Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Porozni delci silicijevega dioksida so bili pripravljeni s sol-gel metodo z nekaj modifikacijami za pridobitev makroporoznih delcev. Ti delci so bili derivatizirani z reverzibilno adicijo in fragmentacijsko verižno polimerizacijo (RAFT) z N-fenilmaleimid-metilvinilizocianatom (PMI) in stirenom za pripravo stacionarne faze z interkalacijo N-fenilmaleimida v polistiren (PMP). Ozke kolone iz nerjavečega jekla (100 × 1,8 mm notranji premer) so bile polnjene z gnojevko. Ocenjena je bila ločitev peptidne mešanice, ki jo sestavlja pet peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) na koloni PMP, kromatografska učinkovitost in razgradnja humanega serumskega albumina (HAS) s tripsinom. V optimalnih pogojih eluiranja je teoretično število plošč v peptidni mešanici kar 280.000 plošč/m². Primerjava ločitvene učinkovitosti razvite kolone s komercialno kolono Ascentis Express. Na koloni RP-Amide je bilo ugotovljeno, da je bila ločevalna učinkovitost kolone PMP boljša od komercialne kolone glede učinkovitosti ločevanja in ločljivosti.
V zadnjih letih je biofarmacevtska industrija postala rastoči svetovni trg z znatnim povečanjem tržnega deleža. Z eksplozivno rastjo biofarmacevtske industrije1,2,3 je analiza peptidov in beljakovin zelo zaželena. Poleg ciljnega peptida med sintezo peptidov nastane več nečistoč, zato je za pridobitev peptidov želene čistosti potrebno kromatografsko čiščenje. Analiza in karakterizacija beljakovin v telesnih tekočinah, tkivih in celicah je izjemno zahtevna naloga zaradi velikega števila potencialno zaznavnih vrst v enem samem vzorcu. Čeprav je masna spektrometrija učinkovito orodje za sekvenciranje peptidov in beljakovin, ločevanje ne bo idealno, če se takšni vzorci vbrizgajo v masni spektrometer v enem prehodu. To težavo je mogoče ublažiti z uporabo ločevanja s tekočinsko kromatografijo (LC) pred MS analizo, kar bo zmanjšalo število analitov, ki vstopijo v masni spektrometer v določenem času4,5,6. Poleg tega se lahko med ločevanjem v tekoči fazi analiti osredotočijo v ozkih območjih, s čimer se ti analiti koncentrirajo in izboljša občutljivost MS detekcije. Tekočinska kromatografija (LC) je v zadnjem desetletju znatno napredovala in postala priljubljena tehnika v proteomska analiza7,8,9,10.
Tekočinska kromatografija z reverzno fazo (RP-LC) se pogosto uporablja za čiščenje in ločevanje peptidnih zmesi z uporabo oktadecil-modificiranega silicijevega dioksida (ODS) kot stacionarne faze11,12,13. Vendar pa stacionarne faze RP ne zagotavljajo zadovoljivega ločevanja peptidov in beljakovin zaradi svoje kompleksne strukture in amfifilne narave14,15. Zato so za analizo peptidov in beljakovin potrebne posebej zasnovane stacionarne faze s polarnimi in nepolarnimi skupinami, ki interagirajo s temi analiti in jih zadržijo16. Mešana kromatografija, ki zagotavlja multimodalne interakcije, je lahko alternativa RP-LC za ločevanje peptidov, beljakovin in drugih kompleksnih zmesi. Pripravljenih je bilo več mešanih stacionarnih faz, kolone, napolnjene s temi fazami, pa so bile uporabljene za ločevanje peptidov in beljakovin17,18,19,20,21. Mešane stacionarne faze (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) so primerne za ločevanje peptidov in beljakovin zaradi prisotnosti polarnih in nepolarnih delcev. skupine22,23,24,25,26,27,28. Podobno polarne interkalirajoče stacionarne faze s kovalentno vezanimi polarnimi skupinami kažejo dobro ločevalno moč in edinstveno selektivnost za polarne in nepolarne analite, saj je ločevanje odvisno od interakcije med analitom in stacionarno fazo. Multimodalne interakcije 29, 30, 31, 32. Nedavno so Zhang in sod.30 pripravili dodecilno terminirano poliaminsko stacionarno fazo in uspešno ločili ogljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene in več drugih analitov. Polarni interkalator ima tako polarne kot nepolarne skupine, zato ga je mogoče uporabiti za ločevanje peptidov in proteinov, ki imajo tako hidrofobne kot hidrofilne dele. Polarno vgrajene kolone (npr. amidno vgrajene kolone C18) so komercialno dostopne pod trgovskim imenom kolone Ascentis Express RP-Amide, vendar se te kolone uporabljajo samo za analizo amina 33.
V tej študiji je bila pripravljena in ocenjena polarno vgrajena stacionarna faza (v N-fenilmaleimid vgrajen polistiren) za ločevanje peptidov in tripsinskih prebavov HSA. Stacionarna faza je bila pripravljena z uporabo naslednje strategije. Porozni delci silicijevega dioksida so bili pripravljeni po postopku, navedenem v naši prejšnji publikaciji, z nekaj spremembami protokola priprave. Razmerje med sečnino, polietilen glikolom (PEG), TMOS, vodo in ocetno kislino je bilo prilagojeno za pripravo delcev silicijevega dioksida z veliko velikostjo por. Nato je bil sintetiziran nov ligand, fenilmaleimid-metil vinil izocianat, in uporabljen za derivatizacijo delcev silicijevega dioksida za pripravo polarno vgrajene stacionarne faze. Nastala stacionarna faza je bila vstavljena v kolono iz nerjavečega jekla (100 × 1,8 mm notranji premer) z uporabo optimizirane sheme pakiranja. Pakiranje kolone je bilo podprto z mehanskim vibracijam, da se zagotovi nastanek homogene plasti znotraj kolone. Ocenite ločevanje mešanic peptidov, ki jih sestavlja pet peptidov, v polnjeni koloni; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) in tripsin prebav humanega serumskega albumina (HAS). Ugotovljeno je bilo, da se mešanica peptidov in tripsin prebava HSA ločita z dobro ločljivostjo in učinkovitostjo. Učinkovitost ločevanja kolone PMP je bila primerjana z učinkovitostjo kolone Ascentis Express RP-Amide. Ugotovljeno je bilo, da so tako peptidi kot proteini dobro ločeni in učinkoviti na koloni PMP, ki je bila učinkovitejša od kolone Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), sečnina, ocetna kislina, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil klorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijev klorid, sečnina, heksan metildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) HPLC kakovosti, metanol, 2-propanol in aceton, kupljeni pri podjetju Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA).
Zmes sečnine (8 g), polietilen glikola (8 g) in 8 ml 0,01 N ocetne kisline smo mešali 10 minut, nato pa smo ji v ledeno mrzlih pogojih dodali 24 ml TMOS. Reakcijsko zmes smo segrevali 6 ur pri 40 °C in nato 8 ur pri 120 °C v avtoklavu iz nerjavečega jekla. Vodo smo odlili in preostali material sušili 12 ur pri 70 °C. Posušeno mehko maso smo zmleli v pečici in kalcinirali 12 ur pri 550 °C. Pripravili in karakterizirali smo tri serije, da bi preverili ponovljivost velikosti delcev, velikosti por in površine.
Z modifikacijo površine silicijevega dioksida s predhodno sintetiziranim ligandom fenilmaleimid-metilvinilizocianatom (PCMP), ki ji je sledila radialna polimerizacija s stirenom, je bila pripravljena spojina, ki vsebuje polarno skupino. Stacionarna faza za agregate in polistirenske verige. Postopek priprave je opisan spodaj.
N-fenilmaleimid (200 mg) in metil vinil izocianat (100 mg) smo raztopili v suhem toluenu in v reakcijsko bučko dodali 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN), da smo pripravili kopolimer fenilmaleimid-metil vinil izocianata (PMCP). Zmes smo segrevali pri 60 °C 3 ure, filtrirali in sušili v pečici pri 40 °C 3 ure.
Posušene delce silicijevega dioksida (2 g) smo dispergirali v suhem toluenu (100 ml), mešali in sonificirali v 500 ml okroglodnem bučki 10 minut. PMCP (10 mg) smo raztopili v toluenu in ga po kapljicah dodajali v reakcijsko bučko preko lijaka za kapljanje. Zmes smo 8 ur refluksirali pri 100 °C, filtrirali, sprali z acetonom in sušili pri 60 °C 3 ure. Nato smo delce silicijevega dioksida, vezane na PMCP (100 g), raztopili v toluenu (200 ml) in dodali 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) v prisotnosti 100 µL dibutilkositrovega dilaurata kot katalizatorja. Zmes smo mešali pri 50 °C 8 ur, filtrirali in sušili pri 50 °C 3 ure.
Stiren (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) in na TEMPO-PMCP vezane delce silicijevega dioksida (1,5 g) smo dispergirali v toluenu in prepihali z dušikom. Polimerizacija stirena je bila izvedena pri 100 °C 12 ur. Nastali produkt smo spirali z metanolom in sušili pri 60 °C čez noč. Celotna reakcijska shema je prikazana na sliki 1.
Vzorce smo 1 uro razplinjali pri 393 K, da smo dosegli preostali tlak manj kot 10-3 Torr. Za določitev celotnega volumna por smo uporabili količino N2, adsorbiranega pri relativnem tlaku P/P0 = 0,99. Morfologijo golih in ligandno vezanih delcev silicijevega dioksida smo pregledali z vrstično elektronsko mikroskopijo (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonska). Posušene vzorce (goli silicijev dioksid in ligandno vezani delci silicijevega dioksida) smo z lepilnim ogljikovim trakom namestili na aluminijasto kolono. Na vzorce smo z razpršilnim premazom Q150T nanesli zlato, na vzorce pa smo nanesli 5 nm plast Au. To izboljša učinkovitost postopka z uporabo nizkih napetosti in zagotavlja drobnozrnato hladno razprševanje. Za elementarno analizo smo uporabili elementarni analizator Thermo Electron (Waltham, MA, ZDA) Flash EA1112. Za določitev porazdelitve velikosti delcev smo uporabili analizator velikosti delcev Malvern (Worcestershire, Združeno kraljestvo) Mastersizer 2000. Goli delci silicijevega dioksida in ligandno vezani delci silicijevega dioksida (5 mg) Vsaka) je bila dispergirana v 5 ml izopropanola, sonificirana 10 minut, mešana v vrtincu 5 minut in postavljena na optično mizo Mastersizerja. Termogravimetrična analiza je bila izvedena s hitrostjo 5 °C na minuto v temperaturnem območju od 30 do 800 °C.
Ozkoprečne kolone iz nerjavečega jekla s stekleno oblogo dimenzij (100 × 1,8 mm notranji premer) so bile polnjene z metodo polnjenja v suspenziji, pri čemer je bil uporabljen isti postopek, kot je bil uporabljen v Ref. 31. Kolono iz nerjavečega jekla (s stekleno oblogo, 100 × 1,8 mm notranji premer) z izhodnim priključkom, ki vsebuje frito velikosti 1 µm, smo priključili na pakirni sistem za suspenzijo (Alltech Deerfield, IL, ZDA). Pripravite suspenzijo stacionarne faze tako, da 150 mg stacionarne faze suspendirate v 1,2 ml metanola in jo pošljete v shranjevalno kolono. Kot topilo za suspenzijo in kot pogonsko topilo smo uporabili metanol. Kolono smo zaporedno napolnili s tlakom 100 MP 10 minut, 80 MP 15 minut in 60 MP 30 minut. Med polnjenjem smo z dvema stresalnikoma za plinsko kromatografijo (Alltech, Deerfield, IL, ZDA) izvajali mehanske vibracije, da smo zagotovili enakomerno polnjenje kolone. Zaprite pakirni sistem za suspenzijo in počasi sproščajte tlak, da preprečite morebitne poškodbe v koloni. Kolono odklopite od enote za polnjenje suspenzije in priključite drug priključek na vhod in sistem LC, da preverite njeno delovanje.
Izdelana je bila LC črpalka (10AD Shimadzu, Japonska), injektor (Valco (ZDA) C14 W.05) s 50nL injekcijsko zanko, membranski degaziator (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilarno okno, poseben detektor µLC naprave (UV-2075) in mikrokolone s stekleno oblogo. Uporabljene so bile zelo ozke in kratke povezovalne cevi, da se zmanjša učinek dodatnega širjenja pasov kolone. Po pakiranju so bile na izhodu 1/16″ redukcijskega spoja nameščene kapilare (50 μm no 365) in kapilare redukcijskega spoja (50 μm). Zbiranje podatkov in kromatografska obdelava sta bila izvedena s programsko opremo Multichro 2000. Spremljanje pri 254 nm. Analiti so bili testirani na UV absorbanco. Kromatografski podatki so bili analizirani z OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin iz človeškega seruma, liofiliziran prašek, ≥ 96 % (elektroforeza v agaroznem gelu) 3 mg, zmešan s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M sečnino (1 ml) in 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 ml). Raztopino smo mešali 10 minut in jo 6 ur držali v vodni kopeli pri 37 °C, nato pa smo reakcijo pogasili z 1 ml 0,1 % TFA. Raztopino smo filtrirali in shranili pri temperaturi pod 4 °C.
Ločitev peptidnih zmesi in tripsinskih prebavov HSA je bila ločeno ocenjena na PMP kolonah. Preverite ločitev peptidne zmesi in tripsinskega prebava HSA s PMP kolono in primerjajte rezultate z Ascentis Express RP-Amide kolono. Teoretično število plošč se izračuna na naslednji način:
SEM slike golih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande, so prikazane na sliki 2. SEM slike golih delcev silicijevega dioksida (A, B) kažejo, da so ti delci v nasprotju z našimi prejšnjimi študijami sferični, podolgovati ali imajo nepravilno simetrijo. Površina delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande (C, D), je bolj gladka kot površina golih delcev silicijevega dioksida, kar je lahko posledica prevleke polistirenskih verig na površini delcev silicijevega dioksida.
Slike vrstičnega elektronskega mikroskopa golih delcev silicijevega dioksida (A, B) in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande (C, D).
Porazdelitve velikosti delcev golih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande, so prikazane na sliki 3(A). Krivulje porazdelitve velikosti delcev na podlagi volumna so pokazale, da se je velikost delcev silicijevega dioksida po kemijski modifikaciji povečala (slika 3A). Podatki o porazdelitvi velikosti delcev silicijevega dioksida iz trenutne in prejšnje študije so primerjani v tabeli 1(A). Velikost delcev PMP na podlagi volumna, d(0,5), je 3,36 μm, v primerjavi z našo prejšnjo študijo z vrednostjo ad(0,5) 3,05 μm (delci silicijevega dioksida, vezani na polistiren)34. Ta serija je imela ožjo porazdelitev velikosti delcev v primerjavi z našo prejšnjo študijo zaradi različnih razmerij PEG, sečnine, TMOS in ocetne kisline v reakcijski mešanici. Velikost delcev faze PMP je nekoliko večja od velikosti delcev faze delcev silicijevega dioksida, vezanih na polistiren, ki smo jo prej preučevali. To pomeni, da je površinska funkcionalizacija delcev silicijevega dioksida s stirenom nanesla le plast polistirena (0,97 µm) na površino silicijevega dioksida, medtem ko je bila v fazi PMP debelina plasti 1,38 µm.
Porazdelitev velikosti delcev (A) in porazdelitev velikosti por (B) golih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande.
Velikost por, volumen por in površina delcev silicijevega dioksida v trenutni študiji so podani v tabeli 1(B). Profili PSD golih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande, so prikazani na sliki 3(B). Rezultati so primerljivi z našo prejšnjo študijo. Velikosti por golih in ligandno vezanih delcev silicijevega dioksida so 310 oziroma 241, kar kaže, da se velikost por po kemični modifikaciji zmanjša za 69, kot je prikazano v tabeli 1(B), sprememba krivulje pa je prikazana na sliki 3(B). Podobno se je volumen por delcev silicijevega dioksida po kemični modifikaciji zmanjšal z 0,67 na 0,58 cm3/g. Specifična površina trenutno preučevanih delcev silicijevega dioksida je 116 m2/g, kar je primerljivo z našo prejšnjo študijo (124 m2/g). Kot je prikazano v tabeli 1(B), se je površina (m2/g) delcev silicijevega dioksida po kemični modifikaciji prav tako zmanjšala s 116 m2/g na 105 m2/g. modifikacija.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze so prikazani v tabeli 2. Vsebnost ogljika v trenutni stacionarni fazi je 6,35 %, kar je manj kot v naši prejšnji študiji (delci silicijevega dioksida, vezani na polistiren, 7,93 %35 oziroma 10,21 %)42. Vsebnost ogljika v trenutni stacionarni fazi je nizka, ker so bili pri pripravi trenutne SP poleg stirena uporabljeni tudi nekateri polarni ligandi, kot sta fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PCMP) in 4-hidroksi-TEMPO. Masni odstotek dušika v trenutni stacionarni fazi je 2,21 % v primerjavi z 0,1735 oziroma 0,85 mas. % dušika v prejšnjih študijah. To pomeni, da je masni odstotek dušika v trenutni stacionarni fazi višji zaradi fenilmaleimida. Podobno je bila vsebnost ogljika v produktih (4) in (5) 2,7 % oziroma 2,9 %, medtem ko je bila vsebnost ogljika v končnem produktu (6) 6,35 %, kot je prikazano v tabeli 2. Izguba teže je bila preverjena s stacionarno fazo PMP, krivulja TGA pa je prikazana na sliki 4. Krivulja TGA kaže izgubo teže 8,6 %, kar se dobro ujema z vsebnostjo ogljika (6,35 %), ker ligandi ne vsebujejo le C, temveč tudi N, O in H.
Fenilmaleimid-metilvinilizocianatni ligand je bil izbran za modifikacijo površine silicijevega dioksida, ker ima polarne fenilmaleimidne skupine in vinilizocianatne skupine. Vinil izocianatne skupine lahko nadalje reagirajo s stirenom z živo radikalno polimerizacijo. Drugi razlog je vstavitev skupine, ki ima zmerno interakcijo z analitom in nima močne elektrostatične interakcije med analitom in stacionarno fazo, saj fenilmaleimidni del pri normalnem pH nima virtualnega naboja. Polarnost stacionarne faze je mogoče nadzorovati z optimalno količino stirena in reakcijskim časom polimerizacije prostih radikalov. Zadnji korak reakcije (polimerizacija prostih radikalov) je ključnega pomena in lahko spremeni polarnost stacionarne faze. Izvedena je bila elementarna analiza za preverjanje ogljikove obremenitve teh stacionarnih faz. Ugotovljeno je bilo, da povečanje količine stirena in reakcijskega časa poveča ogljikovo obremenitev stacionarne faze in obratno. SP, pripravljeni z različnimi koncentracijami stirena, imajo različne ogljikove obremenitve. Ponovno naložite te stacionarne faze v kolone iz nerjavečega jekla in preverite njihovo kromatografsko delovanje (selektivnost, ločljivost, vrednost N, itd.). Na podlagi teh poskusov je bila izbrana optimizirana formulacija za pripravo stacionarne faze PMP, da se zagotovi nadzorovana polarnost in dobro zadrževanje analita.
Pet peptidnih mešanic (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) je bilo prav tako ovrednotenih z uporabo PMP kolone z mobilno fazo; 60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1 % TFA) pri pretoku 80 μL/min. V optimalnih pogojih eluiranja je teoretično število plošč (N) na kolono (100 × 1,8 mm notranji premer) 20.000 ± 100 (200.000 plošč/m²). Tabela 3 prikazuje vrednosti N za tri kolone PMP, kromatogrami pa so prikazani na sliki 5A. Pri hitri analizi na koloni PMP pri visoki hitrosti pretoka (700 μL/min) je bilo v eni minuti eluiranih pet peptidov, vrednosti N so bile zelo dobre, 13.500 ± 330 na kolono (100 × 1,8 mm notranji premer), kar ustreza 135.000 ploščam/m² (slika 5B). Tri kolone enake velikosti (100 × 1,8 mm notranji premer) so bile napolnjene s tremi različnimi serijami stacionarne faze PMP za preverjanje ponovljivosti. Koncentracija analita za vsako kolono je bila zabeležena z uporabo optimalnih pogojev eluiranja in števila teoretičnih plošč N ter retencijskega časa za ločevanje iste testne zmesi na vsaki koloni. Podatki o ponovljivosti za kolone PMP so prikazani v tabeli 4. Ponovljivost kolone PMP se dobro ujema z zelo nizkimi vrednostmi %RSD, kot je prikazano v tabeli 3.
Ločevanje peptidne zmesi na koloni PMP (B) in koloni Ascentis Express RP-Amide (A); mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), dimenzije kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer); analitično. Vrstni red eluiranja spojin: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) in 5 (levcin) kislinski enkefalin).
PMP kolona (100 × 1,8 mm notranji premer) je bila ocenjena za ločevanje tripsinskih prebavov humanega serumskega albumina v visokozmogljivi tekočinski kromatografiji. Kromatogram na sliki 6 kaže, da je vzorec dobro ločen in da je ločljivost zelo dobra. Prebave HSA so bile analizirane s pretokom 100 µL/min, mobilno fazo 70/30 acetonitril/voda in 0,1 % TFA. Kot je prikazano na kromatogramu (slika 6), je bila prebava HSA razdeljena na 17 vrhov, ki ustrezajo 17 peptidom. Izračunana je bila učinkovitost ločevanja vsakega vrha v prebavi HSA, vrednosti pa so podane v tabeli 5.
Triptični prebav HSA (100 × 1,8 mm notranji premer) smo ločili na PMP koloni; pretok (100 µL/min), mobilna faza acetonitril/voda 60/40 z 0,1 % TFA.
kjer je L dolžina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP protitlak kolone in u linearna hitrost mobilne faze. Prepustnost kolone PMP je bila 2,5 × 10⁻¹⁴ m², pretok 25 μL/min, uporabljena pa je bila mešanica ACN/voda v razmerju 60/40 v/v. Prepustnost kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) je bila podobna kot v naši prejšnji študiji Ref. 34. Prepustnost kolone, napolnjene s površinsko poroznimi delci, je: 1,7 × 10⁻¹⁴ za delce velikosti 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁴ za delce velikosti 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁴ in 2,5 × 10⁻¹⁴ m² za delce velikosti 2,6 μm. Za delce velikosti 5 μm 43 je torej prepustnost faze PMP podobna prepustnosti delcev z jedrom in lupino velikosti 5 μm.
kjer je Wx teža kolone, napolnjene s kloroformom, Wy teža kolone, napolnjene z metanolom, in ρ gostota topila. Gostoti metanola (ρ = 0,7866) in kloroforma (ρ = 1,484). Skupna poroznost kolon SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm notranji premer) 34 in kolon C18-Urea 31, ki smo jih prej preučevali, je bila 0,63 oziroma 0,55. To pomeni, da prisotnost ligandov sečnine zmanjša prepustnost stacionarne faze. Po drugi strani pa je skupna poroznost kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) 0,60. Prepustnost kolon PMP je nižja kot pri kolonah, napolnjenih s C18-vezanimi delci silicijevega dioksida, ker so v stacionarnih fazah tipa C18 ligandi C18 vezani na delce silicijevega dioksida kot linearne verige, medtem ko se v stacionarnih fazah tipa polistirena okoli njega tvori relativno debela polimerna plast. V V tipičnem poskusu se poroznost kolone izračuna kot:
Slika 7A in B prikazuje kolono PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) in kolono Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm notranji premer) z uporabo enakih pogojev elucije (tj. 60/40 ACN/H2O in 0,1 % TFA). ) van Deemterjevega diagrama. Izbrane mešanice peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) so bile pripravljene v 20 µL/min. Najmanjši pretok za obe koloni je 800 µL/min. Najmanjše vrednosti HETP pri optimalnem pretoku (80 µL/min) za kolono PMP in kolono Ascentis Express RP-Amide so bile 2,6 µm oziroma 3,9 µm. Vrednosti HETP kažejo, da je učinkovitost ločevanja kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) veliko boljša od komercialno dostopne kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm notranji premer). Van Deemterjev diagram na sliki 7(A) kaže, da zmanjšanje vrednosti N z naraščajočim pretokom ni bistveno v primerjavi z našo prejšnjo študijo. Višja učinkovitost ločevanja kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) je bila ... id) v primerjavi s kolono Ascentis Express RP-Amide temelji na izboljšavah oblike, velikosti delcev in kompleksnih postopkov pakiranja kolone, uporabljenih v trenutnem delu34.
(A) van Deemterjev diagram (HETP glede na linearno hitrost mobilne faze), pridobljen z uporabo kolone PMP (100 × 1,8 mm notranji premer) v 60/40 ACN/H2O z 0,1 % TFA. (B) van Deemterjev diagram (HETP glede na linearno hitrost mobilne faze), pridobljen z uporabo kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm notranji premer) v 60/40 ACN/H2O z 0,1 % TFA.
Pripravili in ocenili smo polarno vgrajeno polistirensko stacionarno fazo za ločevanje sintetičnih peptidnih mešanic in tripsinskih prebavov humanega serumskega albumina (HAS) v visokozmogljivi tekočinski kromatografiji. Kromatografska učinkovitost PMP kolon za peptidne mešanice je odlična glede učinkovitosti ločevanja in ločljivosti. Izboljšana ločevalna učinkovitost PMP kolon je posledica različnih razlogov, kot so velikost delcev in velikost por silicijevega dioksida, nadzorovana sinteza stacionarne faze in kompleksno pakiranje kolone. Poleg visoke učinkovitosti ločevanja je nizek protitlak kolone pri visokih pretokih še ena prednost te stacionarne faze. PMP kolone kažejo dobro ponovljivost in se lahko uporabljajo za analizo peptidnih mešanic in tripsinsko prebavo različnih beljakovin. To kolono nameravamo uporabiti za ločevanje naravnih produktov, bioaktivnih spojin iz zdravilnih rastlin in glivičnih ekstraktov v tekočinski kromatografiji. V prihodnosti bodo PMP kolone ocenjene tudi za ločevanje beljakovin in monoklonskih protiteles.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. in Petersson, P. Raziskave sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Izboljšani aktivni peptidi, zasnovani za zdravljenje nalezljivih bolezni. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. in Khrestchatisky, M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg. Odkrivanje zdravil. 15 (1-2) danes, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD in Shen, Y. Napredna proteomska tekočinska kromatografija. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Napredna tekočinska kromatografija-masna spektrometrija omogoča vključitev široko usmerjene metabolomike in proteomike. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM in Salisbury, JJ Vloga UHPLC pri razvoju zdravil. J. Sep. Sci. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. in Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki ultravisokotlačne tekočinske kromatografije za hitre ločitve. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA in Tchelitcheff, P. Uporaba ultra visokozmogljive tekočinske kromatografije pri razvoju zdravil. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitni makroporozni hidrogeli, pripravljeni iz emulzij olje v vodi z visoko notranjo fazo, za učinkovito čiščenje enterovirusov. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. in Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. in Guillarme, D. Novi trendi v ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov s tekočinsko kromatografijo z reverzno fazo: teorija in uporaba. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE in Gebler, JC Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo sistema RP-RP-HPLC z uporabo različnih vrednosti pH v prvi in ​​drugi ločilni dimenziji. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Raziskane so bile značilnosti prenosa mase in kinetična učinkovitost visoko učinkovitih kromatografskih kolon, napolnjenih s popolnoma in površinsko poroznimi delci C18 pod 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nedavni trendi in analitični izzivi pri izolaciji, identifikaciji in validaciji rastlinskih bioaktivnih peptidov. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Proteomska pokrajina kraljestva življenja. Nature 582(7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Nadaljnja obdelava terapevtskih peptidov s preparativno tekočinsko kromatografijo. Molecule (Basel, Švica) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. in Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba pri biopolimerih. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. in Sun, Y. Ligandi za mešano proteinsko kromatografijo: princip, karakterizacija in zasnova. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).