierne interakcie s analytom a žiadne silné elektrostatické interakcie medzi analytom a stacionárnou fázou, pretože fenylmaleimidová časť nemá pri normálnom pH žiadny virtuálny náboj. Polaritu stacionárnej fázy možno riadiť optimálnym množstvom styrénu a reakčným časom polymerizácie voľných radikálov. Posledný krok reakcie (polymérizácia voľných radikálov) je kritický, pretože mení polaritu stacionárnej fázy. Na kontrolu obsahu uhlíka v týchto stacionárnych fázach bola vykonaná elementárna analýza. Bolo pozorované, že zvyšovanie množstva styrénu a reakčného času zvyšuje obsah uhlíka v stacionárnej fáze a naopak. SP pripravené s rôznymi koncentráciami styrénu majú rôzne zaťaženie uhlíkom. Podobne boli tieto stacionárne fázy umiestnené na kolóny z nehrdzavejúcej ocele a boli skontrolované ich chromatografické vlastnosti (selektivita, rozlíšenie, hodnota N atď.). Na základe týchto experimentov bolo zvolené optimalizované zloženie na prípravu stacionárnej fázy PMP, aby sa zabezpečila kontrolovaná polarita a dobrá retencia analytu.
Kolóna PMP bola tiež vyhodnotená na analýzu piatich zmesí peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín-enkefalín) s použitím kapacity mobilnej fázy 60/40 (v/v) ACN/voda (0,1 % TFA) pri prietoku 80 µl/min. Za optimálnych elučných podmienok (200 000 platní/m²) je počet teoretických platní (N) na kolónu (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100. Hodnoty N pre tri kolóny PMP sú uvedené v tabuľke 3 a chromatogramy sú znázornené na obrázku 5A. Rýchla analýza pri vysokom prietoku (700 µl/min) na kolóne PMP, päť peptidov eluovaných v priebehu jednej minúty, vynikajúca hodnota N 13 500 ± 330 na kolónu (priemer 100 x 1,8 mm), čo zodpovedá 135 000 platniam/m (obr. 5B). Tri kolóny rovnakej veľkosti (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) boli naplnené tromi rôznymi dávkami stacionárnej fázy PMP na testovanie reprodukovateľnosti. Analyty boli zaznamenané pre každú kolónu separáciou rovnakej testovanej zmesi na každej kolóne s použitím optimálnych elučných podmienok, počtu teoretických platní N a retenčného času. Údaje o reprodukovateľnosti pre kolóny PMP sú uvedené v tabuľke 4. Reprodukovateľnosť kolóny PMP dobre korelovala s veľmi nízkymi hodnotami %RSD, ako je uvedené v tabuľke 3.
Separácia zmesí peptidov na kolóne PMP (B) a kolóne Ascentis Express RP-Amide (A), mobilná fáza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), rozmery kolóny PMP (100 x 1,8 mm vnútorný priemer), analýza. Elučné poradie zlúčenín: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (enkefalín kyseliny leukovej).
Na separáciu tryptického hydrolyzátu ľudského sérového albumínu pomocou HPLC bola použitá PMP kolóna (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm). Chromatogram na obrázku 6 ukazuje, že vzorky sú dobre separované s veľmi dobrým rozlíšením. Roztoky HSA boli analyzované s použitím prietoku 100 μl/min, mobilnej fázy acetonitril/voda 70/30 a 0,1 % TFA. Štiepenie HSA bolo rozdelené do 17 píkov, ako je znázornené na chromatograme (obr. 6), čo zodpovedá 17 peptidom. Bola vypočítaná účinnosť separácie jednotlivých píkov z hydrolyzátu HSA a hodnoty sú uvedené v tabuľke 5.
Tryptické hydrolyzáty HSA boli separované na PMP kolóne (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm), prietok (100 μl/min), mobilná fáza acetonitril/voda 60/40 a 0,1 % TFA.
kde L je dĺžka kolóny, η je viskozita mobilnej fázy, ΔP je spätný tlak kolóny a u je lineárna rýchlosť mobilnej fázy. Permeabilita kolóny PMP bola 2,5 × 10–14 m2, prietok bol 25 µl/min, bol použitý zmes ACN/voda v pomere 60/40 obj./obj. Permeabilita kolóny PMP (ID 100 × 1,8 mm) bola podobná permeabilite našej predchádzajúcej štúdie v Ref.34. Permeabilita kolóny naplnenej povrchovo pórovitými časticami je 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 pre častice s veľkosťou 5 µm43. Preto je permeabilita fázy PMP podobná permeabilite častíc s jadrom a obalom s veľkosťou 5 μm.
kde Wx je hmotnosť kolóny naplnenej chloroformom, Wy je hmotnosť kolóny naplnenej metanolom a ρ je hustota rozpúšťadla. Hustota metanolu (ρ = 0,7866) a chloroformu (ρ = 1,484). Celková pórovitosť kolóny s časticami oxidu kremičitého-C18 (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm)34 a našej predtým študovanej kolóny C18-močovina31 bola 0,63 a 0,55. To znamená, že prítomnosť ligandov močoviny znižuje priepustnosť stacionárnej fázy. Na druhej strane, celková pórovitosť kolóny PMP (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) je 0,60. Kolóny PMP sú menej priepustné ako kolóny naplnené časticami oxidu kremičitého viazanými na C18, pretože v stacionárnych fázach typu C18 sú ligandy C18 pripojené k časticiam oxidu kremičitého v lineárnych reťazcoch, zatiaľ čo v stacionárnych fázach typu polystyrénu sa okolo častíc tvorí relatívne hrubý polymér. vrstva A. V typickom experimente sa pórovitosť kolóny vypočíta takto:
Na obr. 7A, B sú znázornené Van Deemterove grafy pre kolónu PMP (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) a kolónu Ascentis Express RP-Amide (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) za rovnakých elučných podmienok, 60/40 ACN/H2O a 0,1 % TFA 20 µl/min až 800 µl/min na oboch kolónach. Minimálne hodnoty HETP pri optimálnom prietoku (80 µl/min) boli 2,6 µm pre kolónu PMP a 3,9 µm pre kolónu Ascentis Express RP-Amide. Hodnoty HETP ukazujú, že separačná účinnosť kolóny PMP (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) je oveľa vyššia ako účinnosť komerčne dostupnej kolóny Ascentis Express RP-Amide (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm). Z van Deemterovho grafu na obr. 7(A) vyplýva, že pokles hodnoty N nie je so zvyšujúcim sa prietokom v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou významne vyšší. Vyššia separačná účinnosť kolóny PMP (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) v porovnaní s kolónou Ascentis Express RP-Amide je založená na vylepšenom tvare a veľkosti častíc a sofistikovanom postupe plnenia kolóny použitom v súčasnej práci34.
(A) Van Deemterov graf (HETP vs. lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný na kolóne PMP (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O s 0,1 % TFA. (B) Van Deemterov graf (HETP vs. lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný na kolóne Ascentis Express RP-Amide (vnútorný priemer 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O s 0,1 % TFA.
Bola pripravená a vyhodnotená polárna stacionárna fáza interkalovaného polystyrénu na separáciu zmesi syntetických peptidov a tryptického hydrolyzátu ľudského sérového albumínu (HSA) vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii. Chromatografický výkon PMP kolón pre zmesi peptidov je vynikajúci z hľadiska separačnej účinnosti a rozlíšenia. Zlepšená separačná účinnosť PMP kolón je spôsobená niekoľkými dôvodmi, ako je veľkosť častíc oxidu kremičitého a veľkosť pórov, kontrolovaná syntéza stacionárnych fáz a komplexné výplňové materiály kolóny. Okrem vysokej separačnej účinnosti je ďalšou výhodou tejto stacionárnej fázy nízky spätný tlak v kolóne pri vysokých prietokoch. PMP kolóny sú vysoko reprodukovateľné a možno ich použiť na analýzu zmesí peptidov a tryptického štiepenia rôznych proteínov. Túto kolónu plánujeme použiť na separáciu bioaktívnych zlúčenín z prírodných produktov, extraktov liečivých rastlín a húb v kvapalinovej chromatografii. V budúcnosti budú PMP kolóny hodnotené aj na separáciu proteínov a monoklonálnych protilátok.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výskum systémov separácie peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakterizáciu kolóny. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výskum systémov separácie peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakterizáciu kolóny.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. a Petersson, P. Skúmanie systémov na separáciu peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakterizáciu kolóny. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výskum systémov separácie peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakteristiky kolóny. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výskum systémov separácie peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakteristiky kolóny.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. a Petersson, P. Skúmanie systémov na separáciu peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakterizáciu kolóny.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. a kol. Metódy na vytvorenie vylepšených aktívnych peptidov na liečbu infekčných ochorení. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: Veda a trh. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: Veda a trh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Chreschatyski M. Syntetické terapeutické peptidy: veda a trh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Khreschatsky M. Syntetické terapeutické peptidy: veda a trh. Objav liekov. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kvapalinová chromatografia. Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kvapalinová chromatografia.Pozri F., Smith RD a Shen Yu. Pokročilá proteomická kvapalinová chromatografia. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Pokročilé zloženie bielkovín 液相色谱。Pozri F., Smith RD a Shen Yu. Pokročilá proteomická kvapalinová chromatografia.J. Chromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. a kol. Pokročilá kvapalinová chromatografia s hmotnostnou spektrometriou dokáže kombinovať širokospektrálnu metabolomiku a proteomiku. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC vo farmaceutickom vývoji. Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC vo farmaceutickom vývoji.Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC vo farmaceutickom vývoji.Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC vo vývoji liekov. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty ultravysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchle separácie. Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty ultravysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchle separácie.Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchlu separáciu. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty ultravysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchlu separáciu.Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchlu separáciu.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA a Tchelitcheff, P. Využitie ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie vo farmaceutickom vývoji. Wren, SA a Tchelitcheff, P. Využitie ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie vo farmaceutickom vývoji.Ren, SA a Chelischeff, P. Použitie ultravysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie vo farmaceutickom vývoji. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA a Tchelitcheff, P.Ren, SA a Chelischeff, P. Aplikácia ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie vo vývoji liekov.J. Chromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. a kol. Monolitický makroporézny hydrogél odvodený z emulzie olej vo vode s vysokým obsahom vnútornej fázy na účinné čistenie enterovírusu 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike.J. Chromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nové trendy v separácii terapeutických peptidov a proteínov pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou: Teória a aplikácie. & Guillarme, D. Nové trendy v separácii terapeutických peptidov a proteínov pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou: Teória a aplikácie. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощиоью хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nové trendy v separácii terapeutických peptidov a proteínov pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou: teória a aplikácie. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.a Guillarmé, D. Nové trendy v separácii terapeutických peptidov a proteínov pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou: teória a aplikácie.J. Pharm. Biomedicínske vedy. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Dvojrozmerná separácia peptidov pomocou systému RP-RP-HPLC s rôznym pH v prvom a druhom separačnom rozmere. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Dvojrozmerná separácia peptidov pomocou systému RP-RP-HPLC s rôznym pH v prvom a druhom separačnom rozmere.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Dvojrozmerná separácia peptidov pomocou systému RP-RP-HPLC s rôznym pH v prvom a druhom separačnom rozmere.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Dvojrozmerná separácia peptidov s použitím rôznych hodnôt pH v prvom a druhom separačnom rozmere pomocou systému RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. a kol. Skúmanie prenosu hmoty a kinetických charakteristík vysokoúčinných chromatografických kolón naplnených plne pórovitými a povrchovo pórovitými časticami C18 menšími ako 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. a kol. Najnovšie trendy a analytické výzvy v izolácii, identifikácii a validácii rastlinných bioaktívnych peptidov. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB a kol. Proteomická krajina ríše života. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. a kol. Dodatočná úprava terapeutických peptidov preparatívnou kvapalinovou chromatografiou. Molecules (Bazilej, Švajčiarsko) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. a Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácie na biopolyméry. Yang, Y. a Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácie na biopolyméry.Yang, Yu. a Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácia na biopolyméry. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. a Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácia v biopolyméroch.Yang, Yu. a Gene, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácia na biopolyméry.J. Chromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).