Javascript je trenutno onemogočen v vašem brskalniku. Nekatere funkcije tega spletnega mesta ne bodo delovale, ko je javascript onemogočen.
Registrirajte se s svojimi posebnimi podatki in določenim zdravilom, ki vas zanima, in podatke, ki jih posredujete, bomo povezali s članki v naši obsežni zbirki podatkov in vam nemudoma po e-pošti poslali kopijo PDF.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Oddelek za klinično in eksperimentalno medicino cine, Univerza v Catanii, Catania, 95123, Italija;2 Center za eksperimentalno onkologijo in hematologijo, AOU Policlinico »G.Rodolico – San Marco«, Catania, 95123, Italija;3 Medicinska onkologija, AOU Poliklinika “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija;4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italija;5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Italija;6 Oddelek za biomedicinske in biotehnološke vede, Univerza v Catanii, medicinska genetika, Catania, Italija, 95123;7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Italija Komunikacije: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-pošta [e-pošta zaščitena];[email protected] Namen: Mutacije zarodne linije v BRCA1 in BRCA2 ter ugotovljeni rak dojk (BC), jajčnikov (OC) in drugo, povezano z življenjskim tveganjem za raka. Testiranje na gen BRCA je ključno za ocenjevanje individualnega tveganja, pa tudi za iskanje metod preprečevanja pri zdravih nosilcih in prilagajanje zdravljenja pri bolnikih z rakom. Razširjenost sprememb BRCA1 in BRCA2 se med geografskimi regijami močno razlikuje, in čeprav obstajajo podatki o BR Patogene različice CA v sicilijanskih družinah, manjkajo študije, posebej usmerjene na populacije na vzhodni Siciliji. Cilj naše študije je bil raziskati incidenco in porazdelitev sprememb zarodne linije BRCA v kohorti bolnikov z BC z vzhodne Sicilije in oceniti njihovo povezanost s posebnimi lastnostmi BC z uporabo sekvenciranja naslednje generacije. Prisotnost sprememb je bila povezana s stopnjo tumorja in indeksom proliferacije. REZULTATI: Na splošno je imelo 35 bolnikov (9 %) patogeno različico BRCA, 17 (49 %) BRCA1 in 18 (51 %) BRCA2. Spremembe BRCA1 prevladujejo pri trojno negativnih bolnikih z BC, medtem ko so mutacije BRCA2 pogostejše pri bolnikih z luminalnim BC. V primerjavi z nenosilci so imeli subjekti z različicami BRCA1 znatno višjo stopnjo tumorja in prolifer ativni indeks. Zaključki: Naše ugotovitve zagotavljajo pregled mutacijskega statusa BRCA pri bolnikih z BC z vzhodne Sicilije in potrjujejo vlogo analize NGS pri prepoznavanju bolnikov z dednim BC. Na splošno so ti podatki skladni s prejšnjimi dokazi, ki podpirajo presejanje BRCA za pravilno preprečevanje in zdravljenje raka pri nosilcih mutacij.
Rak dojke (BC) je najpogostejša maligna bolezen na svetu in najsmrtonosnejši rak pri ženskah.1 Biološke značilnosti, ki določajo prognozo in klinično vedenje raka dojke, so bile obsežno raziskane in sčasoma delno razjasnjene. Dejansko se trenutno uporablja več nadomestnih označevalcev za razvrščanje raka dojke v različne molekularne podtipe. To so estrogen (ER) in/ali progesteronski receptor (PgR), pomnoževanje receptorja 2 človeškega epidermalnega rastnega faktorja (HER2). , proliferacijski indeks Ki-67 in stopnjo tumorja (G).2 Kombinacija teh spremenljivk je identificirala naslednje kategorije BC: 1) Luminalni tumorji, ki kažejo izražanje ER in/ali PgR, so predstavljali 75 % BC. Ti tumorji so bili nadalje razdeljeni na Luminal A, ko je bil Ki-67 pod 20 % in HER2 negativen, in Luminal B, ko je bil Ki-67 enak ali višji od 20 % in v prisotnosti ojačanje HER2, ne glede na indeks proliferacije;2) HER2+ tumorji, ki so ER in PgR negativni, vendar kažejo ojačanje HER2. Ta skupina predstavlja 10 % vseh tumorjev dojke;3) Trojni negativni rak dojke (TNBC), ki ne kaže ekspresije ER in PgR ter ojačanja HER2, predstavlja približno 15 % rakov dojke.2-4
Med temi podtipi BC predstavljata stopnja tumorja in indeks proliferacije presečne biomarkerje, ki so neposredno in neodvisno povezani z agresivnostjo in prognozo tumorja.5,6
Poleg zgoraj omenjenih bioloških značilnosti je vloga dednih genetskih sprememb, ki vodijo v razvoj BC, v zadnjih nekaj letih postala vse pomembnejša.7 Približno 1 od 10 tumorjev dojk je podedovan zaradi sprememb zarodne linije v specifičnih genih.8 Dve veliki epidemiološki študiji, ki sta vključevali več kot 180.000 žensk, sta nedavno identificirali skupino osmih genov (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C in RAD51D), ki so v prvi vrsti odgovorni za dedni BC. Med temi geni sta BRCA1 in BRCA2 (v nadaljevanju BRCA1/2) pokazala najmočnejšo korelacijo z razvojem tumorjev dojk.9-12 Pravzaprav mutacije zarodne linije BRCA1/2 znatno povečajo življenjsko tveganje za BC kot tudi druge maligne bolezni, vključno z jajčniki, prostate, trebušne slinavke, kolorektalnega in melanoma. Od starosti 13 do 80 let je kumulativna incidenca BC 72 % pri ženskah s patogeno različico (PV) BRCA1 in 69 % pri ženskah s PV BRCA2.14
Predvsem nedavna publikacija kaže, da je tveganje za BC odvisno od vrste PV. Pravzaprav so v primerjavi s patogenimi okrnjenimi različicami očitne missense različice, zlasti v genu BRCA1, povezane z zmanjšanim tveganjem za BC, zlasti pri starejših ženskah.15
Prisotnost PV BRCA1 ali BRCA2 je bila povezana z različnimi biološkimi in klinično-patološkimi značilnostmi. 16, 17 BK, povezane z BRCA1, so običajno klinično agresivne, slabo diferencirane in zelo proliferativne. Ti tumorji so običajno trikrat negativni in se pojavijo zgodaj. Tumorji, ki se pojavijo pri bolnikih z mutacijo BRCA2, običajno kažejo zmerne do dobro diferencirane stopnje in variabilni proliferativni indeksi. Ti tumorji so pogostejši v lumnu B in se običajno pojavijo pri starejših odraslih.16-18 Predvsem mutacije v BRCA1 in BRCA2 povečajo občutljivost na specifična zdravljenja, vključno s solmi platine in tarčnimi zdravili, kot so zaviralci poli(ADP-riboze) polimeraze (PARPi).19,20
V zadnjih nekaj letih je izvajanje sekvenciranja naslednje generacije (NGS) v klinični praksi omogočilo vse večjemu številu bolnikov z BC, da opravijo molekularno testiranje za sindrome dovzetnosti za raka, vključno z BRCA1/2.21 Hkrati so definicije, ki temeljijo na natančnih merilih v zvezi z družinsko anamnezo, demografskimi in klinično-patološkimi značilnostmi, omogočile boljše prepoznavanje posameznikov, ki so vredni testiranja BRCA1/2.22,23 V tem kontekstu dokazi e se kopiči pri presejanju BRCA1/2 pri specifičnih populacijah, kar poudarja razlike med geografskimi regijami.24–27 Čeprav obstajajo poročila o kohorti BC na zahodni Siciliji, je na voljo manj podatkov o presejanju BRCA1/2 pri populaciji vzhodne Sicilije.28,29
Tukaj opisujemo rezultate presejanja zarodne linije BRCA1/2 pri bolnikih z BC iz vzhodne Sicilije, pri čemer dodatno povezujemo prisotnost mutacij BRCA1 ali BRCA2 z glavnimi klinično-patološkimi značilnostmi teh tumorjev.
Retrospektivna študija je bila izvedena v »Centru za eksperimentalno onkologijo in hematologijo« v bolnišnici Policlinico. Rodolico – San Marco v Catanii. Od januarja 2017 do marca 2021 je bilo v naš laboratorij za molekularno diagnostiko na genetsko testiranje BRCA/2 napotenih skupno 455 bolnikov z rakom dojke in jajčnikov, melanomom, trebušno slinavko ali prostato. Ta študija je bila izvedena v skladu z Decla obrok iz Helsinkov, vsi udeleženci pa so pred molekularno analizo dali pisno informirano soglasje.
Histološke in biološke značilnosti (ER, PgR, status HER2, Ki-67 in stopnja) BC so ocenili na vzorcih biopsije jedra ali kirurških vzorcev, pri čemer so upoštevali samo agresivne komponente tumorja. Na podlagi teh značilnosti so bili BC razvrščeni kot sledi: luminalni A (ER+ in/ali PgR+, HER2-, Ki-67<20 %), luminalni B (ER+ in/ali PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalno B-HER2+ (ER in/ali PgR+, HER2+), HER2+ (ER in PgR-, HER2+) ali trojno negativno (ER in PgR-, HER2-).
Pred oceno statusa mutacije BRCA1 in BRCA2 je multidisciplinarna ekipa, vključno z onkologom, genetikom in psihologom, opravila posvetovanje o tumorski genetiki za vsakega bolnika, da bi ugotovila prisotnost BRCA1 in/ali BRCA1.ali posamezniki z visokim tveganjem za PV v genu BRCA2. Izbor bolnikov je bil izveden v skladu s smernicami Italijanskega združenja za medicinsko onkologijo (AIOM) in lokalnimi sicilijanskimi priporočili.30,31 Ta merila vključujejo: (i) družinsko anamnezo znanih patogenih variant v genih za občutljivost (npr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN);(ii) samci z BC;(iii) tiste z BC in OC;(iv) ženske z BC <36 let, TNBC <60 let ali obojestranski BC <50 let;(v) osebna zdravstvena anamneza BC <50 let in vsaj en sorodnik v prvem kolenu: (a) BC < 50 let;(b) nemucinozni in nemejni OC katere koli starosti;(c) dvostranski BC;(d) moški BC;(e) rak trebušne slinavke;(f) rak prostate;(vi) dve ali več osebnih anamnez BC > 50 let in družinska anamneza BC, OC ali raka trebušne slinavke za sorodnike, ki so med seboj v sorodstvu v prvem kolenu (vključno s sorodniki, s katerimi je v sorodstvu v prvem kolenu);(vii) Osebna anamneza OK in vsaj en sorodnik v prvem kolenu: (a) pr. n. št. <50 let;(b) NOC;(c) dvostranski BC;(d) moški BC;(vii) ženska z visoko stopnjo seroznega OC.
Od vsakega bolnika smo pridobili 20 ml perifernega vzorca krvi in ​​ga zbrali v epruvete EDTA (BD Biosciences). Genomsko DNK smo izolirali iz 0,7 ml vzorcev polne krvi z uporabo kompleta QIAsymphony DSP DNA Midi Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italija) v skladu z navodili proizvajalca in spustili skozi fluorometer Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Wal tham, MA, ZDA) Izvedite kvantifikacijo.Ciljno obogatitev in pripravo knjižnice izvaja Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, ki je pripravljen za nalaganje v komplet Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 za avtomatizirano pripravo knjižnice v skladu z navodili proizvajalca. Komplet je sestavljen iz dveh skupin začetnih začetkov multipleksne PCR, ki ju je mogoče uporabiti za preučevanje vseh genov BRCA1 (NM_007300.3) in BRCA2 (NM_000059.3).B Na kratko, 15 µL vsakega razredčenega vzorca DNK (10 ng) je bilo dodanih na plošče s črtno kodo za pripravo knjižnice, vsi reagenti in potrošni material pa so bili naloženi na instrument Ion Chef™. Avtomatizirana priprava knjižnice in združevanje knjižnice črtnih vzorcev sta bila nato izvedena na instrumentu Ion Chef™. Število pripravljenih knjižnic je bilo nato ocenjeno s fluorometrom Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Walt ham, MA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Nazadnje so knjižnice združene v ekvimolarnih razmerjih v epruvetah za vzorce knjižnice Ion Chef™ (epruvete s črtno kodo) in naložene na instrument Ion Chef™. Sekvenciranje je bilo izvedeno z instrumentom Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) z uporabo čipa Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). analizo sta izvedla programska oprema Amplicon Suite (SmartSeq srl) in programska oprema Ion Reporter.
Nomenklatura vseh variant je sledila trenutnim smernicam konzorcija za variacijo človeškega genoma, ki je na voljo na spletu (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinični pomen variant BRCA1/2 je bil opredeljen z uporabo klasifikacije mednarodnega konzorcija ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) in svetovanja različne baze podatkov, kot so ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD in UMD. Razvrstitev vključuje pet različnih kategorij tveganja: benigne (kategorija I), verjetno benigne (kategorija II), različica negotovega pomena (VUS, kategorija III), verjetno patogene (kategorija IV) in patogene (kategorija V). VarSome je analiziral tudi učinek mutacij na strukturo beljakovin in funkcija, informativno orodje z dostopom do 30 baz podatkov.32
Za dodelitev potencialnega kliničnega pomena vsakemu VUS so bili uporabljeni naslednji računalniški algoritmi za napovedovanje beljakovin: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) in Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd _input.php). Različice, razvrščene v razred 1 in 2, so bile obravnavane kot divji tip.
Sangerjevo sekvenciranje je potrdilo prisotnost vsake patogene različice. Na kratko, za vsako odkrito različico je bil zasnovan par specifičnih primerjev z uporabo referenčnih sekvenc genov BRCA1 in BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 oziroma NG_012772.3, NM_000059.3). Zato je bil izveden ciljni PCR, ki mu je sledilo Sangerjevo zaporedje. nciranje.
Bolniki, ki so bili negativni na genu BRCA1/2, so bili testirani s pomnožitvijo sonde, odvisne od multipleksne ligacije (MLPA) v skladu z navodili proizvajalca za oceno prisotnosti velikih genomskih preureditev (LGR). Na kratko, vzorci DNK so denaturirani in uporabljenih je do 60 sond, specifičnih za gena BRCA1 in BRCA2, od katerih vsaka zazna specifično zaporedje DNK, dolgo približno 60 nukleotidov.Pro. produkte pomnoževanja, sestavljene iz edinstvenega nabora pomnožev PCR, smo nato analizirali s kapilarno elektroforezo in programsko opremo Cofalyser.Net v povezavi z ustreznimi tabelami Cofalyser, specifičnimi za serijo (www.mrcholland.com).
Izbrane klinično-patološke spremenljivke (histološka stopnja in Ki-67 % indeks proliferacije) so bile povezane s prisotnostjo BRCA1/2 PV, izračunane s programsko opremo Prism v. 8.4 z uporabo Fisherjevega natančnega testa ob predpostavki, da je p-vrednost <0,05 pomembna.
Med januarjem 2017 in marcem 2021 je bilo 455 bolnikov pregledanih za mutacije BRCA1/2 zarodne linije. Testiranje mutacij je bilo opravljeno v Centru za eksperimentalno onkologijo in hematologijo bolnišnice Policlinico. V skladu s sicilijansko smernico (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), Rodolico iz Catanie – San Marco« skupaj, 389 bolnikov Bilo je rak dojke, 37 rak jajčnikov, 16 rak trebušne slinavke, 8 rak prostate in 5 melanom.Porazdelitev bolnikov glede na vrsto raka in rezultate analize je prikazana na sliki 1.
Slika 1 prikazuje diagram poteka, ki prikazuje pregled študije. Bolnice s tumorji dojke, melanoma, trebušne slinavke, prostate ali jajčnikov so bile testirane na mutacije v genih BRCA1 in BRCA2.
Okrajšave: PVs, patogena varianta;VUS, varianta negotovega pomena;WT, zaporedje divjega tipa BRCA1/2.
Naše študije smo selektivno osredotočili na skupine raka dojke. Bolnice so imele mediano starost 49 let (razpon 23–89) in so bile pretežno ženske (n = 376 ali 97 %).
Od teh preiskovancev jih je imelo 64 (17 %) mutacije BRCA1/2 in so bile vse ženske. Petintrideset (9 %) jih je imelo PV in 29 (7,5 %) VUS. Sedemnajst (48,6 %) od 35 patogenih variant se je pojavilo pri BRCA1 in 18 (51,4 %) pri BRCA2, medtem ko se je 5 VUS pojavilo pri BRCA1 (17,2 %) in 24 (82). 0,8 %) pri BRCA2 (sliki 1 in 2). LGR ni bil prisoten v analizi MLPA.
Slika 2. Analiza mutacij BRCA1 in BRCA2 pri 389 bolnicah z rakom dojke. (A) Porazdelitev patogenih variant (PV) (rdeča), različic negotovega pomena (VUS) (oranžna) in WT (modra) pri 389 bolnicah z rakom dojke;(B) 389 bolnic z rakom dojke Petintrideset (9 %) je imelo patogene različice (PV) BRCA1/2. Med njimi jih je bilo 17 (48,6 %) nosilcev PV BRCA1 (temno rdeče) in 18 (51,4 %) nosilcev BRCA2 (svetlo rdeče);(C) 29 (7,5 %) od 389 oseb je imelo VUS, 5 (17,2 %) genov BRCA1 (temno oranžni) in 24 (82,8 %) genov BRCA2 (svetlo oranžni).
Okrajšave: PVs, patogena varianta;VUS, varianta negotovega pomena;WT, zaporedje divjega tipa BRCA1/2.
Nato smo raziskali razširjenost molekularnih podtipov BC pri bolnikih s PV BRCA1/2. Porazdelitev je vključevala 2 (5,7 %) luminalni A, 15 (42,9 %) luminalni B, 3 (8,6 %) luminalni B-HER2+, 2 (5,7 %) HER2+ in 13 (37,1 %) bolnikov s TNBC. Med BRCA1 pozitivnimi bolniki je bilo 5 (29,4 %) sta imela luminalni B BC, 2 (11,8 %) sta imela bolezen HER2+ in 10 (58,8 %) jih je imelo TNBC. Tumorji brez mutacij BRCA1 so bili luminalni A ali luminalni B-HER2+ (slika 3). V BRCA2-pozitivni podskupini je bilo 10 (55,6 %) tumorjev luminalni B, 3 (16,7 %) so bili luminalni B-HER2+, 3 (16,7 %) TNBC in 2 (11,1 %) so bili luminalni A (slika 3). V tej skupini ni bilo prisotnih tumorjev HER2+. Tako so mutacije BRCA1 prevladujoče pri bolnikih s TNBC, medtem ko so spremembe BRCA2 prevladujoče pri posameznikih lumna B.
Slika 3 Razširjenost podtipov raka dojke pri bolnikih s patogenimi različicami BRCA1 in BRCA2. Histogrami, ki prikazujejo porazdelitev PV BRCA1- (temno rdeče) in BRCA2- (svetlo rdeče) med molekularnimi podtipi bolnic z rakom dojke. Številke, navedene v vsakem polju, predstavljajo odstotek bolnikov s PV BRCA1 in BRCA2 za vsak podtip raka dojke.
Okrajšave: PVs, patogena varianta;HER2+, pozitiven receptor 2 za človeški epidermalni rastni faktor;TNBC, trojno negativni rak dojke.
Nato smo ocenili tip in gensko lokalizacijo PV BRCA1 in BRCA2. Pri PV BRCA1 smo opazili 7 različic enojnega nukleotida (SNV), 6 izbrisov, 3 podvajanja in 1 vstavitev. Samo ena mutacija (c.5522delG) predstavlja novo odkritje. Najpogostejši PV BRCA1, odkrit pri obeh osebah, je bil c.5035_5039 delCTAAT. Ta sprememba vključuje izbris petih nukleotidov (CTAAT) v eksonu 15 BRCA1, kar ima za posledico zamenjavo aminokisline levcin s tirozinom pri kodonu 1679 in zaradi premika okvirja prevajanja s predvidenim alternativnim stop kodonom povzroči prezgodnjo okrnitev beljakovin. Vse druge spremembe so odkrite samo v enem primeru. Predvsem je bil eden od prijavljenih PV lociran v konsenzno območje mesta spoja (c.4357+1G>T) (tabela 1).
Kar zadeva BRCA2 PV, smo opazili 6 izbrisov, 6 SNV in 2 podvojitve. Nobena od ugotovljenih sprememb ni nova. V naši populaciji so se ponovile tri mutacije, c.428dup in c.8487+1G>A, opažene pri 3 osebah, ki ji je sledil c.5851_5854delAGTT, pridobljen v dveh primerih. Sprememba c.428dup vključuje ponovitev C v eksonu 5 BRCA2, za katerega je predvideno, da kodira skrajšano, nefunkcionalno beljakovino. Mutacija c.8487+1G>A se pojavi v intronski regiji BRCA2 introna 19 (± 1,2) in vpliva na konsenzno zaporedje spajanja, kar ima za posledico spremenjeno spajanje, ki povzroči nenormalen ali odsoten protein. Patogena različica c.5851_5854delAGTT je posledica do 4-nukleotidne delecije iz nukleotidnih položajev 5851 do 5854 v kodirnem eksonu 10 gena BRCA2 in povzroči translacijski premik okvirja s predvidenim alternativnim stop kodonom (p.S1951WfsTer). Predvsem, kot smo že poročali, sta bili pri istem bolniku odkriti obe spremembi c.631G>A in c.7008-2A>T.34 Prva mutacija vključuje zamenjavo adenozina (A) v eksonu 7 BRCA2 z nukleotidom, ki vsebuje gvanin (G), kar povzroči spremembo valina v izolevcin na kodonu 211, aminokislina izolevcin je aminokislina z zelo podobnimi lastnostmi. Ta sprememba vpliva na normalno spajanje mRNA. Druga različica se nahaja v intronski regiji in povzroči dvojni A v subtimin (T) institucijo pred eksonom 13 gena, ki kodira BRCA2. Sprememba c.7008-2A>T lahko ustvari več transkriptov različnih dolžin. Poleg tega so bile v skupini PV BRCA2 4 od 18 sprememb (22,2 %) intronične.
Nato smo preslikali škodljive mutacije BRCA1/2 v funkcionalnih domenah in regijah, ki vežejo beljakovine (slika 4). V genu BRCA1 je bilo 50 % PV lociranih v regiji gruče raka dojke (BCCR), medtem ko je bilo 22 % mutacij lociranih v regiji grozda raka jajčnikov (OCCR) (slika 4A). V genu BRCA2 PV je bilo 35,7 % različic lociranih v BC. Regija CR in 42,8 % mutacij je bilo lociranih v OCCR (slika 4B). Nato smo ocenili lokacijo PV znotraj proteinskih domen BRCA1 in BRCA2. Za protein BRCA1 smo našli tri PV v domenah zanke in zvite tuljave ter dve mutaciji v domeni BRCT (slika 4A). Za protein BRCA2 so 4 PV preslikali na ponovitev BRC domeni, medtem ko so bile 3 intronske in 3 eksonične spremembe odkrite v domeni vezave oligo/oligosaharida (OB) in stolpa (T) (slika 4B).
Slika 4 Shematski prikaz proteinov BRCA1 in BRCA2 in lokalizacija patogenih različic. Ta slika prikazuje porazdelitev patogenih različic BRCA1 (A) in BRCA2 (B) pri bolnicah z rakom dojke. Eksonske mutacije so prikazane v modri barvi, medtem ko so intronske različice prikazane v oranžni barvi. Višina stolpca predstavlja število primerov. Poročana sta proteina BRCA1 in BRCA2 in njuna funkcionalna področja. (A) BR Protein CA1 vsebuje domeno z zanko (RING) in jedrsko lokalizacijsko sekvenco (NLS), domeno s spiralno navitjem, domeno grozda SQ/TQ (SCD) in C-terminalno domeno BRCA1 (BRCT).(B) Protein BRCA2 vsebuje osem ponovitev BRC, domeno, ki veže DNA, s spiralno domeno (Helical), tri gube, ki vežejo oligonukleotide/oligosaharide (OB), stolp domena (T) in NLS na strani C. Področja, imenovana Breast Cancer Cluster Region (BCCR) in Ovarian Cancer Cluster Region (OCCR), so prikazana na dnu.*Predstavljajo mutacije, ki določajo stop kodone.
Nato smo raziskali klinično-patološke značilnosti BC, ki bi lahko bile v korelaciji s prisotnostjo BRCA1/2 PV. Popolna klinična evidenca je bila na voljo za 181 BRCA1/2-negativnih bolnikov (ki niso bili nosilci) in vseh nosilcev (n = 35). Obstajala je korelacija med stopnjo proliferacije tumorja in stopnjo.
Porazdelitev Ki-67 smo izračunali na podlagi mediane naše kohorte (25 %, razpon <10-90 %). Subjekti s Ki-67 < 25 % so bili opredeljeni kot "nizki Ki-67", medtem ko so bili posamezniki z vrednostmi ≥ 25 % obravnavani kot "visoki Ki-67". Ugotovljene so bile pomembne razlike Ki-67 (p<0,01) med nenosilci in nosilci BRCA1 PV. s (slika 5A).
Slika 5 Korelacija Ki-67 s porazdelitvijo stopnje pri ženskah z rakom dojke z in brez PV BRCA1 in BRCA2. (A) Okvirni prikaz, ki prikazuje mediane vrednosti Ki-67 pri 181 bolnicah z BC brez nosilcev v primerjavi z bolnicami s PV BRCA1 (18) ali BRCA2 (17). Vrednosti P pod 0,5 so veljale za statistično značilne. (B) Histogram, ki predstavlja dodelitev bolnikov z rakom BC v skupine histološke stopnje (G2 in G3) glede na status mutacije BRCA1 in BRCA2 (preiskovanci WT, nosilci PV BRCA1 in BRCA2).
Prav tako smo preverili, ali je stopnja tumorja povezana s prisotnostjo BRCA1/2 PV. Ker G1 BC ni bil v naši populaciji, smo bolnike razdelili v dve skupini (G2 ali G3). V skladu z rezultati Ki-67 je analiza pokazala statistično značilno korelacijo med stopnjo tumorja in mutacijo BRCA1, z večjim deležem tumorjev G3 pri nosilcih BRCA1 v primerjavi z nenosilci (p<0,0 05) (slika 5B).
Napredek v tehnologiji sekvenciranja DNK je omogočil napredek brez primere pri genetskem testiranju BRCA1/2, kar ima ključne posledice za bolnike z družinsko anamnezo raka. Do danes je bilo identificiranih in razvrščenih približno 20.000 različic BRCA1/2 v skladu z Ameriškim združenjem za medicinsko genetiko 35 in sistemom ENIGMA.35,36 Dobro je znano, da se spekter mutacije BRCA1/2 zelo razlikuje. ly po geografskih regijah.37 Znotraj Italije se je stopnja BRCA1/2 PV gibala od 8 % do 37 %, kar kaže na velike razlike med državami.38,39 S skoraj 5 milijoni prebivalcev je Sicilija peta največja regija v Italiji glede na število prebivalcev. Čeprav obstajajo podatki o porazdelitvi BRCA1/2 na zahodni Siciliji, ni obsežnih dokazov v vzhodnem delu otoka.
Naša študija je eno prvih poročil o incidenci BRCA1/2 PV pri bolnikih z BC na vzhodni Siciliji.28 Našo analizo smo osredotočili na BC, saj je to daleč najpogostejša bolezen v naši kohorti.
Pri testiranju 389 bolnikov z BC je 9 % nosilo PV BRCA1/2, enakomerno porazdeljene med BRCA1 in BRCA2. Ti rezultati so skladni s tistimi, o katerih so prej poročali pri italijanski populaciji.28 Zanimivo je, da je bilo 3 % (13/389) naše kohorte moških. Ta stopnja je višja od pričakovane za rak dojke pri moških (1 % vseh BC),40 kar odraža naš izbor populacij na podlagi tveganja mutacije BRCA1/2. Vendar nobeden od teh moških ni razvil BRCA1/2 PV, zato so bili kandidati za nadaljnjo molekularno analizo, da bi izključili prisotnost manj pogostih mutacij, kot so PALB2, RAD51C in D, med drugim. Različice negotovega pomena so bile pridobljene pri 7 % subjektov, pri katerih je bil očiten BRCA2 VUS. Tudi ta rezultat je skladen s predhodno obstoječimi dokazi.28,41,42
Ko smo analizirali porazdelitev molekularnih podtipov BC pri ženskah z mutacijo BRCA1/2, smo potrdili znane povezave med TNBC in BRCA1 PV (58,8 %) ter med luminalnim B BC in BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Tumorji luminalnega A in HER2+ pri nosilcih BRCA1 in BRCA2 PV so skladni z obstoječimi literaturnimi podatki.16,43
Nato se osredotočimo na vrsto in lokacijo BRCA1/2 PV. V naši kohorti je bil najpogostejši BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT. Čeprav so Incorvaia et al.niso opisali te različice v svoji sicilijanski kohorti, drugi avtorji so jo poročali kot zarodno linijo BRCA1 PV.34 V naši kohorti je bilo najdenih več BRCA1 PV – npr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA in c.5266dupC – ki so jih opazili na Siciliji.28 Od teh dve ustanovitveni mutaciji BRCA1 (c.18 1T>G in c.5266dupC) običajno najdemo pri aškenaških Judih v vzhodni in srednji Evropi (Poljska, Češka), Slovencih, Avstrijcih, Madžarih, Beloruskih in Nemcih), 44,45 in je bila v Združenih državah in Argentini nedavno opredeljena kot "ponavljajoča se različica zarodne linije" pri italijanskih bolnikih z BC in OC. Različico 34c.514del so predhodno identificirali pri 8 bolnicah z rakom dojke iz severnega Siciliji v Palermu in Messini. Zanimivo je, da celo Incorvaia et al.našli različico c.3253dupA v nekaterih družinah v Catanii.28 Najbolj reprezentativne PV BRCA2 so c.428dup, c.5851_5854delAGTT in intronska različica c.8487+1G>A, o kateri so poročali podrobneje 28 pri bolniku v Palermu s c.428dup, opazili so PV c.5851_5854delAGTT v gospodinjstvih na severozahodu Sicilije, predvsem v regijah Trapani in Palermo, medtem ko so c.5851_5854delAGTT PV opazili v gospodinjstvih na severozahodu Sicilije. Različica 8487+1G>A je bila pogostejša pri osebah iz Messine, Palerma in Caltanissette.28 Rebbeck et al.predhodno opisal spremembo c.5851_5854delAGTT v Kolumbiji.37 Še en BRCA2 PV, c.631+1G>A, je bil odkrit pri bolnikih z BC in OC na Siciliji (Agrigento, Siracusa in Ragusa).28 Predvsem smo opazili soobstoj dveh različic BRCA2 (BRCA2 c.631G>A in c.7008-2A>T ) pri istem bolniku, za katerega smo domnevali, da je ločen v cis načinu, kot smo že poročali.34,46 Te mutacije BRCA2 uble so dejansko pogosto opažene v italijanski regiji in ugotovljeno je bilo, da uvajajo prezgodnje stop kodone, kar vpliva na spajanje messenger RNA in povzroča odpoved proteina BRCA2.47,48
Preslikali smo tudi PV BRCA1 in BRCA2 v domnevnih regijah OCCR in BCCR proteinskih domen in genov. Te regije so opisali Rebbeck et al.kot področja tveganja za razvoj raka jajčnikov oziroma dojke.49 Vendar pa dokazi o povezavi med lokacijo variant zarodne linije in tveganjem za raka dojke ali jajčnikov ostajajo sporni.28,50-52 V naši populaciji so bili PV BRCA1 pretežno locirani v regiji BCCR, medtem ko so bili PV BRCA2 pretežno locirani v regiji OCCR. Vendar nismo mogli najti nobene povezave med domnevnim OCCR in BC. Regije CR in značilnosti BC. To je lahko posledica omejenega števila bolnikov z mutacijami BRCA1/2. Z vidika proteinske domene so PV BRCA1 porazdeljeni vzdolž celotnega proteina, spremembe BRCA2 pa najdemo prednostno v domeni ponovitve BRC.
Nazadnje smo povezali klinično-patološke značilnosti BC z BRCA1/2 PV. Zaradi omejenega števila vključenih bolnikov smo ugotovili le pomembno korelacijo med Ki-67 in stopnjo tumorja. Čeprav sta ocena in razlaga Ki-67 še vedno nekoliko sporni, je gotovo, da so visoke proliferativne stopnje povezane s povečanim tveganjem za ponovitev bolezni in zmanjšanim preživetjem. Do danes je meja za razlikovanje med « in »nizek« Ki-67 je 20 %. Vendar ta prag ne velja za našo populacijo bolnikov z mutacijo BRCA1/2, ki ima mediano vrednost Ki-67 25 %. Ta trend visokih stopenj Ki-67 je mogoče razložiti s prevalenco v naših kohortah luminalnega B in TNBC, od katerih je bilo prisotnih le malo tumorjev luminalnega A. Vendar se zdi, da nekateri dokazi kažejo, da je višja mejna vrednost Ki-67 (25– 30%) lahko bolje razvrsti bolnike glede na njihovo prognozo.53,54 Iz rezultatov naše analize pomembna korelacija ni presenetljiva. Pojavlja se med visokim Ki-67 in stopnjami ter prisotnostjo BRCA1 PV. Pravzaprav so tumorji, povezani z BRCA1, tipični za TNBC in kažejo bolj agresivne lastnosti.16,17
Za zaključek ta študija zagotavlja poročilo o mutacijskem statusu BRCA1/2 v kohorti BC z vzhodne Sicilije. Na splošno so naše ugotovitve skladne s predhodno obstoječimi dokazi, tako glede razširjenosti mutacij kot klinično-patoloških značilnosti pri BC. Za oceno prisotnosti je upravičenih več študij v večjih populacijah bolnikov z BC z mutacijo BRCA1/2, kot je uporaba multigenomsko razširjene mutacijske analize. PV, ki so ločeni in manj pogosti kot BRCA1/2. To bo omogočilo identifikacijo in pravilno obravnavo vse večjega števila subjektov s povečanim tveganjem za raka zaradi genetskih mutacij.
Potrdili smo, da so bolniki podpisali informirano soglasje za anonimno objavo svojih vzorcev tumorjev za raziskovalne namene. Vsi bolniki so podpisali pisno informirano soglasje v skladu s Helsinško deklaracijo. V skladu s politiko AOU Policlinico »G.Rodolico – S.Marco« je bila ta študija izvzeta iz etičnega pregleda, ker je bila analiza BRCA1/2 izvedena v skladu s klinično prakso in vsi bolniki so dali pisno informirano soglasje. uporabo njihovih podatkov v raziskovalne namene.
Zahvaljujemo se prof. Paolu Vigneriju za njegovo pomoč pri oskrbi bolnic z rakom dojke, kot je zahtevala Etična komisija.
Federica Martorana poroča o honorarjih Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Drugi avtorji izjavljajo, da v tem delu ni navzkrižja interesov.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN ocenjuje incidenco in umrljivost 36 vrst raka v 185 državah po vsem svetu. CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660