Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati.Uporabite gumba Prejšnji in Naslednji, da se premikate po treh diapozitivih hkrati, ali pa uporabite gumbe drsnika na koncu, da se premikate skozi tri diapozitive hkrati.
Krvno-možganska pregrada in krvno-možganska pregrada preprečujeta bioterapevtskim sredstvom, da bi dosegli svoje tarče v osrednjem živčnem sistemu in s tem onemogočajo učinkovito zdravljenje nevroloških bolezni.Da bi odkrili nove možganske prenašalce in vivo, smo uvedli knjižnico peptidov faga T7 in serijsko zbrali kri in cerebrospinalno tekočino (CSF) z uporabo kaniliranega zavestnega modela velikega bazena podgan.Specifični fagni kloni so bili po štirih krogih selekcije močno obogateni s CSF.Testiranje posameznih kandidatnih peptidov je pokazalo več kot 1000-kratno obogatitev CSF.Bioaktivnost peptidno posredovane dostave v možgane je bila potrjena s 40-odstotnim zmanjšanjem ravni amiloida-β v cerebrospinalni tekočini z uporabo zaviralca peptida BACE1, povezanega z identificiranim novim tranzitnim peptidom.Ti rezultati kažejo, da so lahko peptidi, identificirani z metodami selekcije fagov in vivo, uporabna sredstva za sistemsko dostavo makromolekul v možgane s terapevtskim učinkom.
Raziskave ciljne terapije osrednjega živčnega sistema (CNS) so se v veliki meri osredotočile na prepoznavanje optimiziranih zdravil in učinkovin, ki kažejo lastnosti ciljanja na osrednje živčevje, z manj truda pri odkrivanju mehanizmov, ki poganjajo aktivno dostavo zdravil v možgane.To se zdaj začenja spreminjati, saj je dovajanje zdravil, zlasti velikih molekul, sestavni del sodobnega nevroznanstvenega razvoja zdravil.Okolje centralnega živčnega sistema je dobro zaščiteno s sistemom cerebrovaskularne pregrade, ki jo sestavljata krvno-možganska pregrada (BBB) ​​​​in krvno-možganska pregrada (BCBB)1, zaradi česar je dovajanje zdravil v možgane težko1,2.Ocenjuje se, da se skoraj vsa zdravila z velikimi molekulami in več kot 98 % zdravil z majhnimi molekulami izloči iz možganov3.Zato je zelo pomembno identificirati nove možganske transportne sisteme, ki zagotavljajo učinkovito in specifično dostavo terapevtskih zdravil v CNS 4,5.Vendar pa BBB in BCSFB predstavljata tudi odlično priložnost za dostavo zdravil, saj prodreta in vstopita v vse strukture možganov skozi njihovo obsežno vaskulaturo.Tako trenutna prizadevanja za uporabo neinvazivnih metod dostave v možgane v veliki meri temeljijo na mehanizmu receptorsko posredovanega transporta (PMT) z uporabo endogenega receptorja BBB6.Kljub nedavnemu ključnemu napredku pri uporabi poti receptorja transferina 7, 8 je potreben nadaljnji razvoj novih dostavnih sistemov z izboljšanimi lastnostmi.V ta namen je bil naš cilj identificirati peptide, ki so sposobni posredovati pri transportu cerebrospinalne tekočine, saj bi jih načeloma lahko uporabili za dostavo makromolekul v CNS ali za odpiranje novih receptorskih poti.Zlasti specifični receptorji in prenašalci cerebrovaskularnega sistema (BBB in BSCFB) lahko služijo kot potencialne tarče za aktivno in specifično dostavo bioterapevtskih zdravil.Cerebrospinalna tekočina (CSF) je sekretorni produkt horoidnega pleksusa (CS) in je v neposrednem stiku z intersticijsko tekočino možganov skozi subarahnoidni prostor in ventrikularni prostor4.Nedavno je bilo dokazano, da subarahnoidna cerebrospinalna tekočina prekomerno difundira v intersticij možganov9.Upamo, da bomo dostopali do parenhimskega prostora z uporabo tega subarahnoidnega vtočnega trakta ali neposredno skozi BBB.Da bi to dosegli, smo uvedli robustno strategijo izbire fagov in vivo, ki idealno identificira peptide, ki se prenašajo po kateri koli od teh dveh različnih poti.
Zdaj opisujemo sekvenčno in vivo presejalno metodo prikaza fagov z vzorčenjem CSF skupaj z visoko zmogljivim sekvenciranjem (HTS) za spremljanje začetnih izbirnih krogov z največjo raznolikostjo knjižnice.Presejanje je bilo izvedeno na zavestnih podganah s trajno vsajeno kanilo velike cisterne (CM), da bi se izognili kontaminaciji krvi.Pomembno je, da ta pristop izbere ciljanje na možgane in peptide s transportno aktivnostjo čez cerebrovaskularno pregrado.Uporabili smo fage T7 zaradi njihove majhnosti (~60 nm)10 in predlagali, da so primerni za transport veziklov, ki omogočajo transcelično prečkanje endotelijske in/ali epitelno-medulne pregrade.Po štirih krogih opazovanja so bile izolirane populacije fagov, ki kažejo močno in vivo obogatitev cerebrospinalne tekočine in povezavo možganskih mikrožil.Pomembno je, da smo lahko potrdili naše ugotovitve z dokazovanjem, da so prednostni in kemično sintetizirani najboljši kandidatni peptidi sposobni prenašati beljakovinski tovor v cerebrospinalno tekočino.Najprej so bili farmakodinamični učinki CNS določeni s kombiniranjem vodilnega tranzitnega peptida z zaviralcem peptida BACE1.Poleg dokazovanja, da in vivo funkcionalne presejalne strategije lahko identificirajo nove možganske transportne peptide kot učinkovite nosilce proteinskega tovora, pričakujemo, da bodo podobni funkcionalni selekcijski pristopi postali pomembni tudi pri prepoznavanju novih možganskih transportnih poti.
Na podlagi enot za oblikovanje plakov (PFU) je bila po koraku pakiranja fagov zasnovana in ustvarjena knjižnica naključnih 12-mernih linearnih fagnih peptidov T7 z raznolikostjo približno 109 (glejte Materiali in metode).Pomembno je omeniti, da smo skrbno analizirali to knjižnico pred in vivo premikanjem.PCR pomnoževanje vzorcev knjižnice fagov z uporabo modificiranih primerjev je ustvarilo amplikone, ki so bili neposredno uporabni za HTS (dopolnilna slika 1a).Zaradi a) napak pri zaporedju HTS11, b) vpliva na kakovost primerjev (NNK) 1-12 in c) prisotnosti faga divjega tipa (wt) (vložki okostja) v knjižnici v pripravljenosti je bil izveden postopek filtriranja zaporedja za pridobivanje samo preverjenih informacij o zaporedju (dodatna slika 1b).Ti koraki filtra veljajo za vse knjižnice sekvenciranja HTS.Za standardno knjižnico je bilo pridobljenih skupno 233.868 odčitkov, od katerih jih je 39% prešlo merila filtra in so bili uporabljeni za analizo knjižnice in izbiro za naslednje kroge (dodatna slika 1c–e).Odčitki so bili pretežno večkratniki dolžine 3 baznih parov z vrhom pri 36 nukleotidih (dodatna slika 1c), kar potrjuje zasnovo knjižnice (NNK) 1-12.Predvsem približno 11 % članov knjižnice je vsebovalo 12-dimenzionalni vstavek PAGISRELVDKL hrbtenice divjega tipa (wt), skoraj polovica zaporedij (49 %) pa je vsebovala vstavke ali izbrise.HTS knjižnične knjižnice je potrdil veliko raznolikost peptidov v knjižnici: več kot 81% peptidnih zaporedij je bilo najdenih samo enkrat in le 1, 5% se jih je pojavilo v ≥4 kopijah (dopolnilna slika 2a).Frekvence aminokislin (aa) na vseh 12 položajih v repertoarju so dobro korelirale s frekvencami, pričakovanimi za število kodonov, ki jih ustvari degenerirani repertoar NKK (dodatna slika 2b).Opažena frekvenca ostankov aa, kodiranih s temi vložki, je dobro korelirala z izračunano frekvenco (r = 0,893) (dopolnilna slika 2c).Priprava knjižnic fagov za injiciranje vključuje korake pomnoževanja in odstranitve endotoksina.Prej je bilo dokazano, da to potencialno zmanjšuje raznolikost knjižnic fagov 12,13.Zato smo sekvencirali knjižnico fagov, pomnoženo na plošči, ki je bila podvržena odstranitvi endotoksina, in jo primerjali z izvirno knjižnico, da bi ocenili pogostost AA.Opazili so močno korelacijo (r = 0,995) med prvotnim bazenom ter pomnoženim in prečiščenim bazenom (dodatna slika 2d), kar kaže, da konkurenca med kloni, pomnoženimi na ploščah z uporabo faga T7, ni povzročila večje pristranskosti.Ta primerjava temelji na pogostosti tripeptidnih motivov v vsaki knjižnici, saj raznolikosti knjižnic (~ 109) ni mogoče v celoti zajeti niti s HTS.Frekvenčna analiza aa na vsakem položaju je pokazala majhno pristranskost, odvisno od položaja, v zadnjih treh položajih vnesenega repertoarja (dodatna slika 2e).Na koncu smo ugotovili, da sta kakovost in raznolikost knjižnice sprejemljivi in ​​da so bile opažene le manjše spremembe v raznolikosti zaradi pomnoževanja in priprave knjižnic fagov med več krogi izbire.
Serijsko vzorčenje cerebrospinalne tekočine se lahko izvede s kirurško implantacijo kanile v CM zavestnih podgan, da se olajša identifikacija faga T7, injiciranega intravensko (iv) preko BBB in/ali BCSFB (sl. 1a-b).Uporabili smo dve neodvisni izbirni roki (roki A in B) v prvih treh krogih selekcije in vivo (slika 1c).Postopoma smo povečevali strogost selekcije z zmanjševanjem skupne količine faga, vnesenega v prvih treh krogih selekcije.Za četrti krog paniranja smo združili vzorce iz vej A in B ter izvedli tri dodatne neodvisne selekcije.Za preučevanje in vivo lastnosti delcev faga T7 v tem modelu je bil podganam preko repne vene injiciran fag divjega tipa (glavni vložek PAGISRELVDKL).Obnova fagov iz cerebrospinalne tekočine in krvi v različnih časovnih točkah je pokazala, da so relativno majhni T7 ikozaedrični fagi imeli hitro začetno fazo očistka iz krvnega prostora (dopolnilna slika 3).Na podlagi apliciranih titrov in volumna krvi podgan smo izračunali, da le približno 1 % mas.fag iz apliciranega odmerka je bil odkrit v krvi 10 minut po intravenskem injiciranju.Po tem začetnem hitrem upadu so izmerili počasnejši primarni očistek z razpolovnim časom 27,7 minut.Pomembno je, da je bilo iz predelka CSF pridobljenih le zelo malo fagov, kar kaže na nizko ozadje za migracijo fagov divjega tipa v predel CSF (dopolnilna slika 3).V povprečju je bilo v celotnem obdobju vzorčenja (0-250 min) odkritih le približno 1 x 10-3 % titrov faga T7 v krvi in ​​4 x 10-8 % prvotno infundiranih fagov v cerebrospinalni tekočini.Predvsem je bil razpolovni čas (25,7 min) faga divjega tipa v cerebrospinalni tekočini podoben tistemu, ki so ga opazili v krvi.Ti podatki kažejo, da je pregrada, ki ločuje predel cerebrospinalne tekočine od krvi, nedotaknjena pri podganah s kanilo CM, kar omogoča in vivo selekcijo knjižnic fagov za identifikacijo klonov, ki se zlahka prenesejo iz krvi v predel cerebrospinalne tekočine.
(a) Nastavitev metode za ponovno vzorčenje cerebrospinalne tekočine (CSF) iz velikega bazena.(b) Diagram, ki prikazuje celično lokacijo pregrade centralnega živčnega sistema (CNS) in izbirno strategijo, uporabljeno za identifikacijo peptidov, ki prehajajo krvno-možgansko pregrado (BBB) ​​in krvno-možgansko pregrado.(c) Diagram poteka presejalnega prikaza faga in vivo.V vsakem krogu izbire so bili intravensko injicirani fagi (živalski identifikatorji znotraj puščic).Dve neodvisni alternativni veji (A, B) se hranita ločeno do 4. izbirnega kroga.Za selekcijska kroga 3 in 4 je bil vsak klon faga, ekstrahiran iz CSF, ročno sekvenciran.(d) Kinetika faga, izoliranega iz krvi (rdeči krogi) in cerebrospinalne tekočine (zeleni trikotniki) med prvim krogom selekcije pri dveh kaniliranih podganah po intravenski injekciji knjižnice peptidov T7 (2 x 1012 fagov/žival).Modri ​​kvadratki označujejo povprečno začetno koncentracijo faga v krvi, izračunano iz količine vbrizganega faga ob upoštevanju skupnega volumna krvi.Črni kvadratki označujejo točko presečišča črte y, ekstrapolirane iz koncentracij krvnih fagov.(e,f) Predstavite relativno pogostost in porazdelitev vseh možnih prekrivajočih se tripeptidnih motivov, ki jih najdemo v peptidu.Prikazano je število najdenih motivov v 1000 branjih.Z rdečimi pikami so označeni značilno (p < 0,001) obogateni motivi.(e) Korelacijski razpršeni diagram, ki primerja relativno frekvenco tripeptidnega motiva vbrizgane knjižnice s fagom, pridobljenim iz krvi živali #1.1 in #1.2.(f) Korelacijski razpršeni diagram, ki primerja relativne frekvence tripeptidnih motivov živalskega faga #1.1 in #1.2, izoliranih v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini.(g, h) Predstavitev ID-ja sekvence faga, obogatenega s krvjo (g) v primerjavi z vbrizganimi knjižnicami, in faga, obogatenega s CSF (h) v primerjavi s krvjo po krogu selekcije in vivo pri obeh živalih.Velikost enočrkovne kode kaže, kako pogosto se ta aminokislina pojavi na tem mestu.Zelena = polarna, vijolična = nevtralna, modra = bazična, rdeča = kisle in črna = hidrofobne aminokisline.Sliko 1a, b je oblikoval in izdelal Eduard Urich.
Začetno hitro odstranjevanje knjižnice je bilo manj izrazito v primerjavi s fagom divjega tipa.Povprečni razpolovni čas vbrizgane knjižnice pri obeh živalih je bil 24,8 minut v krvi, podobno kot pri fagu divjega tipa, in 38,5 minut v CSF.Tripeptidni motivi so bili izbrani, ker zagotavljajo minimalno osnovo za tvorbo strukture in interakcije peptid-protein 14, 15.Podatki kažejo, da je sestava knjižnice v krvnem predelu le malo obogatena.Aminokislinske frekvence in konsenzne sekvence so bile nadalje analizirane na vsakem položaju z uporabo prilagoditve programske opreme Weblogo16.Zanimivo je, da smo ugotovili močno obogatitev ostankov glicina v krvi (slika 1g).Ko so kri primerjali s kloni, izbranimi iz CSF, so opazili močno selekcijo in nekaj izbire motivov (slika 1f) in nekatere aminokisline so bile prednostno prisotne na vnaprej določenih položajih v 12-členski (slika 1h).Po strogem filtriranju podatkov o zaporedju v cerebrospinalni tekočini živali #1.1 in #1.2 je bilo pridobljenih skupno 964 in 420 edinstvenih 12-mernih peptidov (dodatna slika 1d-e).Izolirane fagne klone smo pomnožili in podvrgli drugemu krogu selekcije in vivo.Fagi, ekstrahirani iz drugega kroga selekcije, so bili izpostavljeni HTS pri vsaki živali in vsi identificirani peptidi so bili uporabljeni kot vhod v program za prepoznavanje motivov za analizo pojavljanja tripeptidnih motivov (sl. 2a, b, ef).V primerjavi s prvim ciklom faga, pridobljenega iz cerebrospinalne tekočine, smo opazili nadaljnjo selekcijo in preklic izbire številnih motivov v cerebrospinalni tekočini v vejah A in B (slika 2).Za določitev, ali predstavljajo različne vzorce doslednega zaporedja, je bil uporabljen algoritem za identifikacijo omrežja.Opažena je bila jasna podobnost med 12-dimenzionalnimi sekvencami, ki jih je pridobil CSF v alternativnem kladu A (sl. 2c, d) in kladu B (sl. 2g, h).Skupna analiza v vsaki veji je pokazala različne izbirne profile za 12-merne peptide (dopolnilna slika 5c, d) in povečanje razmerja titra CSF/krvi skozi čas za združene klone po drugem krogu selekcije v primerjavi s prvim krogom selekcije (dopolnilna slika 5e).).
Obogatitev motivov in peptidov v cerebrospinalni tekočini z dvema zaporednima krogoma izbire funkcionalnega prikaza fagov in vivo.
Vse fage cerebrospinalne tekočine, pridobljene iz prvega kroga vsake živali (živali #1.1 in #1.2), smo združili, pomnožili, HT-sekvencirali in ponovno injicirali skupaj (2 x 1010 fagov/žival) 2 podganam s kanilo SM (#1.1 → #).2.1 in 2.2, 1.2 → 2.3 in 2.4).(a, b, e, f) Korelacijske razpršitve, ki primerjajo relativno pogostost tripeptidnih motivov vseh fagov, pridobljenih iz CSF, v prvem in drugem izbirnem krogu.Relativna frekvenca in porazdelitev motivov, ki predstavljajo vse možne prekrivajoče se tripeptide, ki jih najdemo v peptidih v obeh usmeritvah.Prikazano je število najdenih motivov v 1000 branjih.Motivi, ki so bili pomembno (p <0,001) izbrani ali izključeni v eni od primerjanih knjižnic, so označeni z rdečimi pikami.(c, d, g, h) Predstavitev logotipa zaporedja vseh s CSF bogatih 12 aminokislin dolgih zaporedij na podlagi 2. in 1. kroga selekcije in vivo.Velikost enočrkovne kode kaže, kako pogosto se ta aminokislina pojavi na tem mestu.Za predstavitev logotipa se primerja pogostost zaporedij cerebrospinalne tekočine, ekstrahiranih iz posameznih živali med dvema izbirnima krogoma, in prikazana so obogatena zaporedja v drugem krogu: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 in (h) #1.2–#2.4.Najbolj obogatene aminokisline na danem mestu pri (c, d) živalih št.2.1 in št.2.2 ali (g, h) pri živalih št.2.3 in št.2.4 so prikazane v barvah.Zelena = polarna, vijolična = nevtralna, modra = bazična, rdeča = kisle in črna = hidrofobne aminokisline.
Po tretjem krogu selekcije smo identificirali 124 edinstvenih peptidnih zaporedij (#3.1 in #3.2) iz 332 fagnih klonov, rekonstituiranih s CSF, izoliranih iz dveh živali (dodatna slika 6a).Zaporedje LGSVS (18,7 %) je imelo največji relativni delež, sledili so mu vstavki divjega tipa PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) in SARGSWREIVSLS (2,2 %).V zadnjem četrtem krogu smo združili dve neodvisno izbrani veji treh ločenih živali (slika 1c).Od 925 sekvenciranih fagnih klonov, pridobljenih iz cerebrospinalne tekočine, smo v četrtem krogu našli 64 edinstvenih peptidnih sekvenc (dopolnilna slika 6b), med katerimi je relativni delež divjega tipa faga padel na 0,8 %.Najpogostejši klonovi CSF v četrtem krogu so bili LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) in RLSSVDSDLSGC (3, 2 %).%)).Razpon dolžin izbranih peptidov je posledica nukleotidnih vstavkov/delecij ali prezgodnjih zaustavitvenih kodonov v knjižničnih začetnih začetnikih pri uporabi degeneriranih kodonov za oblikovanje knjižnice NNK.Prezgodnji stop kodoni ustvarjajo krajše peptide in so izbrani, ker vsebujejo ugoden aa motiv.Daljši peptidi lahko nastanejo zaradi vstavkov/delecij v začetnih začetnikih sintetičnih knjižnic.To postavi oblikovani stop kodon izven okvirja in ga bere, dokler se ni ne pojavi nov stop kodon.Na splošno smo faktorje obogatitve izračunali za vse štiri izbirne kroge s primerjavo vhodnih podatkov z izhodnimi podatki vzorca.Za prvi krog presejanja smo uporabili titre fagov divjega tipa kot nespecifično referenco ozadja.Zanimivo je, da je bila negativna selekcija fagov zelo močna v prvem ciklu cerebrospinalne tekočine, vendar ne v krvi (slika 3a), kar je lahko posledica majhne verjetnosti pasivne difuzije večine članov peptidne knjižnice v predel cerebrospinalne tekočine ali pa se relativni fagi bolj učinkovito zadržijo ali odstranijo iz krvnega obtoka kot bakteriofagi.Vendar pa so v drugem krogu slikanja opazili močno selekcijo fagov v cerebrospinalni tekočini v obeh klasih, kar nakazuje, da je bil prejšnji krog obogaten s fagi, ki prikazujejo peptide, ki spodbujajo privzem cerebrospinalne tekočine (slika 3a).Spet brez znatne obogatitve krvi.Tudi v tretjem in četrtem krogu so bili fagni kloni znatno obogateni s CSF.Če primerjamo relativno frekvenco vsakega edinstvenega peptidnega zaporedja med zadnjima dvema krogoma izbire, smo ugotovili, da so bila zaporedja še bolj obogatena v četrtem krogu izbire (slika 3b).Skupaj 931 tripeptidnih motivov je bilo ekstrahiranih iz vseh 64 edinstvenih peptidnih zaporedij z uporabo obeh peptidnih orientacij.Najbolj obogateni motivi v četrtem krogu so bili natančneje preučeni za njihove profile obogatitve v vseh krogih v primerjavi z vbrizgano knjižnico (mejna vrednost: 10-odstotna obogatitev) (dodatna slika 6c).Splošni vzorci selekcije so pokazali, da je bila večina preučevanih motivov obogatena v vseh prejšnjih krogih obeh selekcijskih vej.Vendar so bili nekateri motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) pretežno iz alternativnega razreda A, medtem ko so bili drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) obogateni z alternativnim klasom B.
Validacija transporta cerebrospinalne tekočine peptidov, prikazanih s fagi, obogatenih s CSF, in biotiniliranih vodilnih peptidov, konjugiranih s streptavidinom.
Faktorji obogatitve za zadnje tri kroge (R2-R4) so ​​bili izračunani s primerjavo s prejšnjim krogom in prvim krogom (R1) s podatki o teži.Odprte črte so cerebrospinalna tekočina, zasenčene palice so plazma.(***p<0,001, na podlagi Studentovega t-testa).(b) Seznam najpogostejših fagnih peptidov, razvrščenih glede na njihov relativni delež glede na vse fage, zbrane v CSF po 4. krogu selekcije.Šest najpogostejših fagnih klonov je označenih z barvo, oštevilčenimi in njihovimi faktorji obogatitve med 3. in 4. krogom selekcije (vstavki).(c, d) Šest najbolj obogatenih fagnih klonov, praznih fagnih in starševskih fagnih peptidnih knjižnic iz 4. kroga smo analizirali posamično v modelu vzorčenja CSF.CSF in vzorce krvi smo zbrali ob navedenih časovnih točkah.(c) Enake količine 6 kandidatnih fagnih klonov (2 x 1010 fagov/žival), praznih fagov (#1779) (2 x 1010 fagov/žival) in osnovnih fagnih peptidnih knjižnic (2 x 1012 fagov/žival). Injicirajte vsaj 3 CM, ki se dajo kanilirani živali ločeno preko repne vene.Prikazana je farmakokinetika cerebrospinalne tekočine vsakega vbrizganega klona faga in knjižnice fagnih peptidov skozi čas.(d) prikazuje povprečno razmerje cerebrospinalne tekočine/kri za vse pridobljene fage/ml v času vzorčenja.(e) Štirje sintetični vodilni peptidi in ena kodirana kontrola so bili povezani z biotinom na streptavidin preko njihovega N-konca (prikaz tetramerja), čemur je sledila injekcija (repna vena iv, 10 mg streptavidina/kg).Vsaj tri intubirane podgane (N = 3).).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na podlagi testa ANOVA).Enaki in podobni fragmenti aminokislin so barvno kodirani.
Od vseh obogatenih fagov v četrtem krogu (slika 3b) je bilo izbranih šest kandidatnih klonov za nadaljnjo individualno analizo v modelu vzorčenja CSF.Enake količine šestih kandidatnih fagov, praznih fagov (brez vložka) in knjižnic profagnih peptidov so bile injicirane v tri kanilirane CM živali, farmakokinetika pa je bila določena v CSF (sl. 3c) in krvi (dodatna slika 7).Vsi testirani fagni kloni so ciljali na predel CSF na ravni, ki je bila 10-1000-krat višja od ravni praznega kontrolnega faga (#1779).Na primer, klona #2020 in #2077 sta imela približno 1000-krat višje titre CSF kot kontrolni fag.Farmakokinetični profil vsakega izbranega peptida je drugačen, vendar imajo vsi visoko sposobnost navajanja CSF.Opazili smo konstantno zmanjšanje skozi čas za klona #1903 in #2011, medtem ko za klone #2077, #2002 in #2009 povečanje v prvih 10 minutah lahko kaže na aktiven transport, vendar ga je treba preveriti.Kloni #2020, #2002 in #2077 so se stabilizirali na visokih ravneh, medtem ko se je koncentracija CSF klona #2009 po začetnem povečanju počasi zmanjšala.Nato smo primerjali relativno pogostnost vsakega kandidata za CSF z njegovo koncentracijo v krvi (slika 3d).Korelacija povprečnega titra vsakega kandidata za cerebrospinalno tekočino z njegovim krvnim titrom ob vseh časih vzorčenja je pokazala, da so bili trije od šestih kandidatov znatno obogateni s krvjo CSF.Zanimivo je, da je klon #2077 pokazal večjo stabilnost krvi (dodatna slika 7).Da bi potrdili, da so sami peptidi sposobni aktivnega transporta tovora, ki ni fagnih delcev, v predel CSF, smo sintetizirali štiri vodilne peptide, derivatizirane z biotinom na N-koncu, kjer se peptidi pritrdijo na fagni delec.Biotinilirane peptide (št. 2002, 2009, 2020 in 2077) smo konjugirali s streptavidinom (SA), da smo dobili multimerne oblike, ki nekoliko posnemajo geometrijo fagov.Ta oblika nam je tudi omogočila merjenje izpostavljenosti SA v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini kot proteinskih peptidih, ki prenašajo tovor.Pomembno je, da se lahko podatki o fagih pogosto reproducirajo, ko so sintetični peptidi dajani v tem SA-konjugiranem formatu (slika 3e).Umešani peptidi so imeli manjšo začetno izpostavljenost in hitrejši očistek CSF z nezaznavnimi nivoji v 48 urah.Da bi pridobili vpogled v dostavne poti teh klonov peptidnih fagov v prostor cerebrospinalne tekočine, smo analizirali lokalizacijo posameznih zadetkov peptidov fagov z uporabo imunohistokemije (IHC) za neposredno odkrivanje delcev fagov 1 uro po intravenski injekciji in vivo.Zlasti klonove #2002, #2077 in #2009 je bilo mogoče odkriti z močnim obarvanjem v možganskih kapilarah, medtem ko kontrolni fag (#1779) in klon #2020 nista bila odkrita (dodatna slika 8).To nakazuje, da ti peptidi prispevajo k učinku na možgane prav s prehajanjem BBB.Za preizkus te hipoteze je potrebna nadaljnja podrobna analiza, saj je lahko vključena tudi pot BSCFB.
Zaradi njegovega edinstvenega plazemskega profila in znatnega povečanja CSF skozi čas je bil klon s fagnim prikazom št. 2077 nadalje raziskan v daljšem 48-urnem obdobju in je bil sposoben reproducirati hitro povečanje CSF, opaženo v povezavi s trajnimi ravnmi SA (slika 4a).Kar zadeva druge identificirane fagne klone, je bil #2077 močno obarvan za možganske kapilare in je pokazal znatno kolokalizacijo s kapilarnim markerjem lektinom, ko smo ga gledali pri višji ločljivosti in morda nekaj obarvanja v parenhimskem prostoru (slika 4b).Da bi raziskali, ali je mogoče doseči farmakološke učinke, posredovane s peptidi, v CNS, smo izvedli poskus, v katerem smo biotinilirane različice i) tranzitnega peptida #2077 in ii) peptida zaviralca BACE1 zmešali s SA v dveh različnih razmerjih.Za eno kombinacijo smo uporabili le zaviralec peptida BACE1, za drugo pa smo uporabili razmerje 1:3 zaviralca peptida BACE1 proti peptidu #2077.Oba vzorca sta bila aplicirana intravenozno in skozi čas so bile izmerjene ravni beta-amiloidnega peptida 40 (Abeta40) v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini.Abeta40 je bila izmerjena v CSF, saj odraža inhibicijo BACE1 v možganskem parenhimu.Kot je bilo pričakovano, sta oba kompleksa znatno zmanjšala koncentracijo Abeta40 v krvi (sl. 4c, d).Vendar le vzorci, ki vsebujejo mešanico peptida št.2077 in zaviralec peptida BACE1, konjugiranega s SA, je povzročil znatno zmanjšanje Abeta40 v cerebrospinalni tekočini (slika 4c).Podatki kažejo, da je peptid št.2077 je sposoben prenesti 60 kDa protein SA v CNS in povzroči tudi farmakološke učinke s SA-konjugiranimi inhibitorji peptida BACE1.
(a) Klonalna injekcija (2 × 10 fagov/žival) faga T7, ki kaže dolgoročne farmakokinetične profile CSF peptida #2077 (RLSSVDSDLSGC) in neinjiciranega kontrolnega faga (#1779) pri vsaj treh podganah, intubiranih s CM.(b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrožil pri podganah, vbrizganih s fagi (2 × 10 10 fagov/žival), ki prikazuje nasprotno barvanje peptida #2077 in žil (lektin).Te fagne klone smo dali 3 podganam in jih pustili krožiti 1 uro pred perfuzijo.Možgani so bili razrezani in obarvani s poliklonalnimi FITC-označenimi protitelesi proti kapsidi faga T7.Deset minut pred perfuzijo in kasnejšo fiksacijo je bil intravensko apliciran lektin, označen z DyLight594.Fluorescentne slike, ki prikazujejo obarvanje lektina (rdeče) luminalne strani mikrožil in fagov (zeleno) v lumnu kapilar in perivaskularnem možganskem tkivu.Lestvica ustreza 10 µm.(c, d) Biotiniliran inhibitorni peptid BACE1 sam ali v kombinaciji z biotiniliranim tranzitnim peptidom #2077 je bil spojen s streptavidinom, čemur je sledila intravenska injekcija vsaj treh kaniliranih CM podgan (10 mg streptavidina/kg).Zmanjšanje Aβ40, posredovano z zaviralcem peptida BACE1, je bilo izmerjeno z Aβ1-40 ELISA v krvi (rdeča) in cerebrospinalni tekočini (oranžna) ob navedenih časovnih točkah.Za večjo jasnost je na grafu narisana črtkana črta v merilu 100 %.(c) Odstotno zmanjšanje Aβ40 v krvi (rdeči trikotniki) in cerebrospinalni tekočini (oranžni trikotniki) pri podganah, zdravljenih s streptavidinom, konjugiranim s tranzitnim peptidom #2077 in inhibitornim peptidom BACE1 v razmerju 3:1.(d) Odstotno zmanjšanje Aβ40 v krvi (rdeči krogi) in cerebrospinalni tekočini (oranžni krogi) pri podganah, zdravljenih s streptavidinom, povezanim samo z inhibitornim peptidom BACE1.Koncentracija Aβ v kontroli je bila 420 pg/ml (standardni odklon = 101 pg/ml).
Prikaz fagov je bil uspešno uporabljen na več področjih biomedicinskih raziskav17.Ta metoda je bila uporabljena za študije vaskularne raznolikosti in vivo 18, 19 kot tudi študije, ki ciljajo na možganske žile 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26.V tej študiji smo razširili uporabo te izbirne metode ne le na neposredno identifikacijo peptidov, ki ciljajo na možganske žile, ampak tudi na odkrivanje kandidatov z aktivnimi transportnimi lastnostmi za prečkanje krvno-možganske pregrade.Zdaj opisujemo razvoj izbirnega postopka in vivo pri podganah, intubiranih s CM, in prikazujemo njegov potencial za identifikacijo peptidov z lastnostmi navajanja CSF.Z uporabo faga T7, ki prikazuje knjižnico 12-mernih naključnih peptidov, smo lahko dokazali, da je fag T7 dovolj majhen (približno 60 nm v premeru)10, da se lahko prilagodi krvno-možganski pregradi in tako neposredno prečka krvno-možgansko pregrado ali horoidni pleksus.Opazili smo, da je bilo zbiranje cerebrospinalne tekočine pri kaniliranih CM podganah dobro nadzorovana in vivo funkcionalna presejalna metoda in da se ekstrahirani fag ne le veže na vaskulaturo, temveč deluje tudi kot prenašalec preko krvno-možganske pregrade.Poleg tega smo s hkratnim zbiranjem krvi in ​​uporabo HTS na cerebrospinalni tekočini in fagih, pridobljenih iz krvi, potrdili, da na našo izbiro cerebrospinalne tekočine ni vplivala obogatitev krvi ali primernost za širjenje med krogi izbire.Vendar pa je krvni del del izbirnega postopka, saj morajo fagi, ki lahko dosežejo predel CSF, preživeti in krožiti v krvnem obtoku dovolj dolgo, da se obogatijo v možganih.Da bi pridobili zanesljive informacije o zaporedju iz neobdelanih podatkov HTS, smo v poteku dela analize implementirali filtre, prilagojene napakam zaporedja, specifičnim za platformo.Z vključitvijo kinetičnih parametrov v presejalno metodo smo potrdili hitro farmakokinetiko fagov divjega tipa T7 (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 in tudi določili njihov razpolovni čas v cerebrospinalni tekočini (t½ ~ 26 min) na minuto).Kljub podobnim farmakokinetičnim profilom v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini je bilo v cerebrospinalni tekočini mogoče zaznati le 0,001 % koncentracije faga v krvi, kar kaže na nizko mobilnost v ozadju divjega tipa faga T7 skozi krvno-možgansko pregrado.To delo poudarja pomen prvega kroga izbire pri uporabi in vivo strategij panninga, zlasti za sisteme fagov, ki se hitro odstranijo iz obtoka, saj le malo klonov lahko doseže predel CNS.Tako je bilo v prvem krogu zmanjšanje knjižnične raznolikosti zelo veliko, saj je bilo v tem zelo strogem modelu CSF na koncu zbrano le omejeno število klonov.Ta strategija paniranja in vivo je vključevala več selekcijskih korakov, kot je aktivno kopičenje v predelu CSF, preživetje klona v krvnem predelu in hitra odstranitev klonov faga T7 iz krvi v prvih 10 minutah (slika 1d in dopolnilna slika 4M).).Tako so bili po prvem krogu v cerebrospinalni tekočini identificirani različni kloni fagov, čeprav je bil za posamezne živali uporabljen isti začetni bazen.To nakazuje, da več strogih izbirnih korakov za izvorne knjižnice z velikim številom članov knjižnice povzroči znatno zmanjšanje raznolikosti.Zato bodo naključni dogodki postali sestavni del začetnega izbirnega procesa, ki bo močno vplival na rezultat.Verjetno je veliko klonov v prvotni knjižnici imelo zelo podobno nagnjenost k obogatitvi CSF.Vendar pa se lahko tudi pod enakimi poskusnimi pogoji rezultati selekcije razlikujejo zaradi majhnega števila vsakega posameznega klona v začetnem bazenu.
Motivi, obogateni s CSF, se razlikujejo od tistih v krvi.Zanimivo je, da smo opazili prvi premik proti peptidom, bogatim z glicinom, v krvi posameznih živali.(Slika 1g, dopolnilni sliki 4e, 4f).Peptidi glicina, ki vsebujejo fage, so lahko bolj stabilni in je manj verjetno, da bodo vzeti iz obtoka.Vendar ti peptidi, bogati z glicinom, niso bili odkriti v vzorcih cerebrospinalne tekočine, kar kaže na to, da so kurirane knjižnice šle skozi dva različna izbirna koraka: enega v krvi in ​​drugega, da se kopiči v cerebrospinalni tekočini.Kloni, obogateni s cerebrospinalno tekočino, ki izhajajo iz četrtega kroga selekcije, so bili obsežno testirani.Potrjeno je bilo, da so skoraj vsi posamično testirani kloni obogateni s CSF v primerjavi s slepim kontrolnim fagom.En peptidni zadetek (#2077) je bil podrobneje pregledan.Pokazal je daljšo razpolovno dobo v plazmi v primerjavi z drugimi zadetki (slika 3d in dodatna slika 7) in zanimivo je, da je ta peptid vseboval ostanek cisteina na C-koncu.Nedavno je bilo dokazano, da lahko dodatek cisteina peptidom izboljša njihove farmakokinetične lastnosti z vezavo na albumin 29.To trenutno ni znano za peptid št. 2077 in zahteva nadaljnje študije.Nekateri peptidi so pokazali valenčno odvisnost pri obogatitvi CSF (podatki niso prikazani), kar je lahko povezano s prikazano površinsko geometrijo kapside T7.Sistem T7, ki smo ga uporabili, je pokazal 5-15 kopij vsakega peptida na delec faga.IHC je bila izvedena na kandidatnih klonih svinčenega faga, injiciranih intravensko v možgansko skorjo podgan (dopolnilna slika 8).Podatki so pokazali, da so vsaj trije kloni (št. 2002, št. 2009 in št. 2077) sodelovali z BBB.Treba je še ugotoviti, ali ta interakcija BBB povzroči kopičenje CSF ali premik teh klonov neposredno v BCSFB.Pomembno je, da pokažemo, da izbrani peptidi ohranijo svojo transportno zmogljivost CSF, ko so sintetizirani in vezani na beljakovinski tovor.Vezava N-terminalnih biotiniliranih peptidov na SA v bistvu ponavlja rezultate, dobljene z njihovimi fagnimi kloni v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini (slika 3e).Končno smo pokazali, da lahko svinčeni peptid št. 2077 spodbudi možgansko delovanje biotiniliranega peptidnega zaviralca BACE1, konjugiranega na SA, kar povzroči izrazite farmakodinamične učinke v CNS s pomembnim znižanjem ravni Abeta40 v CSF (slika 4).V bazi podatkov nismo mogli identificirati nobenih homologov z izvajanjem iskanja homologije peptidnega zaporedja vseh zadetkov.Pomembno je omeniti, da je velikost knjižnice T7 približno 109, medtem ko je teoretična velikost knjižnice za 12-mere 4 x 1015. Zato smo izbrali le majhen del prostora raznolikosti knjižnice 12-mernih peptidov, kar lahko pomeni, da je mogoče identificirati bolj optimizirane peptide z vrednotenjem sosednjega zaporednega prostora teh identificiranih zadetkov.Hipotetično je lahko eden od razlogov, zakaj nismo našli nobenih naravnih homologov teh peptidov, deselekcija med evolucijo, da bi preprečili nenadzorovan vstop določenih peptidnih motivov v možgane.
Naši rezultati skupaj zagotavljajo osnovo za prihodnje delo za podrobnejšo identifikacijo in karakterizacijo transportnih sistemov cerebrovaskularne pregrade in vivo.Osnovna postavitev te metode temelji na funkcionalni selekcijski strategiji, ki ne le identificira klone z lastnostmi cerebralne vaskularne vezave, ampak vključuje tudi kritični korak, v katerem imajo uspešni kloni intrinzično aktivnost za prečkanje bioloških ovir in vivo v predel CNS.je razjasniti mehanizem transporta teh peptidov in njihovo prednost pri vezavi na mikrovaskulaturo, specifično za možgansko regijo.To lahko vodi do odkritja novih poti za transport BBB in receptorjev.Pričakujemo, da se lahko identificirani peptidi neposredno vežejo na cerebrovaskularne receptorje ali na krožeče ligande, ki se prenašajo skozi BBB ali BCSFB.Peptidni vektorji s transportno aktivnostjo cerebrospinalne tekočine, odkriti v tem delu, bodo nadalje raziskani.Trenutno preiskujemo možgansko specifičnost teh peptidov za njihovo sposobnost prehajanja BBB in/ali BCSFB.Ti novi peptidi bodo izjemno dragocena orodja za potencialno odkrivanje novih receptorjev ali poti in za razvoj novih visoko učinkovitih platform za dostavo makromolekul, kot so biološka zdravila, v možgane.
Kanulirajte veliko cisterno (CM) z uporabo modifikacije prej opisane metode.Anestezirane Wistar podgane (200-350 g) smo namestili na stereotaksični aparat in naredili srednji rez čez obrito in aseptično pripravljeno lasišče, da smo izpostavili lobanjo.V predelu zgornjega krila izvrtajte dve luknji in v luknje privijte pritrdilne vijake.Dodatna luknja je bila izvrtana v stranski okcipitalni greben za stereotaktično vodenje kanile iz nerjavečega jekla v CM.Okoli kanile nanesite zobni cement in ga pritrdite z vijaki.Po fotostrjevanju in strjevanju cementa smo kožno rano zaprli s supramidnim šivom 4/0.Pravilno namestitev kanile potrdimo s spontanim iztekanjem cerebrospinalne tekočine (CSF).Odstranite podgano iz stereotaksične naprave, zagotovite ustrezno pooperativno nego in zdravljenje bolečine ter pustite, da si opomore vsaj en teden, dokler v cerebrospinalni tekočini ne opazite znakov krvi.Podgane Wistar (Crl:WI/Han) so bile pridobljene iz reke Charles (Francija).Vse podgane so bile v posebnih pogojih brez patogenov.
Nežno vzdržujte podgano pri zavesti s kanilo CM v roki.Odstranite Daturo iz kanile in zberite 10 µl spontano tekoče cerebrospinalne tekočine.Ker je bila prehodnost kanile končno ogrožena, so bili v to študijo vključeni samo čisti vzorci cerebrospinalne tekočine brez znakov kontaminacije krvi ali razbarvanja.Vzporedno smo iz majhnega reza na konici repa odvzeli približno 10–20 μl krvi v epruvete s heparinom (Sigma-Aldrich).CSF in kri smo zbrali v različnih časovnih točkah po intravenski injekciji faga T7.Pred odvzemom vsakega vzorca CSF je bilo zavrženih približno 5–10 μl tekočine, kar ustreza mrtvi prostornini katetra.
Knjižnice so bile ustvarjene z uporabo vektorja T7Select 10-3b, kot je opisano v sistemskem priročniku T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Na kratko, naključni 12-merni DNK vložek je bil sintetiziran v naslednji obliki:
Kodon NNK je bil uporabljen, da bi se izognili dvojnim stop kodonom in prekomerni ekspresiji aminokislin v vstavku.N je ročno zmešano ekvimolarno razmerje vsakega nukleotida, K pa je ročno zmešano ekvimolarno razmerje nukleotidov adenina in citozina.Enoverižne regije smo pretvorili v dvoverižno DNA z nadaljnjo inkubacijo z dNTP (Novagen) in encimom Klenow (New England Biolabs) v pufru Klenow (New England Biolabs) 3 ure pri 37 °C.Po reakciji smo pridobili dvoverižno DNA z obarjanjem z EtOH.Nastalo DNK smo razgradili z restrikcijskima encimoma EcoRI in HindIII (oba Roche).Razcepljeni in očiščeni (QIAquick, Qiagen) vložek (T4 ligaza, New England Biolabs) je bil nato ligiran v okvirju v predhodno razcepljeni vektor T7 po aminokislini 348 kapsidnega gena 10B.Ligacijske reakcije so bile inkubirane pri 16 °C 18 ur pred in vitro pakiranjem.Pakiranje fagov in vitro je bilo izvedeno v skladu z navodili, priloženimi kompletu za kloniranje T7Select 10-3b (Novagen), raztopina za pakiranje pa je bila enkrat pomnožena do lize z uporabo Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizate smo centrifugirali, titrirali in zamrznili pri -80 °C kot osnovno raztopino glicerola.
Neposredno PCR pomnoževanje variabilnih regij faga, pomnoženih v bujonu ali plošči z uporabo lastniških 454/Roche-amplicon fuzijskih primerjev.Osnovni fuzijski temeljni premaz vsebuje zaporedja, ki obdajajo variabilno regijo (NNK) 12 (specifična za šablono), GS FLX Titanium Adapter A in ključno zaporedje štirih baz knjižnice (TCAG) (dodatna slika 1a):
Primer reverzne fuzije vsebuje tudi biotin, pritrjen na kroglice za zajemanje, in GS FLX Titanium Adapter B, potreben za klonsko pomnoževanje med emulzijsko PCR:
Amplikoni so bili nato izpostavljeni pirosekvenciranju 454/Roche v skladu s protokolom 454 GS-FLX Titanium.Za ročno Sangerjevo sekvenciranje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) je bila DNK faga T7 pomnožena s PCR in sekvencirana z naslednjimi pari primerjev:
Vložke iz posameznih plakov smo podvrgli PCR pomnoževanju z Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (po navodilih proizvajalca).Izvedite vroč zagon (10 min pri 95 °C) in 35 ciklov pospeševanja (50 s pri 95 °C, 1 min pri 50 °C in 1 min pri 72 °C).
Fagi iz knjižnic, fagi divjega tipa, fagi, rešeni iz CSF in krvi, ali posamezni kloni so bili pomnoženi v Escherichia coli BL5615 v TB brozgi (Sigma Aldrich) ali v 500 cm2 posodah (Thermo Scientific) 4 ure pri 37 °C.Fage smo ekstrahirali iz plošč z izpiranjem plošč s pufrom Tris-EDTA (Fluka Analytical) ali z zbiranjem plakov s sterilnimi konicami pipet.Fage smo izolirali iz supernatanta kulture ali ekstrakcijskega pufra z enim krogom obarjanja s polietilenglikolom (PEG 8000) (Promega) in resuspendirali v pufru Tris-EDTA.
Pomnoženi fag je bil podvržen 2-3 krogom odstranitve endotoksina z uporabo kroglic za odstranjevanje endotoksina (Miltenyi Biotec) pred intravensko (IV) injekcijo (500 μl/žival).V prvem krogu je bilo vnesenih 2×1012 fagov;v drugem 2×1010 fagov;v tretjem in četrtem selekcijskem krogu 2×109 fagov na žival.Vsebnost fagov v cerebrospinalni tekočini in vzorcih krvi, zbranih ob navedenih časovnih točkah, je bila določena s štetjem plakov v skladu z navodili proizvajalca (priročnik sistema T7Select).Izbor fagov je bil izveden z intravensko injekcijo prečiščenih knjižnic v repno veno ali s ponovnim injiciranjem faga, ekstrahiranega iz cerebrospinalne tekočine iz prejšnjega izbirnega kroga, nadaljnji odvzemi pa so bili izvedeni po 10 minutah, 30 minutah, 60 minutah, 90 minutah, 120 minutah, 180 minutah in 240 minutah vzorci cerebrospinalne tekočine in krvi.Izvedeni so bili skupno štirje krogi in vivo premikanja, v katerih sta bili dve izbrani veji ločeno shranjeni in analizirani v prvih treh krogih izbire.Vsi fažni vstavki, ekstrahirani iz cerebrospinalne tekočine iz prvih dveh krogov selekcije, so bili izpostavljeni 454/Roche pirosekvenciranju, medtem ko so bili vsi kloni, ekstrahirani iz cerebrospinalne tekočine iz zadnjih dveh krogov selekcije, ročno sekvencirani.Vsi krvni fagi iz prvega kroga selekcije so bili prav tako izpostavljeni pirosekvenciranju 454/Roche.Za injiciranje fagnih klonov smo izbrane fage pomnožili v E. coli (BL5615) na 500 cm2 ploščah pri 37 °C 4 ure.Posamezno izbrane in ročno sekvencirane klone smo razmnoževali v mediju TB.Po ekstrakciji fagov, čiščenju in odstranitvi endotoksina (kot je opisano zgoraj) smo intravensko v eno repno veno injicirali 2 × 1010 fagov/žival v 300 μl.
Predobdelava in kvalitativno filtriranje zaporednih podatkov.Analiza primarnih podatkov vključuje stroge večstopenjske postopke filtriranja.poravnava, ki omogoča do 2 nedoslednosti na poravnavo31.Po prevodu vložka se del za prvim stop kodonom na 5' koncu primerja odstrani iz vložka.Poleg tega so bili odstranjeni tudi nukleotidi, ki vodijo do nepopolnih kodonov na 3' koncu primerja.Da bi izključili vstavke, ki vsebujejo samo zaporedja v ozadju, so bili odstranjeni tudi prevedeni vstavki, ki se začnejo z aminokislinskim vzorcem "PAG".Peptidi s post-translacijsko dolžino manj kot 3 aminokisline so bili odstranjeni iz knjižnice.Na koncu odstranite odvečnost v skupini vstavkov in določite pogostost vsakega edinstvenega vstavljanja.Rezultati te analize so vključevali seznam nukleotidnih zaporedij (vstavkov) in njihovih (branih) frekvenc (dodatni sliki 1c in 2).
Združite vstavke DNK N-mer po podobnosti zaporedja: Za odpravo napak pri zaporedju, značilnih za 454/Roche (kot so težave s sekvenciranjem homopolimernih podaljškov) in odstranitev manj pomembnih presežkov, so predhodno filtrirani vstavki (vstavki) zaporedja N-mer DNK razvrščeni po podobnosti.vstavljanja (dovoljeni sta do 2 neujemajoči se bazi) z uporabo iterativnega algoritma, definiranega na naslednji način: vstavljanja so razvrščena najprej po frekvenci (od najvišjega do najnižjega), in če sta enaka, po sekundarnem razvrščanju po dolžini (od najdaljšega do najkrajšega)).Tako najpogostejši in najdaljši vstavitve določajo prvo »skupino«.Skupinska frekvenca je nastavljena na ključno frekvenco.Nato je bil vsak vstavek, ki je ostal na razvrščenem seznamu, poskušal dodati v skupino s parno poravnavo Needleman-Wunsch.Če število neujemanj, vstavkov ali izbrisov v poravnavi ne preseže praga 2, se v skupino doda vstavitev, skupna pogostost skupine pa se poveča za to, kako pogosto je bila vstavitev dodana.Vložki, dodani v skupino, so označeni kot uporabljeni in izločeni iz nadaljnje obdelave.Če zaporedja vstavljanja ni mogoče dodati že obstoječi skupini, se zaporedje vstavljanja uporabi za ustvarjanje nove skupine z ustrezno pogostostjo vstavljanja in se označi kot uporabljeno.Ponovitev se konča, ko je bilo vsako zaporedje vstavljanja uporabljeno za oblikovanje nove skupine ali pa se lahko vključi v že obstoječo skupino.Konec koncev se združeni vložki, sestavljeni iz nukleotidov, sčasoma prevedejo v peptidne sekvence (peptidne knjižnice).Rezultat te analize je niz vstavkov in njihovih ustreznih frekvenc, ki sestavljajo število zaporednih branj (dodatna slika 2).
Generiranje motiva: Na podlagi seznama edinstvenih peptidov je bila ustvarjena knjižnica, ki vsebuje vse možne vzorce aminokislin (aa), kot je prikazano spodaj.Vsak možni vzorec dolžine 3 je bil ekstrahiran iz peptida in njegov inverzni vzorec je bil dodan skupaj s skupno knjižnico motivov, ki vsebuje vse vzorce (tripeptide).Knjižnice zelo ponavljajočih se motivov so bile razvrščene in redundanca odstranjena.Nato smo za vsak tripeptid v knjižnici motivov z računalniškimi orodji preverili njegovo prisotnost v knjižnici.V tem primeru se frekvenca peptida, ki vsebuje tripeptid najdenega motiva, doda in dodeli motivu v knjižnici motivov (»število motivov«).Rezultat generiranja motiva je dvodimenzionalni niz, ki vsebuje vse pojavitve tripeptidov (motivov) in njihovih ustreznih vrednosti, ki so število odčitkov zaporedja, ki privedejo do ustreznega motiva, ko so odčitki filtrirani, združeni in prevedeni.Meritve, kot je podrobno opisano zgoraj.
Normalizacija števila motivov in ustreznih raztresenih grafov: Število motivov za vsak vzorec je bilo normalizirano z uporabo
kjer je ni število branj, ki vsebujejo temo i.Tako vi predstavlja odstotno frekvenco odčitkov (ali peptidov), ki vsebujejo motiv i v vzorcu.P-vrednosti za nenormalizirano število motivov so bile izračunane z uporabo Fisherjevega natančnega testa.Kar zadeva korelograme števila motivov, so bile Spearmanove korelacije izračunane z uporabo normaliziranega števila motivov z R.
Za vizualizacijo vsebnosti aminokislin na vsakem mestu v knjižnici peptidov so bili ustvarjeni spletni logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Prvič, vsebnost aminokislin na vsakem položaju 12-mernega peptida je shranjena v matriki 20×12.Nato se nabor 1000 peptidov, ki vsebujejo enako relativno vsebnost aminokislin na vsakem položaju, ustvari v formatu hitrega zaporedja in zagotovi kot vhod v spletni logotip 3, ki ustvari grafično predstavitev relativne vsebnosti aminokislin na vsakem položaju.za dano knjižnico peptidov.Za vizualizacijo večdimenzionalnih naborov podatkov so bili toplotni zemljevidi ustvarjeni z interno razvitim orodjem v R (biosHeatmap, paket R, ki še ni bil izdan).Dendrogrami, predstavljeni v toplotnih zemljevidih, so bili izračunani z uporabo Wardove metode hierarhičnega združevanja z metriko evklidske razdalje.Za statistično analizo podatkov o točkovanju motivov so bile vrednosti P za nenormalizirano točkovanje izračunane z uporabo Fisherjevega natančnega testa.P-vrednosti za druge nize podatkov so bile izračunane v R z uporabo Studentovega t-testa ali ANOVA.
Izbrane fagne klone in fage brez vložkov smo injicirali intravensko preko repne vene (2 × 1010 fagov/žival v 300 μl PBS).Deset minut pred perfuzijo in kasnejšo fiksacijo smo istim živalim intravensko injicirali 100 μl lektina, označenega z DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minut po injiciranju faga so podgane perfundirali skozi srce s 50 ml PBS, čemur je sledilo 50 ml 4% PFA/PBS.Vzorci možganov so bili čez noč dodatno fiksirani v 4% PFA/PBS in čez noč namočeni v 30% saharozi pri 4 °C.Vzorci so hitro zamrznjeni v mešanici OCT.Inkubirajte čez noč.Nazadnje smo rezine 3-krat sprali s PBS in jih pregledali s konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Vsi peptidi z minimalno čistostjo 98 % so bili sintetizirani z GenScript USA, biotinilirani in liofilizirani.Biotin je vezan preko dodatnega trojnega glicinskega distančnika na N-koncu.Preverite vse peptide z masno spektrometrijo.
Streptavidin (Sigma S0677) smo zmešali s 5-kratnim ekvimolarnim presežkom biotiniliranega peptida, biotiniliranega inhibitornega peptida BACE1 ali kombinacije (razmerje 3:1) biotiniliranega inhibitornega peptida BACE1 in inhibitornega peptida BACE1 v 5–10 % DMSO/inkubiranega v PBS.1 uro pri sobni temperaturi pred injiciranjem.S streptavidinom konjugirane peptide smo injicirali intravensko v odmerku 10 mg/kg v eno od repnih ven podgan z možgansko votlino.
Koncentracijo kompleksov streptavidin-peptid smo ocenili z ELISA.Mikrotitrske plošče Nunc Maxisorp (Sigma) smo čez noč pri 4 °C prekrili z 1,5 μg/ml mišjega protitelesa proti streptavidinu (Thermo, MA1-20011).Po 2-urnem blokiranju (blokirni pufer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatina, 1 % BSA) pri sobni temperaturi 2 uri, ploščo 3 sekunde spiramo z 0,05 % Tween-20/PBS (izpiralni pufer), v vdolbinice, razredčene z blokirnim pufrom (plazma 1:), dodamo vzorce CSF in plazme. 10.000, CSF 1:115).Ploščo smo nato čez noč inkubirali pri 4 °C z detekcijskim protitelesom (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Po treh korakih pranja je bil streptavidin odkrit z inkubacijo v raztopini substrata TMB (Roche) do 20 minut.Po zaustavitvi razvoja barve z 1 M H2SO4 izmerite absorbanco pri 450 nm.
Delovanje kompleksa streptavidin-peptid-inhibitor BACE1 je bilo ocenjeno z Aβ(1-40) ELISA v skladu s protokolom proizvajalca (Wako, 294-64701).Na kratko, vzorce cerebrospinalne tekočine smo razredčili v standardnem razredčilu (1:23) in inkubirali čez noč pri 4 °C v ploščah s 96 vdolbinicami, prevlečenih s protitelesom za zajemanje BNT77.Po petih korakih pranja smo dodali s HRP-konjugirano protitelo BA27 in ga inkubirali 2 uri pri 4 °C, čemur je sledilo pet korakov pranja.Aβ (1–40) smo odkrili z inkubacijo v raztopini TMB 30 minut pri sobni temperaturi.Ko je razvoj barve ustavljen s stop raztopino, izmerite absorbanco pri 450 nm.Vzorci plazme so bili izpostavljeni ekstrakciji na trdni fazi pred Aβ (1–40) ELISA.Plazmo smo dodali 0,2 % DEA (Sigma) v plošče s 96 vdolbinicami in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut.Po zaporednem izpiranju plošč SPE (Oasis, 186000679) z vodo in 100% metanolom smo na plošče SPE dodali vzorce plazme in odstranili vso tekočino.Vzorce smo sprali (najprej s 5 % metanolom, nato s 30 % metanolom) in eluirali z 2 % NH4OH/90 % metanolom.
Kako citirati ta članek: Urich, E. et al.Dostava tovora v možgane z uporabo tranzitnih peptidov, identificiranih in vivo.znanost.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB in Moos T. Dostava makromolekularnih zdravil v možgane z uporabo ciljne terapije.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brašnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. in Martinez-Martinez, P. Dostava peptidnih in beljakovinskih zdravil čez krvno-možgansko pregrado.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-možganska pregrada: ozko grlo pri razvoju zdravil za možgane.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG in Byrd, A. Obeti za izboljšano dostavo zdravil in ciljanje v možgane preko poti horoidnega pleksusa-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Posodobitev biofarmacevtskih izdelkov z molekularnimi trojanskimi konji za dostavo možganov.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transport peptidov, ki ga posreduje receptor WM, preko krvno-možganske pregrade.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Povečajte prodor v možgane in učinkovitost terapevtskih protiteles z uporabo monovalentnih molekularnih čolnov.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transport receptorja za transferin (TfR) določa možganski privzem afinitetnih različic protiteles TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).