Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Tekoča biopsija (LB) je koncept, ki hitro pridobiva na priljubljenosti na področju biomedicine. Koncept temelji predvsem na odkrivanju fragmentov zunajcelične DNK (ccfDNA) v obtoku, ki se po celični smrti v različnih tkivih sproščajo predvsem kot majhni fragmenti. Majhen delež teh fragmentov izvira iz tujih tkiv ali organizmov. V trenutnem delu smo ta koncept uporabili pri školjkah, kontrolni vrsti, znani po svoji visoki zmogljivosti filtracije morske vode. Uporabljamo sposobnost školjk, da delujejo kot naravni filtri za zajemanje fragmentov okoljske DNK iz različnih virov, da bi zagotovili informacije o biotski raznovrstnosti morskih obalnih ekosistemov. Naši rezultati kažejo, da hemolimfa školjk vsebuje fragmente DNK, ki se zelo razlikujejo po velikosti, od 1 do 5 kb. Sekvenciranje s puško je pokazalo, da je veliko število fragmentov DNK tujega mikrobnega izvora. Med njimi smo našli fragmente DNK bakterij, arhej in virusov, vključno z virusi, za katere je znano, da okužijo različne gostitelje, ki jih pogosto najdemo v obalnih morskih ekosistemih. Skratka, naša študija dokazuje, da koncept LB, uporabljen pri školjkah, predstavlja bogat, a še neraziskan vir znanja o mikrobni raznolikosti v morskih obalnih ekosistemih.
Vpliv podnebnih sprememb (CC) na biotsko raznovrstnost morskih ekosistemov je hitro rastoče področje raziskav. Globalno segrevanje ne povzroča le pomembnih fizioloških stresov, temveč tudi premika evolucijske meje toplotne stabilnosti morskih organizmov, kar vpliva na habitat številnih vrst in jih spodbuja k iskanju ugodnejših pogojev [1, 2]. Poleg vpliva na biotsko raznovrstnost metazojev CC moti občutljivo ravnovesje interakcij med gostiteljem in mikrobi. Ta mikrobna disbakterioza predstavlja resno grožnjo za morske ekosisteme, saj morske organizme naredi bolj dovzetne za nalezljive patogene [3, 4]. Domneva se, da imajo školjke pomembno vlogo pri množičnih poginih, kar je resen problem za upravljanje globalnih morskih ekosistemov [5, 6]. To je pomembno vprašanje glede na ekonomske, ekološke in prehranske vplive številnih morskih vrst. To še posebej velja za školjke, ki živijo v polarnih regijah, kjer so učinki CK bolj neposredni in hudi [6, 7]. Pravzaprav se školjke, kot je Mytilus spp., pogosto uporabljajo za spremljanje učinkov CC na morske ekosisteme. Ni presenetljivo, da je bilo razvitih relativno veliko biomarkerjev za spremljanje njihovega zdravja, pogosto z uporabo dvostopenjskega pristopa, ki vključuje funkcionalne biomarkerje, ki temeljijo na encimski aktivnosti ali celičnih funkcijah, kot sta viabilnost celic in fagocitna aktivnost [8]. Te metode vključujejo tudi merjenje koncentracije specifičnih kazalnikov tlaka, ki se kopičijo v mehkih tkivih po absorpciji velikih količin morske vode. Vendar pa visoka filtracijska zmogljivost in polodprt krvni obtok školjk ponujata priložnost za razvoj novih biomarkerjev hemolimfe z uporabo koncepta tekoče biopsije (LB), preprostega in minimalno invazivnega pristopa k obravnavi pacientov v vzorcih krvi [9, 10]. Čeprav je v človeški LB mogoče najti več vrst molekul v krvnem obtoku, ta koncept temelji predvsem na analizi sekvenciranja DNK fragmentov zunajcelične DNK (ccfDNA) v krvnem obtoku v plazmi. Pravzaprav je prisotnost DNK v krvnem obtoku v človeški plazmi znana že od sredine 20. stoletja [11], vendar je šele v zadnjih letih pojav visokozmogljivih metod sekvenciranja privedel do klinične diagnoze na podlagi ccfDNA. Prisotnost teh fragmentov DNK v krvnem obtoku je deloma posledica pasivnega sproščanja genomske DNK (jedrne in mitohondrijske) po celični smrti. Pri zdravih posameznikih je koncentracija ccfDNA običajno nizka (<10 ng/ml), vendar se lahko pri bolnikih, ki trpijo za različnimi patologijami ali so izpostavljeni stresu, poveča za 5–10-krat, kar povzroči poškodbo tkiva. Pri zdravih posameznikih je koncentracija ccfDNA običajno nizka (<10 ng/ml), vendar se lahko pri bolnikih, ki trpijo za različnimi patologijami ali so izpostavljeni stresu, poveča za 5–10-krat, kar povzroči poškodbo tkiva. Pri zdravih ljudeh je koncentracija vkkDNK v normi nizka (<10 ng/ml), vendar se lahko poveča za 5–10 krat pri bolnikih z drugačno patologijo ali pod stresom, ki povzroča poškodbe tkiv. Pri zdravih ljudeh je koncentracija cccDNA običajno nizka (<10 ng/ml), vendar se lahko pri bolnikih z različnimi patologijami ali pod stresom, ki vodi do poškodb tkiva, poveča za 5–10-krat.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Koncentracije ccfDNA so običajno nizke (<10 ng/ml) pri zdravih ljudeh, vendar se lahko povečajo za 5-10 krat pri bolnikih z različnimi patologijami ali stresom, kar povzroči poškodbe tkiv. Koncentracije ccfDNA so pri zdravih posameznikih običajno nizke (<10 ng/ml), pri bolnikih z različnimi patologijami ali stresom pa se lahko povečajo za 5–10-krat, kar povzroči poškodbo tkiva.Velikost fragmentov ccfDNA se zelo razlikuje, vendar običajno znaša od 150 do 200 bp. [12]. Analiza lastne ccfDNA, tj. ccfDNA iz normalnih ali transformiranih gostiteljskih celic, se lahko uporabi za odkrivanje genetskih in epigenetskih sprememb, prisotnih v jedrnem in/ali mitohondrijskem genomu, kar zdravnikom pomaga pri izbiri specifičnih molekularno usmerjenih terapij [13]. Vendar pa se ccfDNA lahko pridobi iz tujih virov, kot je ccfDNA iz fetalnih celic med nosečnostjo ali iz presajenih organov [14,15,16,17]. ccfDNA je tudi pomemben vir informacij za odkrivanje prisotnosti nukleinskih kislin povzročitelja okužbe (tujega), kar omogoča neinvazivno odkrivanje razširjenih okužb, ki jih krvne kulture ne odkrijejo, s čimer se izognemo invazivni biopsiji okuženega tkiva [18]. Nedavne študije so dejansko pokazale, da človeška kri vsebuje bogat vir informacij, ki jih je mogoče uporabiti za identifikacijo virusnih in bakterijskih patogenov, in da je približno 1 % ccfDNA, ki jo najdemo v človeški plazmi, tujega izvora [19]. Te študije kažejo, da je mogoče biotsko raznovrstnost mikrobioma v krvnem obtoku organizma oceniti z analizo ccfDNA. Vendar se je ta koncept do nedavnega uporabljal izključno pri ljudeh in v manjši meri pri drugih vretenčarjih [20, 21].
V tem članku uporabljamo LB potencial za analizo ccfDNA Aulacomya atra, južne vrste, ki jo pogosto najdemo na subantarktičnih otokih Kerguelen, skupini otokov na vrhu velike planote, ki je nastala pred 35 milijoni let po vulkanskem izbruhu. Z uporabo in vitro eksperimentalnega sistema smo ugotovili, da školjke hitro absorbirajo fragmente DNK v morski vodi in vstopijo v hemolimfo. Sekvenciranje s puško je pokazalo, da ccfDNA hemolimfe školjk vsebuje fragmente DNK lastnega in tujega izvora, vključno s simbiotskimi bakterijami in fragmenti DNK iz biomov, značilnih za hladne vulkanske morske obalne ekosisteme. CcfDNA hemolimfe vsebuje tudi virusna zaporedja, pridobljena iz virusov z različnimi gostiteljskimi območji. Našli smo tudi fragmente DNK večceličnih živali, kot so kostne ribe, morske vetrnice, alge in žuželke. Skratka, naša študija dokazuje, da se lahko koncept LB uspešno uporabi pri morskih nevretenčarjih za ustvarjanje bogatega genomskega repertoarja v morskih ekosistemih.
Odrasli (55–70 mm dolgi) školjki Mytilus platensis (M. platensis) in Aulacomya atra (A. atra) sta bili decembra 2018 zbrani na skalnatih obalah Port-au-France (049°21.235 J, 070°13.490 V) na otokih Kerguelen. Druge odrasle modre školjke (Mytilus spp.) so bile pridobljene od komercialnega dobavitelja (PEI Mussel King Inc., Otok princa Edvarda, Kanada) in nameščene v temperaturno nadzorovano (4 °C) prezračevano posodo, ki je vsebovala 10–20 l umetne slanice z gostoto 32 ‰ (umetna morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, ZDA). Za vsak poskus sta bili izmerjeni dolžina in teža posameznih lupin.
Prosto dostopen protokol za ta program je na voljo na spletu (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Na kratko, hemolimfa LB je bila zbrana iz abduktornih mišic, kot je opisano [22]. Hemolimfa je bila očiščena s centrifugiranjem pri 1200×g 3 minute, supernatant pa je bil zamrznjen (-20 °C) do uporabe. Za izolacijo in čiščenje cfDNA so bili vzorci (1,5–2,0 ml) odtajani in obdelani z uporabo kompleta NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) v skladu z navodili proizvajalca. ccfDNA je bila shranjena pri -80 °C do nadaljnje analize. V nekaterih poskusih je bila ccfDNA izolirana in očiščena z uporabo kompleta QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Prečiščena DNK je bila kvantificirana s standardnim testom PicoGreen. Porazdelitev fragmentov izolirane ccfDNA je bila analizirana s kapilarno elektroforezo z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornija) z uporabo kompleta High Sensitivity DNA Kit. Test je bil izveden z 1 µl vzorca ccfDNA v skladu z navodili proizvajalca.
Za sekvenciranje fragmentov ccfDNA hemolimfe je Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pripravil knjižnice shotgun z uporabo kompleta Illumina DNA Mix iz kompleta Illumina MiSeq PE75. Uporabljen je bil standardni adapter (BioO). Datoteke s surovimi podatki so na voljo v arhivu odčitkov zaporedja NCBI (SRR8924808 in SRR8924809). Osnovna kakovost odčitkov je bila ocenjena z uporabo FastQC [23]. Za izrezovanje adapterjev in odčitkov slabe kakovosti je bil uporabljen Trimmomatic [24]. Odčitki s shotgun-om s parnimi konci so bili FLASH združeni v daljše posamezne odčitke z minimalnim prekrivanjem 20 bp, da bi se izognili neskladjem [25]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo baze podatkov taksonomije školjk NCBI (vrednost e < 1e−3 in 90 % homologija), maskiranje zaporedij z nizko kompleksnostjo pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo baze podatkov taksonomije školjk NCBI (vrednost e < 1e−3 in 90 % homologija), maskiranje zaporedij z nizko kompleksnostjo pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni podatki so bili označeni s pomočjo BLASTN z uporabo podatkovne baze taksonomije dvotvornih moljuskov NCBI (značilnost e < 1e-3 in 90 % gomologije), maskiranje nizke zapletenosti pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo baze podatkov taksonomije školjk NCBI (vrednost e < 1e-3 in 90 % homologija), maskiranje zaporedja z nizko kompleksnostjo pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 prah [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Združeni podatki so bili označeni s pomočjo BLASTN z uporabo taksonomske baze podatkov dvotvornih moljuskov NCBI (razmernost e <1e-3 in 90 % gomologije), maskiranje nizke zapletenosti pa je bilo izvedeno z DUST [26]. Združeni odčitki so bili označeni z BLASTN z uporabo taksonomske baze podatkov školjk NCBI (vrednost e <1e-3 in 90 % homologija), maskiranje zaporedja z nizko kompleksnostjo pa je bilo izvedeno z uporabo DUST [26].Odčitki so bili razdeljeni v dve skupini: povezani z zaporedji školjk (tukaj imenovani samoodčitki) in nepovezani (ne-samoodčitki). Dve skupini sta bili ločeno sestavljeni z uporabo programa MEGAHIT za ustvarjanje kontigov [27]. Medtem je bila taksonomska porazdelitev odčitkov tujih mikrobiomov klasificirana z uporabo programa Kraken2 [28] in grafično predstavljena s tortnim diagramom Krona na Galaxy [29, 30]. Optimalni kmers so bili na podlagi naših predhodnih poskusov določeni kot kmers-59. Samokontige smo nato identificirali s poravnavo z BLASTN (baza podatkov NCBI za školjke, vrednost e < 1e−10 in 60% homologija) za končno opombo. Samokontige smo nato identificirali s poravnavo z BLASTN (baza podatkov NCBI za školjke, vrednost e < 1e−10 in 60% homologija) za končno opombo. Nato so bili lastni kontigi identificirani s sopostavko z BLASTN (baza podatkov dvotvornih mehkužcev NCBI, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%) za dokončno opombo. Samokontige smo nato identificirali z ujemanjem z BLASTN (baza podatkov o školjkah NCBI, vrednost e <1e-10 in 60 % homologija) za končno opombo.然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Nato so bili identificirani lastni kontigi za dokončne opombe s sopostavko z BLASTN (baza podatkov NCBI za dvotvorne mehkužce, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%). Samokontige smo nato identificirali za končno opombo z ujemanjem z BLASTN (baza podatkov o školjkah NCBI, vrednost e <1e-10 in 60 % homologija). Vzporedno so bili kontigi nesvojih skupin označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e < 1e−10 in 60% homologija). Vzporedno so bili kontigi nesvojih skupin označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e < 1e−10 in 60% homologija). Vzporedno tujerodne skupine skupin so bile označene s pomočjo BLASTN (na podlagi podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%). Vzporedno so bili kontigi tujih skupin označeni z BLASTN (baza podatkov NT NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重叠群。 Vzporedni kontigi, ki se ne nanašajo na lastno skupino, so bili označeni s pomočjo BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in gomologija 60%). Vzporedno so bili kontigi, ki niso del lastne skupine, označeni z BLASTN (baza podatkov nt NCBI, vrednost e <1e-10 in 60% homologija). BLASTX je bil izveden tudi na nelastnih kontigih z uporabo podatkovnih baz NCBI za proteine ​​nr in RefSeq (vrednost e < 1e−10 in 60 % homologija). BLASTX je bil izveden tudi na nelastnih kontigih z uporabo podatkovnih baz NCBI za proteine ​​nr in RefSeq (vrednost e < 1e−10 in 60 % homologija). BLASTX je bil prav tako izveden na nesamostalnih kontigah z uporabo baznih podatkov bele št. in RefSeq NCBI (pomen e <1e-10 in gomologija 60 %). BLASTX je bil izveden tudi na ne-lastnih kontigih z uporabo podatkovnih baz proteinov nr in RefSeq NCBI (vrednost e < 1e-10 in 60 % homologija).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60 % 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60 % 同源性）。 BLASTX je prav tako deloval na nesamostalnih kontigah z uporabo baznih podatkov bele št. in RefSeq NCBI (pomen e <1e-10 in gomologija 60 %). BLASTX je bil izveden tudi na ne-lastnih kontigih z uporabo podatkovnih baz proteinov nr in RefSeq NCBI (vrednost e <1e-10 in 60 % homologija).Zbirki ne-samokontigov BLASTN in BLASTX predstavljajo končne kontige (glej dodatno datoteko).
Primerji, uporabljeni za PCR, so navedeni v tabeli S1. Za amplifikacijo ciljnih genov ccfDNA je bila uporabljena Taq DNA polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON). Uporabljeni so bili naslednji reakcijski pogoji: denaturacija pri 95 °C 3 minute, 95 °C 1 minuta, nastavljena temperatura žarjenja 1 minuta, elongacija pri 72 °C 1 minuta, 35 ciklov in končno 72 °C v 10 minutah. . PCR produkte smo ločili z elektroforezo v agaroznih gelih (1,5 %), ki so vsebovali SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pri 95 V.
Klapavice (Mytilus spp.) so bile aklimatizirane v 500 ml oksigenirane morske vode (32 PSU) 24 ur pri 4 °C. V vialo je bila dodana plazmidna DNK, ki je vsebovala vložek, ki kodira zaporedje cDNA človeškega galektina-7 (NCBI pristopna številka L07769), v končni koncentraciji 190 μg/μl. Klapavice, inkubirane pod enakimi pogoji brez dodatka DNK, so bile kontrola. Tretji kontrolni rezervoar je vseboval DNK brez školjk. Za spremljanje kakovosti DNK v morski vodi so bili vzorci morske vode (20 μl; tri ponovitve) odvzeti iz vsakega rezervoarja ob navedenem času. Za sledljivost plazmidne DNK so bile klapavice LB pobrane ob navedenih časih in analizirane s qPCR in ddPCR. Zaradi visoke vsebnosti soli v morski vodi so bili alikvoti pred vsemi PCR testi razredčeni v vodi kakovosti PCR (1:10).
Digitalna kapljična PCR (ddPCR) je bila izvedena z uporabo protokola BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Za določitev optimalne temperature (tabela S1) uporabite temperaturni profil. Kapljice so bile generirane z generatorjem kapljic QX200 (BioRad). ddPCR je bila izvedena na naslednji način: 95 °C 5 minut, 50 ciklov pri 95 °C 30 sekund in določeni temperaturi žarjenja 1 minuto ter 72 °C 30 sekund, 4 °C 5 minut in 90 °C v 5 minutah. Število kapljic in pozitivnih reakcij (število kopij/µl) je bilo izmerjeno z bralnikom kapljic QX200 (BioRad). Vzorci z manj kot 10.000 kapljicami so bili zavrnjeni. Kontrola vzorca ni bila izvedena vsakič, ko je bila izvedena ddPCR.
qPCR smo izvedli z uporabo Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Avstralija) in specifičnih primerjev LGALS7. Vse kvantitativne PCR smo izvedli v 20 µl z uporabo kompleta QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). qPCR smo začeli s 15-minutno inkubacijo pri 95 °C, ki ji je sledilo 40 ciklov pri 95 °C 10 sekund in pri 60 °C 60 sekund z enim zbiranjem podatkov. Krivulje taljenja smo ustvarili z zaporednimi meritvami pri 95 °C 5 sekund, 65 °C 60 sekund in 97 °C na koncu qPCR. Vsak qPCR smo izvedli v treh ponovitvah, razen za kontrolne vzorce.
Ker so školjke znane po visoki hitrosti filtracije, smo najprej raziskali, ali lahko filtrirajo in zadržijo fragmente DNK, ki so prisotni v morski vodi. Zanimalo nas je tudi, ali se ti fragmenti kopičijo v njihovem polodprtem limfnem sistemu. To vprašanje smo rešili eksperimentalno s sledenjem usode topnih fragmentov DNK, dodanih v akvarije z modrimi školjkami. Za lažje sledenje fragmentom DNK smo uporabili tujo (ne lastno) plazmidno DNK, ki vsebuje človeški gen galektin-7. ddPCR sledi fragmentom plazmidne DNK v morski vodi in školjkah. Naši rezultati kažejo, da če je količina fragmentov DNK v morski vodi ostala relativno konstantna skozi čas (do 7 dni) v odsotnosti školjk, potem je ta raven v prisotnosti školjk skoraj popolnoma izginila v 8 urah (slika 1a,b). Fragmente eksogene DNK smo zlahka zaznali v 15 minutah v intravalvularni tekočini in hemolimfi (slika 1c). Te fragmente je bilo mogoče zaznati še do 4 ure po izpostavljenosti. Ta aktivnost filtriranja glede na fragmente DNK je primerljiva s aktivnostjo filtriranja bakterij in alg [31]. Ti rezultati kažejo, da lahko školjke filtrirajo in kopičijo tujo DNK v svojih tekočih predelkih.
Relativne koncentracije plazmidne DNA v morski vodi v prisotnosti (A) ali odsotnosti (B) školjk, izmerjene z ddPCR. V sliki A so rezultati izraženi v odstotkih, pri čemer robovi polj predstavljajo 75. in 25. percentil. Prilagojena logaritemska krivulja je prikazana z rdečo barvo, sivo osenčeno območje pa predstavlja 95-odstotni interval zaupanja. V sliki B rdeča črta predstavlja povprečje, modra črta pa 95-odstotni interval zaupanja za koncentracijo. C Kopičenje plazmidne DNA v hemolimfi in valvularni tekočini školjk v različnih časih po dodatku plazmidne DNA. Rezultati so predstavljeni kot absolutno število zaznanih kopij/ml (±SE).
Nato smo raziskali izvor ccfDNA v školjkah, zbranih iz nahajališč školjk na otokih Kerguelen, oddaljeni skupini otokov z omejenim antropogenim vplivom. V ta namen smo izolirali in očistili cccDNA iz hemolimf školjk z metodami, ki se običajno uporabljajo za čiščenje človeške cccDNA [32, 33]. Ugotovili smo, da so povprečne koncentracije ccfDNA hemolimfe v školjkah v območju nizkih mikrogramov na ml hemolimfe (glej tabelo S2, Dodatne informacije). Ta razpon koncentracij je veliko večji kot pri zdravih ljudeh (nizki nanogrami na mililiter), vendar lahko v redkih primerih pri bolnikih z rakom raven ccfDNA doseže več mikrogramov na mililiter [34, 35]. Analiza porazdelitve velikosti ccfDNA hemolimfe je pokazala, da se ti fragmenti zelo razlikujejo po velikosti, od 1000 bp do 5000 bp (slika 2). Podobni rezultati so bili pridobljeni z uporabo kompleta QIAamp Investigator Kit na osnovi silicijevega dioksida, metode, ki se pogosto uporablja v forenzični znanosti za hitro izolacijo in čiščenje genomske DNK iz vzorcev DNK z nizko koncentracijo, vključno s ccfDNA [36].
Reprezentativni elektroforegram ccfDNA hemolimfe školjk. Ekstrahirano s kompletom NucleoSnap Plasma (zgoraj) in kompletom QIAamp DNA Investigator. B Violinski diagram, ki prikazuje porazdelitev koncentracij ccfDNA hemolimfe (±SE) v školjkah. Črna in rdeča črta predstavljata mediano oziroma prvi in ​​tretji kvartil.
Približno 1 % ccfDNA pri ljudeh in primatih ima tuji vir [21, 37]. Glede na polodprt krvni obtok školjk, morsko vodo, bogato z mikrobi, in porazdelitev velikosti ccfDNA školjk smo postavili hipotezo, da lahko ccfDNA hemolimfe školjk vsebuje bogat in raznolik bazen mikrobne DNK. Da bi preizkusili to hipotezo, smo sekvencirali ccfDNA hemolimfe iz vzorcev Aulacomya atra, zbranih na otokih Kerguelen, kar je dalo več kot 10 milijonov odčitkov, od katerih je 97,6 % prestalo kontrolo kakovosti. Odčitki so bili nato razvrščeni glede na lastne in tuje vire z uporabo podatkovnih baz školjk BLASTN in NCBI (slika S1, Dodatne informacije).
Pri ljudeh se lahko v krvni obtok sprosti tako jedrna kot mitohondrijska DNK [38]. Vendar v tej študiji ni bilo mogoče podrobno opisati jedrne genomske DNK školjk, saj genom A. atra ni bil sekvenciran ali opisan. Vendar smo z uporabo knjižnice školjk uspeli identificirati številne fragmente ccfDNA lastnega izvora (slika S2, dodatne informacije). Prisotnost fragmentov DNK lastnega izvora smo potrdili tudi z usmerjeno PCR amplifikacijo sekvenciranih genov A. atra (slika 3). Podobno lahko, glede na to, da je mitohondrijski genom A. atra na voljo v javnih bazah podatkov, najdemo dokaze o prisotnosti fragmentov mitohondrijske ccfDNA v hemolimfi A. atra. Prisotnost fragmentov mitohondrijske DNK je bila potrjena s PCR amplifikacijo (slika 3).
V hemolimfi A. atra (rdeče pike – številka zaloge: SRX5705969) in M. platensis (modre pike – številka zaloge: SRX5705968), pomnoženi s PCR, so bili prisotni različni mitohondrijski geni. Slika je prirejena po Breton et al., 2011 B Amplifikacija supernatanta hemolimfe iz A. atra Shranjeno na papirju FTA. Za dodajanje neposredno v epruveto PCR, ki vsebuje mešanico PCR, uporabite 3 mm luknjač.
Glede na obilno vsebnost mikrobov v morski vodi smo se sprva osredotočili na karakterizacijo zaporedij mikrobne DNK v hemolimfi. Za to smo uporabili dve različni strategiji. Prva strategija je uporabila Kraken2, program za klasifikacijo zaporedij, ki temelji na algoritmih in lahko identificira mikrobna zaporedja z natančnostjo, primerljivo z BLAST in drugimi orodji [28]. Ugotovljeno je bilo, da je več kot 6719 odčitkov bakterijskega izvora, 124 in 64 pa iz arhej oziroma virusov (slika 4). Najpogostejši fragmenti bakterijske DNK so bili Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) in Bacteroidetes (17 %) (slika 4a). Ta porazdelitev je skladna s prejšnjimi študijami mikrobioma modre morske školjke [39, 40]. Gamaproteobakterije so bile glavni razred Proteobacteria (44 %), vključno s številnimi Vibrionales (slika 4b). Metoda ddPCR je potrdila prisotnost fragmentov DNK Vibrio v ccfDNA hemolimfe A. atra (slika 4c) [41]. Za pridobitev več informacij o bakterijskem izvoru ccfDNA je bil uporabljen dodaten pristop (slika S2, Dodatne informacije). V tem primeru so bili odčitki, ki so se prekrivali, sestavljeni kot odčitki s parnimi konci in so bili z uporabo BLASTN in vrednosti e 1e−3 ter mejne vrednosti z >90% homologijo razvrščeni kot odčitki s parnimi konci. V tem primeru so bili odčitki, ki so se prekrivali, sestavljeni kot odčitki s parnimi konci in so bili z uporabo BLASTN in vrednosti e 1e−3 ter mejne vrednosti z >90% homologijo razvrščeni kot odčitki s parnimi konci. V tem primeru so bile prekrivajoče se čtenije zbrane kot čtenije s parnimi konci in klasificirane kot lastne (dvoustvorjeni moljuski) ali tuje po izvoru z uporabo BLASTN in vrednosti e 1e-3 in odsekov z mologijo> 90%. V tem primeru so bili prekrivajoči se odčitki zbrani kot parni odčitki in so bili razvrščeni kot naravni (školjke) ali neoriginalni z uporabo BLASTN in e vrednosti 1e-3 ter mejne vrednosti z >90% homologijo.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和 >90 %同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 V tem primeru so bile prekrivajoče se čtenije zbrane kot čtenije s parnimi konci in klasificirane kot lastne (dvustvorčati moljuski) ali neosebne po izvoru z uporabo vrednosti e BLASTN in 1e-3 in porabe gomologije> 90%. V tem primeru so bili prekrivajoči se odčitki zbrani kot odčitki s parnimi konci in razvrščeni kot lastni (školjke) ali neoriginalni z uporabo vrednosti e BLASTN in 1e-3 ​​ter praga homologije > 90%.Ker genom A. atra še ni bil sekvenciran, smo uporabili strategijo de novo sestavljanja z orodjem za sestavljanje MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Skupno je bilo identificiranih 147.188 kontigov odvisnega izvora (školjke). Te kontige smo nato razstavili z e-vrednostmi 1e-10 z uporabo BLASTN in BLASTX. Ta strategija nam je omogočila identifikacijo 482 fragmentov, ki niso školjke, in so prisotni v ccfDNA A. atra. Več kot polovica (57 %) teh fragmentov DNK je bila pridobljena iz bakterij, predvsem iz škržnih simbiontov, vključno s sulfotrofnimi simbionti, in iz škržnih simbiontov Solemya velum (slika 5).
Relativna številčnost na ravni tipa. B Mikrobna raznolikost dveh glavnih debel (Firmicutes in Proteobacteria). Reprezentativna amplifikacija ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenti gena 16S rRNA (modro) v treh atra hemolimfah.
Analiziranih je bilo skupno 482 zbranih kontigov. Splošni profil taksonomske porazdelitve metagenomskih kontigovskih anotacij (prokarioti in evkarionti). B Podrobna porazdelitev bakterijskih fragmentov DNK, identificiranih z BLASTN in BLASTX.
Analiza Kraken2 je tudi pokazala, da ccfDNA školjk vsebuje fragmente arhealne DNK, vključno s fragmenti DNK Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) in Thaurmarcheota (11 %) (slika 6a). Prisotnost fragmentov DNK, pridobljenih iz Euryarchaeota in Crenarchaeota, ki so bili prej najdeni v mikrobni skupnosti kalifornijskih školjk, ne bi smela biti presenečenje [42]. Čeprav je Euryarchaeota pogosto povezana z ekstremnimi razmerami, je zdaj znano, da sta tako Euryarchaeota kot Crenarcheota med najpogostejšimi prokarioti v morskem kriogenem okolju [43, 44]. Prisotnost metanogenih mikroorganizmov v školjkah ni presenetljiva glede na nedavna poročila o obsežnih uhajanjih metana iz puščanj na dnu planote Kerguelen [45] in morebitno mikrobno proizvodnjo metana, opaženo ob obali otokov Kerguelen [46].
Naša pozornost se je nato preusmerila na odčitke DNA virusov. Kolikor nam je znano, je to prva študija vsebnosti virusov v školjkah, ki ni bila izvedena v okviru ciljne skupine. Kot smo pričakovali, smo našli fragmente DNA bakteriofagov (Caudovirales) (slika 6b). Vendar pa najpogostejša virusna DNA prihaja iz debla nukleocitovirusov, znanih tudi kot jedrno citoplazemski veliki DNA virus (NCLDV), ki ima največji genom od vseh virusov. Znotraj tega debla večina zaporedij DNA pripada družinama Mimimidoviridae (58 %) in Poxviridae (21 %), katerih naravni gostitelji vključujejo vretenčarje in členonožce, medtem ko majhen delež teh zaporedij DNA pripada znanim virološkim algam. Okužuje morske evkariontske alge. Zaporedja so bila pridobljena tudi iz virusa Pandora, velikanskega virusa z največjo velikostjo genoma od vseh znanih virusnih rodov. Zanimivo je, da je bil obseg gostiteljev, za katere je znano, da so okuženi z virusom, kot je bilo določeno s sekvenciranjem ccfDNA hemolimfe, relativno velik (slika S3, Dodatne informacije). Vključuje viruse, ki okužijo žuželke, kot sta Baculoviridae in Iridoviridae, pa tudi viruse, ki okužijo amebe, alge in vretenčarje. Našli smo tudi zaporedja, ki se ujemajo z genomom Pithovirus sibericum. Pitovirusi (znani tudi kot »zombi virusi«) so bili prvič izolirani iz 30.000 let starega permafrosta v Sibiriji [47]. Tako so naši rezultati skladni s prejšnjimi poročili, ki kažejo, da niso vse sodobne vrste teh virusov izumrle [48] in da so ti virusi morda prisotni v oddaljenih subarktičnih morskih ekosistemih.
Nazadnje smo preizkusili, ali lahko najdemo fragmente DNK drugih večceličnih živali. Z BLASTN in BLASTX z nt, nr in RefSeq knjižnicami (genomskimi in beljakovinskimi) smo identificirali skupno 482 tujih kontigov. Naši rezultati kažejo, da med tujimi fragmenti ccfDNA večceličnih živali prevladuje DNK kostnih kosti (slika 5). Najdeni so bili tudi fragmenti DNK žuželk in drugih vrst. Relativno velik del fragmentov DNK ni bil identificiran, verjetno zaradi premajhne zastopanosti velikega števila morskih vrst v genomskih podatkovnih bazah v primerjavi s kopenskimi vrstami [49].
V tem članku uporabljamo koncept LB na školjkah in trdimo, da lahko sekvenciranje ccfDNA hemolimfe ponudi vpogled v sestavo morskih obalnih ekosistemov. Ugotovili smo predvsem, da 1) hemolimfa školjk vsebuje relativno visoke koncentracije (mikrogramske ravni) relativno velikih (~1-5 kb) fragmentov DNK v krvnem obtoku; 2) ti fragmenti DNK so tako neodvisni kot neodvisni; 3) med tujimi viri teh fragmentov DNK smo našli bakterijsko, arhejsko in virusno DNK ter DNK drugih večceličnih živali; 4) kopičenje teh tujih fragmentov ccfDNA v hemolimfi se dogaja hitro in prispeva k notranji filtracijski aktivnosti školjk. Skratka, naša študija dokazuje, da koncept LB, ki se je doslej uporabljal predvsem na področju biomedicine, kodira bogat, a neraziskan vir znanja, ki ga je mogoče uporabiti za boljše razumevanje interakcije med kontrolnimi vrstami in njihovim okoljem.
Poleg primatov so izolacijo ccfDNA odkrili tudi pri sesalcih, vključno z mišmi, psi, mačkami in konji [50, 51, 52]. Vendar pa je naša študija, kolikor vemo, prva, ki poroča o odkrivanju in sekvenciranju ccfDNA pri morskih vrstah z odprtim krvnim obtokom. Ta anatomska značilnost in sposobnost filtriranja školjk lahko vsaj delno pojasnita različne velikostne značilnosti fragmentov DNK v krvnem obtoku v primerjavi z drugimi vrstami. Pri ljudeh je večina fragmentov DNK, ki krožijo v krvi, majhnih fragmentov, velikosti od 150 do 200 bp z največjim vrhom 167 bp [34, 53]. Majhen, a pomemben delež fragmentov DNK je velik med 300 in 500 bp, približno 5 % pa jih je daljših od 900 bp [54]. Razlog za to porazdelitev velikosti je, da se glavni vir ccfDNA v plazmi pojavi kot posledica celične smrti, bodisi zaradi celične smrti bodisi zaradi nekroze hematopoetskih celic v krvnem obtoku pri zdravih posameznikih bodisi zaradi apoptoze tumorskih celic pri bolnikih z rakom (znano kot krožeča tumorska DNA). , ctDNA). Porazdelitev velikosti ccfDNA hemolimfe, ki smo jo našli v školjkah, se je gibala od 1000 do 5000 bp, kar kaže na to, da ima ccfDNA školjk drugačen izvor. To je logična hipoteza, saj imajo školjke polodprt žilni sistem in živijo v morskih vodnih okoljih, ki vsebujejo visoke koncentracije mikrobne genomske DNA. Pravzaprav so naši laboratorijski poskusi z eksogeno DNA pokazali, da školjke kopičijo fragmente DNK v morski vodi, vsaj po nekaj urah pa se po celičnem privzemu razgradijo in/ali sprostijo in/ali shranijo v različnih organizacijah. Glede na redkost celic (tako prokariontskih kot evkariontskih) bo uporaba intravalvularnih predelkov zmanjšala količino ccfDNA iz lastnih virov kot tudi iz tujih virov. Glede na pomen prirojene imunosti školjk in veliko število fagocitov v krvnem obtoku smo postavili hipotezo, da je celo tuja ccfDNA obogatena v fagocitih v krvnem obtoku, ki kopičijo tujo DNK ob zaužitju mikroorganizmov in/ali celičnih ostankov. Naši rezultati skupaj kažejo, da je ccfDNA hemolimfe školjk edinstveno skladišče molekularnih informacij in krepi njihov status varovalne vrste.
Naši podatki kažejo, da lahko sekvenciranje in analiza fragmentov ccfDNA hemolimfe, pridobljene iz bakterij, zagotovi ključne informacije o bakterijski flori gostitelja in bakterijah, prisotnih v okoliškem morskem ekosistemu. Tehnike sekvenciranja posnetkov so razkrile zaporedja komenzalne bakterije A. atra v škrgah, ki bi jih spregledali, če bi uporabili običajne metode identifikacije 16S rRNA, deloma zaradi pristranskosti referenčne knjižnice. Pravzaprav je naša uporaba podatkov LB, zbranih iz M. platensis v isti plasti školjk v Kerguelenu, pokazala, da je bila sestava bakterijskih simbiontov, povezanih s škrgami, enaka za obe vrsti školjk (slika S4, dodatne informacije). Ta podobnost dveh genetsko različnih školjk lahko odraža sestavo bakterijskih združb v hladnih, žveplenih in vulkanskih usedlinah Kerguelena [55, 56, 57, 58]. Višje ravni mikroorganizmov, ki zmanjšujejo žveplo, so bile dobro opisane pri nabiranju školjk z bioturbiranih obalnih območij [59], kot je obala Port-au-France. Druga možnost je, da je flora komenzalnih školjk prizadeta zaradi horizontalnega prenosa [60, 61]. Potrebnih je več raziskav, da bi ugotovili korelacijo med morskim okoljem, površino morskega dna in sestavo simbiotskih bakterij v školjkah. Te študije trenutno potekajo.
Dolžina in koncentracija ccfDNA hemolimfe, enostavnost čiščenja in visoka kakovost, ki omogoča hitro sekvenciranje s puško, so nekatere od številnih prednosti uporabe ccfDNA školjk za oceno biotske raznovrstnosti v morskih obalnih ekosistemih. Ta pristop je še posebej učinkovit za karakterizacijo virusnih združb (viromov) v danem ekosistemu [62, 63]. Za razliko od bakterij, arhej in evkariontov virusni genomi ne vsebujejo filogenetsko ohranjenih genov, kot so zaporedja 16S. Naši rezultati kažejo, da se lahko tekoče biopsije indikatorskih vrst, kot so školjke, uporabijo za identifikacijo relativno velikega števila fragmentov virusa ccfDNA, za katere je znano, da okužijo gostitelje, ki običajno naseljujejo obalne morske ekosisteme. To vključuje viruse, za katere je znano, da okužijo protozoje, členonožce, žuželke, rastline in bakterijske viruse (npr. bakteriofage). Podobno porazdelitev smo ugotovili, ko smo preučevali virom ccfDNA hemolimfe modrih školjk (M. platensis), zbranih v isti plasti školjk v Kerguelenu (tabela S2, dodatne informacije). Sekvenciranje ccfDNA s puško je resnično nov pristop, ki pridobiva na veljavi pri preučevanju viroma ljudi ali drugih vrst [21, 37, 64]. Ta pristop je še posebej uporaben za preučevanje virusov z dvoverižno DNA, saj med vsemi virusi z dvoverižno DNA ni ohranjen noben gen, kar predstavlja najbolj raznolik in širok razred virusov v Baltimoru [65]. Čeprav večina teh virusov ostaja nerazvrščenih in lahko vključuje viruse iz popolnoma neznanega dela virusnega sveta [66], smo ugotovili, da viromi in gostiteljski razponi školjk A. atra in M. platensis spadajo med obe vrsti podobno (glej sliko S3, dodatne informacije). Ta podobnost ni presenetljiva, saj lahko odraža pomanjkanje selektivnosti pri privzemu DNA, prisotne v okolju. Za karakterizacijo viroma RNA so trenutno potrebne nadaljnje študije z uporabo prečiščene RNA.
V naši študiji smo uporabili zelo strog postopek sekvenciranja, prilagojen po delu Kowarskega in sodelavcev [37], ki so uporabili dvostopenjsko brisanje združenih odčitkov in kontigov pred in po sestavljanju nativne ccfDNA, kar je povzročilo visok delež nepreslikanih odčitkov. Zato ne moremo izključiti, da imajo nekateri od teh nepreslikanih odčitkov še vedno svoj izvor, predvsem zato, ker nimamo referenčnega genoma za to vrsto klapavic. Ta postopek sekvenciranja smo uporabili tudi zato, ker smo bili zaskrbljeni zaradi himer med lastnimi in nelastnimi odčitki ter dolžin odčitkov, ki jih je ustvaril Illumina MiSeq PE75. Drug razlog za večino nepreiskanih odčitkov je, da veliko morskih mikrobov, zlasti na oddaljenih območjih, kot je Kerguelen, ni bilo označenih. Uporabili smo Illumina MiSeq PE75, pri čemer smo predpostavili, da so dolžine fragmentov ccfDNA podobne človeški ccfDNA. Za prihodnje študije, glede na naše rezultate, ki kažejo, da ima hemolimfna ccfDNA daljše odčitke kot ljudje in/ali sesalci, priporočamo uporabo platforme za sekvenciranje, ki je primernejša za daljše fragmente ccfDNA. Ta praksa bo močno olajšala prepoznavanje več indikacij za globljo analizo. Pridobitev trenutno nedostopnega celotnega zaporedja jedrnega genoma A. atra bi prav tako močno olajšala razlikovanje ccfDNA od lastnih in tujih virov. Glede na to, da se je naša raziskava osredotočila na možnost uporabe koncepta tekoče biopsije na klapavicah, upamo, da bodo z uporabo tega koncepta v prihodnjih raziskavah razvita nova orodja in cevovodi za povečanje potenciala te metode za preučevanje mikrobne raznolikosti školjk. morski ekosistem.
Kot neinvazivni klinični biomarker so povišane ravni ccfDNA v človeški plazmi povezane z različnimi boleznimi, poškodbami tkiva in stresnimi stanji [67,68,69]. To povečanje je povezano s sproščanjem fragmentov DNK lastnega izvora po poškodbi tkiva. To vprašanje smo obravnavali z uporabo akutnega toplotnega stresa, pri katerem so bile školjke na kratko izpostavljene temperaturi 30 °C. To analizo smo izvedli na treh različnih vrstah školjk v treh neodvisnih poskusih. Vendar po akutnem toplotnem stresu nismo ugotovili nobene spremembe v ravneh ccfDNA (glejte sliko S5, dodatne informacije). To odkritje lahko vsaj delno pojasni dejstvo, da imajo školjke polodprt krvni obtok in zaradi visoke filtrirne aktivnosti kopičijo velike količine tuje DNK. Po drugi strani pa so školjke, tako kot mnogi nevretenčarji, lahko bolj odporne na poškodbe tkiva, ki jih povzroča stres, s čimer omejujejo sproščanje ccfDNA v njihovi hemolimfi [70, 71].
Do danes se je analiza DNK biotske raznovrstnosti v vodnih ekosistemih osredotočala predvsem na metabarkodiranje okoljske DNK (eDNK). Vendar pa je ta metoda pri analizi biotske raznovrstnosti običajno omejena, kadar se uporabljajo začetni oligonukleotidi. Uporaba sekvenciranja s shotgun metodo zaobide omejitve PCR in pristransko izbiro nizov začetnih oligonukleotidov. Tako je naša metoda v nekem smislu bližje nedavno uporabljeni metodi visokozmogljivega sekvenciranja eDNK s shotgun metodo, ki je sposobna neposredno sekvencirati fragmentirano DNK in analizirati skoraj vse organizme [72, 73]. Vendar pa obstaja več temeljnih vprašanj, ki ločijo LB od standardnih metod eDNK. Seveda je glavna razlika med eDNK in LB uporaba naravnih filtrirnih gostiteljev. Poročali so o uporabi morskih vrst, kot so spužve in školjke (Dresseina spp.), kot naravnega filtra za preučevanje eDNK [74, 75]. Vendar pa je Dreissena v svoji študiji uporabila biopsije tkiva, iz katerih je bila ekstrahirana DNK. Analiza ccfDNK iz LB ne zahteva biopsije tkiva, specializirane in včasih drage opreme in logistike, povezane z eDNK ali biopsijo tkiva. Pravzaprav smo nedavno poročali, da je mogoče ccfDNA iz LB shranjevati in analizirati s podporo FTA brez vzdrževanja hladne verige, kar je velik izziv za raziskave na oddaljenih območjih [76]. Ekstrakcija ccfDNA iz tekočih biopsij je prav tako preprosta in zagotavlja visokokakovostno DNK za sekvenciranje s puško in PCR analizo. To je velika prednost glede na nekatere tehnične omejitve, povezane z analizo eDNA [77]. Preprostost in nizki stroški metode vzorčenja so še posebej primerni za dolgoročne programe spremljanja. Poleg visoke sposobnosti filtriranja je še ena dobro znana značilnost školjk kemična mukopolisaharidna sestava njihove sluzi, ki spodbuja absorpcijo virusov [78, 79]. Zaradi tega so školjke idealen naravni filter za karakterizacijo biotske raznovrstnosti in vpliva podnebnih sprememb v danem vodnem ekosistemu. Čeprav je prisotnost fragmentov DNK, pridobljenih iz gostitelja, mogoče razumeti kot omejitev metode v primerjavi z eDNA, so stroški, povezani s tako nativnim ccfDNA v primerjavi z eDNA, hkrati razumljivi zaradi ogromne količine informacij, ki so na voljo za zdravstvene študije. offset gostitelj. To vključuje prisotnost virusnih zaporedij, integriranih v genom gostitelja. To je še posebej pomembno za školjke, glede na prisotnost horizontalno prenesenih levkemičnih retrovirusov v školjkah [80, 81]. Druga prednost LB pred eDNA je, da izkorišča fagocitno aktivnost krvnih celic v krvnem obtoku v hemolimfi, ki zajame mikroorganizme (in njihove genome). Fagocitoza je glavna funkcija krvnih celic v školjkah [82]. Nenazadnje metoda izkorišča visoko filtrirno zmogljivost školjk (povprečno 1,5 l/h morske vode) in dvodnevno kroženje, kar poveča mešanje različnih plasti morske vode, kar omogoča zajem heterologne eDNA. [83, 84]. Analiza ccfDNA školjk je torej zanimiva pot glede na prehranske, ekonomske in okoljske vplive školjk. Podobno kot analiza LB, zbrane pri ljudeh, ta metoda odpira tudi možnost merjenja genetskih in epigenetskih sprememb v gostiteljski DNK kot odziv na eksogene snovi. Na primer, tehnologije sekvenciranja tretje generacije si je mogoče zamisliti za izvajanje analize metilacije celotnega genoma v naravni ccfDNA z uporabo nanopornega sekvenciranja. Ta postopek bi moral biti olajšan z dejstvom, da je dolžina fragmentov ccfDNA školjk idealno združljiva s platformami za dolgo branje sekvenciranja, ki omogočajo analizo metilacije DNK celotnega genoma iz enega samega sekvenciranja brez potrebe po kemičnih transformacijah.85,86] To je zanimiva možnost, saj je bilo dokazano, da vzorci metilacije DNK odražajo odziv na okoljski stres in vztrajajo več generacij. Zato lahko zagotovi dragocen vpogled v osnovne mehanizme, ki urejajo odziv po izpostavljenosti podnebnim spremembam ali onesnaževalcem [87]. Vendar pa uporaba LB ni brez omejitev. Ni treba posebej poudarjati, da to zahteva prisotnost indikatorskih vrst v ekosistemu. Kot je bilo že omenjeno, uporaba LB za oceno biotske raznovrstnosti določenega ekosistema zahteva tudi strog bioinformatični postopek, ki upošteva prisotnost fragmentov DNK iz vira. Drug velik problem je razpoložljivost referenčnih genomov za morske vrste. Upamo, da bodo pobude, kot sta projekt genomov morskih sesalcev in nedavno ustanovljeni projekt Fish10k [88], olajšale takšno analizo v prihodnosti. Uporaba koncepta LB za organizme, ki se prehranjujejo s filtracijo morske vode, je združljiva tudi z najnovejšim napredkom v tehnologiji sekvenciranja, zaradi česar je zelo primerna za razvoj večohmskih biomarkerjev, ki zagotavljajo pomembne informacije o zdravju morskih habitatov kot odziv na okoljski stres.
Podatki o sekvenciranju genoma so bili deponirani v arhivu branja zaporedij NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod oznako Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Vpliv podnebnih sprememb na morsko življenje in ekosisteme. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alppanidou V, Bevilacqua S in drugi. Upoštevajte skupne vplive podnebnih sprememb in drugih lokalnih stresorjev na morsko okolje. splošno znanstveno okolje. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Znanost prvega marca. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Zmanjšana toleranca na vročino pri ponavljajočih se pogojih toplotnega stresa pojasnjuje visoko poletno umrljivost modrih školjk. Znanstveno poročilo 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER in sod. Nedavne spremembe v pogostosti, vzrokih in obsegu poginov živali. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Več vrstno nespecifičnih patogenov je lahko povzročilo množično smrtnost Pinna nobilis. življenje. 2020; 10: 238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potencialni vpliv podnebnih sprememb na arktične zoonoze. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Modre klapavice (Mytilus edulis spp.) kot signalni organizmi pri spremljanju onesnaženosti obal: pregled. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tekoče biopsije v zdravljenje raka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C in sod. Zorenje tekoče biopsije: Omogoča kroženje tumorske DNK. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kisline v človeški plazmi. Zapisniki sej podružnic Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova vloga proste DNK kot molekularnega označevalca za zdravljenje raka. Kvantifikacija biomolarne analize. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekoča biopsija vstopa v kliniko – vprašanja izvedbe in prihodnji izzivi. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW in drugi. Fetalna DNK je prisotna v materini plazmi in serumu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Študija poteka nosečnosti in njenih zapletov z uporabo zunajcelične RNA v krvi žensk med nosečnostjo. Dopediatria. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J in sod. Tekoča biopsija: za odkrivanje alogenskih lezij v presadku ledvice se uporablja DNK darovalcev brez celic. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacije v prenatalni diagnostiki: sekvenciranje genoma materine plazme. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D in sod. Hitro odkrivanje patogenov z metagenomskim sekvenciranjem okuženih telesnih tekočin naslednje generacije. Nat Medicine. 2021;27:115-24.