Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Plodnost ptic je odvisna od njihove zmožnosti, da v tubulih za shranjevanje semenčic (SST) dlje časa shranijo dovolj sposobne sperme.Natančen mehanizem, s katerim spermatozoidi vstopijo, bivajo v SST in zapustijo SST, ostaja sporen.Sperma kokoši šarkasi je pokazala visoko nagnjenost k aglutinaciji, ki tvori mobilne nitaste snope, ki vsebujejo veliko celic.Zaradi težav pri opazovanju gibljivosti in obnašanja semenčic v neprozornem jajcevodu smo za preučevanje aglutinacije in gibljivosti semenčic uporabili mikrofluidno napravo s prerezom mikrokanalov, podobnim prerezu semenčic.Ta študija razpravlja o tem, kako nastanejo snopi semenčic, kako se premikajo in njihovi možni vlogi pri podaljšanju bivanja semenčic v SST.Raziskali smo hitrost semenčic in reološko obnašanje, ko je bil pretok tekočine ustvarjen znotraj mikrofluidnega kanala s hidrostatskim tlakom (hitrost pretoka = 33 µm/s).Spermatozoidi ponavadi plavajo proti toku (pozitivna reologija) in hitrost snopa semenčic je znatno zmanjšana v primerjavi z enojno semenčico.Opazili so, da se snopi semenčic premikajo spiralno in se povečujejo v dolžino in debelino, ko se pridobi več posameznih semenčic. Opažali so snope semenčic, ki so se približevali stranskim stenam mikrofluidnih kanalov in se jih držali, da bi se izognili pretoku tekočine s hitrostjo > 33 µm/s. Opažali so snope semenčic, ki so se približevali stranskim stenam mikrofluidnih kanalov in se jih držali, da bi se izognili pretoku tekočine s hitrostjo > 33 µm/s. Zabeleženo je, da se spermatozoidi približajo in prilijejo k bočnim stenkam mikrofluidnih kanalov, da bi preprečili smetenje s hitrostjo pretoka tekočine> 33 mkm / s. Opazili so, da se snopki semenčic približajo stranskim stenam mikrofluidnih kanalov in se jih oprimejo, da bi se izognili odnašanju pri pretoku tekočine >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Zabeleženo je, da se spermatozoidi približajo in prilepijo k bočnim stenkam mikrožidkostnega kanala, da bi se izognili odmetavanju toka tekočine s hitrostjo > 33 mkm/s. Opazili so, da se snopi semenčic približajo stranskim stenam mikrofluidnega kanala in se jih oprimejo, da jih ne bi odnesel pretok tekočine pri >33 µm/s.Skenirna in transmisijska elektronska mikroskopija sta razkrila, da so snopi semenčic podprti z obilico gostega materiala.Pridobljeni podatki dokazujejo edinstveno mobilnost semenčic piščancev Sharkazi, kot tudi sposobnost semenčic za aglutinacijo in tvorbo mobilnih snopov, kar prispeva k boljšemu razumevanju dolgotrajnega shranjevanja semenčic pri SMT.
Da pride do oploditve pri ljudeh in večini živali, morajo semenčice in jajčeca prispeti na mesto oploditve ob pravem času.Zato se mora parjenje zgoditi pred ali v času ovulacije.Po drugi strani pa nekateri sesalci, kot so psi, pa tudi vrste, ki niso sesalci, kot so žuželke, ribe, plazilci in ptice, dlje časa hranijo semenčice v svojih reproduktivnih organih, dokler niso njihova jajčeca pripravljena za oploditev (asinhrona oploditev 1 ).Ptice lahko ohranijo sposobnost preživetja semenčic, ki so sposobne oploditve jajčec 2-10 tednov2.
To je edinstvena lastnost, ki razlikuje ptice od drugih živali, saj zagotavlja visoko verjetnost oploditve po enkratnem osemenitvi več tednov brez hkratnega parjenja in ovulacije.Glavni organ za shranjevanje sperme, imenovan tubul za shranjevanje sperme (SST), se nahaja v notranjih gubah sluznice na uterovaginalnem stičišču.Do danes mehanizmi, s katerimi sperma vstopi, se zadržuje in izstopi iz banke semenčic, še niso povsem razumljeni.Na podlagi prejšnjih študij je bilo postavljenih veliko hipotez, vendar nobena ni bila potrjena.
Forman4 je domneval, da spermatozoidi ohranjajo svoje prebivališče v votlini SST z neprekinjenim nihanjem v nasprotni smeri toka tekočine skozi proteinske kanale, ki se nahajajo na epitelijskih celicah SST (reologija).ATP se izčrpa zaradi nenehne flagelarne aktivnosti, ki je potrebna za ohranjanje sperme v lumnu SST, in gibljivost sčasoma upade, dokler se sperme ne odnesejo iz banke semenčic s pretokom tekočine in začnejo novo potovanje po naraščajočem jajcevodu, da oplodijo spermo.Jajce (Forman4).Ta model shranjevanja sperme je podprt z odkrivanjem akvaporinov 2, 3 in 9 z imunocitokemijo, ki so prisotni v epitelnih celicah SST.Do danes manjkajo študije o reologiji piščančjega semena in njegovi vlogi pri shranjevanju SST, izbiri vaginalne sperme in tekmovanju sperme.Pri piščancih sperma vstopi v nožnico po naravnem parjenju, vendar se več kot 80 % semenčic izvrže iz nožnice kmalu po parjenju.To nakazuje, da je vagina primarno mesto za izbor sperme pri pticah.Poleg tega so poročali, da manj kot 1 % semenčic, oplojenih v nožnici, konča v SST2.Pri umetni osemenitvi piščancev v nožnici se število semenčic, ki dosežejo SST, poveča 24 ur po osemenitvi.Zaenkrat mehanizem izbire semenčic med tem procesom ni jasen, gibljivost semenčic pa lahko igra pomembno vlogo pri prevzemu semenčic SST.Zaradi debelih in neprozornih sten jajcevodov je težko neposredno spremljati gibljivost semenčic v jajcevodih ptic.Zato nimamo osnovnega znanja o tem, kako spermatozoidi po oploditvi prehajajo v SST.
Reologija je bila pred kratkim priznana kot pomemben dejavnik za nadzor transporta sperme v genitalijah sesalcev.Na podlagi sposobnosti gibljivih semenčic, da migrirajo proti toku, so Zaferani et al8 uporabili mikrofluidni sistem corra za pasivno izolacijo gibljivih semenčic iz vzorcev semenske tekočine.Ta vrsta razvrščanja semena je bistvena za medicinsko zdravljenje neplodnosti in klinične raziskave ter ima prednost pred tradicionalnimi metodami, ki so časovno in delovno intenzivne ter lahko ogrozijo morfologijo in strukturno celovitost semenčic.Vendar do danes še niso bile izvedene študije o vplivu izločkov iz spolnih organov piščancev na gibljivost semenčic.
Ne glede na mehanizem, ki ohranja spermo shranjeno v SST, so številni raziskovalci opazili, da rezidenčni semenčici aglutinirajo glavo proti glavi v SST piščancev 9, 10, prepelic 2 in puranov 11, da tvorijo aglutinirane snope sperme.Avtorji domnevajo, da obstaja povezava med to aglutinacijo in dolgotrajnim shranjevanjem semenčic v SST.
Tingari in Lake12 sta poročala o močni povezavi med spermatozoidi v žlezi piščanca, ki sprejema spermo, in se spraševala, ali ptičja sperma aglutinira na enak način kot semenčica sesalcev.Menijo, da so globoke povezave med semenčicami v semenovodu morda posledica stresa, ki ga povzroča prisotnost velikega števila semenčic v majhnem prostoru.
Pri ocenjevanju obnašanja semenčic na svežih visečih stekelcih so vidni prehodni znaki aglutinacije, predvsem na robovih semenskih kapljic.Vendar pa je aglutinacijo pogosto motilo rotacijsko delovanje, povezano z neprekinjenim gibanjem, kar pojasnjuje prehodno naravo tega pojava.Raziskovalci so tudi opazili, da so se, ko je bilo razredčilo dodano semenu, pojavili podolgovati "nitasti" celični agregati.
Zgodnji poskusi posnemanja sperme so bili narejeni z odstranitvijo tanke žice iz viseče kapljice, kar je povzročilo podolgovat semenčici podoben vezikel, ki štrli iz kapljice semena.Spermatozoidi so se takoj poravnali vzporedno znotraj vezikla, vendar je celotna enota hitro izginila zaradi 3D omejitve.Zato je za preučevanje aglutinacije semenčic potrebno opazovati gibljivost in obnašanje semenčic neposredno v izoliranih tubulih za shranjevanje semenčic, kar je težko doseči.Zato je treba razviti instrument, ki posnema semenčice, da bi podprl študije gibljivosti semenčic in aglutinacijskega vedenja.Brillard et al13 so poročali, da je povprečna dolžina tubulov za shranjevanje sperme pri odraslih piščancih 400–600 µm, nekateri SST pa so lahko dolgi celo 2000 µm.Mero in Ogasawara14 sta semenske žleze razdelila na povečane in nepovečane tubule za shranjevanje sperme, ki sta bila enaka po dolžini (~500 µm) in širini vratu (~38 µm), vendar je bil srednji premer lumna tubulov 56,6 in 56,6 µm..11,2 μm oz.V trenutni študiji smo uporabili mikrofluidno napravo z velikostjo kanala 200 µm × 20 µm (Š × V), katere presek je nekoliko podoben prerezu ojačanega SST.Poleg tega smo pregledali gibljivost semenčic in aglutinacijsko obnašanje v tekoči tekočini, kar je skladno s Foremanovo hipotezo, da tekočina, ki jo proizvajajo epitelijske celice SST, ohranja semenčice v lumnu v protitočni (reološki) smeri.
Namen te študije je bil premagati težave pri opazovanju gibljivosti semenčic v jajcevodu in se izogniti težavam pri proučevanju reologije in obnašanja semenčic v dinamičnem okolju.Uporabljena je bila mikrofluidna naprava, ki ustvarja hidrostatični tlak za simulacijo gibljivosti semenčic v genitalijah piščanca.
Ko je bila kapljica razredčenega vzorca sperme (1:40) naložena v mikrokanalno napravo, je bilo mogoče prepoznati dve vrsti gibljivosti sperme (izolirana sperma in vezana sperma).Poleg tega so spermatozoidi plavali proti toku (pozitivna reologija; video 1, 2). Čeprav so imeli snopi semenčic nižjo hitrost kot hitrost osamljenih semenčic (p <0,001), so povečali odstotek semenčic s pozitivno reotakso (p <0,001; tabela 2). Čeprav so imeli snopi semenčic nižjo hitrost kot hitrost osamljenih semenčic (p <0,001), so povečali odstotek semenčic s pozitivno reotakso (p <0,001; tabela 2). Čeprav so bile količine spermatozoidov bolj nizke, kot pri enih spermatozoidih (p < 0,001), so povečale odstotek spermatozoidov, ki kažejo pozitiven reotaksis (p < 0,001; tabela 2). Čeprav so imeli snopi semenčic nižjo hitrost kot hitrost posameznih semenčic (p <0,001), so povečali odstotek semenčic s pozitivno reotakso (p <0,001; tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））)）) Čeprav je bila hitrost spermatozoidov nižja kot pri posameznih spermatozoidih (p < 0,001), so povečali odstotek spermatozoidov s pozitivno reologijo (p < 0,001; tabela 2). Čeprav je bila hitrost snopov semenčic nižja od hitrosti posameznih semenčic (p <0,001), so povečali odstotek semenčic s pozitivno reologijo (p <0,001; tabela 2).Pozitivna reologija za posamezne semenčice in šope je ocenjena na približno 53 % oziroma 85 %.
Ugotovljeno je bilo, da spermatozoidi piščancev sharkasi takoj po ejakulaciji tvorijo linearne snope, sestavljene iz več deset posameznikov.Ti šopi se sčasoma povečajo v dolžino in debelino in lahko ostanejo in vitro več ur, preden se razpršijo (video 3).Ti nitasti snopi so oblikovani kot semenčice ehidne, ki nastanejo na koncu epididimisa.Ugotovljeno je bilo, da ima seme kokoši šarkaši veliko nagnjenost k aglutinaciji in oblikovanju mrežastega snopa v manj kot eni minuti po zbiranju.Ti žarki so dinamični in se lahko držijo vseh bližnjih sten ali statičnih predmetov.Čeprav snopi semenčic zmanjšajo hitrost semenčic, je jasno, da makroskopsko povečajo njihovo linearnost.Dolžina snopov se spreminja glede na število zbranih semenčic v snopih.Izolirali smo dva dela snopa: začetni del, vključno s prosto glavo aglutinirane sperme, in terminalni del, vključno z repom in celotnim distalnim koncem sperme.Z visokohitrostno kamero (950 fps) smo v začetnem delu snopa opazovali proste glavice aglutiniranih semenčic, ki so zaradi svojega nihajnega gibanja odgovorne za gibanje snopa, preostale pa vlečejo v snop s spiralnim gibanjem (video 4).Vendar pa je bilo pri dolgih šopah opaženo, da je nekaj prostih glavic semenčic pritrjenih na telo, končni del šopa pa deluje kot lopatica, ki pomaga pri poganjanju šopa.
Medtem ko se v počasnem toku tekočine snopi semenčic gibljejo vzporedno drug z drugim, pa se začnejo prekrivati ​​in lepiti na vse, kar miruje, da jih tok ne odplavi, ko se hitrost toka povečuje.Snopi nastanejo, ko se peščica semenčic približa ena drugi, se začnejo sinhrono premikati in ovijati druga okoli druge ter se nato prilepijo na lepljivo snov.Sliki 1 in 2 prikazujeta, kako se semenčice približujejo druga drugi in tvorijo spoj, ko se repki ovijajo drug okoli drugega.
Raziskovalci so uporabili hidrostatični tlak, da so ustvarili pretok tekočine v mikrokanalu za preučevanje reologije sperme.Uporabljen je bil mikrokanal velikosti 200 µm × 20 µm (Š × V) in dolžine 3,6 µm.Uporabite mikrokanale med vsebniki z brizgami, nameščenimi na koncih.Za boljšo vidnost kanalov so bile uporabljene jedilne barve.
Privežite povezovalne kable in dodatke na steno.Video posnetek je bil posnet s fazno kontrastnim mikroskopom.Z vsako sliko so predstavljene slike fazno kontrastne mikroskopije in kartiranja.(A) Povezava med dvema tokovoma se upira toku zaradi spiralnega gibanja (rdeča puščica).(B) Povezava med cevnim snopom in steno kanala (rdeče puščice), hkrati pa sta povezana z dvema drugima snopoma (rumene puščice).(C) Snopi semenčic v mikrofluidnem kanalu se začnejo povezovati med seboj (rdeče puščice) in tvorijo mrežo snopov semenčic.(D) Tvorba mreže snopov semenčic.
Ko je bila kapljica razredčene sperme naložena v mikrofluidno napravo in je bil ustvarjen tok, so opazili, da se žarek sperme premika v nasprotni smeri toka.Snopi se tesno prilegajo stenam mikrokanalčkov, proste glave v začetnem delu snopov pa se tesno prilegajo njim (video 5).Prav tako se držijo kakršnih koli mirujočih delcev na svoji poti, kot so naplavine, da se uprejo toku, da jih odnese.Sčasoma se ti šopi spremenijo v dolge filamente, ki ujamejo druge posamezne semenčice in krajše šope (video 6).Ko se pretok začne upočasnjevati, začnejo dolge linije sperme tvoriti mrežo linij sperme (video 7; slika 2).
Pri visoki hitrosti pretoka (V > 33 µm/s) se spiralna gibanja niti povečajo, saj poskušajo ujeti številne posamezne snope, ki tvorijo spermo, ki se bolje upirajo odnašajoči sili toka. Pri visoki hitrosti pretoka (V > 33 µm/s) se spiralna gibanja niti povečajo, saj poskušajo ujeti številne posamezne snope, ki tvorijo spermo, ki se bolje upirajo odnašajoči sili toka. Pri visoki hitrosti toka (V > 33 mkm/s) se spiralevidna gibanja nitej usilivajo, ker poskušajo zajeti več posameznih spermatozoidov, ki tvorijo lupine, ki se bolje upirajo drejfujočemu silnemu toku. Pri visokih hitrostih pretoka (V > 33 µm/s) se vijačna gibanja pramenov povečajo, ko poskušajo ujeti veliko posameznih semenčic, ki tvorijo snope, ki se lahko bolje uprejo odnašajoči sili toka.在高流速 (V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri visokih hitrostih toka (V > 33 mkm/s) se spiralno gibanje nitej poveča v poskusu zajetja množice posameznih spermatozoidov, ki tvorijo jajca, da se bolje soprotstavijo sili drejfa toka. Pri visokih hitrostih pretoka (V > 33 µm/s) se spiralno gibanje filamentov poveča, da bi zajeli veliko posameznih semenčic, ki tvorijo snope, da bi se bolje uprli silam odnašanja toka.Poskušali so tudi pritrditi mikrokanale na stranske stene.
Snopi semenčic so bili identificirani kot grozdi glav semenčic in zavihanih repov s svetlobno mikroskopijo (LM).Snopi semenčic z različnimi agregati so bili identificirani tudi kot zvite glave in bičkovi agregati, več zlitih repkov semenčic, glave semenčic, pritrjene na rep, in glave semenčic z upognjenimi jedri kot več zlitih jeder.transmisijska elektronska mikroskopija (TEM).Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) je pokazala, da so bili snopi semenčic obloženi agregati glavic semenčic, agregati semenčic pa so pokazali pritrjeno mrežo zavitih repkov.
Morfologijo in ultrastrukturo semenčic, nastanek snopov semenčic smo proučevali s svetlobno mikroskopijo (polovični presek), vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), brise semenčic smo obarvali z akridin oranžnim in pregledali z epifluorescenčno mikroskopijo.
Barvanje razmaza semenčic z akridin oranžno (slika 3B) je pokazalo, da so bile glave semenčic zlepljene in prekrite z izločevalnim materialom, kar je povzročilo nastanek velikih šopov (slika 3D).Snopi sperme so bili sestavljeni iz agregatov sperme z mrežo pritrjenih repov (sl. 4A-C).
Tvorba snopa semenčic S fazno kontrastno mikroskopijo in brisi semenčic, obarvanimi z akridin oranžno, so pokazali, da se glavice semenčic držijo skupaj.(A) Zgodnja tvorba semenčic se začne s semenčico (beli krog) in tremi semenčicami (rumeni krog), pri čemer se spirala začne pri repu in konča pri glavici.(B) Fotomikrografija razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžno, ki prikazuje prilepljene glave semenčic (puščice).Izcedek pokriva glavo(e).Povečava: ×200.
Skenirni elektronski mikrograf snopa sperme in razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžno.(A, B, D, E) so digitalne barvne elektronske mikrofotografije semenčic, C in F pa mikrofotografije brisov sperme, obarvanih z akridinsko oranžno barvo, ki prikazujejo pritrditev več semenčic, ki ovijajo kavdalno mrežo.(AC) Semenčice so prikazane kot mreža pritrjenih repkov (puščice).(D) Adhezija več semenčic (z lepljivo snovjo, roza obris, puščica), ki se ovijajo okoli repa.(E in F) Agregati glave semenčic (kazalci), prekriti z lepilnim materialom (kazalci).Spermatozoidi so tvorili snope z več vrtinčastimi strukturami (F).(C) ×400 in (F) ×200 povečavi.
Z uporabo transmisijske elektronske mikroskopije smo ugotovili, da imajo snopi semenčic pritrjene repke (sl. 6A, C), glave, pritrjene na repke (sl. 6B), ali glave, pritrjene na repke (sl. 6D).Glave semenčic v snopu so ukrivljene in v odseku predstavljajo dve jedrski regiji (slika 6D).V zareznem snopu so imele semenčice zvito glavo z dvema jedrnima regijama in več bičkovimi regijami (slika 5A).
Digitalni barvni elektronski mikrograf, ki prikazuje povezovalne repke v snopu semenčic in aglutinacijski material, ki povezuje glavice semenčic.(A) Pritrjen rep velikega števila semenčic.Opazite, kako je rep videti v pokončni (puščica) in ležeči (puščica) projekciji.(B) Glava (puščica) sperme je povezana z repom (puščica).(C) Pritrjenih je več repkov sperme (puščice).
Za odkrivanje glav semenčic v snopih semenčic, prekritih z izločki ali membranami, je bila uporabljena vrstična elektronska mikroskopija (slika 6B), kar kaže, da so snopi semenčic zasidrani z zunajceličnim materialom.Aglutinirani material je bil koncentriran v glavi sperme (sklop, podoben glavi meduze; slika 5B) in razširjen distalno, kar je pod fluorescenčno mikroskopijo dalo bleščeč rumen videz, ko je bilo obarvano z akridin oranžno (slika 6C).Ta snov je jasno vidna pod vrstičnim mikroskopom in velja za vezivo.Poltanki rezi (slika 5C) in brisi sperme, obarvani z akridin oranžno, so pokazali snope sperme, ki vsebujejo gosto zložene glave in zavite repke (slika 5D).
(A) Prečni digitalni barvni prenosni elektronski mikrograf snopa sperme, ki prikazuje zvito glavo sperme z dvodelnim jedrom (modro) in več bičkovimi deli (zeleno).(C) Poltanek rez, ki prikazuje zbrane glave semenčic (puščice) in zavite repke (puščice).(D) Mikrografija razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžno, ki prikazuje agregate glav semenčic (puščice) in zvite prilepljene repke (puščice).Upoštevajte, da lepljiva snov (S) pokriva glavo semenčice.(D) × 1000 povečava.
S transmisijsko elektronsko mikroskopijo (slika 7A) je bilo tudi ugotovljeno, da so bile glave semenčic zvite in da so imela jedra spiralno obliko, kar so potrdili brisi sperme, obarvani z akridin oranžno in pregledani s fluorescenčno mikroskopijo (slika 7B).
(A) Digitalni barvni prenosni elektronski mikrograf in (B) razmaz sperme, obarvan z akridinsko oranžno barvo, ki prikazuje zvite glave in pritrjene glave in repke spermijev (puščice).(B) × 1000 povečava.
Zanimiva ugotovitev je, da se Sharkazijeva sperma združuje v mobilne nitaste snope.Lastnosti teh snopov nam omogočajo razumevanje njihove možne vloge pri absorpciji in shranjevanju semenčic v SST.
Po parjenju sperma vstopi v vagino in je podvržena intenzivnemu procesu selekcije, zaradi česar le omejeno število sperme vstopi v SST15,16.Do danes mehanizmi, s katerimi semenčice vstopijo in izstopijo iz SST, niso jasni.Pri perutnini so semenčice shranjene v SST za daljše obdobje od 2 do 10 tednov, odvisno od vrste6.Ostajajo polemike o stanju semena med shranjevanjem v SST.So v gibanju ali mirujejo?Z drugimi besedami, kako semenčice ohranijo svoj položaj v SST tako dolgo?
Forman4 je predlagal, da bi lahko bivanje in izmet SST razložili v smislu gibljivosti sperme.Avtorji domnevajo, da spermiji ohranijo svoj položaj tako, da plavajo proti toku tekočine, ki ga ustvari epitelij SST, in da se spermiji izvržejo iz SST, ko njihova hitrost pade pod točko, pri kateri se začnejo premikati nazaj zaradi pomanjkanja energije.Zaniboni5 je potrdil prisotnost akvaporinov 2, 3 in 9 v apikalnem delu epitelijskih celic SST, kar lahko posredno podpira Foremanov model shranjevanja sperme.V trenutni študiji smo ugotovili, da skoraj polovica Sharkashijevih semenčic kaže pozitivno reologijo v tekoči tekočini in da aglutinirani snopi semenčic povečajo število semenčic s pozitivno reologijo, čeprav jih aglutinacija upočasni.Kako semenčice potujejo po ptičjem jajcevodu do mesta oploditve, ni povsem razumljeno.Pri sesalcih folikularna tekočina kemoterapijo pritegne semenčice.Vendar se domneva, da kemoatraktanti usmerjajo semenčice, da se približajo na velike razdalje7.Zato so za transport semenčic odgovorni drugi mehanizmi.Poročali so, da je sposobnost sperme, da se orientira in teče proti tekočini jajcevodov, ki se sprosti po parjenju, glavni dejavnik pri ciljanju na spermo pri miših.Parker 17 je predlagal, da spermatozoidi prečkajo jajcevode s plavanjem proti ciliarnemu toku pri pticah in plazilcih.Čeprav ni bilo eksperimentalno dokazano pri pticah, je bil Adolphi18 prvi, ki je ugotovil, da daje ptičja sperma pozitivne rezultate, ko se s trakom filtrirnega papirja ustvari tanka plast tekočine med pokrovnim stekelcem in objektnim stekelcem.reologija.Hino in Yanagimachi [19] sta postavila mišji kompleks jajčnik-tubar-maternica v perfuzijski obroč in vbrizgala 1 µl črnila v prežico, da bi vizualizirala pretok tekočine v jajcevodih.Opazili so zelo aktivno gibanje krčenja in sproščanja v jajcevodu, pri katerem so se vse kroglice črnila vztrajno premikale proti ampuli jajcevoda.Avtorji poudarjajo pomen pretoka tubarne tekočine iz spodnjega v zgornji jajcevod za dvig semenčic in oploditev.Brillard20 je poročal, da pri piščancih in puranih semenčice migrirajo z aktivnim gibanjem od vaginalnega vhoda, kjer so shranjene, do utero-vaginalnega stičišča, kjer so shranjene.Vendar to gibanje ni potrebno med uterovaginalnim stikom in infundibulumom, ker se semenčice prenašajo s pasivnim premikanjem.Ob poznavanju teh prejšnjih priporočil in rezultatov, pridobljenih v trenutni študiji, lahko domnevamo, da je sposobnost semenčic, da se gibljejo navzgor (reologija), ena od lastnosti, na katerih temelji postopek selekcije.To določa prehod semenčic skozi nožnico in njihov vstop v CCT za shranjevanje.Kot je predlagal Forman4, lahko to tudi olajša proces vstopa semenčic v SST in njegov habitat za nekaj časa in nato izstopa, ko se njihova hitrost začne upočasnjevati.
Po drugi strani pa sta Matsuzaki in Sasanami 21 predlagala, da se gibljivost ptičjih semenčic spremeni iz stanja mirovanja v gibljivost v reproduktivnem traktu samcev in samic.Inhibicija rezidenčne gibljivosti semenčic v SST je bila predlagana za razlago dolgega časa shranjevanja sperme in nato pomlajevanja po izstopu iz SST.V hipoksičnih pogojih sta Matsuzaki et al.
Vzorec aglutinacije sperme velja za verodostojno razlago za dolgo obdobje shranjevanja sperme v SST, saj je to pogost vzorec zadrževanja sperme pri perutnini 2,22,23.Bakst idr.2 opazili, da se je večina semenčic prilepila druga na drugo in tvorila fascikularne agregate, posamezne semenčice pa so bile redko najdene v CCM prepelice.Po drugi strani pa Wen et al.24 opazili več razpršenih semenčic in manj šopov semenčic v lumnu SST pri piščancih.Na podlagi teh opazovanj se lahko domneva, da se nagnjenost k aglutinaciji semenčic razlikuje med pticami in med semenčicami v istem ejakulatu.Poleg tega so Van Krey et al.9 je predlagal, da je naključna disociacija aglutiniranih semenčic odgovorna za postopno prodiranje semenčic v lumen jajcevodne cevi.Po tej hipotezi bi morali iz SST najprej izločiti semenčice z manjšo aglutinacijsko sposobnostjo.V tem kontekstu je lahko sposobnost aglutinacije semenčic dejavnik, ki vpliva na izid tekmovanja semenčic pri umazanih pticah.Poleg tega dlje ko aglutinirana semenčica disociira, dlje se ohranja plodnost.
Čeprav so agregacijo semenčic in združevanje v snope opazili v več študijah 2, 22, 24, niso bili podrobno opisani zaradi zapletenosti njihovega kinematičnega opazovanja znotraj SST.Izvedenih je bilo več poskusov preučevanja aglutinacije semenčic in vitro.Ko smo tanko žico odstranili iz viseče kapljice semena, so opazili obsežno, a prehodno agregacijo.To vodi do dejstva, da iz kapljice štrli podolgovat mehurček, ki posnema semensko žlezo.Zaradi omejitev 3D in kratkih časov sušenja kapanja je celoten blok hitro propadel9.V trenutni študiji smo z uporabo piščancev Sharkashi in mikrofluidnih čipov lahko opisali, kako se ti šopi oblikujejo in kako se premikajo.Snopki semenčic so se oblikovali takoj po zbiranju semena in ugotovljeno je bilo, da se premikajo v spirali, kar kaže pozitivno reologijo, ko je prisotno v toku.Poleg tega so pri makroskopskem pregledu opazili, da snopi semenčic povečajo linearnost gibljivosti v primerjavi z izoliranimi semenčicami.To nakazuje, da lahko pride do aglutinacije sperme pred penetracijo SST in da proizvodnja sperme ni omejena na majhno območje zaradi stresa, kot je bilo prej predlagano (Tingari in Lake12).Med nastajanjem čopkov semenčice sinhrono plavajo, dokler ne tvorijo stika, nato se njihovi repki ovijejo drug okoli drugega in glavica semenčice ostane prosta, rep in distalni del semenčice pa se zlepita z lepljivo snovjo.Zato je za gibanje odgovorna prosta glava ligamenta, ki vleče preostali del ligamenta.Vrtilna elektronska mikroskopija snopov semenčic je pokazala pritrjene glave semenčic, prekrite z veliko lepljivega materiala, kar kaže na to, da so bile glave semenčic pritrjene v snope mirovanja, kar se je morda zgodilo po tem, ko so dosegli mesto shranjevanja (SST).
Ko je bris sperme obarvan z akridin oranžnim, je pod fluorescentnim mikroskopom mogoče videti zunajcelični lepilni material okoli semenčic.Ta snov omogoča, da se snopi semenčic oprimejo in oprimejo okoliških površin ali delcev, tako da ne odnašajo z okoliškim tokom.Tako naša opažanja kažejo vlogo adhezije semenčic v obliki mobilnih snopov.Njihova sposobnost, da plavajo proti toku in se držijo bližnjih površin, omogoča, da semenčice ostanejo dlje v SST.
Rothschild25 je uporabil hemocitometrično kamero za preučevanje lebdeče porazdelitve govejega semena v kapljici suspenzije, pri čemer je posnel fotomikrografe skozi kamero z navpično in vodoravno optično osjo mikroskopa.Ob upoštevanju tega, skupaj s sposobnostjo semena piščancev Sharkashi, da tvori lepljive šope, lahko poveča verjetnost, da se bo seme prilepilo na steno SST in se shranilo dlje časa.
Forman10 je opazil, da je hidroliza α-glikozidnih vezi v glikoprotein-glikolipidnih oblogah z obdelavo ptičjega semena z nevraminidazo povzročila zmanjšano plodnost brez vpliva na gibljivost semenčic.Avtorji domnevajo, da učinek nevraminidaze na glikokaliks poslabša sekvestracijo sperme na utero-vaginalnem spoju in s tem zmanjša plodnost.Njihova opažanja ne morejo prezreti možnosti, da lahko zdravljenje z nevraminidazo zmanjša prepoznavanje semenčic in jajčnih celic.Forman in Engel10 sta ugotovila, da se je plodnost zmanjšala, ko so bile kokoši intravaginalno osemenjene s semenom, obdelanim z nevraminidazo.Vendar IVF s spermo, obdelano z nevraminidazo, ni vplivala na plodnost v primerjavi s kontrolnimi piščanci.Avtorji so zaključili, da so spremembe v glikoprotein-glikolipidni prevleki okoli membrane semenčic zmanjšale sposobnost oploditve sperme s poslabšanjem sekvestracije sperme na utero-vaginalnem spoju, kar je posledično povečalo izgubo sperme zaradi hitrosti utero-vaginalnega stika, vendar ne vpliva na prepoznavanje sperme in jajčeca.
Pri puranih sta Bakst in Bauchan 11 našla majhne vezikle in fragmente membrane v lumnu SST in opazila, da so se nekatere od teh granul zlile z membrano sperme.Avtorji kažejo, da lahko ti odnosi prispevajo k dolgoročnemu shranjevanju semenčic v SST.Vendar pa raziskovalci niso navedli vira teh delcev, ne glede na to, ali jih izločajo epitelne celice CCT, proizvajajo in izločajo moški reproduktivni sistem ali jih proizvaja sperma sama.Prav tako so ti delci odgovorni za aglutinacijo.Grützner et al27 so poročali, da epididimalne epitelne celice proizvajajo in izločajo specifičen protein, ki je potreben za tvorbo enopornih semenskih poti.Avtorji tudi poročajo, da je disperzija teh snopov odvisna od interakcije epididimalnih proteinov.Nixon et al28 so ugotovili, da adneksi izločajo beljakovino, kisli, s cisteinom bogat osteonektin;SPARC sodeluje pri tvorbi semenčic pri kratkokljunih ehidnah in kljunah.Sipanje teh žarkov je povezano z izgubo tega proteina.
V trenutni študiji je ultrastrukturna analiza z uporabo elektronske mikroskopije pokazala, da se spermatozoidi držijo velike količine gostega materiala.Te snovi naj bi bile odgovorne za aglutinacijo, ki kondenzira med in okoli sprijetih glav, vendar v nižjih koncentracijah v predelu repa.Predvidevamo, da se ta aglutinirajoča snov izloča iz moškega reproduktivnega sistema (epididimisa ali semenovoda) skupaj s semenom, saj med izlivom pogosto opazimo ločevanje semena od limfe in semenske plazme.Poročali so, da ko ptičja semenčica prehaja skozi epididimis in vas deferens, pride do sprememb, povezanih z zorenjem, ki podpirajo njihovo sposobnost vezave beljakovin in pridobivanja glikoproteinov, povezanih s plazemsko lemo.Obstojnost teh proteinov na rezidenčnih membranah semenčic v SST kaže, da lahko ti proteini vplivajo na pridobitev stabilnosti membrane semenčic 30 in določajo njihovo plodnost 31.Ahammad et al32 so poročali, da so semenčice, pridobljene iz različnih delov moškega reproduktivnega sistema (od testisov do distalnega semenovoda), pokazale postopno povečanje sposobnosti preživetja v pogojih shranjevanja v tekočini, ne glede na temperaturo shranjevanja, sposobnost preživetja pri piščancih pa se poveča tudi v jajcevodih po umetni oploditvi.
Šopi sperme kokoši Sharkashi imajo drugačne značilnosti in funkcije kot druge vrste, kot so ehidne, kljunarice, lesne miši, podgane jeleni in morski prašički.Vendar so ti snopi povečali odstotek reološko pozitivnih semenčic in povečali sposobnost semenčic, da se stabilizirajo v dinamičnem okolju.Tako naši rezultati potrjujejo prejšnji predlog, da je aglutinacija sperme v SST povezana z dolgotrajnim shranjevanjem sperme.Domnevamo tudi, da lahko nagnjenost sperme k oblikovanju šopov nadzoruje stopnjo izgube sperme v SST, kar lahko spremeni izid tekmovanja sperme.Po tej predpostavki semenčice z nizko aglutinacijsko sposobnostjo najprej sprostijo SST, medtem ko semenčice z visoko aglutinacijsko sposobnostjo proizvedejo večino potomcev.Tvorba enopornih snopov semenčic je koristna in vpliva na razmerje med starši in otroki, vendar uporablja drugačen mehanizem.Pri ehidnah in kljunah so spermatozoidi razporejeni vzporedno drug z drugim, da povečajo hitrost žarka naprej.Snopi ehidna se premikajo približno trikrat hitreje kot posamezne semenčice.Domneva se, da je nastanek takšnih semenčic pri jehidnah evolucijska prilagoditev za ohranjanje prevlade, saj so samice promiskuitetne in se običajno parijo z več samci.Zato spermatozoidi iz različnih ejakulatov močno tekmujejo za oploditev jajčeca.
Aglutinirane semenčice piščancev šarkasi je enostavno vizualizirati s fazno kontrastno mikroskopijo, ki se šteje za prednost, saj omogoča enostavno proučevanje obnašanja semenčic in vitro.Mehanizem, s katerim tvorba šopov semenčic spodbuja razmnoževanje pri piščancih šarkasi, je prav tako drugačen od tistega, ki ga opazimo pri nekaterih placentnih sesalcih, ki predstavljajo kooperativno vedenje semenčic, kot so lesne miši, kjer nekaj semenčic doseže jajčeca, kar pomaga drugim sorodnim osebkom doseči in poškodovati jajca.da se dokažeš.altruistično vedenje.Samooploditev 34. Še en primer kooperativnega vedenja pri semenčicah so našli pri jelenjih miših, kjer so se semenčice lahko identificirale in združile z genetsko najbolj sorodnimi semenčicami ter oblikovale kooperativne skupine, da bi povečale svojo hitrost v primerjavi z nesorodnimi semenčicami35.
Rezultati, pridobljeni v tej študiji, niso v nasprotju s Fomanovo teorijo o dolgotrajnem shranjevanju semenčic v SWS.Raziskovalci poročajo, da se semenčice dalj časa premikajo v toku epitelijskih celic, ki obdajajo SST, po določenem času pa se zaloge energije semenčic izčrpajo, kar povzroči zmanjšanje hitrosti, kar omogoča izgon snovi z majhno molekulsko maso.energija semenčic s pretokom tekočine iz lumna SST Votlina jajcevodne cevi.V trenutni študiji smo opazili, da je polovica posamezne sperme pokazala sposobnost plavanja proti tekočim tekočinam, njihova adhezija v snopu pa je povečala njihovo sposobnost, da pokažejo pozitivno reologijo.Poleg tega so naši podatki skladni s podatki Matsuzaki et al.1, ki je poročal, da lahko povečano izločanje laktata v SST zavre gibljivost rezidenčne sperme.Vendar pa naši rezultati opisujejo nastanek gibljivih ligamentov sperme in njihovo reološko obnašanje v prisotnosti dinamičnega okolja znotraj mikrokanala, da bi razjasnili njihovo obnašanje v SST.Prihodnje raziskave se bodo morda osredotočile na ugotavljanje kemične sestave in izvora aglutinacijskega sredstva, kar bo raziskovalcem nedvomno pomagalo razviti nove načine shranjevanja tekočega semena in podaljšati trajanje plodnosti.
Ptice so bile nameščene v posameznih kletkah (30 x 40 x 40 cm), izpostavljene svetlobnemu programu (16 ur svetlobe in 8 ur teme) in hranjene s hrano, ki je vsebovala 160 g surovih beljakovin, 2800 kcal presnovne energije in 35 g kalcija vsaka.
Po podatkih 36, ​​37 je bilo seme odvzeto samcem z masažo trebuha.V treh dneh je bilo odvzetih 45 vzorcev semena 15 moškim.Seme (n = 15/dan) je bilo takoj razredčeno 1:1 (v:v) z Belsville Poultry Semen Diluent, ki vsebuje kalijev difosfat (1,27 g), mononatrijev glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozo (0,5 d) brezvodni natrij.acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijev citrat monohidrat (0,064 g), kalijev monofosfat (0,065 g), magnezijev klorid (0,034 g) in H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarnost 333 mOsm/kg38.Vzorce razredčenega semena smo najprej pregledali pod svetlobnim mikroskopom, da bi zagotovili dobro kakovost semena (vlažnost), nato pa shranili v vodni kopeli pri 37 °C do uporabe v pol ure po odvzemu.
Kinematika in reologija semenčic sta opisani s pomočjo sistema mikrofluidnih naprav.Vzorci semena so bili nadalje razredčeni do 1:40 v Beltsville Avian Semen Diluent, naloženi v mikrofluidno napravo (glej spodaj) in kinetični parametri so bili določeni s sistemom za računalniško analizo semena (CASA), ki je bil predhodno razvit za mikrofluidno karakterizacijo.o mobilnosti semenčic v tekočem mediju (Oddelek za strojništvo, Inženirska fakulteta, Univerza Assiut, Egipt).Vtičnik lahko prenesete na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Izmerjene so bile hitrost krivulje (VCL, μm/s), linearna hitrost (VSL, μm/s) in povprečna hitrost trajektorije (VAP, μm/s).Video posnetke semenčic so posneli z obrnjenim mikroskopom s faznim kontrastom Optika XDS-3 (s 40-kratnim objektivom), povezanim s kamero Tucson ISH1000 pri 30 fps za 3 s.S programsko opremo CASA preučite vsaj tri področja in 500 poti sperme na vzorec.Posneti videoposnetek je bil obdelan z domačim CASA.Opredelitev gibljivosti v vtičniku CASA temelji na hitrosti plavanja sperme v primerjavi s hitrostjo pretoka in ne vključuje drugih parametrov, kot je gibanje od strani do strani, saj je bilo ugotovljeno, da je to bolj zanesljivo pri pretoku tekočine.Reološko gibanje je opisano kot gibanje semenčic v nasprotni smeri toka tekočine.Semenčice z reološkimi lastnostmi smo delili s številom gibljivih semenčic;semenčice, ki so bile v mirovanju, in semenčice, ki se konvektivno premikajo, so bile izključene iz štetja.
Vse uporabljene kemikalije so bile pridobljene od Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipt), razen če ni drugače navedeno.Naprava je bila izdelana, kot so opisali El-sherry et al.40 z nekaj spremembami.Materiali, uporabljeni za izdelavo mikrokanalov, so vključevali steklene plošče (Howard Glass, Worcester, MA), negativni rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diaceton alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Nemčija) in poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanali so izdelani z mehko litografijo.Najprej je bila prozorna zaščitna obrazna maska ​​z želeno mikrokanalno zasnovo natisnjena na tiskalniku visoke ločljivosti (Prismatic, Cairo, Egypt in Pacific Arts and Design, Markham, ON).Mojstri so bili narejeni z uporabo steklenih plošč kot substratov.Plošče so bile očiščene v acetonu, izopropanolu in deionizirani vodi in nato prevlečene z 20 µm plastjo SU8-25 s prevleko s centrifugiranjem (3000 rpm, 1 min).Plasti SU-8 so bile nato nežno posušene (65 °C, 2 min in 95 °C, 10 min) in izpostavljene UV sevanju za 50 s.Po izpostavitvi pečemo pri 65 °C in 95 °C 1 minuto in 4 minute, da zamrežimo izpostavljene plasti SU-8, čemur sledi razvijanje v diaceton alkoholu 6,5 minute.Vaflje močno zapečemo (200°C 15 min), da dodatno utrdimo plast SU-8.
PDMS smo pripravili z mešanjem monomera in trdilca v masnem razmerju 10:1, nato ga razplinili v vakuumskem eksikatorju in vlili na glavni okvir SU-8.PDMS je bil strjen v pečici (120 °C, 30 min), nato so bili kanali izrezani, ločeni od glavnega materiala in perforirani, da so omogočili pritrditev cevi na vhodu in izstopu iz mikrokanala.Končno so bili mikrokanali PDMS trajno pritrjeni na mikroskopska stekelca z uporabo prenosnega koronskega procesorja (Electro-Technic Products, Chicago, IL), kot je opisano drugje.Mikrokanal, uporabljen v tej študiji, meri 200 µm × 20 µm (Š × V) in je dolg 3,6 cm.
Pretok tekočine, ki ga povzroča hidrostatični tlak znotraj mikrokanala, se doseže z vzdrževanjem nivoja tekočine v vstopnem rezervoarju nad višinsko razliko Δh39 v izstopnem rezervoarju (slika 1).
kjer je f koeficient trenja, definiran kot f = C/Re za laminarni tok v pravokotnem kanalu, kjer je C konstanta, odvisna od razmerja stranic kanala, L je dolžina mikrokanala, Vav je povprečna hitrost znotraj mikrokanala, Dh je hidravlični premer kanala, g – gravitacijski pospešek.Z uporabo te enačbe je mogoče povprečno hitrost kanala izračunati z naslednjo enačbo: