Nekatere teme o odpravljanju težav s LC niso nikoli zastarele, saj obstajajo težave v praksi LC, čeprav se tehnologija instrumentov sčasoma izboljšuje. Obstaja veliko načinov, na katere se lahko pojavijo težave v sistemu LC in končajo v slabi obliki vrha. Ko se pojavijo težave, povezane z obliko vrha, kratek seznam možnih vzrokov za te rezultate pomaga poenostaviti našo izkušnjo odpravljanja težav.
Zabavno je bilo pisati to rubriko »Odpravljanje težav pri LC« in vsak mesec razmišljati o temah, saj nekatere teme nikoli ne gredo iz mode. Medtem ko na področju kromatografskih raziskav nekatere teme ali ideje postanejo zastarele, saj jih nadomestijo novejše in boljše ideje, na področju odpravljanja težav, odkar se je v tej reviji (takratni reviji LC Journal) pojavil prvi članek o odpravljanju težav, saj so nekatere teme še vedno pomembne) leta 1983(1). ).V zadnjih nekaj letih sem več razdelkov o odpravljanju težav s LC osredotočil na sodobne trende, ki vplivajo na tekočinsko kromatografijo (LC) (na primer relativno primerjavo našega razumevanja učinka pritiska na zadrževanje [2] Novi napredki) Naša interpretacija rezultatov LC in kako odpraviti težave s sodobnimi instrumenti LC. V tem mesečnem obroku nadaljujem svojo serijo (3), ki se je začela decembra 2021 in se je osredotočala na nekaj tem o »življenju in smrti« pri odpravljanju težav s LC — elementi, ki so odlični za vsako orodje za odpravljanje težav, so bistveni, ne glede na starost sistema, ki ga uporabljamo. Osrednja tema te serije je zelo pomembna za znamenito stensko tabelo LCGC »Vodnik za odpravljanje težav pri LC« (4), ki visi v številnih laboratorijih. Za tretji del te serije sem se odločil osredotočiti na vprašanja, povezana z obliko vrha ali značilnostmi vrha. Neverjetno, stenski grafikon navaja 44 različnih možnih vzrokov za slabo konično obliko! Vseh teh vprašanj ne moremo podrobno obravnavati v enem članku, zato se bom v tem prvem delu o tej temi osredotočil na nekatere izmed tistih, ki jih najpogosteje vidim. Upam, da bodo mladi in stari uporabniki LC našli nekaj koristnih nasvetov in opomnikov o tej pomembni temi.
Vedno bolj se mi zdi, da na vprašanja o odpravljanju težav odgovarjam z "vse je možno". Ta odgovor se morda zdi enostaven, če upoštevamo opažanja, ki jih je težko razlagati, vendar se mi zdi pogosto ustrezen. Glede na številne možne vzroke za slabo obliko vrha je pomembno, da ostanemo odprti, ko razmišljamo, kaj bi lahko bila težava, in da lahko določimo prednost morebitnim vzrokom, da začnemo naša prizadevanja za odpravljanje težav, pri čemer se osredotočamo na tiste najpogostejše možnosti, ta točka je zelo pomembna. možno.
Ključni korak pri vsakem odpravljanju težav – vendar menim, da je podcenjen – je spoznanje, da obstaja težava, ki jo je treba rešiti. Zavedanje, da obstaja težava, pogosto pomeni spoznanje, da je to, kar se zgodi z orodjem, drugačno od naših pričakovanj, ki so oblikovana s teorijo, empiričnim znanjem in izkušnjami (5). Tu omenjena »oblika konice« se dejansko ne nanaša le na obliko konice (simetrično, asimetrično, gladko). , puhast, vodilni rob, rep itd.), temveč tudi na širino. Naša pričakovanja glede dejanske oblike vrhov so preprosta. Teorija (6) dobro podpira pričakovanje iz učbenikov, da morajo biti v večini primerov kromatografski vrhovi simetrični in ustrezati obliki Gaussove porazdelitve, kot je prikazano na sliki 1a. Kaj pričakujemo od širin vrhov, je bolj zapleteno vprašanje in o tej temi bomo razpravljali v prihodnjem članku. Druga oblika vrhov s na sliki 1 prikazujejo nekatere druge možnosti, ki bi jih lahko opazili – z drugimi besedami, nekaj načinov, kako bi lahko šlo kaj narobe. V nadaljevanju tega dela bomo posvetili nekaj časa razpravi o nekaterih specifičnih primerih situacij, ki lahko privedejo do teh tipov oblik.
Včasih vrhov v kromatogramu, kjer se pričakuje, da bodo eluirani, sploh ni opaziti. Zgornji stenski diagram kaže, da je odsotnost vrha (ob predpostavki, da vzorec dejansko vsebuje ciljni analit v koncentraciji, zaradi katere mora biti odziv detektorja zadosten, da ga vidimo nad šumom) običajno povezana s težavo z instrumentom ali nepravilnimi pogoji mobilne faze (če ga sploh opazimo).vrhovi, običajno prešibki). Kratek seznam možnih težav in rešitev v tej kategoriji lahko najdete v tabeli I.
Kot je bilo omenjeno zgoraj, je vprašanje, koliko razširitve vrhov je treba tolerirati, preden mu posvetimo pozornost in ga poskušamo popraviti, zapletena tema, o kateri bom razpravljal v prihodnjem članku. Moje izkušnje kažejo, da znatno razširitev vrhov pogosto spremlja znatna sprememba oblike vrhov, rep vrhov pa je pogostejši kot pred vrhom ali cepitev. Vendar pa so nominalno simetrični vrhovi prav tako razširjeni, kar je lahko posledica nekaj različnih razlogov:
Vsaka od teh težav je bila podrobno obravnavana v prejšnjih številkah Troubleshooting LC in bralci, ki jih zanimajo te teme, se lahko obrnejo na te prejšnje članke za informacije o temeljnih vzrokih in možnih rešitvah teh težav.Več podrobnosti.
Zaostajanje vrhov, frontiranje vrhov in cepitev lahko povzročijo kemični ali fizikalni pojavi, seznam možnih rešitev za te težave pa se zelo razlikuje glede na to, ali imamo opravka s kemičnim ali fizikalnim problemom. Pogosto lahko s primerjavo različnih vrhov v kromatogramu najdete pomembne namige o tem, kateri je krivec. Če imajo vsi vrhovi v kromatogramu podobne oblike, vzrok najverjetneje ni fizični. .Če je prizadet le eden ali nekaj vrhov, preostali pa so videti v redu, je vzrok najverjetneje kemični.
Kemični vzroki največjega zaostanka so preveč zapleteni, da bi tukaj na kratko razpravljali. Zainteresirani bralec je napoten na nedavno številko »Odpravljanje težav pri LC« za bolj poglobljeno razpravo (10). Vendar je enostavno poskusiti zmanjšati maso vbrizganega analita in videti, ali se oblika vrha izboljša. Če je tako, potem je to dober namig, da je težava »masna preobremenitev«. V tem primeru mora biti metoda omejena na vbrizgavanje majhne mase analita ali pa je treba kromatografske pogoje spremeniti tako, da je mogoče doseči dobre oblike vrhov tudi z vbrizganimi večjimi masami.
Obstaja tudi veliko možnih fizičnih razlogov za najvišjo vrednost repa. Bralci, ki jih zanima podrobna razprava o možnostih, so napoteni na drugo nedavno številko »LC Troubleshooting« (11). Eden pogostejših fizičnih vzrokov za največjo vrednost repa je slaba povezava na točki med injektorjem in detektorjem (12). Ekstremen primer je prikazan na sliki 1d, pridobljen v mojem laboratoriju pred nekaj tedni. V tem primeru smo zgradili sistem z novo injekcijo ventil, ki ga prej nismo uporabljali, in namestili injekcijsko zanko majhne prostornine z obročkom, ki je bil vlit na kapilaro iz nerjavečega jekla. Po nekaj začetnih poskusih za odpravljanje težav smo ugotovili, da je globina odprtine v statorju ventila za vbrizgavanje veliko globlja, kot smo bili navajeni, kar je povzročilo veliko mrtvo prostornino na dnu odprtine. To težavo zlahka rešimo z zamenjavo injekcijske zanke z drugo cevjo, lahko prilagodimo železo postavite v pravilen položaj, da odpravite mrtvo prostornino na dnu vrat.
Čelne vrhove, kot so prikazani na sliki 1e, lahko povzročijo tudi fizične ali kemične težave. Pogost fizikalni vzrok za vodilni rob je, da postelja delcev v stolpcu ni dobro zapakirana ali da so se delci sčasoma reorganizirali. Tako kot pri koničnem repu, ki ga povzroča ta fizikalni pojav, je najboljši način, da to odpravite, da zamenjate stolpec in nadaljujete. V bistvu so oblike vrhov vodilnega roba s kemičnim izvorom pogosto posledica tega, kar imenujemo »ne V idealnih (linearnih) pogojih je količina analita, ki ga zadrži stacionarna faza (torej retencijski faktor), linearno povezana s koncentracijo analita v koloni. Kromatografsko to pomeni, da ko se masa analita, vbrizganega v kolono, povečuje, vrh postane višji, vendar ne širši. To razmerje se prekine, ko je retenzijsko vedenje nelinearno in vrhovi ne postanejo le ta nižji, ampak tudi širši, ko je vbrizgana večja masa. Poleg tega nelinearne oblike določajo obliko kromatografskih vrhov, kar ima za posledico vodilne ali zadnje robove. Tako kot pri masni preobremenitvi, ki povzroči rep vrhov (10), je mogoče tudi vodenje vrhov, ki ga povzroča nelinearna retenca, diagnosticirati z zmanjšanjem mase vbrizganega analita. Če se oblika vrhov izboljša, je treba metodo spremeniti tako, da ne preseže kakovosti vbrizga, ki povzroča vodilni rob, ali kromatografske pogoje je treba spremeniti, da se to obnašanje čim bolj zmanjša.
Včasih opazimo nekaj, kar se zdi kot "razdeljen" vrh, kot je prikazano na sliki 1f. Prvi korak pri reševanju tega problema je ugotoviti, ali je oblika vrha posledica delne koelucije (tj. prisotnosti dveh različnih, vendar tesno eluiranih spojin). Če dejansko obstajata dva različna analita, ki se eluirata blizu skupaj, potem je treba izboljšati njuno ločljivost (na primer s povečanjem selektivnosti, zadrževanja ali števila plošč) in navideznega »razcepljeni« vrhovi so povezani s fizično zmogljivostjo. Zmogljivost nima nobene zveze s samim stolpcem. Pogosto je najpomembnejši namig pri tej odločitvi, ali imajo vsi vrhovi v kromatogramu razcepljene oblike ali samo enega ali dva. Če gre samo za enega ali dva, gre verjetno za težavo s soelucijo;če so vsi vrhovi razdeljeni, je to verjetno fizična težava, najverjetneje povezana s samim stolpcem.
Razcepljeni vrhovi, povezani s fizikalnimi lastnostmi same kolone, so običajno posledica delno blokiranih vstopnih ali izstopnih frit ali reorganizacije delcev v koloni, kar omogoča, da mobilna faza teče hitreje kot mobilna faza na določenih območjih oblikovanja kanala kolone v drugih regijah (11). Delno zamašeno frito je včasih mogoče očistiti z obračanjem toka skozi kolono;vendar je po mojih izkušnjah to običajno kratkoročna in ne dolgoročna rešitev. To je pri sodobnih kolonah pogosto usodno, če se delci ponovno združijo znotraj kolone. Na tej točki je najbolje zamenjati kolono in nadaljevati.
Vrh na sliki 1g, prav tako iz nedavnega primera v mojem lastnem laboratoriju, običajno kaže, da je signal tako visok, da je dosegel najvišjo mejo odzivnega območja. Pri detektorjih optične absorbance (v tem primeru UV-vis), ko je koncentracija analita zelo visoka, analit absorbira večino svetlobe, ki prehaja skozi pretočno celico detektorja, tako da je zaznati zelo malo svetlobe. Pod temi pogoji na električni signal iz fotodetektorja močno vplivajo različni viri hrupa, kot sta razpršena svetloba in "temni tok", zaradi česar je signal zelo "nejasen" na videz in neodvisen od koncentracije analita.Ko se to zgodi, je težavo pogosto mogoče zlahka rešiti z zmanjšanjem količine vbrizganega analita – z zmanjšanjem količine vbrizganja, redčenjem vzorca ali obojega.
In chromatography school, we use the detector signal (ie, the y-axis in the chromatogram) as an indicator of the analyte concentration in the sample.So it seems odd to see a chromatogram with a signal below zero, as the simple interpretation is that this indicates a negative analyte concentration – which of course is not physically possible.In my experience, negative peaks are most often observed when using optical absorbance detectors (eg, UV-vis).
V tem primeru negativni vrh preprosto pomeni, da molekule, ki se eluirajo iz kolone, absorbirajo manj svetlobe kot sama mobilna faza tik pred vrhom in po njem. To se lahko zgodi na primer pri uporabi relativno nizkih valovnih dolžin zaznavanja (<230 nm) in dodatkov mobilne faze, ki absorbirajo večino svetlobe pri teh valovnih dolžinah. Takšni dodatki so lahko komponente topila mobilne faze, kot je metanol, ali komponente pufra, kot sta acetat ali format. Dejansko lahko uporabite negativne vrhove za pripravo umeritvene krivulje in pridobitev natančnih kvantitativnih informacij, zato ni temeljnega razloga, da bi se jim samim po sebi izogibali (to metodo včasih imenujemo "posredna UV-detekcija") (13). Če pa se res želimo v celoti izogniti negativnim vrhom, je v primeru detekcije absorbance najboljša rešitev uporaba druge valovne dolžine detekcije, tako da analit absorbira več kot mobilna faza, ali spremeniti sestavo mobilne faze tako da absorbirajo manj svetlobe kot analiti.
Negativni vrhovi se lahko pojavijo tudi pri uporabi zaznavanja lomnega količnika (RI), ko se lomni količnik komponent, ki niso analit v vzorcu, kot je matriks topila, razlikuje od lomnega količnika mobilne faze. To se zgodi tudi pri zaznavanju UV-vis, vendar je ta učinek ponavadi oslabljen glede na zaznavanje RI. V obeh primerih je mogoče negativne vrhove zmanjšati tako, da se natančneje ujemate s sestavo matrike vzorca. tistemu mobilne faze.
V tretjem delu o osnovni temi odpravljanja težav s LC sem razpravljal o situacijah, v katerih se opažena oblika vrha razlikuje od pričakovane ali običajne oblike vrha. Učinkovito odpravljanje takšnih težav se začne s poznavanjem pričakovanih oblik vrha (na podlagi teorije ali predhodnih izkušenj z obstoječimi metodami), zato so odstopanja od teh pričakovanj očitna. Težave z obliko vrha imajo veliko različnih potencialnih vzrokov (preširoko, rep, vodilni rob itd.). V tem delu podrobno razpravljam o nekaterih razlogih Vidim najpogosteje. Poznavanje teh podrobnosti je dobro mesto za začetek odpravljanja težav, vendar ne zajame vseh možnosti. Bralci, ki jih zanima bolj poglobljen seznam vzrokov in rešitev, se lahko obrnejo na stensko tabelo LCGC »LC Troubleshooting Guide«.
(4) Stenska tabela LCGC »LC Troubleshooting Guide«. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza podatkov in obdelava signalov v kromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF in Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.