Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Nenadzorovana krvavitev je eden glavnih vzrokov smrti.Doseganje hitre hemostaze zagotavlja preživetje osebe kot prva pomoč med bojem, prometnimi nesrečami in operacijami zmanjševanja smrti.Kompozitni oder, ojačan z nanoporoznimi vlakni (NFRCS), pridobljen iz enostavne sestave, ki tvori hemostatski film (HFFC), kot neprekinjena faza lahko sproži in izboljša hemostazo.Razvoj NFRCS temelji na zasnovi krila kačjega pastirja.Struktura kril kačjega pastirja je sestavljena iz prečnih in vzdolžnih kril, membrane kril pa so med seboj povezane, da ohranijo celovitost mikrostrukture.HFFC enakomerno prekrije površino vlakna s filmom nanometrske debeline in poveže naključno porazdeljeno debelino bombaža (Ct) (dispergirana faza) v nanoporozno strukturo.Kombinacija kontinuirne in dispergirane faze zniža ceno izdelka za desetkrat v primerjavi s komercialno dostopnimi izdelki.Spremenjeni NFRCS (tamponi ali zapestnice) se lahko uporabljajo v različnih biomedicinskih aplikacijah.Študije in vivo so pokazale, da razviti Cp NFRCS sproži in izboljša proces koagulacije na mestu aplikacije.NFRCS lahko modulira mikrookolje in deluje na celični ravni zaradi svoje nanoporozne strukture, kar ima za posledico boljše celjenje ran v modelu ekscizijske rane.
Nenadzorovana krvavitev med bojnimi, intraoperativnimi in nujnimi situacijami lahko resno ogrozi življenje ranjenca1.Ta stanja nadalje vodijo do splošnega povečanja perifernega žilnega upora, kar povzroči hemoragični šok.Ustrezni ukrepi za nadzor krvavitve med operacijo in po njej veljajo za potencialno smrtno nevarne2,3.Poškodba velikih žil povzroči veliko izgubo krvi, kar ima za posledico stopnjo umrljivosti ≤ 50 % v boju in 31 % med operacijo1.Ogromna izguba krvi povzroči zmanjšanje telesne prostornine, kar zmanjša minutni volumen srca.Povečanje celotnega perifernega žilnega upora in progresivna motnja mikrocirkulacije vodita do hipoksije v organih, ki podpirajo življenje.Če se stanje nadaljuje brez učinkovitega posredovanja, se lahko pojavi hemoragični šok1,4,5.Drugi zapleti vključujejo napredovanje hipotermije in presnovne acidoze, pa tudi koagulacijsko motnjo, ki ovira proces koagulacije.Hud hemoragični šok je povezan z večjim tveganjem smrti 6,7,8.Pri (progresivnem) šoku stopnje III je transfuzija krvi bistvena za preživetje bolnika med intraoperativno in pooperativno obolevnostjo in umrljivostjo.Za premagovanje vseh zgoraj omenjenih življenjsko nevarnih situacij smo razvili kompozitni oder, ojačan z nanoporoznimi vlakni (NFRCS), ki uporablja minimalno koncentracijo polimera (0,5 %) z uporabo kombinacije vodotopnih hemostatskih polimerov.
Z uporabo ojačitve z vlakni je mogoče razviti stroškovno učinkovite izdelke.Naključno razporejena vlakna spominjajo na strukturo kril kačjega pastirja, ki jih uravnotežijo vodoravne in navpične črte na krilih.Prečne in vzdolžne žile krila komunicirajo s krilno membrano (slika 1). Zato je bil ob upoštevanju večkratnih koristi, vključno z> 90% kristalno celulozo (daje povečanje hemostatične aktivnosti) CT uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10. Zato je bil ob upoštevanju večkratnih koristi, vključno z> 90% kristalno celulozo (daje povečanje hemostatične aktivnosti) CT uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10. Slednje, upoštevajoč njegove številne prednosti, v tem primeru > 90% kristalne celuloze (udeležuje se povečane hemostatske aktivnosti), Ct je bil uporabljen v skeletnem sistemu NFRCS9,10. Zato je bil Ct glede na njegove številne prednosti, vključno z >90 % kristalne celuloze (vključena v povečano hemostatsko aktivnost), uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增强止血活性，，Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Zato je bil Ct glede na številne prednosti, vključno z več kot 90 % kristalne celuloze (pomaga povečati hemostatsko aktivnost), uporabljen kot ogrodje za NFRCS9,10.HFFC deluje kot matrigel, ki drži skupaj naključno postavljene Ct.
Slika prikazuje diagram zasnove NFRCS, ki temelji na strukturi krila kačjega pastirja (A).Ta slika prikazuje primerjalno analogijo strukture kril kačjega pastirja (sekajoče in vzdolžne žile kril so med seboj povezane) in fotomikrografijo prečnega prereza Cp NFRCS (B).Shematski prikaz NFRCS.
NFRC so bili razviti z uporabo HFFC kot neprekinjene faze za obravnavo zgornjih omejitev.HFFC je sestavljen iz različnih hemostatskih polimerov, ki tvorijo film, vključno s hitozanom (kot glavnim hemostatskim polimerom) z metilcelulozo (MC), hidroksipropil metilcelulozo (HPMC 50 cp) in polivinil alkoholom (PVA)) (125 kDa) kot nosilnim polimerom, ki pospešuje tvorbo tromba.nastanek.Dodatek polivinilpirolidina K30 (PVP K30) je izboljšal sposobnost absorpcije vlage NFRCS.Polietilen glikol 400 (PEG 400) je bil dodan za izboljšanje zamreženja polimerov v vezanih polimernih mešanicah.Na Ct smo nanesli tri različne HFFC hemostatske sestavke (Cm HFFC, Ch HFFC in Cp HFFC), in sicer hitozan z MC (Cm), hitozan s HPMC (Ch) in hitozan s PVA (Cp).Različne študije karakterizacije in vitro in in vivo so potrdile hemostatično in ransko celjenje aktivnosti NFRC.Kompozitni materiali, ki jih ponuja NFRCS, se lahko uporabljajo za prilagoditev različnih oblik gradbenih odrov, da ustrezajo posebnim potrebam.
Poleg tega se lahko NFRCS spremeni kot povoj ali zvitek, da pokrije celotno območje poškodbe spodnjih okončin in drugih delov telesa.Posebej za bojne poškodbe okončin se lahko zasnovana zasnova NFRCS spremeni v polovico roke ali celotno nogo (dodatna slika S11).NFRCS je mogoče narediti v zapestnico z lepilom za tkivo, ki se lahko uporablja za zaustavitev krvavitev zaradi hudih samomorilnih poškodb zapestja.Naš glavni cilj je razviti NFRCS s čim manj polimera, ki ga je mogoče dostaviti veliki populaciji (pod pragom revščine) in ki ga je mogoče dati v komplet prve pomoči.Enostavna, učinkovita in ekonomična zasnova NFRCS koristi lokalnim skupnostim in ima lahko globalni vpliv.
Hitozan (molekularna teža 80 kDa) in Amarant sta bila kupljena pri Mercku v Indiji.Hidroksipropil metilceluloza 50 CP, polietilen glikol 400 in metilceluloza so bili kupljeni pri Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbaj.Polivinilni alkohol (molekulska teža 125 kDa) (87-90% hidroliziranih) je bil kupljen pri National Chemicals, Gujarat.Polivinilpirolidin K30 je bil kupljen pri Molychemu v Mumbaju, sterilni brisi so bili kupljeni pri Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, z vodo Milli Q (sistem za čiščenje vode Direct-Q3, Merck, Indija) kot nosilcem.
NFRCS je bil razvit po metodi liofilizacije11,12.Vse sestave HFFC (tabela 1) smo pripravili z mehanskim mešalnikom.Natančno težo naloženega polimera, navedeno v tabeli 1, smo dodali raztopini hitozana in mešali, dokler nismo dobili bistre raztopine polimera.Nastali zmesi dodamo PVP K30 in PEG 400 v količinah, navedenih v tabeli 1, in nadaljujemo z mešanjem, dokler ne dobimo bistre raztopine viskoznega polimera.
Isti postopek se uporablja za izdelavo različnih oblik in struktur, kot so tamponi ali cilindrični tamponi ali katere koli druge oblike za različne namene.
Nastali raztopini hitozana dodamo 1% PEG 400 in mešamo 30 minut.Nastalo raztopino vlijemo v kvadratno ali pravokotno posodo in 12 ur zamrznimo pri -80 ° C.
Razviti NFRCS je bil podvržen poskusom z infrardečo spektroskopijo s Fourierjevo transformacijo (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonska), da bi potrdili kemijsko združljivost hitozana z drugimi polimeri 14,15.FTIR spektri (širina spektralnega območja od 400 do 4000 cm-1) vseh preizkušenih vzorcev so bili dobljeni z izvedbo 32 pregledov.
Hitrost absorpcije krvi (bar) za vse formulacije je bila ovrednotena po metodi, ki sta jo opisala Chen et al.16 z manjšimi spremembami.Razviti NFRK vseh sestavkov smo posušili v vakuumski peči pri 105 ° C čez noč, da smo odstranili preostalo topilo.30 mg NFRCS (začetna teža vzorca – W0) in 30 mg Ct (pozitivna kontrola) smo dali v ločene posode, ki vsebujejo predmešanico 3,8 % natrijevega citrata.V vnaprej določenih časovnih intervalih, tj.Končna teža krvi, ki jo absorbira NFRCS 16, je bila v vsaki časovni točki upoštevana (W1).Izračunajte odstotek vrstice z naslednjo formulo:
Čas strjevanja krvi (BCT) je bil določen, kot so poročali Wang et al.17.Čas, potreben za strjevanje polne krvi (kri podgane, predhodno zmešane s 3,8 % natrijevim citratom) v prisotnosti NFRCS, je bil izračunan kot BCT testnega vzorca.Različne komponente NFRCS (30 mg) so bile nameščene v 10 ml vijakov vijakov in inkubirane pri 37 ° C.V vialo smo dodali kri (0,5 ml) in dodali 0,3 ml 0,2 M Cacl2, da smo aktivirali koagulacijo krvi.Na koncu obrnite vialo vsakih 15 sekund (do 180°), dokler ne nastane trden strdek.BCT vzorca je ocenjen s številom flips Vails17,18.Na podlagi BCT sta bili za nadaljnje študije karakterizacije izbrani dve optimalni sestavi iz NFRCS Cm, Ch in Cp.
BCT sestavkov Ch NFRCS in Cp NFRCS je bil določen z uporabo metode, ki so jo opisali Li et al.19.V ločene petrijske posode (37 ° C) postavite 15 x 15 mm2 ch NFRC, CP NFRCS in CS (pozitiven nadzor).Kri, ki je vsebovala 3,8 % natrijevega citrata, je bila zmešana z 0,2 M CaCl2 v volumskem razmerju 10:1, da se je začel proces strjevanja krvi.Na površino vzorca smo nanesli 20 µL 0,2 M CACL2 podgane krvne mešanice podgane in dali v prazen petrijev posoda.Kontrola je bila kri, nalita v prazne petrijevke brez Ct.V določenih intervalih 0, 3 in 5 minut zaustavite strjevanje tako, da vzorcu, ki vsebuje posodo, dodate 10 ml deionizirane (DI) vode, ne da bi motili strdek.Nekoagulirani eritrociti (eritrociti) se v prisotnosti deionizirane vode podvržejo hemolizi in sprostijo hemoglobin.Hemoglobin v različnih časovnih točkah (HA(t)) smo izmerili pri 540 nm (λmax hemoglobin) z UV-Vis spektrofotometrom.Kot referenčni standard smo vzeli absolutno absorpcijo hemoglobina (AH(0)) v 0 min 20 µl krvi v 10 ml deionizirane vode.Relativni privzem hemoglobina (RHA) koagulirane krvi je bil izračunan iz razmerja HA(t)/HA(0) z uporabo iste serije krvi.
Z analizatorjem teksture (Texture Pro CT v1.3 Build 15, Brookfield, ZDA) so bile določene lepilne lastnosti NFRK do poškodovanega tkiva.Po 3-minutni inkubaciji pri sobni temperaturi (RT) (25 °C) smo zabeležili adhezivno moč NFRCS pri konstantni hitrosti 0,5 mm/s.
Glavna značilnost kirurških tesnil je povečati strjevanje krvi in ​​hkrati zmanjšati izgubo krvi.Koagulacija brez izgube v NFRCS je bila ocenjena po predhodno objavljeni metodi z rahlimi spremembami 19.Naredite mikrocentrifugirno epruveto (2 ml) (notranji premer 10 mm) z luknjo 8 × 5 mm2 na eni strani centrifugalne epruvete (ki predstavlja odprto rano).NFRCS se uporablja za zapiranje odprtine, trak pa za tesnjenje zunanjih robov.V cev za mikrocentrifugo dodajte 20 ul 0,2 M Cacl2, ki vsebuje 3,8% premik natrijevega citrata.Po 10 minutah smo mikrocentrifugalne epruvete odstranili iz posod in določili povečanje mase posod zaradi odtoka krvi iz NFRK (n = 3).Izguba krvi CH NFRC in CP NFRC so primerjali s CS.
Mokra celovitost NFRC je bila določena na podlagi metode, ki sta jo opisala Mishra in Chaudhary21 z manjšimi spremembami.NFRC postavite v 100 ml bučke Erlenmeyer s 50 ml vode in 60 s vrtine, ne da bi tvorili vrh.Vizualni pregled in določanje prednosti vzorcev za fizično celovitost na podlagi zbiranja.
Vezavna trdnost HFFC na CT je bila preučena po predhodno objavljenih metodah z manjšimi spremembami.Celovitost površinske prevleke je bila ocenjena z izpostavljanjem NFRK akustičnim valom (zunanjim dražljajem) v prisotnosti miliq vode (CT).Razviti NFRCS Ch NFRCS in Cp NFRCS smo dali v čašo, napolnjeno z vodo, in sonikirali 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oziroma 30 minut.Po sušenju je bila odstotna razlika med začetno in končno težo NFRCS uporabljena za izračun odstotka izgube materiala (HFFC).In vitro BCT je nadalje podpiral vezavno trdnost ali izgubo površinskih materialov.Učinkovitost vezave HFFC na CT zagotavlja koagulacijo krvi in ​​elastično prevleko na površini CT22.
Homogenost razvitih NFRC je bila določena z BCT vzorcev (30 mg), odvzetih iz naključno izbranih splošnih lokacij NFRC.Za določitev skladnosti NFRCS sledite prej omenjenemu postopku BCT.Bližina vseh petih vzorcev zagotavlja enakomerno pokritost površine in odlaganje HFFC v CT mreži.
Nominalna kontaktna površina s krvjo (NBCA) je bila določena, kot je bilo predhodno sporočeno z nekaterimi spremembami.Koagulirajte kri tako, da stisnete 20 µl krvi med obe površini Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS in Cs.Po 1 uri smo oba dela stenta ločili in ročno izmerili površino strdka.Povprečna vrednost treh ponovitev je veljala za NBCA NFRCS19.
Analiza dinamične sorpcije hlapov (DVS) je bila uporabljena za oceno učinkovitosti NFRCS za absorpcijo vode iz zunanjega okolja ali z mesta poškodbe, ki je odgovorno za začetek koagulacije.DVS gravimetrično oceni ali zabeleži privzem in izgubo hlapov v vzorcu z uporabo ultra občutljive tehtnice z masno ločljivostjo ±0,1 µg.Delni parni tlak (relativna vlažnost) ustvari elektronski krmilnik masnega pretoka okoli vzorca z mešanjem nasičenih in suhih nosilnih plinov. V skladu s smernicami Evropske farmakopeje so bili vzorci glede na odstotek vnosa vlage v vzorce razvrščeni v 4 kategorije (0–0,012 % m/m − nehigroskopski, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopski, 2–15 % zmerno higroskopski in > 15 % zelo higroskopski)23. V skladu s smernicami Evropske farmakopeje so bili vzorci glede na odstotek vnosa vlage v vzorce razvrščeni v 4 kategorije (0–0,012 % m/m − nehigroskopski, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopski, 2–15 % zmerno higroskopski in > 15 % zelo higroskopski)23.V skladu s priporočili Evropske farmakopeje smo vzorce glede na odstotek vpojnosti vlage razdelili v 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopni, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopni, 2– petnajst %).% VAMORNO GIGROSKOPIN I> 15% ENь GIGROKOPOPOPINGUN) 23. % zmerno higroskopski in> 15% zelo higroskopski) 23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 ， ， 样品 分为 4 类 （0-0.012% w/w- 非 吸湿 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 0,2-2% w/w 轻微 吸湿性 、 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 23。 23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012 % W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。V skladu s priporočili Evropske farmakopeje so vzorci razdeljeni v 4 razrede glede na odstotek vlage, ki jo vzorec absorbira (0-0,012 mas. % – nehigroskopski, 0,2-2 mas. % rahlo higroskopni, 2-15 mas. %).% VAMORNO GGROSKOPIJAN,> 15 % enus gagroskopin) 23. % zmerno higroskopski,> 15% zelo higroskopski) 23.Higroskopsko učinkovitost NFCS X NFCS in TsN NFCS smo določili na analizatorju DVS TA TGA Q5000 SA.Med tem postopkom so bili pridobljeni čas delovanja, relativna vlažnost (RH) in teža vzorca v realnem času pri 25 °C24.Vsebnost vlage se izračuna z natančno masno analizo NFRCS z uporabo naslednje enačbe:
MC je vlažnost NFRCS.m1 – suha teža NSAID.m2 je masa NFRCS v realnem času pri dani RH.
Celotno površino smo ocenili s poskusom adsorpcije dušika s tekočim dušikom po praznjenju vzorcev pri 25 °C 10 ur (<7 × 10–3 Torr). Celotno površino smo ocenili s poskusom adsorpcije dušika s tekočim dušikom po praznjenju vzorcev pri 25 °C 10 ur (<7 × 10–3 Torr). Skupna površina površine je bila ocenjena s pomočjo eksperimenta z adsorpcijo dušika z živim dušikom po izpustu vzorcev pri 25 °C v 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Celotno površino smo ocenili z uporabo poskusa adsorpcije dušika s tekočim dušikom, potem ko smo vzorce izpraznili pri 25 °C 10 ur (<7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。temperatura 25°C Skupna površina površine je bila ocenjena z uporabo poskusov z adsorpcijo dušika z živim dušikom po izpustu vzorcev v 10 urah pri 25 °C (< 7 × 10-3 torr). Celotna površina je bila ocenjena z uporabo poskusov adsorpcije dušika s tekočim dušikom, potem ko so bili vzorci izpraznjeni 10 ur pri 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Skupna površina, volumen por in velikost por NFRCS so bili določeni s Quantachrome iz NOVA 1000e, Avstrija, z uporabo programske opreme RS 232.
Pripravite 5 % RBC (fiziološka raztopina kot razredčilo) iz polne krvi.Nato prenesite alikvot HFFC (0,25 ml) na ploščo s 96 vdolbinicami in 5 % mase RBC (0,1 ml).Mešanico inkubiramo 40 minut pri 37 °C.Mešanica rdečih krvnih celic in seruma je veljala za pozitivno kontrolo, mešanica fiziološke raztopine in rdečih krvnih celic pa za negativno kontrolo.Hemaglutinacijo smo določili po Stajitzkyjevi lestvici.Predlagane lestvice so naslednje: + + + + gosti zrnati agregati;+ + + gladke spodnje blazinice z ukrivljenimi robovi;+ + gladke spodnje blazinice z raztrganimi robovi;+ ozki rdeči obročki okoli robov gladkih blazinic;– (negativno) diskretni rdeči gumb 12 v sredini spodnjega vdolbinice.
Hemokompatibilnost NFRCS smo proučevali po metodi Mednarodne organizacije za standardizacijo (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Gravimetrična metoda, ki so jo opisali Singh et al.Za oceno tvorbe trombov v prisotnosti ali na površini NFRC -jev so bile narejene manjše spremembe.500 mg CS, CH NFRC in CP NFRC -jev inkubiramo v fiziološki raztopini s fosfatom (PBS) 24 ur pri 37 ° C.Po 24 urah smo odstranili PBS in NFRC zdravili z 2 ml krvi, ki vsebuje 3,8% natrijevega citrata.Na površini NFRCS inkubiranim vzorcem dodajte 0,04 ml 0,1 M CaCl2.Po 45 minutah dodamo 5 ml destilirane vode, da zaustavimo koagulacijo.Koagulirano kri na površini NFRK smo obdelali s 36-38% raztopino formaldehida.S formaldehidom fiksirane strdke smo posušili in stehtali.Odstotek tromboze smo ocenili z izračunom teže kozarca brez krvi in ​​vzorca (negativna kontrola) in kozarca s krvjo (pozitivna kontrola).
Kot prvo potrditev so bili vzorci vizualizirani pod optičnim mikroskopom, da bi razumeli sposobnost površinske prevleke HFFC, medsebojno povezane Ct in mreže Ct, da tvorijo pore.Tanki odseki Ch in Cp iz NFRCS so bili obrezani z rezilom skalpela.Nastali rez smo položili na predmetno stekelce, prekrili s pokrovnim stekelcem in robove pritrdili z lepilom.Pripravljene diapozitive so bili gledali pod optičnim mikroskopom in fotografije so bile posnete na različnih povečavah.
Odlaganje polimerov v mrežah Ct je bilo vizualizirano s fluorescenčno mikroskopijo na podlagi metode, ki so jo opisali Rice et al.29. Sestavek HFFC, uporabljen za formulacijo, je bil zmešan s fluorescenčnim barvilom (amarant), NFRCS (Ch & Cp) pa smo pripravili po prej omenjeni metodi. Sestavek HFFC, uporabljen za formulacijo, je bil zmešan s fluorescenčnim barvilom (amarant), NFRCS (Ch & Cp) pa smo pripravili po prej omenjeni metodi.Sestavek HFFC, uporabljen za formulacijo, je bil zmešan s fluorescentnim barvilom (amarant) in NFRCS (Ch in Cp) je bil pridobljen po prej omenjeni metodi.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Sestava HFFC, uporabljena v formulaciji, je bila pomešana s fluorescentnim barvilom (amarant) in prejela NFRC (CH in CP), kot je bilo že omenjeno.Iz dobljenih vzorcev smo izrezali tanke rezine NFRK, jih položili na stekelca in prekrili s pokrovnimi stekelci.Pripravljena preparata opazujte pod fluorescentnim mikroskopom z zelenim filtrom (310-380 nm).Slike so bile posnete pri 4-kratni povečavi, da bi razumeli razmerja Ct in odvečno odlaganje polimerov v mreži Ct.
Površinska topografija NFRCS CH in CP je bila določena z mikroskopom atomske sile (AFM) z ultra ostrim konzolnim konzolom v načinu tapka: 42 N/M, 320 KHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan.Hrapavost površine je bila določena s povprečnim kvadratom (RMS) z uporabo programske opreme (Scanning Probe Image Processor).Različne lokacije NFRCS so bile upodobljene na 3D slikah, da se preveri enotnost površine.Standardni odklon rezultata za dano območje je definiran kot površinska hrapavost.Enačba RMS je bila uporabljena za kvantificiranje hrapavosti površine NFRCS31.
Študije na podlagi FESEM so bile izvedene z uporabo FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, da bi razumeli površinsko morfologijo Ch NFRCS in Cp NFRCS, ki je pokazala boljši BCT kot Cm NFRCS.Študija FESEM je bila izvedena po metodi, ki sta jo opisala Zhao in sod.32 z manjšimi spremembami.NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS in Cp NFRCS smo predhodno zmešali z 20 µl 3,8 % natrijevega citrata, predhodno zmešanega s krvjo podgan.Vzorcem, obdelanim s krvjo, smo dodali 20 μl 0,2 M CaCl2 za sprožitev koagulacije in vzorce inkubirali pri sobni temperaturi 10 minut.Poleg tega so bili odvečni eritrociti odstranjeni s površine NFRCS z izpiranjem s fiziološko raztopino.
Naslednje vzorce obdelamo z 0,1 % glutaraldehidom in nato posušimo v pečici z vročim zrakom pri 37 °C, da odstranimo vlago.Posušene vzorce smo premazali in analizirali 32 .Druge slike, pridobljene med analizo, so bile tvorba strdka na površini posameznih bombažnih vlaken, odlaganje polimera med Ct, morfologija (oblika) eritrocitov, celovitost strdka in morfologija eritrocitov v prisotnosti NFRCS.Neobdelana območja NFRCS in področja NFRCS, obdelana s Ch in Cp, inkubirana s krvjo, so bila skenirana za elementarne ione (natrij, kalij, dušik, kalcij, magnezij, cink, baker in selen)33.Primerjajte odstotke elementarnih ionov med obdelanimi in neobdelanimi vzorci, da boste razumeli kopičenje elementarnih ionov med nastajanjem strdka in homogenost strdka.
Debelina površinske prevleke CP HFFC na površini CT je bila določena z uporabo FESEM.Prečni prerezi Cp NFRCS so bili izrezani iz ogrodja in prevlečeni z napršenjem.Nastale vzorce napršene prevleke je opazoval FESEM in izmerila debelino površinske prevleke 34, 35, 36.
Rentgenski mikro-CT zagotavlja 3D nedestruktivno slikanje visoke ločljivosti in vam omogoča preučevanje notranje strukturne ureditve NFRK.Micro-CT uporablja rentgenski žarek, ki poteka skozi vzorec, da zabeleži lokalni koeficient linearnega slabljenja rentgenskih žarkov v vzorcu, kar pomaga pri pridobivanju morfoloških informacij.Notranjo lokacijo CT v CP NFRC in krvno obdelani CP NFRC je bil pregledan z mikro-CT, da bi razumeli učinkovitost absorpcije in strjevanje krvi v prisotnosti NFRCS37,38,39.3D strukture s krvjo obdelanih in neobdelanih vzorcev Cp NFRCS so bile rekonstruirane z mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Nemčija).Z uporabo VG Studio-Max Software različice 2.2 je bilo posnetih več rentgenskih slik iz različnih zornih kotov (v idealnem primeru 360 ° pokritosti) za razvoj 3D slik za NFRC.Zbrane podatke o projekcijah smo rekonstruirali v 3D volumetrične slike z uporabo ustrezne preproste programske opreme 3D ScanIP Academic.
Poleg tega je bilo za razumevanje porazdelitve strdka v NFRCS dodanih 20 µl predmešane citrirane krvi in ​​20 µl 0,2 M CaCl2 za sprožitev strjevanja krvi.Pripravljene vzorce pustimo strjevati.Površino NFRK smo obdelali z 0,5% glutaraldehidom in 30 minut posušili v pečici z vročim zrakom pri 30–40 ° C.Krvni strdek, ki je nastal na NFRCS, je bil skeniran, rekonstruiran in vizualizirana je bila 3D slika krvnega strdka.
Antibakterijski testi so bili izvedeni na Cp NFRCS (najboljše v primerjavi s Ch NFRCS) z uporabo prej opisane metode z manjšimi modifikacijami.Antibakterijska aktivnost CP NFRC in CP HFFC je bila določena z uporabo treh različnih preskusnih mikroorganizmov [s.aureus (gram-pozitivne bakterije), E.coli (gram-negativne bakterije) in bele kandide (C.Albičans)], ki rastejo na agarju v petrijskih posodah v petritrih v inkubatorju.Enakomerno nacepite 50 ml razredčene suspenzije bakterijske kulture v koncentraciji 105-106 CFU ml-1 na agarsko gojišče.Medij vlijemo v petrijevko in pustimo, da se strdi.Na površini plošče z agarjem so naredili vdolbinice za polnjenje s HFFC (3 vdolbinice za HFFC in 1 za negativno kontrolo).Dodajte 200 µl HFFC v 3 vdolbinice in 200 µl pH 7,4 PBS v 4. vdolbinico.Na drugo stran petrijevke položite 12 mm Cp NFRCS disk na strjen agar in ga navlažite s PBS (pH 7,4).Tablete ciprofloksacina, ampicilina in flukonazola veljajo za referenčne standarde za Staphylococcus aureus, Escherichia coli in Candida albicans.Ročno izmerite cono inhibicije in naredite digitalno sliko cone inhibicije.
Po institucionalni etični odobritvi je bila študija izvedena na Kasturba Medical College of Education and Research v Manipalu, Karnataka, v južni Indiji.In vitro eksperimentalni protokol TEG je pregledal in odobril Odbor za institucionalno etiko Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Predmeti so bili izbrani izmed prostovoljnih krvodajalcev (starih od 18 do 55 let) iz bolnišnične krvne banke.Poleg tega je bil od prostovoljcev pridobljen obrazec za informirano soglasje za odvzem vzorcev krvi.Nativni TEG (N-TEG) ​​je bil uporabljen za preučevanje učinka formulacije Cp HFFC na polno kri, predhodno zmešano z natrijevim citratom.N-TEG je splošno priznan po svoji vlogi pri oživljanju na kraju samem, kar klinikom povzroča težave zaradi možnosti klinično pomembne zamude pri rezultatih (rutinski koagulacijski testi).Analiza N-TEG je bila izvedena s polno krvjo.Informirano soglasje in podrobno anamnezo so pridobili vsi udeleženci.Študija ni vključevala udeležencev s hemostatičnimi ali trombotičnimi zapleti, kot so nosečnost/poporodna bolezen ali bolezen jeter.Iz študije so bili izključeni tudi subjekti, ki so jemali zdravila, ki vplivajo na koagulacijsko kaskado.Osnovne laboratorijske preiskave (hemoglobin, protrombinski čas, aktivirani tromboplastin in število trombocitov) smo opravili vsem udeležencem po standardnih postopkih.N-TEG določa viskoelastičnost krvnega strdka, začetno strukturo strdka, interakcijo delcev, krepitev strdka in lizo strdka.Analiza N-TEG zagotavlja grafične in numerične podatke o skupnih učinkih več celičnih elementov in plazme.Analiza N-TEG je bila izvedena na dveh različnih volumnih Cp HFFC (10 µl in 50 µl).Posledično smo 1 ml polne krvi s citronsko kislino dodali 10 μl Cp HFFC.Dodajte 1 ml (Cp HFFC + citrirana kri), 340 µl mešane krvi v 20 µl 0,2 M CaCl2, ki vsebuje TEG posodo.Nato so bile posode s TEG naložene v TEG® 5000, ZDA za merjenje R, K, kota alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % vzorcev krvi v prisotnosti Cp HFFC41.
Protokol študije in vivo je pregledal in odobril Institucionalni odbor za etiko živali (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s priporočili Odbora za nadzor in nadzor poskusov na živalih (CPCSEA).Vse in vivo NFRCS študije (2 × 2 cm2) so bile izvedene pri ženskih podganah Wistar (tehtali 200 do 250 g).Vse živali so bile aklimatizirane pri temperaturi 24-26°C, živali so imele prost dostop do standardne hrane in vode ad libitum.Vse živali so bile naključno razdeljene v različne skupine, vsaka skupina je bila sestavljena iz treh živali.Vse študije so bile izvedene v skladu s Študijami na živalih: poročilo o poskusih in vivo 43 .Pred študijo smo živali anestezirali z intraperitonealno (ip) aplikacijo mešanice 20-50 mg ketamina (na 1 kg telesne teže) in 2-10 mg ksilazina (na 1 kg telesne teže).Po študiji smo izračunali volumen krvavitve z oceno razlike med začetno in končno težo vzorcev, povprečno vrednost, dobljeno iz treh testov, pa smo vzeli kot volumen krvavitve vzorca.
Model amputacije podganjega repa je bil uporabljen za razumevanje potenciala NFRCS za modulacijo krvavitve v travmi, bitki ali prometni nesreči (model poškodbe).Odrežite 50 % repa z rezilom skalpela in ga postavite na zrak za 15 s, da zagotovite normalno krvavitev.Poleg tega smo testne vzorce položili na rep podgane s pritiskom (Ct, Cs, Ch NFRCS in Cp NFRCS).Za testne vzorce (n = 3) so poročali o krvavitvah in PCT17,45.
Učinkovitost nadzora tlaka NFRCS v boju je bila raziskana na modelu površinske stegnenice.Femoralno arterijo izpostavimo, punktiramo s troakarjem 24G in izkrvavimo v 15 sekundah.Ko opazite nenadzorovano krvavitev, se preskusni vzorec s pritiskom položi na mesto vboda.Takoj po nanosu testnega vzorca smo zabeležili čas strjevanja krvi in ​​naslednjih 5 minut opazovali hemostatsko učinkovitost.Isti postopek smo ponovili s Cs in Ct46.
Dowling et al.47 je predlagal model poškodbe jeter za oceno hemostatskega potenciala hemostatskih materialov v kontekstu intraoperativne krvavitve.BCT je bil zabeležen za vzorce Ct (negativna kontrola), okvir Cs (pozitivna kontrola), vzorce Ch NFRCS in vzorce Cp NFRCS.Suprahepatična vena cava podgane je bila izpostavljena z izvajanjem mediane laparotomije.Po tem smo s škarjami izrezali distalni del levega režnja.Z rezilom skalpela naredite rez v jetra in pustite, da nekaj sekund krvavijo.Natančno stehtana testna vzorca Ch NFRCS in Cp NFRCS smo položili na poškodovano površino brez kakršnega koli pozitivnega tlaka in zabeležili BCT.Kontrolna skupina (Ct) je nato uporabila pritisk, ki mu je sledil Cs 30 s47, ne da bi prekinila poškodbo.
Testi celjenja ran in vivo so bili izvedeni z uporabo ekscizijskega modela rane za oceno lastnosti celjenja ran razvitih NFRCS na osnovi polimerov.Modeli ekscizijskih ran so bili izbrani in izvedeni po predhodno objavljenih metodah z manjšimi modifikacijami19,32,48.Vse živali so bile anestezirane, kot je opisano prej.Z luknjačem za biopsijo (12 mm) naredite krožni globoki rez v kožo hrbta.Pripravljena mesta rane so bila prevlečena s Cs (pozitivna kontrola), Ct (prepoznavanje, da bombažne blazinice ovirajo celjenje), Ch NFRCS in Cp NFRCS (eksperimentalna skupina) in negativna kontrola brez kakršnega koli zdravljenja.Vsak dan študije so pri vseh podganah izmerili površino rane.Z digitalnim fotoaparatom posnemite sliko rane in nanesite novo oblogo.Odstotek zaprtja rane je bil izmerjen z naslednjo formulo:
Glede na odstotek zaprtja rane na 12. dan študije je bila podganja koža najboljše skupine izrezana ((Cp NFRCS) in kontrolna skupina) in proučena z barvanjem H&E in Massonovim trikromnim barvanjem. Glede na odstotek zaprtja rane na 12. dan študije je bila podganja koža najboljše skupine izrezana ((Cp NFRCS) in kontrolna skupina) in proučena z barvanjem H&E in Massonovim trikromnim barvanjem.Glede na odstotek zaprtja rane na 12. dan študije smo podganam najboljše skupine ((Cp NFRCS) in kontrolne skupine) izrezali kožo in jo pregledali z barvanjem s hematoksilin-eozinom in Massonovim trikromom.根据 研究 第 12 天 的 伤口 百分比 ， ， 切除 切除 佳组 ((CP NFRCS) 和 对照组) 的 大鼠 皮肤 ， 进行 进行 进行 h & e 染色 和 Masson 三 色 色 染色 研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组)Podgane v najboljši skupini ((Cp NFRCS) in kontrolne skupine) so bile izrezane za obarvanje s hematoksilin-eozinom in obarvanje s trikromom po Massonu na podlagi odstotka zaprtja rane na 12. dan študije.Izvedeni postopek barvanja je bil izveden po predhodno opisanih metodah 49, 50.Na kratko, po fiksaciji v 10% formalinu so bili vzorci dehidrirani z uporabo serije razvrščenih alkoholov.Z mikrotomom pridobite tanke dele (debele 5 µm) izrezanega tkiva.Tanke serijske odseke kontrol in Cp NFRCS smo obdelali s hematoksilinom in eozinom, da bi preučili histopatološke spremembe.Massonovo trikromno barvanje je bilo uporabljeno za odkrivanje tvorbe kolagenskih fibril.Dobljene rezultate so slepo proučevali patologi.
Stabilnost vzorcev Cp NFRCS so proučevali pri sobni temperaturi (25 °C ± 2 °C/60 % RH ± 5 %) 12 mesecev51.Cp NFRCS (razbarvanje površine in rast mikrobov) je bil vizualno pregledan in testiran glede odpornosti proti obrabi in BCT v skladu z zgornjimi metodami, opisanimi v razdelku Materiali in metode.
Razširljivost in ponovljivost Cp NFRCS smo preučili s pripravo Cp NFRCS velikosti 15×15 cm2.Poleg tega je bilo 30 mg vzorcev (n = 5) izrezanih iz različnih frakcij Cp NFRCS in BCT proučevanih vzorcev je bil ocenjen, kot je opisano prej v razdelku Metode.
Poskušali smo razviti različne oblike in strukture z uporabo sestavkov Cp NFRCS za različne biomedicinske aplikacije.Takšne oblike ali konfiguracije vključujejo stožčaste brise za krvavitve iz nosu, zobozdravstvene posege in cilindrične brise za vaginalne krvavitve.
Vsi nizi podatkov so izraženi kot povprečje ± standardni odklon in so bili analizirani z ANOVA z uporabo Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, ZDA), čemur je sledil Bonferronijev test večkratnih primerjav (*p<0,05).
Vsi postopki, izvedeni v študijah na ljudeh, so bili v skladu s standardi Inštituta in Nacionalnega raziskovalnega sveta ter Helsinško deklaracijo iz leta 1964 in njenimi poznejšimi dopolnitvami ali podobnimi etičnimi standardi.Vsi udeleženci so bili obveščeni o značilnostih študije in njeni prostovoljni naravi.Podatki o udeležencih ostanejo zaupni, ko so zbrani.In vitro eksperimentalni protokol TEG je pregledal in odobril Odbor za institucionalno etiko Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Prostovoljci so podpisali informirano soglasje za odvzem vzorcev krvi.
Vsi postopki, izvedeni v študijah na živalih, so bili izvedeni v skladu z Medicinsko fakulteto Kastuba, Inštitut za visoko šolstvo Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Vsi zasnovani poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami Odbora za nadzor in nadzor poskusov na živalih (CPCSEA).Vsi avtorji sledijo smernicam ARRIVE.
Spektri FTIR vseh NFRCS so bili analizirani in primerjani s spektrom hitozana, prikazanim na sliki 2A.Značilni spektralni vrhovi hitozana (posneti) pri 3437 cm-1 (raztezanje OH in NH, prekrivanje), 2945 in 2897 cm-1 (raztezanje CH), 1660 cm-1 (napenjanje NH2), 1589 cm-1 (upogibanje N–H), 1157 cm-1 (raztezanje mostu O-), 1067 cm-1 (raztezanje C–O, sekundarni hidro xyl), 993 cm-1 (raztegljiv CO, Bo-OH) 52.53.54.Dodatna tabela S1 prikazuje vrednosti absorpcijskega spektra FTIR NFRCS za hitozan (poročevalec), čisti hitozan, Cm, Ch in Cp.Spektri FTIR vseh NFRCS (Cm, Ch in Cp) so pokazali enake značilne absorpcijske pasove kot čisti hitozan brez bistvenih sprememb (slika 2A).Rezultati FTIR so potrdili odsotnost kemičnih ali fizikalnih interakcij med polimeri, uporabljenimi za razvoj NFRCS, kar kaže, da so uporabljeni polimeri inertni.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS in Cs.(A) predstavlja kombinirane spektre FTIR sestavkov hitozana in Cm NFRCS, Ch NFRCS in Cp NFRCS pod stiskanjem.(B) a) Stopnja privzema NFRCS v polni krvi Cm, Ch, Cp in Cg (n = 3);Vzorci Ct so pokazali višji BAR, ker ima vatirana palčka večjo absorpcijsko učinkovitost;b) Kri po absorpciji krvi Prikaz absorbiranega vzorca.Grafični prikaz BCT testnega vzorca C (Cp NFRCS je imel najboljši BCT (15 s, n = 3)). Podatki v C, D, E in G so bili prikazani kot povprečje ± SD, stolpci napak pa predstavljajo SD, ***p < 0,0001. Podatki v C, D, E in G so bili prikazani kot povprečje ± SD, stolpci napak pa predstavljajo SD, ***p < 0,0001. Podatki v C, D, E in G so predstavljeni kot srednje ± standardno odstopanje, pogrešne plošče pa predstavljajo standardno odstopanje, ***p <0,0001. Podatki v C, D, E in G so predstavljeni kot povprečje ± standardna deviacija, stolpci napak pa predstavljajo standardno deviacijo, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Danny v c, d, e j g. Oneni, *** P <0.0001. Podatki v C, D, E in G so prikazani kot povprečje ± standardna deviacija, vrstice napak predstavljajo standardno deviacijo, ***p<0,0001.