Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Nenadzorovana krvavitev je eden glavnih vzrokov smrti. Doseganje hitre hemostaze zagotavlja preživetje osebe kot prva pomoč med bojem, prometnimi nesrečami in operacijami za zmanjšanje smrtnosti. Nanoporozni kompozitni oder, ojačan z vlakni (NFRCS), pridobljen iz preproste hemostatične filmotvorne sestave (HFFC) kot neprekinjene faze, lahko sproži in okrepi hemostazo. Razvoj NFRCS temelji na zasnovi krila kačjega pastirja. Struktura krila kačjega pastirja je sestavljena iz prečnih in vzdolžnih kril, membrane kril pa so med seboj povezane, da se ohrani celovitost mikrostrukture. HFFC enakomerno prekrije površino vlaken s filmom debeline nanometra in poveže naključno porazdeljeno debelino bombaža (Ct) (disperzna faza) v nanoporozno strukturo. Kombinacija neprekinjene in dispergirane faze zniža stroške izdelka za desetkrat v primerjavi s komercialno dostopnimi izdelki. Modificirani NFRCS (tamponi ali zapestnice) se lahko uporabljajo v različnih biomedicinskih aplikacijah. Študije in vivo so pokazale, da razviti Cp NFRCS sproži in okrepi proces koagulacije na mestu nanosa. NFRCS lahko modulira mikrookolje in deluje na celični ravni zaradi svoje nanoporozne strukture, kar ima za posledico boljše celjenje ran v modelu ekscizijske rane.
Nenadzorovana krvavitev med bojem, med operacijo in v nujnih primerih lahko predstavlja resno grožnjo za življenje ranjenca1. Ta stanja dodatno vodijo do splošnega povečanja perifernega žilnega upora, kar vodi v hemoragični šok. Ustrezni ukrepi za nadzor krvavitve med operacijo in po njej veljajo za potencialno smrtno nevarne2,3. Poškodba velikih žil vodi do obsežne izgube krvi, kar ima za posledico stopnjo umrljivosti ≤ 50 % v boju in 31 % med operacijo1. Obsežna izguba krvi vodi do zmanjšanja telesnega volumna, kar zmanjša srčni izpust. Povečanje celotnega perifernega žilnega upora in progresivna okvara mikrocirkulacije vodita do hipoksije v organih, ki podpirajo življenje. Če se stanje nadaljuje brez učinkovitega posredovanja, se lahko pojavi hemoragični šok1,4,5. Drugi zapleti vključujejo napredovanje hipotermije in metabolne acidoze ter motnjo koagulacije, ki ovira proces koagulacije. Hud hemoragični šok je povezan z večjim tveganjem za smrt6,7,8. Pri šoku III. stopnje (progresivni) je transfuzija krvi bistvena za preživetje bolnika med intraoperativno in pooperativno obolevnostjo in umrljivostjo. Da bi premagali vse zgoraj omenjene življenjsko nevarne situacije, smo razvili nanoporozni kompozitni oder, ojačan z vlakni (NFRCS), ki uporablja minimalno koncentracijo polimera (0,5 %) z uporabo kombinacije vodotopnih hemostatskih polimerov.
Z uporabo vlaknene ojačitve je mogoče razviti stroškovno učinkovite izdelke. Naključno razporejena vlakna spominjajo na strukturo krila kačjega pastirja, ki jo uravnotežijo vodoravne in navpične črte na krilih. Prečne in vzdolžne žile krila komunicirajo s krilno membrano (slika 1). NFRCS je sestavljen iz ojačanega Ct kot sistema odra z boljšo fizikalno in mehansko trdnostjo (slika 1). Zaradi cenovne dostopnosti in izdelave kirurgi med operacijami in prevezami raje uporabljajo bombažne nitne merilnike (Ct). Zato je bil Ct glede na njegove številne prednosti, vključno z > 90 % kristalne celuloze (ki prispeva k izboljšanju hemostatične aktivnosti), uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10. Zato je bil Ct glede na njegove številne prednosti, vključno z > 90 % kristalne celuloze (ki prispeva k izboljšanju hemostatične aktivnosti), uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10. Slednje, upoštevajoč njegove številne prednosti, v tem primeru > 90% kristalne celuloze (udeležuje se povečane hemostatske aktivnosti), Ct je bil uporabljen v skeletnem sistemu NFRCS9,10. Zato je bil Ct zaradi številnih prednosti, vključno z >90 % kristalne celuloze (ki sodeluje pri povečani hemostatski aktivnosti), uporabljen kot skeletni sistem NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Zato je bil Ct zaradi številnih prednosti, vključno z več kot 90 % kristalne celuloze (ki pomaga izboljšati hemostatično aktivnost), uporabljen kot ogrodje za NFRCS9,10.Ct je bil površinsko prevlečen (opazili so nastanek nanodebelega filma) in medsebojno povezan s hemostatično filmotvorno sestavo (HFFC). HFFC deluje kot matrigel, ki drži naključno razporejen Ct skupaj. Razvita zasnova prenaša napetost znotraj dispergirane faze (ojačitvena vlakna). Z minimalnimi koncentracijami polimerov je težko dobiti nanoporozne strukture z dobro mehansko trdnostjo. Poleg tega ni enostavno prilagoditi različnih kalupov za različne biomedicinske aplikacije.
Slika prikazuje diagram zasnove NFRCS, ki temelji na strukturi krila kačjega pastirja (A). Ta slika prikazuje primerjalno analogijo strukture krila kačjega pastirja (sekajoče se in vzdolžne žile krila so med seboj povezane) in prečno fotomikrografijo Cp NFRCS (B). Shematski prikaz NFRCS.
NFRC so bili razviti z uporabo HFFC kot kontinuirne faze, da bi odpravili zgoraj navedene omejitve. HFFC je sestavljen iz različnih filmotvornih hemostatskih polimerov, vključno s hitozanom (kot glavnim hemostatskim polimerom) z metilcelulozo (MC), hidroksipropil metilcelulozo (HPMC 50 cp) in polivinil alkoholom (PVA) (125 kDa) kot nosilnim polimerom, ki spodbuja nastanek trombov. Dodatek polivinilpirolidina K30 (PVP K30) je izboljšal sposobnost absorpcije vlage NFRCS. Za izboljšanje zamreženja polimerov v vezanih polimernih mešanicah je bil dodan polietilen glikol 400 (PEG 400). Na Ct so bile uporabljene tri različne hemostatične sestave HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC in Cp HFFC), in sicer hitosan z MC (Cm), hitosan s HPMC (Ch) in hitosan s PVA (Cp). Različne in vitro in in vivo karakterizacijske študije so potrdile hemostatično aktivnost in aktivnost celjenja ran NFRCS. Kompozitni materiali, ki jih ponuja NFRCS, se lahko uporabijo za prilagoditev različnih oblik odrov specifičnim potrebam.
Poleg tega je mogoče NFRCS spremeniti v povoj ali zvitek, ki pokrije celotno območje poškodbe spodnjih okončin in drugih delov telesa. Posebej za poškodbe okončin med bojem je mogoče zasnovano zasnovo NFRCS spremeniti v polovico roke ali celo nogo (dodatna slika S11). NFRCS je mogoče izdelati v zapestnico s tkivnim lepilom, ki se lahko uporablja za zaustavitev krvavitve pri hudih samomorilskih poškodbah zapestja. Naš glavni cilj je razviti NFRCS z čim manj polimera, ki ga je mogoče dostaviti veliki populaciji (pod pragom revščine) in ga je mogoče namestiti v komplet prve pomoči. NFRCS je preprost, učinkovit in ekonomičen v zasnovi ter koristi lokalnim skupnostim in ima lahko globalni vpliv.
Hitozan (molekulska masa 80 kDa) in amarant sta bila kupljena pri podjetju Merck v Indiji. Hidroksipropil metilceluloza 50 Cp, polietilen glikol 400 in metilceluloza so bili kupljeni pri podjetju Loba Chemie Pvt. LLC v Mumbaju. Polivinil alkohol (molekulska masa 125 kDa) (87–90 % hidroliziran) je bil kupljen pri podjetju National Chemicals v Gujaratu. Polivinilpirolidin K30 je bil kupljen pri podjetju Molychem v Mumbaju, sterilni brisi pa pri podjetju Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd. v Tamil Naduju, z vodo Milli Q (sistem za čiščenje vode Direct-Q3, Merck, Indija) kot nosilcem.
NFRCS je bil razvit z metodo liofilizacije11,12. Vse sestave HFFC (tabela 1) so bile pripravljene z uporabo mehanskega mešala. Pripravite 0,5-odstotno raztopino hitosana z uporabo 1-odstotne ocetne kisline v vodi z neprekinjenim mešanjem pri 800 vrt/min na mehanskem mešalu. Natančna teža naloženega polimera, navedena v tabeli 1, je bila dodana raztopini hitosana in mešana, dokler ni bila pridobljena bistra polimerna raztopina. Nastali mešanici sta bila dodana PVP K30 in PEG 400 v količinah, navedenih v tabeli 1, in mešanje se je nadaljevalo, dokler ni bila pridobljena bistra viskozna polimerna raztopina. Nastala kopel polimerne raztopine je bila sonificirana 60 minut, da se odstranijo ujeti zračni mehurčki iz polimerne mešanice. Kot je prikazano na dodatni sliki S1(b), je bil Ct enakomerno porazdeljen v vsaki vdolbinici 6-vdolbinske plošče (kalupa), dopolnjene s 5 ml HFFC.
Šestjamična plošča je bila 60 minut sonicirana, da se je doseglo enakomerno omočenje in porazdelitev HFFC v Ct omrežju. Nato je bila šestjamična plošča zamrznjena pri -20 °C za 8–12 ur. Zamrznjene plošče so bile liofilizirane 48 ur, da so bile pridobljene različne formulacije NFRCS. Isti postopek se uporablja za izdelavo različnih oblik in struktur, kot so tamponi ali valjasti tamponi ali katere koli druge oblike za različne aplikacije.
Natančno stehtan hitosan (80 kDa) (3 %) raztopimo v 1 % ocetni kislini z magnetnim mešalom. Nastali raztopini hitosana dodamo 1 % PEG 400 in mešamo 30 minut. Nastalo raztopino prelijemo v kvadratno ali pravokotno posodo in zamrznemo pri -80 °C 12 ur. Zamrznjene vzorce liofiliziramo 48 ur, da dobimo porozni Cs13.
Razviti NFRCS je bil podvržen poskusom z uporabo Fourierjeve transformacijske infrardeče spektroskopije (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonska) za potrditev kemijske združljivosti hitosana z drugimi polimeri14,15. FTIR spektri (širina spektralnega območja od 400 do 4000 cm-1) vseh testiranih vzorcev so bili pridobljeni z izvedbo 32 skeniranj.
Stopnja absorpcije krvi (BAR) za vse formulacije je bila ocenjena z metodo, ki so jo opisali Chen in sod. 16, z manjšimi spremembami. Razvite NFRK vseh sestav so bile čez noč sušene v vakuumski pečici pri 105 °C, da so odstranili preostalo topilo. 30 mg NFRCS (začetna teža vzorca – W0) in 30 mg Ct (pozitivna kontrola) so bile dane v ločene posodice, ki so vsebovale predmešanico 3,8 % natrijevega citrata. V vnaprej določenih časovnih intervalih, tj. 5, 10, 20, 30, 40 in 60 sekund, so bile NFRCS odstranjene in njihove površine očiščene neabsorbirane krvi tako, da so vzorce za 30 sekund postavili na Ct. Končna teža krvi, ki jo je absorbiral NFRCS 16 (W1), je bila upoštevana v vsaki časovni točki. Izračunajte odstotek BAR z uporabo naslednje formule:
Čas strjevanja krvi (BCT) je bil določen, kot so poročali Wang in sod.17. Čas, potreben za strjevanje polne krvi (kri podgan, predhodno zmešane s 3,8 % natrijevega citrata) v prisotnosti NFRCS, je bil izračunan kot BCT testnega vzorca. Različne komponente NFRCS (30 mg) so bile dane v 10 ml viale z navojnim zamaškom in inkubirane pri 37 °C. V vialo je bila dodana kri (0,5 ml) in 0,3 ml 0,2 M CaCl2 za aktivacijo strjevanja krvi. Na koncu je bilo treba vialo obračati vsakih 15 sekund (do 180°), dokler se ne tvori čvrst strdek. BCT vzorca je ocenjen s številom prevrnjenih vial17,18. Na podlagi BCT sta bili za nadaljnje študije karakterizacije izbrani dve optimalni sestavi iz NFRCS Cm, Ch in Cp.
BCT sestavkov Ch NFRCS in Cp NFRCS je bil določen z uporabo metode, ki so jo opisali Li in sod. 19. 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS in Cs (pozitivna kontrola) smo namestili v ločene petrijevke (37 °C). Kri, ki je vsebovala 3,8 % natrijevega citrata, smo zmešali z 0,2 M CaCl2 v volumskem razmerju 10:1, da smo začeli proces strjevanja krvi. 20 µl mešanice 0,2 M CaCl2 podganje krvi smo nanesli na površino vzorca in ga namestili v prazno petrijevko. Kontrola je bila kri, vlita v prazne petrijevke brez Ct. V fiksnih intervalih 0, 3 in 5 minut smo strjevanje ustavili tako, da smo vzorcu, ki je vseboval posodo, dodali 10 ml deionizirane (DI) vode, ne da bi pri tem poškodovali strdek. Nekoagulirani eritrociti (eritrociti) se v prisotnosti deionizirane vode hemolizirajo in sproščajo hemoglobin. Hemoglobin v različnih časovnih točkah (HA(t)) je bil izmerjen pri 540 nm (λmax hemoglobin) z uporabo UV-Vis spektrofotometra. Kot referenčni standard je bila uporabljena absolutna absorpcija hemoglobina (AH(0)) v 0 minutah 20 µl krvi v 10 ml deionizirane vode. Relativni privzem hemoglobina (RHA) koagulirane krvi je bil izračunan iz razmerja HA(t)/HA(0) z uporabo iste serije krvi.
Z analizatorjem teksture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, ZDA) so določili adhezivne lastnosti NFRK na poškodovano tkivo. Ob notranjo stran svinjske kože (brez plasti maščobe) smo pritisnili valjasto posodo z odprtim dnom. Vzorce (Ch NFRCS in Cp NFRCS) smo s kanilo nanesli v valjaste kalupe, da smo ustvarili adhezijo na kožo prašiča. Po 3-minutni inkubaciji pri sobni temperaturi (RT) (25 °C) smo izmerili adhezivno moč NFRCS s konstantno hitrostjo 0,5 mm/s.
Glavna značilnost kirurških tesnilnih mas je povečanje strjevanja krvi ob hkratnem zmanjšanju izgube krvi. Koagulacija brez izgub pri NFRCS je bila ocenjena z uporabo predhodno objavljene metode z manjšimi spremembami 19. Izdelana je bila mikrocentrifugalna epruveta (2 ml) (notranji premer 10 mm) z luknjo 8 × 5 mm2 na eni strani centrifugalne epruvete (ki predstavlja odprto rano). Za zaprtje odprtine se uporabi NFRCS, za tesnjenje zunanjih robov pa trak. V mikrocentrifugalno epruveto, ki vsebuje 3,8 % premiks natrijevega citrata, dodamo 20 µl 0,2 M CaCl2. Po 10 minutah smo mikrocentrifugalne epruvete odstranili iz posodic in ugotovili povečanje mase posodic zaradi odtoka krvi iz NFRK (n = 3). Izguba krvi Ch NFRCS in Cp NFRCS sta bili primerjani s Cs.
Mokra celovitost NFRCS je bila določena na podlagi metode, ki sta jo opisala Mishra in Chaudhary21, z manjšimi spremembami. NFRCS smo dali v 100 ml erlenmajerico s 50 ml vode in mešali 60 sekund, ne da bi se oblikoval vrh. Vizualni pregled in določanje prioritet vzorcev glede fizične celovitosti na podlagi odvzema.
Vezavna moč HFFC na Ct je bila proučevana z uporabo predhodno objavljenih metod z manjšimi spremembami. Celovitost površinske prevleke je bila ocenjena z izpostavitvijo NFRK akustičnim valovom (zunanji dražljaj) v prisotnosti milliQ vode (Ct). Razvite NFRCS Ch NFRCS in Cp NFRCS so bile postavljene v čašo, napolnjeno z vodo, in sonicirane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oziroma 30 minut. Po sušenju je bila odstotna razlika med začetno in končno težo NFRCS uporabljena za izračun odstotka izgube materiala (HFFC). In vitro BCT je dodatno podprl vezavno moč ali izgubo površinskih materialov. Učinkovitost vezave HFFC na Ct zagotavlja koagulacijo krvi in ​​elastično prevleko na površini Ct22.
Homogenost razvitega NFRCS je bila določena z BCT vzorcev (30 mg), odvzetih z naključno izbranih splošnih lokacij NFRCS. Za določitev skladnosti z NFRCS sledite prej omenjenemu postopku BCT. Bližina med vsemi petimi vzorci zagotavlja enakomerno pokritost površine in odlaganje HFFC v mreži Ct.
Nominalna kontaktna površina krvi (NBCA) je bila določena, kot je bilo že opisano, z nekaj spremembami. Kri je bila koagulirana tako, da je bilo 20 µl krvi vpeto med obe površini Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS in Cs. Po 1 uri sta bila oba dela stenta ločena in ročno izmerjena površina strdka. Povprečna vrednost treh ponovitev je bila upoštevana kot NBCA NFRCS19.
Za oceno učinkovitosti NFRCS pri absorpciji vode iz zunanjega okolja ali z mesta poškodbe, ki je odgovorno za začetek koagulacije, je bila uporabljena analiza dinamične sorpcije hlapov (DVS). DVS gravimetrično ocenjuje ali beleži absorpcijo in izgubo hlapov v vzorcu z uporabo ultra občutljive tehtnice z masno ločljivostjo ±0,1 µg. Delni parni tlak (relativna vlažnost) se ustvari z elektronskim regulatorjem masnega pretoka okoli vzorca z mešanjem nasičenih in suhih nosilnih plinov. V skladu s smernicami Evropske farmakopeje so bili vzorci glede na odstotek absorpcije vlage razvrščeni v 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopski, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopski, 2–15 % zmerno higroskopski in > 15 % zelo higroskopski)23. V skladu s smernicami Evropske farmakopeje so bili vzorci glede na odstotek absorpcije vlage razvrščeni v 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopski, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopski, 2–15 % zmerno higroskopski in > 15 % zelo higroskopski)23.V skladu s priporočili Evropske farmakopeje so bili vzorci glede na odstotek absorpcije vlage razdeljeni v 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopski, 0,2–2 % m/m rahlo higroskopski, 2–petnajst %).% zmerno higroskopičen in > 15 % zelo higroskopičen)23. % zmerno higroskopičnih in > 15 % zelo higroskopičnih)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012 % w/w-非吸湿性、0,2–2 % w/w 轻微吸湿性、2–15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012 % W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。V skladu s priporočili Evropske farmakopeje so vzorci razdeljeni v 4 razrede, odvisno od odstotka vlage, ki ga vzorec absorbira (0–0,012 mas. % – nehigroskopski, 0,2–2 mas. % rahlo higroskopski, 2–15 mas. %).% zmerno gigroskopičen, > 15 % zelo gigroskopičen) 23. % zmerno higroskopičen, > 15 % zelo higroskopičen) 23.Higroskopska učinkovitost NFCS X NFCS in TsN NFCS je bila določena na analizatorju DVS TA TGA Q5000 SA. Med tem postopkom so bili pridobljeni čas delovanja, relativna vlažnost (RH) in teža vzorca v realnem času pri 25 °C24. Vsebnost vlage se izračuna z natančno masno analizo NFRCS z uporabo naslednje enačbe:
MC je vlažnost NFRCS. m1 – suha teža NSAID. m2 je masa NFRCS v realnem času pri dani relativni vlažnosti.
Skupna površina je bila ocenjena z uporabo poskusa adsorpcije dušika s tekočim dušikom po praznjenju vzorcev pri 25 °C 10 ur (< 7 × 10–3 Torr). Skupna površina je bila ocenjena z uporabo poskusa adsorpcije dušika s tekočim dušikom po praznjenju vzorcev pri 25 °C 10 ur (< 7 × 10–3 Torr). Skupna površina površine je bila ocenjena s pomočjo eksperimenta z adsorpcijo dušika z živim dušikom po izpustu vzorcev pri 25 °C v 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Skupna površina je bila ocenjena z uporabo poskusa adsorpcije dušika s tekočim dušikom po praznjenju vzorcev pri 25 °C 10 ur (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Temperatura 25°C Skupna površina površine je bila ocenjena z uporabo poskusov z adsorpcijo dušika z živim dušikom po izpustu vzorcev v 10 urah pri 25 °C (< 7 × 10-3 torr). Skupna površina je bila ocenjena z uporabo poskusov adsorpcije dušika s tekočim dušikom po 10 urah praznjenja vzorcev pri 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Skupna površina, volumen por in velikost por NFRCS so bili določeni s Quantachromeom podjetja NOVA 1000e, Avstrija, z uporabo programske opreme RS 232.
Iz polne krvi pripravite 5 % eritrocitov (s fiziološko raztopino kot redčilom). Nato prenesite alikvot HFFC (0,25 ml) na 96-vdolbinsko ploščo in 5 % mase eritrocitov (0,1 ml). Zmes inkubirajte pri 37 °C 40 minut. Zmes rdečih krvnih celic in seruma je bila obravnavana kot pozitivna kontrola, mešanica fiziološke raztopine in rdečih krvnih celic pa kot negativna kontrola. Hemaglutinacijo smo določili po Stajitzkyjevi lestvici. Predlagane lestvice so naslednje: + + + + gosti granularni agregati; + + + gladke spodnje blazinice z ukrivljenimi robovi; + + gladke spodnje blazinice z raztrganimi robovi; + ozki rdeči obroči okoli robov gladkih blazinic; – (negativno) diskreten rdeč gumb 12 v središču spodnje vdolbinice.
Hemokompatibilnost NFRCS je bila proučevana po metodi Mednarodne organizacije za standardizacijo (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Gravimetrična metoda, ki so jo opisali Singh in sod., je bila manjše spremembe izvedene za oceno nastanka trombov v prisotnosti ali na površini NFRCS. 500 mg Cs, Ch in Cp NFRCS je bilo 24 ur inkubiranih v fosfatno pufrirani fiziološki raztopini (PBS) pri 37 °C. Po 24 urah je bil PBS odstranjen in NFRCS je bil obdelan z 2 ml krvi, ki je vsebovala 3,8 % natrijevega citrata. Na površino NFRCS je bilo inkubiranim vzorcem dodanih 0,04 ml 0,1 M CaCl2. Po 45 minutah je bilo dodanih 5 ml destilirane vode, da se ustavi koagulacija. Koagulirana kri na površini NFRK je bila obdelana s 36–38 % raztopino formaldehida. Strdki, fiksirani s formaldehidom, so bili posušeni in stehtani. Odstotek tromboze smo ocenili z izračunom teže kozarca brez krvi in ​​vzorca (negativna kontrola) ter kozarca s krvjo (pozitivna kontrola).
Za začetno potrditev so bili vzorci vizualizirani pod optičnim mikroskopom, da bi razumeli sposobnost površinske prevleke HFFC, medsebojno povezanega Ct in mreže Ct za tvorbo por. Tanki rezi Ch in Cp iz NFRCS so bili obrezani s skalpelom. Nastali rez je bil postavljen na stekleno stekelce, prekrit s krovnim stekelcem, robovi pa so bili pritrjeni z lepilom. Pripravljena stekelca so bila pregledana pod optičnim mikroskopom in fotografirana pri različnih povečavah.
Odlaganje polimerov v Ct omrežjih je bilo vizualizirano s fluorescenčno mikroskopijo na podlagi metode, ki so jo opisali Rice in sod.29. Sestava HFFC, uporabljena za formulacijo, je bila zmešana s fluorescentnim barvilom (amarant) in NFRCS (Ch in Cp) so bili pripravljeni po prej omenjeni metodi. Sestava HFFC, uporabljena za formulacijo, je bila zmešana s fluorescentnim barvilom (amarant) in NFRCS (Ch in Cp) so bili pripravljeni po prej omenjeni metodi.Sestava HFFC, uporabljena za formulacijo, je bila zmešana s fluorescentnim barvilom (amarant) in NFRCS (Ch in Cp) je bil pridobljen po prej omenjeni metodi.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Sestava HFFC, uporabljena v formulaciji, je bila zmešana s fluorescentnim barvilom (Amaranth) in prejela NFRCS (Ch in Cp), kot je bilo že omenjeno.Iz pridobljenih vzorcev so bili izrezani tanki rezini NFRK, nameščeni na steklena stekelca in prekriti s krovnimi stekelci. Pripravljena stekelca opazujte pod fluorescentnim mikroskopom z zelenim filtrom (310–380 nm). Slike so bile posnete pri 4-kratni povečavi, da bi razumeli odnose Ct in prekomerno odlaganje polimerov v mreži Ct.
Površinska topografija NFRCS Ch in Cp je bila določena z uporabo atomskega silovnega mikroskopa (AFM) z ultra ostro konzolo TESP v načinu tapkanja: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan. Hrapavost površine je bila določena z efektivno vrednostjo korena kvadrata (RMS) z uporabo programske opreme (Scanning Probe Image Processor). Različne lokacije NFRCS so bile upodobljene na 3D-slikah, da se preveri enakomernost površine. Standardni odklon rezultata za dano območje je opredeljen kot hrapavost površine. Za kvantifikacijo hrapavosti površine NFRCS31 je bila uporabljena enačba RMS.
Študije na osnovi FESEM so bile izvedene z uporabo FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, da bi razumeli površinsko morfologijo Ch NFRCS in Cp NFRCS, ki sta pokazala boljši BCT kot Cm NFRCS. Študija FESEM je bila izvedena po metodi, ki so jo opisali Zhao et al.32, z manjšimi spremembami. NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS in Cp NFRCS je bilo predhodno zmešanih z 20 µl 3,8 % natrijevega citrata, predhodno zmešanega s krvjo podgan. V vzorce, obdelane s krvjo, je bilo dodanih 20 μl 0,2 M CaCl2, da se sproži koagulacija, vzorci pa so bili 10 minut inkubirani pri sobni temperaturi. Poleg tega so bili odvečni eritrociti odstranjeni s površine NFRCS z izpiranjem s fiziološko raztopino.
Nadaljnji vzorci so bili obdelani z 0,1 % glutaraldehida in nato posušeni v pečici na vroč zrak pri 37 °C, da so odstranili vlago. Posušeni vzorci so bili prevlečeni in analizirani 32. Druge slike, pridobljene med analizo, so bile nastanek strdka na površini posameznih bombažnih vlaken, odlaganje polimera med Ct, morfologija (oblika) eritrocitov, celovitost strdka in morfologija eritrocitov v prisotnosti NFRCS. Neobdelana območja NFRCS in območja NFRCS, obdelana s Ch in Cp, inkubirana s krvjo, so bila skenirana za elementarne ione (natrij, kalij, dušik, kalcij, magnezij, cink, baker in selen) 33. Primerjajte odstotke elementarnih ionov med obdelanimi in neobdelanimi vzorci, da bi razumeli kopičenje elementarnih ionov med nastajanjem strdka in homogenost strdka.
Debelina površinske prevleke Cp HFFC na površini Ct je bila določena z uporabo FESEM. Prečni prerezi Cp NFRCS so bili izrezani iz ogrodja in naneseni z naprševanjem. Nastali vzorci nanesenega naprševanja so bili opazovani s FESEM in izmerjena je bila debelina površinske prevleke 34, 35, 36.
Rentgenski mikro-CT omogoča visokoločljivostno 3D-slikanje brez destruktivnega delovanja in omogoča preučevanje notranje strukturne ureditve NFRK. Mikro-CT uporablja rentgenski žarek, ki prehaja skozi vzorec, za beleženje lokalnega linearnega koeficienta slabljenja rentgenskih žarkov v vzorcu, kar pomaga pridobiti morfološke informacije. Notranja lokacija Ct v Cp NFRCS in s krvjo obdelanih Cp NFRCS je bila pregledana z mikro-CT, da bi razumeli učinkovitost absorpcije in strjevanje krvi v prisotnosti NFRCS37,38,39. 3D-strukture s krvjo obdelanih in neobdelanih vzorcev Cp NFRCS so bile rekonstruirane z uporabo mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Nemčija). Z uporabo programske opreme VG STUDIO-MAX različice 2.2 je bilo posnetih več rentgenskih slik iz različnih kotov (idealno s 360° pokritostjo) za razvoj 3D-slik za NFRCS. Zbrani projekcijski podatki so bili rekonstruirani v 3D-volumetrične slike z uporabo ustrezne preproste programske opreme 3D ScanIP Academic.
Poleg tega smo za razumevanje porazdelitve strdka v NFRCS dodali 20 µl predhodno zmešane citratne krvi in ​​20 µl 0,2 M CaCl2, da bi sprožili strjevanje krvi. Pripravljene vzorce smo pustili, da se strdijo. Površina NFRK je bila obdelana z 0,5 % glutaraldehidom in sušena v pečici na vroč zrak pri 30–40 °C 30 minut. Krvni strdek, ki je nastal na NFRCS, smo skenirali, rekonstruirali in vizualizirali njegovo 3D-slika.
Antibakterijski testi so bili izvedeni na Cp NFRCS (najbolje v primerjavi s Ch NFRCS) z uporabo prej opisane metode z manjšimi spremembami. Antibakterijsko aktivnost Cp NFRCS in Cp HFFC so določili z uporabo treh različnih testnih mikroorganizmov [S. aureus (grampozitivne bakterije), E. coli (gramnegativne bakterije) in bela Candida (C. albicans)], ki rastejo na agarju v petrijevkah v inkubatorju. Na agar gojišče enakomerno inokulirajte 50 ml razredčene suspenzije bakterijske kulture s koncentracijo 105-106 CFU ml-1. Gojišče vlijte v petrijevko in pustite, da se strdi. Na površini agar plošče so bile narejene vdolbinice za napolnitev s HFFC (3 vdolbinice za HFFC in 1 za negativno kontrolo). V 3 vdolbinice dodajte 200 µl HFFC in v 4. vdolbinico 200 µl PBS s pH 7,4. Na drugi strani petrijevke postavite 12 mm Cp NFRCS disk na strjeni agar in ga navlažite s PBS (pH 7,4). Tablete ciprofloksacina, ampicilina in flukonazola veljajo za referenčne standarde za Staphylococcus aureus, Escherichia coli in Candida albicans. Ročno izmerite območje inhibicije in naredite digitalno sliko območja inhibicije.
Po institucionalni etični odobritvi je bila študija izvedena na Medicinski fakulteti za izobraževanje in raziskave Kasturba v Manipalu v Karnataki v južni Indiji. Protokol eksperimenta in vitro TEG je pregledal in odobril Institucionalni etični odbor Medicinske fakultete Kasturba v Manipalu v Karnataki (IEC: 674/2020). Preiskovanci so bili rekrutirani med prostovoljnimi darovalci krvi (starimi od 18 do 55 let) iz bolnišnične krvne banke. Poleg tega je bil od prostovoljcev pridobljen obrazec za informirano soglasje za odvzem vzorcev krvi. Za preučevanje učinka formulacije Cp HFFC na polno kri, predhodno zmešano z natrijevim citratom, je bil uporabljen nativni TEG (N-TEG). N-TEG je splošno priznan po svoji vlogi pri oživljanju na mestu oskrbe, kar povzroča težave zdravnikom zaradi možnosti klinično pomembne zamude pri rezultatih (rutinski koagulacijski testi). Analiza N-TEG je bila izvedena s polno kri. Od vseh udeležencev sta bila pridobljena informirana privolitev in podrobna zdravstvena anamneza. V študijo niso bili vključeni udeleženci s hemostatskimi ali trombotičnimi zapleti, kot so nosečnost/poporodni čas ali bolezen jeter. Iz študije so bili izključeni tudi preiskovanci, ki so jemali zdravila, ki vplivajo na koagulacijsko kaskado. Pri vseh udeležencih so bili opravljeni osnovni laboratorijski testi (hemoglobin, protrombinski čas, aktivirani tromboplastin in število trombocitov) po standardnih postopkih. N-TEG določa viskoelastičnost krvnega strdka, začetno strukturo strdka, interakcijo delcev, krepitev strdka in lizo strdka. Analiza N-TEG zagotavlja grafične in numerične podatke o skupnih učinkih več celičnih elementov in plazme. Analiza N-TEG je bila izvedena na dveh različnih volumnih Cp HFFC (10 µl in 50 µl). Posledično je bil 1 ml polne krvi s citronsko kislino dodan 10 μl Cp HFFC. V 20 µl posode s TEG, ki vsebuje 0,2 M CaCl2, dodajte 1 ml (Cp HFFC + citratna kri) in 340 µl mešane krvi. Nato so bile TEG plošče naložene v TEG® 5000, US za merjenje R, K, kota alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % vzorcev krvi v prisotnosti Cp HFFC41.
Protokol študije in vivo je pregledal in odobril Institucionalni odbor za etiko živali (IAEC), Medicinske fakultete Kasturba, Visokošolskega inštituta Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s priporočili Odbora za nadzor in nadzor poskusov na živalih (CPCSEA). Vse študije NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) so bile izvedene na samicah podgan Wistar (s telesno težo od 200 do 250 g). Vse živali so bile aklimatizirane na temperaturo 24–26 °C, živali so imele prost dostop do standardne hrane in vode ad libitum. Vse živali so bile naključno razdeljene v različne skupine, vsako skupino so sestavljale tri živali. Vse študije so bile izvedene v skladu z dokumentom Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Pred študijo so bile živali anestezirane z intraperitonealno (ip) aplikacijo mešanice 20–50 mg ketamina (na 1 kg telesne teže) in 2–10 mg ksilazina (na 1 kg telesne teže). Po študiji je bil volumen krvavitve izračunan z oceno razlike med začetno in končno težo vzorcev, povprečna vrednost, dobljena iz treh testov, pa je bila uporabljena kot volumen krvavitve vzorca.
Za razumevanje potenciala NFRCS za modulacijo krvavitve pri travmi, boju ali prometni nesreči (model poškodbe) je bil uporabljen model amputacije repa podgane. Z rezilom skalpela odrežite 50 % repa in ga za 15 sekund postavite na zrak, da zagotovite normalno krvavitev. Poleg tega so bili testni vzorci s pritiskom nameščeni na rep podgane (Ct, Cs, Ch NFRCS in Cp NFRCS). Pri testnih vzorcih so poročali o krvavitvah in PCT (n = 3)17,45.
Učinkovitost nadzora tlaka z NFRCS v boju je bila raziskana na modelu površinske femoralne arterije. Femoralna arterija je bila izpostavljena, prebodena s trokarjem 24G in izkrvavljena v 15 sekundah. Ko je bila opažena nenadzorovana krvavitev, je bil testni vzorec nameščen na mesto vboda in pritisnjen. Takoj po nanosu testnega vzorca je bil zabeležen čas strjevanja krvi in ​​​​hemostatska učinkovitost je bila opazovana naslednjih 5 minut. Enak postopek je bil ponovljen s Cs in Ct46.
Dowling in sod.47 so predlagali model poškodbe jeter za oceno hemostatičnega potenciala hemostatskih materialov v kontekstu intraoperativne krvavitve. BCT so zabeležili za vzorce Ct (negativna kontrola), Cs ogrodje (pozitivna kontrola), vzorce Ch NFRCS in Cp NFRCS. Suprahepatična vena cava podgane je bila izpostavljena z izvedbo medialne laparotomije. Nato je bil distalni del levega režnja izrezan s škarjami. Z rezilom skalpela je bil narejen rez v jetrih in puščen nekaj sekund krvaveti. Natančno stehtani testni vzorci Ch NFRCS in Cp NFRCS so bili nameščeni na poškodovano površino brez pozitivnega tlaka in zabeležen je bil BCT. Kontrolna skupina (Ct) je nato uporabila pritisk, ki mu je sledil Cs 30 s47, ne da bi pri tem pretrgala poškodbo.
In vivo testi celjenja ran so bili izvedeni z uporabo modela ekscizijske rane za oceno lastnosti celjenja ran razvitih NFRCS na osnovi polimerov. Modeli ekscizijskih ran so bili izbrani in izvedeni v skladu s predhodno objavljenimi metodami z manjšimi spremembami19,32,48. Vse živali so bile anestezirane, kot je bilo opisano prej. Z biopsijskim luknjačem (12 mm) so naredili krožni globok rez v koži hrbta. Pripravljena mesta ran so bila obvezovana s Cs (pozitivna kontrola), Ct (ob upoštevanju, da bombažne blazinice motijo ​​celjenje), Ch NFRCS in Cp NFRCS (poskusna skupina) ter negativno kontrolo brez kakršnega koli zdravljenja. Vsak dan študije je bila pri vseh podganah izmerjena površina rane. Z digitalnim fotoaparatom so fotografirali območje rane in namestili nov povoj. Odstotek zaprtja rane je bil izmerjen po naslednji formuli:
Na podlagi odstotka zaprtja rane 12. dan študije je bila podganam najboljše skupine ((Cp NFRCS) in kontrolna skupina) odstranjena koža in preučena z barvanjem s H&E ter Massonovim trikromnim barvanjem. Na podlagi odstotka zaprtja rane 12. dan študije je bila podganam najboljše skupine ((Cp NFRCS) in kontrolna skupina) odstranjena koža in preučena z barvanjem s H&E ter Massonovim trikromnim barvanjem.Na podlagi odstotka zaprtja rane 12. dan študije je bila koža podgan najboljše skupine ((Cp NFRCS) in kontrolne skupine) izrezana in pregledana z barvanjem s hematoksilin-eozinom in Massonovim trikromom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组＄)Podgane v najboljši skupini ((Cp NFRCS) in kontrolni skupini) so bile 12. dan študije izrezane za barvanje s hematoksilin-eozinom in Massonovo trikromsko barvanje na podlagi odstotka zaprtja rane.Postopek barvanja je bil izveden po predhodno opisanih metodah49,50. Na kratko, po fiksaciji v 10 % formalinu so bili vzorci dehidrirani z uporabo vrste stopenjskih alkoholov. Za pridobitev tankih rezin (debeline 5 µm) izrezanega tkiva smo uporabili mikrotom. Tanke serijske rezine kontrolnih vzorcev in Cp NFRCS smo obdelali s hematoksilinom in eozinom za preučevanje histopatoloških sprememb. Za odkrivanje nastanka kolagenskih fibril smo uporabili Massonovo trikromsko barvanje. Pridobljene rezultate so patologi slepo preučevali.
Stabilnost vzorcev Cp NFRCS je bila preučevana pri sobni temperaturi (25 °C ± 2 °C/60 % relativne vlažnosti ± 5 %) 12 mesecev51. Cp NFRCS (površinska razbarvanje in rast mikrobov) je bil vizualno pregledan in preizkušen glede odpornosti proti obrabi v pregibih in BCT v skladu z zgoraj navedenimi metodami, opisanimi v poglavju Materiali in metode.
Prilagodljivost in ponovljivost Cp NFRCS sta bili preučeni s pripravo Cp NFRCS velikosti 15 × 15 cm2. Poleg tega so bili iz različnih frakcij Cp NFRCS izrezani 30 mg vzorci (n = 5), BCT preučevanih vzorcev pa je bil ocenjen, kot je opisano prej v poglavju Metode.
Poskušali smo razviti različne oblike in strukture z uporabo sestavkov Cp NFRCS za različne biomedicinske aplikacije. Takšne oblike ali konfiguracije vključujejo stožčaste brise za krvavitve iz nosu, zobozdravstvene posege in valjaste brise za vaginalne krvavitve.
Vsi nabori podatkov so izraženi kot povprečje ± standardni odklon in so bili analizirani z ANOVA z uporabo programa Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, Kalifornija, ZDA), ki mu je sledil Bonferronijev test večkratnih primerjav (*p<0,05).
Vsi postopki, izvedeni v študijah na ljudeh, so bili v skladu s standardi inštituta in Nacionalnega raziskovalnega sveta, pa tudi z Helsinško deklaracijo iz leta 1964 in njenimi poznejšimi spremembami ali podobnimi etičnimi standardi. Vsi udeleženci so bili seznanjeni z značilnostmi študije in njeno prostovoljno naravo. Podatki o udeležencih ostanejo zaupni po zbiranju. Protokol eksperimenta in vitro TEG je pregledal in odobril Institucionalni etični odbor Medicinske fakultete Kasturba v Manipalu v Karnataki (IEC: 674/2020). Prostovoljci so podpisali informirano soglasje za odvzem vzorcev krvi.
Vsi postopki, izvedeni v študijah na živalih, so bili izvedeni v skladu s smernicami Medicinske fakultete Kastuba, Visokošolskega inštituta Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Vsi načrtovani poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami Odbora za nadzor in nadzor poskusov na živalih (CPCSEA). Vsi avtorji upoštevajo smernice ARRIVE.
FTIR spektri vseh NFRCS so bili analizirani in primerjani s spektrom hitosana, prikazanim na sliki 2A. Karakteristični spektralni vrhovi hitosana (posneti) pri 3437 cm-1 (raztezanje OH in NH, prekrivanje), 2945 in 2897 cm-1 (raztezanje CH), 1660 cm-1 (deformacija NH2), 1589 cm-1 (upogibanje N–H), 1157 cm-1 (raztezanje mostu O-), 1067 cm-1 (raztezanje C–O, sekundarni hidroksil), 993 cm-1 (raztezanje CO, Bo-OH) 52,53,54. Dodatna tabela S1 prikazuje vrednosti absorpcijskega spektra FTIR NFRCS za hitosan (reporterski), čisti hitosan, Cm, Ch in Cp. FTIR spektri vseh NFRCS (Cm, Ch in Cp) so pokazali enake karakteristične absorpcijske pasove kot čisti hitosan brez bistvenih sprememb (slika 2A). Rezultati FTIR so potrdili odsotnost kemičnih ali fizikalnih interakcij med polimeri, uporabljenimi za razvoj NFRCS, kar kaže na inertnost uporabljenih polimerov.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS in Cs. (A) predstavlja kombinirane FTIR spektre sestave hitosana in Cm NFRCS, Ch NFRCS in Cp NFRCS pod stiskanjem. (B) a) Hitrost absorpcije Cm, Ch, Cp in Cg v NFRCS v polni krvi (n = 3); Ct vzorci so pokazali višji BAR, ker ima vatirana palčka večjo absorpcijsko učinkovitost; b) Kri po absorpciji krvi. Ilustracija absorbiranega vzorca. Grafični prikaz BCT testnega vzorca C (Cp NFRCS je imel najboljši BCT (15 s, n = 3)). Podatki v C, D, E in G so prikazani kot povprečje ± SD, stolpci napak pa predstavljajo SD, ***p < 0,0001. Podatki v C, D, E in G so prikazani kot povprečje ± SD, stolpci napak pa predstavljajo SD, ***p < 0,0001. Podatki v C, D, E in G so predstavljeni kot srednje ± standardno odstopanje, pogrešne plošče pa predstavljajo standardno odstopanje, ***p <0,0001. Podatki v C, D, E in G so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon, stolpci napak pa predstavljajo standardni odklon, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Podatki v C, D, E in G so prikazani kot srednja vrednost ± standardno odstopanje, plošče pogreškov predstavljajo standardno odstopanje, ***p <0,0001. Podatki v C, D, E in G so prikazani kot povprečje ± standardni odklon, stolpci napak predstavljajo standardni odklon, ***p<0,0001.