Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Tekoča biopsija (LB) je koncept, ki hitro pridobiva na priljubljenosti na področju biomedicine.Koncept temelji predvsem na detekciji fragmentov krožeče zunajcelične DNA (ccfDNA), ki se večinoma sprostijo kot majhni fragmenti po celični smrti v različnih tkivih.Majhen delež teh drobcev izvira iz tujih (tujih) tkiv ali organizmov.V trenutnem delu smo ta koncept uporabili za školjke, nadzorno vrsto, znano po visoki zmogljivosti filtriranja morske vode.Uporabljamo sposobnost školjk, da delujejo kot naravni filtri za zajemanje okoljskih fragmentov DNK iz različnih virov, da zagotovimo informacije o biotski raznovrstnosti morskih obalnih ekosistemov.Naši rezultati kažejo, da hemolimfa školjk vsebuje fragmente DNA, ki se zelo razlikujejo po velikosti, od 1 do 5 kb.Sekvenciranje puške je pokazalo, da je veliko število fragmentov DNK tujega mikrobnega izvora.Med njimi smo našli fragmente DNK bakterij, arhej in virusov, vključno z virusi, za katere je znano, da okužijo različne gostitelje, ki jih običajno najdemo v obalnih morskih ekosistemih.Na koncu naša študija dokazuje, da koncept LB, uporabljen za školjke, predstavlja bogat, a še neraziskan vir znanja o mikrobni raznolikosti v morskih obalnih ekosistemih.
Vpliv podnebnih sprememb (CC) na biotsko raznovrstnost morskih ekosistemov je hitro rastoče področje raziskav.Globalno segrevanje ne povzroča le pomembnih fizioloških obremenitev, ampak tudi premika evolucijske meje toplotne stabilnosti morskih organizmov, vpliva na habitat številnih vrst in jih spodbuja k iskanju ugodnejših pogojev [1, 2].Poleg tega, da vpliva na biotsko raznovrstnost metazojev, CC poruši občutljivo ravnovesje med interakcijami gostitelj-mikrob.Ta mikrobna disbakterioza predstavlja resno grožnjo morskim ekosistemom, saj naredi morske organizme bolj dovzetne za nalezljive patogene [3, 4].Menijo, da imajo SS pomembno vlogo pri množičnih smrtih, kar je resen problem za upravljanje globalnih morskih ekosistemov [5, 6].To je pomembno vprašanje glede na gospodarske, ekološke in prehranske vplive številnih morskih vrst.To še posebej velja za školjke, ki živijo v polarnih regijah, kjer so učinki CK takojšnji in resnejši [6, 7].Pravzaprav školjke, kot je Mytilus spp.se pogosto uporabljajo za spremljanje učinkov CC na morske ekosisteme.Ni presenetljivo, da je bilo za spremljanje njihovega zdravja razvito razmeroma veliko število biomarkerjev, pogosto pa z dvotirnim pristopom, ki vključuje funkcionalne biomarkerje, ki temeljijo na encimski aktivnosti ali celičnih funkcijah, kot sta sposobnost preživetja celic in fagocitna aktivnost [8].Te metode vključujejo tudi merjenje koncentracije specifičnih kazalnikov tlaka, ki se kopičijo v mehkih tkivih po absorpciji velikih količin morske vode.Vendar pa visoka filtracijska zmogljivost in pol odprti krvni sistem škoda ponujata priložnost za razvoj novih biomarkerjev hemolimf z uporabo koncepta tekoče biopsije (LB), preprostega in minimalno invazivnega pristopa k upravljanju pacientov.vzorci krvi [9, 10].Čeprav je v človeškem LB mogoče najti več vrst krožnih molekul, ta koncept temelji predvsem na analizi sekvenciranja DNA cirkulacijskih zunajceličnih fragmentov DNA (ccfDNA) v plazmi.Dejansko je prisotnost kroženja DNK v človeški plazmi znana že od sredine 20. stoletja [11], vendar je šele v zadnjih letih dohod metod zaporedja z visoko prepustnostjo privedlo do klinične diagnoze, ki temelji na ccfDNA.Prisotnost teh krožnih fragmentov DNK je delno posledica pasivnega sproščanja genomske DNK (jedrskega in mitohondrijskega) po celični smrti. Pri zdravih osebah je koncentracija ccfDNA običajno nizka (<10 ng/mL), vendar se lahko poveča za 5–10-krat pri bolnikih, ki trpijo zaradi različnih patologij ali so podvrženi stresu, kar povzroči poškodbe tkiva. Pri zdravih osebah je koncentracija ccfDNA običajno nizka (<10 ng/mL), vendar se lahko poveča za 5–10-krat pri bolnikih, ki trpijo zaradi različnih patologij ali so podvrženi stresu, kar povzroči poškodbe tkiva. Pri zdravih ljudeh je koncentracija vkkDNK v normi nizka (<10 ng/ml), vendar se lahko poveča za 5–10 krat pri bolnikih z drugačno patologijo ali pod stresom, ki povzroča poškodbe tkiv. Pri zdravih ljudeh je koncentracija cccDNA običajno nizka (<10 ng/mL), lahko pa se poveča za 5–10-krat pri bolnikih z različnimi patologijami ali pod stresom, ki vodi do poškodbe tkiva.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低．(<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Koncentracije ccfDNA so običajno nizke (<10 ng/ml) pri zdravih ljudeh, vendar se lahko povečajo za 5-10 krat pri bolnikih z različnimi patologijami ali stresom, kar povzroči poškodbe tkiv. Koncentracije ccfDNA so običajno nizke (<10 ng/ml) pri zdravih osebah, vendar se lahko povečajo za 5-10-krat pri bolnikih z različnimi patologijami ali stresom, kar povzroči poškodbe tkiva.Velikost fragmentov ccfDNA je zelo različna, vendar običajno znaša od 150 do 200 bp.[12].Analizo samoizpeljane ccfDNA, tj. ccfDNA iz normalnih ali transformiranih gostiteljskih celic, je mogoče uporabiti za odkrivanje genetskih in epigenetskih sprememb, prisotnih v jedrskem in/ali mitohondrijskem genomu, s čimer zdravnikom pomaga pri izbiri specifičnih molekularno usmerjenih terapij [13].Vendar pa je ccfDNA mogoče pridobiti iz tujih virov, kot je ccfDNA iz fetalnih celic med nosečnostjo ali iz presajenih organov [14,15,16,17].ccfDNA je tudi pomemben vir informacij za odkrivanje prisotnosti nukleinskih kislin povzročitelja okužbe (tujek), ki omogoča neinvazivno odkrivanje razširjenih okužb, ki jih hemokulture ne prepoznajo, in se izognemo invazivni biopsiji okuženega tkiva [18].Nedavne študije so dejansko pokazale, da človeška kri vsebuje bogat vir informacij, ki se lahko uporabijo za identifikacijo virusnih in bakterijskih patogenov, in da je približno 1 % ccfDNA, najdene v človeški plazmi, tujega izvora [19].Te študije dokazujejo, da je biotsko raznovrstnost krožečega mikrobioma organizma mogoče oceniti z analizo ccfDNA.Vendar se je do nedavnega ta koncept uporabljal izključno pri ljudeh in v manjši meri pri drugih vretenčarjih [20, 21].
V tem članku uporabljamo potencial LB za analizo ccfDNA Aulacomya atra, južne vrste, ki jo običajno najdemo na subantarktičnih Kerguelenovih otokih, skupini otokov na vrhu velike planote, ki je nastala pred 35 milijoni let.vulkanski izbruh.Z uporabo eksperimentalnega sistema in vitro smo ugotovili, da školjke hitro prevzamejo fragmente DNK v morski vodi in vstopijo v hemolimfni del.Sekvenciranje puške je pokazalo, da ccfDNA hemolimfe školjk vsebuje fragmente DNK lastnega in nelastnega izvora, vključno s simbiotičnimi bakterijami in fragmenti DNK iz biomov, značilnih za hladne vulkanske morske obalne ekosisteme.Hemolimfna ccfDNA vsebuje tudi virusne sekvence, pridobljene iz virusov z različnimi vrstami gostiteljev.Našli smo tudi fragmente DNK večceličnih živali, kot so koščene ribe, morske vetrnice, alge in žuželke.Na koncu naša študija dokazuje, da je mogoče koncept LB uspešno uporabiti za morske nevretenčarje, da ustvarite bogat genomski repertoar v morskih ekosistemih.
Odrasli (55-70 mm dolgi) Mytilus platensis (M. platensis) in Aulacomya atra (A. atra) so bili zbrani z medplimskih skalnatih obal Port-au-France (049°21.235 J, 070°13.490 V.).Otoki Kerguelen decembra 2018. Druge odrasle modre školjke (Mytilus spp.) so bile pridobljene od komercialnega dobavitelja (PEI Mussel King Inc., Otok princa Edvarda, Kanada) in postavljene v temperaturno nadzorovano (4 °C) posodo s prezračevanjem, ki vsebuje 10–20 L 32‰ umetne slanice.(umetna morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginija, ZDA).Za vsak poskus smo izmerili dolžino in težo posameznih školjk.
Brezplačen odprt dostopni protokol za ta program je na voljo na spletu (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Na kratko, hemolimfa LB je bila zbrana iz mišic abduktorjev, kot je opisano [22].Hemolimfo smo zbistrili s centrifugiranjem pri 1200×g 3 minute, supernatant do uporabe zamrznili (-20°C).Za izolacijo in čiščenje cfDNA smo vzorce (1,5-2,0 ml) odmrznili in obdelali s kompletom NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) v skladu z navodili proizvajalca.ccfDNA smo shranili pri -80 °C do nadaljnje analize.V nekaterih poskusih je bila ccfDNA izolirana in prečiščena z uporabo QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Očiščeno DNA smo kvantificirali s standardnim testom PicoGreen.Porazdelitev fragmentov izolirane ccfDNA smo analizirali s kapilarno elektroforezo z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) z uporabo kompleta DNA visoke občutljivosti.Test smo izvedli z uporabo 1 µl vzorca ccfDNA v skladu z navodili proizvajalca.
Za sekvenciranje fragmentov ccfDNA hemolimfe je Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pripravil knjižnice pušk z uporabo kompleta Illumina DNA Mix kompleta Illumina MiSeq PE75.Uporabljen je bil standardni adapter (BioO).Datoteke z neobdelanimi podatki so na voljo v arhivu branja zaporedja NCBI (SRR8924808 in SRR8924809).Osnovna kakovost branja je bila ocenjena s FastQC [23].Trimmomatic [24] je bil uporabljen za striženje adapterjev in branje slabe kakovosti.Odčitki puške s seznanjenimi konci so bili FLASH združeni v daljše posamezne odčitke z najmanjšim prekrivanjem 20 bp, da bi se izognili neusklajenosti [25]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo podatkovne baze taksonomije školjk NCBI (vrednost e < 1e-3 in 90-odstotna homologija), maskiranje zaporedij nizke kompleksnosti pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo podatkovne baze taksonomije školjk NCBI (vrednost e < 1e-3 in 90-odstotna homologija), maskiranje zaporedij nizke kompleksnosti pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni podatki so bili označeni s pomočjo BLASTN z uporabo podatkovne baze taksonomije dvotvornih moljuskov NCBI (značilnost e < 1e-3 in 90 % gomologije), maskiranje nizke zapletenosti pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo baze podatkov o taksonomiji školjk NCBI (vrednost e < 1e-3 in 90-odstotna homologija), nizko kompleksno maskiranje zaporedja pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 prah [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Združeni podatki so bili označeni s pomočjo BLASTN z uporabo taksonomske baze podatkov dvotvornih moljuskov NCBI (razmernost e <1e-3 in 90 % gomologije), maskiranje nizke zapletenosti pa je bilo izvedeno z DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo NCBI taksonomske baze podatkov o školjkah (vrednost e <1e-3 in 90-odstotna homologija), nizko kompleksno maskiranje zaporedja pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26].Odčitki so bili razdeljeni v dve skupini: povezani s sekvencami školjk (tukaj imenovani samoodčitavanja) in nepovezani (nesamoodčitavanja).Dve skupini sta bili ločeno sestavljeni z uporabo MEGAHIT-a za ustvarjanje kontigov [27].Medtem je bila taksonomska porazdelitev odčitkov mikrobioma tujcev razvrščena z uporabo Kraken2 [28] in grafično predstavljena s krožnim grafikonom Krona na Galaxy [29, 30].Iz naših predhodnih poskusov smo določili, da je optimalni kmer kmer-59. Lastni kontigi so bili nato identificirani s poravnavo z BLASTN (zbirka podatkov NCBI o školjkah, vrednost e < 1e-10 in 60 % homologija) za končno opombo. Lastni kontigi so bili nato identificirani s poravnavo z BLASTN (zbirka podatkov NCBI o školjkah, vrednost e < 1e-10 in 60 % homologija) za končno opombo. Nato so bili lastni kontigi identificirani s sopostavko z BLASTN (baza podatkov dvotvornih mehkužcev NCBI, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%) za dokončno opombo. Samokontigi so bili nato identificirani z ujemanjem z BLASTN (zbirka podatkov o školjkah NCBI, vrednost e <1e-10 in 60 % homologija) za končno opombo.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Nato so bili identificirani lastni kontigi za dokončne opombe s sopostavko z BLASTN (baza podatkov NCBI za dvotvorne moljuske, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%). Samokontigi so bili nato identificirani za končno opombo z ujemanjem z BLASTN (zbirka podatkov o školjkah NCBI, vrednost e <1e-10 in 60-odstotna homologija). Vzporedno so bili kontigi skupin, ki niso lastne sebi, označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija). Vzporedno so bili kontigi skupin, ki niso lastne sebi, označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija). .Parallelьno чuжerodnыe grupOvыe konjigi bylierotirOnы ° °ю Blastn (byз 1e-10 °, el) Vzporedno so bili kontigi tujih skupin označeni z BLASTN (baza podatkov NT NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠群。 .PARelElOnTosgi, nednocsEsSesK KSOBSTVENNOй GRUPPE, ыLiNoTirotion IGOMOLOGI 60%). Vzporedno so bili kontigi skupin, ki niso lastni, označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija). BLASTX je bil izveden tudi na kontigih, ki niso lastni sebi, z uporabo baz podatkov NCBI o beljakovinah nr in RefSeq (vrednost e < 1e-10 in 60-odstotna homologija). BLASTX je bil izveden tudi na kontigih, ki niso lastni sebi, z uporabo baz podatkov NCBI o beljakovinah nr in RefSeq (vrednost e < 1e-10 in 60-odstotna homologija). Blastx ыl bыl perrODedne nanematelerelьnых Konjiga 60%). BLASTX je bil izveden tudi na nesamostojnih kontigih z uporabo podatkovnih baz beljakovin nr in RefSeq NCBI (vrednost e < 1e-10 in 60-odstotna homologija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60 % 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60 % 同源性）。 BLASTX je prav tako deloval na nesamostalnih kontigah z uporabo baznih podatkov bele št. in RefSeq NCBI (pomen e <1e-10 in gomologija 60 %). BLASTX je bil izveden tudi na nesamostojnih kontigih z uporabo podatkovnih zbirk beljakovin nr in RefSeq NCBI (vrednost e <1e-10 in 60 % homologija).Baze BLASTN in BLASTX nesamokontigov predstavljajo končne kontige (glejte dodatno datoteko).
Primerji, uporabljeni za PCR, so navedeni v tabeli S1.Taq DNA polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) je bila uporabljena za pomnoževanje ciljnih genov ccfDNA.Uporabljeni so bili naslednji reakcijski pogoji: denaturacija pri 95 ° C 3 minute, 95 ° C 1 minuto, nastavite temperaturo žarjenja 1 minuto, podaljšanje pri 72 ° C 1 minuto, 35 ciklov in končno 72 ° C v 10 minutah..PCR izdelke smo ločili z elektroforezo v agaroznih gelih (1,5%), ki vsebujejo SYBRTM varno madež z gelom DNA (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pri 95 V.
Školjke (Mytilus spp.) so bile 24 ur aklimatizirane v 500 ml oksigenirane morske vode (32 PSU) pri 4 °C.Plazmidni DNK, ki vsebuje vložek, ki kodira človeško galektin-7 cDNA zaporedje (pristopna številka NCBI L07769), smo dodali vialu pri končni koncentraciji 190 μg/μl.Kontrola so bile školjke, inkubirane pod enakimi pogoji brez dodajanja DNK.Tretji kontrolni rezervoar je vseboval DNK brez školjk.Za spremljanje kakovosti DNK v morski vodi so bili vzorci morske vode (20 μl; tri ponovitve) odvzeti iz vsakega rezervoarja ob določenem času.Za sledljivost plazmidne DNA so bile školjke LB pobrane ob navedenih časih in analizirane s qPCR in ddPCR.Zaradi visoke vsebnosti soli v morski vodi so bili alikvoti pred vsemi testi PCR razredčeni v vodi kakovosti PCR (1:10).
Digitalni kapljični PCR (ddPCR) je bil izveden z uporabo protokola BioRad QX200 (Misissauga, Ontario, Kanada).Za določitev optimalne temperature uporabite temperaturni profil (tabela S1).Kapljice so bile ustvarjene z generatorjem kapljic QX200 (BioRad).ddPCR smo izvedli na naslednji način: 95 °C 5 minut, 50 ciklov 95 °C 30 s in dano temperaturo žarjenja 1 minuto in 72 °C 30 sekund, 4 °C 5 minut in 90 °C v 5 minutah.Število kapljic in pozitivnih reakcij (število kopij/µl) smo izmerili z bralnikom kapljic QX200 (BioRad).Vzorci z manj kot 10.000 kapljicami so bili zavrnjeni.Kontrola vzorca ni bila izvedena vsakič, ko je bil zagnan ddPCR.
qPCR je bil izveden z uporabo Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Avstralija) in LGALS7 specifičnih primerjev.Vse kvantitativne PCR so bile izvedene v 20 µl z uporabo kompleta QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).qPCR se je začel s 15-minutno inkubacijo pri 95 °C, ki ji je sledilo 40 ciklov pri 95 °C za 10 sekund in pri 60 °C za 60 sekund z enim zbiranjem podatkov.Krivulje taljenja so bile ustvarjene z zaporednimi meritvami pri 95 °C 5 s, 65 °C 60 s in 97 °C na koncu qPCR.Vsak qPCR je bil izveden v treh izvodih, razen kontrolnih vzorcev.
Ker so školjke znane po visoki stopnji filtracije, smo najprej raziskali, ali lahko filtrirajo in zadržijo fragmente DNK, ki so prisotni v morski vodi.Zanimalo nas je tudi, ali se ti drobci kopičijo v njihovem polodprtem limfnem sistemu.To težavo smo eksperimentalno rešili tako, da smo izsledili usodo topnih fragmentov DNK, dodanih v rezervoarje z modrimi školjkami.Za lažje sledenje fragmentom DNK smo uporabili tujo (ne lastno) plazmidno DNK, ki vsebuje človeški gen galektin-7.ddPCR izsledi fragmente plazmidne DNA v morski vodi in školjkah.Naši rezultati kažejo, da če je količina fragmentov DNA v morski vodi ostala relativno konstantna skozi čas (do 7 dni) v odsotnosti školjk, potem je v prisotnosti školjk ta raven skoraj popolnoma izginila v 8 urah (sl. 1a,b).Fragmente eksogene DNA smo zlahka odkrili v 15 minutah v intravalvularni tekočini in hemolimfi (slika 1c).Te delce je bilo mogoče zaznati še do 4 ure po izpostavljenosti.Ta filtrirna aktivnost glede na fragmente DNA je primerljiva s filtrirno aktivnostjo bakterij in alg [31].Ti rezultati kažejo, da lahko školjke filtrirajo in kopičijo tujo DNK v svojih predelkih s tekočino.
Relativne koncentracije plazmidne DNA v morski vodi v prisotnosti (A) ali odsotnosti (B) školjk, izmerjene z ddPCR.V A so rezultati izraženi v odstotkih, pri čemer obrobe polj predstavljajo 75. in 25. percentil.Prilagojena logaritemska krivulja je prikazana rdeče, območje, osenčeno s sivo, pa predstavlja 95-odstotni interval zaupanja.V B rdeča črta predstavlja povprečje, modra črta pa 95-odstotni interval zaupanja za koncentracijo.C Kopičenje plazmidne DNA v hemolimfi in valvularni tekočini školjk ob različnih časih po dodatku plazmidne DNA.Rezultati so predstavljeni kot absolutne zaznane kopije/mL (±SE).
Nato smo raziskali izvor ccfDNA v školjkah, zbranih iz školjčišč na Kerguelenovih otokih, oddaljeni skupini otokov z omejenim antropogenim vplivom.V ta namen je bila cccDNA iz hemolimf školjk izolirana in prečiščena z metodami, ki se običajno uporabljajo za čiščenje človeške cccDNA [32, 33].Ugotovili smo, da so povprečne koncentracije ccfDNA hemolimfe v školjkah v območju nizkih mikrogramov na ml hemolimfe (glejte tabelo S2, dodatne informacije).Ta razpon koncentracij je veliko večji kot pri zdravih ljudeh (nizki nanogrami na mililiter), vendar lahko v redkih primerih pri bolnikih z rakom raven ccfDNA doseže več mikrogramov na mililiter [34, 35].Analiza porazdelitve velikosti hemolimfne ccfDNA je pokazala, da se ti fragmenti zelo razlikujejo po velikosti, in sicer od 1000 bp do 1000 bp.do 5000 bp (slika 2).Podobni rezultati so bili dobljeni s pomočjo kompleta za raziskovanje QiaAmp na osnovi silicijevega dioksida, metode, ki se običajno uporablja pri forenzični znanosti za hitro izolacijo in čiščenje genomske DNK iz vzorcev DNK z nizko koncentracijo, vključno s ccfDNA [36].
Reprezentativni elektroforegram ccfDNA hemolimfe školjk.Ekstrahirano z NucleoSnap Plasma Kit (zgoraj) in QIAamp DNA Investigator Kit.B Violinski graf, ki prikazuje porazdelitev koncentracij ccfDNA hemolimfe (±SE) v školjkah.Črna in rdeča črta predstavljata mediano ter prvi in ​​tretji kvartil.
Približno 1 % ccfDNA pri ljudeh in primatih ima tuj vir [21, 37].Glede na pol odprti krožni sistem školjk, morsko vodo, bogato z mikrobi, in porazdelitev velikosti školjke ccfDNA, smo domnevali, da lahko školjska hemolimfna ccfDNA vsebuje bogat in raznolik bazen mikrobne DNK.Da bi preizkusili to hipotezo, smo sekvencirali ccfDNA hemolimfe iz vzorcev Aulacomya atra, zbranih z otokov Kerguelen, kar je prineslo več kot 10 milijonov odčitkov, od katerih jih je 97,6 % prestalo nadzor kakovosti.Odčitki so bili nato razvrščeni v skladu z viri in ne-samimi viri z uporabo baznih baz Blastn in NCBI (slika S1, dodatne informacije).
Pri ljudeh se lahko tako jedrska kot mitohondrijska DNK sprostita v krvni obtok [38].Vendar v tej študiji ni bilo mogoče podrobno opisati jedrske genomske DNK školjk, glede na to, da genom A. atra ni bil sekvenciran ali opisan.Vendar smo lahko identificirali številne fragmente ccfDNA našega izvora z uporabo knjižnice školjk (slika S2, dodatne informacije).Prisotnost fragmentov DNA lastnega izvora smo potrdili tudi z usmerjenim PCR pomnoževanjem tistih genov A. atra, ki smo jih sekvencirali (slika 3).Podobno, glede na to, da je mitohondrijski genom A. atra na voljo v javnih bazah podatkov, je mogoče najti dokaze o prisotnosti mitohondrijskih fragmentov ccfDNA v hemolimfi A. atra.Prisotnost fragmentov mitohondrijske DNA smo potrdili s PCR pomnoževanjem (slika 3).
V hemolimfi A. atra (rdeče pike - številka zalog: srx5705969) in M. platenssis (modre pike - številka: SRX5705968), ojačana s PCR, so bili prisotni različni mitohondrijski geni.Slika prirejena po Breton et al., 2011 B Pomnoževanje supernatanta hemolimfe iz A. atra Shranjeno na FTA papirju.Uporabite 3 mm luknjač za dodajanje neposredno v epruveto PCR, ki vsebuje mešanico PCR.
Glede na obilno vsebnost mikrobov v morski vodi smo se sprva osredotočili na karakterizacijo sekvenc mikrobne DNK v hemolimfi.Za to uporabljamo dve različni strategiji.Prva strategija je uporabljala Kraken2, na algoritmu temelječ program za klasifikacijo zaporedij, ki lahko identificira mikrobna zaporedja z natančnostjo, primerljivo z BLAST in drugimi orodji [28].Za več kot 6719 odčitkov je bilo ugotovljeno, da so bakterijskega izvora, medtem ko je bilo 124 in 64 iz arhej oziroma virusov (slika 4).Najpogostejši fragmenti bakterijske DNA so bili Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) in Bacteroidetes (17 %) (slika 4a).Ta porazdelitev je skladna s prejšnjimi študijami mikrobioma morske modre školjke [39, 40].Gammaproteobacteria so bile glavni razred Proteobacteria (44%), vključno s številnimi Vibrionales (slika 4b).Metoda ddPCR je potrdila prisotnost fragmentov DNA Vibrio v ccfDNA hemolimfe A. atra (slika 4c) [41].Za pridobitev več informacij o bakterijskem izvoru ccfDNA je bil uporabljen dodaten pristop (slika S2, dodatne informacije). V tem primeru se glasi, da so bili prekrito sestavljeni kot brali v paru in so bili razvrščeni kot self (školjke) ali nepoštenega izvora z uporabo Blastn in E vrednost 1e-3 in izklop z> 90% homologije. V tem primeru se glasi, da so bili prekrito sestavljeni kot brali v paru in so bili razvrščeni kot self (školjke) ali nepoštenega izvora z uporabo Blastn in E vrednost 1e-3 in izklop z> 90% homologije. V tem primeru so bile prekrivajoče se čtenije zbrane kot čtenije s parnimi konci in klasificirane kot lastne (dvustvorčati moljuski) ali druge po izvoru z uporabo BLASTN in vrednosti e 1e-3 in odsekov z mologijo> 90%. V tem primeru so bila prekrivajoča se odčitava zbrana kot parna branja in so bili razvrščeni kot izvorni (školjki) ali ne-originalni z uporabo vrednosti Blastn in E 1E-3 in preseka z> 90% homologije.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90 % 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 V tem primeru so bile prekrivajoče se čtenije zbrane kot čtenije s parnimi konci in klasificirane kot lastne (dvustvorčati moljuski) ali neosebne po izvoru z uporabo vrednosti e BLASTN in 1e-3 in porabe gomologije> 90%. V tem primeru so bili prekrivajoči se odčitki zbrani kot seznanjeni odčitki in razvrščeni kot lastni (školjke) ali neoriginalni z uporabo vrednosti e BLASTN in 1e-3 ter pragom homologije > 90 %.Ker genom A. Atra še ni bil sekvenciran, smo uporabili strategijo montaže de novo kompleta Megahit naslednje generacije (NGS).Skupaj 147.188 kontigov je bilo opredeljenih kot odvisni (školjke) izvora.Ti kontigi so bili nato eksplodirani z e-vrednostmi 1e-10 z uporabo BLASTN in BLASTX.Ta strategija nam je omogočila identifikacijo 482 fragmentov neškoljk, prisotnih v ccfDNA A. atra.Več kot polovica (57%) teh fragmentov DNK je bilo pridobljenih iz bakterij, predvsem iz škrlic simbiontov, vključno s sulfotrofnimi simbionti in iz Gill Symbionts Solemya velum (slika 5).
Relativna številčnost na ravni tipa.B Mikrobna raznolikost dveh glavnih fil (Firmicutes in Proteobacteria).Reprezentativno pomnoževanje ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenti gena 16S rRNA (modri) v treh atra hemolimfah.
Skupno je bilo analiziranih 482 zbranih kontigov.Splošni profil taksonomske porazdelitve metagenomskih kontigov (prokarionti in evkarionti).B Podrobna porazdelitev fragmentov bakterijske DNA, identificirana z BLASTN in BLASTX.
Analiza Kraken2 je tudi pokazala, da je ccfDNA školjke vsebovala fragmente DNA arhej, vključno z fragmenti DNA Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) in Thaurmarcheota (11 %) (slika 6a).Prisotnost fragmentov DNK, pridobljenih iz Euryarchaeota in Crenarchaeota, ki so jih prej našli v mikrobni skupnosti kalifornijskih školjk, ne bi smela biti presenečenje [42].Čeprav je Euryarchaeota pogosto povezana z ekstremnimi pogoji, je zdaj priznano, da sta tako Euryarchaeota kot Crenarcheota med najpogostejšimi prokarionti v morskem kriogenem okolju [43, 44].Prisotnost metanogenih mikroorganizmov v školjkah ni presenetljiva, glede na nedavna poročila o obsežnem uhajanju metana iz spodnjih uhajanj na planoti Kerguelen [45] in možni mikrobni proizvodnji metana, opaženi ob obali otokov Kerguelen [46].
Naša pozornost se je nato preusmerila na odčitke iz DNK virusov.Kolikor nam je znano, je to prva neciljna študija vsebnosti virusa v školjkah.Kot je bilo pričakovano, smo našli fragmente DNA bakteriofagov (Caudovirales) (slika 6b).Vendar najpogostejša virusna DNK izvira iz skupine nukleocitovirusov, znanih tudi kot virus jedrske citoplazme velike DNK (NCLDV), ki ima največji genom od vseh virusov.Znotraj tega debla večina zaporedij DNK pripada družini Mimimidoviridae (58 %) in Poxviridae (21 %), katerih naravni gostitelji vključujejo vretenčarje in členonožce, medtem ko majhen delež teh zaporedij DNK pripada znanim virološkim algam.Okuži morske evkariontske alge.Sekvence so bile pridobljene tudi iz virusa Pandora, velikanskega virusa z največjo velikostjo genoma med vsemi znanimi virusnimi rodovi.Zanimivo je, da je bil obseg gostiteljev, za katere je znano, da so okuženi z virusom, kot je določeno s sekvenciranjem ccfDNA hemolimfe, razmeroma velik (slika S3, dodatne informacije).Vključuje viruse, ki okužijo žuželke, kot sta Baculoviridae in Iridoviridae, ter viruse, ki okužijo amebe, alge in vretenčarje.Našli smo tudi sekvence, ki se ujemajo z genomom Pithovirus sibericum.Pitovirusi (znani tudi kot "zombi virusi") so bili prvič izolirani iz 30.000 let starega permafrosta v Sibiriji [47].Tako so naši rezultati skladni s prejšnjimi poročili, ki kažejo, da niso vse sodobne vrste teh virusov izumrle [48] in da so lahko ti virusi prisotni v oddaljenih subarktičnih morskih ekosistemih.
Nazadnje smo testirali, ali lahko najdemo fragmente DNK drugih večceličnih živali.BLASTN in BLASTX sta identificirala skupaj 482 tujih kontigov s knjižnicami nt, nr in RefSeq (genomske in proteinske).Naši rezultati kažejo, da med tujimi fragmenti ccfDNA večceličnih živali prevladuje DNA kostnih kosti (slika 5).Našli so tudi fragmente DNK žuželk in drugih vrst.Relativno velik del fragmentov DNK ni bil identificiran, verjetno zaradi premajhne zastopanosti velikega števila morskih vrst v genomskih zbirkah podatkov v primerjavi s kopenskimi vrstami [49].
V tem prispevku uporabljamo koncept LB za školjke, pri čemer trdimo, da lahko zaporedje posnetkov hemolimfe ccfDNA zagotovi vpogled v sestavo morskih obalnih ekosistemov.Zlasti smo ugotovili, da 1) hemolimfa školjk vsebuje relativno visoke koncentracije (mikrogramske ravni) relativno velikih (~1-5 kb) krožečih fragmentov DNK;2) ti fragmenti DNK so samostojni in nesamostojni 3) Med tujimi viri teh fragmentov DNK smo našli DNK bakterij, arhej in virusov ter DNK drugih večceličnih živali;4) Kopičenje teh tujih fragmentov ccfDNA v hemolimfi poteka hitro in prispeva k notranji filtracijski aktivnosti školjk.Na koncu naša študija dokazuje, da koncept LB, ki se je doslej uporabljal predvsem na področju biomedicine, kodira bogat, a neraziskan vir znanja, ki ga je mogoče uporabiti za boljše razumevanje interakcije med kontrolnimi vrstami in njihovim okoljem.
Poleg primatov so poročali o izolaciji ccfDNA pri sesalcih, vključno z mišmi, psi, mačkami in konji [50, 51, 52].Vendar pa je, kolikor vemo, naša študija prva, ki poroča o odkrivanju in sekvenciranju ccfDNA v morskih vrstah z odprtim sistemom kroženja.Ta anatomska značilnost in sposobnost filtriranja školjk lahko vsaj delno pojasnita različne značilnosti velikosti krožečih fragmentov DNK v primerjavi z drugimi vrstami.Pri ljudeh je večina fragmentov DNK, ki krožijo po krvi, majhnih fragmentov velikosti od 150 do 200 bp.z največjim vrhom 167 bp [34, 53].Majhen, a pomemben del fragmentov DNK je velik med 300 in 500 bp, približno 5 % pa jih je daljših od 900 bp.[54].Razlog za to porazdelitev velikosti je, da se glavni vir ccfDNA v plazmi pojavi kot posledica celične smrti, bodisi zaradi celične smrti bodisi zaradi nekroze krvotvornih celic v obtoku pri zdravih posameznikih ali zaradi apoptoze tumorskih celic pri bolnikih z rakom (znano kot krožeča tumorska DNK)., ctDNA).Porazdelitev velikosti ccfDNA hemolimfe, ki smo jo našli v školjkah, je znašala od 1000 do 5000 bp, kar nakazuje, da ima ccfDNA školjke drugačen izvor.To je logična hipoteza, saj imajo školjke polodprt žilni sistem in živijo v morskih vodnih okoljih, ki vsebujejo visoke koncentracije mikrobne genomske DNK.Pravzaprav so naši laboratorijski poskusi z uporabo eksogene DNK pokazali, da školjke kopičijo fragmente DNK v morski vodi, vsaj po nekaj urah se razgradijo po celičnem vnosu in/ali sprostijo in/ali shranijo v različnih organizacijah.Glede na redkost celic (tako prokariontskih kot evkariontskih) bo uporaba intravalvularnih predelkov zmanjšala količino ccfDNA iz lastnih in tujih virov.Glede na pomembnost prirojene imunosti školjk in velikega števila krožečih fagocitov smo nadalje domnevali, da je celo tuja ccfDNA obogatena s krožečimi fagociti, ki kopičijo tujo DNK po zaužitju mikroorganizmov in/ali celičnih ostankov.Naši rezultati skupaj kažejo, da je ccfDNA hemolimfe školjk edinstveno skladišče molekularnih informacij in krepi njihov status nadzorne vrste.
Naši podatki kažejo, da lahko sekvenciranje in analiza fragmentov ccfDNA hemolimfe, pridobljenih iz bakterij, zagotovi ključne informacije o gostiteljski bakterijski flori in bakterijah, prisotnih v okoliškem morskem ekosistemu.Tehnike sekvenciranja posnetkov so razkrile sekvence komenzalne bakterije A. atra gill, ki bi jih zgrešili, če bi uporabili običajne metode identifikacije 16S rRNA, deloma zaradi pristranskosti referenčne knjižnice.Pravzaprav je naša uporaba podatkov LB, zbranih iz M. platensis v isti plasti školjk v Kerguelenu, pokazala, da je bila sestava bakterijskih simbiontov, povezanih s škrgami, enaka za obe vrsti školjk (slika S4, dodatne informacije).Ta podobnost dveh genetsko različnih školjk morda odraža sestavo bakterijskih skupnosti v hladnih, žveplovih in vulkanskih usedlinah Kerguelena [55, 56, 57, 58].Višje stopnje mikroorganizmov, ki zmanjšujejo žveplo, so bile dobro opisane pri nabiranju školjk iz bioturbiranih obalnih območij [59], kot je obala Port-Au-France.Druga možnost je, da lahko na komenzalno floro školjk vpliva horizontalni prenos [60, 61].Potrebnih je več raziskav, da bi ugotovili korelacijo med morskim okoljem, površino morskega dna in sestavo simbiotičnih bakterij v školjkah.Te študije trenutno potekajo.
Dolžina in koncentracija hemolimfne ccfDNA, njeno enostavno čiščenje in visoka kakovost, ki omogoča hitro puško sekvenciranje, so nekatere od številnih prednosti uporabe ccfDNA školjk za oceno biotske raznovrstnosti v morskih obalnih ekosistemih.Ta pristop je še posebej učinkovit za karakterizacijo virusnih skupnosti (viromov) v danem ekosistemu [62, 63].Za razliko od bakterij, arhej in evkariontov virusni genomi ne vsebujejo filogenetsko ohranjenih genov, kot so zaporedja 16S.Naši rezultati kažejo, da se tekoče biopsije indikatorskih vrst, kot so školjke, lahko uporabijo za identifikacijo relativno velikega števila fragmentov virusa ccfDNA, za katere je znano, da okužijo gostitelje, ki običajno naseljujejo obalne morske ekosisteme.To vključuje viruse, za katere je znano, da okužijo praživali, členonožce, žuželke, rastline in bakterijske viruse (npr. bakteriofage).Podobno porazdelitev smo ugotovili, ko smo pregledali virom hemolimfe ccfDNA modrih školjk (M. platensis), zbranih v isti plasti školjk v Kerguelenu (tabela S2, dodatne informacije).Puško sekvenciranje ccfDNA je res nov pristop, ki dobiva zagon pri proučevanju viroma ljudi ali drugih vrst [21, 37, 64].Ta pristop je še posebej uporaben za preučevanje virusov z dvojno vijačno DNA, saj med vsemi virusi z dvojno verižno DNA ni ohranjen noben en gen, ki predstavlja najbolj raznolik in širok razred virusov v Baltimoru [65].Čeprav večina teh virusov ostaja nerazvrščenih in lahko vključuje viruse iz popolnoma neznanega dela virusnega sveta [66], smo ugotovili, da viromi in obsegi gostiteljev školjk A. atra in M. platensis spadajo med obe vrsti.podobno (glejte sliko S3, dodatne informacije).Ta podobnost ni presenetljiva, saj lahko odraža pomanjkanje selektivnosti pri vnosu DNK, ki je prisotna v okolju.Za karakterizacijo viroma RNA so trenutno potrebne prihodnje študije z uporabo prečiščene RNA.
V naši študiji smo uporabili zelo strog cevovod, prilagojen iz dela Kowarskega in sodelavcev [37], ki so uporabili dvostopenjsko brisanje združenih odčitkov in kontigov pred in po sestavljanju izvorne ccfDNA, kar je povzročilo velik delež nepreslikanih odčitkov.Zato ne moremo izključiti, da imajo nekateri od teh nepreslikanih branj še vedno svoj izvor, predvsem zato, ker nimamo referenčnega genoma za to vrsto školjk.Ta cevovod smo uporabili tudi zato, ker smo bili zaskrbljeni zaradi himer med lastnimi in nesamo branji ter dolžinami branja, ki jih ustvari Illumina MiSeq PE75.Drugi razlog za večino neoznačenih odčitkov je, da večina morskih mikrobov, zlasti na oddaljenih območjih, kot je Kerguelen, ni bila označena.Uporabili smo Illumina MiSeq PE75 ob predpostavki, da so dolžine fragmentov ccfDNA podobne človeški ccfDNA.Za prihodnje študije glede na naše rezultate, ki kažejo, da ima hemolimfna ccfDNA daljše odčitke kot ljudje in/ali sesalci, priporočamo uporabo platforme za sekvenciranje, ki je primernejša za daljše fragmente ccfDNA.Ta praksa bo veliko olajšala prepoznavanje več indikacij za poglobljeno analizo.Pridobitev trenutno nedostopnega popolnega zaporedja jedrnega genoma A. atra bi prav tako močno olajšala diskriminacijo ccfDNA iz lastnih in nelasnih virov.Glede na to, da se je naša raziskava osredotočila na možnost uporabe koncepta tekoče biopsije pri školjkah, upamo, da bodo z uporabo tega koncepta v prihodnjih raziskavah razvita nova orodja in cevovodi za povečanje potenciala te metode za preučevanje mikrobne raznolikosti školjk.morski ekosistem.
Kot neinvaziven klinični biomarker so povišane ravni človeške plazme ccfDNA povezane z različnimi boleznimi, poškodbami tkiv in stresnimi stanji [67,68,69].To povečanje je povezano s sproščanjem fragmentov DNA lastnega izvora po poškodbi tkiva.To težavo smo obravnavali z uporabo akutnega toplotnega stresa, pri katerem so bile školjke za kratek čas izpostavljene temperaturi 30 °C.To analizo smo izvedli na treh različnih vrstah školjk v treh neodvisnih poskusih.Vendar pa nismo našli nobene spremembe ravni ccfDNA po akutnem toplotnem stresu (glejte sliko S5, dodatne informacije).To odkritje lahko vsaj deloma razloži dejstvo, da imajo školjke pol odprti krvni sistem in nabirajo velike količine tuje DNK zaradi visoke filtrirne aktivnosti.Po drugi strani pa so lahko školjke, tako kot mnogi nevretenčarji, bolj odporne na poškodbe tkiv, ki jih povzročajo stres, in s tem omejijo sproščanje ccfDNA v njihovi hemolimfi [70, 71].
Doslej je bila analiza DNK biotske raznovrstnosti v vodnih ekosistemih osredotočena predvsem na metačrtno kodiranje okoljske DNK (eDNK).Vendar je ta metoda običajno omejena pri analizi biotske raznovrstnosti, kadar se uporabljajo primerji.Uporaba puško sekvenciranja se izogne ​​omejitvam PCR in pristranski izbiri kompletov primerjev.Tako je v nekem smislu naša metoda bližja nedavno uporabljeni visoko zmogljivi metodi sekvenciranja eDNA Shotgun, ki lahko neposredno zaporedi fragmentirano DNA in analizira skoraj vse organizme [72, 73].Vendar pa obstajajo številna temeljna vprašanja, ki razlikujejo LB od standardnih metod eDNA.Seveda je glavna razlika med eDNA in LB uporaba naravnih gostiteljev filtrov.Poročali so o uporabi morskih vrst, kot so spužve in školjke (Dresseina spp.), kot naravnega filtra za preučevanje eDNK [74, 75].Dreissenina študija pa je uporabila biopsije tkiv, iz katerih je bila ekstrahirana DNK.Analiza ccfDNA iz LB ne zahteva biopsije tkiva, specializirane in včasih drage opreme in logistike, povezane z eDNA ali biopsijo tkiva.Pravzaprav smo nedavno poročali, da je mogoče ccfDNA iz LB shraniti in analizirati s podporo FTA brez vzdrževanja hladne verige, kar je velik izziv za raziskave na oddaljenih območjih [76].Ekstrakcija ccfDNA iz tekočih biopsij je prav tako preprosta in zagotavlja visokokakovostno DNK za sekvenciranje puške in analizo PCR.To je velika prednost glede na nekatere tehnične omejitve, povezane z analizo eDNK [77].Enostavnost in nizki stroški metode vzorčenja so posebej primerni tudi za dolgoročne programe spremljanja.Poleg njihove visoke sposobnosti filtriranja je še ena dobro znana značilnost školjk kemična mukopolisaharidna sestava njihove sluzi, ki spodbuja absorpcijo virusov [78, 79].Zaradi tega so školjke idealen naravni filter za karakterizacijo biotske raznovrstnosti in vpliva podnebnih sprememb v danem vodnem ekosistemu.Čeprav lahko prisotnost fragmentov DNA, pridobljenih iz gostitelja, razumemo kot omejitev metode v primerjavi z eDNA, so stroški, povezani s tako nativno ccfDNA v primerjavi z eDNA, hkrati razumljivi za ogromno količino informacij, ki so na voljo za zdravstvene študije.offset gostitelj.To vključuje prisotnost virusnih sekvenc, integriranih v genom gostitelja gostitelja.To je še posebej pomembno za školjke, glede na prisotnost vodoravno prenosljivih levkemičnih retrovirusov v školjkah [80, 81].Druga prednost LB nad EDNA je, da izkorišča fagocitno aktivnost obtočnih krvnih celic v hemolimfi, ki zajema mikroorganizme (in njihove genome).Fagocitoza je glavna funkcija krvnih celic pri školjkah [82].Končno metoda izkorišča visoko zmogljivost filtriranja školjk (povprečno 1,5 l/h morske vode) in dvodnevno kroženje, ki poveča mešanje različnih plasti morske vode, kar omogoča zajem heterologne eDNA.[83, 84].Tako je analiza ccfDNA školjk zanimiva pot glede na prehranske, ekonomske in okoljske vplive školjk.Podobno kot analiza LB, zbranega od ljudi, tudi ta metoda odpira možnost merjenja genetskih in epigenetskih sprememb gostiteljske DNK kot odgovor na eksogene snovi.Na primer, tehnologije sekvenciranja tretje generacije se lahko predvidevajo za izvedbo analize metilacije celotnega genoma v domači ccfDNA z uporabo sekvenciranja nanopor.Ta proces bi moralo olajšati dejstvo, da je dolžina fragmentov ccfDNA školjk idealno združljiva z dolgo berljivimi platformami za sekvenciranje, ki omogočajo analizo metilacije DNA v celotnem genomu iz enega samega zaporedja brez potrebe po kemičnih transformacijah. 85, 86] To je zanimiva možnost, saj se je pokazalo, da vzorci metilacije DNA odražajo odziv na okoljski stres in trajajo več generacij.Zato lahko zagotovi dragocen vpogled v temeljne mehanizme, ki urejajo odziv po izpostavljenosti podnebnim spremembam ali onesnaževalom [87].Vendar pa uporaba LB ni brez omejitev.Ni treba posebej poudarjati, da to zahteva prisotnost indikatorskih vrst v ekosistemu.Kot že omenjeno, uporaba LB za oceno biotske raznovrstnosti danega ekosistema zahteva tudi strog cevovod za bioinformatiko, ki upošteva prisotnost fragmentov DNK iz vira.Druga velika težava je razpoložljivost referenčnih genomov za morske vrste.Upamo, da bodo pobude, kot so projekt morskih sesalcev in nedavno uveljavljeni projekt Fish10k [88], v prihodnosti olajšale takšno analizo.Uporaba koncepta LB pri morskih organizmih za hranjenje filtrov je združljiva tudi z najnovejšim napredkom v tehnologiji sekvenciranja, zaradi česar je zelo primeren za razvoj več-OHM biomarkerjev za zagotavljanje pomembnih informacij o zdravju morskih habitatov kot odziv na okoljski stres.
Podatki o sekvenciranju genoma so bili deponirani v NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Vpliv podnebnih sprememb na morsko življenje in ekosisteme.Cole biologija.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Upoštevajte skupne vplive podnebnih sprememb in drugih lokalnih dejavnikov stresa na morsko okolje.splošno znanstveno okolje.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Znanost prvega marca.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Zmanjšana toplotna toleranca v ponavljajočih se toplotnih stresnih pogojih pojasnjuje visoko poletno smrtnost modrih školjk.Znanstveno poročilo 2019;9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nedavne spremembe v pogostosti, vzrokih in obsegu poginov živali.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Več vrstno nespecifičnih patogenov je lahko povzročilo množično smrtnost Pinna nobilis.življenje.2020; 10: 238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potencialni vpliv podnebnih sprememb na arktične zoonoze.Int J Cirkumpolarno zdravje.2005;64: 468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Modra školjka (Mytilus edulis spp.) kot signalni organizmi pri spremljanju onesnaženosti obale: pregled.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tekoče biopsije pri zdravljenju raka.Nat Rev Clean Oncol.2017;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Tekoče zorenje biopsije: Omogoča kroženje DNK tumorja.Nat Rev Rak.2017; 17: 223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kisline v človeški plazmi.Zapisniki sestankov hčerinskih družb Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova vloga brezcelične DNA kot molekularnega markerja za zdravljenje raka.Kvantifikacija biomolarne analize.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekoča biopsija vstopa v kliniko – težave pri izvajanju in prihodnji izzivi.Nat Rev Clin Oncol.2021;18: 297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW in drugi.Fetalna DNK je prisotna v materini plazmi in serumu.Lanceta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Študija poteka nosečnosti in njenih zapletov z uporabo krožeče zunajcelične RNA v krvi žensk med nosečnostjo.Dopediatrija.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Tekoča biopsija: DNK brez darovalcev se uporablja za odkrivanje alogenskih lezij v ledvičnem presadku.Nat Rev Nephrol.2021;17: 591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacije v prenatalni diagnostiki: sekvenciranje genoma materine plazme.Anna dr.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Hitro odkrivanje patogenov z naslednjo generacijo metagenomskega sekvenciranja okuženih telesnih tekočin.Nat Medicine.2021; 27: 115-24.