Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je strukovina, ktorá sa používa na výrobu potravín a zlepšenie pôdy.Globálna expanzia NLL ako plodiny prilákala mnoho patogénnych húb vrátane lupinovej antrakózy, ktorá spôsobuje ničivú chorobu antrakózy.Pri šľachtení NLL sa používajú dve alely, LANR1 a Anman, ktoré poskytujú zvýšenú rezistenciu, ale základné molekulárne mechanizmy zostávajú neznáme.V tejto štúdii boli markery LANR1 a Anman použité na skríning európskych vzoriek NLL.Testovanie vakcíny v kontrolovanom prostredí potvrdilo účinnosť oboch rezistentných darcov.Profilovanie diferenciálnej génovej expresie sa uskutočňovalo na reprezentatívnych rezistentných a citlivých líniách.Rezistencia na antrakózu bola spojená s nadmernou expresiou génových ontologických výrazov „GO: 0006952 Defense Response“, „Go: 0055114 Redox Proces“ a „Go: 0015979 fotosyntéza“.Okrem toho línia LANR1 (83A: 476) vykazovala po inokulácii rýchlo významné preprogramovanie transkriptómu, zatiaľ čo ostatné čiary vykazovali oneskorenie tejto odpovede asi o 42 hodín.Včasné reakcie na 83a: 476, vrátane starostlivého potlačenia génov spojených s fotosyntézou, sa časovo zhodovali s úspešnou ochranou počas vegetatívnej fázy rastu plesňovej biológie, čo naznačuje, že efektor spúšťa imunitu.
V systémoch rotácie plodín sa tiež považuje za zelený hnoj v dôsledku fixácie dusíka baktériami fixujúcimi sa symbiotickým dusíkom a celkové zlepšenie štruktúry pôdy.Vďaka rozsiahlej kultivácii NLL sa postupnosť patogénnych húb vyvinula nové poľnohospodárske výklenky a spôsobili nové choroby znižujúce plodiny. Najpozoruhodnejším pre poľnohospodárov a chovateľov lupínov bol výskyt antracózy spôsobený patogénnymi hubami, Colletotrichum Lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. Najpozoruhodnejším pre poľnohospodárov a chovateľov lupínov bol výskyt antracózy spôsobený patogénnymi hubami, Colletotrichum Lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. „ Upini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. Najvýznamnejšie pre lupínových poľnohospodárov a chovateľov bolo vznik antrakózy spôsobenej patogénnym hubovým colletotrichum Lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. Наиболее поразителя для фермеров и и и и ю люпина ~ Ichum Lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. Najvýraznejšie pre poľnohospodárov a chovateľov lupínov je vznik antrakózy spôsobenej patogénnym hubovým colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в целенаправленой морvidлогии. & H. Schrenk,. & H. Schrenk ,.a H. Schrenk. & H. 施伦克 ，。 & H. 施伦克 ，。a H. Schlenk ,.V dôsledku malého počtu RIL a veľkej genetickej vzdialenosti medzi markermi a zodpovedajúcimi alelami však nie je možné vyvodiť žiadne spoľahlivé závery o ich základných génoch.Na druhej strane, použitie reverznej genetiky v lupinoch je ťažké kvôli ich veľmi nízkemu regeneračnému potenciálu, čo robí genetickú manipuláciu Cumbersome37.
Vývoj domestikovanej zárodočnej plazmy nesúci požadovanú alelu v homozygotnom stave, ako napríklad 83a: 476 (LANR1) a Mandelup (Anman), otvoril dvere štúdiu rezistencie na antrakózu v tvári prítomnosti protichodných kombinácií Alleles v divokých populáciách.Možnosti molekulárnych mechanizmov.Porovnajte obranné reakcie generované špecifickými genotypmi.Táto štúdia hodnotila včasnú transkriptómovú odpoveď NLL na očkovanie C. lupini.Po prvé, panel Európskych zárodkov NLL obsahujúci 215 riadkov bol skrínovaný pomocou molekulárnych markerov, ktoré označujú alely LANR1 a Anman.Fenotypovanie antrakózy sa potom uskutočňovalo na 50 nll linkách, ktoré boli predtým vybrané pre molekulárne markery, za kontrolovaných podmienok.Na základe týchto experimentov sa pre diferenciálnu regiláciu expresie génovej expresie obrannej expresie s použitím dvoch komplementárnych prístupov: vysoko výkonné sekvenovanie RNA a kvantifikácia PCR v reálnom čase a kvantifikácia PCR v reálnom čase sa vybrali štyri línie, ktoré sa líšili v rezistencii na antrakózu a alelickej kompozícii LANR1/Anmana, pre profilovanie génovej expresie diferenciálnej obrany pomocou dvoch komplementárnych prístupov: vysoko výkonné sekvenovanie RNA a kvantifikácia PCR v reálnom čase.
Skríning súboru Germplazmu NLL (n = 215) s markermi LANR1 (Anseq3 a Anseq4) a Anman (Anseq4) a Anman (Anmanm1) ukázal, že iba jedna línia (95726, blízko Salamanca-b) amplifuje „rezistenciu“ pre všetky markery, zatiaľ čo „prítomnosť„ prítomnosti „náchylných“ altelov “zistených proporcií v (značka.Rozdiely v priemernom skóre sa pohybovali od 1,8 (stredne rezistentné) do 6,9 (citlivé) a rozdiely v hmotnosti rastlín sa pohybovali od 0,62 (citlivé) do 4,45 g (rezistentné). V dvoch replikáciách experimentu bola pozorovaná významná korelácia medzi hodnotami (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastlín, p <0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami ( - 0,59 a - 0,77, p <0,0001). V dvoch replikáciách experimentu bola pozorovaná významná korelácia medzi hodnotami (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastlín, p <0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami ( - 0,59 a - 0,77, p <0,0001). Ыявлена ​​достоверная коррелялия между значениями, наблююериериериериериериериериеререререриерved (0,51 дл э п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п э э эsia ээксто э s ээксто э s ээксто э s ээксто э s ээксосend лезни, p = 0 00017 и 0,61 для массы растения, p <0 0001), а а те межежжду этими дви двум п <0 0001). Zistila sa významná korelácia medzi hodnotami pozorovanými v dvoch opakovaniach experimentu (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastlín, p <0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami ( - 0,59 a -0,77, p <0,0001) 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 到 的 值 存在 显着 相关性 相关性 （疾病 严重 程度 分为 分为 ， ， 参数 之间 之间 （植物 重量 为 0,61 ， p <0,0001)在 两 次 重复 实验 中 观察 值 之间 存在 相关性 （（疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 ， ， 之间 之间 （（（（（（（（（（（（和 为1)。 Наблюалась значительная корреляция межжу значениями, наблююмыми д 5 п 5 п 5 п 5 п 3, 0 6 , 00017 и масса растения 0,61, p <0 0001), и между этими двумя парараметрами (-0,59) 0,77, 0,77, p <0 0001. Medzi hodnotami pozorovaná v duplikáte bola významná korelácia (skóre závažnosti ochorenia 0,51, p = 0,00017 a hmotnosť rastlín 0,61, p <0,0001) a medzi týmito dvoma parametrami (-0,59 a -0 0,0001) 0,77, p <0,0001. ).Medzi typické príznaky pozorované v citlivých rastlinách patrí zachytenie a krútenie stonky pripomínajúceho štruktúru „pastierskeho luku“, po ktorej nasledujú oválne lézie s oranžovými/ružovými sporozoitmi (doplnkový obrázok 1).Austrálske prístupy nesúce gény LANR1 (83A: 476 a Tanjil) a Anman (Mandelup) sú mierne rezistentné, 0,0331 a 0,0036).Niektoré čiary, ktoré tiež nesú „rezistentné“ LANR1 a/alebo Anman alely, vykazujú príznaky choroby.
Je zaujímavé, že niekoľko čiar NLL bez „rezistentných“ markerových alel odhalilo vysokú úroveň rezistencie na antraknózu (porovnateľné alebo vyššie ako pre LANR1 alebo Anman Genotypes), ako napríklad Boregín (P hodnota P <0,0001 pre obidve parametre), hodnota Bojar (P cojar (P-signál pre skóre 0,001. Je zaujímavé, že niekoľko čiar NLL bez „rezistentných“ markerových alel odhalilo vysokú úroveň rezistencie na antraknózu (porovnateľné alebo vyššie ako pre LANR1 alebo Anman Genotypes), ako napríklad Boregín (P hodnota P <0,0001 pre obidve parametre), hodnota Bojar (P cojar (P-signál pre skóre 0,001. Je zaujímavé, že niekoľko línií NLL bez „rezistentných“ markerových alel vykázalo vysokú úroveň rezistencie na antracózu (porovnateľná alebo vyššia ako pre LANR1 alebo Anman Genotypes), ako je Boregín (P hodnota P <0,0001 pre obidva parametre), Bojar (P hodnota <0,0001 pre hodnotu a hodnotu pre rastlinu) a populáciu B-549/79b (nie pre hodnotu P pre hodnotu a nie. Je zaujímavé, že niektoré systémy NLL, ktoré nemajú žiadne „antigénne“ markery, vykazujú vysokú horizontálnu rezistenciu (ekvivalent s LANR1 alebo anman génmi alebo vyšším), ako je napríklad tupý alebo vyššie), ako je napríklad alebo vyšší markery (oba parametre p <0,0001), Bojar (hodnota p <0,0001, hmotnosť rastlín 0,001) a kmeň B-549/79B (P hodnota <0,0001, hmotnosť <0,0001). Интересно, ччо некоторые линии Nll, лишеные каких-VaVибо маркерных алелелел «резистентентити», ' ти а антракнозу (сравнимые ickи ыше, чем у генотиов Lanr1 иVe anman), „ чение p <0 0001, масса растения 0,001) и популяция b-549/79b (ценка p-значение <0 0001, маса н неззначичительна). Je zaujímavé, že niektoré línie NLL bez „rezistencie“ markerových alel vykazovali vysoké hladiny rezistencie na antraknózu (porovnateľné s alebo vyššími ako LANR1 alebo Anman Genotypes), ako je napríklad Boregín (hodnota P pre oba parametre <0,0001), Bojar (p-hodnota <0,0001, rastlinná hmotnosť 0,001) a populácia B-549/79b (P-Value <Tento jav naznačuje možnosť nového genetického zdroja rezistencie, ktorý vysvetľuje pozorovanú nedostatok korelácie medzi markerovými genotypmi a fenotypmi ochorenia (hodnoty P od ~ 0,42 do ~ 0,98).Test Kolmogorov-Smirnov teda ukázal, že údaje o rezistencii na antraknózu boli približne normálne distribuované pre skóre (p-hodnoty 0,25 a 0,11) a rastlinnú hmotu (p-hodnoty 0,47 a 0,55), čo naznačuje, že som zapojených viac alel ako LANR1 a Anman.

Protokol Illumina Novaseq 6000 dosiahol v priemere 40,5 párov MREAD na vzorku (29,7 až 54,4 MREADS) (doplnková tabuľka S3).Skóre zarovnania v referenčnej sekvencii sa pohybovalo od 75,5% do 88,6%.Priemerná korelácia údajov o počte čítania medzi experimentálnymi variantmi medzi biologickými replikáciami sa pohybovala od 0,812 do 0,997 (priemer 0,959). 在 分析 的 35,170 个 基因 中 ， 2917 个 没有 ， ， 其他 4785 个 的 表达 可以 忽略不计 （基本 平均值 <5）。35 170 Z 35,170 analyzovaných génov nebolo exprimovaných 2917 a zostávajúcich 4785 génov malo zanedbateľnú expresiu (základná priemer <5).Počet zvažovaných génov exprimovaných (priemerná základná ≥ 5) počas experimentu bol teda 27 468 (78,1%) (doplnková tabuľka S4).
Od prvého časového bodu všetky čiary NLL reagovali na naočkovanie C. lupini (kmeň Col-08) preprogramovaním transkriptómu (tabuľka 1), avšak medzi čiarami sa pozorovali významné rozdiely.Rezistentná čiara 83a: 476 (nesúci gén LANR1) vykazovala v prvom časovom bode (6 hpi) významné preprogramovanie transkriptómov v prvom časovom bode (6 hpi) s 31-69-násobným zvýšením počtu izolovaných génov UP a dole v porovnaní s inými časovými bodmi v tomto časovom bode.Okrem toho bol tento vrchol krátkodobý, pretože expresia iba niekoľkých génov zostala významne zmenená v druhom časovom bode (12 HPI).Zaujímavé je, že Boregine, ktorý v teste štepu tiež ukázal vysokú úroveň rezistencie, počas experimentu nepodstúpil také masívne transkripčné preprogramovanie.Počet diferencovane exprimovaných génov (DEG) bol však rovnaký pre Boregín a 83a: 476 pri 12 hpi.Mandelup aj populácia 22660 vykazovali vrcholy deg v poslednom časovom bode (48 l/s), čo naznačuje relatívne oneskorenie v obranných reakciách.
Pretože 83A:476 prešla masívnym preprogramovaním transkriptómu v reakcii na C. lupini pri 6 HPI v porovnaní so všetkými ostatnými líniami, ~91 % DEG pozorovaných v tomto časovom bode bolo líniovo špecifických (obr. 1).Medzi líniami štúdie však došlo k určitému prekrývaniu skorých odpovedí, pretože 68,5%, 50,9% a 52,6% DEG v Boregine, Mandelup a populácii 22660 sa v určitých časových bodoch prekrývalo s tými, ktoré sa našli v 83A:476.Tieto stupne však predstavovali iba malú frakciu (0,97–1,70%) všetkých stupňov, ktoré sú v súčasnosti detegované pomocou 83a: 476.Okrem toho bolo v tomto čase koherentné 11 stupňov od všetkých čiary (doplnkové tabuľky S4-S6), vrátane bežných komponentov obranných reakcií rastlín: proteín prenosu lipidov (Tanjilg_32225), endoglukan-1,3-β-glukozid enzým (Tanjilg_23384), dva stresové proteíny, ako je SAM22 (TanJIL31528 a TanJIL1528 a TanJIL31 a TanJilg ), základný latexový proteín (Tanjilg_32352) a dva proteíny štruktúrnych buniek bohatých na glycín (Tanjilg_19701 a Tanjilg_19702).Došlo tiež k relatívne vysokému prekrytiu v transkriptómových odpovediach medzi 83A:476 a Boregine pri 24 HPI (celkovo 16-38 % DEG) a medzi Mandelupom a populáciou 22660 pri 48 HPI (celkom 14-20 % °).
Venn Diagram znázorňujúci počet diferencovane exprimovaných génov (DEG) v úzko listových lupínových (NLL) líniách inokulovaných Colletotrichum lupini (kmeň COL-08 získaný z lupínskych polí v Wierzhenice, Poľsko, 1999).Analyzované čiary NLL boli: 83a: 476 (rezistentné, nesúci alelu LANR1), Boregín (rezistentné, genetické pozadie neznáme), Mandelup (mierne odolný, nesúci anman alelu) a populáciu 22660 (veľmi citlivé).Skratka HPI znamená hodiny po očkovaní.Nulové hodnoty boli odstránené na zjednodušenie grafu.
Sada nadmerne exprimovaných génov pri 6 HPI sa analyzovala na prítomnosť kanonických domén génov R (doplnková tabuľka S7).Táto štúdia odhalila indukciu transkriptómových génov klasických génov rezistencie na ochorenie s doménami NBS-LRR iba pri 83a: 476.Všetky tieto gény majú kanonické domény usporiadané v konzervovaných sekvenciách.
Gény s významne zmenenou expresiou v reakcii na inokuláciu s C. lupini (kmeň Col-08) boli podrobené analýze obohatenia génovej ontológie (GO) (doplnková tabuľka S8). Najčastejšie nadmerne zastúpeným biologickým procesom bol „GO: 0006952 OBROVSKÁ Odpoveď“, ktorá sa objavila v 6 zo 16 (časových x čiara) kombinácií s vysokou významnosťou (hodnota P <0,001) (obr. 2). Najčastejšie nadmerne zastúpeným biologickým procesom bol „GO: 0006952 OBROVSKÁ Odpoveď“, ktorá sa objavila v 6 zo 16 (časových x čiara) kombinácií s vysokou významnosťou (hodnota P <0,001) (obr. 2). Наиболее часто чрезмерbecо представленным термином биологического пр л л л л л л л Obo л л л л Obo л л л л Obo. из 16 (время × линия) комбинаций с ысокой значимостюю (значение p <0,001) (рV. 2). Najčastejšie nadmerne zastúpený termín biologického procesu bol „GO:0006952 obranná odpoveď“, ktorý sa objavil v 6 zo 16 kombinácií (čas × línia) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2).最 常 被 过度 代表 的 生物 术语 “ Najreprezentatívnejší termín biologického procesu je „GO:0006952 obranná odpoveď“, ktorý sa vyskytuje v 6 zo 16 (时间×线) kombinácií s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процестроческого процестроческого процестроческого процестроческого 5009 появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значий значимостью (значение) P. Najčastejšie nadmerne zastúpený termín biologického procesu bol „GO:0006952 Defense Response“, ktorý sa vyskytoval v 6 zo 16 kombinácií (čas × čiara) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2).Toto je očakávaný výsledok, ktorý zdôrazňuje protiplesňovú odozvu rezistentných línií.: 0006950 Stresová reakcia “.
Termíny génovej ontológie bioprocesov vybrané v anotácii odlišne exprimovaných génov počas transkriptómových odpovedí lupiny úzkolistej (NLL) naočkovanej lupinou antraxovou (kmeň Col-08 získaný z lupinových polí vo Wierzheniciach v Poľsku v roku 1999) sú značne prehnané.Analyzované línie NLL boli: 83A:476 (rezistentné, nesúce homozygotnú alelu Lanr1), Boregine (rezistentné, neznáme genetické pozadie), Mandelup (stredne odolné, nesúce homozygotnú alelu AnMan) a populácia 22660 (citlivá).
Pretože táto štúdia bola zameraná na identifikáciu génov, ktoré prispievajú k rezistencii na antraknózu, gény priradené k výrazom GO „GO: 0006952 obranné reakcie“ a „GO: 0055114 Redoxné procesy“ boli analyzované s medznými hodnotami, pretože základná hodnota znamená ≥ 30 s aspoň jednou čiarou.× bod v čase kombináciou štatisticky významných hodnôt log2 (Zmena záhybu).Počet génov splnených týchto kritérií bol 65 na Go: 0006952 a 524 pre Go: 0055114.
83a: 476 odhalilo dva stupne píky anotované termínom GO: 0006952, prvý pri 6 génoch na palec (64 génov, regulácie hore a dole) a druhý v 24 génoch na palec (iba 15 génov, iba regulácia hore).Boregín tiež ukázal, že GO: 0006952 vrcholoval v rovnakom časovom bode, ale s menšou hodnotou (11 a 8) a preferenčnou aktiváciou.Mandeloop vykazoval dva vrcholy GO: 0006952 pri 12 a 48 HPI, ktoré nesú 12 génov (prvé s aktivujúcimi génmi a druhý s iba supresívnymi génmi), zatiaľ čo populácia 22660 pri 6 HPI (13 génov) mala väčšiu prevažovanie zvýšeného píky.regulácia.Je potrebné poznamenať, že 96,4% GO: 0006952 stupňov v týchto píkoch malo rovnaký typ odpovede (hore alebo dole), čo naznačuje významné prekrývanie obranných reakcií napriek rozdielom v počte zúčastnených génov.Najväčšia skupina sekvencií súvisiacich s termínom GO: 0006952 kóduje správny proteín 22 (SAM22 podobný SAM22), ktorý patrí do proteínového proteínového proteínového proteínu spojeného s patogenézou (PR-10) a latexový proteínový proteín.Podobný (MLP-podobný) proteín) proteín (obr. 3).Obe skupiny sa líšili v povahe vyjadrenia a smeru reakcie.Gény kódujúce proteíny podobné SAM22 vykazovali konzistentnú a významnú indukciu v skorých časových bodoch (6 alebo 12 hPI) a vo všeobecnosti nereagovali na konci experimentu (48 hPI), zatiaľ čo proteíny podobné MLP vykazovali koordináciu pri 6 hPI.HPI.83a: 476 a Mandelup pri 48 hp/in, takmer všetky ostatné dátové body nereagovali.Okrem toho sa nasledovali rozdiely v profiloch expresných proteínov podobných proteínových génov SAM22, pozorovaná variabilita rezistencie na antrakózu, pretože rezistentnejšie línie mali viac časových bodov významne indukujúce tieto gény ako náchylnejšie gény.Ďalší gén LLR18A/B-B-10 vykazoval veľmi podobný expresný vzorec ako proteínový gén podobný SAM22.

Okrem toho sa vyhodnotili profily expresných génov RNA-seq kandidátnych génov LANR1 (Tanjilg_05042) a Anman (Tanjilg_12861) (obr. 3).S.).nastaviteľné)).
Najviac exprimované gény v termíne GO: „Redox proces“ 0055114 boli gény kódujúce proteíny cytochrómu p450 a peroxidázu (obr. 4).Vo vzorkách izolovaných z 83a: 476 pri 6 HPI sa medzi inokulovanými a kontrolnými rastlinami všeobecne pozorovali maximálne alebo minimálne hodnoty log2 (násobná zmena) (pre 86,6% génov), čo zdôrazňuje vysokú reakciu tohto genotypu na očkovanie pohlavia.83a: 476 vykazovalo najvýznamnejšie GO: 0055114 ° pri 6 hpi (503 génov), zatiaľ čo zvyšok čiary pri 48 hpi (Boregine, 31 génov; Mandelup, 85 génov; a populácia 22660, 78 génov)).Vo väčšine génov GO: 0055114 rodiny sa pozorovali dva typy reakcií na očkovanie (aktivácia a inhibícia).Je zaujímavé, že až 97,6% stupňov identifikovaných pre termín GO: 0055114 v Mandelupe pri 48 hp tieto pozorovania naznačujú, že napriek výrazne menšiemu rozsahu (tj počet mutovaných redoxných génov je 85 verzus 503), vzor oneskoreného transkriptómu reakcií mandelupe na antrahracnózu podobný včasnej odpovede 83A: 476.V Boregine a populácii 22660 je táto konvergencia nižšia na 51,6% a 75,6%.
Boli odhalené vzorce expresie hlavných zložiek termínu biologického procesu „GO: 0055114 Redox proces“.
Toto GO: 0015979 ° Sada obsahovala 105 génov, ktoré boli významne potlačené pri 6 HPI pri 83A: 476.V tejto podskupine bolo 37 génov tiež downregulovaných v Mandelupe pri 48 hpi a 35 v rovnakom časovom bode v populácii 22660, vrátane 19 stupňov spoločných pre oba genotypy.Žiadne stupne súvisiace s termínom GO: 0015979 boli významne aktivované v akejkoľvek kombinácii (riadok X).
Boli odhalené vzorce expresie hlavných zložiek termínu biologického procesu „GO: 0015979“.Analyzovali sa nasledujúce lupinové linky: 83A: 476 (rezistentné, nesúce homozygotnú alelu LANR1), Boregín (rezistentné, genetické pozadie neznáme), Mandelup (mierne rezistentný, nesúci homozygotnú anmanovú alelu) a populáciu 22660 (Sustible).
Na základe výsledkov analýzy diferenciálnej expresie a pravdepodobne sa podieľalo na obranných reakciách proti patogénnym húb, táto sada siedmich génov bola vybraná na kvantifikáciu profilov expresie pomocou PCR v reálnom čase (doplnková tabuľka S9).
Predpokladaný proteínový gén Tanjilg_10657 bol významne indukovaný vo všetkých študovaných líniách a časových bodoch v porovnaní s kontrolnými (MIMIC) rastlinami (doplnkové tabuľky S10, S11).Okrem toho profil expresie Tanjilg_10657 vykazoval v priebehu experimentu zvyšujúci sa trend pre všetky riadky.Populácia 22660 vykázala najvyššiu citlivosť Tanjilg_10657 na naočkovanie 114-násobnou aktiváciou a najvyššou úrovňou relatívnej expresie (4,4 ± 0,4) pri 24 hpi (obr. 6A).Proteínový gén PR10 LLR18A Tanjilg_27015 tiež vykazoval aktiváciu vo všetkých riadkoch a časových bodoch, so štatistickou významnosťou vo väčšine dátových bodov (obr. 6B).Podobne ako v prípade Tanjilg_10657, najvyššia relatívna hladina expresie Tanjilg_27015 bola pozorovaná v naočkovanej populácii 22660 pri 24 hpi (19,5 ± 2,4).Gén kyseliny endochitinázy Tanjilg_04706 bol významne upregulovaný vo všetkých líniách a vo všetkých časových bodoch, s výnimkou 6 hpi (obr. 6C).Bol silne indukovaný v prvom časovom bode (6 hpi) pri 83a: 476 (o 10,5 krát) a mierne sa zvýšil v iných riadkoch (o 6,6-7,5 krát).Počas experimentu zostala expresia Tanjilg_04706 na podobných úrovniach v 83a: 476 a Boregín, zatiaľ čo v Mandelupe a populácii 22660 sa významne zvýšila a dosiahla relatívne vysoké hodnoty (5,9 ± 1,5 a 6,2 ± 1,5).Endoglucan-1,3-P-glukozidázový gén Tanjilg_23384 vykazoval vysokú aktiváciu v prvých dvoch časových bodoch (6 a 12 HPI) vo všetkých líniách s výnimkou populácie 22660 (obr. 6D).Najvyššie úrovne relatívnej expresie Tanjilg_23384 boli pozorované v druhom časovom bode (12 hpi) v Mandelupe (2,7 ± 0,3) a 83a: 476 (1,5 ± 0,1).Pri 24 hpi bola expresia Tanjilg_23384 relatívne nízka vo všetkých študovaných čiarach (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Expresné profily vybraných génov (AG) odhalené kvantitatívnym PCR.Čísla 6, 12 a 24 predstavujú hodiny po očkovaní.Gény LANDEXH7 a LANTUB6 sa použili na normalizáciu a LANTUB6 sa použil na kalibráciu medzi sériami.Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku založenú na troch biologických replikátoch, z ktorých každý je priemerom troch technických replikátov. Štatistická významnosť rozdielov v hladinách expresie medzi naočkovanými (Colletotrichum lupini, kmeňom COL-08, získanými v roku 1999 z lupinského poľa v Wierzenica, Poľskom) a rastlinami naočkovanými) sú označené nad dátovými bodmi (*P hodnota <0,05, ** P v hodnote ≤ 0,01, *** P v hodnote ≤ 0,001). Štatistická významnosť rozdielov v hladinách expresie medzi naočkovanými (Colletotrichum lupini, kmeňom COL-08, získanými v roku 1999 z lupinského poľa v Wierzenica, Poľskom) a rastlinami naočkovanými) sú označené nad dátovými bodmi (*P hodnota <0,05, ** P v hodnote ≤ 0,01, *** P v hodnote ≤ 0,001). 接种 （Colletotrichum lupini ， col-08 株 ， 1999 年 从 波兰 波兰 波兰 从 模拟） 和 对照 （接种 接种） 植物 植物 之间 表达 水平 差异 的 显着性 值。 上方 （（*p 值 <0,05, ** p 值 \接种 （Colletotrichum lupini ， Color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 Wierzenica 的 羽扇） 和 对照 （接种 之间 之间 水平 差异 的 统计学 统计学 显着性 标记 数据点 上方 上方 <0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001)。 Štatisticky významné rozdiely v hladinách expresie medzi naočkovanými (Collotrichum lupini, kmeňom COL-08, získanými z lupínskych polí vo Verzhenice, Poľsku, v roku 1999) sa zaznamenávajú nad dátovými bodmi (*P-hodnota <0,05, ** p-hodnoty ≤ 0,01, *** p-hodnoty ≤ 0,001).Analyzované čiary NLL boli: 83a: 476 (rezistentné, nesúce homozygotnú alelu LANR1), Mandelup (mierne rezistentný, nesúujúci homozygotnú anmanovú alelu), Boregín (rezistentný, neznámy genetický pozadie) a populácia 22660 (náchylné).
Kandidát gén Tanjilg_05042 v lokuse LANR1 vykazoval výrazne odlišný expresný vzorec z profilov získaných zo štúdií RNA-sekv. (Obr. 6E).Významná aktivácia tohto génu bola pozorovaná v Mandelupe a populácii 22660 (až 39,7 a 11,7 -krát), čo malo za následok relatívne vysoké hladiny expresie (do 1,4 ± 0,14 a 7,2 ± 1,3).83a: 476 tiež odhalilo určitú zvýšenú reguláciu génu Tanjilg_05042 (až 3,8-násobne), dosiahnuté hladiny relatívnej expresie (0,044 ± 0,002) boli však viac ako 30-násobne nižšie ako hladiny pozorované v Mandelupe a 22660 populácii.Analyzované pomocou qPCR vykazovali významné rozdiely v hladinách expresie medzi genotypmi v miernych (kontrolných) variantoch, pričom dosiahol 58-násobný rozdiel medzi populáciami 22660 a 83a: 476, ako aj medzi populáciami 22660 a 22660. Dvojnásobný rozdiel sa dosiahol medzi vrtom a mandalupom.
Kandidátsky gén v Anman Locus, Tanjilg_12861, bol aktivovaný v reakcii na vakcináciu v 83a: 476 a Mandelup, bol v populácii 22660 neutrálny a bol znížený v boregíne (obr. 6F).Relatívna expresia génu Tanjilg_12861 bola najvyššia v naočkovanej 83a: 476 (0,14 ± 0,01).Gén tepelného šokovania tepelného šoku 17,4 kDa TREEIn Tanjilg_05080 HSP17.4 vykazoval nižšie hodnoty relatívnej expresie vo všetkých študovaných kmeňoch a časových bodoch (obr. 6G).Najvyššia hodnota bola pozorovaná pri 24 hpi v populácii 22660 (0,14 ± 0,02, osemnásobné zvýšenie reakcie na očkovanie).
Porovnanie profilov génovej expresie (obr. 7) odhalilo vysokú koreláciu medzi Tanjilg_10657 a štyrmi ďalšími génmi: Tanjilg_27015 (r = 0,89), Tanjilg_05080 (r = 0,85), tanjilg_05042 (r = 0,80) a tanjilg_04706 (r = 0,79).Takéto výsledky môžu naznačovať koreguláciu týchto génov počas obranných reakcií.Gény Tanjilg_12861 a Tanjilg_23384 vykazovali rôzne profily expresie s nižšími hodnotami korelácie Pearsona korelácie (od 0,08 do 0,43 a -0,19 až 0,28) v porovnaní s inými génmi.
Korelácie medzi profilmi génovej expresie boli detegované pomocou kvantitatívneho PCR.Analyzovali sa nasledujúce zúžené lupínové línie: 83a: 476 (rezistentné, nesúci homozygotnú alelu LANR1), Mandelup (mierne rezistentný, nesúci homozygotnú anmanovú alelu), Boregín (rezistentné, genetické pozadie neznáme) a populáciu 22660 (Sustible).Vypočítali sa tri časové body (6, 12 a 24 hodín po naočkovaní), vrátane naočkovaných (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získané z lupínskych polí v Wierzhenice, Poľskom v roku 1999) a kontrolných (simulovaných) rastlín.Stupnica ukazuje hodnotu korelačného koeficientu Pearsona.
Na základe údajov získaných pri 6 konských sílch na palec sa WGCNA uskutočňovala na 9981 ° C identifikovanom porovnaním naočkovaných a kontrolných rastlín s cieľom zamerať sa na skoré obranné reakcie (doplnková tabuľka S12).Zistilo sa dvadsaťdva génových modulov (zhluky) s korelovanými (pozitívnymi alebo negatívnymi) profilmi expresie medzi genotypmi a experimentálnymi variantmi. V priemere boli hladiny génovej expresie zostupné v poradí 83A: 476> Mandelup> Bregín> Populácia 22660 (v oboch variantoch však tento trend bol silnejší v kontrolných rastlinách). V priemere boli hladiny génovej expresie zostupné v poradí 83A: 476> Mandelup> Bregín> Populácia 22660 (v oboch variantoch však tento trend bol silnejší v kontrolných rastlinách). В среднем уовни экспрессии 201 генов снижались в порядке 83a: 476> Mandelup> Boregine> Obyvateľstvo 22660 ( сильнее у контрольных растений). Hladiny génovej expresie v priemere sa v poradí 83A znížili: 476> Mandelup> Bregín> Populácia 22660 (v oboch variantoch však tento trend bol silnejší v kontrolných rastlinách).平均 而 言 基因 表达 水平 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 按 83A: 476> MANDELUP> BREGINE> OBSAHU 22660 的 下降 然而 ， ， 在 两 种 变体 中 ， ， 这 种 趋势 植物 更 强。。。。。。。。。。。。。。。。平均 而 ， 基因 “ В среднем уовни экспрессии генов снижались в ру 83a: 476> Mandelup> Boregine> populácia 22660 ( нее у контрольных растений). Hladiny génovej expresie v priemere sa v sérii 83a znížili: 476> Mandelup> Bregín> Populácia 22660 (v oboch variantoch však tento trend bol silnejší v kontrolných rastlinách).Vakcinácia viedla k zvýšeniu regulácie génovej expresie, najmä v moduloch 18, 19, 14, 6 a 1 (v zostupnom poradí účinku), negatívnej regulácii (napr. Moduly 9 a 20) alebo s neutrálnymi účinkami (napr. Moduly 11, 22, 8 a 13).Analýza obohatenia termínu GO (doplnková tabuľka S13) odhalila „GO: 0006952 Ochranné odpovede“ pre inokulovaný modul (18) s maximálnou aktiváciou, vrátane génov analyzovaných qPCR (Tanjilg_04706, Tanjilg_2384, Tanjilg_10657 a Tanjilg_270155), ako aj mnohí subpresia). .Koncentrátor modulu 18 (obr. 8) bol identifikovaný ako gén Tanjilg_26536 kódujúci proteín LLR18B podobný PR-10 a koncentrátor modulu 9 bol identifikovaný ako gén Tanjilg_28955 kódujúci proteín fotosystému II PSBQ.Kandidátový gén Lanr1 rezistencie na antrakózu, Tanjilg_05042, sa našiel v module 22 (obr. 9) a je spojený s pojmami „GO: 0044260 bunkový makromolekulárny metabolický procesy“ a „GO: 0006355 Transkripčný regulácia„ GO, DNA Templatlácia “, ktorý prepravuje TANJILG_012 HUB.Gén kóduje transkripčný faktor tepelného stresu A-4A (HSFA4A).
Vážená sieťová analýza génovej koexpresie modulov s nadmerne zastúpenými pojmami biologického procesu „GO: 0006952 OBROVSKY“.Ligation sa zjednodušila na zvýraznenie štyroch génov analyzovaných qPCR (Tanjilg_04706, Tanjilg_23384, Tanjilg_10657 a Tanjilg_27015).
Analýza váženej siete génovej koexpresie modulu s nadmerným zastúpeným biologickým procesom „GO: 0006355: transkripčná regulácia, templát DNA“ a nesie kandidátsky gén rezistencie na antraknózu LANR1 Tanjilg_05042.Ligation sa zjednodušila, aby sa izoloval gén Tanjilg_05042 a centrálny gén Tanjilg_01212.
Skríning rezistencie na antrakózu zozbieraný v Austrálii ukázal, že väčšina skorých prepustených kultivarov bola náchylná;Kalya, Coromup a Mandelup boli opísané ako mierne odolné, zatiaľ čo Wonga, Tanjil a 83a: 476 boli opísané ako vysoko rezistentné 26,27,31.Mali rovnakú alelu odporu, označené LANR1 a Coromup a Mandelup mali inú alelu, označenú Anman10, 26, 39, zatiaľ čo Kalya odovzdal inú alelu., Lanr2.Skríning rezistencie na antrakózu v Nemecku viedol k identifikácii rezistentnej línie BO7212 s kandidátnou alelou inou ako LANR1, označenou LANRBO36.
Naša štúdia odhalila veľmi nízku frekvenciu (asi 6%) alely LANR1 v testovanej zárodočnej plazme.Toto pozorovanie je v súlade s výsledkami skríningu východoeurópskeho zárodočného plazmy pomocou markerov Anseq3 a Anseq4, ktoré ukázali, že alela LANR1 je prítomná iba v dvoch bieloruských líniách.To naznačuje, že alela LANR1 nie je zatiaľ široko používaná miestnymi šľachtiteľskými programami, na rozdiel od Austrálie, kde je jednou z kľúčových alel pre šľachtenie podporované markerom.Môže to byť spôsobené nižšou úrovňou odporu, ktorý poskytuje alela LANR1 v európskych terénnych podmienkach v porovnaní s austrálskou správou.Štúdie antrakózy v vysokých zrážkových oblastiach v Austrálii okrem toho ukázali, že reakcie rezistencie sprostredkované alelou LANR1 nemusia byť účinné v poveternostných podmienkach, ktoré uprednostňujú rast a rýchly rozvoj patogena19,42.V skutočnosti sa v tejto štúdii pozorovali aj niektoré príznaky antracózy v genotypoch nesúceho alelu LANR1, čo naznačuje, že rezistencia môže za optimálnych podmienok pre vývoj C. lupini zmiznúť.Okrem toho sú možné 28,30,43 false pozitívny interpretácia prítomnosti markerov Anseq3 a Anseq4, ktoré sú približne 1 cm od lokusu LANR1.
Naša štúdia ukázala, že 83A:476 nesúci alelu Lanr1 reagoval na inokuláciu C. lupini rozsiahlym preprogramovaním transkriptómu v prvom analyzovanom časovom bode (6 hpi), zatiaľ čo v Mandelupe, nesúcom alelu AnMan, boli transkriptomické reakcie pozorované oveľa neskôr.(od 24 do 48 k).Tieto dočasné variácie obranných reakcií sú spojené s rozdielmi v symptómoch ochorenia, čo zdôrazňuje dôležitosť včasného rozpoznania patogénu pre úspešnú reakciu na rezistenciu.Na infikovanie rastlinného tkaniva musia spóry antraxu prejsť niekoľkými vývojovými štádiami na povrchu hostiteľa, vrátane klíčenia, delenia buniek a tvorby apresoria.Príloha je infekčná štruktúra, ktorá sa pripája k povrchu hostiteľa a uľahčuje prenikanie do hostiteľských tkanív.Spóry C. gloeosporioides v extrakte hrachu teda vykazovali prvé rozdelenie jadra po 75-90 minútach inkubácie, tvorbu zárodočnej trubice po 90-120 minútach a potlačenie po 4 hodinách45.Mango C. gloeosporioides vykazovalo viac ako 40% klíčenie konídií po 3 hodinách inkubácie a asi 20% tvorbu apresorov po 4 hodinách.Gén CAP20 C. gloeosporioides spojený s virulenciou vykazoval transkripčnú aktivitu v konídiách tvoriacich epifyty po 3,5 hodinovej inkubácii v povrchovom vosku avokáda s vysokými koncentráciami proteínu CAP20 po 4 hodinách a 46 minútach.Podobne aktivita génov biosyntézy melanínu v C. trifolii bola indukovaná počas 2-hodinovej inkubácie, po ktorej nasledovalo vytvorenie apresoria po 1 hodine.Štúdie tkanív listov ukázali, že jahody naočkované C. acutatum majú prvé potlačenie pri 8 hpi, zatiaľ čo paradajky naočkované C. coccodes majú prvé potlačenie pri 4 hpi48,49.Vo veľkej miere v súlade s časovým stupňom Colletotrichum spp.infekčný proces.Rýchle obranné reakcie na 83A:476 naznačujú zapojenie génov rezistencie rastlín a efektorom spúšťanej imunity (ETI) do tejto línie, zatiaľ čo Mandelupove oneskorené reakcie podporujú hypotézu mikro-asociovanej imunity spúšťanej molekulárnym vzorom (MTI) 50. Skoré reakcie na 83A: 476 a Mandelup.Čiastočné prekrývanie medzi up- alebo down-regulovanými génmi v oneskorenej odpovedi tiež podporuje tento koncept, pretože ETI sa často považuje za zrýchlenú a zosilnenú MTI reakciu, ktorá kulminuje v programovanej bunkovej smrti v mieste infekcie, známej ako anafylaktický šok51,52.
Väčšina génov pripisovaných nadmerne zastúpeným termínovým génovým ontológiou GO: 0006952 „obranná reakcia“ je 11 homológov proteínu 22 (podobne ako SAM22) a siedmimi hlavnými litexovými proteínmi (MLP).-podobné proteíny 31, 34, 43 a 423 vykazovali podobnosť sekvencie.Gény podobné SAM22 vykazovali významnú aktiváciu, ktorá trvala dlhšie, čo vykazuje zvýšené hladiny rezistencie na antraknózu (83a: 476 a Boregín).Gény podobné MLP však boli downregulované iba v líniách nesúcich alelu kandidátnej rezistencie (83A: 476/LANR1 pri 6 hpi a Mandelup/Anman pri 24 hpi).Je potrebné poznamenať, že všetky identifikované homológy podobné SAM22 pochádzajú z génového klastra preklenujúceho približne 105 kb, zatiaľ čo gény podobné MLP pochádzajú zo samostatných oblastí genómu.Koordinovaná aktivácia takýchto génov podobných SAM22 bola tiež nájdená v našej predchádzajúcej štúdii rezistencie na NLL na diapterthetoxiku inokuláciu, čo naznačuje, že sa podieľajú na horizontálnych zložkách obrannej reakcie.Tento záver je tiež podporený správami o pozitívnej reakcii génov podobných SAM22 na poškodenie alebo ošetrenie kyselinou salicylovou, plesňovými induktormi alebo peroxidom vodíka.
Ukázalo sa, že gény podobné MLP reagujú na rôzne abiotické a biotické stresy vrátane bakteriálnych, vírusových a patogénnych plesňových infekcií v mnohých rastlinných druhoch55.Smery reakcie na určité interakcie medzi rastlinami a patogénmi sa pohybovali od silne zvyšovania (tj počas zamorenia bavlny s verticillium dahliae) až po výrazné zníženie (tj po infekcii jabĺk s alternaria spp.) 56,57.Počas avokádovej obrany infekcie F. Niger bola pozorovaná významná zníženie génu podobného MLP 423 a počas infekcie jablkových stromov botroseosphaeria berengeriana f.cn.Piricola a Alternaria Alternata sú Apple Patotypes58,59.Okrem toho mal Apple Calli nadmerne exprimujúci gén podobný MLP 423 nižšiu expresiu génov spojených s rezistenciou a bol náchylnejší na plesňovú infekciu59.Po fusarium oxysporum F bol gén 423 podobný MLP potlačený aj v rezistentných bežných fazuľových zárodočných plazmoch.cn.Infekcia fazule 60.
Ďalšími členmi rodiny PR-10 identifikovaných v našej štúdii RNA-seq boli gény LLR18A a LLR18B v reakcii na upreguláciu, ako aj upregulovaný (1 gén) alebo downregulovaný (3 gény) gén pre lipidový prenos proteínu DIR1..Okrem toho WGCNA zdôrazňuje gén LLR18B ako náboj v tomto module, ktorý je vysoko citlivý na očkovanie a nesie niekoľko génov ochrannej reakcie.Gény LLR18A a LLR18B boli indukované v žltých listoch lupínu v reakcii na patogénne baktérie, ako aj v kmeňoch NLL po D. ToxicA inokulácii, zatiaľ čo ryžový homológ týchto génov, RSOSPR10, rýchlo vyvolal genifózne plesky, ktoré boli protestisované pre prepravu JAMMONICE TRAWES sú potrebné pre začiatok systémového získaného odporu (SAR).S vývojom ochranných reakcií sa proteín DIR1 transportuje zo zamerania infekcie cez floem na vyvolanie SAR vo vzdialených orgánoch.Je zaujímavé, že gén DIR1 Tanjilg_02313 bol významne indukovaný v prvom časovom bode v riadkoch 84a: 476 a populácii 22660, ale rezistencia na antrakózu sa úspešne vyvinula iba v riadku 84A: 476.To môže naznačovať určitú subfunkcionalizáciu génu DIR1 v NLL, pretože zostávajúce tri homológy reagovali na naočkovanie iba v 83a: 476 riadku pri 6 HPI a táto reakcia bola nasmerovaná nadol.
V našej štúdii boli najbežnejšími komponentmi zodpovedajúcimi biologickému procesu nazývaným „redox proces: 0055114“ proteín cytochrómu P450, peroxidáza, kyselina linolová 9S-/13S-lipoxygenáza a 1-aminocyklopropán-1-karboxyová oxidáza.Okrem toho naša WGCNA definuje homológ HSFA4A ako moduly prenášajúce rozbočovač, ako je kandidát na gén rezistencie LANR1 Tanjilg_05042.HSFA4A je súčasťou regulácie jadrovej transkripcie závislej od redoxu v rastlinách.
Proteíny cytochrómu P450 sú oxidoreduktázy, ktoré katalyzujú hydroxylačné reakcie NADPH a/alebo O2 sa znížil z -10,6 log2 (zmena násobku) na 5,7 v dôsledku veľkého počtu zmenených homológov (37) a rozdielov v vzorcoch odozvy medzi špecifickými génmi, čo odráža revíziu smerom nahor..Použitie iba údajov RNA-Seq na objasnenie predpokladanej biologickej funkcie génov NLL v takej veľkej proteínovej nadrodine by bolo veľmi špekulatívne.Je však potrebné poznamenať, že niektoré gény cytochrómu P450 sú spojené so zvýšenou rezistenciou na patogénne huby alebo baktérie, vrátane príspevku k alergickým reakciám69,70,71.
Peroxidázy triedy III sú multifunkčné rastlinné enzýmy zapojené do širokého spektra metabolických procesov počas rastu a vývoja rastlín, ako aj v reakcii na environmentálne stresy, ako je slanosť, sucho, vysoká intenzita svetla a patogénny útok72.Peroxidázy sa podieľajú na interakcii niekoľkých druhov rastlín s Anthracis, vrátane Stylosanthes humilis a C. gloeosporioides, Lens culinaris a C. truncatum, Phaseolus vulgaris a C. lindemuthianum, Cucumis sativus a C. lagenarium73,74,75,766.Reakcia je veľmi rýchla, niekedy dokonca aj pri 4 hpi, predtým, ako huba prenikne do rastlinného tkaniva73.Gén peroxidázy tiež reagoval na inokuláciu D. toxic nll.Okrem svojich typických funkcií na reguláciu oxidačného vzplanutia alebo elimináciu oxidačného stresu môžu peroxidázy interferovať s rastom patogénov vytváraním fyzických bariér založených na zosilnení bunkovej steny počas lignifikácie, podjednotky alebo zosieťovania špecifických zlúčenín.Túto funkciu možno pripísať in silico génu TanjilG_03329 kódujúceho predpokladanú aniónovú peroxidázu tvoriacu lignín, ktorá bola v našej štúdii významne upregulovaná v línii rezistentnej na 83A:476 pri 6 HPI, ale nie v iných kmeňoch a časových bodoch, ktoré nereagovali.
9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolovej je prvým krokom v oxidačnej dráhe lipidovej biosyntézy78.Produkty tejto dráhy majú pri obrane rastlín viac funkcií, vrátane posilnenia bunkovej steny prostredníctvom tvorby ložísk kalózy a pektínu a regulácie oxidačného stresu prostredníctvom produkcie reaktívnych druhov kyslíka79,80,81,82,83.V tejto štúdii sa expresia kyseliny linolovej 9S-/13S-lipoxygenázy zmenila u všetkých kmeňov, ale v citlivej populácii 22660 upregulácia prevládala v rôznych časových bodoch, zatiaľ čo v kmeňoch nesúcich rezistentné LANR1 a anman alela zdôrazňuje diverzifikáciu oxylipínovej vrstvy v ochranných antrvaxových reakciách medzi týmito genotypmi.
Homológ 1-aminocyklopropán-1-karboxylátoxidázy (ACO) bol významne upregulovaný (9 génov) alebo downregulovaný (2 gény), keď bol inokulovaný lupinou.Až na dve výnimky sa všetky tieto reakcie vyskytli pri 6 hp.na 83a: 476.Enzymatická reakcia sprostredkovaná proteínmi ACO je krokom obmedzujúci rýchlosť pri produkcii etylénu, a preto je vysoko regulovaný84.Etylén je rastlinný hormón, ktorý hrá rôzne úlohy pri regulácii vývoja rastlín a reakcie na abiotické a biotické stresové podmienky.Indukcia transkripcie ACO a aktivácia etylénovej signálnej dráhy sa podieľa na zvýšení rezistencie ryže na hemibiotrofickú hubu oryzae oryzae reguláciou produkcie reaktívnych druhov kyslíka a fytoalexínov.Veľmi podobný proces infekcie listov, ktorý sa zistil medzi M. oryzae a C. lupini88,89, na pozadí významnej zvýšenej regulácie homológov ACO v 83A: 476 línii hlásenej v tejto štúdii, posúva možnosť uväznenia rezistencie voči NLL antraracnózovým etylénovým centrálnym krokom v molekulárnych cestách.
V tejto štúdii bolo pozorované rozsiahle potlačenie mnohých génov spojených s fotosyntézou pri 6 HPI v 83a: 476 a pri 48 hpi v Mandeloop a 22660 populácii.Rozsah a progresia týchto zmien sú úmerné úrovne.V tomto experimente bola pozorovaná rezistencia na antrakózu.Nedávno bola v niekoľkých modeloch interakcií rastlinných patogénov, vrátane patogénnych baktérií a húb, hlásená silná a skorá represia transkriptov súvisiacich s fotosyntézou.Haste (z 2 HPI v niektorých interakciách) a globálne potlačenie génov spojených s fotosyntézou v reakcii na infekciu môžu spustiť imunitu rastlín na základe nasadenia reaktívnych druhov kyslíka a ich interakcie s dráhou kyseliny salicylovej na sprostredkovanie alergických reakcií 90,94.
Záverom možno povedať, že mechanizmy obrannej reakcie navrhnuté pre najodolnejšiu líniu (83A: 476) zahŕňajú rýchle rozpoznávanie patogénu génom R (pravdepodobne TIR-NBS-LRR Tanjilg_05042) a alergickú reakciu sprostredkovanú kyselinu salicylovú a etylénovú signalizáciu, po ktorej nasleduje vytvorenie SAR s dlhým dosahom.Akcia je podporená proteínom DIR-1.Je potrebné poznamenať, že biotrofické obdobie infekcie C. lupini je veľmi krátke (približne 2 dni), po ktorom nasleduje nekrotický rast95.Prechod medzi týmito štádiami môže byť spojený s nekrózou a expresiou proteínov indukovateľných etylénu, ktoré pôsobia ako spúšťače pre nadcitlivenie reakcií v hostiteľských rastlinách.Preto je časové okno na úspešné zachytenie C. Lupiniho v biotrofickom štádiu veľmi úzke.Preprogramovanie génov spojených s redoxom a fotosyntézou pozorovaným v 83a: 476 pri 6 HPI je v súlade s progresiou hubových hýf a heralsov vývoj úspešnej ochrannej reakcie v biotrofickom štádiu.Transcriptomické reakcie Mandelupu a populácie 22660 môžu byť príliš oneskorené na to, aby zachytili huby pred prechodom na nekrotický rast, avšak mandelup môže byť účinnejší ako populácia 22660, pretože relatívne rýchla regulácia proteínu PR-10 podporuje horizontálnu rezistenciu.
ETI, poháňaný kanonickým génom R, sa javí ako spoločný mechanizmus rezistencie na fazuľu voči antracóze.V modelovom strukovisku Medicago Truncatula je teda rezistencia na antranózu udelená génom RCT1, členom génovej triedy rastlín R rastlín TIR-NBS-LRR97.Tento gén tiež poskytuje širokospektrálnu rezistenciu na antrakózu v lucertácii, keď sa prenesie do citlivých rastlín.V spoločnej fazule (P. vulgaris) bolo doteraz identifikovaných viac ako dva desiatky génov rezistencie na antraknózu.Niektoré z týchto génov sa nachádzajú v oblastiach, ktoré bez akýchkoľvek kanonických g génov R, avšak mnoho ďalších sa nachádza na okrajoch chromozómov nesúcich klaster génov NBS-LRR, vrátane TIR-NBS-LRS99.Štúdia SSR v celom genóme tiež potvrdila asociáciu génu NBS-LRR s rezistenciou na antraknózu v spoločnej fazule.Kanonický r gén sa našiel aj v genomickej oblasti nesúcej hlavný lokus rezistencie na antraknózu v bielom lupine 101.
Naša práca ukazuje, že okamžitá rezistentná reakcia, aktivovaná v skorom štádiu infekcie rastlín (najlepšie najneskôr ako 12 hpi), účinne chráni úzko lisovaný lupín pred antraknózou spôsobenou patogénnou hubou kolegom Lupini.Pomocou vysoko priepustného sekvenovania sme demonštrovali diferenciálne expresné profily génov rezistencie na antrakózu v rastlinách NLL sprostredkovaných génmi LANR1 a anmanovou rezistenciou.Úspešná obrana zahŕňa starostlivo navrhovanie génov proteínov zapojených do redoxu, fotosyntézy a patogenézy v priebehu niekoľkých hodín od prvého kontaktu rastliny s patogénom.Podobné ochranné reakcie, ale v čase oneskorené, sú oveľa menej účinné pri ochrane rastlín pred chorobami.Rezistencia na antrax sprostredkovaná génom LANR1 sa podobá typickej rýchlej reakcii génu R (imunita vyvolaná efektorom), zatiaľ čo gén Anman s najväčšou pravdepodobnosťou poskytuje horizontálnu reakciu (imunita vyvolaná molekulárnym vzorom spojeným s mikróbmi), čo poskytuje miernu úroveň udržateľnosti.
Rady 215 NLL používané na skríning antracózových markerov pozostávali zo 74 kultivarov, 60 riadkov získaných krížením alebo šľachtením, 5 mutantov a 76 divokých alebo pôvodných zárodočných plazmy.Linky pochádzajú zo 17 krajín, najmä z Poľska (58), Španielska (47), Nemecka (27), Austrálie (26), Ruska (19), Bieloruska (7), Talianska (5) a ďalších línií.z 10 krajín.Sada obsahuje aj referenčné riadky: 83a: 476, Tanjil, Wonga, ktoré nesú alelu LANR1, a Mandelup nesúci anman alelu.Línie boli získané z Európskej databázy genetických zdrojov vlčieho bôbu, ktorú spravuje Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poľsko (doplnková tabuľka S1).
Rastliny sa pestovali za kontrolovaných podmienok (fotoperióda 16 hodín, teplota 25 ° C počas dňa a 18 ° C v noci).Analyzovali sa dva biologické replikáty.DNA bola izolovaná z troch týždňov starých listov pomocou Mini súpravy DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa protokolu.Kvalita a koncentrácia izolovanej DNA bola hodnotená spektrofotometrickými metódami (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Analyzovali sa marker Anmanm1, ktorý označuje gén antracózového rezistencie génu (odvodený od cv. Mandelup) a markery Anseq3 a Anseq4, ktorý lemuje gén LANR1 (odvodený od porovnania Tanjil) 11,26,28.Homozygoty pre rezistentnú alelu boli hodnotené ako „1 ″, citlivé - ako„ 0 “a heterozygoty - ako 0,5.
Na základe výsledkov skríningu markerov Anmanm1, Anseq3 a Anseq4 a dostupnosti semien pre konečné následné experimenty bolo pre fenotypovanie rezistencie na antraknózu vybratých 50 nll riadkov.Analýza sa uskutočnila dvojmo v počítači riadenom skleníku so 14 -hodinovým fotoperiódiou s teplotným rozsahom 22 ° C počas dňa a 19 ° C v noci.Semená sú poškriabané (odrezanie semien na opačnej strane embrya s ostrou čepeľou) pred zasiatím, aby sa zabránilo spánku semien v dôsledku príliš tvrdého srsu semien a na zabezpečenie rovnomerného klíčenia.Rastliny sa pestovali v kvetináčoch (11 × 11 x 21 cm) so sterilnou pôdou (TS-1 REC 085 Stredný základ, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poľsko).Očarovanie sa uskutočňovalo s kmeňom Colletotrichum Lupini Col-08, pestovaného v roku 1999 zo stoniek z úzko lisovaných lupínskych rastlín pestovaných v poli vo Verzhenitse, Greater Poland (52 ° 27 ′ 42 ″ S 17 ° 04 ′ 05 ″ E).Získajte oblasť.Izoláty sa kultivovali v médiu SNA pri 20 ° C pri čiernom svetle počas 21 dní, aby sa vyvolala sporulácia.Štyri týždne po siate, keď rastliny dosiahli štádium 4 až 6 listov, sa inokulácia uskutočňovala postrekovaním suspenziou konídie pri koncentrácii 0,5 x 106 konídie na ml.Po očkovaní sa rastliny držali v tme 24 hodín pri vlhkosti asi 98% a teploty 25 ° C, aby sa uľahčilo klíčenie konídie a proces infekcie.Rastliny sa potom pestovali v 14-hodinovej fotoperióde v noci 22 ° C/19 ° C a 70% vlhkosť.Skóre ochorenia sa dosiahlo 22 dní po naočkovaní a pohybovalo sa od 0 (imunitné) do 9 (veľmi citlivé) v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti nekrotických lézií na stonkách a listoch.Okrem toho sa po bodovaní zmerala hmotnosť rastlín.Vzťahy medzi markerovými genotypmi a fenotypmi ochorenia sa vypočítali ako bodové korelácie s dvoma sekvenciami (neprítomnosť heterozygotných markerov v súbore čiar na analýzu fenotypu rezistencie na antraknózu).