Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo posodobljenega brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev stalne podpore spletno mesto prikazujemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati. Za premikanje med tremi diapozitivi hkrati uporabite gumba Prejšnji in Naslednji ali pa drsnike na koncu za premikanje med tremi diapozitivi hkrati.
Krvno-možganska pregrada in krvno-možganska pregrada preprečujeta, da bi bioterapevtska sredstva dosegla svoje cilje v osrednjem živčnem sistemu, kar ovira učinkovito zdravljenje nevroloških bolezni. Da bi odkrili nove možganske prenašalce in vivo, smo uvedli knjižnico fagnih peptidov T7 in serijsko zbirali kri in cerebrospinalno tekočino (CSF) z uporabo kanuliranega modela velikega bazena pri zavesti podgan. Specifični fagni kloni so bili po štirih krogih selekcije visoko obogateni v CSF. Testiranje posameznih kandidatnih peptidov je pokazalo več kot 1000-kratno obogatitev v CSF. Bioaktivnost peptidno posredovane dostave v možgane je bila potrjena s 40-odstotnim zmanjšanjem ravni amiloida-β v cerebrospinalni tekočini z uporabo zaviralca peptida BACE1, povezanega z identificiranim novim tranzitnim peptidom. Ti rezultati kažejo, da so lahko peptidi, identificirani z metodami selekcije fagov in vivo, koristna sredstva za sistemsko dostavo makromolekul v možgane s terapevtskim učinkom.
Raziskave terapije, usmerjene v centralni živčni sistem (CŽS), so se večinoma osredotočale na prepoznavanje optimiziranih zdravil in učinkovin, ki kažejo lastnosti, usmerjene v CŽS, z manj truda, namenjenega odkrivanju mehanizmov, ki spodbujajo aktivno dostavo zdravil v možgane. To se zdaj začenja spreminjati, saj je dostava zdravil, zlasti velikih molekul, sestavni del sodobnega razvoja zdravil v nevroznanosti. Okolje centralnega živčnega sistema je dobro zaščiteno s sistemom cerebrovaskularne pregrade, ki ga sestavljata krvno-možganska pregrada (KMP) in krvno-možganska pregrada (KMP)1, zaradi česar je dostava zdravil v možgane zahtevna1,2. Ocenjuje se, da se skoraj vsa zdravila z velikimi molekulami in več kot 98 % zdravil z majhnimi molekulami izloči iz možganov3. Zato je zelo pomembno prepoznati nove sisteme za prenos zdravil v možgane, ki zagotavljajo učinkovito in specifično dostavo terapevtskih zdravil v CŽS4,5. Vendar pa KMP in KMP predstavljata tudi odlično priložnost za dostavo zdravil, saj prodirajo in vstopajo v vse strukture možganov skozi njihovo obsežno žilje. Zato trenutna prizadevanja za uporabo neinvazivnih metod dostave v možgane v veliki meri temeljijo na mehanizmu receptorsko posredovanega transporta (PMT) z uporabo endogenega receptorja BBB6. Kljub nedavnemu ključnemu napredku pri uporabi poti transferinskega receptorja7,8 je potreben nadaljnji razvoj novih sistemov za dostavo z izboljšanimi lastnostmi. V ta namen je bil naš cilj identificirati peptide, ki lahko posredujejo pri transportu v cerebrospinalni tekočini (CSF), saj bi jih načeloma lahko uporabili za dostavo makromolekul v CNS ali za odpiranje novih receptorskih poti. Zlasti specifični receptorji in transporterji cerebrospinalnega sistema (BBB in BSCFB) lahko služijo kot potencialne tarče za aktivno in specifično dostavo bioterapevtskih zdravil. Likvor (CSF) je sekretorni produkt horoidnega pleksusa (KS) in je v neposrednem stiku z intersticijsko tekočino možganov skozi subarahnoidni prostor in ventrikularni prostor4. Nedavno je bilo dokazano, da subarahnoidna cerebrospinalna tekočina prekomerno difundira v intersticij možganov9. Upamo, da bomo lahko dostopali do parenhimskega prostora z uporabo tega subarahnoidnega dovodnega trakta ali neposredno skozi krvno-možgansko bariero (BBB). Da bi to dosegli, smo uvedli robustno strategijo selekcije fagov in vivo, ki idealno identificira peptide, ki se prenašajo po kateri koli od teh dveh različnih poti.
Opisujemo metodo zaporednega in vivo presejanja fagov z vzorčenjem cerebrospinalne tekočine (CSF), povezano z visokozmogljivim sekvenciranjem (HTS), za spremljanje začetnih krogov selekcije z največjo raznolikostjo knjižnic. Presejanje je bilo izvedeno na zavestnih podganah s trajno vsajeno kanilo velike cisterne (CM), da se prepreči kontaminacija krvi. Pomembno je, da ta pristop izbere tako peptide, ki ciljajo na možgane, kot tudi peptide s transportno aktivnostjo čez cerebrovaskularno pregrado. Uporabili smo fage T7 zaradi njihove majhnosti (~60 nm)10 in predlagali, da so primerni za transport veziklov, ki omogočajo transcelularno prehajanje endotelijske in/ali epitelijsko-medularne pregrade. Po štirih krogih iskanja smo izolirali populacije fagov, ki kažejo močno in vivo obogatitev CSF in povezavo z možganskimi mikrovili. Pomembno je, da smo lahko potrdili naše ugotovitve z dokazom, da so prednostni in kemično sintetizirani najboljši kandidatni peptidi sposobni prenašati beljakovinski tovor v cerebrospinalno tekočino. Najprej smo ugotovili farmakodinamične učinke CNS z združevanjem vodilnega tranzitnega peptida z inhibitorjem peptida BACE1. Poleg tega, da dokazujemo, da lahko strategije funkcionalnega presejanja in vivo prepoznajo nove peptide za prenos možganov kot učinkovite nosilce beljakovin, pričakujemo, da bodo podobni pristopi funkcionalne selekcije postali pomembni tudi pri prepoznavanju novih poti prenosa možganov.
Na podlagi enot, ki tvorijo plake (PFU), je bila po koraku pakiranja fagov zasnovana in ustvarjena knjižnica naključnih 12-mernih linearnih fagnih peptidov T7 z raznolikostjo približno 109 (glejte Materiali in metode). Pomembno je omeniti, da smo to knjižnico pred in vivo panningom skrbno analizirali. PCR amplifikacija vzorcev fagnih knjižnic z uporabo modificiranih primerjev je ustvarila amplikone, ki so bili neposredno uporabni za HTS (dodatna slika 1a). Zaradi a) napak v sekvenciranju HTS11, b) vpliva na kakovost primerjev (NNK)1-12 in c) prisotnosti faga divjega tipa (wt) (skeletni vložki) v rezervni knjižnici je bil izveden postopek filtriranja zaporedja za ekstrakcijo samo preverjenih informacij o zaporedju (dodatna slika 1b). Ti koraki filtriranja veljajo za vse knjižnice za sekvenciranje HTS. Za standardno knjižnico je bilo pridobljenih skupno 233.868 odčitkov, od katerih jih je 39 % prestalo merila filtra in je bilo uporabljenih za analizo in izbor knjižnice za nadaljnje kroge (dodatna slika 1c–e). Odčitki so bili pretežno večkratniki treh baznih parov z vrhom pri 36 nukleotidih (dodatna slika 1c), kar potrjuje zasnovo knjižnice (NNK) 1-12. Omeniti velja, da je približno 11 % članov knjižnice vsebovalo 12-dimenzionalni vložek PAGISRELVDKL divjega tipa (wt), skoraj polovica zaporedij (49 %) pa je vsebovala insercije ali delecije. HTS knjižnične knjižnice je potrdil veliko raznolikost peptidov v knjižnici: več kot 81 % peptidnih zaporedij je bilo najdenih le enkrat in le 1,5 % se jih je pojavilo v ≥4 kopijah (dodatna slika 2a). Frekvence aminokislin (aa) na vseh 12 položajih v repertoarju so se dobro ujemale s frekvencami, pričakovanimi za število kodonov, ki jih generira degenerirani repertoar NKK (dodatna slika 2b). Opazovana frekvenca ostankov aa, kodiranih s temi inserti, se je dobro ujemala z izračunano frekvenco (r = 0,893) (dodatna slika 2c). Priprava fagnih knjižnic za injiciranje vključuje koraka amplifikacije in odstranitve endotoksina. Predhodno je bilo dokazano, da to potencialno zmanjšuje raznolikost fagnih knjižnic12,13. Zato smo sekvencirali fagno knjižnico, amplificirano na plošči, ki je bila podvržena odstranitvi endotoksina, in jo primerjali z originalno knjižnico, da bi ocenili pogostost aminokislin (AA). Med originalnim skupom in amplificiranim in prečiščenim skupom je bila opažena močna korelacija (r = 0,995), kar kaže, da tekmovanje med kloni, amplificiranimi na ploščah z uporabo faga T7, ni povzročilo večje pristranskosti. Ta primerjava temelji na pogostosti tripeptidnih motivov v vsaki knjižnici, saj raznolikosti knjižnic (~109) ni mogoče v celoti zajeti niti s HTS. Frekvenčna analiza aminokislin na vsakem položaju je pokazala majhno pristranskost, odvisno od položaja, na zadnjih treh položajih vnesenega repertoarja (dodatna slika 2e). Skratka, ugotovili smo, da sta bili kakovost in raznolikost knjižnice sprejemljivi in ​​da so bile zaradi amplifikacije in priprave fagnih knjižnic med več krogi selekcije opažene le manjše spremembe v raznolikosti.
Serijsko vzorčenje cerebrospinalne tekočine se lahko izvede s kirurško implantacijo kanile v cerebrospinalni ovoj pri zavestnih podganah, da se olajša identifikacija faga T7, ki je bil injiciran intravensko (iv) preko krvno-možganske barijere (BBB) ​​in/ali BCSFB (slika 1a-b). V prvih treh krogih in vivo selekcije smo uporabili dve neodvisni selekcijski veji (veji A in B) (slika 1c). Postopoma smo povečevali strogost selekcije z zmanjševanjem skupne količine faga, vnesenega v prvih treh krogih selekcije. Za četrti krog iskanja smo združili vzorce iz vej A in B ter izvedli tri dodatne neodvisne selekcije. Za preučevanje lastnosti in vivo delcev faga T7 v tem modelu smo podganam injicirali fag divjega tipa (glavni vložek PAGISRELVDKL) preko repne vene. Pridobivanje fagov iz cerebrospinalne tekočine in krvi v različnih časovnih točkah je pokazalo, da so imeli relativno majhni ikozaedrski fagi T7 hitro začetno fazo očistka iz krvnega predela (dodatna slika 3). Na podlagi danih titrov in volumna krvi podgan smo izračunali, da je bilo 10 minut po intravenski injekciji v krvi zaznanih le približno 1 % mas. faga iz danega odmerka. Po tem začetnem hitrem upadu je bil izmerjen počasnejši primarni očistek z razpolovno dobo 27,7 minute. Pomembno je, da je bilo iz predela cerebrospinalne tekočine pridobljenih le zelo malo fagov, kar kaže na nizko ozadje za migracijo fagov divjega tipa v predel cerebrospinalne tekočine (dodatna slika 3). V povprečju je bilo v celotnem obdobju vzorčenja (0–250 min) v cerebrospinalni tekočini zaznanih le približno 1 x 10⁻⁹ % titrov faga T7 v krvi in ​​4 x 10⁻⁹ % začetno infundiranih fagov. Omeniti velja, da je bil razpolovni čas (25,7 min) faga divjega tipa v cerebrospinalni tekočini podoben tistemu, ki smo ga opazili v krvi. Ti podatki kažejo, da je pregrada, ki ločuje predel cerebrospinalne tekočine od krvi, pri podganah s kaniloma, ki jim je bil vstavljen kongenitalni medij, nedotaknjena, kar omogoča in vivo selekcijo fagnih knjižnic za identifikacijo klonov, ki se zlahka prenašajo iz krvi v predel cerebrospinalne tekočine.
(a) Vzpostavitev metode za ponovno vzorčenje cerebrospinalne tekočine (CSF) iz velikega bazena. (b) Diagram, ki prikazuje celično lokacijo pregrade centralnega živčnega sistema (CŽS) in strategijo selekcije, uporabljeno za identifikacijo peptidov, ki prečkajo krvno-možgansko pregrado (KMB) ​​in krvno-možgansko pregrado. (c) Diagram poteka presejanja fagov in vivo. V vsakem krogu selekcije so bili fagi (živalski identifikatorji znotraj puščic) injicirani intravensko. Dve neodvisni alternativni veji (A, B) sta bili ločeno shranjeni do 4. kroga selekcije. V 3. in 4. krogu selekcije je bil vsak fagni klon, ekstrahiran iz CSF, ročno sekvenciran. (d) Kinetika faga, izoliranega iz krvi (rdeči krogi) in cerebrospinalne tekočine (zeleni trikotniki) med prvim krogom selekcije pri dveh kanuliranih podganah po intravenski injekciji knjižnice peptidov T7 (2 x 1012 fagov/žival). Modri ​​kvadratki označujejo povprečno začetno koncentracijo faga v krvi, izračunano iz količine injiciranega faga, ob upoštevanju celotnega volumna krvi. Črni kvadratki označujejo presečišče y-črte, ekstrapolirane iz koncentracij fagov v krvi. (e,f) Predstavljamo relativno pogostost in porazdelitev vseh možnih prekrivajočih se tripeptidnih motivov, najdenih v peptidu. Prikazano je število motivov, najdenih v 1000 odčitkih. Stacionarno (p < 0,001) obogateni motivi so označeni z rdečimi pikami. (e) Korelacijski razpršeni diagram, ki primerja relativno pogostost tripeptidnega motiva vbrizgane knjižnice s fagom, pridobljenim iz krvi živali št. 1.1 in št. 1.2. (f) Korelacijski razpršeni diagram, ki primerja relativne pogostosti tripeptidnih motivov živalskih fagov št. 1.1 in št. 1.2, izoliranih v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini. (g, h) Predstavitev zaporedne identifikacije faga, obogatenega s krvjo (g), v primerjavi z vbrizganimi knjižnicami in fagom, obogatenim s cerebrospinalno tekočino (h), v primerjavi s krvjo po krogu selekcije in vivo pri obeh živalih. Velikost enočrkovne kode označuje, kako pogosto se ta aminokislina pojavlja na tem položaju. Zelena = polarna, vijolična = nevtralna, modra = bazična, rdeča = kisla in črna = hidrofobne aminokisline. Sliki 1a, b je zasnoval in izdelal Eduard Urich.
Dvema podganama z instrumentalno CM (klada A in B) smo injicirali knjižnico fagnih peptidov in izolirali fag iz cerebrospinalne tekočine in krvi (slika 1d). Začetno hitro čiščenje knjižnice je bilo manj izrazito v primerjavi s fagom divjega tipa. Povprečni razpolovni čas injicirane knjižnice pri obeh živalih je bil v krvi 24,8 minute, podobno kot pri fagu divjega tipa, in 38,5 minute v cerebrospinalni tekočini. Vzorce fagov krvi in ​​cerebrospinalne tekočine vsake živali smo podvrgli HTS in vse identificirane peptide smo analizirali na prisotnost kratkega tripeptidnega motiva. Tripeptidni motivi so bili izbrani, ker zagotavljajo minimalno osnovo za tvorbo strukture in interakcije peptid-protein14,15. Ugotovili smo dobro korelacijo v porazdelitvi motivov med injicirano knjižnico fagov in kloni, ekstrahiranimi iz krvi obeh živali (slika 1e). Podatki kažejo, da je sestava knjižnice v krvnem predelu le malo obogatena. Frekvence aminokislin in konsenzna zaporedja smo nadalje analizirali na vsakem položaju z uporabo prilagoditve programske opreme Weblogo16. Zanimivo je, da smo ugotovili močno obogatitev krvi z ostanki glicina (slika 1g). Pri primerjavi krvi s kloni, izbranimi iz cerebrospinalne tekočine, smo opazili močno selekcijo in nekaj deselekcije motivov (slika 1f), nekatere aminokisline pa so bile prednostno prisotne na vnaprej določenih položajih v 12-členskem členu (slika 1h). Omeniti velja, da so se posamezne živali bistveno razlikovale v cerebrospinalni tekočini, medtem ko smo pri obeh živalih opazili obogatitev krvi z glicinom (dodatna slika 4a–j). Po strogem filtriranju podatkov o zaporedju v cerebrospinalni tekočini živali št. 1.1 in št. 1.2 smo dobili skupno 964 oziroma 420 edinstvenih 12-mernih peptidov (dodatna slika 1d–e). Izolirane fagne klone smo pomnožili in podvrgli drugemu krogu selekcije in vivo. Fagi, ekstrahirani iz drugega kroga selekcije, so bili pri vsaki živali podvrženi HTS in vsi identificirani peptidi so bili uporabljeni kot vhodni podatki za program za prepoznavanje motivov za analizo pojavljanja tripeptidnih motivov (slika 2a, b, ef). V primerjavi s prvim ciklom faga, pridobljenega iz cerebrospinalne tekočine (CSF), smo v vejah A in B opazili nadaljnjo selekcijo in deselekcijo številnih motivov v CSF (slika 2). Uporabljen je bil algoritem za identifikacijo omrežja, da bi ugotovili, ali predstavljajo različne vzorce skladnega zaporedja. Opazili smo jasno podobnost med 12-dimenzionalnimi zaporedji, pridobljenimi s CSF, v alternativni kladi A (slika 2c, d) in kladi B (slika 2g, h). Skupna analiza v vsaki veji je pokazala različne selekcijske profile za 12-merne peptide (dodatna slika 5c, d) in povečanje razmerja titer CSF/krv sčasoma za združene klone po drugem krogu selekcije v primerjavi s prvim krogom selekcije (dodatna slika 5e).
Obogatitev motivov in peptidov v cerebrospinalni tekočini z dvema zaporednima krogoma selekcije funkcionalnega fagnega prikaza in vivo.
Vsi fagi iz cerebrospinalne tekočine, pridobljeni iz prvega kroga vsake živali (živali št. 1.1 in št. 1.2), so bili združeni, pomnoženi, HT-sekvencirani in ponovno injicirani skupaj (2 x 1010 fagov/žival) 2 podganama s kanulirano SM (št. 1.1 → št.). 2.1 in 2.2, 1.2 → 2.3 in 2.4). (a, b, e, f) Korelacijski razpršeni diagrami, ki primerjajo relativno pogostost tripeptidnih motivov vseh fagov, pridobljenih iz cerebrospinalne tekočine, v prvem in drugem krogu izbora. Relativna pogostost in porazdelitev motivov, ki predstavljajo vse možne prekrivajoče se tripeptide, najdene v peptidih v obeh orientacijah. Prikazano je število motivov, najdenih v 1000 odčitkih. Motivi, ki so bili v eni od primerjanih knjižnic statistično značilno (p < 0,001) izbrani ali izključeni, so označeni z rdečimi pikami. (c, d, g, h) Predstavitev logotipa zaporedja vseh zaporedij, dolgih 12 aminokislin, bogatih s cerebrospinalno tekočino (CSF), na podlagi 2. in 1. kroga selekcije in vivo. Velikost enočrkovne kode označuje, kako pogosto se ta aminokislina pojavlja na tem položaju. Za predstavitev logotipa se primerja pogostost zaporedij CSF, ekstrahiranih iz posameznih živali med dvema krogoma selekcije, in prikažejo se obogatena zaporedja v drugem krogu: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 in (h) #1.2–#2.4. Najbolj obogatene aminokisline na danem položaju pri (c, d) živalih št. 2.1 in št. 2.2 ali (g, h) pri živalih št. 2.3 in št. 2.4 so prikazane v barvah. Zelena = polarna, vijolična = nevtralna, modra = bazična, rdeča = kisla in črna = hidrofobne aminokisline.
Po tretjem krogu selekcije smo identificirali 124 edinstvenih peptidnih zaporedij (#3.1 in #3.2) iz 332 fagnih klonov, rekonstituiranih iz cerebrospinalne tekočine (CSF), izoliranih iz dveh živali (dodatna slika 6a). Zaporedje LGSVS (18,7 %) je imelo najvišji relativni delež, sledili so mu vstavki divjega tipa PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) in SARGSWREIVSLS (2,2 %). V zadnjem četrtem krogu smo združili dve neodvisno izbrani veji iz treh ločenih živali (slika 1c). Od 925 sekvenciranih fagnih klonov, pridobljenih iz CSF, smo v četrtem krogu našli 64 edinstvenih peptidnih zaporedij (dodatna slika 6b), med katerimi se je relativni delež faga divjega tipa zmanjšal na 0,8 %. Najpogostejši kloni CSF v četrtem krogu so bili LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) in RLSSVDSDLSGC (3,2 %). Razpon dolžin izbranih peptidov je posledica vstavkov/delecij nukleotidov ali prezgodnjih stop kodonov v začetnih oligonukleotidih knjižnice pri uporabi degeneriranih kodonov za načrtovanje knjižnice NNK. Prezgodnji stop kodoni ustvarjajo krajše peptide in so izbrani, ker vsebujejo ugoden motiv aminokisline (aminokisline). Daljši peptidi lahko nastanejo zaradi vstavkov/delecij v začetnih oligonukleotidih sintetičnih knjižnic. To postavi zasnovan stop kodon zunaj okvirja in ga bere, dokler se ne pojavi nov stop kodon nižje v verigi. Na splošno smo izračunali faktorje obogatitve za vse štiri kroge izbora s primerjavo vhodnih podatkov z izhodnimi podatki vzorca. Za prvi krog presejanja smo kot nespecifično referenčno ozadje uporabili titre fagov divjega tipa. Zanimivo je, da je bila negativna selekcija fagov zelo močna v prvem ciklu cerebrospinalne tekočine (CSF), ne pa tudi v krvi (slika 3a), kar je lahko posledica nizke verjetnosti pasivne difuzije večine članov peptidne knjižnice v predel CSF ali pa se relativni fagi učinkoviteje zadržujejo ali odstranjujejo iz krvnega obtoka kot bakteriofagi. Vendar pa je bila v drugem krogu iskanja v obeh kladah opažena močna selekcija fagov v CSF, kar kaže na to, da je bil prejšnji krog obogaten s fagi, ki prikazujejo peptide, ki spodbujajo privzem CSF (slika 3a). Ponovno brez znatne obogatitve krvi. Tudi v tretjem in četrtem krogu so bili fagni kloni znatno obogateni v CSF. Če primerjamo relativno frekvenco vsakega edinstvenega peptidnega zaporedja med zadnjima dvema krogoma selekcije, smo ugotovili, da so bila zaporedja v četrtem krogu selekcije še bolj obogatena (slika 3b). Iz vseh 64 edinstvenih peptidnih zaporedij je bilo z uporabo obeh peptidnih orientacij ekstrahiranih skupno 931 tripeptidnih motivov. Najbolj obogateni motivi v četrtem krogu so bili podrobneje pregledani glede profilov obogatitve v vseh krogih v primerjavi z vbrizgano knjižnico (mejna vrednost: 10-odstotna obogatitev) (dodatna slika 6c). Splošni vzorci selekcije so pokazali, da je bila večina preučevanih motivov obogatena v vseh prejšnjih krogih obeh selekcijskih vej. Vendar pa so bili nekateri motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) pretežno iz alternativnega klada A, medtem ko so bili drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) obogateni v alternativnem kladu B.
Validacija transporta fagno prikazanih peptidov, obogatenih s cerebrospinalno tekočino, in biotiniliranih vodilnih peptidov, konjugiranih s streptavidinskimi koristnimi tovori, v cerebrospinalni tekočini (CSF).
(a) Razmerja obogatitve, izračunana v vseh štirih krogih (R1-R4) na podlagi titrov vbrizganih (vnos = I) fagov (PFU) in določenih titrov fagov v cerebrospinalni tekočini (izhod = O). Faktorji obogatitve za zadnje tri kroge (R2-R4) so ​​bili izračunani s primerjavo s prejšnjim krogom in prvim krogom (R1) s podatki o teži. Prazni stolpci predstavljajo cerebrospinalno tekočino, osenčeni stolpci pa plazmo. (***p<0,001, na podlagi Studentovega t-testa). (b) Seznam najpogostejših fagnih peptidov, razvrščenih glede na njihov relativni delež glede na vse fage, zbrane v cerebrospinalni tekočini po 4. krogu selekcije. Šest najpogostejših fagnih klonov je označenih z barvo, oštevilčenih, njihovi faktorji obogatitve pa so prikazani med 3. in 4. krogom selekcije (vstavki). (c,d) Šest najbolj obogatenih fagnih klonov, prazni fagi in starševske knjižnice fagnih peptidov iz 4. kroga so bili analizirani posamično v modelu vzorčenja cerebrospinalne tekočine. Vzorci cerebrospinalne tekočine in krvi so bili zbrani v navedenih časovnih točkah. (c) Enake količine 6 kandidatnih fagnih klonov (2 x 1010 fagov/živali), praznih fagov (#1779) (2 x 1010 fagov/živali) in osnovnih knjižnic fagnih peptidov (2 x 1012 fagov/živali). Vsaj 3 CM se injicira ločeno kanilirani živali preko repne vene. Prikazana je farmakokinetika cerebrospinalne tekočine (CSF) vsakega injiciranega fagnega klona in knjižnice fagnih peptidov skozi čas. (d) prikazuje povprečno razmerje CSF/kri za vse pridobljene fage/ml v času vzorčenja. (e) Štirje sintetični vodilni peptidi in en premešani kontrolni peptid so bili povezani z biotinom na streptavidin preko njihovega N-terminusa (tetramerni prikaz), čemur je sledila injekcija (repna vena iv, 10 mg streptavidina/kg). Vsaj tri intubirane podgane (N = 3). Vzorci cerebrospinalne tekočine (CSF) so bili odvzeti ob navedenih časovnih točkah, koncentracije streptavidina pa so bile izmerjene z ELISA testom proti streptavidinu v CSF (nd = ni zaznan). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na podlagi testa ANOVA). (f) Primerjava aminokislinskega zaporedja najbolj obogatenega klona fagnega peptida št. 2002 (vijolična) z drugimi izbranimi kloni fagnih peptidov iz 4. kroga selekcije. Identični in podobni aminokislinski fragmenti so barvno kodirani.
Od vseh obogatenih fagov v četrtem krogu (slika 3b) je bilo šest kandidatnih klonov izbranih za nadaljnjo individualno analizo v modelu vzorčenja cerebrospinalne tekočine (CSF). Enake količine knjižnic šestih kandidatnih fagov, praznih fagov (brez vstavka) in profagnih peptidov so bile injicirane v tri kanulirane živali s kongenitalno melanocitno boleznijo (CM), farmakokinetika pa je bila določena v testih CSF (slika 3c) in krvi (dodatna slika 7). Vsi testirani fagni kloni so ciljali na predel CSF na ravni, ki je bila 10–1000-krat višja od ravni praznega kontrolnega faga (#1779). Na primer, klona #2020 in #2077 sta imela približno 1000-krat višje titre v CSF kot kontrolni fag. Farmakokinetični profil vsakega izbranega peptida je drugačen, vendar imajo vsi visoko sposobnost usmerjanja v CSF. Pri klonih št. 1903 in št. 2011 smo sčasoma opazili stalno zmanjševanje, medtem ko bi pri klonih št. 2077, št. 2002 in št. 2009 povečanje v prvih 10 minutah lahko kazalo na aktivni transport, vendar je to treba preveriti. Kloni št. 2020, št. 2002 in št. 2077 so se stabilizirali na visokih ravneh, medtem ko se je koncentracija klona št. 2009 v cerebrospinalni tekočini po začetnem povečanju počasi zmanjševala. Nato smo primerjali relativno pogostost vsakega kandidata v cerebrospinalni tekočini z njegovo koncentracijo v krvi (slika 3d). Korelacija povprečnega titra vsakega kandidata v cerebrospinalni tekočini z njegovim titrom v krvi pri vseh časih vzorčenja je pokazala, da so bili trije od šestih kandidatov znatno obogateni s krvno cerebrospinalno tekočino. Zanimivo je, da je klon št. 2077 pokazal večjo stabilnost v krvi (dodatna slika 7). Da bi potrdili, da so peptidi sami sposobni aktivno prenašati tovor, ki ni fagni delci, v predel cerebrospinalne tekočine, smo sintetizirali štiri vodilne peptide, derivatizirane z biotinom na N-terminalu, kjer se peptidi vežejo na fagni delec. Biotinilirane peptide (št. 2002, 2009, 2020 in 2077) smo konjugirali s streptavidinom (SA), da smo dobili multimerne oblike, ki so nekoliko posnemale geometrijo faga. Ta oblika nam je omogočila tudi merjenje izpostavljenosti SA v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini kot beljakovinskih peptidov, ki prenašajo tovor. Pomembno je, da smo podatke o fagih pogosto lahko reproducirali, ko smo sintetične peptide dajali v tej obliki, konjugirani s SA (slika 3e). Zmešani peptidi so imeli manjšo začetno izpostavljenost in hitrejše izločanje iz cerebrospinalne tekočine z nezaznavnimi ravnmi v 48 urah. Da bi dobili vpogled v poti dostave teh peptidnih fagnih klonov v cerebrospinalno tekočino, smo analizirali lokalizacijo posameznih zadetkov fagnih peptidov z uporabo imunohistokemije (IHC) za neposredno zaznavanje fagnih delcev 1 uro po intravenski injekciji in vivo. Omeniti velja, da so kloni št. 2002, št. 2077 in št. 2009 lahko zaznali z močnim obarvanjem v možganskih kapilarah, medtem ko kontrolni fag (št. 1779) in klon št. 2020 nista bila zaznana (dodatna slika 8). To kaže, da ti peptidi prispevajo k učinku na možgane prav s prečkanjem KMB. Za preizkus te hipoteze je potrebna nadaljnja podrobna analiza, saj je lahko vključena tudi pot BSCFB. Pri primerjavi aminokislinskega zaporedja najbolj obogatenega klona (št. 2002) z drugimi izbranimi peptidi je bilo ugotovljeno, da imajo nekateri od njih podobne aminokislinske podaljške, kar lahko kaže na podoben transportni mehanizem (slika 3f).
Zaradi svojega edinstvenega plazemskega profila in znatnega povečanja cerebrospinalne tekočine skozi čas je bil fagni klon št. 2077 nadalje raziskan v daljšem 48-urnem obdobju in je lahko reproduciral hitro povečanje cerebrospinalne tekočine, opaženo v povezavi s trajnimi ravnmi SA (slika 4a). Kar zadeva druge identificirane fagne klone, se je #2077 močno obarval za možganske kapilare in pokazal znatno kolokalizacijo s kapilarnim markerjem lektinom, ko smo ga opazovali pri višji ločljivosti, in morda nekaj obarvanja v parenhimskem prostoru (slika 4b). Da bi raziskali, ali je mogoče doseči farmakološke učinke, ki jih posredujejo peptidi, v CNS, smo izvedli poskus, v katerem smo biotinilirane različice i) tranzitnega peptida #2077 in ii) peptida inhibitorja BACE1 zmešali s SA v dveh različnih razmerjih. Za eno kombinacijo smo uporabili samo zaviralec peptida BACE1, za drugo pa smo uporabili razmerje 1:3 med zaviralcem peptida BACE1 in peptidom #2077. Oba vzorca smo aplicirali intravensko, ravni beta-amiloidnega peptida 40 (Abeta40) v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini pa smo merili skozi čas. Abeta40 je bil izmerjen v cerebrospinalni tekočini (CSF), saj odraža inhibicijo BACE1 v možganskem parenhimu. Kot je bilo pričakovano, sta oba kompleksa znatno znižala raven Abeta40 v krvi (slika 4c, d). Vendar pa so le vzorci, ki so vsebovali mešanico peptida št. 2077 in inhibitorja peptida BACE1, konjugiranega s SA, povzročili znatno zmanjšanje Abeta40 v cerebrospinalni tekočini (slika 4c). Podatki kažejo, da je peptid št. 2077 sposoben prenašati 60 kDa SA protein v CNS in povzroča tudi farmakološke učinke z inhibitorji peptida BACE1, konjugiranimi s SA.
(a) Klonska injekcija (2 × 10 fagov/žival) faga T7, ki prikazuje dolgoročne farmakokinetične profile peptida CSF št. 2077 (RLSSVDSDLSGC) in neinjiciranega kontrolnega faga (št. 1779) pri vsaj treh podganah, intubiranih s kongenitalno maso (CM). (b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrožil pri podganah, ki so jim injicirali fage (2 × 10 10 fagov/žival), ki prikazuje kontrastno barvanje peptida št. 2077 in žil (lektin). Te fagne klone so dali 3 podganam in jih pustili krožiti 1 uro pred perfuzijo. Možgane so prerezali in obarvali s poliklonskimi protitelesi, označenimi s FITC, proti kapsidi faga T7. Deset minut pred perfuzijo in poznejšo fiksacijo je bil intravensko apliciran z DyLight594 označen lektin. Fluorescentne slike, ki prikazujejo obarvanje lektina (rdeče) na luminalni strani mikrožil in fagov (zeleno) v lumnu kapilar in perivaskularnem možganskem tkivu. Merilna vrstica ustreza 10 µm. (c, d) Biotiniliran inhibitorni peptid BACE1 sam ali v kombinaciji z biotiniliranim tranzitnim peptidom št. 2077 je bil spojen s streptavidinom, čemur je sledila intravenska injekcija vsaj trem kanuliranim podganam CM (10 mg streptavidina/kg). Zmanjšanje Aβ40, ki ga povzroča inhibitor peptida BACE1, je bilo izmerjeno z ELISA testom Aβ1-40 v krvi (rdeča) in cerebrospinalni tekočini (oranžna) v navedenih časovnih točkah. Za boljšo jasnost je na grafu narisana pikčasta črta v merilu 100 %. (c) Odstotno zmanjšanje Aβ40 v krvi (rdeči trikotniki) in cerebrospinalni tekočini (oranžni trikotniki) pri podganah, zdravljenih s streptavidinom, konjugiranim s tranzitnim peptidom št. 2077 in inhibitornim peptidom BACE1 v razmerju 3:1. (d) Odstotno zmanjšanje Aβ40 v krvi (rdeči krogi) in cerebrospinalni tekočini (oranžni krogi) pri podganah, zdravljenih s streptavidinom, spojenim samo z inhibitornim peptidom BACE1. Koncentracija Aβ v kontrolni skupini je bila 420 pg/ml (standardni odklon = 101 pg/ml).
Fagni prikaz je bil uspešno uporabljen na več področjih biomedicinskih raziskav17. Ta metoda je bila uporabljena za študije vaskularne raznolikosti in vivo18,19 kot tudi za študije, usmerjene v možganske žile20,21,22,23,24,25,26. V tej študiji smo uporabo te selekcijske metode razširili ne le na neposredno identifikacijo peptidov, ki ciljajo na možganske žile, temveč tudi na odkrivanje kandidatov z lastnostmi aktivnega transporta za prehajanje krvno-možganske pregrade. Zdaj opisujemo razvoj in vivo selekcijskega postopka pri intubiranih podganah s kongenitalno melanokarcinomozo in prikazujemo njegov potencial za identifikacijo peptidov z lastnostmi usmerjanja v cerebrospinalno tekočino (CSF). Z uporabo faga T7, ki prikazuje knjižnico 12-mernih naključnih peptidov, smo lahko dokazali, da je fag T7 dovolj majhen (približno 60 nm v premeru)10, da se prilagodi krvno-možganski pregradi in s tem neposredno prečka krvno-možgansko pregrado ali horoidni pleksus. Opazili smo, da je odvzem cerebrospinalne tekočine (CSF) pri kanuliranih podganah CM dobro nadzorovana metoda funkcionalnega presejanja in vivo ter da se ekstrahirani fag ni le vezal na žilje, temveč je deloval tudi kot prenašalec čez krvno-možgansko pregrado. Poleg tega smo z istočasnim odvzemom krvi in ​​uporabo HTS na CSF in fage, pridobljene iz krvi, potrdili, da na našo izbiro CSF ​​ni vplivala obogatitev krvi ali primernost za ekspanzijo med krogi selekcije. Vendar pa je krvni predel del selekcijskega postopka, saj morajo fagi, ki lahko dosežejo predel CSF, preživeti in krožiti v krvnem obtoku dovolj dolgo, da se obogatijo v možganih. Da bi iz surovih podatkov HTS pridobili zanesljive informacije o zaporedju, smo v analitični potek dela uvedli filtre, prilagojene napakam sekvenciranja, specifičnim za platformo. Z vključitvijo kinetičnih parametrov v metodo presejanja smo potrdili hitro farmakokinetiko fagov divjega tipa T7 (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 in določili tudi njihov razpolovni čas v cerebrospinalni tekočini (t½ ~ 26 min) na minuto. Kljub podobnim farmakokinetičnim profilom v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini je bilo v cerebrospinalni tekočini mogoče zaznati le 0,001 % koncentracije faga v krvi, kar kaže na nizko mobilnost faga divjega tipa T7 v ozadju skozi krvno-možgansko pregrado. To delo poudarja pomen prvega kroga selekcije pri uporabi strategij in vivo panninga, zlasti za fagne sisteme, ki se hitro odstranijo iz krvnega obtoka, saj le malo klonov lahko doseže predel CNS. Tako je bilo v prvem krogu zmanjšanje raznolikosti knjižnice zelo veliko, saj je bilo v tem zelo strogem modelu cerebrospinalne tekočine sčasoma zbranih le omejeno število klonov. Ta strategija in vivo panninga je vključevala več korakov selekcije, kot so aktivno kopičenje v predelu cerebrospinalne tekočine, preživetje klonov v predelu krvi in ​​hitra odstranitev klonov faga T7 iz krvi v prvih 10 minutah (slika 1d in dopolnilna slika 4M). Tako so bili po prvem krogu v cerebrospinalni tekočini identificirani različni kloni fagov, čeprav je bil za posamezne živali uporabljen isti začetni nabor. To kaže, da več strogih korakov selekcije za izvorne knjižnice z velikim številom članov knjižnice povzroči znatno zmanjšanje raznolikosti. Zato bodo naključni dogodki postali sestavni del začetnega selekcijskega procesa in bodo močno vplivali na rezultat. Verjetno je, da so imeli številni kloni v prvotni knjižnici zelo podobno nagnjenost k obogatitvi CSF. Vendar pa se lahko tudi v enakih eksperimentalnih pogojih rezultati selekcije razlikujejo zaradi majhnega števila posameznih klonov v začetnem naboru.
Motivi, obogateni v cerebrospinalni tekočini (CSF), se razlikujejo od tistih v krvi. Zanimivo je, da smo prvi premik k peptidom, bogatim z glicinom, opazili v krvi posameznih živali (slika 1g, dopolnilni sliki 4e, 4f). Fagi, ki vsebujejo glicinske peptide, so lahko bolj stabilni in manj verjetno, da bodo izločeni iz obtoka. Vendar pa teh peptidov, bogatih z glicinom, nismo zaznali v vzorcih cerebrospinalne tekočine, kar kaže na to, da so kurirane knjižnice šle skozi dva različna koraka selekcije: enega v krvi in ​​drugega, ki se je kopičil v cerebrospinalni tekočini. Kloni, obogateni s CSF, ki so nastali v četrtem krogu selekcije, so bili obsežno testirani. Skoraj vsi posamično testirani kloni so bili potrjeni kot obogateni s CSF v primerjavi s fagom s slepo kontrolo. En zadetek peptida (#2077) je bil podrobneje pregledan. Pokazal je daljši razpolovni čas v plazmi v primerjavi z drugimi zadetki (slika 3d in dopolnilna slika 7) in zanimivo je, da je ta peptid vseboval ostanek cisteina na C-terminusu. Nedavno je bilo dokazano, da lahko dodatek cisteina peptidom izboljša njihove farmakokinetične lastnosti z vezavo na albumin 29. To trenutno za peptid št. 2077 ni znano in zahteva nadaljnje raziskave. Nekateri peptidi so pokazali valenčno odvisnost pri obogatitvi cerebrospinalne tekočine (podatki niso prikazani), kar je lahko povezano s prikazano površinsko geometrijo kapside T7. Sistem T7, ki smo ga uporabili, je pokazal 5–15 kopij vsakega peptida na fagni delec. IHC je bila izvedena na kandidatnih vodilnih fagnih klonih, ki so bili intravensko injicirani v možgansko skorjo podgan (dodatna slika 8). Podatki so pokazali, da so vsaj trije kloni (št. 2002, št. 2009 in št. 2077) interagirali s krvno-možgansko bariero (BBB). Še vedno ni jasno, ali ta interakcija s BBB povzroči kopičenje cerebrospinalne tekočine ali premik teh klonov neposredno v BCSFB. Pomembno je, da smo pokazali, da izbrani peptidi ohranijo svojo transportno zmogljivost v cerebrospinalni tekočini, ko so sintetizirani in vezani na beljakovinski tovor. Vezava N-terminalnih biotiniliranih peptidov na SA v bistvu ponavlja rezultate, pridobljene z njihovimi ustreznimi fagnimi kloni v krvi in ​​cerebrospinalni tekočini (slika 3e). Nazadnje smo pokazali, da je vodilni peptid #2077 sposoben spodbujati delovanje biotiniliranega peptidnega inhibitorja BACE1, konjugiranega s SA, na možgane, kar povzroča izrazite farmakodinamične učinke v CNS z znatnim zmanjšanjem ravni Abeta40 v cerebrospinalni tekočini (slika 4). Z iskanjem homologije peptidnega zaporedja vseh zadetkov v bazi podatkov nismo mogli identificirati nobenih homologov. Pomembno je omeniti, da je velikost knjižnice T7 približno 109, medtem ko je teoretična velikost knjižnice za 12-mere 4 x 1015. Zato smo izbrali le majhen del prostora raznolikosti 12-merne peptidne knjižnice, kar lahko pomeni, da je mogoče identificirati bolj optimizirane peptide z ocenjevanjem sosednjega prostora zaporedja teh identificiranih zadetkov. Hipotetično je lahko eden od razlogov, zakaj nismo našli nobenih naravnih homologov teh peptidov, deselekcija med evolucijo, da bi preprečili nenadzorovan vstop določenih peptidnih motivov v možgane.
Naši rezultati skupaj zagotavljajo osnovo za prihodnje delo na podrobnejši identifikaciji in karakterizaciji transportnih sistemov cerebrovaskularne pregrade in vivo. Osnovna postavitev te metode temelji na strategiji funkcionalne selekcije, ki ne le identificira klone z lastnostmi vezave na možganske žile, temveč vključuje tudi ključni korak, pri katerem imajo uspešni kloni intrinzično aktivnost za prečkanje bioloških ovir in vivo v predel CNS. Cilj je razjasniti mehanizem transporta teh peptidov in njihovo preferenco za vezavo na mikrožilje, specifično za možgansko regijo. To lahko privede do odkritja novih poti za transport krvno-možgansko bariero (KMB) in receptorjev. Pričakujemo, da se lahko identificirani peptidi neposredno vežejo na cerebrovaskularne receptorje ali na ligande v krvnem obtoku, ki se prenašajo skozi KMB ali BCSFB. Peptidni vektorji z aktivnostjo transporta v cerebrospinalni tekočini, odkriti v tem delu, bodo dodatno raziskani. Trenutno preučujemo možgansko specifičnost teh peptidov glede njihove sposobnosti prečkanja KMB in/ali BCSFB. Ti novi peptidi bodo izjemno dragocena orodja za morebitno odkrivanje novih receptorjev ali poti ter za razvoj novih, zelo učinkovitih platform za dostavo makromolekul, kot so biološka zdravila, v možgane.
V veliko cisterno (VC) smo kanulirali z uporabo modifikacije prej opisane metode. Anestezirane podgane Wistar (200–350 g) smo namestili na stereotaksični aparat in naredili medialni rez čez obrito in aseptično pripravljeno lasišče, da smo razkrili lobanjo. V predelu zgornjega dela hrbtenjače smo izvrtali dve luknji in vanje pritrdili pritrdilne vijake. V lateralnem okcipitalnem grebenu smo izvrtali dodatno luknjo za stereotaktično vodenje kanile iz nerjavečega jekla v VC. Okoli kanile smo nanesli zobni cement in ga pritrdili z vijaki. Po fotopolymerizaciji in strjevanju cementa smo kožno rano zaprli s supramidnim šivom 4/0. Pravilno namestitev kanile smo potrdili s spontanim uhajanjem cerebrospinalne tekočine (CSF). Podgano smo odstranili iz stereotaksičnega aparata, ji zagotovili ustrezno pooperativno oskrbo in lajšanje bolečin ter ji pustili, da si opomore vsaj en teden, dokler se v cerebrospinalni tekočini ne pojavijo znaki krvi. Podgane Wistar (Crl:WI/Han) smo dobili od Charles Riverja (Francija). Vse podgane so bile gojene v specifičnih pogojih brez patogenov. Vse poskuse na živalih je odobril Veterinarski urad mesta Basel v Švici in so bili izvedeni v skladu z dovoljenjem za živali št. 2474 (Ocena aktivnega možganskega transporta z merjenjem ravni terapevtskih kandidatov v cerebrospinalni tekočini in možganih podgan).
Podgano nežno ohranjajte pri zavesti s kanilo CM v roki. Odstranite daturo iz kanile in zberite 10 µl spontano tekoče cerebrospinalne tekočine. Ker je bila prehodnost kanile na koncu ogrožena, so bili v to študijo vključeni le vzorci bistre cerebrospinalne tekočine brez znakov kontaminacije s krvjo ali razbarvanja. Vzporedno je bilo iz majhne zareze na konici repa v epruvete s heparinom (Sigma-Aldrich) odvzetih približno 10–20 μl krvi. CSF in kri sta bila zbrana v različnih časovnih točkah po intravenski injekciji faga T7. Pred vsakim odvzemom vzorca CSF je bilo zavrženih približno 5–10 μl tekočine, kar ustreza mrtvemu volumnu katetra.
Knjižnice so bile ustvarjene z uporabo vektorja T7Select 10-3b, kot je opisano v priročniku za sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Na kratko, naključni 12-merni vložek DNA je bil sintetiziran v naslednji obliki:
Kodon NNK je bil uporabljen za preprečevanje dvojnih stop kodonov in prekomerne ekspresije aminokislin v insertu. N je ročno mešano ekvimolarno razmerje vsakega nukleotida, K pa je ročno mešano ekvimolarno razmerje adeninskih in citozinskih nukleotidov. Enoverižne regije so bile pretvorjene v dvoverižno DNA z nadaljnjo inkubacijo z dNTP (Novagen) in Klenowim encimom (New England Biolabs) v Klenowem pufru (New England Biolabs) 3 ure pri 37 °C. Po reakciji je bila dvoverižna DNA pridobljena z obarjanjem z EtOH. Nastala DNA je bila prebavljena z restrikcijskima encimoma EcoRI in HindIII (oba od Roche). Razcepljen in prečiščen (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligaza, New England Biolabs) je bil nato ligiran v okvirju v predhodno razcepljen vektor T7 za aminokislino 348 kapsidnega gena 10B. Ligacijske reakcije so bile inkubirane pri 16 °C 18 ur pred pakiranjem in vitro. Pakiranje fagov in vitro je bilo izvedeno v skladu z navodili, priloženimi kompletu za kloniranje T7Select 10-3b (Novagen), raztopina za pakiranje pa je bila enkrat amplificirana do lize z uporabo Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizati so bili centrifugirani, titrirani in zamrznjeni pri -80 °C kot osnovna raztopina glicerola.
Neposredna PCR amplifikacija fagnih variabilnih regij, pomnoženih v juhi ali plošči, z uporabo lastniških fuzijskih primerjev 454/Roche-amplicon. Primer za neposredno fuzijo vsebuje zaporedja, ki obdajajo variabilno regijo (NNK) 12 (specifično za predlogo), GS FLX Titanium Adapter A in ključno zaporedje štirih baz knjižnice (TCAG) (dodatna slika 1a):
Primer za reverzno fuzijo vsebuje tudi biotin, pritrjen na zajemne kroglice, in GS FLX Titanium Adapter B, potreben za klonsko amplifikacijo med emulzijsko PCR:
Amplikone smo nato pirosekvencirali s protokolom 454/Roche po protokolu 454 GS-FLX Titanium. Za ročno Sangerjevo sekvenciranje (analizator DNA Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) smo DNA faga T7 pomnožili s PCR in sekvencirali z naslednjimi pari začetnih oligonukleotidov:
Vstavke iz posameznih plakov smo podvrgli PCR amplifikaciji z uporabo kompleta Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (v skladu z navodili proizvajalca). Izvedli smo vroči zagon (10 min pri 95 °C) in 35 ciklov povečanja (50 s pri 95 °C, 1 min pri 50 °C in 1 min pri 72 °C).
Fagi iz knjižnic, fagi divjega tipa, fagi, rešeni iz cerebrospinalne tekočine in krvi, ali posamezni kloni so bili amplificirani v Escherichia coli BL5615 v TB juhi (Sigma Aldrich) ali v 500 cm2 posodah (Thermo Scientific) 4 ure pri 37 °C. Fagi so bili ekstrahirani iz plošč z izpiranjem plošč s Tris-EDTA pufrom (Fluka Analytical) ali z zbiranjem plakov s sterilnimi konicami pipet. Fagi so bili izolirani iz supernatanta kulture ali ekstrakcijskega pufra z enim krogom obarjanja s polietilen glikolom (PEG 8000) (Promega) in resuspendirani v Tris-EDTA pufru.
Amplificirani fag je bil pred intravensko (IV) injekcijo (500 μl/žival) podvržen 2-3 krogom odstranjevanja endotoksinov z uporabo kroglic za odstranjevanje endotoksinov (Miltenyi Biotec). V prvem krogu je bilo vnesenih 2 × 1012 fagov; v drugem 2 × 1010 fagov; v tretjem in četrtem krogu selekcije 2 × 109 fagov na žival. Vsebnost fagov v vzorcih cerebrospinalne tekočine in krvi, odvzetih v navedenih časovnih točkah, je bila določena s štetjem plakov v skladu z navodili proizvajalca (priročnik za sistem T7Select). Selekcija fagov je bila izvedena z intravensko injekcijo prečiščenih knjižnic v repno veno ali s ponovno injekcijo faga, ekstrahiranega iz cerebrospinalne tekočine iz prejšnjega kroga selekcije, nadaljnji odvzemi pa so bili izvedeni pri 10 minutah, 30 minutah, 60 minutah, 90 minutah, 120 minutah, 180 minutah in 240 minutah vzorcev cerebrospinalne tekočine in krvi. Izvedeni so bili skupno štirje krogi in vivo panninga, v katerih sta bili izbrani veji ločeno shranjeni in analizirani v prvih treh krogih selekcije. Vsi fagni vložki, ekstrahirani iz cerebrospinalne tekočine (CSF) iz prvih dveh krogov selekcije, so bili podvrženi pirosekvenciranju 454/Roche, medtem ko so bili vsi kloni, ekstrahirani iz CSF iz zadnjih dveh krogov selekcije, ročno sekvencirani. Tudi vsi krvni fagi iz prvega kroga selekcije so bili podvrženi pirosekvenciranju 454/Roche. Za injiciranje fagnih klonov so bili izbrani fagi pomnoženi v E. coli (BL5615) na 500 cm2 ploščah pri 37 °C 4 ure. Posamezno izbrani in ročno sekvencirani kloni so bili razmnoženi v TB mediju. Po ekstrakciji fagov, čiščenju in odstranitvi endotoksina (kot je opisano zgoraj) je bilo 2 × 1010 fagov/žival v 300 μl intravensko injiciranih v eno repno veno.
Predhodna obdelava in kvalitativno filtriranje podatkov o zaporedju. Surovi podatki 454/Roche so bili pretvorjeni iz binarnega standardnega formata pretočnega zemljevida (sff) v Pearsonov človeku berljiv format (fasta) z uporabo programske opreme proizvajalca. Nadaljnja obdelava nukleotidnega zaporedja je bila izvedena z uporabo lastniških programov in skriptov C (neobjavljen programski paket), kot je opisano spodaj. Analiza primarnih podatkov vključuje stroge večstopenjske postopke filtriranja. Za filtriranje odčitkov, ki niso vsebovali veljavnega zaporedja DNA z 12-mernim vstavkom, so bili odčitki zaporedno poravnani z začetno oznako (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), končno oznako (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) in ozadnim vstavkom (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) z uporabo globalnega Needleman-Wunschovega testa. poravnava, ki omogoča do 2 neskladnosti na poravnavo31. Zato so bili iz knjižnice odstranjeni odčitki brez začetnih in končnih oznak ter odčitki z ozadnimi vstavki, tj. poravnave, ki presegajo dovoljeno število neusklajenosti. Kar zadeva preostale odčitke, je bilo iz prvotnega odčitanega zaporedja izrezano in nadalje obdelano zaporedje N-mer DNA, ki sega od začetne oznake do stop oznake (v nadaljevanju »vložek«). Po translaciji vstavka se iz vstavka odstrani del za prvim stop kodonom na 5' koncu primerja. Poleg tega so bili odstranjeni tudi nukleotidi, ki vodijo do nepopolnih kodonov na 3' koncu primerja. Za izključitev vstavkov, ki vsebujejo samo ozadna zaporedja, so bili odstranjeni tudi prevedeni vstavki, ki se začnejo z vzorcem aminokislin »PAG«. Iz knjižnice so bili odstranjeni peptidi s posttranslacijsko dolžino manj kot 3 aminokisline. Nazadnje je bila v naboru vstavkov odstranjena redundanca in določena je bila frekvenca vsakega edinstvenega vstavka. Rezultati te analize so vključevali seznam nukleotidnih zaporedij (vstavkov) in njihovih (odčitanih) frekvenc (dodatni sliki 1c in 2).
Združevanje vstavkov N-mer DNA po podobnosti zaporedja: Za odpravo napak v sekvenciranju, specifičnih za 454/Roche (kot so težave s sekvenciranjem homopolimernih podaljškov), in odstranitev manj pomembnih redundanc se predhodno filtrirani vstavki (vstavki) zaporedja N-mer DNA razvrstijo po podobnosti. Vstavki (vstavki) so predhodno filtrirani (dovoljeni sta do 2 neujemajoči se bazi) z uporabo iterativnega algoritma, ki je definiran na naslednji način: vstavki so najprej razvrščeni po frekvenci (od najvišje do najnižje), in če so enaki, po sekundarni razvrstitvi po dolžini (od najdaljše do najkrajše). Tako najpogostejši in najdaljši vstavki določajo prvo »skupino«. Frekvenca skupine je nastavljena na ključno frekvenco. Nato se je vsak vstavek, ki je ostal na razvrščenem seznamu, poskušal dodati v skupino s parno poravnavo Needleman-Wunsch. Če število neujemanja, vstavkov ali izbrisov v poravnavi ne presega praga 2, se v skupino doda vstavek, skupna frekvenca skupine pa se poveča za pogostost dodajanja vstavka. Vstavki, dodani v skupino, so označeni kot uporabljeni in izključeni iz nadaljnje obdelave. Če vstavljenega zaporedja ni mogoče dodati že obstoječi skupini, se vstavljeno zaporedje uporabi za ustvarjanje nove skupine z ustrezno frekvenco vstavljanja in označi kot uporabljeno. Iteracija se konča, ko je vsako vstavljeno zaporedje bodisi uporabljeno za oblikovanje nove skupine bodisi ga je mogoče vključiti v že obstoječo skupino. Navsezadnje se združeni vstavki, sestavljeni iz nukleotidov, sčasoma prevedejo v peptidna zaporedja (peptidne knjižnice). Rezultat te analize je niz vstavkov in njihovih ustreznih frekvenc, ki sestavljajo število zaporednih odčitkov (dodatna slika 2).
Generiranje motivov: Na podlagi seznama edinstvenih peptidov je bila ustvarjena knjižnica, ki je vsebovala vse možne vzorce aminokislin (ak), kot je prikazano spodaj. Vsak možni vzorec dolžine 3 je bil izvlečen iz peptida in dodan njegov inverzni vzorec skupaj s skupno knjižnico motivov, ki je vsebovala vse vzorce (tripeptide). Knjižnice zelo ponavljajočih se motivov so bile sekvencirane in odstranjena redundanca. Nato smo za vsak tripeptid v knjižnici motivov z računalniškimi orodji preverili njegovo prisotnost v knjižnici. V tem primeru se doda frekvenca peptida, ki vsebuje najdeni motiv tripeptida, in ta motivu v knjižnici motivov dodeli (»število motivov«). Rezultat generiranja motivov je dvodimenzionalna matrika, ki vsebuje vse pojavitve tripeptidov (motivov) in njihove ustrezne vrednosti, ki predstavljajo število zaporednih odčitkov, ki povzročijo ustrezen motiv, ko so odčitki filtrirani, združeni in prevedeni. Metrike so podrobno opisane zgoraj.
Normalizacija števila motivov in ustreznih razpršenih diagramov: Število motivov za vsak vzorec je bilo normalizirano z uporabo
kjer je ni število odčitkov, ki vsebujejo temo i. Torej vi predstavlja odstotno frekvenco odčitkov (ali peptidov), ki vsebujejo motiv i v vzorcu. P-vrednosti za nenormalizirano število motivov so bile izračunane z uporabo Fisherjevega natančnega testa. Glede korelogramov števila motivov so bile Spearmanove korelacije izračunane z uporabo normaliziranega števila motivov z R.
Za vizualizacijo vsebnosti aminokislin na vsakem položaju v knjižnici peptidov so bili ustvarjeni spletni logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Najprej se vsebnost aminokislin na vsakem položaju 12-mernega peptida shrani v matriko 20×12. Nato se v formatu fasta-sequence ustvari niz 1000 peptidov, ki vsebujejo enako relativno vsebnost aminokislin na vsakem položaju in se posreduje kot vhod za web-logo 3, ki ustvari grafično predstavitev relativne vsebnosti aminokislin na vsakem položaju za dano knjižnico peptidov. Za vizualizacijo večdimenzionalnih naborov podatkov so bili toplotni zemljevidi ustvarjeni z uporabo interno razvitega orodja v jeziku R (biosHeatmap, paket R, ki še ni izdan). Dendrogrami, predstavljeni na toplotnih zemljevidih, so bili izračunani z uporabo Wardove hierarhične metode združevanja z evklidsko metriko razdalje. Za statistično analizo podatkov o točkovanju motivov so bile vrednosti P za nenormalizirano točkovanje izračunane z uporabo Fisherjevega natančnega testa. P-vrednosti za druge nabore podatkov so bile izračunane v R z uporabo Studentovega t-testa ali ANOVA.
Izbrane fagne klone in fage brez vstavkov smo injicirali intravensko preko repne vene (2 × 1010 fagov/žival v 300 μl PBS). Deset minut pred perfuzijo in kasnejšo fiksacijo smo istim živalim intravensko injicirali 100 μl lektina, označenega z DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minut po injiciranju faga smo podgane skozi srce perfuzirali s 50 ml PBS, nato pa s 50 ml 4% PFA/PBS. Vzorce možganov smo dodatno fiksirali čez noč v 4% PFA/PBS in jih čez noč namočili v 30% saharozi pri 4 °C. Vzorce smo hitro zamrznili v mešanici OCT. Imunohistokemična analiza zamrznjenih vzorcev je bila izvedena pri sobni temperaturi na 30 µm kriosekcijah, blokiranih z 1% BSA in inkubiranih s poliklonskimi protitelesi, označenimi s FITC, proti fagu T7 (Novus NB 600-376A) pri 4 °C. Inkubiramo čez noč. Na koncu so bile sekcije trikrat oprane s PBS in pregledane s konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Vse peptide z minimalno čistostjo 98 % je sintetiziralo podjetje GenScript USA, jih biotiniliralo in liofiliziralo. Biotin je vezan preko dodatnega trojnega glicinskega distančnika na N-koncu. Vse peptide preverite z masno spektrometrijo.
Streptavidin (Sigma S0677) smo zmešali s 5-kratnim ekvimolarnim presežkom biotiniliranega peptida, biotiniliranega inhibitornega peptida BACE1 ali kombinacije (razmerje 3:1) biotiniliranega inhibitornega peptida BACE1 in inhibitornega peptida BACE1 v 5–10 % DMSO/inkubirali v PBS. 1 uro pri sobni temperaturi pred injiciranjem. S streptavidinom konjugirane peptide smo injicirali intravensko v odmerku 10 mg/kg v eno od repnih ven podgan z možgansko votlino.
Koncentracijo streptavidin-peptidnih kompleksov smo ocenili z ELISA testom. Mikrotitrske plošče Nunc Maxisorp (Sigma) smo čez noč pri 4 °C prekrili z 1,5 μg/ml mišjega protitelesa proti streptavidinu (Thermo, MA1-20011). Po 2 urah blokiranja (blokirni pufer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatine, 1 % BSA) pri sobni temperaturi smo ploščo 3 sekunde sprali z 0,05 % Tween-20/PBS (pralnim pufrom). V vdolbinice smo dodali vzorce cerebrospinalne tekočine in plazme, razredčene z blokirnim pufrom (plazma 1:10.000, cerebrospinalna tekočina 1:115). Ploščo smo nato čez noč inkubirali pri 4 °C z detekcijskim protitelesom (1 μg/ml, proti streptavidinu-HRP, Novus NB120-7239). Po treh korakih izpiranja smo streptavidin detektirali z inkubacijo v raztopini substrata TMB (Roche) do 20 minut. Po zaustavitvi razvoja barve z 1M H2SO4 smo izmerili absorbanco pri 450 nm.
Delovanje kompleksa streptavidin-peptid-inhibitor BACE1 je bilo ocenjeno z Aβ(1-40) ELISA testom v skladu s protokolom proizvajalca (Wako, 294-64701). Na kratko, vzorci cerebrospinalne tekočine so bili razredčeni v standardnem razredčilu (1:23) in inkubirani čez noč pri 4 °C v 96-vdolbinskih ploščah, prevlečenih z zajemalnim protitelesom BNT77. Po petih korakih izpiranja je bilo dodano HRP-konjugirano protitelo BA27 in inkubirano 2 uri pri 4 °C, nato pa še pet korakov izpiranja. Aβ(1–40) je bil detektiran z inkubacijo v raztopini TMB 30 minut pri sobni temperaturi. Po zaustavitvi razvoja barve z raztopino za ustavitev izmerite absorbanco pri 450 nm. Vzorce plazme so pred Aβ(1–40) ELISA testom podvrgli ekstrakciji na trdni fazi. Plazmo so dodali k 0,2 % DEA (Sigma) v 96-vdolbinskih ploščah in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut. Po zaporednem izpiranju SPE plošč (Oasis, 186000679) z vodo in 100 % metanolom so bili vzorci plazme dodani na SPE plošče in vsa tekočina je bila odstranjena. Vzorce smo sprali (najprej s 5 % metanolom, nato s 30 % metanolom) in eluirali z 2 % NH4OH/90 % metanolom. Po sušenju eluata pri 55 °C 99 minut s konstantnim tokom N2 smo vzorce reducirali v standardnih razredčilih in izmerili Aβ(1–40), kot je opisano zgoraj.
Kako citirati ta članek: Urich, E. et al. Dostava tovora v možgane z uporabo tranzitnih peptidov, identificiranih in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB in Moos T. Dostava makromolekularnih zdravil v možgane z uporabo ciljne terapije. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. in Martinez-Martinez, P. Dostava peptidnih in beljakovinskih zdravil skozi krvno-možgansko pregrado. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-možganska pregrada: ozko grlo pri razvoju zdravil za možgane. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG in Byrd, A. Možnosti za izboljšano dostavo zdravil in njihovo ciljanje v možgane prek poti horoidni pleksus-cerebrospinalna tekočina. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacija biofarmacevtskih izdelkov z molekularnimi trojanskimi konji za dostavo v možgane. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorsko posredovan transport peptidov skozi krvno-možgansko pregrado. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Povečanje penetracije možganov in učinkovitosti terapevtskih protiteles z uporabo monovalentnih molekularnih prevoznikov. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transport receptorja transferina (TfR) določa privzem afinitetnih variant protiteles TfR v možgane. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).