Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo zaradi zagotavljanja stalne podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Porozne delce silicijevega dioksida smo pripravili s sol-gel metodo z nekaterimi modifikacijami, da smo dobili makroporozne delce. Ti delci so bili derivatizirani s polimerizacijo z reverzibilnim adicijskim fragmentacijskim prenosom verige (RAFT) z N-fenilmaleimid-metilvinilizocianatom (PMI) in stirenom za pripravo N-fenilmaleimidne interkalacije polistirena (PMP) stacionarne faze. Ozkocevna kolona iz nerjavečega jekla s (100 × 1,8 mm id) so bili pakirani s pakiranjem v gnojevko. Ocenjeno PMP kolonsko ločevanje mešanice peptidov, sestavljeno iz petih peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) kromatografsko delovanje) in razgradnjo človeškega serumskega albumina (HAS) s tripsinom. Pri optimalnih pogojih eluiranja je teoretično število plošč peptidne mešanice kar 280.000 plošč/m². Če primerjamo učinkovitost ločevanja razvite kolone s komercialno kolono Ascentis Express RP-Amide, je bilo ugotovljeno, da je bila učinkovitost ločevanja kolone PMP boljša od komercialne kolone v smislu učinkovitosti ločevanja in ločljivosti.
V zadnjih letih je biofarmacevtska industrija postala rastoči svetovni trg z znatnim povečanjem tržnega deleža. Z eksplozivno rastjo biofarmacevtske industrije1,2,3 je analiza peptidov in proteinov zelo zaželena. Poleg ciljnega peptida se med sintezo peptidov ustvarijo številne nečistoče, ki zahtevajo kromatografsko čiščenje, da dobimo peptide želene čistosti. Analiza in karakterizacija proteinov v telesnih tekočinah, tkiv in celic je izjemno zahtevna naloga zaradi velikega števila potencialno zaznavnih vrst v enem samem vzorcu. Čeprav je masna spektrometrija učinkovito orodje za določanje zaporedja peptidov in beljakovin, ločevanje ne bo idealno, če takšne vzorce vbrizgamo v masni spektrometer v enem prehodu. To težavo je mogoče ublažiti z izvajanjem ločevanja s tekočinsko kromatografijo (LC) pred analizo MS, kar bo zmanjšalo število analitov, ki vstopajo v masni spektrometer. v danem času 4,5,6. Poleg tega se lahko med ločevanjem tekoče faze analiti osredotočijo na ozka območja, s čimer se koncentrirajo ti analiti in izboljša občutljivost zaznavanja MS. Tekočinska kromatografija (LC) je v zadnjem desetletju znatno napredovala in je postala priljubljena tehnika v proteomski analizi 7,8,9,10.
Tekočinska kromatografija z reverzno fazo (RP-LC) se pogosto uporablja za čiščenje in ločevanje peptidnih mešanic z uporabo oktadecilno modificiranega silicijevega dioksida (ODS) kot stacionarne faze 11,12,13. Vendar pa stacionarne faze RP ne zagotavljajo zadovoljivega ločevanja peptidov in proteinov zaradi svoje kompleksne strukture in amfifilne narave 14,15. Zato so posebej zasnovane stacionarne faze so potrebni za analizo peptidov in proteinov s polarnimi in nepolarnimi deli, da medsebojno delujejo s temi analiti in jih zadržijo16. Mešana kromatografija, ki zagotavlja multimodalne interakcije, je lahko alternativa RP-LC za ločevanje peptidov, proteinov in drugih kompleksnih mešanic. Pripravljenih je bilo več mešanih stacionarnih faz in kolone, napolnjene s temi fazami, so bile uporabljene za ločevanje peptidov in proteinov17 ,18,19,20,21.Mešane stacionarne faze (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) so primerne za ločevanje peptidov in proteinov zaradi prisotnosti polarnih in nepolarnih skupin22,23,24,25,26,27,28. Podobno kažejo polarne interkalacijske stacionarne faze s kovalentno vezanimi polarnimi skupinami dobro moč ločevanja in edinstveno selektivnost za polarne in nepolarne analite, saj je ločevanje odvisno od interakcije med analitom in stacionarno fazo.Multimodalne interakcije 29, 30, 31, 32. Pred kratkim sta Zhang et al.30 je pripravil dodecil-terminirano poliaminsko stacionarno fazo in uspešno ločil ogljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene in več drugih analitov. Polarni interkalator ima polarne in nepolarne skupine, zato ga je mogoče uporabiti za ločevanje peptidov in proteinov, ki imajo tako hidrofobne kot hidrofilne dele. Polarne vgrajene kolone (npr. C18, vdelan v amide) kolone) so komercialno na voljo pod trgovskim imenom Ascentis Express RP-Amide columns, vendar se te kolone uporabljajo samo za analizo amina 33.
V trenutni študiji je bila pripravljena polarno vgrajena stacionarna faza (polistiren, vdelan v N-fenilmaleimid) in ovrednotena za ločevanje peptidov in tripsinskih digestov HSA. Stacionarna faza je bila pripravljena z uporabo naslednje strategije. Porozni delci silicijevega dioksida so bili pripravljeni v skladu s postopkom, podanim v naši prejšnji publikaciji, z nekaj spremembami protokola priprave. Razmerje sečnine, polietilen glikola (PEG), TMOS , je bila vodena ocetna kislina prilagojena za pripravo delcev silicijevega dioksida z veliko velikostjo por. Drugič, nov ligand, fenilmaleimid-metil vinil izocianat, je bil sintetiziran in uporabljen za derivatizacijo delcev silicijevega dioksida za pripravo polarno vgrajene stacionarne faze. Nastala stacionarna faza je bila pakirana v kolono iz nerjavečega jekla (100 × 1,8 mm id) z uporabo optimizirane polnilne sheme. Pakiranje kolone je podprto z mehanskimi vibracijami, da zagotovite, da se znotraj kolone oblikuje homogena postelja. Ocenite ločevanje napolnjene kolone mešanic peptidov, sestavljenih iz petih peptidov;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) in tripsin digest humanega serumskega albumina (HAS). Opaženo je bilo, da se peptidna zmes in tripsin digest HSA ločita z dobro ločljivostjo in učinkovitostjo. Učinkovitost ločevanja kolone PMP je bila primerjana z zmogljivostjo kolone Ascentis Express RP-Amide. opazili so, da so peptidi in proteini dobro ločeni in učinkoviti na koloni PMP, ki je bila učinkovitejša od kolone Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), sečnina, ocetna kislina, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil klorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijev klorid, sečnina, heksan metildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (B). PO), acetonitril stopnje HPLC (ACN), metanol, 2-propanol in aceton, kupljen pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA).
Zmes sečnine (8 g), polietilenglikola (8 g) in 8 mL 0,01 N ocetne kisline smo mešali 10 minut, nato pa ji dodali 24 mL TMOS v ledeno mrzlih pogojih. Reakcijsko zmes smo segrevali pri 40 °C 6 ur in nato pri 120 °C 8 ur v avtoklavu iz nerjavečega jekla. Vodo smo odlili in preostali material smo sušeno pri 70°C 12 ur. Posušeno mehko maso smo gladko zmleli v pečici in 12 ur kalcinirali pri 550°C. Pripravili smo tri serije in jih karakterizirali, da bi preverili ponovljivost velikosti delcev, velikosti por in površine.
S površinsko modifikacijo delcev silicijevega dioksida s predhodno sintetiziranim ligandom fenilmaleimid-metilvinilizocianatom (PCMP), ki mu je sledila radialna polimerizacija s stirenom, smo pripravili spojino, ki vsebuje polarne skupine.Stacionarna faza za agregate in polistirenske verige. Postopek priprave je opisan spodaj.
N-fenilmaleimid (200 mg) in metil vinil izocianat (100 mg) raztopimo v suhem toluenu in v reakcijsko bučko dodamo 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN), da pripravimo kopolimer fenilmaleimid-metil vinil izocianata (PMCP). Zmes segrevamo pri 60 °C 3 ure, filtriramo in sušimo v sušilniku pri 40 °C 3 ure.
Posušene delce silicijevega dioksida (2 g) smo dispergirali v suhem toluenu (100 ml), mešali in obdelovali z ultrazvokom v 500 ml bučki z okroglim dnom 10 minut. PMCP (10 mg) smo raztopili v toluenu in dodali po kapljicah v reakcijsko bučko preko kapalnega lija. Zmes smo refluktirali pri 100 °C 8 ur, filtrirali in izprali z acetonom ter posušili pri 60 °C 3 ure. Nato delce silicijevega dioksida, vezane na PMCP (100 g), raztopimo v toluenu (200 ml) in dodamo 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) v prisotnosti 100 µL dibutilkositrovega dilaurata kot katalizatorja. Zmes mešamo pri 50 °C 8 ur, filtriramo in sušimo pri 50 °C 3 ure. ure.
Stiren (1 mL), benzoil peroksid BPO (0,5 mL) in delci silicijevega dioksida, vezani na TEMPO-PMCP (1,5 g), so bili dispergirani v toluenu in prečiščeni z dušikom. Polimerizacija stirena je bila izvedena pri 100 °C 12 ur. Nastali produkt smo izprali z metanolom in sušili pri 60 °C čez noč. Prikazana je celotna reakcijska shema na sliki 1.
Vzorce smo razplinili pri 393 K 1 uro, da smo dosegli preostali tlak manj kot 10-3 Torr. Količina N2, adsorbiranega pri relativnem tlaku P/P0 = 0,99, je bila uporabljena za določitev skupnega volumna por. Morfologijo golih in z ligandi vezanih delcev silicijevega dioksida smo pregledali z vrstično elektronsko mikroskopijo (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonska). Posušeni vzorci ( goli silicijev dioksid in z ligandi vezani delci silicijevega dioksida) so bili nameščeni na aluminijasto kolono z lepilnim ogljikovim trakom. Na vzorce je bilo naneseno zlato z uporabo Q150T razpršilnega premaznika, na vzorce pa je bila nanesena 5 nm plast Au. To izboljša učinkovitost postopka z uporabo nizkih napetosti in zagotavlja fino zrnato, hladno razprševanje. Elementni analizator Thermo Electron (Waltham, MA, ZDA) Flash EA1112 uporabljen za elementarno analizo. Za pridobitev porazdelitve velikosti delcev je bil uporabljen analizator velikosti delcev Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Goli delci silicijevega dioksida in delci silicijevega dioksida, vezani na ligand (po 5 mg), so bili dispergirani v 5 ml izopropanola, sonicirani 10 minut, vrtinčeni 5 minut in postavljeni na optično mizo Mastersizerja. Thermo gravimetrična analiza je bila izvedena s hitrostjo 5 °C na minuto v temperaturnem območju od 30 do 800 °C.
Stekleni stebri z ozkim izvrtinom iz nerjavečega jekla dimenzij (100 × 1, 8 mm id) so bili pakirani z metodo pakiranja v gnojevki z uporabo istega postopka, uporabljenega v ref.31. Kolona iz nerjavečega jekla (obložena s steklom, notranji premer 100 × 1,8 mm) z izhodnim nastavkom, ki vsebuje 1 µm frito, je bila povezana s pakirnikom gnojevke (Alltech Deerfield, IL, ZDA). Pripravite suspenzijo stacionarne faze tako, da suspendirate 150 mg stacionarne faze v 1,2 ml metanola in jo pošljete v kolono za shranjevanje. Metanol je bil uporabljen tudi kot topilo za gnojevko. kot pogonsko topilo. Zaporedoma napolnite kolono s pritiskom 100 MP 10 minut, 80 MP 15 minut in 60 MP 30 minut. Med pakiranjem so bile uporabljene mehanske vibracije z dvema GC stresalnikoma kolone (Alltech, Deerfield, IL, ZDA), da se zagotovi enakomerno pakiranje kolone. Zaprite polnilo za gnojevko in počasi sprostite tlak, da preprečite poškodbe znotraj kolone. Odklopite kolono iz enote za pakiranje gnojevke in priključite drug priključek na dovod in na sistem LC, da preverite njegovo delovanje.
Črpalka LC (10AD Shimadzu, Japonska), injektor (Valco (ZDA) C14 W.05) s 50 nL injekcijsko zanko, membranski razplinjevalec (Shimadzu DGU-14A), kapilarno okno UV-VIS. Poseben detektor naprave µLC (UV-2075) in s steklom obložene mikrokolone. Uporabite zelo ozke in kratke povezovalne cevi, da zmanjšate učinek. razširitve pasov dodatne kolone. Po pakiranju so bile kapilare (50 μm id 365 in reducirne spojne kapilare (50 μm) nameščene na 1/16″ izhodu reducirnega spoja. Zbiranje podatkov in kromatografska obdelava sta bili opravljeni s programsko opremo Multichro 2000. Spremljanje pri 254 nm. Analiti so bili testirani na UV absorbanco. Kromatografske podatke je analiziral OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin iz človeškega seruma, liofiliziran prašek, ≥ 96 % (elektroforeza v agaroznem gelu) 3 mg, pomešan s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M sečnino (1 ml) in 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 ml). Raztopino smo mešali 10 minut in hranili v vodni kopeli pri 37 °C 6 ur, nato pa jo pogasili z 1 ml 0,1 % TFA. Raztopino filtrirajte in shranjujte pri temperaturi do 4 °C.
Ločevanje peptidnih zmesi in razkrojev tripsina HSA smo ovrednotili ločeno na kolonah PMP. Preverite ločevanje mešanice peptidov in razkroja tripsina HSA s kolono PMP in primerjajte rezultate s kolono Ascentis Express RP-Amide. Teoretično število plošč se izračuna na naslednji način:
SEM slike golih delcev silicijevega dioksida in z ligandi vezanih delcev silicijevega dioksida so prikazane na sl.2. Seme slike golih delcev silicijevega dioksida (a, b) kažejo, da so v nasprotju z našimi prejšnjimi študijami ti delci sferični, v katerih so delci podolgovate ali imajo nepravilno simetrijo.
Slike golih delcev silicijevega dioksida z vrstičnim elektronskim mikroskopom (A, B) in z ligandi vezanih delcev silicijevega dioksida (C, D).
Porazdelitev velikosti delcev golih delcev silicijevega dioksida in z ligandi vezanih delcev silicijevega dioksida je prikazana na sliki 3(A). Krivulje porazdelitve velikosti delcev na osnovi volumna so pokazale, da se je velikost delcev silicijevega dioksida po kemijski modifikaciji povečala (slika 3A). Podatki o porazdelitvi velikosti delcev silicijevega dioksida iz trenutne in prejšnje študije so primerjani v tabeli 1(A). Velikost delcev na osnovi volumna, d(0,5), P MP je 3,36 μm v primerjavi z našo prejšnjo študijo z vrednostjo ad(0,5) 3,05 μm (delci silicijevega dioksida, vezanega na polistiren)34. Ta serija je imela ožjo porazdelitev velikosti delcev v primerjavi z našo prejšnjo študijo zaradi različnih razmerij PEG, sečnine, TMOS in ocetne kisline v reakcijski mešanici. Velikost delcev faze PMP je nekoliko večja od velikosti delcev silicijevega dioksida, vezanega na polistiren. fazo delcev, ki smo jo predhodno preučevali. To pomeni, da je površinska funkcionalizacija delcev silicijevega dioksida s stirenom le nanesla plast polistirena (0,97 µm) na površino silicijevega dioksida, medtem ko je bila v fazi PMP debelina plasti 1,38 µm.
Porazdelitev velikosti delcev (A) in porazdelitev velikosti por (B) golih delcev silicijevega dioksida in z ligandi vezanih delcev silicijevega dioksida.
Velikost por, volumen por in površina delcev silicijevega dioksida trenutne študije so podani v tabeli 1(B). Profili PSD golih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligand, so prikazani na sliki 3(B). Rezultati so primerljivi z našo prejšnjo študijo. 69 po kemični modifikaciji, kot je prikazano v tabeli 1(B), sprememba krivulje pa je prikazana na sliki 3(B). Podobno se je volumen por delcev silicijevega dioksida po kemični modifikaciji zmanjšal z 0,67 na 0,58 cm3/g. Specifična površina trenutno raziskanih delcev silicijevega dioksida je 116 m2/g, kar je primerljivo z našo prejšnjo študijo (124 m2/g). kot je prikazano v tabeli 1(B), se je tudi površina (m2/g) delcev silicijevega dioksida po kemični modifikaciji zmanjšala s 116 m2/g na 105 m2/g.
Rezultati elementne analize stacionarne faze so prikazani v tabeli 2. Obremenitev z ogljikom trenutne stacionarne faze je 6,35 %, kar je nižje od obremenitve ogljika naše prejšnje študije (delci silicijevega dioksida, vezani s polistirenom, 7,93 %35 oziroma 10,21 %) 42. Obremenitev ogljika trenutne stacionarne faze je nizka, ker so pri pripravi trenutne SP poleg stirena nekateri polarni ligandi, kot je npr. Uporabljena sta bila fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PCMP) in 4-hidroksi-TEMPO. Težni odstotek dušika trenutne stacionarne faze je 2,21 % v primerjavi z 0,1735 oziroma 0,85 masnega % dušika v prejšnjih študijah. To pomeni, da je masni % dušika višji v trenutni stacionarni fazi zaradi fenilmaleimida. Podobno so obremenitve ogljika v izdelkih ( 4) in (5) sta bila 2,7 % oziroma 2,9 %, medtem ko je bila obremenitev z ogljikom končnega izdelka (6) 6,35 %, kot je prikazano v tabeli 2. Izguba teže je bila preverjena s stacionarno fazo PMP, krivulja TGA pa je prikazana na sliki 4. Krivulja TGA kaže izgubo teže 8,6 %, kar se dobro ujema z obremenitvijo ogljika (6,35 %), ker ligandi ne vsebujejo le C, ampak tudi N, O in H.
Fenilmaleimid-metilvinilizocianatni ligand je bil izbran za površinsko modifikacijo delcev silicijevega dioksida, ker ima polarne fenilmaleimidne skupine in vinilizocianatne skupine. Vinil izocianatne skupine lahko nadalje reagirajo s stirenom s polimerizacijo živih radikalov. Drugi razlog je vstaviti skupino, ki ima zmerno interakcijo z analitom in nima močne elektrostatične interakcije med analitom in stacionarno fazo, saj p henilmaleimidni del nima navideznega naboja pri normalnem pH. Polarnost stacionarne faze je mogoče nadzorovati z optimalno količino stirena in reakcijskim časom polimerizacije prostih radikalov. Zadnja stopnja reakcije (polimerizacija prostih radikalov) je kritična in lahko spremeni polarnost stacionarne faze. Izvedena je bila analiza elementov, da se preveri obremenitev teh stacionarnih faz z ogljikom. Ugotovljeno je bilo, da se s povečanjem količine stirena in reakcijskega časa poveča obremenitev ogljika stacionarne faze in obratno. SP, pripravljeni z različnimi koncentracijami stirena, imajo različne obremenitve ogljika. Ponovno naložite te stacionarne faze v kolone iz nerjavečega jekla in preverite njihovo kromatografsko delovanje (selektivnost, ločljivost, vrednost N itd.). Na podlagi teh poskusov je bila izbrana optimizirana formulacija za pripravo stacionarne faze PMP, da se zagotovi nadzorovana polarnost in dobro zadrževanje analita.
Pet mešanic peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin enkefalin) je bilo ovrednotenih tudi z uporabo PMP kolone z uporabo mobilne faze;60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1 % TFA) pri pretoku 80 μL/min. Pri optimalnih pogojih eluiranja je teoretično število plošč (N) na kolono (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 plošč/m²). Tabela 3 podaja vrednosti N za tri kolone PMP in kromo togrami so prikazani na sliki 5A. Hitra analiza na koloni PMP pri visoki hitrosti pretoka (700 μL/min), pet peptidov je bilo eluiranih v eni minuti, vrednosti N so bile zelo dobre, 13.500 ± 330 na kolono (100 × 1,8 mm id), ustreza 135.000 ploščam/m (slika 5B). Tri enako velike kolone (100 × 1,8 mm id) smo napolnili s tremi različnimi serijami stacionarne faze PMP, da preverimo ponovljivost. Koncentracijo analita za vsako kolono smo zabeležili z uporabo optimalnih pogojev eluiranja in števila teoretičnih plošč N ter retencijskega časa za ločevanje iste preskusne mešanice na vsaki koloni. Podatki o ponovljivosti za kolone PMP so prikazani v tabeli 4. Ponovljivost kolone PMP dobro korelira z zelo nizkimi vrednostmi %RSD, kot je prikazano v tabeli 3 .
Ločevanje mešanice peptidov na koloni PMP (B) in koloni Ascentis Express RP-Amide (A);mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), mere kolone PMP (100 × 1,8 mm id);analitični Vrstni red elucije spojin: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) in 5 (levcinska kislina enkefalin)).
Kolona PMP (100 × 1,8 mm notranjega premera) je bila ovrednotena za ločevanje triptičnih digestov humanega serumskega albumina v tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti. Kromatogram na sliki 6 kaže, da je vzorec dobro ločen in je ločljivost zelo dobra. HSA digestije so analizirali s hitrostjo pretoka 100 µL/min, mobilno fazo 70/30 acetonitril/voda in 0,1 % TFA. Kot je prikazano v kromatogramu (slika 6) je bila razgradnja HSA razdeljena na 17 vrhov, ki ustrezajo 17 peptidom. Učinkovitost ločevanja vsakega vrha v razgradnji HSA je bila izračunana in vrednosti so podane v tabeli 5.
Triptični digest HSA (100 × 1,8 mm id) je bil ločen na koloni PMP;hitrost pretoka (100 µL/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda z 0,1 % TFA.
kjer je L dolžina kolone, η je viskoznost mobilne faze, ΔP je protitlak kolone in u je linearna hitrost mobilne faze. Prepustnost kolone PMP je bila 2,5 × 10-14 m2, pretok je bil 25 μL/min in uporabljen je bil 60/40 v/v ACN/voda. Prepustnost kolone PMP (100 × 1,8 mm id ) je bila podobna tisti iz naše prejšnje študije Ref.34. Prepustnost kolone, polnjene s površinsko poroznimi delci, je: 1,7 × 10-15 za delce velikosti 1,3 μm, 3,1 × 10-15 za delce velikosti 1,7 μm, 5,2 × 10-15 in 2,5 × 10-14 m2 za delce velikosti 2,6 μm Za 5 μm delcev 43. Zato je prepustnost faze PMP podobna prepustnosti 5 μm delcev jedro-lupina.
kjer je Wx teža kolone, napolnjene s kloroformom, Wy je teža kolone, napolnjene z metanolom, in ρ je gostota topila. Gostote metanola (ρ = 0,7866) in kloroforma (ρ = 1,484). Skupna poroznost kolon SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 in C18-U rea kolone 31, ki smo ju predhodno proučevali, sta bila 0,63 oziroma 0,55. To pomeni, da prisotnost sečninskih ligandov zmanjša prepustnost stacionarne faze. Po drugi strani pa je skupna poroznost kolone PMP (100 × 1,8 mm id) 0,60. Prepustnost kolon PMP je nižja kot pri kolonah, polnjenih z delci silicijevega dioksida, vezanimi na C18, ker v tipu C18 v stacionarnih fazah so ligandi C18 pritrjeni na delce silicijevega dioksida kot linearne verige, medtem ko se v stacionarnih fazah polistirenskega tipa okoli njih oblikuje razmeroma debela polimerna plast. V tipičnem poskusu se poroznost kolone izračuna kot:
Slika 7A, B prikazujeta kolono PMP (100 × 1,8 mm notranjega premera) in kolono Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm notranjega premera) z enakimi pogoji eluiranja (tj. 60/40 ACN/H2O in 0,1 % TFA).) parcele van Deemter.Izbrane mešanice peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) so bile pripravljene v 20 µL/ Najmanjša hitrost pretoka za obe koloni je 800 µL/min. Najmanjše vrednosti HETP pri optimalni hitrosti pretoka (80 µL/min) za kolono PMP in kolona Ascentis Express RP-Amide je bila 2,6 µm oziroma 3,9 µm. Vrednosti HETP kažejo, da je učinkovitost ločevanja kolone PMP (100 × 1,8 mm id) veliko boljša od komercialno dostopne kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Van Deemterjev graf na sliki 7(A) kaže, da zmanjšanje vrednosti N z povečanje pretoka ni pomembno v primerjavi z našo prejšnjo študijo. Večja učinkovitost ločevanja kolone PMP (100 × 1,8 mm id) v primerjavi s kolono Ascentis Express RP-Amide temelji na izboljšavah v obliki delcev, velikosti in kompleksnih postopkih pakiranja kolone, uporabljenih v trenutnem delu34.
(A) van Deemterjev graf (HETP v primerjavi z linearno hitrostjo mobilne faze), dobljen s kolono PMP (100 × 1,8 mm premera) v 60/40 ACN/H2O z 0,1 % TFA. (B) van Deemterjev graf (HETP v primerjavi z linearno hitrostjo mobilne faze), dobljen z uporabo kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm premera) v 60/4 0 ACN/H2O z 0,1 % TFA.
Pripravljena je bila polistirenska stacionarna faza z vgrajenim polistirenom, ki je bila pripravljena in ovrednotena za ločevanje sintetičnih peptidnih zmesi in tripsinskih pretvorb humanega serumskega albumina (HAS) v tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti. Kromatografska učinkovitost kolon PMP za peptidne zmesi je odlična glede učinkovitosti in ločljivosti ločevanja. Izboljšana učinkovitost ločevanja kolon PMP je posledica različnih razlogov, kot sta velikost delcev in velikost por si delci lica, nadzorovana sinteza stacionarne faze in kompleksno pakiranje kolone. Poleg visoke učinkovitosti ločevanja je še ena prednost te stacionarne faze nizek protitlak kolone pri visokih stopnjah pretoka. Kolone PMP izkazujejo dobro ponovljivost in se lahko uporabljajo za analizo peptidnih mešanic in razgradnjo različnih proteinov s tripsinom. To kolono nameravamo uporabiti za ločevanje naravnih proizvodov, bioaktivnih spojin iz zdravilnih rastlin in izvlečkov gliv v tekoči kromi tografija. V prihodnosti bodo kolone PMP ovrednotene tudi za ločevanje proteinov in monoklonskih protiteles.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Raziskave sistemov za ločevanje peptidov s kromatografijo z reverzno fazo, I. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone.J.Kromatografija.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Izboljšani aktivni peptidi, zasnovani za zdravljenje nalezljivih bolezni. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg.odkritje zdravil.15 (1-2) danes, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredna proteomska tekočinska kromatografija.J.Kromatografija.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Napredna tekočinska kromatografija-masna spektrometrija omogoča vključitev široko usmerjene metabolomike in proteomike.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vloga UHPLC pri razvoju zdravil.J.Sep. Sci. 30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki ultravisokotlačne tekočinske kromatografije za hitro ločevanje.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Uporaba tekočinske kromatografije ultra visoke ločljivosti pri razvoju zdravil.J.Kromatografija.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitni makroporozni hidrogeli, pripravljeni iz emulzij olja v vodi z visoko notranjo fazo za učinkovito čiščenje enterovirusov. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki.J.Kromatografija. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Nastajajoči trendi v ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov z reverzno fazno tekočinsko kromatografijo: teorija in aplikacije.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo sistema RP-RP-HPLC z uporabo različnih vrednosti pH v prvi in ​​drugi dimenziji ločevanja.J.Sep. Sci. 28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Raziskane so bile značilnosti prenosa mase in kinetične lastnosti visokoučinkovitih kromatografskih kolon, polnjenih s C18 sub-2 μm popolnoma in površinsko poroznimi delci. J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nedavni trendi in analitični izzivi pri izolaciji, identifikaciji in validaciji rastlinskih bioaktivnih peptidov.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Proteomska pokrajina kraljestva življenja. Nature 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Nadaljnja obdelava terapevtskih peptidov s preparativno tekočinsko kromatografijo. Molecule (Basel, Švica) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba pri biopolimerih. J.Kromatografija. A 1218 (49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandi za proteinsko kromatografijo v mešanem načinu: princip, karakterizacija in zasnova. J.Biotehnologija.144(1), 3-11 (2009).