Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo zaradi zagotavljanja stalne podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Morfogeneza človeškega črevesja vzpostavlja značilnosti kript-resic 3D epitelijske mikroarhitekture in prostorske organizacije. Ta edinstvena struktura je potrebna za vzdrževanje črevesne homeostaze z zaščito niše matičnih celic v bazalni kripti pred eksogenimi mikrobnimi antigeni in njihovimi metaboliti. Poleg tega črevesne resice in izločajoča sluz predstavljajo funkcionalno diferencirane epitelne celice z zaščitno pregrado na površini črevesne sluznice. Zato je ponovno ustvarjanje 3D epitelijskih struktur ključnega pomena za konstrukcijo in vitro modelov črevesja. Predvsem lahko organsko mimetično črevesje na čipu inducira spontano 3D morfogenezo črevesnega epitelija z izboljšanimi fiziološkimi funkcijami in biomehaniko. Tukaj nudimo ponovljiv protokol za robustno induciranje črevesne morfogeneze v črevesju. t na mikrofluidnem čipu kot tudi v Transwell vgrajenem hibridnem čipu. Opisujemo podrobne metode za izdelavo naprave, gojenje epitelijskih celic Caco-2 ali intestinalnih organoidov v običajnih okoljih kot tudi na mikrofluidni platformi, indukcijo 3D morfogeneze in karakterizacijo vzpostavljenega 3D epitelija z uporabo več načinov slikanja. Ta protokol doseže regeneracijo funkcionalnega črevesja mikroarhitekturo z nadzorovanjem bazolateralnega pretoka tekočine za 5 dni. Naša metoda morfogeneze in vitro uporablja fiziološko pomemben strižni stres in mehansko gibanje ter ne zahteva zapletenega celičnega inženiringa ali manipulacije, ki bi lahko prekašala druge obstoječe tehnike. Predvidevamo, da bi naš predlagani protokol lahko imel široke posledice za biomedicinsko raziskovalno skupnost, saj zagotavlja metodo za regeneracijo 3D črevesnih epitelijskih plasti in vitro za biomedicinske, klinične in farmacevtske aplikacije.
Poskusi dokazujejo, da so intestinalne epitelijske celice Caco-2, gojene v črevesju na čipu1,2,3,4,5 ali dvoslojnih mikrofluidnih napravah6,7, lahko podvržene spontani 3D morfogenezi in vitro brez jasnega razumevanja osnovnega mehanizma. V naši nedavni študiji smo ugotovili, da je odstranitev bazolateralno izločenih antagonistov morfogena iz naprav za kulturo potrebna in zadostna za induciranje 3D epitelijske smrti fogenezo in vitro, ki je bila dokazana s Caco-2 in črevesnimi organoidi, pridobljenimi iz bolnikov.Epitelijske celice so bile potrjene. V tej študiji smo se posebej osredotočili na celično proizvodnjo in porazdelitev koncentracije močnega antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), v črevesju na čipu in modificiranih mikrofluidnih napravah, ki vsebujejo vložke Transwell, imenovanih »hibridni čip«. Dokazujemo, da dodatek eksogenih antagonistov Wnt (kot je DKK-1, represor Wnt 1, izloča frizzled protein 1 ali Soggy-1) v črevesju na čipu zavira morfogenezo ali moti predstrukturirano 3D epitelno plast, kar kaže, da je antagonistični stres med kulturo odgovoren za črevesno morfogenezo in vitro. Zato je praktičen pristop za doseganje robustne morfogeneze na epitelnem vmesniku odstranitev ali minimalno vzdrževanje ravni antagonistov Wnt v bazolateralnem delu ment z aktivnim izpiranjem (npr. v platformah gut-on-a-chip ali hybrid-on-a-chip) ali difuzijo. Bazolateralni mediji (npr. iz vložkov Transwell v velike bazolateralne rezervoarje v vrtinah).
V tem protokolu nudimo podrobno metodo za izdelavo mikronaprav gut-on-a-chip in hibridnih čipov, ki jih je mogoče vstaviti v Transwell (koraki 1-5) za gojenje črevesnih epitelijskih celic na poroznih membranah na osnovi polidimetilsiloksana (PDMS) (koraki 6A, 7A, 8, 9) ali poliestrskih membranah vložkov Transwell (koraki 6B, 7B, 8, 9) in inducirano 3D morfogenezo in vitro (korak 10). Identificirali smo tudi celične in molekularne lastnosti, ki kažejo na tkivno specifično histogenezo in celično diferenciacijo, odvisno od linije, z uporabo več modalitet slikanja (koraki 11-24). Morfogenezo induciramo z uporabo človeških črevesnih epitelijskih celic, kot je Caco-2 ali črevesnih organoidov, v dveh oblikah kulture s tehničnimi podrobnostmi, vključno s površinskimi modifikacijami. ifikacija poroznih membran, ustvarjanje 2D monoslojev ter črevesna biokemična in reprodukcija biomehanskega mikrookolja. in vitro. Za induciranje 3D morfogeneze iz 2D epitelijskih monoslojev smo odstranili antagoniste morfogena v obeh gojenih oblikah s pretokom medija v bazolateralni predel kulture. Končno nudimo predstavitev uporabnosti obnovljivega 3D epitelija telijska plast, ki se lahko uporabi za modeliranje epitelijske rasti, odvisne od morfogena, vzdolžnih sokultur gostitelja in mikrobioma, okužbe s patogeni, vnetne poškodbe, disfunkcije epitelijske pregrade in terapij na osnovi probiotikov Primer.vplivov.
Naš protokol je lahko koristen za širok spekter znanstvenikov v osnovnih (npr. biologija črevesne sluznice, biologija izvornih celic in razvojna biologija) in aplikativnih raziskavah (npr. predklinično testiranje zdravil, modeliranje bolezni, tkivno inženirstvo in gastroenterologija). Zaradi ponovljivosti in robustnosti našega protokola za induciranje 3D morfogeneze črevesnega epitelija in vitro predvidevamo, da bo naš tehnično strategijo je mogoče posredovati občinstvu, ki preučuje dinamiko celičnega signaliziranja med črevesnim razvojem, regeneracijo ali homeostazo. Poleg tega je naš protokol uporaben za zasliševanje okužbe z različnimi povzročitelji okužb, kot so Norovirus 8, Koronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ali Vibrio cholerae.Koristna so tudi poslušanja patologije in patogeneze bolezni. Uporaba mikrofiziološkega sistema črevesja na čipu lahko omogoči vzdolžno sokulturo 10 in kasnejšo oceno obrambe gostitelja, imunskih odzivov in popravila poškodb, povezanih s patogeni, v prebavilih (GI) 11. Druge motnje GI, povezane s sindromom puščajočega črevesja, celiakijo, Crohnovo boleznijo, ulceroznim kolitisom, pouchitisom ali Sindrom razdražljivega črevesja je mogoče simulirati, ko so 3D črevesne epitelijske plasti pripravljene z uporabo pacientovih 3D črevesnih epitelijskih plasti. Te bolezni vključujejo atrofijo resic, skrajšanje kript, poškodbe sluznice ali oslabljeno epitelno pregrado. Biopsija ali črevesni organoidi, pridobljeni iz izvornih celic12,13. Za boljše modeliranje višje kompleksnosti okolja bolezni bralci lahko razmisli o dodajanju tipov celic, pomembnih za bolezen, kot so mononuklearne celice periferne krvi pacientov (PBMC), modelom, ki vsebujejo 3D mikroarhitekture črevesnih resic-kript.tkivno specifične imunske celice, 5.
Ker je 3D epitelijsko mikrostrukturo mogoče popraviti in vizualizirati brez postopka rezanja, bo gledalce, ki delajo na prostorski transkriptomiki in slikanju z visoko ali super ločljivostjo, morda zanimalo naše kartiranje prostorsko-časovne dinamike genov in proteinov na epitelijskih nišah.Zanima me tehnologija. Odziv na mikrobne ali imunske dražljaje. Poleg tega se vzdolžni preslušavanje gostitelja in mikrobioma 10, 14, ki usklajuje črevesno homeostazo, lahko vzpostavi v 3D plasti črevesne sluznice s sokultiviranjem različnih mikrobnih vrst, mikrobnih skupnosti ali fekalne mikrobiote, zlasti v črevesju na čipu.v platformi. Ta pristop je še posebej privlačen za občinstvo, ki preučuje mukozno imunologijo, gastroenterologijo, človeški mikrobiom, kulturomiko in klinično mikrobiologijo, ki želi v laboratoriju gojiti prej nekultivirano črevesno mikrobioto. Če je naš protokol morfogeneze in vitro mogoče prilagoditi razširljivim formatom kulture, kot so vstavki z več jamicami v ploščah s 24, 96 ali 384 jamicami, ki nenehno dopolnjujejo bazo stranskih predelkov je protokol mogoče razširiti tudi na tiste, ki razvijajo farmacevtske, biomedicinske ali visoko zmogljive presejalne ali validacijske platforme za živilsko industrijo. Kot dokaz načela smo pred kratkim dokazali izvedljivost multipleksnega visoko zmogljivega sistema za morfogenezo, ki je razširljiv na ploščo s 24 vdolbinicami. Poleg tega je bilo komercializiranih več izdelkov organov na čipu16,17,18. Poleg tega lahko validacijo naše metode in vitro morfogeneze pospešimo in jo potencialno sprejmejo številni raziskovalni laboratoriji, industrija ali vladne in regulativne agencije, da bi razumeli celično reprogramiranje in vitro morfogeneze črevesja na transkriptomski ravni za testiranje zdravil ali bioterapevtikov. Absorpcijo in transport kandidatov za zdravila sta ocenila s 3D črevesnimi nadomestki ali z uporabo prilagojenih ali komercialnih modelov organa na čipu za oceno ponovljivosti proces črevesne morfogeneze.
Za preučevanje morfogeneze črevesnega epitelija je bilo uporabljeno omejeno število eksperimentalnih modelov, ki so pomembni za človeka, predvsem zaradi pomanjkanja izvedljivih protokolov za induciranje 3D morfogeneze in vitro. Pravzaprav velik del trenutnega znanja o morfogenezi črevesja temelji na študijah na živalih (npr. ribe cebrice20, miši21 ali piščanci22). Vendar pa so delovno in stroškovno intenzivne, jih je mogoče etično vprašljivo in, kar je najpomembnejše, ne določa natančno človeških razvojnih procesov. Ti modeli so tudi zelo omejeni glede svoje zmožnosti testiranja na večsmerni razširljiv način. Zato naš protokol za regeneracijo 3D tkivnih struktur in vitro prekaša živalske modele in vivo kot tudi druge tradicionalne statične 2D modele celične kulture. Kot je bilo že opisano, nam je uporaba 3D epitelijskih struktur omogočila pregled prostorskih lokalizacija diferenciranih celic v osi kripta-resice kot odziv na različne mukozne ali imunske dražljaje. 3D epitelijske plasti lahko zagotovijo prostor za preučevanje, kako mikrobne celice tekmujejo za oblikovanje prostorskih niš in ekološko evolucijo kot odziv na dejavnike gostitelja (npr. notranje v primerjavi z zunanjimi plastmi sluzi, izločanje IgA in protimikrobnih peptidov). Poleg tega nam lahko 3D epitelijska morfologija omogoči razumevanje, kako črevesna mikrobiota strukturira svoje skupnosti in sinergistično proizvaja mikrobne metabolite (npr. kratkoverižne maščobne kisline), ki oblikujejo celično organizacijo in niše matičnih celic v bazalnih kriptah. Te lastnosti je mogoče dokazati le, če so 3D epitelijske plasti vzpostavljene in vitro.
Poleg naše metode ustvarjanja 3D črevesnih epitelijskih struktur obstaja več metod in vitro. Črevesna organoidna kultura je najsodobnejša tehnika tkivnega inženiringa, ki temelji na gojenju črevesnih izvornih celic pod specifičnimi morfogenimi pogoji 23, 24, 25. Vendar pa je uporaba 3D organoidnih modelov za transportno analizo ali sokulture gostitelja in mikrobioma pogosto zahtevna, ker je črevesni lumen zaprti znotraj organoida, zato je vnos luminalnih komponent, kot so mikrobne celice ali eksogeni antigeni, omejen.Dostop do organoidnih lumnov je mogoče izboljšati z uporabo mikroinjektorja, 26, 27, vendar je ta metoda invazivna in delovno intenzivna ter zahteva specializirano znanje za izvedbo. Poleg tega tradicionalne organoidne kulture, vzdrževane v hidrogelnih odrih v statičnih pogojih, ne odražajo natančno aktivne in vivo biomehanike.
Drugi pristopi, ki jih uporablja več raziskovalnih skupin, uporabljajo predstrukturirana 3D hidrogelna ogrodja za posnemanje črevesne epitelijske strukture z gojenjem izoliranih človeških črevesnih celic na površini gela. Izdelajte hidrogelne ogrodja z uporabo 3D-natisnjenih, mikromletih ali litografsko izdelanih kalupov. Ta metoda prikazuje samoorganizirano razporeditev izoliranih epitelijskih celic in vitro s fiziološko pomembnimi gradienti morfogena , ki vzpostavlja epitelno strukturo visokega razmerja stranic in preslušavanje stroma-epitelij z vključitvijo stromalnih celic v oder. Vendar pa lahko narava predstrukturiranih ogrodij prepreči prikaz samega spontanega morfogenetskega procesa. Ti modeli prav tako ne zagotavljajo dinamičnega luminalnega ali intersticijskega toka, saj nimajo strižne napetosti tekočine, ki jo črevesne celice potrebujejo za morfogenezo in pridobitev fiziološke funkcije. Druga nedavna študija je uporabila hidrogelne ogrodja v mikrofluidni platformi in vzorčaste intestinalne epitelne strukture s tehnikami laserskega jedkanja. Mišji intestinalni organoidi sledijo vgraviranim vzorcem, da tvorijo črevesne tubularne strukture, intraluminalni pretok tekočine pa je mogoče povzeti z uporabo mikrofluidnega modula. Vendar pa ta model ne kaže niti spontanih morfogenetskih procesov niti ne vključuje črevesnih mehanobioloških gibanj Tehnike .3D-tiskanja iz iste skupine so uspele ustvariti miniaturne črevesne cevke s spontanimi morfogenetskimi procesi. Kljub zapleteni izdelavi različnih segmentov črevesja v cevki ta model prav tako nima pretoka luminalne tekočine in mehanske deformacije. Poleg tega je lahko delovanje modela omejeno, zlasti po končanem postopku biotiskanja, kar moti eksperimentalne pogoje ali interakcije med celicami. Namesto tega naš predlagani protokol zagotavlja spontani črevesni morfogen esis, fiziološko pomemben strižni stres, biomehanika, ki posnema gibljivost črevesja, dostopnost neodvisnih apikalnih in bazolateralnih predelkov ter poustvarjanje kompleksnih bioloških mikrookolij modularnosti. Zato lahko naš protokol 3D morfogeneze in vitro zagotovi komplementaren pristop za premagovanje izzivov obstoječih metod.
Naš protokol je v celoti osredotočen na 3D epitelijsko morfogenezo, pri čemer so samo epitelne celice v kulturi in nobenih drugih vrst okoliških celic, kot so mezenhimske celice, endotelne celice in imunske celice. Kot je bilo že opisano, je jedro našega protokola indukcija epitelne morfogeneze z odstranitvijo zaviralcev morfogena, izločenih na bazolateralni strani vnesenega medija. Medtem ko robustna modularnost naš črevesje na čipu in hibrid na čipu nam omogočata, da poustvarimo valovito 3D epitelno plast, dodatne biološke zapletenosti, kot so epitelno-mezenhimske interakcije33,34, odlaganje zunajceličnega matriksa (ECM) 35 in v našem modelu lastnosti kript-resic, ki posredujejo niše matičnih celic v bazalnih kriptah, je treba še dodatno upoštevati. Stromalne celice (npr. fibro blasti) v mezenhimu igrajo ključno vlogo pri proizvodnji proteinov ECM in regulaciji črevesne morfogeneze in vivo35,37,38. Dodatek mezenhimskih celic k našemu modelu je izboljšal morfogenetski proces in učinkovitost celične pritrditve. Endotelijska plast (tj. kapilare ali limfne žile) ima pomembno vlogo pri uravnavanju molekularnega transporta39 in rekrutiranja imunskih celic40 v črevesju mikrookolje. Poleg tega so komponente vaskulature, ki jih je mogoče povezati med tkivnimi modeli, predpogoj, ko so tkivni modeli zasnovani za prikaz medsebojnega delovanja več organov. Zato bo morda treba vključiti endotelijske celice za modeliranje natančnejših fizioloških značilnosti z ločljivostjo na ravni organa. Imunske celice, pridobljene iz bolnikov, so bistvene tudi za prikaz prirojenih imunskih odzivov, predstavitve antigena, prirojenega adaptivnega imunskega preslušavanja in tkivno specifičnega preslušavanja. c imunost v kontekstu posnemanja črevesne bolezni.
Uporaba hibridnih čipov je enostavnejša od črevesja na čipu, ker je nastavitev naprave enostavnejša in uporaba vložkov Transwell omogoča razširljivo kulturo črevesnega epitelija. Vendar komercialno dostopni vložki Transwell s poliestrskimi membranami niso elastični in ne morejo simulirati peristaltičnih gibov. Poleg tega je apikalni predel vložka Transwell, nameščen v hibridnem čipu, ostal nepremični ar stres na apikalni strani. Jasno je, da statične lastnosti v apikalnem predelu redko omogočajo dolgoročno sokulturo bakterij v hibridnih čipih. Čeprav lahko pri uporabi hibridnih čipov robustno induciramo 3D morfogenezo v vložkih Transwell, lahko pomanjkanje fiziološko pomembne biomehanike in apikalnega pretoka tekočine omeji izvedljivost platform hibridnih čipov za potencialne aplikacije.
Celovite rekonstrukcije osi človeška kripta-resice v kulturah črevesja na čipu in hibridov na čipu niso bile v celoti vzpostavljene. Ker se morfogeneza začne iz epitelnega monosloja, 3D mikroarhitekture ne zagotavljajo nujno morfološke podobnosti s kriptami in vivo. Čeprav smo karakterizirali proliferirajočo celično populacijo blizu domene bazalne kripte v mikromotorju V 3D-epitelu kripta in vilusne regije niso bile jasno razmejene. Čeprav višji zgornji kanali na čipu vodijo do povečane višine mikroinženirskega epitelija, je največja višina še vedno omejena na ~300–400 µm. Dejanska globina človeških črevesnih kript v tankem in debelem črevesu je ~135 µm oziroma ~400 µm, višina pa resice tankega črevesa so ~600 µm41.
S stališča slikanja je lahko in situ slikanje 3D mikroarhitektur v super ločljivosti omejeno na črevesje na čipu, saj je zahtevana delovna razdalja od leče objektiva do epitelne plasti reda velikosti nekaj milimetrov. Da bi odpravili to težavo, bo morda potreben oddaljeni objektiv. Poleg tega je izdelava tankih rezov za pripravo vzorcev za slikanje zahtevna zaradi visoke elastičnosti PDMS. Poleg tega je ker poplastna mikroizdelava črevesja na čipu vključuje trajno oprijem med vsako plastjo, je izjemno težko odpreti ali odstraniti zgornjo plast, da bi pregledali površinsko strukturo epitelne plasti. Na primer z uporabo vrstičnega elektronskega mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS je bila omejevalni dejavnik v mikrofluidnih študijah, ki obravnavajo hidrofobne majhne molekule, saj lahko PDMS nespecifično adsorbira takšne hidrofobne molekule. Alternative za PDMS se lahko upoštevajo z drugimi polimernimi materiali. Druga možnost je, da površinska modifikacija PDMS (npr. prevleka z lipofilnimi materiali 42 ali poli(etilen glikol) 43) zmanjša adsorpcija hidrofobnih molekul.
Nazadnje, naša metoda ni bila dobro opredeljena v smislu zagotavljanja visoko zmogljivega presejanja ali uporabniku prijazne eksperimentalne platforme »ena velikost za vse«. Trenutni protokol zahteva črpalko z brizgo na mikronapravo, ki zavzema prostor v CO2 inkubatorju in preprečuje obsežne poskuse. To omejitev je mogoče znatno izboljšati z razširljivostjo formatov inovativnih kultur (npr. 24 vdolbinic, 96 vdolbinic ali 384-vdolbinic). dobro porozni vložki, ki omogočajo neprekinjeno dopolnjevanje in odstranjevanje bazolateralnega medija).
Za induciranje 3D morfogeneze človeškega črevesnega epitelija in vitro smo uporabili črevesno napravo z mikrofluidnim čipom, ki vsebuje dva vzporedna mikrokanala in elastično porozno membrano vmes, da bi ustvarili lumensko-kapilarni vmesnik. Prikazali smo tudi uporabo enokanalne mikrofluidne naprave (hibridnega čipa), ki zagotavlja neprekinjen bazolateralni pretok pod zraslimi polariziranimi epitelijskimi plastmi na Transwellovih vložkih. Na obeh platformah je mogoče prikazati morfogenezo različnih človeških črevesnih epitelijskih celic z uporabo usmerjene manipulacije toka za odstranitev antagonistov morfogena iz bazolateralnega prostora. Celoten eksperimentalni postopek (slika 1) je sestavljen iz petih delov: (i) mikroizdelava črevesnega čipa ali Transwellovega vstavljivega hibridnega čipa (koraki 1-5; polje 1), (ii) priprava črevesne epitelijske celice (celice Caco-2) ali človeške črevesne organoide;polja 2-5), (iii) kultura črevesnih epitelijskih celic na črevesnih čipih ali hibridnih čipih (koraki 6-9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) in (v) ) za karakterizacijo 3D epitelne mikrostrukture (koraki 11-24). Nazadnje je bila oblikovana ustrezna kontrolna skupina (o kateri je podrobneje razpravljano spodaj) za validacijo učinkovitost in vitro morfogeneze s primerjavo epitelijske morfogeneze s prostorskimi, časovnimi, pogojnimi ali postopkovnimi kontrolami.
Uporabili smo dve različni platformi kulture: črevesje na čipu z ravnimi kanali ali nelinearnimi zavitimi kanali ali hibridne čipe, ki vsebujejo vložke Transwell (TW) v mikrofluidni napravi, izdelani, kot je opisano v okvirju 1, in korak 1 -5. »Izdelava naprave« prikazuje glavne korake pri izdelavi enega samega čipa ali hibridnega čipa. »Kultura človeških črevesnih epitelijskih celic« pojasnjuje vir celic (Caco-2 ali človeški intestinalni organoidi) in postopek gojenja, uporabljen v tem protokolu. »In vitro morfogeneza« prikazuje splošne korake, v katerih se Caco-2 ali epitelijske celice, pridobljene iz organoida, gojijo na črevesnem čipu ali na Transwellovih vstavkih hibridnega čipa, čemur sledi indukcija 3D morfogeneze in tvorba značilne epitelijske strukture. Številka koraka programa ali številka polja je prikazana spodaj vsaka puščica. Aplikacija ponuja primere, kako je mogoče uporabiti uveljavljene črevesne epitelne plasti, na primer pri karakterizaciji celične diferenciacije, fizioloških študijah črevesja, vzpostavitvi ekosistemov mikrobioma gostitelja in modeliranju bolezni. Imunofluorescenčne slike v »Cell Differentiation« prikazujejo jedra, F-aktin in MUC2, izražene v 3D Caco-2 epitelijski plasti, ustvarjeni v črevesju čip. Signalizacija MUC2 je prisotna v vrčastih celicah in sluzi, izločeni s površin sluznice. Fluorescentne slike v Gut Physiology prikazujejo sluz, ki nastane z barvanjem na ostanke sialne kisline in N-acetilglukozamina z uporabo fluorescenčnega aglutinina pšeničnih kalčkov. Dve prekrivajoči se sliki v »Host-Microbe Co-Cultures« prikazujeta reprezentativne sokulture gostitelja in mikrobioma v črevesju čip. Leva plošča prikazuje sokulturo E. coli, ki izraža zeleni fluorescentni protein (GFP) z mikroinženiringom 3D Caco-2 epitelijskih celic. Desna plošča prikazuje lokalizacijo GFP E. coli, sokultivirane s 3D Caco-2 epitelnimi celicami, čemur sledi imunofluorescenčno obarvanje s F-aktinom (rdeče) in jedri (modro). Modeliranje bolezni ponazarja zdrave v primerjavi z puščajočim črevesjem pri čipih za vnetje črevesja pod fiziološkim izzivom z bakterijskimi antigeni (npr. lipopolisaharidom, LPS) in imunskimi celicami (npr. PBMC;zelena).Celice Caco-2 so bile kultivirane, da se vzpostavi 3D epitelijska plast.Skale bar, 50 µm.Slike v spodnji vrstici: "Diferenciacija celic" prilagojena z dovoljenjem iz reference.2.Oxford University Press;Reproducirano z dovoljenjem Ref.5.NAS;»Host-Microbe Co-Culture« prilagojeno z dovoljenjem iz ref.3.NAS;»Modeliranje bolezni« prilagojeno z dovoljenjem reference.5.NAS.
Tako črevesje na čipu kot hibridni čipi so bili izdelani z uporabo replik PDMS, ki so bile z mehko litografijo1,44 izvlečene iz silicijevih kalupov in oblikovane s SU-8. Zasnova mikrokanalov v vsakem čipu je določena z upoštevanjem hidrodinamike, kot sta strižna napetost in hidrodinamični tlak1,4,12. Prvotna zasnova črevesja na čipu (razširjeni podatki, slika 1a), ki je obsegala dveh sočasno postavljenih vzporednih ravnih mikrokanalov, se je razvilo v kompleksno črevesje na čipu (razširjeni podatki, slika 1b), ki vključuje par ukrivljenih mikrokanalov za induciranje podaljšanega časa zadrževanja tekočine, nelinearnih vzorcev toka in večosne deformacije kultiviranih celic (sl. 2a–f). Izberemo lahko t-on-a-chips. Dokazali smo, da zapleteni Gut-Chip močno inducira tudi 3D morfogenezo v podobnem časovnem okviru s podobno stopnjo epitelijske rasti v primerjavi z originalnim Gut-Chip-om, ne glede na vrsto kultivirane celice. Zato so za induciranje 3D-morfogeneze linearne in kompleksne črevesne zasnove na čipu zamenljive. Replike PDMS, utrjene na silicijevem molu ds z vzorci SU-8 so po odstranitvi iz kalupa zagotovili negativne lastnosti (sl.2a). Za izdelavo črevesja na čipu je bila pripravljena zgornja plast PDMS zaporedno vezana na porozni film PDMS in nato poravnana s spodnjo plastjo PDMS z ireverzibilno vezavo z uporabo koronskega tretiralnika (sl. 2b–f). Za izdelavo hibridnih čipov so utrjene replike PDMS prilepili na steklena stekelca, da so ustvarili enokanalne mikrofluidne naprave, ki lahko sprejmejo modate Transwell vložki (slika 2h in razširjeni podatki, slika 2). Postopek lepljenja se izvede z obdelavo površin replike PDMS in stekla s kisikovo plazmo ali koronsko obdelavo. Po sterilizaciji mikroizdelane naprave, pritrjene na silikonsko cev, je bila nastavitev naprave pripravljena za izvedbo 3D morfogeneze črevesnega epitelija (slika 2g).
a, Shematska ponazoritev priprave delov PDMS iz silikonskih kalupov z vzorci SU-8. Neutrjeno raztopino PDMS smo vlili na silikonski kalup (levo), utrdili pri 60 °C (na sredini) in odstranili iz kalupa (desno). Izvlečeni PDMS smo razrezali na kose in očistili za nadaljnjo uporabo. b, Fotografija silikonskega kalupa, uporabljenega za pripravo zgornje plasti PDMS. c, Fotografija silikonskega kalupa d, ki se uporablja za izdelavo porozne membrane PDMS.d, Serija fotografij zgornjih in spodnjih komponent PDMS in sestavljene črevesne naprave na čipu.e, Shema poravnave zgornje, membranske in spodnje komponente PDMS. Vsaka plast je nepovratno povezana s plazemsko ali koronsko obdelavo.f, Shema izdelane naprave črevesje na čipu s prekrivajočim se zvitim mikrokanom nels in vakuumske komore.g, Nastavitev črevesja na čipu za mikrofluidno celično kulturo. Izdelano črevesje na čipu, sestavljeno s silikonsko cevjo in brizgo, je bilo postavljeno na pokrovno stekelce. Naprava za čip je bila nameščena na pokrov 150 mm petrijevke za obdelavo. Vezivo se uporablja za zapiranje silikonske cevke.h, Vizualni posnetki izdelave hibridnega čipa in 3D morfogeneza z uporabo hibridnih čipov. Transwellovi vložki, pripravljeni neodvisno za gojenje 2D enoslojev črevesnih epitelijskih celic, so bili vstavljeni v hibridni čip za induciranje črevesne 3D morfogeneze. Medij je perfundiran skozi mikrokanale pod celično plastjo, vzpostavljeno na Transwellovem vložku. Lestvica, 1 cm.h Ponatisnjeno z dovoljenjem reference.4.Elsevier.
V tem protokolu so bili kot epitelijski viri uporabljeni celična linija Caco-2 in intestinalni organoidi (slika 3a). Obe vrsti celic sta bili gojeni neodvisno (okvir 2 in okvir 5) in uporabljeni za zasejanje z ECM obloženih mikrokanalov črevesja na čipu ali vložkov Transwell. Ko so celice konfluentne (>95-odstotna pokritost v bučkah), rutinsko kultivirane celice Caco-2 (med prehodi) 10 in 50) v T-bučke poberemo za pripravo disociiranih celičnih suspenzij s tekočino za tripsinizacijo (polje 2). Človeški črevesni organoidi iz črevesnih biopsij ali kirurških resekcij so bili kultivirani v Matrigelovih kupolah v ploščah s 24 vdolbinicami za podporo strukturnemu mikrookolju. Medij, ki vsebuje bistvene morfogene (kot so Wnt, R-spondin in No ggin) in rastni faktorji, pripravljeni, kot je opisano v okvirju 3, so bili dodani vsak drugi dan, dokler organoidi niso zrasli na ~500 µm v premeru. Popolnoma zrasli organoidi se poberejo in disociirajo v posamezne celice za sejanje v črevesje ali Transwellove vstavke na čipu (okvir 5). Kot smo že poročali, ga je mogoče razlikovati glede na vrsto bolezni12,13 (npr. ulcerozni kolitis, Crohnova bolezen, kolorektalna bolezen). talnega raka ali običajnega darovalca), mesto lezije (npr. lezija v primerjavi z območjem brez poškodb) in lokacijo prebavil v traktu (npr. dvanajstnik, jejunum, ileum, slepo črevo, debelo črevo ali danka). V okvirju 5 ponujamo optimiziran protokol za gojenje organoidov debelega črevesa (koloidov), ki običajno zahtevajo višje koncentracije morfogenov kot organoidi tankega črevesa.
a, Delovni tok za indukcijo črevesne morfogeneze v črevesnem čipu. V tem protokolu se za prikaz 3D morfogeneze uporabljajo človeški intestinalni epitelij Caco-2 in intestinalni organoidi. Izolirane epitelne celice so bile zasejane v pripravljeni napravi črevesja na čipu (priprava čipa). Ko so celice posejane (zasajene) in pritrjene (pritrjene) na PDMS porozne membrane na dan 0 (D0), apikalni (AP) pretok se sproži in vzdržuje prva 2 dni (pretok, AP, D0-D2). Bazolateralni (BL) pretok se prav tako sproži skupaj s cikličnimi razteznimi gibi (raztezanje, pretok, AP in BL), ko se oblikuje popolna 2D monosloj. Intestinalna 3D morfogeneza se pojavi spontano po 5 dneh mikrofluidne kulture (morfogeneza, D 5). Slike faznega kontrasta prikazujejo reprezentativno morfologijo celic Caco-2 v vsakem eksperimentalnem koraku ali časovni točki (palični graf, 100 µm). Štirje shematski diagrami, ki ponazarjajo ustrezne kaskade črevesne morfogeneze (zgoraj desno). Črtkane puščice v shemi predstavljajo smer pretoka tekočine. b, slika SEM, ki prikazuje površinsko topologijo vzpostavljenega 3D epitelija Caco-2 (levo). Vstavljeno označevanje povečano območje (belo črtkano polje) prikazuje regenerirane mikrovile na 3D plasti Caco-2 (desno).c, vodoravni sprednji pogled na uveljavljene membrane Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rdeča) in neprekinjene čopičaste meje z oznako F-aktin (zeleno) in jedra (modro) Imunofluorescenčna konfokalna vizualizacija epitelijskih celic na črevesnih čipih. Puščice, ki kažejo na srednjo shemo navedite lokacijo žariščne ravnine za vsak konfokalni pogled.d, Časovni potek morfoloških sprememb v organoidih, gojenih na čipu, pridobljenem s fazno kontrastno mikroskopijo 3., 7., 9., 11. in 13. dan. Vložek (zgoraj desno) prikazuje veliko povečavo predložene slike.e, DIC fotomikrografija organoidnega 3D epitelija, vzpostavljenega v črevesju na rezini, posneti 7. dan.f, Čez postavljene imunofluorescenčne slike, ki prikazujejo markerje za izvorne celice (LGR5;škrlatna), vrčaste celice (MUC2; zelena), F-aktin (siva) in jedra (cian), ki so 3 dni rasli na črevesnih čipih (levo) oziroma 13-dnevni (srednji) organoidi na epitelijski plasti. Glejte tudi sliko 3 z razširjenimi podatki, ki poudarja signalizacijo LGR5 brez signalizacije MUC2. Fluorescenčne slike, ki prikazujejo epitelno mikrostrukturo (desno) 3D organa oidni epitelij, vzpostavljen v črevesju na čipu z obarvanjem plazemske membrane z barvilom CellMask (desno) na 13. dan kulture. Merilna vrstica je 50 μm, razen če je navedeno drugače. b Ponatisnjeno z dovoljenjem reference.2.Oxford University Press;c Prilagojeno z dovoljenjem Reference.2.Oxford University Press;e in f prilagojena z dovoljenjem s sklicevanjem.12 Pod licenco Creative Commons CC BY 4.0.
V črevesju na čipu je treba spremeniti hidrofobno površino porozne membrane PDMS za uspešno prevleko ECM. V tem protokolu uporabljamo dve različni metodi za spreminjanje hidrofobnosti membran PDMS. Za gojenje celic Caco-2 je samo površinska aktivacija z obdelavo z UV/ozonom zadostovala za zmanjšanje hidrofobnosti površine PDMS, prekrivanje ECM in pritrditev celic Caco-2 na membrano PDMS Vendar pa mikrofluidna kultura organoidnega epitelija zahteva kemično temeljeno površinsko funkcionalizacijo, da se doseže učinkovito odlaganje proteinov ECM z zaporednim nanosom polietilenimina (PEI) in glutaraldehida na mikrokanale PDMS. Po površinski modifikaciji so bili proteini ECM deponirani, da pokrijejo funkcionalizirano površino PDMS in nato vneseni v izolirani organoidni epitelij. Ko so celice pritrjene, se začne mikrofluidna celična kultura. s perfuzijo samo medija v zgornji mikrokanal, dokler celice ne tvorijo popolne enoplastne plasti, medtem ko spodnji mikrokanal vzdržuje statične pogoje. Ta optimizirana metoda za površinsko aktivacijo in prevleko ECM omogoča pritrditev organoidnega epitelija za induciranje 3D morfogeneze na površini PDMS.
Transwell kulture zahtevajo tudi ECM prevleko pred setvijo celic;vendar kulture Transwell ne zahtevajo zapletenih korakov predobdelave za aktiviranje površine poroznih vložkov. Za gojenje celic Caco-2 na vložkih Transwell ECM prevleka na poroznih vložkih pospeši pritrditev disociiranih celic Caco-2 (<1 ura) in tvorbo tesne spojne pregrade (<1-2 dni). Za gojenje organoidov na vložkih Transwell se izolirani organoidi zasejejo na vložke, prevlečene z ECM, pritrjene na površino membrane. (<3 h) in vzdrževati, dokler organoidi ne tvorijo popolne enoplastne plasti s celovitostjo pregrade. Transwell kulture se izvajajo v ploščah s 24 vdolbinicami brez uporabe hibridnih čipov.
In vitro 3D morfogenezo je mogoče sprožiti z uporabo pretoka tekočine na bazolateralnem vidiku vzpostavljene epitelijske plasti. V črevesju na čipu se je epitelijska morfogeneza začela, ko je bil medij perfundiran v zgornje in spodnje mikrokanale (slika 3a). Kot je bilo že opisano, je kritično uvesti pretok tekočine v spodnjem (bazolateralnem) predelu za neprekinjeno odstranjevanje usmerjenih izločenih zaviralcev morfogena Da zagotovimo dovolj hranilnih snovi in ​​seruma celicam, vezanim na porozne membrane, in ustvarimo luminalni strižni stres, običajno uporabimo dvojni tok v črevesju na čipu. Pri hibridnih čipih so bili Transwell vložki, ki vsebujejo epitelne monosloje, vstavljeni v hibridne čipe. Nato je bil medij nanesen pod bazolateralno stran poroznega Transwell vložka skozi mikrokanal. Pojavila se je črevesna morfogeneza 3 -5 dni po začetku bazolateralnega toka v obeh kulturnih platformah.
Morfološke značilnosti mikroinženirskih 3D epitelijskih plasti je mogoče analizirati z uporabo različnih načinov slikanja, vključno s fazno kontrastno mikroskopijo, diferencialno interferenčno kontrastno (DIC) mikroskopijo, SEM ali imunofluorescenčno konfokalno mikroskopijo (sliki 3 in 4). Fazno kontrastno ali DIC slikanje je mogoče enostavno izvesti kadar koli med kulturo za spremljanje oblike in štrline 3D epitelijskih plasti.D zaradi optične prosojnosti PDMS in poliestrskih filmov lahko platforma gut-on-a-chip in hibridni čip zagotovita slikanje in situ v realnem času brez potrebe po rezanju ali razstavljanju naprave. Pri izvajanju imunofluorescenčnega slikanja (slike 1, 3c, f in 4b, c) so celice običajno fiksirane s 4 % (m/vol) paraformaldehida ( PFA), ki mu sledita Triton X-100 in 2 % (wt/vol)) goveji serumski albumin (BSA), po vrstnem redu. Odvisno od tipa celice se lahko uporabijo različni fiksativi, sredstva za povečanje permeabilnosti in blokirna sredstva. Primarna protitelesa, ki ciljajo na označevalce celic ali regij, odvisnih od linije, se uporabljajo za označevanje celic, imobiliziranih in situ na čipu, ki jim sledijo sekundarna protitelesa skupaj z barvilom proti madežem, ki cilja na katero koli jedro nas (npr. 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ali F-aktin (npr. fluorescentno označen faloidin). Slikanje v živo na podlagi fluorescence se lahko izvede tudi in situ za odkrivanje proizvodnje sluzi (sl.1, »Celična diferenciacija« in »Črevesna fiziologija«), naključna kolonizacija mikrobnih celic (slika 1, »Sokultura gostitelja in mikroba«), rekrutacija imunskih celic (slika 1, »Modeliranje bolezni«) ali obrisi 3D epitelijske morfologije (sl. 3c,f in 4b,c). Pri spreminjanju črevesja na čip za ločevanje zgornjega sloja od spodnjega mikrokanalnega sloja, kot je opisano v ref. Kot je prikazano na sliki 2, je mogoče 3D epitelno morfologijo in mikrovile na meji apikalne ščetke vizualizirati s SEM (sl. 3b). Ekspresijo markerjev diferenciacije je mogoče oceniti z izvajanjem kvantitativnega PCR5 ali sekvenciranja enocelične RNA. V tem primeru rastejo 3D plasti epitelijskih celic n v črevesnih čipih ali hibridnih čipih se pobere s tripsinizacijo in nato uporabi za molekularno ali genetsko analizo.
a, Potek dela za indukcijo črevesne morfogeneze v hibridnem čipu. Caco-2 in intestinalni organoidi so uporabljeni v tem protokolu za prikaz 3D morfogeneze v platformi hibridnega čipa. Disociirane epitelne celice so bile zasejane v pripravljene vložke Transwell (TW prep; glejte spodnjo sliko). Ko so bile celice zasejane (zasajene) in pritrjene na poliestrske membrane v Transwell vložki so vse celice gojili v statičnih pogojih (kultura TW). Po 7 dneh je bil en sam Transwell vložek, ki je vseboval 2D monosloj epitelijskih celic, integriran v hibridni čip za uvedbo bazolateralnega toka (Flow, BL), kar je na koncu vodilo do generiranja 3D epitelijske plasti (morfogeneza). Mikrografije faznega kontrasta, ki prikazujejo morfološke značilnosti epitelijskih celic človeških organov, pridobljenih iz normalno donorsko (linija C103) naraščajoče debelo črevo v vsakem eksperimentalnem koraku ali časovni točki. Sheme v zgornjih plasteh ponazarjajo eksperimentalno konfiguracijo za vsak korak.b, hibridni čipi (leva shema) lahko vodijo do 3D morfogeneze organoidnih epitelijskih celic s pogledi konfokalne mikroskopije od zgoraj navzdol, posnetimi na različnih položajih Z (zgoraj, na sredini in spodaj);glejte desno shemo in ustrezne pikčaste črte).je pokazal očitne morfološke značilnosti. F-aktin (cian), jedro (sivo).c, Fluorescenčne konfokalne mikrografije (3D kotni pogled) epitelijskih celic, pridobljenih iz organoida, gojenih v statičnem Transwellu (TW; vložek znotraj belega črtkanega polja) v primerjavi s hibridnim čipom (največji polni posnetek), ki primerja morfologijo 2D in 3D. Par 2D navpičnih navzkrižnih izrezani pogledi (vstavljen v zgornjem desnem kotu; »XZ«) prikazujejo tudi 2D in 3D značilnosti. Merilna vrstica, 100 µm.c Ponatisnjeno z dovoljenjem reference.4.Elsevier.
Kontrole je mogoče pripraviti s kultiviranjem istih celic (Caco-2 ali intestinalnih organoidnih epitelijskih celic) v dvodimenzionalne monosloje pod običajnimi statičnimi pogoji kulture. Predvsem lahko pride do izčrpanja hranil zaradi omejene prostorninske zmogljivosti mikrokanalov (tj. ~4 µL v zgornjem kanalu pri prvotni zasnovi črevesnega čipa). Zato je mogoče tudi epitelno morfologijo pred in po aplikaciji bazolateralnega toka oceniti. v primerjavi.
Postopek mehke litografije je treba izvajati v čisti sobi. Za vsako plast na čipu (zgornji in spodnji sloj ter membrane) in hibridne čipe so bile uporabljene različne fotomaske, ki so bile izdelane na ločenih silicijevih rezinah, ker so bile višine mikrokanalov različne. Ciljne višine zgornjih in spodnjih mikrokanalov črevesja na čipu so 500 µm oziroma 200 µm. Cilj kanala višina hibridnega čipa je 200 µm.
Postavite 3-palčno silikonsko rezino v posodo z acetonom. Nežno vrtite ploščo 30 sekund, nato posušite rezino na zraku. Prenesite rezino na ploščo z IPA, nato pa ploščo vrtite 30 sekund, da jo očistite.
Po želji lahko uporabite raztopino piranha (mešanica vodikovega peroksida in koncentrirane žveplove kisline, 1:3 (vol/vol)), da povečate odstranitev organskih ostankov s površine silicijeve rezine.
Raztopina Piranha je izjemno jedka in proizvaja toploto. Potrebni so dodatni varnostni ukrepi. Za odstranjevanje odpadkov pustite, da se raztopina ohladi in prenesite v čisto, suho posodo za odpadke. Uporabite sekundarne posode in pravilno označite posode za odpadke. Za podrobnejše postopke upoštevajte varnostne smernice obrata.
Oblate dehidriramo tako, da jih postavimo na 200 °C segreto ploščo za 10 minut. Po dehidraciji smo oblate petkrat stresli na zrak, da se ohladijo.
Na sredino očiščene silikonske rezine vlijemo ~10 g fotorezista SU-8 2100. S pinceto fotorezist enakomerno razmažemo po rezini. Občasno položimo rezist na 65°C segreto ploščo, da se fotorezist manj lepi in lažje razmažemo. Oblata ne polagamo direktno na grelno ploščo.
SU-8 je bil enakomerno porazdeljen na rezino s prevleko z vrtenjem. Programirajte prihajajočo rotacijo SU-8 za 5–10 s, da se širi pri 500 vrt/min pri pospešku 100 vrt/min. Nastavite glavno vrtenje za vzorčenje debeline 200 µm pri 1500 vrt/min ali dosežete debelino 250 µm (naredite višino 500 µm). za zgornjo plast črevesja na čipu; glejte “Kritični koraki” spodaj) nastavite na pospešek 300 vrt/min 30 sekund pri 1200 vrt/min.
Glavno hitrost ožemanja je mogoče prilagoditi glede na ciljno debelino vzorca SU-8 na silicijevi rezini.
Za izdelavo vzorcev SU-8 z višino 500 µm za zgornjo plast črevesja na čipu so se koraki centrifugiranja in mehkega pečenja te škatle (koraka 7 in 8) zaporedno ponovili (glejte korak 9), da so nastali dve plasti 250 µm debele plasti SU-8, ki jo je mogoče v 12. koraku te škatle nanesti v plasti in združiti z izpostavljenostjo UV, tako da je nastala plast 500 µm visoko.
Mehko spečemo oblate s premazom SU-8 tako, da oblate previdno postavimo na vročo ploščo pri 65 °C za 5 minut, nato preklopimo nastavitev na 95 °C in inkubiramo dodatnih 40 minut.
Če želite doseči 500 μm višine vzorca SU-8 v zgornjem mikrokanalu, ponovite koraka 7 in 8, da ustvarite dve 250 μm debeli plasti SU-8.
Z uporabo UV Mask Alignerja izvedite preskus žarnice v skladu z navodili proizvajalca, da izračunate čas izpostavljenosti rezine. (čas izpostavljenosti, ms) = (doza izpostavljenosti, mJ/cm2)/(moč žarnice, mW/cm2).
Po določitvi časa osvetlitve postavite fotomasko na nosilec maske poravnalnika UV maske in jo položite na SU-8 premazano rezino.
Natisnjeno površino fotomaske položite neposredno na stran silicijeve rezine, prevlečeno s SU-8, da zmanjšate UV-disperzijo.
Izpostavite rezino s premazom SU-8 in fotomasko navpično 260 mJ/cm2 UV svetlobe za vnaprej določen čas osvetlitve (glejte 10. korak tega okvirja).
Po izpostavitvi UV so bile silicijeve rezine, prevlečene s SU-8, pečene 5 minut pri 65 °C in 15 minut pri 95 °C na vsaki grelni plošči, da so bili izdelani vzorci z višino 200 µm. Podaljšajte čas po pečenju pri 95 °C na 30 minut, da boste izdelali vzorce z višino 500 µm.
Razvijalec se vlije v stekleno posodo in pečen oblat položi v posodo. Količina razvijalca SU-8 se lahko razlikuje glede na velikost steklene plošče. Prepričajte se, da uporabite dovolj razvijalca SU-8, da v celoti odstranite neosvetljeni SU-8. Na primer, ko uporabljate stekleno posodo premera 150 mm in prostornino 1 L, uporabite ~300 ml razvijalca SU-8. Kalup razvijajte 25 minut z občasnim nežnim vrtenje.
Razvit kalup sperite s ~10 ml svežega razvijalca, ki mu sledi IPA, tako da raztopino razpršite s pipeto.
Postavite rezino v plazemski čistilec in jo za 1,5 minute izpostavite kisikovi plazmi (atmosferski plin, ciljni tlak 1 × 10−5 Torr, moč 125 W).
Postavite rezino v vakuumski eksikator s stekelcem v notranjosti. Oblatine in stekelca lahko postavite eno poleg druge. Če je vakuumski eksikator razdeljen na več plasti s ploščo, postavite stekelca v spodnjo komoro, rezine pa v zgornjo komoro. Na kozarec nakapajte 100 μL raztopine trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana potisnite in uporabite vakuum za silanizacijo.
Vialo z zamrznjenimi celicami Caco-2 odtajajte v vodni kopeli pri 37 °C, nato pa odmrznjene celice prenesite v bučko T75, ki vsebuje 15 ml na 37 °C predhodno ogretega medija Caco-2.
Za prehajanje celic Caco-2 pri ~90 % konfluenci najprej segrejte medij Caco-2, PBS in 0,25 % tripsina/1 mM EDTA v vodni kopeli pri 37 °C.
Gojišče aspirirajte z vakuumsko aspiracijo. Celice dvakrat sperite s 5 ml toplega PBS, tako da ponovite vakuumsko aspiracijo in dodate svež PBS.