Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Vrtiljak, ki hkrati prikazuje tri diapozitive. Za premikanje med tremi diapozitivi hkrati uporabite gumba Prejšnji in Naslednji ali pa drsnike na koncu za premikanje med tremi diapozitivi hkrati.
Nedavno je bila razvita platforma brez kemikalij, ki temelji na nanotehnologiji z uporabo umetnih vodnih nanostruktur (EWNS). EWNS imajo visok površinski naboj in so nasičene z reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS), ki lahko interagirajo s številnimi mikroorganizmi in jih inaktivirajo, vključno s patogeni, ki se prenašajo s hrano. Tukaj je prikazano, da je mogoče njihove lastnosti med sintezo natančno prilagoditi in optimizirati, da se še poveča njihov antibakterijski potencial. Laboratorijska platforma EWNS je bila zasnovana za natančno prilagoditev lastnosti EWNS s spreminjanjem parametrov sinteze. Karakterizacija lastnosti EWNS (naboj, velikost in vsebnost ROS) z uporabo sodobnih analitičnih metod. Poleg tega so bile ocenjene glede na njihov potencial mikrobne inaktivacije proti mikroorganizmom, ki se prenašajo s hrano, kot so Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum in Saccharomyces cerevisiae. Rezultati, predstavljeni tukaj, kažejo, da je mogoče lastnosti EWNS med sintezo natančno prilagoditi, kar ima za posledico eksponentno povečanje učinkovitosti inaktivacije. Zlasti se je površinski naboj povečal za faktor štirikrat, reaktivne kisikove vrste pa so se povečale. Hitrost odstranjevanja mikrobov je bila odvisna od mikrobov in se je gibala od 1,0 do 3,8 log po 45-minutni izpostavljenosti aerosolnemu odmerku 40.000 #/cc EWNS.
Mikrobna kontaminacija je glavni vzrok bolezni, ki se prenašajo s hrano, ki jih povzroča zaužitje patogenov ali njihovih toksinov. Samo v Združenih državah Amerike bolezni, ki se prenašajo s hrano, povzročijo približno 76 milijonov bolezni, 325.000 sprejemov v bolnišnico in 5.000 smrti vsako leto1. Poleg tega Ministrstvo za kmetijstvo Združenih držav Amerike (USDA) ocenjuje, da je povečana poraba svežih pridelkov odgovorna za 48 % vseh prijavljenih bolezni, ki se prenašajo s hrano, v Združenih državah2. Stroški bolezni in smrti, ki jih povzročajo patogeni, ki se prenašajo s hrano, v Združenih državah Amerike, so zelo visoki, Centri za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC) pa jih ocenjujejo na več kot 15,6 milijarde ameriških dolarjev na leto3.
Trenutno se kemični4, sevalni5 in toplotni6 protimikrobni posegi za zagotavljanje varnosti hrane večinoma izvajajo na omejenih kritičnih kontrolnih točkah (KKT) vzdolž proizvodne verige (običajno po žetvi in/ali med pakiranjem) in ne neprekinjeno. Zato so nagnjeni k navzkrižni kontaminaciji. 7. Boljši nadzor nad boleznimi, ki se prenašajo s hrano, in kvarjenjem hrane zahteva protimikrobne posege, ki jih je mogoče potencialno uporabiti v celotnem kontinuumu od kmetije do mize, hkrati pa zmanjšati vpliv na okolje in stroške.
Nedavno je bila razvita protimikrobna platforma brez kemikalij, ki temelji na nanotehnologiji in lahko inaktivira površinske in zračne bakterije z uporabo umetnih vodnih nanostruktur (EWNS). EWNS so bile sintetizirane z uporabo dveh vzporednih procesov, elektrospreja in ionizacije vode (slika 1a). Prejšnje študije so pokazale, da imajo EWNS edinstven nabor fizikalnih in bioloških lastnosti8,9,10. EWNS imajo povprečno 10 elektronov na strukturo in povprečno velikost nanometrskega merila 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Poleg tega je elektronska spinska resonanca (ESR) pokazala, da EWNS vsebuje veliko količino reaktivnih kisikovih spojin (ROS), predvsem hidroksilnih (OH•) in superoksidnih (O2-) radikalov (slika 1c)8. EVNS so v zraku dolgo časa in lahko trčijo z mikroorganizmi, ki so suspendirani v zraku in so prisotni na površini, pri čemer dostavijo svoj ROS in povzročijo inaktivacijo mikroorganizmov (slika 1d). Te zgodnje študije so tudi pokazale, da lahko EWNS interagirajo z različnimi gramnegativnimi in grampozitivnimi bakterijami, vključno z mikobakterijami, na površinah in v zraku ter jih inaktivirajo. Transmisijska elektronska mikroskopija je pokazala, da je inaktivacijo povzročila motnja celične membrane. Poleg tega so študije akutnega vdihavanja pokazale, da visoki odmerki EWNS ne povzročajo poškodb pljuč ali vnetja 8.
(a) Elektropršenje nastane, ko se med kapilarno cevko, ki vsebuje tekočino, in protielektrodo uporabi visoka napetost. (b) Uporaba visokega tlaka povzroči dva različna pojava: (i) elektropršenje vode in (ii) nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti (ionov), ujetih v EWNS. (c) Edinstvena struktura EWNS. (d) Zaradi svoje nanoskopske narave so EWNS zelo mobilne in lahko interagirajo s patogeni v zraku.
Nedavno je bila dokazana tudi sposobnost protimikrobne platforme EWNS za inaktivacijo mikroorganizmov, ki se prenašajo s hrano, na površini sveže hrane. Pokazalo se je tudi, da se lahko površinski naboj EWNS v kombinaciji z električnim poljem uporabi za doseganje ciljne dostave. Poleg tega so bili predhodni rezultati za ekološke paradižnike po 90-minutni izpostavljenosti pri EWNS približno 50.000 #/cm3 spodbudni, pri čemer so bili opaženi različni mikroorganizmi, ki se prenašajo s hrano, kot sta E. coli in Listeria 11. Poleg tega predhodni organoleptični testi niso pokazali senzoričnih učinkov v primerjavi s kontrolnimi paradižniki. Čeprav so ti začetni rezultati inaktivacije spodbudni za uporabo na področju varnosti hrane tudi pri zelo nizkih odmerkih EWNS 50.000#/cm3, je jasno, da bi bil višji potencial inaktivacije bolj koristen za nadaljnje zmanjšanje tveganja okužbe in kvarjenja.
Tukaj se bomo osredotočili na razvoj platforme za generiranje EWNS, ki bo omogočila natančno nastavitev parametrov sinteze in optimizacijo fizikalno-kemijskih lastnosti EWNS za povečanje njihovega antibakterijskega potenciala. Optimizacija se je osredotočila zlasti na povečanje njihovega površinskega naboja (za izboljšanje ciljne dostave) in vsebnosti ROS (za izboljšanje učinkovitosti inaktivacije). Karakterizirali bomo optimizirane fizikalno-kemijske lastnosti (velikost, naboj in vsebnost ROS) z uporabo sodobnih analitičnih metod in uporabili običajne živilske mikroorganizme, kot je E.
EVNS je bil sintetiziran s sočasnim elektropršenjem in ionizacijo vode visoke čistosti (18 MΩ cm–1). Električni nebulizator 12 se običajno uporablja za atomizacijo tekočin in sintezo polimernih in keramičnih delcev 13 ter vlaken 14 nadzorovane velikosti.
Kot je podrobno opisano v prejšnjih publikacijah 8, 9, 10, 11, je bila v tipičnem poskusu med kovinsko kapilaro in ozemljeno protielektrodo priključena visoka napetost. Med tem postopkom se pojavita dva različna pojava: i) elektropršenje in ii) ionizacija vode. Močno električno polje med obema elektrodama povzroči kopičenje negativnih nabojev na površini kondenzirane vode, kar povzroči nastanek Taylorjevih stožcev. Posledično nastanejo visoko nabite kapljice vode, ki se še naprej razpadajo na manjše delce, kot v Rayleighovi teoriji16. Hkrati močna električna polja povzročijo, da se nekatere molekule vode cepijo in odvzamejo elektrone (ionizirajo), kar vodi do nastanka velike količine reaktivnih kisikovih spojin (ROS)17. Hkrati generirani ROS18 je bil enkapsuliran v EWNS (slika 1c).
Na sliki 2a je prikazan sistem za generiranje EWNS, razvit in uporabljen pri sintezi EWNS v tej študiji. Prečiščena voda, shranjena v zaprti steklenici, je bila skozi teflonsko cev (notranji premer 2 mm) dovajana v iglo iz nerjavečega jekla 30G (kovinska kapilara). Pretok vode se nadzoruje z zračnim tlakom v steklenici, kot je prikazano na sliki 2b. Igla je nameščena na teflonski konzoli in jo je mogoče ročno nastaviti na določeno razdaljo od protielektrode. Protielektroda je poliran aluminijast disk z luknjo v sredini za vzorčenje. Pod protielektrodo je aluminijast lijak za vzorčenje, ki je preko vzorčevalne odprtine povezan s preostalim delom eksperimentalne postavitve (slika 2b). Da bi se izognili kopičenju naboja, ki bi lahko motil delovanje vzorčevalnika, so vse komponente vzorčevalnika električno ozemljene.
(a) Sistem za generiranje vodnih nanostruktur (EWNS). (b) Prečni prerez vzorčevalnika in elektrospreja, ki prikazuje najpomembnejše parametre. (c) Eksperimentalna postavitev za inaktivacijo bakterij.
Zgoraj opisani sistem za generiranje EWNS lahko spreminja ključne obratovalne parametre za lažjo natančno nastavitev lastnosti EWNS. Za natančno nastavitev značilnosti EWNS prilagodite uporabljeno napetost (V), razdaljo med iglo in protielektrodo (L) ter pretok vode (φ) skozi kapilaro. Simbol, ki se uporablja za predstavitev različnih kombinacij: [V (kV), L (cm)]. Prilagodite pretok vode, da dobite stabilen Taylorjev stožec določenega nabora [V, L]. Za namene te študije je bil premer odprtine protielektrode (D) vzdrževan na 0,5 palca (1,29 cm).
Zaradi omejene geometrije in asimetrije jakosti električnega polja ni mogoče izračunati iz prvih principov. Namesto tega je bila za izračun električnega polja uporabljena programska oprema QuickField™ (Svendborg, Danska)19. Električno polje ni enakomerno, zato je bila vrednost električnega polja na konici kapilare uporabljena kot referenčna vrednost za različne konfiguracije.
Med študijo je bilo ocenjenih več kombinacij napetosti in razdalje med iglo in protielektrodo glede na nastanek Taylorjevega stožca, stabilnost Taylorjevega stožca, stabilnost proizvodnje EWNS in ponovljivost. Različne kombinacije so prikazane v dodatni tabeli S1.
Izhod sistema za generiranje EWNS je bil neposredno povezan z analizatorjem velikosti delcev Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) za merjenje koncentracije števila delcev, pa tudi z aerosolnim Faradayevim elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). ) za aerosolne tokove je bil izmerjen, kot je opisano v naši prejšnji publikaciji. SMPS in aerosolni elektrometer sta vzorčila s pretokom 0,5 L/min (skupni pretok vzorca 1 L/min). Koncentracija števila delcev in pretok aerosola sta bila merjena 120 sekund. Meritev se ponovi 30-krat. Na podlagi meritev toka se izračuna skupni naboj aerosola in oceni povprečni naboj EWNS za dano skupno število izbranih delcev EWNS. Povprečne stroške EWNS lahko izračunamo z enačbo (1):
kjer je IEl izmerjeni tok, NSMPS digitalna koncentracija, izmerjena s SMPS, φEl pa pretok na elektrometer.
Ker relativna vlažnost (RH) vpliva na površinski naboj, sta bila temperatura in (RH) med poskusom konstantna pri 21 °C oziroma 45 %.
Za merjenje velikosti in življenjske dobe EWNS sta bila uporabljena mikroskopija atomskih sil (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) in sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonska). Frekvenca skeniranja AFM je bila 1 Hz, površina skeniranja 5 μm × 5 μm in 256 vrstic skeniranja. Vse slike so bile podvržene poravnavi slik 1. reda z uporabo programske opreme Asylum (območje maske 100 nm, prag 100 pm).
Preskusni lijak je bil odstranjen in površina sljude je bila postavljena na razdaljo 2,0 cm od protielektrode za povprečni čas 120 s, da se prepreči aglomeracija delcev in nastanek nepravilnih kapljic na površini sljude. EWNS je bil razpršen neposredno na površino sveže rezane sljude (Ted Pella, Redding, CA). Slika površine sljude takoj po AFM razprševanju. Kontaktni kot površine sveže rezane nemodificirane sljude je blizu 0°, zato je EVNS porazdeljen po površini sljude v obliki kupole. Premer (a) in višina (h) difuznih kapljic sta bila izmerjena neposredno iz topografije AFM in uporabljena za izračun difuzijskega volumna kupole EWNS z uporabo naše predhodno validirane metode. Ob predpostavki, da imajo vgrajeni EWNS enak volumen, lahko ekvivalentni premer izračunamo z enačbo (2):
Na podlagi naše predhodno razvite metode smo za zaznavanje prisotnosti kratkoživih radikalnih intermediatov v EWNS uporabili spinsko past elektronske spinske resonance (ESR). Aerosoli so bili prepihnjeni skozi 650 μm Midget razpršilnik (Ace Glass, Vineland, NJ), ki je vseboval 235 mM raztopino DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon. Vse meritve ESR so bile izvedene z uporabo spektrometra Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ZDA) in ploščate celice. Za zbiranje in analizo podatkov je bila uporabljena programska oprema Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ZDA). Določanje značilnosti ROS je bilo izvedeno le za niz obratovalnih pogojev [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS so bile izmerjene z uporabo SMPS po upoštevanju izgub EWNS v udarnem elementu.
Ravni ozona so bile spremljane z uporabo 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za vse lastnosti EWNS se kot izmerjena vrednost uporablja povprečna vrednost, kot merilna napaka pa standardni odklon. Za primerjavo vrednosti optimiziranih atributov EWNS z ustreznimi vrednostmi osnovnega EWNS so bili izvedeni t-testi.
Slika 2c prikazuje predhodno razvit in karakteriziran sistem "vlečenja" elektrostatičnega izločanja (EPES), ki se lahko uporablja za ciljno dovajanje EWNS na površino. EPES uporablja naboje EVNS, ki jih je mogoče pod vplivom močnega električnega polja "voditi" neposredno na površino tarče. Podrobnosti o sistemu EPES so predstavljene v nedavni publikaciji Pyrgiotakisa in sodelavcev 11. EPES je torej sestavljen iz 3D-natisnjene PVC komore s zoženimi konci, ki vsebuje dve vzporedni kovinski plošči iz nerjavečega jekla (nerjaveče jeklo 304, zrcalno prevlečeno) na sredini, oddaljeni 15,24 cm. Plošče so bile priključene na zunanji vir visoke napetosti (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodnja plošča je bila vedno priključena na pozitivno napetost, zgornja plošča pa je bila vedno priključena na ozemljitev (plavajoča ozemljitev). Stene komore so prekrite z aluminijasto folijo, ki je električno ozemljena, da se prepreči izguba delcev. Komora ima zatesnjena sprednja nakladalna vrata, ki omogočajo postavitev testnih površin na plastična stojala, ki jih dvignejo nad spodnjo kovinsko ploščo, da se preprečijo motnje zaradi visoke napetosti.
Učinkovitost nanašanja EWNS v EPES je bila izračunana v skladu s predhodno razvitim protokolom, podrobno opisanim v Dodatni sliki S111.
Kot kontrolna komora je bila na sistem EPES zaporedno priključena druga valjasta pretočna komora, v kateri je bil za odstranjevanje EWNS uporabljen vmesni HEPA filter. Kot je prikazano na sliki 2c, je bil aerosol EWNS črpan skozi dve vgrajeni komori. Filter med kontrolno sobo in EPES odstrani vse preostale EWNS, kar ima za posledico enako temperaturo (T), relativno vlažnost (RH) in raven ozona.
Ugotovljeno je bilo, da pomembni mikroorganizmi, ki se prenašajo s hrano, kontaminirajo sveža živila, kot so E. coli (ATCC #27325), indikator fekalnega sistema, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen, ki se prenaša s hrano, Listeria innearmy (ATCC #33090), nadomestek za patogeno Listeria monocytogenes, pridobljen iz ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), nadomestek za kvarljiv kvas, in bolj odporna inaktivirana bakterija Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupite naključne škatle ekoloških grozdnih paradižnikov na lokalni tržnici in jih shranite v hladilniku pri 4 °C do uporabe (do 3 dni). Poskusni paradižniki so bili vsi enake velikosti, premera približno 1,2 cm.
Protokol za gojenje, inokulacijo, izpostavljenost in štetje kolonij je podrobno opisan v naši prejšnji publikaciji in v dodatnih podatkih. Učinkovitost EWNS je bila ocenjena z izpostavitvijo inokuliranih paradižnikov 40.000 #/cm3 za 45 minut. Na kratko, trije paradižniki so bili uporabljeni za oceno preživelih mikroorganizmov v času t = 0 min. Trije paradižniki so bili postavljeni v EPES in izpostavljeni EWNS pri 40.000 #/cm3 (paradižniki, izpostavljeni EWNS), preostali trije pa so bili postavljeni v kontrolno komoro (kontrolni paradižniki). Dodatna obdelava paradižnikov v obeh skupinah ni bila izvedena. Paradižniki, izpostavljeni EWNS, in kontrolni paradižniki so bili odstranjeni po 45 minutah, da bi ocenili učinek EWNS.
Vsak poskus je bil izveden v treh ponovitvah. Analiza podatkov je bila izvedena v skladu s protokolom, opisanim v dodatnih podatkih.
Mehanizme inaktivacije smo ocenili s sedimentacijo izpostavljenih vzorcev EWNS (45 min pri koncentraciji aerosola EWNS 40.000 #/cm3) in neobsevanih vzorcev neškodljivih bakterij E. coli, Salmonella enterica in Lactobacillus. Delce smo fiksirali v 2,5 % glutaraldehidu, 1,25 % paraformaldehidu in 0,03 % pikrinski kislini v 0,1 M natrijevem kakodilatnem pufru (pH 7,4) 2 uri pri sobni temperaturi. Po izpiranju smo 2 uri naknadno fiksirali z 1 % osmijevim tetroksidom (OsO4)/1,5 % kalijevim ferocianidom (KFeCN6), 3-krat sprali v vodi in 1 uro inkubirali v 1 % uranil acetatu, nato dvakrat sprali v vodi in nato 10 minut dehidrirali v 50 %, 70 %, 90 % in 100 % alkoholu. Vzorce smo nato za 1 uro namestili v propilen oksid in impregnirali z mešanico propilen oksida in TAAP Epona (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kalifornija) v razmerju 1:1. Vzorce smo vdelali v TAAB Epon in polimerizirali pri 60 °C 48 ur. Strjena granulirana smola je bila razrezana in vizualizirana s TEM z uporabo običajnega transmisijskega elektronskega mikroskopa JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonska), opremljenega s kamero AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, ZDA).
Vsi poskusi so bili izvedeni v treh ponovitvah. Za vsako časovno točko so bili bakterijski izpirki zasejani v treh ponovitvah, kar je dalo skupno devet podatkovnih točk na točko, katerih povprečje je bilo uporabljeno kot bakterijska koncentracija za ta določeni mikroorganizem. Standardni odklon je bil uporabljen kot merilna napaka. Vse točke štejejo.
Logaritem zmanjšanja koncentracije bakterij v primerjavi s t = 0 min smo izračunali po naslednji formuli:
kjer je C0 koncentracija bakterij v kontrolnem vzorcu v času 0 (tj. po tem, ko se je površina posušila, vendar preden je bila postavljena v komoro), Cn pa koncentracija bakterij na površini po n minutah izpostavljenosti.
Da bi upoštevali naravno razgradnjo bakterij med 45-minutno izpostavljenostjo, je bilo logaritemsko zmanjšanje v primerjavi s kontrolno skupino po 45 minutah izračunano tudi na naslednji način:
kjer je Cn koncentracija bakterij v kontrolnem vzorcu v času n in Cn-Control koncentracija kontrolnih bakterij v času n. Podatki so predstavljeni kot logaritemsko zmanjšanje v primerjavi s kontrolo (brez izpostavljenosti EWNS).
Med študijo je bilo ocenjenih več kombinacij napetosti in razdalje med iglo in protielektrodo glede na nastanek Taylorjevega stožca, stabilnost Taylorjevega stožca, stabilnost proizvodnje EWNS in ponovljivost. Različne kombinacije so prikazane v dodatni tabeli S1. Za celovito študijo sta bila izbrana dva primera, ki kažeta stabilne in ponovljive lastnosti (Taylorjev stožec, nastanek EWNS in stabilnost skozi čas). Slika 3 na sliki 3 prikazuje rezultate za naboj, velikost in vsebnost ROS v obeh primerih. Rezultati so prikazani tudi v tabeli 1. Za referenco, tako slika 3 kot tabela 1 vključujeta lastnosti predhodno sintetiziranih neoptimiziranih EWNS8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statistične pomembnosti z uporabo dvostranskega t-testa so ponovno objavljeni v dodatni tabeli S2. Poleg tega dodatni podatki vključujejo študije o vplivu premera vzorčne odprtine protielektrode (D) in razdalje med ozemljitveno elektrodo in konico (L) (dodatni sliki S2 in S3).
(ac) Porazdelitev velikosti, izmerjena z AFM. (df) Karakteristika površinskega naboja. (g) Karakterizacija ROS EPR.
Pomembno je tudi omeniti, da je bil pri vseh zgoraj navedenih pogojih izmerjeni ionizacijski tok med 2 in 6 μA, napetost pa med -3,8 in -6,5 kV, kar je povzročilo porabo energije manj kot 50 mW za ta posamezni kontaktni modul za generacijo EWNS. Čeprav je bil EWNS sintetiziran pod visokim tlakom, so bile ravni ozona zelo nizke in nikoli niso presegle 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] oziroma [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] in [-3,8 kV, 0,5 cm] sta izračunana polja 2 × 10⁶ V/m oziroma 4,7 × 10⁶ V/m. To je pričakovano, saj je v drugem primeru razmerje med napetostjo in razdaljo veliko večje.
Na sliki 3a,b je prikazan premer EWNS, izmerjen z AFM8. Izračunana povprečna premera EWNS sta bila 27 nm in 19 nm za shemi [-6,5 kV, 4,0 cm] oziroma [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] in [-3,8 kV, 0,5 cm] sta geometrijska standardna odklona porazdelitev 1,41 oziroma 1,45, kar kaže na ozko porazdelitev velikosti. Tako povprečna velikost kot geometrijski standardni odklon sta zelo blizu osnovni EWNS, in sicer 25 nm oziroma 1,41. Na sliki 3c je prikazana porazdelitev velikosti osnovnega EWNS, izmerjena z isto metodo pod enakimi pogoji.
Na sliki 3d,e so prikazani rezultati karakterizacije naboja. Podatki so povprečne meritve 30 sočasnih meritev koncentracije (#/cm3) in toka (I). Analiza kaže, da je povprečni naboj na EWNS 22 ± 6 e- in 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] oziroma [-3,8 kV, 0,5 cm]. Imajo bistveno višje površinske naboje v primerjavi z osnovnim EWNS (10 ± 2 e-), dvakrat večje kot pri scenariju [-6,5 kV, 4,0 cm] in štirikrat večje kot pri scenariju [-3,8 kV, 0,5 cm]. Slika 3f prikazuje podatke o naboju za osnovni EWNS.
Iz koncentracijskih kart števila EWNS (dodatni sliki S5 in S6) je razvidno, da ima scenarij [-6,5 kV, 4,0 cm] bistveno več delcev kot scenarij [-3,8 kV, 0,5 cm]. Omeniti velja tudi, da je bila koncentracija števila EWNS spremljana do 4 ure (dodatni sliki S5 in S6), kjer je stabilnost generacije EWNS v obeh primerih pokazala enake ravni koncentracije števila delcev.
Na sliki 3g je prikazan EPR spekter po odštevanju optimiziranega kontrolnega EWNS (ozadje) pri [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektri so bili primerjani tudi s scenarijem Baseline-EWNS v predhodno objavljenem delu. Izračunano je bilo, da je število EWNS, ki reagirajo s spinskimi pastmi, 7,5 × 10⁴ EWNS/s, kar je podobno predhodno objavljenemu Baseline-EWNS8. EPR spektri so jasno pokazali prisotnost dveh vrst ROS, pri čemer je bil O2- prevladujoča vrsta, OH• pa manj obilen. Poleg tega je neposredna primerjava intenzivnosti vrhov pokazala, da je imel optimiziran EWNS bistveno višjo vsebnost ROS v primerjavi z osnovnim EWNS.
Na sliki 4 je prikazana učinkovitost nanašanja EWNS v EPES. Podatki so povzeti tudi v tabeli I in primerjani z originalnimi podatki EWNS. V obeh primerih EUNS je nanašanje blizu 100 % že pri nizki napetosti 3,0 kV. Običajno je 3,0 kV dovolj za 100 % nanašanje, ne glede na spremembo površinskega naboja. Pod enakimi pogoji je bila učinkovitost nanašanja Baseline-EWNS le 56 % zaradi njihovega nižjega naboja (povprečno 10 elektronov na EWNS).
Na sliki 5 in v tabeli 2 je povzeta vrednost inaktivacije mikroorganizmov, inokuliranih na površini paradižnika po izpostavljenosti približno 40.000 #/cm3 EWNS 45 minut pri optimalnem načinu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirana E. coli in Lactobacillus innocuous sta pokazala znatno zmanjšanje za 3,8 logaritma med 45-minutno izpostavljenostjo. Pod enakimi pogoji se je S. enterica zmanjšala za 2,2 logaritma, medtem ko se je S. cerevisiae in M. parafortutum zmanjšala za 1,0 logaritem.
Elektronske mikrografije (slika 6) prikazujejo fizikalne spremembe, ki jih EWNS povzroči na neškodljivih celicah Escherichia coli, Streptococcus in Lactobacillus, kar vodi do njihove inaktivacije. Kontrolne bakterije so imele nepoškodovane celične membrane, izpostavljene bakterije pa so imele poškodovane zunanje membrane.
Elektronsko mikroskopsko slikanje kontrolnih in izpostavljenih bakterij je pokazalo poškodbe membrane.
Podatki o fizikalno-kemijskih lastnostih optimiziranih EWNS skupaj kažejo, da so se lastnosti (površinski naboj in vsebnost ROS) EWNS bistveno izboljšale v primerjavi s prej objavljenimi osnovnimi podatki EWNS8,9,10,11. Po drugi strani pa je njihova velikost ostala v nanometrskem območju, kar je zelo podobno rezultatom, o katerih so poročali prej, kar jim je omogočilo, da so v zraku ostali dlje časa. Opaženo polidisperznost je mogoče pojasniti s spremembami površinskega naboja, ki določajo velikost EWNS, naključnostjo Rayleighovega učinka in potencialno koalescenco. Vendar pa, kot so podrobno opisali Nielsen in sod.22, visok površinski naboj zmanjša izhlapevanje z učinkovitim povečanjem površinske energije/napetosti vodne kapljice. V naši prejšnji publikaciji8 je bila ta teorija eksperimentalno potrjena za mikrokapljice22 in EWNS. Izguba naboja med delovanjem lahko vpliva tudi na velikost in prispeva k opaženi porazdelitvi velikosti.