Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Existuje potreba spoľahlivého in vitro systému, ktorý dokáže presne reprodukovať fyziologické prostredie srdca na testovanie liekov. Obmedzená dostupnosť systémov kultivácie ľudského srdcového tkaniva viedla k nepresným interpretáciám účinkov liekov na srdce. V tejto štúdii sme vyvinuli model kultúry srdcového tkaniva (CTCM), ktorý elektromechanicky stimuluje srdcové rezy a podlieha fyziologickému natiahnutiu počas systolickej a diastolickej fázy srdcového cyklu. Po 12 dňoch kultivácie tento prístup čiastočne zlepšil životaschopnosť srdcových rezov, ale úplne nezachoval ich štrukturálnu integritu. Preto sme po skríningu malých molekúl zistili, že pridanie 100 nM trijódtyronínu (T3) a 1 μM dexametazónu (Dex) do nášho média udržalo mikroštruktúru rezov počas 12 dní. V kombinácii s liečbou T3/Dex si systém CTCM udržal transkripčné profily, životaschopnosť, metabolickú aktivitu a štrukturálnu integritu na rovnakej úrovni ako čerstvé srdcové tkanivo počas 12 dní. Okrem toho nadmerné naťahovanie srdcového tkaniva v kultúre indukuje hypertrofickú srdcovú signalizáciu, čo svedčí o schopnosti CTCM napodobňovať hypertrofické stavy vyvolané natiahnutím srdca. Záverom možno povedať, že CTCM dokáže modelovať fyziológiu a patofyziológiu srdca v kultúre počas dlhého časového obdobia, čo umožňuje spoľahlivý skríning liekov.
Pred klinickým výskumom sú potrebné spoľahlivé in vitro systémy, ktoré dokážu presne reprodukovať fyziologické prostredie ľudského srdca. Takéto systémy by mali napodobňovať zmenené mechanické roztiahnutie, srdcovú frekvenciu a elektrofyziologické vlastnosti. Zvieracie modely sa bežne používajú ako skríningová platforma pre srdcovú fyziológiu s obmedzenou spoľahlivosťou pri odrážaní účinkov liekov v ľudskom srdci1,2. Ideálny experimentálny model tkanivovej kultúry srdca (CTCM) je v konečnom dôsledku model, ktorý je vysoko citlivý a špecifický pre rôzne terapeutické a farmakologické intervencie, presne reprodukujúci fyziológiu a patofyziológiu ľudského srdca3. Absencia takéhoto systému obmedzuje objavovanie nových liečebných postupov pre srdcové zlyhanie4,5 a viedla ku kardiotoxicite liekov ako hlavnému dôvodu odchodu z trhu6.
V priebehu posledného desaťročia bolo z klinického používania stiahnutých osem nekardiovaskulárnych liekov, pretože spôsobujú predĺženie QT intervalu, čo vedie k ventrikulárnym arytmiám a náhlej smrti7. Preto rastie potreba spoľahlivých predklinických skríningových stratégií na posúdenie kardiovaskulárnej účinnosti a toxicity. Nedávne použitie kardiomyocytov odvodených z ľudských pluripotentných kmeňových buniek (hiPS-CM) pri skríningu liekov a testovaní toxicity poskytuje čiastočné riešenie tohto problému. Hlavnými obmedzeniami tejto metódy sú však nezrelá povaha hiPS-CM a nedostatok viacbunkovej komplexnosti srdcového tkaniva. Nedávne štúdie ukázali, že toto obmedzenie možno čiastočne prekonať použitím skorých hiPS-CM na vytvorenie hydrogélov srdcového tkaniva krátko po nástupe spontánnych kontrakcií a postupným zvyšovaním elektrickej stimulácie v priebehu času. Tieto mikrotkanivá hiPS-CM však nemajú zrelé elektrofyziologické a kontraktilné vlastnosti dospelého myokardu. Okrem toho má ľudské srdcové tkanivo zložitejšiu štruktúru, ktorá pozostáva z heterogénnej zmesi rôznych typov buniek, vrátane endotelových buniek, neurónov a stromálnych fibroblastov, ktoré sú navzájom prepojené špecifickými súbormi proteínov extracelulárnej matrice. Táto heterogenita populácií iných ako kardiomyocytov11,12,13 v srdci dospelých cicavcov je hlavnou prekážkou modelovania srdcového tkaniva pomocou jednotlivých typov buniek. Tieto hlavné obmedzenia zdôrazňujú dôležitosť vývoja metód kultivácie intaktného tkaniva myokardu za fyziologických a patologických podmienok.
Kultivované tenké (300 µm) rezy ľudského srdca sa ukázali ako sľubný model intaktného ľudského myokardu. Táto metóda poskytuje prístup ku kompletnému 3D mnohobunkovému systému podobnému ľudskému srdcovému tkanivu. Avšak až do roku 2019 bolo použitie kultivovaných rezov srdca obmedzené krátkym (24 h) prežitím kultúry. Je to spôsobené viacerými faktormi vrátane nedostatku fyzikálno-mechanického roztiahnutia, rozhrania vzduch-kvapalina a použitia jednoduchých médií, ktoré nepodporujú potreby srdcového tkaniva. V roku 2019 niekoľko výskumných skupín preukázalo, že začlenenie mechanických faktorov do systémov kultivácie srdcového tkaniva môže predĺžiť životnosť kultúry, zlepšiť srdcovú expresiu a napodobniť srdcovú patológiu. Dve elegantné štúdie 17 a 18 ukazujú, že jednoosové mechanické zaťaženie má pozitívny vplyv na srdcový fenotyp počas kultivácie. Tieto štúdie však nepoužívali dynamické trojrozmerné fyzikálno-mechanické zaťaženie srdcového cyklu, pretože rezy srdca boli zaťažené buď izometrickými ťahovými silami 17, alebo lineárnym auxotonickým zaťažením 18. Tieto metódy naťahovania tkaniva viedli k potlačeniu mnohých srdcových génov alebo k nadmernej expresii génov spojených s abnormálnymi reakciami naťahovania. Je pozoruhodné, že Pitoulis a kol. 19 vyvinuli dynamický kultivačný kúpeľ srdcových rezov na rekonštrukciu srdcového cyklu pomocou spätnej väzby silového prevodníka a napäťových pohonov. Hoci tento systém umožňuje presnejšie modelovanie srdcového cyklu in vitro, zložitosť a nízka priepustnosť metódy obmedzujú použitie tohto systému. Naše laboratórium nedávno vyvinulo zjednodušený kultivačný systém využívajúci elektrickú stimuláciu a optimalizované médium na udržanie životaschopnosti rezov srdcového tkaniva ošípaných a ľudí až 6 dní 20,21.
V tomto rukopise popisujeme model tkanivovej kultúry srdca (CTCM) s použitím rezov bravčového srdca, ktorý zahŕňa humorálne signály na rekapituláciu trojrozmernej fyziológie srdca a patofyziologickej distenzie počas srdcového cyklu. Tento CTCM môže zvýšiť presnosť predklinickej predikcie liekov na úroveň, aká sa doteraz nedosiahla, a to poskytnutím nákladovo efektívneho srdcového systému so strednou priepustnosťou, ktorý napodobňuje fyziológiu/patofyziológiu srdca cicavcov pre predklinické testovanie liekov.
Hemodynamické mechanické signály hrajú kľúčovú úlohu pri udržiavaní funkcie kardiomyocytov in vitro 22,23,24. V tomto rukopise sme vyvinuli CTCM (obrázok 1a), ktorý dokáže napodobniť prostredie srdca dospelého človeka indukciou elektrickej aj mechanickej stimulácie pri fyziologických frekvenciách (1,2 Hz, 72 úderov za minútu). Aby sa predišlo nadmernému natiahnutiu tkaniva počas diastoly, na zväčšenie veľkosti tkaniva o 25 % sa použilo 3D tlačiarenské zariadenie (obr. 1b). Elektrická stimulácia indukovaná systémom C-PACE bola načasovaná tak, aby sa začala 100 ms pred systolou pomocou systému zberu údajov, aby sa plne reprodukoval srdcový cyklus. Systém tkanivových kultúr používa programovateľný pneumatický aktuátor (LB Engineering, Nemecko) na cyklické rozťahovanie flexibilnej silikónovej membrány, čo spôsobuje rozťahovanie srdcových plátkov v hornej komore. Systém bol pripojený k externému vzduchovému potrubiu cez tlakový prevodník, čo umožnilo presne nastaviť tlak (± 1 mmHg) a čas (± 1 ms) (obr. 1c).
a Pripevnite rez tkaniva k 7 mm podpornému krúžku, zobrazenému modrou farbou, vo vnútri kultivačnej komory zariadenia. Kultivačná komora je oddelená od vzduchovej komory tenkou flexibilnou silikónovou membránou. Medzi jednotlivé komory umiestnite tesnenie, aby ste zabránili úniku. Veko zariadenia obsahuje grafitové elektródy, ktoré poskytujú elektrickú stimuláciu. b Schematické znázornenie veľkého tkanivového zariadenia, vodiaceho krúžku a podporného krúžku. Rezy tkaniva (hnedé) sú umiestnené na nadrozmernom zariadení s vodiacim krúžkom umiestneným v drážke na vonkajšom okraji zariadenia. Pomocou vodiaceho krúžku opatrne umiestnite podporný krúžok potiahnutý tkanivovým akrylovým lepidlom na rez srdcového tkaniva. c Graf znázorňujúci čas elektrickej stimulácie ako funkciu tlaku vo vzduchovej komore riadeného programovateľným pneumatickým aktuátorom (PPD). Na synchronizáciu elektrickej stimulácie pomocou tlakových senzorov sa použilo zariadenie na zber údajov. Keď tlak v kultivačnej komore dosiahne nastavenú prahovú hodnotu, do C-PACE-EM sa odošle impulzný signál na spustenie elektrickej stimulácie. d Obrázok štyroch CTCM umiestnených na poličke inkubátora. Štyri zariadenia sú pripojené k jednému PPD prostredníctvom pneumatického obvodu a tlakové senzory sú vložené do hemostatického ventilu na monitorovanie tlaku v pneumatickom obvode. Každé zariadenie obsahuje šesť tkanivových rezov.
Pomocou jediného pneumatického ovládača sme boli schopní ovládať 4 zariadenia CTCM, z ktorých každé mohlo pojať 6 rezov tkaniva (obr. 1d). V CTCM sa tlak vzduchu vo vzduchovej komore premieňa na synchrónny tlak v tekutinovej komore a indukuje fyziologickú expanziu srdcového rezu (obrázok 2a a doplnkový film 1). Vyhodnotenie natiahnutia tkaniva pri tlaku 80 mm Hg. ukázalo natiahnutie rezov tkaniva o 25 % (obr. 2b). Ukázalo sa, že toto percentuálne natiahnutie zodpovedá fyziologickej dĺžke sarkomér 2,2–2,3 µm pre normálnu kontraktilitu srdcového rezu17,19,25. Pohyb tkaniva sa hodnotil pomocou vlastných nastavení kamery (doplnkový obrázok 1). Amplitúda a rýchlosť pohybu tkaniva (obr. 2c, d) zodpovedali natiahnutiu počas srdcového cyklu a času počas systoly a diastoly (obr. 2b). Natiahnutie a rýchlosť srdcového tkaniva počas kontrakcie a relaxácie zostali konštantné počas 12 dní v kultúre (obr. 2f). Na vyhodnotenie vplyvu elektrickej stimulácie na kontraktilitu počas kultivácie sme vyvinuli metódu na určenie aktívnej deformity pomocou algoritmu tieňovania (doplnkový obrázok 2a,b) a boli sme schopní rozlíšiť medzi deformáciami s elektrickou stimuláciou a bez nej. Tá istá časť srdca (obr. 2f). V pohyblivej oblasti rezu (R6-9) bolo napätie počas elektrickej stimulácie o 20 % vyššie ako bez elektrickej stimulácie, čo naznačuje príspevok elektrickej stimulácie ku kontraktilnej funkcii.
Reprezentatívne záznamy meraní tlaku v vzdušnej komore, tlaku v tekutinovej komore a pohybu tkaniva potvrdzujú, že tlak v komore mení tlak v tekutinovej komore, čo spôsobuje zodpovedajúci pohyb rezu tkaniva. b Reprezentatívne záznamy percentuálneho natiahnutia (modrá) rezov tkaniva zodpovedajúceho percentuálnemu natiahnutiu (oranžová). c Nameraný pohyb rezu srdca je v súlade s nameranou rýchlosťou pohybu. (d) Reprezentatívne trajektórie cyklického pohybu (modrá čiara) a rýchlosti (oranžová bodkovaná čiara) v reze srdca. e Kvantifikácia času cyklu (n = 19 rezov na skupinu, od rôznych ošípaných), času kontrakcie (n = 19 rezov na skupinu), relaxačného času (n = 19 rezov na skupinu, od rôznych ošípaných), pohybu tkaniva (n = 25 rezov)/skupina od rôznych ošípaných, maximálnej systolickej rýchlosti (n = 24(D0), 25(D12) rezov/skupina od rôznych ošípaných) a maximálnej relaxačnej rýchlosti (n = 24(D0), 25(D12) rezov/skupina od rôznych ošípaných). Obojstranný Studentov t-test nepreukázal žiadny významný rozdiel v žiadnom parametri. f Reprezentatívne záznamy analýzy deformácie rezov tkaniva s (červená) a bez (modrá) elektrickej stimulácie, desať regionálnych oblastí rezov tkaniva z tej istej rezu. Spodné panely zobrazujú kvantifikáciu percentuálneho rozdielu v deformácii v rezoch tkaniva s elektrickou stimuláciou a bez nej v desiatich oblastiach z rôznych rezov. (n = 8 rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Сттьюдеp<0н1ьюден11 **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 rezov/skupina z rôznych ošípaných, obojstranný Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < ＂ （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < ＂ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; *****p <0,00501,0 <0,0501,01,01, 0 (n = 8 sekcií/skupina, z rôznych ošípaných, obojstranný Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
V našom predchádzajúcom statickom biomimetickom kultivačnom systéme srdcových rezov [20, 21] sme udržiavali životaschopnosť, funkciu a štrukturálnu integritu srdcových rezov počas 6 dní aplikáciou elektrickej stimulácie a optimalizáciou zloženia média. Po 10 dňoch však tieto čísla prudko klesli. Budeme sa odvolávať na rezy kultivované v našom predchádzajúcom statickom biomimetickom kultivačnom systéme 20, 21 s kontrolnými podmienkami (Ctrl) a použijeme naše predtým optimalizované médium ako MC podmienky a kultiváciu za súčasnej mechanickej a elektrickej stimulácie (CTCM). Najprv sme zistili, že mechanická stimulácia bez elektrickej stimulácie nebola dostatočná na udržanie životaschopnosti tkaniva počas 6 dní (doplnkový obrázok 3a,b). Je zaujímavé, že so zavedením fyzio-mechanickej a elektrickej stimulácie pomocou STCM zostala životaschopnosť 12-dňových srdcových rezov rovnaká ako v čerstvých srdcových rezoch za podmienok MS, ale nie za podmienok Ctrl, ako ukazuje MTT analýza (obr. 1). 3a). To naznačuje, že mechanická stimulácia a simulácia srdcového cyklu môžu udržiavať tkanivové rezy životaschopné dvakrát dlhšie, ako sa uvádza v našom predchádzajúcom statickom kultivačnom systéme. Avšak hodnotenie štrukturálnej integrity tkanivových rezov imunoznačením srdcového troponínu T a konexínu 43 ukázalo, že expresia konexínu 43 bola v tkanivách MC na 12. deň významne vyššia ako v kontrolných skupinách v ten istý deň. Rovnomerná expresia konexínu 43 a tvorba Z-disku však neboli úplne zachované (obr. 3b). Na kvantifikáciu štrukturálnej integrity tkaniva používame rámec umelej inteligencie (AI)26, kanál hlbokého učenia založený na obrazoch, založený na farbení troponínu-T a konexínu43, na automatickú kvantifikáciu štrukturálnej integrity a fluorescencie srdcových rezov z hľadiska sily lokalizácie. Táto metóda využíva konvolučnú neurónovú sieť (CNN) a rámec hlbokého učenia na spoľahlivú kvantifikáciu štrukturálnej integrity srdcového tkaniva automatizovaným a nestranným spôsobom, ako je opísané v odkaze.26. Tkanivo MC vykazovalo zlepšenú štrukturálnu podobnosť s dňom 0 v porovnaní so statickými kontrolnými rezmi. Okrem toho Massonovo trichrómové farbenie odhalilo významne nižšie percento fibrózy za podmienok MS v porovnaní s kontrolnými podmienkami na 12. deň kultivácie (obr. 3c). Hoci CTCM zvýšila životaschopnosť rezov srdcového tkaniva na 12. deň na úroveň podobnú ako v prípade čerstvého srdcového tkaniva, významne nezlepšila štrukturálnu integritu rezov srdca.
Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu životaschopnosti MTT čerstvých rezov srdca (D0) alebo kultúry rezov srdca počas 12 dní buď v statickej kultúre (D12 Ctrl) alebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu životaschopnosti MTT čerstvých rezov srdca (D0) alebo kultúry rezov srdca počas 12 dní buď v statickej kultúre (D12 Ctrl) alebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 Ctrl).Histogram zobrazuje kvantifikáciu životaschopnosti čerstvých rezov srdca MTT (D0) alebo kultivácie rezov srdca počas 12 dní buď v statickej kultúre (kontrola D12) alebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). ) ), 12 (D12 MC) rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykoná sa jednofaktorový ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 (kontrola). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/軡－ANOVA呑测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001相比，**p。)histogram znázorňujúci kvantifikáciu životaschopnosti MTT v čerstvých rezoch srdca (D0) alebo rezoch srdca kultivovaných 12 dní v statickej kultúre (kontrola D12) alebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) rezov/skupina z rôznych ošípaných, jednofaktorový ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 v porovnaní s D0, **p < 0,01 v porovnaní s D12 (kontrola).b Troponín-T (zelený), konexín 43 (červený) a DAPI (modrý) v čerstvo izolovaných rezoch srdca (D0) alebo rezoch srdca kultivovaných za statických podmienok (Ctrl) alebo CTCM podmienok (MC) počas 12 dní) reprezentatívnych imunofluorescenčných snímok (mierka slepého pokusu = 100 µm). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupiny, každý z rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupiny, každý z rôznych ošípaných, vykonaný jednofaktorový ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани), искусственным интелельным (D12 ственным интелелельный = интелелелек7 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####0их < 0,0,00 #p < 0,00; a ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupín z rôznych ošípaných, vykonaný jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 vs. s D0 a ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl).人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezy/skupina z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA <00;#0.#p相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupina rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA <00##.与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердетканой = 10. deň 7. deň Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####1 vs.00 D; сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Umelá inteligencia na kvantifikáciu štrukturálnej integrity srdcového tkaniva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupina od každej z rôznych ošípaných, jednofaktorový ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Pre porovnanie ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). c Reprezentatívne obrázky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (mierka bez farbiva = 500 µm) (n = 10 rezov/skupina, každý z rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c Reprezentatívne obrázky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (mierka bez farbiva = 500 µm) (n = 10 rezov/skupina, každý z rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; #### p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердшена, сердшена, трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезнов/гсрутранпухрутранпухрутранпухрутранпухут выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравснению; c Reprezentatívne snímky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (nepotiahnutá škála = 500 µm) (n = 10 rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonaný jednosmerný ANOVA test; #### p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）Ｆ=0µ50 尺度=0个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 玸*** D010 p < 10 ，相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度壸裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 #### p 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердшны, сердшена, трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/групдпа, кайтурова свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #0иона < 0,0ного D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentatívne snímky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (slepá vzorka = 500 µm) (n = 10 rezov/skupina, každý z inej ošípanej, testované jednosmernou analýzou rozptylu;### # p < 0,0001 v porovnaní s D0, ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl).Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
Predpokladali sme, že pridaním malých molekúl do kultivačného média by sa mohla zlepšiť integrita kardiomyocytov a znížiť rozvoj fibrózy počas kultivácie CTCM. Preto sme skríning malých molekúl vykonali pomocou našich statických kontrolných kultúr20,21 kvôli malému počtu mätúcich faktorov. Na tento skríning boli vybrané dexametazón (Dex), trijódtyronín (T3) a SB431542 (SB). Tieto malé molekuly sa predtým používali v kultúrach hiPSC-CM na indukciu dozrievania kardiomyocytov zvýšením dĺžky sarkomér, T-tubulov a rýchlosti vedenia vzruchov. Okrem toho je známe, že Dex (glukokortikoid) aj SB potláčajú zápal29,30. Preto sme testovali, či by zahrnutie jednej alebo kombinácie týchto malých molekúl zlepšilo štrukturálnu integritu rezov srdca. Pre počiatočný skríning bola dávka každej zlúčeniny vybraná na základe koncentrácií bežne používaných v modeloch bunkových kultúr (1 μM Dex27, 100 nM T327 a 2,5 μM SB31). Po 12 dňoch kultivácie viedla kombinácia T3 a Dex k optimálnej štrukturálnej integrite kardiomyocytov a minimálnej fibróznej remodelácii (doplnkové obrázky 4 a 5). Okrem toho použitie dvojnásobných alebo dvojnásobných týchto koncentrácií T3 a Dex malo škodlivé účinky v porovnaní s normálnymi koncentráciami (doplnkový obrázok 6a,b).
Po počiatočnom skríningu sme vykonali porovnanie 4 kultivačných podmienok (obrázok 4a): Ctrl: rezy srdca kultivované v našej predtým opísanej statickej kultúre s použitím nášho optimalizovaného média; 20.21 TD: T3 a Ctrl s pridaným dextrometorfínom v stredu; MC: rezy srdca kultivované v CTCM s použitím nášho predtým optimalizovaného média; a MT: CTCM s pridaným T3 a dextrometorfínom do média. Po 12 dňoch kultivácie zostala životaschopnosť tkanív MS a MT rovnaká ako v čerstvých tkanivách hodnotených MTT testom (obr. 4b). Je zaujímavé, že pridanie T3 a dextrometorfínu do transwell kultúr (TD) neviedlo k významnému zlepšeniu životaschopnosti v porovnaní s podmienkami Ctrl, čo naznačuje dôležitú úlohu mechanickej stimulácie pri udržiavaní životaschopnosti rezov srdca.
Schéma experimentálneho návrhu znázorňujúca štyri kultivačné podmienky použité na vyhodnotenie účinkov mechanickej stimulácie a suplementácie T3/Dex na médiu počas 12 dní. b Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultivácii vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (Ctrl, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v porovnaní s D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). b Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultivácii vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (Ctrl, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v porovnaní s D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посенку культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравненсивизеж со сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, п. односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D). b Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultivácii vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) rezov/skupina z rôznych ošípaných, jednofaktorový ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 a **p < 0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D2TD、125)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001 0,0001 0,0001，D##相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC a MT) Poľska срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезыпару, односторонний тест ANOVA; b Histogram znázorňujúci všetky 4 kultivačné podmienky (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), z rôznych ošípaných 12 (D12 MC) rezov/skupina, jednofaktorový ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrola D12). c Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu toku glukózy 12 dní po kultivácii vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (Ctrl, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 6 rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ###p < 0,001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c Stĺpcový graf znázorňuje kvantifikáciu toku glukózy 12 dní po kultivácii vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (Ctrl, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 6 rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ###p < 0,001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 днейтвикиную во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнению со свежид 6 = сри0зерма сри0зерма срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 вне*** D 0,001 поно; 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram zobrazuje kvantifikáciu toku glukózy 12 dní po kultivácii za všetkých 4 kultivačných podmienok (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 6 rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonaný jednosmerný ANOVA test; ###p < 0,001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，吻12 后吁MC天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试D00##0#p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt ） 新鲜 心脏 切牸 切牸 切牸 切牸 切牸培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 поней культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнсисевиз сонсинизезжосования сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тOVA; сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram znázorňujúci kvantifikáciu toku glukózy 12 dní po kultivácii pre všetky 4 kultivačné podmienky (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými rezmi srdca (D0) (n = 6 rezov/skupina, z rôznych ošípaných, jednostranné). Kde boli vykonané ANOVA testy, ###p < 0,001 v porovnaní s D0, ***p < 0,001 v porovnaní s D12 (kontrola).d Grafy analýzy kmeňov čerstvých (modré), tkanív MC z 12. dňa (zelené) a tkanív MT z 12. dňa (červené) v desiatich regionálnych bodoch rezu tkaniva (n = 4 rezy/skupina, jednosmerný ANOVA test; medzi skupinami nebol žiadny významný rozdiel). e Sopkový graf zobrazujúci diferencovane exprimované gény v čerstvých rezoch srdca (D0) v ​​porovnaní so rezmi srdca kultivovanými za statických podmienok (Ctrl) alebo za podmienok MT (MT) počas 10 – 12 dní. f Tepelná mapa génov sarkomér pre rezy srdca kultivované za jednotlivých kultivačných podmienok. Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
Metabolická závislosť od prechodu z oxidácie mastných kyselín na glykolýzu je charakteristickým znakom dediferenciácie kardiomyocytov. Nezrelé kardiomyocyty primárne využívajú glukózu na produkciu ATP a majú hypoplastické mitochondrie s malým počtom kríst5,32. Analýzy využitia glukózy ukázali, že za podmienok MC a MT bolo využitie glukózy podobné ako v tkanivách z 0. dňa (obrázok 4c). Vzorky Ctrl však vykazovali významné zvýšenie využitia glukózy v porovnaní s čerstvým tkanivom. To naznačuje, že kombinácia CTCM a T3/Dex zvyšuje životaschopnosť tkaniva a zachováva metabolický fenotyp 12-dňových kultivovaných rezov srdca. Okrem toho analýza kmeňa ukázala, že hladiny kmeňa zostali rovnaké ako v čerstvom srdcovom tkanive počas 12 dní za podmienok MT a MS (obr. 4d).
Aby sme analyzovali celkový vplyv CTCM a T3/Dex na globálnu transkripčnú krajinu tkaniva srdcových rezov, vykonali sme RNAseq na srdcových rezoch zo všetkých štyroch rôznych kultivačných podmienok (doplnkové údaje 1). Je zaujímavé, že MT rezy vykazovali vysokú transkripčnú podobnosť s čerstvým srdcovým tkanivom, pričom iba 16 z 13 642 génov bolo diferencovane exprimovaných. Ako sme však ukázali skôr, Ctrl rezy vykazovali po 10–12 dňoch v kultivácii 1229 diferencovane exprimovaných génov (obr. 4e). Tieto údaje boli potvrdené qRT-PCR srdcových a fibroblastových génov (doplnkový obrázok 7a-c). Je zaujímavé, že Ctrl rezy vykazovali downreguláciu srdcových a bunkových génov a aktiváciu zápalových génových programov. Tieto údaje naznačujú, že dediferenciácia, ktorá sa normálne vyskytuje po dlhodobej kultivácii, je za MT podmienok úplne utlmená (doplnkový obrázok 8a,b). Starostlivá štúdia génov sarkomér ukázala, že iba za podmienok MT sú gény kódujúce sarkoméru (obr. 4f) a iónový kanál (doplnkový obr. 9) zachované, čo ich chráni pred potlačením za podmienok Ctrl, TD a MC. Tieto údaje ukazujú, že kombináciou mechanickej a humorálnej stimulácie (T3/Dex) môže transkriptóm srdcového rezu zostať podobný čerstvým srdcovým rezom po 12 dňoch v kultivácii.
Tieto transkripčné zistenia podporuje skutočnosť, že štrukturálna integrita kardiomyocytov v rezoch srdca je najlepšie zachovaná za podmienok MT počas 12 dní, ako ukazuje intaktný a lokalizovaný konexín 43 (obr. 5a). Okrem toho bola fibróza v rezoch srdca za podmienok MT významne znížená v porovnaní s Ctrl a podobná čerstvým rezom srdca (obr. 5b). Tieto údaje ukazujú, že kombinácia mechanickej stimulácie a liečby T3/Dex účinne zachováva štruktúru srdca v rezoch srdca v kultúre.
Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky troponínu-T (zelený), konexínu 43 (červený) a DAPI (modrý) v čerstvo izolovaných rezoch srdca (D0) alebo kultivovaných počas 12 dní za všetkých štyroch kultivačných podmienok rezov srdca (mierka = 100 µm). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonal sa jednofaktorový ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a *p < 0,05 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonal sa jednofaktorový ANOVA test; #### p < 0,0001 v porovnaní s D0 a *p < 0,05 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искустственной =D. a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный, #100AN, #1 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonaný jednofaktorový ANOVA test; #### p < 0,0001 v porovnaní s D0 a *p < 0,05 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与 D0 和 5 於 p < 0,001 与D0 和* p < 0 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D 0 和*相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva pomocou umelej inteligencie u rôznych ošípaných (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) rezy/skupina) s jednofaktorovým ANOVA testom;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 v porovnaní s D0 a *p < 0,05 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 (kontrola). b Reprezentatívne snímky a kvantifikácia rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (mierka = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). b Reprezentatívne snímky a kvantifikácia rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (mierka = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) rezov/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa jednosmerný ANOVA test; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0 a ***p < 0,001 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрашенных тронка красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) пгпуровсрепуровсрепуровсрег разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; cez сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatívne snímky a kvantifikácia rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómovým farbivom (mierka = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) rezov/skupina z rôznych ošípaných, vykonané jednosmernou ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 a ***p < 0,001 alebo ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量像和量化（比例尺！= 500 µm）20（n D = 11 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT） 组，进行单因素方差01######与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺、 = 500 µmn＀ = 500 µmn＀ d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切刉切片 切片片 切的的切片 切片 Zloženie Zloženie Zloženie Zloženie Zloženie Zloženie/eekovanie00010000000 #1####与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрашенныхомантров (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разныпыр, свуниех свуниер один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению). b Reprezentatívne snímky a kvantifikácia rezov srdca zafarbených Massonovým trichrómom (mierka = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) rezov z rôznych ošípaných/skupina, jedna metóda ANOVA; ####p < 0,0001 v porovnaní s D0, ***p < 0,001 alebo ****p < 0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl).Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
Nakoniec bola schopnosť CTCM napodobňovať srdcovú hypertrofiu hodnotená zvýšením natiahnutia srdcového tkaniva. Pri CTCM sa maximálny tlak vo vzduchovej komore zvýšil z 80 mmHg na 80 mmHg. Art. (normálne natiahnutie) až na 140 mmHg. Art. (Obr. 6a). To zodpovedá 32 % nárastu natiahnutia (Obr. 6b), ktoré bolo predtým znázornené ako zodpovedajúce percentuálne natiahnutie potrebné na to, aby srdcové rezy dosiahli dĺžku sarkoméru podobnú tej, ktorá sa pozoruje pri hypertrofii. Natiahnutie a rýchlosť srdcového tkaniva počas kontrakcie a relaxácie zostali počas šiestich dní kultivácie konštantné (Obr. 6c). Srdcové tkanivo z podmienok MT bolo vystavené normálnemu natiahnutiu (MT (normálne)) alebo nadmernému natiahnutiu (MT (preťaženie)) počas šiestich dní. Už po štyroch dňoch kultivácie bol hypertrofický biomarker NT-ProBNP v médiu za podmienok MT (preťaženie) významne zvýšený v porovnaní s podmienkami MT (normálne) (Obr. 7a). Okrem toho sa po šiestich dňoch kultivácie veľkosť buniek v MT (OS) (obr. 7b) významne zvýšila v porovnaní s rezmi srdca MT (normálne). Okrem toho sa jadrová translokácia NFATC4 významne zvýšila v preťažených tkanivách (obr. 7c). Tieto výsledky ukazujú progresívny vývoj patologickej remodelácie po hypertenzii a podporujú koncepciu, že zariadenie CTCM možno použiť ako platformu na štúdium signalizácie srdcovej hypertrofie indukovanej natiahnutím.
Reprezentatívne záznamy meraní tlaku vo vzduchovej komore, tlaku v tekutinovej komore a pohybu tkaniva potvrdzujú, že tlak v komore mení tlak v tekutinovej komore, čo spôsobuje zodpovedajúci pohyb rezu tkaniva. b Reprezentatívne krivky percenta natiahnutia a rýchlosti natiahnutia pre normálne natiahnuté (oranžové) a pretiahnuté (modré) rezy tkaniva. c Stĺpcový graf znázorňujúci čas cyklu (n = 19 rezov na skupinu, od rôznych ošípaných), čas kontrakcie (n = 18-19 rezov na skupinu, od rôznych ošípaných), relaxačný čas (n = 19 rezov na skupinu, od rôznych ošípaných)), amplitúdu pohybu tkaniva (n = 14 rezov/skupina, od rôznych ošípaných), maximálnu systolickú rýchlosť (n = 14 rezov/skupina, od rôznych ošípaných) a maximálnu rýchlosť relaxácie (n = 14 (D0), 15 (D6) rezov/skupín) od rôznych ošípaných), obojstranný Studentov t-test nepreukázal žiadny významný rozdiel v žiadnom parametri, čo naznačuje, že tieto parametre zostali konštantné počas 6 dní kultivácie s prepätím. Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
Stĺpcový graf kvantifikácie koncentrácie NT-ProBNP v kultivačnom médiu zo srdcových rezov kultivovaných za podmienok normálneho natiahnutia MT (Norm) alebo nadmerného natiahnutia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) rezy/skupina z rôznych ošípaných, vykonala sa obojsmerná ANOVA; **p < 0,01 v porovnaní s normálnym natiahnutím). Stĺpcový graf kvantifikácie koncentrácie NT-ProBNP v kultivačnom médiu zo srdcových rezov kultivovaných za podmienok normálneho natiahnutia MT (Norm) alebo nadmerného natiahnutia (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) rezy/skupina z rôznych ošípaných, vykonala sa obojsmerná ANOVA; **p < 0,01 v porovnaní s normálnym natiahnutím).Kvantitatívny histogram koncentrácie NT-ProBNP v kultivačnom médiu z rezov srdca kultivovaných za podmienok normálneho MT natiahnutia (norma) alebo pretiahnutia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) rezy/skupina z rôznych ošípaných, vykonala sa dvojfaktorová analýza rozptylu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 v porovnaní s normálnym natiahnutím). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Kvantifikácia koncentrácie NT-ProBNP v srdcových rezoch kultivovaných za podmienok MT normálneho natiahnutia (Norm) alebo nadmerného natiahnutia (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) z rôznych猪的切片/组，可以双向方方发发动 **v porovnaní s normálnym naťahovaním, p < 0,01).histogram Kvantifikácia koncentrácií NT-ProBNP v rezoch srdca kultivovaných za podmienok normálneho natiahnutia MT (norma) alebo pretiahnutia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a D4 MTOS) rezy/skupina od rôznych ošípaných, obojsmerná analýza rozptylu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 v porovnaní s normálnym natiahnutím). b Reprezentatívne snímky rezov srdca zafarbených troponínom-T a WGA (vľavo) a kvantifikácia veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buniek/skupina z 10 rôznych rezov od rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; ****p < 0,0001 v porovnaní s normálnym natiahnutím). b Reprezentatívne snímky rezov srdca zafarbených troponínom-T a WGA (vľavo) a kvantifikácia veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buniek/skupina z 10 rôznych rezov od rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; ****p < 0,0001 v porovnaní s normálnym natiahnutím). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗтвоиенова) определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разезох равс свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнениьм с; растяжением). b Reprezentatívne snímky rezov srdca zafarbených troponínom-T a AZP (vľavo) a kvantifikácia veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buniek/skupina z 10 rôznych rezov od rôznych ošípaných, bol vykonaný obojstranný Studentov t-test; ****p < 0,0001 v porovnaní s normálnym kmeňom). b MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Reprezentatívne snímky rezov srdca zafarbených kalkareínom-T a WGA (vľavo) a veľkosť buniek (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 rôznych rezov (D6 MTNorm)) Bunky/组, t-test s použitím metódy 两方法有尾学生；v porovnaní s normálnym natiahnutím, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗПвиекнева (сленева) оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных разных Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормемельнормемальнормальнормальнта; b Reprezentatívne snímky rezov srdca zafarbených troponínom-T a AZP (vľavo) a kvantifikácia veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) z 10 rôznych rezov od rôznych ošípaných) Bunky/skupina, obojstranné kritérium Studentovho t; ****p < 0,0001 v porovnaní s normálnym kmeňom). c Reprezentatívne snímky rezov srdca MTOS v deň 0 a 6 imunoznačených pre troponín-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 do jadier CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezy/skupina z rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentatívne snímky rezov srdca s MTOS v deň 0 a 6 imunoznačených pre troponín-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 do jadier CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezy/skupina od rôznych ošípaných, vykonal sa obojstranný Studentov t-test; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, Тммуномечиноныя NFATC4, a количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6зпопововововурнозных клеток) разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentatívne snímky rezov srdca v 0. a 6. dni MTOS, imunoznačené na troponín-T a NFATC4, a kvantifikácia translokácie NFATC4 v jadre kavernóznych buniek (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezy/skupina od rôznych ošípaných) vykonaná obojstranným Studentovým t-testom; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化！D0n (MT、、30n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentatívne obrázky calcanin-T a NFATC4 imunoznačenie 第0天和第6天MTOS srdcové rezy a NFATC4 z rôznych NFATC4 易位至CM bunkového jadra (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS) 化的时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS na 0 a 6 Тдень для иммуномаркитировиров NFATC4 a количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6-пзгдус) хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentatívne snímky srdcových rezov MTOS v deň 0 a 6 pre imunoznačenie troponínu-T a NFATC4 a kvantifikáciu translokácie NFATC4 v jadre CM z rôznych ošípaných (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezy/skupina, obojstranné t-kritérium Studentovho testu; *p < 0,05).Chybové úsečky predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku.
Translačný kardiovaskulárny výskum vyžaduje bunkové modely, ktoré presne reprodukujú srdcové prostredie. V tejto štúdii bolo vyvinuté a charakterizované zariadenie CTCM, ktoré dokáže stimulovať ultratenké rezy srdca. Systém CTCM zahŕňa fyziologicky synchronizovanú elektromechanickú stimuláciu a obohatenie tekutinou T3 a Dex. Keď boli rezy srdca ošípaných vystavené týmto faktorom, ich životaschopnosť, štrukturálna integrita, metabolická aktivita a transkripčná expresia zostali po 12 dňoch kultivácie rovnaké ako v čerstvom srdcovom tkanive. Okrem toho nadmerné naťahovanie srdcového tkaniva môže spôsobiť hypertrofiu srdca spôsobenú hyperextenziou. Celkovo tieto výsledky podporujú kľúčovú úlohu fyziologických kultivačných podmienok pri udržiavaní normálneho srdcového fenotypu a poskytujú platformu pre skríning liekov.
K vytvoreniu optimálneho prostredia pre fungovanie a prežitie kardiomyocytov prispieva mnoho faktorov. Najzreteľnejšie z týchto faktorov súvisia s (1) medzibunkovými interakciami, (2) elektromechanickou stimuláciou, (3) humorálnymi faktormi a (4) metabolickými substrátmi. Fyziologické interakcie medzi bunkami vyžadujú komplexné trojrozmerné siete viacerých typov buniek podporovaných extracelulárnou matricou. Takéto komplexné bunkové interakcie je ťažké rekonštruovať in vitro kokultiváciou jednotlivých typov buniek, ale možno ich ľahko dosiahnuť pomocou organotypovej povahy rezov srdca.
Mechanické natiahnutie a elektrická stimulácia kardiomyocytov sú rozhodujúce pre udržanie srdcového fenotypu33,34,35. Zatiaľ čo mechanická stimulácia sa široko používa na kondicionovanie a dozrievanie hiPSC-CM, niekoľko elegantných štúdií sa nedávno pokúsilo o mechanickú stimuláciu rezov srdca v kultúre pomocou jednoosového zaťaženia. Tieto štúdie ukazujú, že 2D jednoosové mechanické zaťaženie má pozitívny vplyv na fenotyp srdca počas kultivácie. V týchto štúdiách boli rezy srdca buď zaťažené izometrickými ťahovými silami17, lineárnym auxotonickým zaťažením18, alebo bol srdcový cyklus znovu vytvorený pomocou spätnej väzby silového prevodníka a napäťových pohonov. Tieto metódy však používajú jednoosové natiahnutie tkaniva bez optimalizácie prostredia, čo vedie k potlačeniu mnohých srdcových génov alebo k nadmernej expresii génov spojených s abnormálnymi reakciami na natiahnutie. CTCM opísaný v tomto dokumente poskytuje 3D elektromechanický stimul, ktorý napodobňuje prirodzený srdcový cyklus z hľadiska času cyklu a fyziologického natiahnutia (25 % natiahnutie, 40 % systola, 60 % diastola a 72 úderov za minútu). Hoci táto trojrozmerná mechanická stimulácia sama o sebe nestačí na udržanie integrity tkaniva, na adekvátne udržanie životaschopnosti, funkcie a integrity tkaniva je potrebná kombinácia humorálnej a mechanickej stimulácie pomocou T3/Dex.
Humorálne faktory zohrávajú dôležitú úlohu pri modulácii fenotypu dospelého srdca. Toto bolo zdôraznené v štúdiách HiPS-CM, v ktorých boli T3 a Dex pridané do kultivačného média na urýchlenie dozrievania buniek. T3 môže ovplyvniť transport aminokyselín, cukrov a vápnika cez bunkové membrány36. Okrem toho T3 podporuje expresiu MHC-α a downreguláciu MHC-β, čím podporuje tvorbu rýchlych myofibríl v zrelých kardiomyocytoch v porovnaní s pomalými myofibrilami u fetálnej CM. Nedostatok T3 u pacientov s hypotyreózou vedie k strate myofibrilárnych prúžkov a zníženej rýchlosti vývoja tonusu37. Dex pôsobí na glukokortikoidné receptory a preukázalo sa, že zvyšuje kontraktilitu myokardu v izolovaných perfundovaných srdciach;38 toto zlepšenie pravdepodobne súvisí s účinkom na vstup riadený ukladaním vápnika (SOCE)39,40. Okrem toho sa Dex viaže na svoje receptory, čo spôsobuje širokú intracelulárnu odpoveď, ktorá potláča imunitnú funkciu a zápal30.
Naše výsledky naznačujú, že fyzikálno-mechanická stimulácia (MS) zlepšila celkový výkon kultivácie v porovnaní s Ctrl, ale nedokázala udržať životaschopnosť, štrukturálnu integritu a srdcovú expresiu počas 12 dní v kultúre. V porovnaní s Ctrl, pridanie T3 a Dex do kultúr CTCM (MT) zlepšilo životaschopnosť a udržalo podobné transkripčné profily, štrukturálnu integritu a metabolickú aktivitu s čerstvým srdcovým tkanivom počas 12 dní. Okrem toho, riadením stupňa natiahnutia tkaniva bol pomocou STCM vytvorený model srdcovej hypertrofie indukovanej hyperextenziou, ktorý ilustruje všestrannosť systému STCM. Treba poznamenať, že hoci remodelácia srdca a fibróza zvyčajne zahŕňajú intaktné orgány, ktorých cirkulujúce bunky dokážu poskytnúť vhodné cytokíny, ako aj fagocytózu a ďalšie faktory remodelácie, časti srdca môžu stále napodobňovať fibrotický proces v reakcii na stres a traumu. Toto bolo predtým hodnotené v tomto modeli srdcového rezu. Treba poznamenať, že parametre CTCM je možné modulovať zmenou tlaku/elektrickej amplitúdy a frekvencie, aby sa simulovali mnohé stavy, ako je tachykardia, bradykardia a mechanická obehová podpora (mechanicky nezaťažené srdce). Vďaka tomu je systém stredne výkonný na testovanie drog. Schopnosť CTCM modelovať hypertrofiu srdca vyvolanú preťažením otvára cestu pre testovanie tohto systému pre personalizovanú terapiu. Záverom možno povedať, že táto štúdia dokazuje, že mechanické natiahnutie a humorálna stimulácia sú rozhodujúce pre udržanie kultúry rezov srdcového tkaniva.
Hoci tu uvedené údaje naznačujú, že CTCM je veľmi sľubnou platformou pre modelovanie intaktného myokardu, táto kultivačná metóda má určité obmedzenia. Hlavným obmedzením kultivácie CTCM je, že na rezy vyvíja kontinuálne dynamické mechanické namáhanie, čo vylučuje schopnosť aktívne monitorovať kontrakcie srdcových rezov počas každého cyklu. Okrem toho, vzhľadom na malú veľkosť srdcových rezov (7 mm) je obmedzená schopnosť vyhodnotiť systolickú funkciu mimo kultivačných systémov pomocou tradičných silových senzorov. V tomto rukopise čiastočne prekonávame toto obmedzenie vyhodnotením optického napätia ako indikátora kontraktilnej funkcie. Toto obmedzenie si však bude vyžadovať ďalšiu prácu a v budúcnosti sa môže riešiť zavedením metód optického monitorovania funkcie srdcových rezov v kultúre, ako je optické mapovanie pomocou vápnika a napäťovo citlivých farbív. Ďalším obmedzením CTCM je, že pracovný model nemanipuluje s fyziologickým stresom (predpätie a dopätie). V CTCM bol tlak indukovaný v opačných smeroch, aby sa reprodukovalo 25 % fyziologické natiahnutie v diastole (plné natiahnutie) a systole (dĺžka kontrakcie počas elektrickej stimulácie) vo veľmi veľkých tkanivách. Toto obmedzenie by sa malo v budúcich návrhoch CTCM odstrániť primeraným tlakom na srdcové tkanivo z oboch strán a použitím presných vzťahov medzi tlakom a objemom, ktoré sa vyskytujú v srdcových komorách.
Prestavba vyvolaná nadmerným natiahnutím, o ktorej sa v tomto rukopise píše, je obmedzená na napodobňovanie hypertrofických hyperstretch signálov. Tento model teda môže pomôcť pri štúdiu hypertrofickej signalizácie vyvolanej natiahnutím bez potreby humorálnych alebo nervových faktorov (ktoré v tomto systéme neexistujú). Na zvýšenie multiplicity CTCM sú potrebné ďalšie štúdie, napríklad kokultivácia s imunitnými bunkami, cirkulujúcimi plazmatickými humorálnymi faktormi a inervácia pri kokultivácii s neuronálnymi bunkami zlepší možnosti modelovania ochorení pomocou CTCM.
V tejto štúdii bolo použitých trinásť ošípaných. Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s inštitucionálnymi smernicami a boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie Univerzity v Louisville. Aortálny oblúk bol podviazaný svorkou a srdce bolo perfundované 1 l sterilnej kardioplégie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparínu, pH do 7,4); Srdcia boli uchovávané v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku až do transportu do laboratória na ľade, čo je zvyčajne <10 minút. Srdcia boli uchovávané v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku až do transportu do laboratória na ľade, čo je zvyčajne <10 minút. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в ладяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в ладяном кардиоплегическом обычно занимает <10 мин. Srdcia boli uchovávané v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku až do transportu do laboratória na ľade, čo zvyčajne trvá <10 minút.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10倂钢将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10倂钢 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льдяной, ном. Srdcia uchovávajte na ľade v kardioplégii až do transportu do laboratória na ľade, zvyčajne <10 min.
Zariadenie CTCM bolo vyvinuté v softvéri SolidWorks pre počítačom podporované navrhovanie (CAD). Kultivačné komory, deliace priečky a vzduchové komory sú vyrobené z priehľadného akrylového plastu obrábaného CNC. Oporný krúžok s priemerom 7 mm je vyrobený z polyetylénu s vysokou hustotou (HDPE) v strede a má drážku pre O-krúžok na uloženie silikónového O-krúžku, ktorý sa používa na utesnenie média pod ním. Kultivačnú komoru od separačnej dosky oddeľuje tenká kremičitá membrána. Silikónová membrána je laserovo vyrezaná zo silikónovej fólie s hrúbkou 0,02″ a má tvrdosť 35A. Spodné a horné silikónové tesnenia sú laserovo vyrezané zo silikónovej fólie s hrúbkou 1/16″ a majú tvrdosť 50A. Na upevnenie bloku a vytvorenie vzduchotesného tesnenia sa používajú skrutky a krídlové matice z nehrdzavejúcej ocele 316L.
Na integráciu so systémom C-PACE-EM je navrhnutá špeciálna doska plošných spojov (PCB). Konektory Swiss Machine na doske plošných spojov sú pripojené ku grafitovým elektródam postriebrenými medenými drôtmi a bronzovými skrutkami 0-60 zaskrutkovanými do elektród. Doska plošných spojov je umiestnená v kryte 3D tlačiarne.
Zariadenie CTCM je ovládané programovateľným pneumatickým aktuátorom (PPD), ktorý vytvára kontrolovaný obehový tlak podobný srdcovému cyklu. S rastúcim tlakom vo vnútri vzduchovej komory sa flexibilná silikónová membrána rozťahuje smerom nahor a tlačí médium pod tkanivo. Oblasť tkaniva sa potom týmto vypudením tekutiny natiahne, čím sa napodobní fyziologická expanzia srdca počas diastoly. Na vrchole relaxácie sa aplikovala elektrická stimulácia prostredníctvom grafitových elektród, ktorá znížila tlak vo vzduchovej komore a spôsobila kontrakciu rezov tkaniva. Vo vnútri potrubia sa nachádza hemostatický ventil so snímačom tlaku na detekciu tlaku vo vzduchovom systéme. Tlak snímaný snímačom tlaku sa privádza do zberača údajov pripojeného k notebooku. To umožňuje nepretržité monitorovanie tlaku vo vnútri plynovej komory. Po dosiahnutí maximálneho tlaku v komore (štandard 80 mmHg, 140 mmHg OS) bolo zariadenie na zber údajov nariadené, aby vyslalo signál do systému C-PACE-EM na generovanie dvojfázového napäťového signálu po dobu 2 ms, nastaveného na 4 V.
Boli získané rezy srdca a kultivačné podmienky v 6 jamkách boli vykonané nasledovne: Odobraté srdcia boli prenesené z prenosovej nádoby do misky obsahujúcej studenú (4 °C) kardioplégiu. Ľavá komora bola izolovaná sterilnou čepeľou a narezaná na kúsky s objemom 1 – 2 cm3. Tieto tkanivové bloky boli pripevnené k tkanivovým podložkám pomocou tkanivového lepidla a umiestnené do vibračného mikrotómového tkanivového kúpeľa obsahujúceho Tyrodeov roztok a kontinuálne okysličené (3 g/l 2,3-butándiónmonooxímu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukózy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztoku), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztoku), až do 1 l ddH2O). Vibračný mikrotóm bol nastavený na rezanie plátkov s hrúbkou 300 µm pri frekvencii 80 Hz, horizontálnej amplitúde vibrácií 2 mm a rýchlosti posuvu 0,03 mm/s. Tkanivový kúpeľ bol obklopený ľadom, aby sa roztok udržal chladný, a teplota sa udržiavala na 4 °C. Rezy tkaniva sa preniesli z mikrotómového kúpeľa do inkubačného kúpeľa obsahujúceho kontinuálne okysličený roztok Tyrode na ľade, kým sa nezískal dostatok rezov pre jednu kultivačnú platňu. Pre transwell kultúry boli rezy tkaniva pripevnené na sterilné 6 mm široké polyuretánové podložky a umiestnené do 6 ml optimalizovaného média (médium 199, 1x doplnok ITS, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalický a 2X antibiotikum-antimykotikum). Na rezy tkaniva sa aplikovala elektrická stimulácia (10 V, frekvencia 1,2 Hz) prostredníctvom C-Pace. Pre TD podmienky sa pri každej výmene média pridal čerstvý T3 a Dex v koncentrácii 100 nM a 1 μM. Médium sa pred výmenou nasýti kyslíkom 3-krát denne. Rezy tkaniva sa kultivovali v inkubátore pri teplote 37 °C a 5 % CO2.
Pre CTCM kultúry boli rezy tkaniva umiestnené na zákazkovo vyrobenej 3D tlačiarni v Petriho miske obsahujúcej modifikovaný Tyrodeov roztok. Zariadenie je navrhnuté tak, aby zväčšilo veľkosť rezu srdca o 25 % plochy podporného krúžku. Toto sa robí preto, aby sa rezy srdca po prenose z Tyrodeovho roztoku do média a počas diastoly neroztiahli. Pomocou histoakrylového lepidla boli rezy s hrúbkou 300 µm upevnené na podpornom krúžku s priemerom 7 mm. Po pripojení rezov tkaniva k podpornému krúžku sa prebytočné rezy tkaniva odrežú a pripojené rezy tkaniva sa vložia späť do kúpeľa s Tyrodeovým roztokom na ľade (4 °C), kým sa nepripraví dostatok rezov pre jedno zariadenie. Celkový čas spracovania pre všetky zariadenia by nemal presiahnuť 2 hodiny. Po pripojení 6 rezov tkaniva k ich podporným krúžkom sa zariadenie CTCM zostavilo. Kultivačná komora CTCM sa prednaplnila 21 ml predoxygenovaného média. Rezy tkaniva sa prenesú do kultivačnej komory a opatrne sa pomocou pipety odstránia všetky vzduchové bubliny. Rez tkaniva sa potom zavedie do otvoru a jemne sa zatlačí na miesto. Nakoniec sa na zariadenie nasadí kryt elektródy a zariadenie sa prenesie do inkubátora. Potom sa CTCM pripojí k vzduchovej hadičke a systému C-PACE-EM. Pneumatický ovládač sa otvorí a vzduchový ventil otvorí CTCM. Systém C-PACE-EM bol nakonfigurovaný tak, aby počas bifázickej stimulácie po dobu 2 ms dodával 4 V pri 1,2 Hz. Médium sa menilo dvakrát denne a elektródy sa menili raz denne, aby sa zabránilo hromadeniu grafitu na elektródach. V prípade potreby sa rezy tkaniva môžu vybrať z kultivačných jamiek, aby sa odstránili všetky vzduchové bubliny, ktoré sa pod ne mohli dostať. Pre podmienky liečby MT sa pri každej výmene média pridal čerstvý T3/Dex so 100 nM T3 a 1 μM Dex. Zariadenia CTCM sa kultivovali v inkubátore pri teplote 37 °C a 5 % CO2.
Na získanie natiahnutých trajektórií srdcových rezov bol vyvinutý špeciálny kamerový systém. Použila sa zrkadlovka (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonsko) s makro objektívom Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Vizualizácia sa uskutočnila pri izbovej teplote po výmene média za čerstvé. Kamera je umiestnená v uhle 51° a video sa nahráva rýchlosťou 30 snímok za sekundu. Najprv sa na kvantifikáciu pohybu srdcových rezov použil softvér s otvoreným zdrojovým kódom (MUSCLEMOTION43) s programom Image-J. Maska bola vytvorená pomocou MATLABu (MathWorks, Natick, MA, USA) na definovanie oblastí záujmu pre bijúce srdcové rezy, aby sa predišlo šumu. Manuálne segmentované masky sa aplikujú na všetky snímky v sekvencii snímok a potom sa odošlú do pluginu MUSCLEMOTION. Muscle Motion používa priemernú intenzitu pixelov v každom snímku na kvantifikáciu jeho pohybu vzhľadom na referenčný rámec. Dáta boli zaznamenané, filtrované a použité na kvantifikáciu času cyklu a posúdenie natiahnutia tkaniva počas srdcového cyklu. Zaznamenané video bolo následne spracované pomocou digitálneho filtra s nulovou fázou prvého rádu. Na kvantifikáciu natiahnutia tkaniva (od vrcholu k vrcholu) bola vykonaná analýza od vrcholu k vrcholu, aby sa rozlíšili vrcholy a minimá v zaznamenanom signáli. Okrem toho sa vykonalo odstránenie trendu pomocou polynómu 6. rádu na elimináciu driftu signálu. Programový kód bol vyvinutý v MATLABe na určenie globálneho pohybu tkaniva, času cyklu, relaxačného času a času kontrakcie (doplnkový programový kód 44).
Pre analýzu deformácie, s použitím rovnakých videí vytvorených na posúdenie mechanického roztiahnutia, sme najprv pomocou softvéru MUSCLEMOTION sledovali dva obrazy predstavujúce vrcholy pohybu (najvyšší (horný) a najnižší (dolný) bod pohybu). Následne sme segmentovali oblasti tkaniva a na segmentované tkanivo sme aplikovali určitý algoritmus tieňovania (doplnkový obrázok 2a). Segmentované tkanivo bolo potom rozdelené na desať podpovrchov a napätie na každom povrchu bolo vypočítané pomocou nasledujúcej rovnice: Deformácia = (Sup-Sdown)/Sdown, kde Sup a Sdown sú vzdialenosti tvaru od horného a dolného tieňa tkaniny (doplnkový obrázok 2b).
Rezy srdca boli fixované v 4 % paraformaldehyde počas 48 hodín. Fixované tkanivá boli dehydratované v 10 % a 20 % sacharóze počas 1 hodiny, potom v 30 % sacharóze cez noc. Rezy boli potom zaliate do zlúčeniny s optimálnou teplotou rezania (zlúčenina OCT) a postupne zmrazené v izopentáne/suchom ľadovom kúpeli. Zalievacie bloky OCT skladujte pri teplote -80 °C až do separácie. Sklíčka boli pripravené ako rezy s hrúbkou 8 μm.
Na odstránenie OCT zo srdcových rezov zahrievajte sklíčka na vyhrievacom bloku pri teplote 95 °C počas 5 minút. Na každé sklíčko pridajte 1 ml PBS a inkubujte 30 minút pri izbovej teplote, potom rezy prepermeanujte nastavením 0,1 % Triton-X do PBS na 15 minút pri izbovej teplote. Aby ste zabránili väzbe nešpecifických protilátok na vzorku, pridajte na sklíčka 1 ml 3 % roztoku BSA a inkubujte 1 hodinu pri izbovej teplote. BSA sa potom odstránil a sklíčka sa premyli PBS. Každú vzorku označte ceruzkou. Primárne protilátky (riedené 1:200 v 1% BSA) (konexín 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a troponín-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) boli pridané počas 90 minút, potom sekundárne protilátky (riedené 1:200 v 1% BSA) proti myšej Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) a proti králičej Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) počas ďalších 90 minút. Premytie 3-krát PBS. Na rozlíšenie cieľového farbenia od pozadia sme ako kontrolu použili iba sekundárnu protilátku. Nakoniec bolo pridané jadrové farbivo DAPI a sklíčka boli umiestnené do krytu Vectashield (Vector Laboratories) a zapečatené lakom na nechty. (-x zväčšenie) a mikroskopu Keyence so 40-násobným zväčšením.
Na farbenie WGA sa použil WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) v koncentrácii 5 μg/ml v PBS a aplikoval sa na fixované rezy počas 30 minút pri izbovej teplote. Sklíčka sa potom premyli PBS a na každé sklíčko sa pridala Sudánová čierna a inkubovali sa 30 minút. Sklíčka sa potom premyli PBS a pridalo sa zalievacie médium vectashield. Sklíčka sa vizualizovali na mikroskope Keyence pri 40-násobnom zväčšení.
OCT bol zo vzoriek odstránený podľa vyššie uvedeného postupu. Po odstránení OCT boli sklíčka ponorené cez noc do Bouinovho roztoku. Sklíčka boli potom opláchnuté destilovanou vodou na 1 hodinu a následne umiestnené do roztoku Bibrich aloe acid fuchsín na 10 minút. Potom boli sklíčka premyté destilovanou vodou a umiestnené na 10 minút do roztoku 5 % fosfomolybdénu/5 % kyseliny fosfowolfrámovej. Bez oplachovania boli sklíčka prenesené priamo do roztoku anilínovej modrej na 15 minút. Potom boli sklíčka premyté destilovanou vodou a umiestnené na 2 minúty do 1 % roztoku kyseliny octovej. Sklíčka boli vysušené v 200 N etanole a prenesené do xylénu. Zafarbené sklíčka boli vizualizované pomocou mikroskopu Keyence s objektívom 10x. Percento fibróznej plochy bolo kvantifikované pomocou softvéru Keyence Analyzer.
Test životaschopnosti buniek CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalógové číslo V13154, podľa protokolu výrobcu s niekoľkými úpravami. Na zabezpečenie jednotnej veľkosti tkaniva počas analýzy MTT sa použil najmä chirurgický razník s priemerom 6 mm. Tkanivá sa jednotlivo umiestnili do jamiek 12-jamkovej platne obsahujúcej substrát MTT podľa protokolu výrobcu. Rezy sa inkubovali pri teplote 37 °C počas 3 hodín a živé tkanivo metabolizovalo substrát MTT za vzniku fialovej formazánovej zlúčeniny. Roztok MTT sa nahradil 1 ml DMSO a inkuboval sa pri teplote 37 °C počas 15 minút, aby sa z rezov srdca extrahoval fialový formazan. Vzorky sa zriedili v pomere 1:10 v DMSO v 96-jamkových platniach s priehľadným dnom a intenzita fialovej farby sa merala pri 570 nm pomocou čítačky platní Cytation (BioTek). Hodnoty sa normalizovali na hmotnosť každého rezu srdca.
Médium pre rezy srdca bolo nahradené médiom obsahujúcim 1 μCi/ml [5-3H]-glukózy (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pre test využitia glukózy, ako bolo opísané predtým. Po 4 hodinách inkubácie sa pridalo 100 µl média do otvorenej mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej 100 µl 0,2 N HCl. Potom sa skúmavka umiestnila do scintilačnej skúmavky obsahujúcej 500 μl dH2O, aby sa [3H]2O odparovalo 72 hodín pri teplote 37 °C. Potom sa mikrocentrifugačná skúmavka vybrala zo scintilačnej skúmavky a pridalo sa 10 ml scintilačnej kvapaliny. Scintilačné počty sa vykonali pomocou kvapalinového scintilačného analyzátora Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Využitie glukózy sa potom vypočítalo s ohľadom na špecifickú aktivitu [5-3H]-glukózy, neúplnú rovnováhu a pozadie, riedenie [5-3H]-neznačenou glukózou a účinnosť scintilačného počítača. Údaje sú normalizované na hmotnosť rezov srdca.
Po homogenizácii tkaniva v Trizole bola RNA izolovaná z rezov srdca pomocou súpravy Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 podľa protokolu výrobcu. Príprava knižnice RNAsec, sekvenovanie a analýza dát boli vykonané nasledovne:
Ako východiskový materiál na prípravu RNA knižnice sa použilo 1 μg RNA na vzorku. Sekvenačné knižnice boli vytvorené pomocou súpravy NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit pre Illumina (NEB, USA) podľa odporúčaní výrobcu a k atribútovým sekvenciám pre každú vzorku boli pridané indexové kódy. Stručne povedané, mRNA bola purifikovaná z celkovej RNA pomocou magnetických guľôčok pripojených pomocou poly-T oligonukleotidov. Fragmentácia sa vykonáva pomocou dvojmocných katiónov pri vysokej teplote v NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Prvé vlákno cDNA bolo syntetizované pomocou náhodných hexamérnych primerov a reverznej transkriptázy M-MuLV (RNáza H-). Druhé vlákno cDNA sa potom syntetizuje pomocou DNA polymerázy I a RNázy H. Zostávajúce presahy sa premenia na tupé konce exonukleázovou/polymerázovou aktivitou. Po adenylácii 3' konca fragmentu DNA sa k nemu pripojí adaptér NEBNext so štruktúrou vlásenkovej slučky, aby sa pripravil na hybridizáciu. Na výber fragmentov cDNA s preferovanou dĺžkou 150-200 bp. Fragmenty knižnice boli purifikované pomocou systému AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Potom boli 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) s cDNA selektovanou podľa veľkosti ligovanou pomocou adaptéra použité 15 minút pri teplote 37 °C a potom 5 minút pri 95 °C pred PCR. PCR bola následne vykonaná s použitím DNA polymerázy Phusion High-Fidelity, univerzálnych PCR primerov a primerov Index (X). Nakoniec boli produkty PCR purifikované (systém AMPure XP) a kvalita knižnice bola posúdená na systéme Agilent Bioanalyzer 2100. Knižnica cDNA bola následne sekvenovaná pomocou sekvenátora Novaseq. Súbory surových obrazov od spoločnosti Illumina boli prevedené na surové čítania pomocou CASAVA Base Calling. Surové dáta sú uložené v súboroch vo formáte FASTQ(fq), ktoré obsahujú čítacie sekvencie a zodpovedajúce bázové kvality. Vyberte HISAT2, aby sa filtrované sekvenčné čítania zhodovali s referenčným genómom Sscrofa11.1. Vo všeobecnosti HISAT2 podporuje genómy akejkoľvek veľkosti vrátane genómov väčších ako 4 miliardy báz a pre väčšinu parametrov sú nastavené predvolené hodnoty. Zostrihové čítania z údajov RNA Seq je možné efektívne zarovnať pomocou HISAT2, najrýchlejšieho systému, ktorý je v súčasnosti k dispozícii, s rovnakou alebo lepšou presnosťou ako akákoľvek iná metóda.
Množstvo transkriptov priamo odráža úroveň génovej expresie. Hladiny génovej expresie sa hodnotia podľa množstva transkriptov (počet sekvenovaní) spojených s genómom alebo exónmi. Počet čítaní je úmerný úrovniam génovej expresie, dĺžke génu a hĺbke sekvenovania. Vypočítali sa FPKM (fragmenty na tisíc bázových párov sekvenovaných transkriptov na milión bázových párov) a pomocou balíka DESeq2 sa určili P-hodnoty diferenciálnej expresie. Následne sme vypočítali mieru falošných objavov (FDR) pre každú hodnotu P pomocou Benjaminiho-Hochbergovej metódy9 na základe vstavanej R-funkcie „p.adjust“.
RNA izolovaná zo srdcových rezov bola prevedená na cDNA v koncentrácii 200 ng/μl pomocou zmesi SuperScript IV Vilo Master od spoločnosti Thermo (Thermo, kat. č. 11756050). Kvantitatívna RT-PCR bola vykonaná pomocou priehľadnej reakčnej platne Applied Biosystems Endura Plate Microamp s 384 jamkami (Thermo, kat. č. 4483319) a optického lepidla Microamp (Thermo, kat. č. 4311971). Reakčná zmes pozostávala z 5 µl zmesi Taqman Fast Advanced Master (Thermo, kat. č. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer a 3,5 µl H2O zmiešaných na jamku. Boli vykonané štandardné cykly qPCR a hodnoty CT boli merané pomocou prístroja Applied Biosystems Quantstudio 5 pre real-time PCR (384-jamkový modul; produkt č. A28135). Primery Taqman boli zakúpené od spoločnosti Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Hodnoty CT všetkých vzoriek boli normalizované na gén GAPDH.
Uvoľňovanie NT-ProBNP z média sa hodnotilo pomocou súpravy NT-ProBNP (pig) (kat. č. MBS2086979, MyBioSource) podľa protokolu výrobcu. Stručne povedané, do každej jamky sa duplicitne pridalo 250 µl každej vzorky a štandardu. Ihneď po pridaní vzorky sa do každej jamky pridalo 50 µl testovacieho činidla A. Platňu jemne pretrepte a utesnite tesniacim materiálom. Tablety sa potom inkubovali pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa roztok odsával a jamky sa 4-krát premyli s 350 µl 1X premývacieho roztoku, pričom sa premývací roztok inkuboval 1 – 2 minúty. Potom sa do každej jamky pridalo 100 µl testovacieho činidla B a utesnilo sa tesniacim materiálom platne. Tableta sa jemne pretrepala a inkubovala sa pri teplote 37 °C počas 30 minút. Roztok sa odsával a jamky sa 5-krát premyli s 350 µl 1X premývacieho roztoku. Do každej jamky pridajte 90 µl roztoku substrátu a platňu utesnite. Platňu inkubujte pri teplote 37 °C počas 10 – 20 minút. Do každej jamky pridajte 50 µl zastavovacieho roztoku. Platňa bola okamžite zmeraná pomocou čítačky platní Cytation (BioTek) nastavenej na 450 nm.
Boli vykonané výkonnostné analýzy s cieľom vybrať veľkosti skupín, ktoré poskytnú výkon > 80 % na detekciu 10 % absolútnej zmeny parametra s 5 % chybovosťou typu I. Boli vykonané výkonnostné analýzy s cieľom vybrať veľkosti skupín, ktoré poskytnú výkon > 80 % na detekciu 10 % absolútnej zmeny parametra s 5 % chybovosťou typu I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80 % м. обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Bola vykonaná analýza sily na výber veľkostí skupín, ktoré by poskytli silu > 80 % na detekciu 10 % absolútnej zmeny parametra s 5 % mierou chybovosti typu I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил былоя > 80% обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Bola vykonaná analýza sily na výber veľkosti skupiny, ktorá by poskytla silu > 80 % na detekciu 10 % absolútnej zmeny parametra a 5 % miery chybovosti typu I.Rezy tkaniva boli pred experimentom náhodne vybrané. Všetky analýzy boli zaslepené a vzorky boli dekódované až po analýze všetkých údajov. Na vykonanie všetkých štatistických analýz bol použitý softvér GraphPad Prism (San Diego, CA). Pre všetky štatistiky boli p-hodnoty považované za významné pri hodnotách <0,05. Pre všetky štatistiky boli p-hodnoty považované za významné pri hodnotách < 0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pre všetky štatistiky boli p-hodnoty považované za významné pri hodnotách < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pre všetky štatistiky boli p-hodnoty považované za významné pri hodnotách < 0,05.Na údajoch bol vykonaný obojstranný Studentov t-test iba s 2 porovnaními. Na určenie významnosti medzi viacerými skupinami bola použitá jednosmerná alebo obojsmerná ANOVA. Pri vykonávaní post hoc testov bola použitá Tukeyho korekcia na zohľadnenie viacnásobných porovnaní. Údaje RNAsec majú špeciálne štatistické aspekty pri výpočte FDR a p.adjust, ako je opísané v časti Metódy.
Viac informácií o dizajne štúdie nájdete v abstrakte správy o výskume prírody (Nature Research Report), ktorý odkazuje na tento článok.