Nekatere teme o odpravljanju težav s tekočim kromatografom (LC) nikoli niso zastarele, saj v praksi LC obstajajo težave, čeprav se tehnologija instrumentov sčasoma izboljšuje. V LC sistemu lahko nastanejo težave, ki se končajo s slabo obliko vrhov. Ko se pojavijo težave, povezane z obliko vrhov, kratek seznam možnih vzrokov za te rezultate pomaga poenostaviti našo izkušnjo odpravljanja težav.
Zabavno je bilo pisati ta stolpec »Odpravljanje težav s tekočinsko kromatografijo« in vsak mesec razmišljati o temah, saj nekatere teme nikoli ne gredo iz mode. Medtem ko na področju raziskav kromatografije nekatere teme ali ideje zastarijo, ko jih nadomestijo novejše in boljše ideje, pa na področju odpravljanja težav velja to od prvega članka o odpravljanju težav v tej reviji (takrat LC Journal), saj so nekatere teme še vedno aktualne) leta 1983 (1). V zadnjih nekaj letih sem se v več razdelkih o odpravljanju težav s tekočinsko kromatografijo osredotočil na sodobne trende, ki vplivajo na tekočinsko kromatografijo (LC) (na primer relativna primerjava našega razumevanja vpliva tlaka na zadrževanje [2] Novi napredki), našo interpretacijo rezultatov LC in kako odpravljati težave s sodobnimi instrumenti LC. V tem mesečnem delu nadaljujem svojo serijo (3), ki se je začela decembra 2021 in se je osredotočala na nekatere »življenjske« teme odpravljanja težav s tekočinsko kromatografijo – elementi, ki so odlični za vsakega odpravljalca težav, so bistveni, ne glede na starost sistema, ki ga uporabljamo. Osrednja tema te serije je zelo pomembna za znameniti stenski grafikon »Vodnik za odpravljanje težav s tekočinsko kromatografijo« (4), ki visi v ... veliko laboratorijev. V tretjem delu te serije sem se osredotočil na vprašanja, povezana z obliko ali značilnostmi vrhov. Neverjetno, stenska tabela navaja 44 različnih možnih vzrokov za slabo obliko vrhov! Vseh teh težav ne moremo podrobno obravnavati v enem članku, zato se bom v tem prvem delu na to temo osredotočil na nekatere, ki jih najpogosteje vidim. Upam, da bodo mladi in stari uporabniki tekočinske kromatografije našli nekaj koristnih nasvetov in opomnikov o tej pomembni temi.
Vse pogosteje na vprašanja o odpravljanju težav odgovarjam z "vse je mogoče". Ta odgovor se morda zdi preprost, ko gre za opazovanja, ki jih je težko interpretirati, vendar se mi zdi pogosto primeren. Pri številnih možnih vzrokih za slabo obliko vrhov je pomembno, da smo pri razmišljanju o tem, kaj bi lahko bila težava, odprtega duha in da znamo prednostno razvrstiti morebitne vzroke, da začnemo odpravljati težave, pri čemer se osredotočimo na najpogostejše možnosti, kar je zelo pomembno.
Ključni korak pri vsakem odpravljanju težav – a mislim, da je podcenjen – je prepoznavanje obstoja težave, ki jo je treba rešiti. Prepoznavanje obstoja težave pogosto pomeni prepoznavanje, da se to, kar se zgodi z orodjem, razlikuje od naših pričakovanj, ki jih oblikujejo teorija, empirično znanje in izkušnje (5). »Oblika vrha«, o kateri se tukaj govori, se dejansko ne nanaša le na obliko vrha (simetrična, asimetrična, gladka, puhasta, na vodilnem robu, repu itd.), temveč tudi na širino. Naša pričakovanja glede dejanske oblike vrha so preprosta. Teorija (6) dobro podpira učbeniško pričakovanje, da bi morali biti kromatografski vrhovi v večini primerov simetrični in ustrezati obliki Gaussove porazdelitve, kot je prikazano na sliki 1a. Kar pričakujemo od širine vrhov, je bolj zapleteno vprašanje in o tej temi bomo razpravljali v prihodnjem članku. Druge oblike vrhov na sliki 1 prikazujejo nekatere druge možnosti, ki bi jih lahko opazili – z drugimi besedami, nekatere načine, kako bi lahko šlo kaj narobe. V preostalem delu tega dela bomo razpravljali o nekaterih specifičnih primerih situacij, ki lahko vodijo do teh vrst oblik.
Včasih vrhov na kromatogramu sploh ne opazimo tam, kjer naj bi bili eluirani. Zgornji stenski grafikon kaže, da je odsotnost vrha (ob predpostavki, da vzorec dejansko vsebuje ciljni analit v koncentraciji, ki bi morala zagotoviti odziv detektorja, da ga vidi nad šumom) običajno povezana z neko težavo z instrumentom ali napačnimi pogoji mobilne faze (če so sploh opaženi). vrhovi, običajno pre»šibki«). Kratek seznam možnih težav in rešitev v tej kategoriji najdete v tabeli I.
Kot je bilo že omenjeno, je vprašanje, koliko razširitve vrhov je treba tolerirati, preden se ji posvetimo in jo poskušamo odpraviti, zapletena tema, o kateri bom razpravljal v prihodnjem članku. Moje izkušnje kažejo, da znatno razširitev vrhov pogosto spremlja pomembna sprememba oblike vrhov, rep vrhov pa je pogostejši kot predvrh ali razcepitev. Vendar pa so tudi nominalno simetrični vrhovi razširjeni, kar lahko povzroči nekaj različnih razlogov:
Vsaka od teh težav je bila podrobno obravnavana v prejšnjih številkah revije Troubleshooting LC, bralci, ki jih te teme zanimajo, pa se lahko za informacije o temeljnih vzrokih in možnih rešitvah teh težav obrnejo na te prejšnje članke. Več podrobnosti.
Repljenje vrhov, frontalizacija vrhov in cepitev vrhov so lahko posledica kemičnih ali fizikalnih pojavov, seznam možnih rešitev za te težave pa se zelo razlikuje, odvisno od tega, ali imamo opravka s kemijsko ali fizikalno težavo. Pogosto lahko s primerjavo različnih vrhov v kromatogramu najdete pomembne namige o tem, kateri je krivec. Če imajo vsi vrhovi v kromatogramu podobne oblike, vzrok najverjetneje ni fizikalni. Če je prizadet le eden ali nekaj vrhov, ostali pa so videti v redu, je vzrok najverjetneje kemični.
Kemični vzroki za nastanek repov vrhov so preveč zapleteni, da bi jih tukaj na kratko obravnavali. Zainteresiranega bralca napotujemo na nedavno številko revije »LC Troubleshooting« za podrobnejšo razpravo (10). Vendar pa je preprost poskus zmanjšati maso vbrizganega analita in preveriti, ali se oblika vrha izboljša. Če je tako, je to dober namig, da je težava »preobremenitev z maso«. V tem primeru je treba metodo omejiti na vbrizgavanje majhnih mas analita ali pa spremeniti kromatografske pogoje, da se dobre oblike vrhov dosežejo tudi pri vbrizganih večjih masah.
Obstaja tudi veliko možnih fizikalnih vzrokov za nastanek repov vrhov. Bralce, ki jih zanima podrobna razprava o možnostih, napotimo na drugo nedavno izdajo revije »LC Troubleshooting« (11). Eden najpogostejših fizikalnih vzrokov za nastanek repov vrhov je slaba povezava na točki med injektorjem in detektorjem (12). Ekstremen primer je prikazan na sliki 1d, ki sem jo pridobil v svojem laboratoriju pred nekaj tedni. V tem primeru smo zgradili sistem z novim injekcijskim ventilom, ki ga prej nismo uporabljali, in namestili injekcijsko zanko majhnega volumna s ferulo, ki je bila vlita v kapilaro iz nerjavečega jekla. Po nekaj začetnih poskusih odpravljanja težav smo ugotovili, da je globina odprtine v statorju injekcijskega ventila veliko globlja, kot smo bili vajeni, kar je povzročilo veliko mrtvo prostornino na dnu odprtine. To težavo je mogoče enostavno rešiti z zamenjavo injekcijske zanke z drugo cevjo, ferulo pa lahko prilagodimo v pravilen položaj, da odpravimo mrtvo prostornino na dnu odprtine.
Čela vrhov, kot so prikazana na sliki 1e, lahko povzročijo tudi fizikalne ali kemične težave. Pogost fizikalni vzrok za vodilni rob je, da plast delcev v koloni ni dobro zapakirana ali da so se delci sčasoma reorganizirali. Kot pri repu vrhov, ki ga povzroča ta fizikalni pojav, je najboljši način za odpravo tega zamenjava kolone in nadaljevanje. V osnovi oblike vrhov vodilnega roba kemičnega izvora pogosto nastanejo zaradi tako imenovanih "nelinearnih" retencijskih pogojev. V idealnih (linearnih) pogojih je količina analita, ki jo zadrži stacionarna faza (torej retencijski faktor), linearno povezana s koncentracijo analita v koloni. Kromatografsko to pomeni, da se z naraščanjem mase analita, vbrizganega v kolono, vrh poveča, vendar ne razširi. To razmerje se prekine, ko je retencijsko vedenje nelinearno, vrhovi pa ne postanejo le višji, ampak tudi širši, ko se vbrizga več mase. Poleg tega nelinearne oblike določajo obliko kromatografskih vrhov, kar povzroči vodilne ali zadnje robove. Kot pri preobremenitvi z maso, ki povzroča rep vrhov (10), je vodilni rob vrhov, ki ga povzroča Nelinearno zadrževanje je mogoče diagnosticirati tudi z zmanjšanjem mase vbrizganega analita. Če se oblika vrha izboljša, je treba metodo spremeniti tako, da ne preseže kakovosti vbrizgavanja, ki povzroča vodilni rob, ali pa spremeniti kromatografske pogoje, da se to vedenje čim bolj zmanjša.
Včasih opazimo nekaj, kar je videti kot "razcepljen" vrh, kot je prikazano na sliki 1f. Prvi korak pri reševanju tega problema je ugotoviti, ali je oblika vrha posledica delne koelucije (tj. prisotnosti dveh različnih, a tesno eluiranih spojin). Če se dejansko dva različna analita eluirata blizu skupaj, potem gre za izboljšanje njune ločljivosti (na primer s povečanjem selektivnosti, retencije ali števila plošč) in so navidezni "razcepljeni" vrhovi povezani s fizikalnimi lastnostmi. Učinkovitost nima nobene zveze s samo kolono. Pogosto je najpomembnejši namig pri tej odločitvi, ali imajo vsi vrhovi v kromatogramu razcepljene oblike ali le eden ali dva. Če je samo eden ali dva, gre verjetno za težavo s koelucijo; če so vsi vrhovi razcepljeni, gre verjetno za fizikalno težavo, najverjetneje povezano s samo kolono.
Razcepljeni vrhovi, povezani s fizikalnimi lastnostmi same kolone, so običajno posledica delno blokiranih frit na vhodu ali izhodu ali reorganizacije delcev v koloni, kar omogoča, da mobilna faza teče hitreje kot mobilna faza na določenih območjih tvorbe kanala kolone, na drugih območjih (11). Delno zamašene frite je včasih mogoče odstraniti z obračanjem toka skozi kolono; vendar je to po mojih izkušnjah običajno kratkoročna in ne dolgoročna rešitev. To je pri sodobnih kolonah pogosto usodno, če se delci znotraj kolone ponovno združijo. Na tej točki je najbolje zamenjati kolono in nadaljevati.
Vrh na sliki 1g, ki je prav tako iz mojega nedavnega primera v laboratoriju, običajno kaže, da je signal tako visok, da je dosegel zgornji del odzivnega območja. Pri optičnih absorbančnih detektorjih (v tem primeru UV-Vis), ko je koncentracija analita zelo visoka, analit absorbira večino svetlobe, ki prehaja skozi pretočno celico detektorja, tako da ostane zelo malo svetlobe za zaznavanje. V teh pogojih na električni signal fotodetektorja močno vplivajo različni viri šuma, kot sta razpršena svetloba in "temni tok", zaradi česar je signal zelo "mehkega" videza in neodvisen od koncentracije analita. Ko se to zgodi, je težavo pogosto mogoče enostavno rešiti z zmanjšanjem volumna injiciranja analita – zmanjšanjem volumna injiciranja, redčenjem vzorca ali obojim.
V šoli kromatografije uporabljamo signal detektorja (tj. os y v kromatogramu) kot indikator koncentracije analita v vzorcu. Zato se zdi nenavadno videti kromatogram s signalom pod ničlo, saj je preprosta razlaga, da to kaže na negativno koncentracijo analita – kar seveda fizično ni mogoče. Po mojih izkušnjah se negativni vrhovi najpogosteje opazijo pri uporabi optičnih absorbančnih detektorjev (npr. UV-vis).
V tem primeru negativni vrh preprosto pomeni, da molekule, ki eluirajo iz kolone, absorbirajo manj svetlobe kot mobilna faza sama tik pred in po vrhu. To se lahko zgodi na primer pri uporabi relativno nizkih valovnih dolžin detekcije (<230 nm) in dodatkov mobilne faze, ki absorbirajo večino svetlobe pri teh valovnih dolžinah. Takšni dodatki so lahko komponente topila mobilne faze, kot je metanol, ali komponente pufra, kot sta acetat ali format. Negativne vrhove lahko dejansko uporabimo za pripravo umeritvene krivulje in pridobitev natančnih kvantitativnih informacij, zato ni temeljnega razloga, da bi se jim sami izognili (ta metoda se včasih imenuje "posredna UV detekcija") (13). Če pa se želimo negativnim vrhom resnično popolnoma izogniti, je v primeru detekcije absorbance najboljša rešitev uporaba drugačne valovne dolžine detekcije, tako da analit absorbira več kot mobilna faza, ali sprememba sestave mobilne faze, tako da absorbirajo manj svetlobe kot analiti.
Negativni vrhovi se lahko pojavijo tudi pri uporabi detekcije lomnega količnika (RI), kadar se lomni količnik komponent v vzorcu, ki niso analit, kot je matrica topila, razlikuje od lomnega količnika mobilne faze. To se zgodi tudi pri UV-vidni detekciji, vendar je ta učinek v primerjavi z detekcijo RI običajno manjši. V obeh primerih je mogoče negativne vrhove zmanjšati z natančnejšim ujemanjem sestave matrice vzorca s sestavo mobilne faze.
V tretjem delu o osnovni temi odpravljanja težav s tekočim kromatografom (LC) sem obravnaval situacije, v katerih se opazovana oblika vrha razlikuje od pričakovane ali normalne oblike vrha. Učinkovito odpravljanje težav s takimi težavami se začne s poznavanjem pričakovanih oblik vrhov (na podlagi teorije ali predhodnih izkušenj z obstoječimi metodami), zato so odstopanja od teh pričakovanj očitna. Težave z obliko vrhov imajo veliko različnih možnih vzrokov (preširoke, repne, sprednji rob itd.). V tem delu podrobno obravnavam nekatere razloge, ki jih najpogosteje opažam. Poznavanje teh podrobnosti je dober začetek odpravljanja težav, vendar ne zajame vseh možnosti. Bralci, ki jih zanima podrobnejši seznam vzrokov in rešitev, se lahko obrnejo na stensko tabelo LCGC »LC Troubleshooting Guide«.
(4) Stenska tabela LCGC »Vodnik za odpravljanje težav s LC«. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza podatkov in obdelava signalov v kromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF in Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.