Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Evolucija mikrobnih parazitov vključuje nasprotje med naravno selekcijo, ki povzroči, da se paraziti izboljšajo, in genetskim odnašanjem, ki povzroči, da paraziti izgubijo gene in kopičijo škodljive mutacije.Tukaj, da bi razumeli, kako se to nasprotovanje pojavi na lestvici ene same makromolekule, opisujemo krio-EM strukturo ribosoma Encephalitozoon cuniculi, evkariontskega organizma z enim najmanjših genomov v naravi.Ekstremno zmanjšanje rRNA v ribosomih E. cuniculi spremljajo strukturne spremembe brez primere, kot je razvoj prej neznanih spojenih povezovalnih rRNA in rRNA brez izboklin.Poleg tega je ribosom E. cuniculi preživel izgubo fragmentov in proteinov rRNA z razvojem sposobnosti uporabe majhnih molekul kot strukturnega posnemanja degradiranih fragmentov in proteinov rRNA.Na splošno smo pokazali, da imajo molekularne strukture, za katere se je dolgo mislilo, da so zmanjšane, degenerirane in podvržene izčrpavajočim mutacijam, številne kompenzacijske mehanizme, ki jih ohranjajo aktivne kljub ekstremnim molekularnim kontrakcijam.
Ker ima večina skupin mikrobnih parazitov edinstvena molekularna orodja za izkoriščanje svojih gostiteljev, moramo pogosto razviti različne terapevtike za različne skupine parazitov1,2.Vendar novi dokazi kažejo, da so nekateri vidiki evolucije parazitov konvergentni in v veliki meri predvidljivi, kar kaže na potencialno osnovo za široke terapevtske posege pri mikrobnih parazitih 3,4,5,6,7,8,9.
Prejšnje delo je identificiralo skupen evolucijski trend pri mikrobnih parazitih, imenovan zmanjšanje genoma ali razpad genoma 10,11,12,13.Sedanje raziskave kažejo, da ko mikroorganizmi opustijo svoj prosti način življenja in postanejo znotrajcelični paraziti (ali endosimbionti), so njihovi genomi v milijonih let podvrženi počasnim, a osupljivim metamorfozam9,11.V procesu, znanem kot razpad genoma, mikrobni paraziti kopičijo škodljive mutacije, ki mnoge prej pomembne gene spremenijo v psevdogene, kar vodi v postopno izgubo genov in propad mutacije14,15.Ta kolaps lahko uniči do 95 % genov v najstarejših znotrajceličnih organizmih v primerjavi s sorodnimi prostoživečimi vrstami.Tako je evolucija znotrajceličnih parazitov vlečenje vrvi med dvema nasprotujočima si silama: darvinistično naravno selekcijo, ki vodi k izboljšanju parazitov, in propadom genoma, ki vrže parazite v pozabo.Kako je parazitu uspelo izstopiti iz tega vlečenja vrvi in ​​ohraniti aktivnost svoje molekularne strukture, ostaja nejasno.
Čeprav mehanizem razpadanja genoma ni popolnoma razumljen, se zdi, da se pojavlja predvsem zaradi pogostega genetskega odmika.Ker paraziti živijo v majhnih, nespolnih in genetsko omejenih populacijah, ne morejo učinkovito odpraviti škodljivih mutacij, ki se včasih pojavijo med replikacijo DNA.To vodi do nepopravljivega kopičenja škodljivih mutacij in zmanjšanja genoma parazita.Zaradi tega parazit ne izgubi samo genov, ki niso več potrebni za njegovo preživetje v znotrajceličnem okolju.Nezmožnost populacij parazitov, da učinkovito odstranijo občasne škodljive mutacije, povzroči, da se te mutacije kopičijo v celotnem genomu, vključno z njihovimi najpomembnejšimi geni.
Velik del našega trenutnega razumevanja zmanjšanja genoma temelji izključno na primerjavi zaporedij genoma, z manj pozornosti na spremembe v dejanskih molekulah, ki opravljajo gospodinjske funkcije in služijo kot potencialne tarče zdravil.Primerjalne študije so pokazale, da se zdi, da breme škodljivih znotrajceličnih mikrobnih mutacij povzroča nagnjenost k napačnemu zvijanju in združevanju beljakovin in nukleinskih kislin, zaradi česar so bolj odvisni od nadzornika in preobčutljivi na toploto19,20,21,22,23.Poleg tega so različni paraziti – neodvisna evolucija, včasih ločena za kar 2,5 milijarde let – doživeli podobno izgubo centrov za nadzor kakovosti v svoji sintezi beljakovin5,6 in mehanizmih popravljanja DNK24.Vendar pa je malo znanega o vplivu znotrajceličnega načina življenja na vse druge lastnosti celičnih makromolekul, vključno z molekularno prilagoditvijo na naraščajoče breme škodljivih mutacij.
V tem delu smo z namenom boljšega razumevanja evolucije proteinov in nukleinskih kislin intracelularnih mikroorganizmov ugotavljali strukturo ribosomov znotrajceličnega parazita Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi je glivi podoben organizem, ki spada v skupino parazitskih mikrosporij, ki imajo nenavadno majhne evkariontske genome in se zato uporabljajo kot modelni organizmi za preučevanje razpada genoma 25, 26, 27, 28, 29, 30.Nedavno je bila določena krio-EM struktura ribosomov za zmerno zmanjšane genome Microsporidia, Paranosema locustae in Vairimorpha necatrix 31, 32 (~ 3,2 Mb genom).Te strukture kažejo, da se nekaj izgube pomnoževanja rRNA kompenzira z razvojem novih stikov med sosednjimi ribosomskimi proteini ali pridobitvijo novih ribosomskih proteinov msL131,32.Vrste Encephalitozoon (genom ~2,5 milijona bp), skupaj z njihovim najbližjim sorodnikom Ordospora, kažejo končno stopnjo zmanjšanja genoma pri evkariontih – imajo manj kot 2000 genov, ki kodirajo beljakovine, in pričakuje se, da njihovi ribosomi niso le brez ekspanzijskih fragmentov rRNA (fragmentov rRNA, ki razlikujejo evkariontske ribosome od bakterijskih ribosomov), temveč tudi štiri rebra. osomskih proteinov zaradi pomanjkanja homologov v genomu E. cuniculi 26,27,28.Zato smo zaključili, da lahko ribosom E. cuniculi razkrije prej neznane strategije za molekularno prilagajanje razpadu genoma.
Naša cryo-EM struktura predstavlja najmanjši evkariontski citoplazemski ribosom, ki ga je treba karakterizirati, in zagotavlja vpogled v to, kako končna stopnja zmanjšanja genoma vpliva na strukturo, sestavljanje in razvoj molekularnega stroja, ki je sestavni del celice.Ugotovili smo, da ribosom E. cuniculi krši veliko splošno ohranjenih principov zvijanja RNA in sestavljanja ribosomov, in odkrili nov, prej neznan ribosomski protein.Precej nepričakovano pokažemo, da so mikrosporidijski ribosomi razvili sposobnost vezave majhnih molekul in domnevamo, da okrnitve v rRNA in proteinih sprožijo evolucijske inovacije, ki lahko na koncu ribosomu podelijo uporabne lastnosti.
Da bi izboljšali naše razumevanje evolucije beljakovin in nukleinskih kislin v znotrajceličnih organizmih, smo se odločili izolirati spore E. cuniculi iz kultur okuženih celic sesalcev, da bi očistili njihove ribosome in določili strukturo teh ribosomov.Težko je pridobiti večje število parazitskih mikrosporij, ker mikrosporij ni mogoče gojiti na hranilnem mediju.Namesto tega rastejo in se razmnožujejo le znotraj gostiteljske celice.Zato smo za pridobitev biomase E. cuniculi za čiščenje ribosomov okužili celično linijo ledvic sesalcev RK13 s sporami E. cuniculi in te okužene celice gojili več tednov, da smo E. cuniculi lahko rasli in se razmnoževali.Z uporabo monosloja okužene celice velikosti približno pol kvadratnega metra smo lahko očistili približno 300 mg spor Microsporidia in jih uporabili za izolacijo ribosomov.Nato smo prečiščene spore razbili s steklenimi kroglicami in izolirali surove ribosome z uporabo postopnega polietilen glikolnega frakcioniranja lizatov.To nam je omogočilo pridobitev približno 300 µg surovih ribosomov E. cuniculi za strukturno analizo.
Nato smo zbrali cryo-EM slike z uporabo dobljenih vzorcev ribosomov in te slike obdelali z uporabo mask, ki ustrezajo veliki ribosomski podenoti, majhni glavi podenote in majhni podenoti.Med tem procesom smo zbrali slike približno 108.000 ribosomskih delcev in izračunali krio-EM slike z ločljivostjo 2,7 Å (dodatne slike 1-3).Nato smo uporabili slike cryoEM za modeliranje rRNA, ribosomskega proteina in faktorja hibernacije Mdf1, povezanega z ribosomi E. cuniculi (sl. 1a, b).
a Struktura ribosoma E. cuniculi v kompleksu s faktorjem hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP).b Zemljevid faktorja hibernacije Mdf1, povezanega z ribosomom E. cuniculi.c Zemljevid sekundarne strukture, ki primerja obnovljeno rRNA v mikrosporidijskih vrstah z znanimi ribosomskimi strukturami.Plošče prikazujejo lokacijo pomnoženih fragmentov rRNA (ES) in ribosomskih aktivnih mest, vključno z mestom dekodiranja (DC), zanko sarcicina (SRL) in centrom peptidil transferaze (PTC).d Elektronska gostota, ki ustreza centru peptidil transferaze ribosoma E. cuniculi, nakazuje, da ima to katalitično mesto enako strukturo pri parazitu E. cuniculi in njegovih gostiteljih, vključno s H. sapiens.e, f Ustrezna elektronska gostota dekodirnega centra (e) in shematska struktura dekodirnega centra (f) kažeta, da ima E. cuniculi ostanke U1491 namesto A1491 (številčenje E. coli) v mnogih drugih evkariontih.Ta sprememba nakazuje, da je lahko E. cuniculi občutljiva na antibiotike, ki ciljajo na to aktivno mesto.
V nasprotju s predhodno ugotovljenimi strukturami ribosomov V. necatrix in P. locustae (obe strukturi predstavljata isto družino mikrosporij Nosematidae in sta si med seboj zelo podobni), so 31,32 ribosomi E. cuniculi podvrženi številnim procesom rRNA in fragmentacije proteinov.Nadaljnja denaturacija (dodatne slike 4-6).V rRNA so najbolj presenetljive spremembe vključevale popolno izgubo pomnoženega fragmenta 25S rRNA ES12L in delno degeneracijo vijačnic h39, h41 in H18 (slika 1c, dopolnilna slika 4).Med ribosomskimi proteini so najbolj presenetljive spremembe vključevale popolno izgubo proteina eS30 in skrajšanje proteinov eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 in eS7 (dodatne slike 4, 5).
Tako se ekstremno zmanjšanje genomov vrst Encephalotozoon/Ordospora odraža v njihovi strukturi ribosomov: ribosomi E. cuniculi doživljajo najbolj dramatično izgubo vsebnosti beljakovin v evkariontskih citoplazmatskih ribosomih, ki so predmet strukturne karakterizacije, in nimajo niti tistih fragmentov rRNA in proteinov, ki so široko ohranjeni ne samo v evkariontih, ampak tudi na treh področjih življenja.Struktura ribosoma E. cuniculi zagotavlja prvi molekularni model za te spremembe in razkriva evolucijske dogodke, ki so jih spregledali tako primerjalna genomika kot študije znotrajcelične biomolekularne strukture (dodatna slika 7).Spodaj opisujemo vsakega od teh dogodkov skupaj z njihovim verjetnim evolucijskim izvorom in njihovim potencialnim vplivom na delovanje ribosomov.
Nato smo ugotovili, da imajo ribosomi E. cuniculi poleg velikih skrajšanj rRNA na enem od svojih aktivnih mest tudi variacije rRNA.Čeprav ima center za peptidil transferazo ribosoma E. cuniculi enako strukturo kot drugi evkariontski ribosomi (slika 1d), se center za dekodiranje razlikuje zaradi variacije zaporedja pri nukleotidu 1491 (številčenje E. coli, slika 1e, f).Ta ugotovitev je pomembna, ker mesto dekodiranja evkariontskih ribosomov običajno vsebuje ostanke G1408 in A1491 v primerjavi z ostanki bakterijskega tipa A1408 in G1491.Ta variacija je osnova za različno občutljivost bakterijskih in evkariontskih ribosomov na družino aminoglikozidov ribosomskih antibiotikov in drugih majhnih molekul, ki ciljajo na mesto dekodiranja.Na mestu dekodiranja ribosoma E. cuniculi je bil ostanek A1491 nadomeščen z U1491, kar bi lahko ustvarilo edinstven vezni vmesnik za majhne molekule, ki ciljajo na to aktivno mesto.Ista različica A14901 je prisotna tudi v drugih mikrosporidijah, kot sta P. locustae in V. necatrix, kar nakazuje, da je razširjena med vrstami mikrosporij (slika 1f).
Ker so bili naši vzorci ribosomov E. cuniculi izolirani iz presnovno neaktivnih spor, smo testirali krio-EM zemljevid E. cuniculi za predhodno opisano vezavo ribosomov v pogojih stresa ali stradanja.Hibernacijski faktorji 31,32,36,37, 38. Ujemali smo predhodno ugotovljeno strukturo hibernirajočega ribosoma s cryo-EM zemljevidom ribosoma E. cuniculi.Za priklop smo uporabili ribosome S. cerevisiae v kompleksu s faktorjem hibernacije Stm138, ribosome kobilice v kompleksu s faktorjem Lso232 in ribosome V. necatrix v kompleksu s faktorjema Mdf1 in Mdf231.Hkrati smo ugotovili gostoto krio-EM, ki ustreza faktorju mirovanja Mdf1.Podobno kot se Mdf1 veže na ribosom V. necatrix, se tudi Mdf1 veže na ribosom E. cuniculi, kjer blokira mesto E ribosoma, kar morda pomaga narediti ribosome na voljo, ko postanejo spore parazita presnovno neaktivne po telesni inaktivaciji (slika 2).).
Mdf1 blokira mesto E ribosoma, kar se zdi, da pomaga inaktivirati ribosome, ko spore parazitov postanejo presnovno neaktivne.V strukturi ribosoma E. cuniculi smo ugotovili, da Mdf1 tvori prej neznan stik s steblom ribosoma L1, delom ribosoma, ki olajša sproščanje deacilirane tRNA iz ribosoma med sintezo beljakovin.Ti stiki kažejo, da se Mdf1 loči od ribosoma z uporabo istega mehanizma kot deacetilirana tRNA, kar je možna razlaga, kako ribosom odstrani Mdf1, da ponovno aktivira sintezo beljakovin.
Vendar pa je naša struktura razkrila neznan stik med Mdf1 in nogo ribosoma L1 (del ribosoma, ki pomaga sprostiti deacilirano tRNA iz ribosoma med sintezo beljakovin).Zlasti Mdf1 uporablja iste kontakte kot segment komolca deacilirane molekule tRNA (slika 2).To predhodno neznano molekularno modeliranje je pokazalo, da Mdf1 disociira od ribosoma z uporabo istega mehanizma kot deacetilirana tRNA, kar pojasnjuje, kako ribosom odstrani ta faktor hibernacije, da ponovno aktivira sintezo beljakovin.
Pri konstruiranju modela rRNA smo ugotovili, da ima ribosom E. cuniculi nenormalno zvite fragmente rRNA, ki smo jih poimenovali zlita rRNA (slika 3).V ribosomih, ki obsegajo tri domene življenja, se rRNA zloži v strukture, v katerih se večina baz rRNA bodisi spari bazne pare in zloži med seboj ali sodeluje z ribosomskimi proteini38,39,40.Vendar pa se zdi, da v ribosomih E. cuniculi rRNA kršijo to načelo zvijanja s pretvorbo nekaterih svojih vijačnic v nezvite regije rRNA.
Struktura vijačnice H18 25S rRNA pri S. cerevisiae, V. necatrix in E. cuniculi.Običajno se v ribosomih, ki zajemajo tri življenjske domene, ta povezovalec zvije v vijačnico RNK, ki vsebuje 24 do 34 ostankov.Nasprotno pa se pri Microsporidia ta povezovalec rRNA postopoma zmanjša na dva enoverižna povezovalca, bogata z uridinom, ki vsebujeta samo 12 ostankov.Večina teh ostankov je izpostavljena topilom.Slika prikazuje, da se zdi, da parazitske mikrosporije kršijo splošna načela zvijanja rRNA, kjer so baze rRNA običajno povezane z drugimi bazami ali vključene v interakcije rRNA-protein.Pri mikrosporiji se nekateri fragmenti rRNA neugodno prepognejo, pri čemer prejšnja vijačnica rRNA postane enoverižni fragment, podaljšan skoraj v ravni črti.Prisotnost teh nenavadnih regij omogoča rRNA mikrosporije, da veže oddaljene fragmente rRNA z minimalnim številom baz RNA.
Najbolj osupljiv primer tega evolucijskega prehoda lahko opazimo v vijačnici H18 25S rRNA (slika 3).Pri vrstah od E. coli do človeka baze te vijačnice rRNA vsebujejo 24-32 nukleotidov, ki tvorijo rahlo nepravilno vijačnico.V predhodno identificiranih ribosomskih strukturah iz V. necatrix in P. locustae,31,32 so baze vijačnice H18 delno odvite, vendar je združevanje nukleotidnih baz ohranjeno.Vendar pa v E. cuniculi ta fragment rRNA postane najkrajša povezovalca 228UUUGU232 in 301UUUUUUUUU307.Za razliko od tipičnih fragmentov rRNA se ti povezovalci, bogati z uridinom, ne zvijajo ali vzpostavljajo obsežnega stika z ribosomskimi proteini.Namesto tega sprejmejo topilo odprte in popolnoma razvite strukture, v katerih so verige rRNA podaljšane skoraj naravnost.Ta raztegnjena konformacija pojasnjuje, kako E. cuniculi uporablja samo 12 baz RNA, da zapolni vrzel 33 Å med spiralama rRNA H16 in H18, medtem ko druge vrste potrebujejo vsaj dvakrat toliko baz rRNA, da zapolnijo vrzel.
Tako lahko dokažemo, da so z energijsko neugodnim zvijanjem parazitske mikrosporidije razvile strategijo za krčenje celo tistih segmentov rRNA, ki ostajajo na splošno ohranjeni med vrstami v treh področjih življenja.Očitno lahko E. cuniculi s kopičenjem mutacij, ki transformirajo vijačnice rRNA v kratke poli-U povezovalce, tvori nenavadne fragmente rRNA, ki vsebujejo čim manj nukleotidov za ligacijo distalnih fragmentov rRNA.To pomaga razložiti, kako je mikrosporija dosegla dramatično zmanjšanje svoje osnovne molekularne strukture, ne da bi pri tem izgubila svojo strukturno in funkcionalno celovitost.
Druga nenavadna značilnost rRNA E. cuniculi je videz rRNA brez zadebelitev (slika 4).Izbokline so nukleotidi brez baznih parov, ki se izvijejo iz vijačnice RNK, namesto da bi se skrili vanjo.Večina izboklin rRNA deluje kot molekularna lepila, ki pomagajo vezati sosednje ribosomske proteine ​​ali druge fragmente rRNA.Nekatere izbokline delujejo kot tečaji, kar omogoča, da se vijačnica rRNA optimalno upogiba in zloži za produktivno sintezo beljakovin 41 .
a Protruzija rRNA (številčenje S. cerevisiae) ni v strukturi ribosoma E. cuniculi, vendar je prisotna v večini drugih evkariontov b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens in E. cuniculi notranji ribosomi.parazitom manjka veliko starodavnih, zelo ohranjenih izboklin rRNA.Te odebelitve stabilizirajo strukturo ribosoma;zato njihova odsotnost v mikrosporiji kaže na zmanjšano stabilnost zvijanja rRNA v parazitih mikrosporije.Primerjava s stebli P (stebla L7/L12 pri bakterijah) kaže, da izguba izboklin rRNA včasih sovpada s pojavom novih izboklin poleg izgubljenih izboklin.Vijačnica H42 v 23S/28S rRNA ima starodavno izboklino (U1206 pri Saccharomyces cerevisiae), za katero se ocenjuje, da je stara vsaj 3,5 milijarde let zaradi svoje zaščite na treh področjih življenja.Pri mikrosporiji se ta izboklina odpravi.Vendar se je ob izgubljeni izboklini pojavila nova izboklina (A1306 pri E. cuniculi).
Presenetljivo smo ugotovili, da ribosomom E. cuniculi manjka večina izboklin rRNA, ki jih najdemo pri drugih vrstah, vključno z več kot 30 izboklinami, ohranjenimi pri drugih evkariontih (slika 4a).Ta izguba odpravi številne stike med ribosomskimi podenotami in sosednjimi vijačnicami rRNA, včasih ustvari velike votle praznine znotraj ribosoma, zaradi česar je ribosom E. cuniculi bolj porozen v primerjavi z bolj tradicionalnimi ribosomi (slika 4b).Predvsem smo ugotovili, da se je večina teh izboklin izgubila tudi v predhodno identificiranih ribosomskih strukturah V. necatrix in P. locustae, ki so jih prejšnje strukturne analize spregledale31,32.
Včasih izgubo izboklin rRNA spremlja razvoj novih izboklin poleg izgubljene izbokline.Na primer, ribosomsko P-deblo vsebuje izboklino U1208 (v Saccharomyces cerevisiae), ki je preživela od E. coli do ljudi in je zato ocenjena na 3,5 milijarde let.Med sintezo beljakovin ta izboklina pomaga steblu P premikati med odprto in zaprto konformacijo, tako da lahko ribosom rekrutira translacijske faktorje in jih dostavi na aktivno mesto.V ribosomih E. cuniculi te odebelitve ni;vendar pa lahko nova odebelitev (G883), ki se nahaja samo v treh baznih parih, prispeva k obnovitvi optimalne prožnosti stebla P (slika 4c).
Naši podatki o rRNA brez izboklin kažejo, da minimizacija rRNA ni omejena na izgubo elementov rRNA na površini ribosoma, ampak lahko vključuje tudi jedro ribosoma, kar ustvarja za parazit specifično molekularno napako, ki ni bila opisana v prostoživečih celicah.opazimo živeče vrste.
Po modeliranju kanoničnih ribosomskih proteinov in rRNA smo ugotovili, da običajne ribosomske komponente ne morejo razložiti treh delov krio-EM slike.Dva od teh fragmentov sta majhni molekuli (slika 5, dopolnilna slika 8).Prvi segment je stisnjen med ribosomska proteina uL15 in eL18 na položaju, ki ga običajno zaseda C-konec eL18, ki je pri E. cuniculi skrajšan.Čeprav ne moremo določiti identitete te molekule, je velikost in oblika tega otoka gostote dobro razložena s prisotnostjo molekul spermidina.Njegovo vezavo na ribosom stabilizirajo mutacije, specifične za mikrosporijo, v proteinih uL15 (Asp51 in Arg56), za katere se zdi, da povečujejo afiniteto ribosoma za to majhno molekulo, saj omogočajo uL15, da ovije majhno molekulo v ribosomsko strukturo.Dodatna slika 2).8, dodatni podatki 1, 2).
Cryo-EM slikanje, ki kaže prisotnost nukleotidov zunaj riboze, vezane na ribosom E. cuniculi.V ribosomu E. cuniculi ta nukleotid zaseda isto mesto kot nukleotid 25S rRNA A3186 (številčenje Saccharomyces cerevisiae) v večini drugih evkariontskih ribosomov.b V ribosomski strukturi E. cuniculi se ta nukleotid nahaja med ribosomskima proteinoma uL9 in eL20, s čimer se stabilizira stik med obema proteinoma.Analiza ohranjenosti zaporedja cd eL20 med vrstami mikrosporij.Filogenetsko drevo vrst Microsporidia (c) in večkratna poravnava zaporedja proteina eL20 (d) kažeta, da sta nukleotidna vezavna ostanka F170 in K172 ohranjena v večini tipičnih mikrosporidij, z izjemo S. lophii, z izjemo zgodnje razvejane mikrosporidije, ki je ohranila podaljšek ES39L rRNA.e Ta slika kaže, da sta ostanka F170 in K172, ki vežeta nukleotide, prisotna samo v eL20 zelo reduciranega genoma mikrosporije, ne pa tudi v drugih evkariontih.Na splošno ti podatki kažejo, da so mikrosporidijski ribosomi razvili nukleotidno vezavno mesto, ki se zdi, da veže molekule AMP in jih uporablja za stabilizacijo interakcij protein-protein v ribosomski strukturi.Visoka ohranjenost tega vezavnega mesta pri mikrosporidijah in njegova odsotnost pri drugih evkariontih nakazuje, da lahko to mesto zagotovi selektivno prednost preživetja za mikrosporidije.Tako se zdi, da žep za vezavo nukleotidov v mikrosporidijskem ribosomu ni degenerirana značilnost ali končna oblika razgradnje rRNA, kot je opisano prej, temveč uporabna evolucijska inovacija, ki mikrosporidijskemu ribosomu omogoča, da neposredno veže majhne molekule in jih uporablja kot molekularne gradnike.gradniki ribosomov.Zaradi tega odkritja je ribosom mikrosporije edini ribosom, za katerega je znano, da uporablja en sam nukleotid kot svoj strukturni gradnik.f Hipotetična evolucijska pot, ki izhaja iz vezave nukleotidov.
Druga nizka molekulska gostota se nahaja na vmesniku med ribosomskimi proteini uL9 in eL30 (slika 5a).Ta vmesnik je bil prej opisan v strukturi ribosoma Saccharomyces cerevisiae kot vezavno mesto za 25S nukleotid rRNA A3186 (del podaljška ES39L rRNA)38.Pokazalo se je, da v degeneriranih ribosomih P. locustae ES39L ta vmesnik veže neznan posamezen nukleotid 31 in predpostavlja se, da je ta nukleotid reducirana končna oblika rRNA, v kateri je dolžina rRNA ~130-230 baz.ES39L se zmanjša na en nukleotid 32,43.Naše cryo-EM slike podpirajo idejo, da je gostoto mogoče razložiti z nukleotidi.Vendar je višja ločljivost naše strukture pokazala, da je ta nukleotid ekstraribosomska molekula, morda AMP (sl. 5a, b).
Nato smo vprašali, ali se je mesto vezave nukleotidov pojavilo v ribosomu E. cuniculi ali je obstajalo že prej.Ker je vezava nukleotidov v glavnem posredovana z ostanki Phe170 in Lys172 v ribosomskem proteinu eL30, smo ocenili ohranitev teh ostankov pri 4396 reprezentativnih evkariontih.Tako kot v zgornjem primeru uL15 smo ugotovili, da sta ostanka Phe170 in Lys172 visoko ohranjena samo v tipični mikrosporidi, nista pa pri drugih evkariontih, vključno z atipično mikrosporidijo Mitosporidium in Amphiamblys, v katerih fragment ES39L rRNA ni reduciran 44, 45, 46 (sl. 5c).-e).
Skupaj ti podatki podpirajo zamisel, da so E. cuniculi in morda druge kanonične mikrosporije razvile sposobnost učinkovitega zajemanja velikega števila majhnih metabolitov v strukturi ribosomov, da bi nadomestile upad ravni rRNA in beljakovin.Pri tem so razvili edinstveno sposobnost vezave nukleotidov zunaj ribosoma, kar kaže, da parazitske molekularne strukture kompenzirajo tako, da zajamejo velike količine majhnih presnovkov in jih uporabijo kot strukturne posnemke degradirane RNA in fragmentov beljakovin..
Tretji nesimulirani del našega krio-EM zemljevida, ki ga najdemo v veliki ribosomski podenoti.Relativno visoka ločljivost (2,6 Å) našega zemljevida nakazuje, da ta gostota pripada beljakovinam z edinstvenimi kombinacijami velikih ostankov stranske verige, kar nam je omogočilo, da smo to gostoto identificirali kot prej neznani ribosomski protein, ki smo ga identificirali kot Poimenovali so ga msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metode, slika 6).Naše iskanje homologije je pokazalo, da je msL2 ohranjen v mikrosporidijskem kladu rodu Encephaliter in Orosporidium, vendar ga ni v drugih vrstah, vključno z drugimi mikrosporidijami.V ribosomski strukturi msL2 zaseda vrzel, ki nastane zaradi izgube podaljšane ES31L rRNA.V tej praznini msL2 pomaga stabilizirati zvijanje rRNA in lahko nadomesti izgubo ES31L (slika 6).
Elektronska gostota in model mikrosporidije specifičnega ribosomskega proteina msL2, ki ga najdemo v ribosomih E. cuniculi.b Večina evkariontskih ribosomov, vključno z ribosomom 80S Saccharomyces cerevisiae, ima pomnoževanje ES19L rRNA pri večini mikrosporidijskih vrst izgubljeno.Prej ugotovljena struktura ribosoma mikrosporidije V. necatrix nakazuje, da je izguba ES19L pri teh parazitih kompenzirana z razvojem novega ribosomskega proteina msL1.V tej študiji smo ugotovili, da je ribosom E. cuniculi razvil tudi dodatno beljakovino, ki posnema ribosomsko RNA, kot očitno nadomestilo za izgubo ES19L.Vendar imata msL2 (trenutno označen kot hipotetični protein ECU06_1135) in msL1 različen strukturni in evolucijski izvor.c To odkritje o ustvarjanju evolucijsko nepovezanih ribosomskih proteinov msL1 in msL2 nakazuje, da če ribosomi kopičijo škodljive mutacije v svoji rRNA, lahko dosežejo ravni sestavne raznolikosti brez primere v celo majhni podskupini tesno povezanih vrst.To odkritje bi lahko pomagalo razjasniti izvor in razvoj mitohondrijskega ribosoma, ki je znan po zelo zmanjšani rRNA in nenormalni variabilnosti v sestavi beljakovin med vrstami.
Nato smo primerjali protein msL2 s prej opisanim proteinom msL1, edinim znanim ribosomskim proteinom, specifičnim za mikrosporijo, ki ga najdemo v ribosomu V. necatrix.Želeli smo preizkusiti, ali sta msL1 in msL2 evolucijsko povezana.Naša analiza je pokazala, da msL1 in msL2 zasedata isto votlino v ribosomski strukturi, vendar imata različni primarni in terciarni strukturi, kar kaže na njun neodvisen evolucijski izvor (slika 6).Tako naše odkritje msL2 zagotavlja dokaz, da lahko skupine kompaktnih evkariontskih vrst neodvisno razvijejo strukturno različne ribosomske proteine, da nadomestijo izgubo fragmentov rRNA.Ta ugotovitev je opazna po tem, da večina citoplazemskih evkariontskih ribosomov vsebuje invariantni protein, vključno z isto družino 81 ribosomskih proteinov.Pojav msL1 in msL2 v različnih klasih mikrosporidije kot odgovor na izgubo razširjenih segmentov rRNA kaže, da degradacija molekularne arhitekture parazita povzroči, da paraziti iščejo kompenzacijske mutacije, kar lahko sčasoma privede do njihove pridobitve v različnih populacijah parazitov.strukture.
Končno, ko je bil naš model dokončan, smo primerjali sestavo ribosoma E. cuniculi s tisto, predvideno iz zaporedja genoma.Za več ribosomskih proteinov, vključno z eL14, eL38, eL41 in eS30, se je prej mislilo, da manjkajo v genomu E. cuniculi zaradi očitne odsotnosti njihovih homologov v genomu E. cuniculi.Izguba številnih ribosomskih proteinov je predvidena tudi pri večini drugih zelo zmanjšanih znotrajceličnih parazitov in endosimbiontov.Na primer, čeprav večina prostoživečih bakterij vsebuje isto družino 54 ribosomskih proteinov, ima samo 11 od teh družin proteinov zaznavne homologe v vsakem analiziranem genomu bakterij, omejenih z gostiteljem.V podporo tej zamisli so eksperimentalno opazili izgubo ribosomskih proteinov v mikrosporidiji V. necatrix in P. locustae, ki nimata proteina eL38 in eL4131,32.
Vendar pa naše strukture kažejo, da so samo eL38, eL41 in eS30 dejansko izgubljeni v ribosomu E. cuniculi.Protein eL14 je bil ohranjen in naša struktura je pokazala, zakaj tega proteina ni bilo mogoče najti pri iskanju homologije (slika 7).V ribosomih E. cuniculi se večina vezavnega mesta eL14 izgubi zaradi razgradnje z rRNA pomnoženega ES39L.V odsotnosti ES39L je eL14 izgubil večino svoje sekundarne strukture in le 18 % zaporedja eL14 je bilo identičnega pri E. cuniculi in S. cerevisiae.Ta slaba ohranjenost zaporedja je izjemna, ker si celo Saccharomyces cerevisiae in Homo sapiens – organizmi, ki so se razvili 1,5 milijarde let narazen – delijo več kot 51 % istih ostankov v eL14.Ta nenavadna izguba ohranitve pojasnjuje, zakaj je E. cuniculi eL14 trenutno označen kot domnevni protein M970_061160 in ne kot ribosomski protein eL1427.
in Ribosom Microsporidia je izgubil podaljšek ES39L rRNA, ki je delno odstranil mesto vezave ribosomskega proteina eL14.V odsotnosti ES39L je protein mikrospore eL14 podvržen izgubi sekundarne strukture, v kateri se nekdanja α-vijačnica, ki veže rRNA, degenerira v zanko minimalne dolžine.b Večkratna poravnava zaporedja kaže, da je protein eL14 visoko ohranjen pri evkariontskih vrstah (57-odstotna identičnost zaporedja med kvasovkami in človeškimi homologi), vendar slabo ohranjen in divergenten v mikrosporiji (v kateri ni več kot 24 % ostankov identičnih homologu eL14).iz S. cerevisiae ali H. sapiens).Ta slaba ohranjenost zaporedja in variabilnost sekundarne strukture pojasnjujeta, zakaj homologa eL14 nikoli niso našli v E. cuniculi in zakaj naj bi bil ta protein izgubljen v E. cuniculi.V nasprotju s tem je bil E. cuniculi eL14 prej označen kot domnevni protein M970_061160.Ta ugotovitev kaže, da je raznolikost genoma mikrosporije trenutno precenjena: nekateri geni, za katere trenutno velja, da so izgubljeni v mikrosporiji, so dejansko ohranjeni, čeprav v zelo diferenciranih oblikah;namesto tega naj bi nekateri kodirali gene mikrosporije za beljakovine, specifične za črve (npr. hipotetični protein M970_061160), ki dejansko kodirajo zelo raznolike proteine, ki jih najdemo v drugih evkariontih.
Ta ugotovitev kaže, da lahko denaturacija rRNA vodi do dramatične izgube ohranjanja zaporedja v sosednjih ribosomskih proteinih, zaradi česar so ti proteini nezaznavni za iskanje homologije.Tako lahko precenimo dejansko stopnjo molekularne razgradnje v organizmih z majhnim genomom, saj nekateri proteini, za katere menimo, da so izgubljeni, dejansko obstajajo, čeprav v zelo spremenjenih oblikah.
Kako lahko paraziti ohranijo delovanje svojih molekularnih strojev v pogojih ekstremnega zmanjšanja genoma?Naša študija odgovarja na to vprašanje z opisom kompleksne molekularne strukture (ribosoma) E. cuniculi, organizma z enim najmanjših evkariontskih genomov.
Že skoraj dve desetletji je znano, da se molekule beljakovin in RNA v mikrobnih parazitih pogosto razlikujejo od svojih homolognih molekul v prostoživečih vrstah, ker nimajo centrov za nadzor kakovosti, so zmanjšane na 50% svoje velikosti v prostoživečih mikrobih itd.številne izčrpavajoče mutacije, ki poslabšajo zlaganje in delovanje.Na primer, pričakuje se, da ribosomom organizmov z majhnim genomom, vključno s številnimi znotrajceličnimi paraziti in endosimbionti, primanjkuje več ribosomskih proteinov in do ene tretjine nukleotidov rRNA v primerjavi s prosto živečimi vrstami 27, 29, 30, 49. Vendar način delovanja teh molekul v parazitu ostaja v veliki meri skrivnost, preučujejo ga predvsem s primerjalno genomiko.
Naša študija kaže, da lahko struktura makromolekul razkrije številne vidike evolucije, ki jih je težko izluščiti iz tradicionalnih primerjalnih genomskih študij znotrajceličnih parazitov in drugih organizmov, omejenih z gostiteljem (dopolnilna slika 7).Na primer, primer proteina eL14 kaže, da lahko precenimo dejansko stopnjo razgradnje molekularnega aparata pri parazitskih vrstah.Zdaj se domneva, da imajo encefalitični paraziti na stotine genov, specifičnih za mikrosporijo.Vendar pa naši rezultati kažejo, da so nekateri od teh na videz specifičnih genov pravzaprav le zelo različne različice genov, ki so pogosti pri drugih evkariontih.Poleg tega primer proteina msL2 kaže, kako spregledamo nove ribosomske proteine ​​in podcenjujemo vsebnost parazitskih molekularnih strojev.Primer majhnih molekul kaže, kako lahko spregledamo najbolj genialne inovacije v parazitskih molekularnih strukturah, ki jim lahko dajo novo biološko aktivnost.
Ti rezultati skupaj izboljšujejo naše razumevanje razlik med molekularnimi strukturami organizmov z omejenimi gostitelji in njihovimi dvojniki v prostoživečih organizmih.Pokažemo, da imajo molekularni stroji, za katere so dolgo mislili, da so zmanjšani, degenerirani in podvrženi različnim izčrpavajočim mutacijam, niz sistematično spregledanih nenavadnih strukturnih značilnosti.
Po drugi strani pa drobni fragmenti rRNA in zliti fragmenti, ki smo jih našli v ribosomih E. cuniculi, kažejo, da lahko zmanjšanje genoma spremeni celo tiste dele osnovnega molekularnega stroja, ki so ohranjeni v treh domenah življenja – po skoraj 3,5 milijardah let.neodvisen razvoj vrst.
Fragmenti rRNA brez izboklin in zliti fragmenti rRNA v ribosomih E. cuniculi so še posebej zanimivi v luči prejšnjih študij molekul RNK v endosimbiotskih bakterijah.Na primer, pri endosimbiontu listne uši Buchnera aphidicola se je pokazalo, da imajo molekule rRNA in tRNA temperaturno občutljive strukture zaradi pristranskosti sestave A+T in visokega deleža nekanoničnih baznih parov 20,50.Te spremembe v RNA, kot tudi spremembe v proteinskih molekulah, naj bi bile zdaj odgovorne za preveliko odvisnost endosimbiontov od partnerjev in nezmožnost endosimbiontov za prenos toplote 21, 23.Čeprav ima rRNA parazitske mikrosporije strukturno različne spremembe, narava teh sprememb nakazuje, da sta lahko zmanjšana toplotna stabilnost in večja odvisnost od spremljevalnih proteinov skupni značilnosti molekul RNA v organizmih z zmanjšanimi genomi.
Po drugi strani pa naše strukture kažejo, da so mikrosporidije parazitov razvile edinstveno sposobnost, da se uprejo široko ohranjenim fragmentom rRNA in proteinov, pri čemer so razvile sposobnost uporabe obilnih in lahko dostopnih majhnih metabolitov kot strukturnih posnemalcev degeneriranih fragmentov rRNA in proteinov.Degradacija molekularne strukture..To mnenje podpira dejstvo, da se majhne molekule, ki kompenzirajo izgubo proteinskih fragmentov v rRNA in ribosomih E. cuniculi, vežejo na za mikrosporijo specifične ostanke v proteinih uL15 in eL30.To nakazuje, da je lahko vezava majhnih molekul na ribosome produkt pozitivne selekcije, pri kateri so bile mutacije, specifične za mikrosporijo v ribosomskih proteinih, izbrane zaradi njihove sposobnosti povečanja afinitete ribosomov za majhne molekule, kar lahko vodi do učinkovitejših ribosomskih organizmov.Odkritje razkriva pametno inovacijo v molekularni strukturi mikrobnih parazitov in nam daje boljše razumevanje, kako molekularne strukture parazitov ohranjajo svojo funkcijo kljub reduktivni evoluciji.
Trenutno identifikacija teh majhnih molekul ostaja nejasna.Ni jasno, zakaj se videz teh majhnih molekul v ribosomski strukturi razlikuje med vrstami mikrosporije.Zlasti ni jasno, zakaj je vezava nukleotidov opažena v ribosomih E. cuniculi in P. locustae, in ne v ribosomih V. necatrix, kljub prisotnosti ostanka F170 v proteinih eL20 in K172 V. necatrix.To izbris lahko povzroči ostanek 43 uL6 (ki se nahaja poleg žepa za vezavo nukleotidov), ki je tirozin pri V. necatrix in ne treonin pri E. cuniculi in P. locustae.Zajetna aromatična stranska veriga Tyr43 lahko moti vezavo nukleotidov zaradi steričnega prekrivanja.Druga možnost je, da je očitna delecija nukleotidov lahko posledica nizke ločljivosti krio-EM slikanja, ki ovira modeliranje ribosomskih fragmentov V. necatrix.
Po drugi strani pa naše delo kaže, da je lahko proces razpadanja genoma inventivna sila.Zlasti struktura ribosoma E. cuniculi nakazuje, da izguba rRNA in proteinskih fragmentov v ribosomu mikrosporije ustvarja evolucijski pritisk, ki spodbuja spremembe v strukturi ribosoma.Te različice se pojavijo daleč od aktivnega mesta ribosoma in zdi se, da pomagajo vzdrževati (ali obnoviti) optimalno sestavo ribosoma, ki bi jo sicer motila zmanjšana rRNA.To nakazuje, da se zdi, da se je glavna inovacija ribosoma mikrosporije razvila v potrebo po pufru odnašanja genov.
Morda to najbolje ponazarja vezava nukleotidov, ki je doslej pri drugih organizmih še niso opazili.Dejstvo, da so ostanki vezave nukleotidov prisotni v tipični mikrosporiji, ne pa tudi pri drugih evkariontih, nakazuje, da mesta vezave nukleotidov niso le relikti, ki čakajo, da izginejo, ali končno mesto za rRNA, ki se obnovi v obliki posameznih nukleotidov.Namesto tega se zdi, da je to spletno mesto uporabna funkcija, ki bi se lahko razvila v več krogih pozitivne selekcije.Vezavna mesta za nukleotide so lahko stranski produkt naravne selekcije: ko se ES39L razgradi, so mikrosporidije prisiljene iskati nadomestilo za obnovitev optimalne biogeneze ribosomov v odsotnosti ES39L.Ker lahko ta nukleotid posnema molekularne stike nukleotida A3186 v ES39L, postane nukleotidna molekula gradnik ribosoma, katerega vezava se dodatno izboljša z mutacijo zaporedja eL30.
V zvezi z molekularno evolucijo intracelularnih parazitov naša študija kaže, da sile Darwinove naravne selekcije in genetski drift razpada genoma ne delujejo vzporedno, ampak nihajo.Prvič, genetski drift odpravi pomembne lastnosti biomolekul, zaradi česar je kompenzacija zelo potrebna.Šele ko bodo paraziti zadovoljili to potrebo skozi darwinovsko naravno selekcijo, bodo njihove makromolekule imele priložnost razviti svoje najbolj impresivne in inovativne lastnosti.Pomembno je, da razvoj veznih mest za nukleotide v ribosomu E. cuniculi nakazuje, da ta vzorec molekularne evolucije od izgube do pridobitve ne samo amortizira škodljive mutacije, ampak včasih podeljuje popolnoma nove funkcije parazitskim makromolekulam.
Ta zamisel je skladna s teorijo gibljivega ravnotežja Sewella Wrighta, ki pravi, da strog sistem naravne selekcije omejuje sposobnost organizmov za inovacije 51,52,53.Če pa genetski odmik zmoti naravno selekcijo, lahko ti odmiki povzročijo spremembe, ki same po sebi niso prilagodljive (ali celo škodljive), ampak vodijo do nadaljnjih sprememb, ki zagotavljajo večjo sposobnost ali novo biološko aktivnost.Naš okvir podpira to zamisel z ilustracijo, da se zdi, da je ista vrsta mutacije, ki zmanjša gubo in funkcijo biomolekule, glavni sprožilec za njeno izboljšanje.V skladu z zmagovalnim evolucijskim modelom naša študija kaže, da je razpad genoma, ki se tradicionalno obravnava kot degenerativni proces, tudi glavno gonilo inovacij, ki včasih in morda celo pogosto omogoča makromolekulam, da pridobijo nove parazitske dejavnosti.jih lahko uporablja.