Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo posodobljenega brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev stalne podpore spletno mesto prikazujemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati. Za premikanje med tremi diapozitivi hkrati uporabite gumba Prejšnji in Naslednji ali pa drsnike na koncu za premikanje med tremi diapozitivi hkrati.
Porozni delci silicijevega dioksida so bili pripravljeni s sol-gel metodo z nekaj modifikacijami za pridobitev delcev s širokimi porami. Ti delci so bili derivatizirani z N-fenilmaleimid-metilvinil izocianatom (PMI) in stirenom s polimerizacijo z reverznim prenosom verige in fragmentacijo (RAFT), da so nastali poliamidi, interkalirani z N-fenilmaleimidom. Stacionarna faza stiren (PMP). Ozke kolone iz nerjavečega jekla (notranji premer 100 × 1,8 mm) so bile polnjene z gnojevko. Kromatografska učinkovitost PMP kolone je bila ocenjena za ločevanje mešanice sintetičnih peptidov, ki jo sestavljajo pet peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokislinski enkefalin) in triptični hidrolizat humanega serumskega albumina (HAS). V optimalnih pogojih eluiranja je teoretično število plošč z mešanico peptidov doseglo 280.000 plošč/m². Pri primerjavi ločevalne učinkovitosti razvite kolone s komercialno kolono Ascentis Express RP-Amide je bilo ugotovljeno, da je bila ločevalna učinkovitost kolone PMP boljša od komercialne kolone glede na učinkovitost ločevanja in ločljivost.
Biofarmacevtska industrija je v zadnjih letih postala rastoči svetovni trg z znatnim povečanjem tržnega deleža. Z eksplozivno rastjo biofarmacevtske industrije1,2,3 obstaja velika potreba po analizi peptidov in beljakovin. Poleg ciljnega peptida med sintezo peptidov nastajajo tudi različne nečistoče, zato je za doseganje želene čistosti peptida potrebno kromatografsko čiščenje. Analiza in karakterizacija beljakovin v telesnih tekočinah, tkivih in celicah je izjemno zahtevna naloga zaradi velikega števila potencialno zaznavnih vrst, prisotnih v enem samem vzorcu. Čeprav je masna spektrometrija učinkovito orodje za sekvenciranje peptidov in beljakovin, bo ločevanje nezadovoljivo, če se taki vzorci neposredno vnesejo v masni spektrometer. To težavo je mogoče rešiti z izvedbo tekočinske kromatografije (LC) pred MS analizo, kar bo zmanjšalo količino analitov, ki v določenem času vstopijo v masni spektrometer4,5,6. Poleg tega se lahko analiti med ločevanjem v tekoči fazi koncentrirajo v ozkem območju, s čimer se ti analiti koncentrirajo in poveča občutljivost MS detekcije. Tekočinska kromatografija (LC) je v zadnjem desetletju znatno napredovala in postala široko uporabljena metoda za proteomsko analizo7,8,9,10.
Tekočinska kromatografija z reverzno fazo (RP-LC) se pogosto uporablja za čiščenje in ločevanje mešanic peptidov z uporabo oktadecil-modificiranega silicijevega dioksida (ODS) kot stacionarne faze11,12,13. Vendar pa zaradi svoje kompleksne strukture in amfoterne narave14,15 stacionarne faze RP ne morejo zagotoviti zadovoljivega ločevanja peptidov in beljakovin. Zato analiza peptidov in beljakovin s polarnimi in nepolarnimi fragmenti zahteva posebej zasnovane stacionarne faze za interakcijo in zadrževanje teh analitov16. Mešana kromatografija, ki ponuja multimodalne interakcije, je lahko alternativa RP-LC za ločevanje peptidov, beljakovin in drugih kompleksnih mešanic. Pripravljenih je bilo več stacionarnih faz mešanega tipa in kolone, napolnjene s temi stacionarnimi fazami, so bile uporabljene za ločevanje peptidov in beljakovin17,18,19,20,21. Zaradi prisotnosti polarnih in nepolarnih skupin so za ločevanje peptidov in beljakovin primerne stacionarne faze mešanega tipa (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC)22,23,24,25,26,27,28. , polarne interkalirane stacionarne faze s kovalentno vezanimi polarnimi skupinami kažejo dobre ločevalne sposobnosti in edinstveno selektivnost za polarne in nepolarne analite, ker je ločevanje odvisno od interakcije med analitom in stacionarno fazo. Multimodalne interakcije 29,30,31,32. Nedavno so Zhang in sod. 30 pridobili behenilno terminirane stacionarne faze poliaminov in uspešno ločili ogljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene in nekatere druge analite. Polarno vgrajeni stacionarni material ima tako polarne kot nepolarne skupine, zato ga je mogoče uporabiti za ločevanje peptidov in beljakovin na hidrofobne in hidrofilne dele. Polarne linijske kolone (npr. kolone C18 z linijskim amidom) so na voljo pod trgovskim imenom kolone Ascentis Express RP-Amide, vendar so bile te kolone uporabljene le za analizo amina 33.
V tej študiji je bila pripravljena polarno vgrajena stacionarna faza (N-fenilmaleimid, vgrajeni polistiren) in ocenjena za ločevanje peptidov in cepitev tripsinskega HSA. Za pripravo stacionarne faze je bila uporabljena naslednja strategija. Porozni delci silicijevega dioksida so bili pripravljeni po postopkih, opisanih v naših prejšnjih publikacijah, z nekaj spremembami v shemah priprave 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Razmerja sečnine, polietilen glikola (PEG), TMOS in vodno-ocetne kisline so bila prilagojena, da so dobili delce silicijevega dioksida z velikimi porami. Drugič, sintetiziran je bil nov ligand fenilmaleimid-metilvinil izocianata in njegovi derivatizirani delci silicijevega dioksida so bili uporabljeni za pripravo polarno vgrajenih stacionarnih faz. Dobljena stacionarna faza je bila vložena v kolono iz nerjavečega jekla (notranji premer 100 × 1,8 mm) po optimizirani shemi pakiranja. Pakiranje kolone je podprto z mehanskim tresljajem, da se zagotovi enakomerna plast znotraj kolone. Napolnjena kolona je bila ocenjena za ločevanje mešanice peptidov, ki jo sestavlja pet peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin-enkefalin peptid) in triptinskih hidrolizatov humanega serumskega albumina (HSA). Ugotovljeno je bilo, da se mešanica peptidov in triptični prebav HSA ločita z dobro ločljivostjo in učinkovitostjo. Učinkovitost ločevanja kolone PMP je bila primerjana z učinkovitostjo kolone Ascentis Express RP-Amide. Ugotovljeno je bilo, da imajo peptidi in proteini dobro ločljivost in visoko učinkovitost ločevanja na koloni PMP, učinkovitost ločevanja kolone PMP pa je višja od učinkovitosti kolone Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), sečnina, ocetna kislina, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijev klorid, sečnina, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) za HPLC, metanol, 2-propanol in aceton. Podjetje Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, ZDA).
Zmes sečnine (8 g), polietilen glikola (8 g) in 8 ml 0,01 N. ocetne kisline smo mešali 10 minut, nato pa smo ji ob hlajenju z ledom dodali 24 ml TMOS. Reakcijsko zmes smo segrevali 6 ur pri 40 °C in nato 8 ur pri 120 °C v avtoklavu iz nerjavečega jekla. Vodo smo dekantirali in ostanek sušili 12 ur pri 70 °C. Posušene mehke bloke smo gladko zmleli in kalcinirali v pečici pri 550 °C 12 ur. Pripravili in karakterizirali smo tri serije za preizkus ponovljivosti velikosti delcev, velikosti por in površine.
Polarna skupina in stacionarna faza za polistirenske verige. Postopek priprave je opisan spodaj.
N-fenilmaleimid (200 mg) in metil vinil izocianat (100 mg) smo raztopili v brezvodnem toluenu, nato pa smo v reakcijsko bučko dodali 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN), da smo dobili kopolimer fenilmaleimida in metil vinil izocianata (PMCP). ) Zmes smo segrevali pri 60 °C 3 ure, filtrirali in sušili v pečici pri 40 °C 3 ure.
Posušene delce silicijevega dioksida (2 g) smo dispergirali v suhem toluenu (100 ml), mešali in sonificirali 10 minut v 500 ml okrogli bučki. PMCP (10 mg) smo raztopili v toluenu in po kapljicah dodajali v reakcijsko bučko preko lijaka za dodajanje. Zmes smo 8 ur refluksirali pri 100 °C, filtrirali, sprali z acetonom in sušili pri 60 °C 3 ure. Nato smo delce silicijevega dioksida, povezane s PMCP (100 g), raztopili v toluenu (200 ml) in ji dodali 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) v prisotnosti 100 μl dibutilkositrovega dilaurata kot katalizatorja. Zmes smo mešali pri 50 °C 8 ur, filtrirali in sušili pri 50 °C 3 ure.
Stiren (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) in delci silicijevega dioksida, pritrjeni na TEMPO-PMCP (1,5 g), so bili dispergirani v toluenu in prepihani z dušikom. Polimerizacija stirena je bila izvedena pri 100 °C 12 ur. Nastali produkt je bil spran z metanolom in sušen čez noč pri 60 °C. Splošna shema reakcije je prikazana na sliki ena.
Vzorce smo razplinjali pri 393 K 1 uro, dokler ni bil dosežen preostali tlak manjši od 10–3 Torr. Za določitev celotnega volumna por smo uporabili količino N2, adsorbiranega pri relativnem tlaku P/P0 = 0,99. Morfologijo čistih in na ligande vezanih delcev silicijevega dioksida smo pregledali z vrstičnim elektronskim mikroskopom (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonska). Suhe vzorce (čisti silicijev dioksid in delci silicijevega dioksida, vezani na ligande) smo z ogljikovim trakom namestili na aluminijaste palice. Zlato smo na vzorec nanesli z napravo za razprševanje Q150T, na vzorec pa smo nanesli 5 nm debelo plast Au. To izboljša učinkovitost nizkonapetostnega postopka in zagotavlja fino hladno razprševanje. Elementarna analiza je bila izvedena z analizatorjem elementarne sestave Thermo Electron (Waltham, MA, ZDA) Flash EA1112. Za določitev porazdelitve velikosti delcev smo uporabili analizator velikosti delcev Malvern (Worcestershire, Združeno kraljestvo) Mastersizer 2000. Neprevlečeni delci silicijevega dioksida in delci silicijevega dioksida, vezani na ligande (vsak po 5 mg), so bili dispergirani v 5 ml izopropanola, sonificirani 10 minut, mešani 5 minut in postavljeni na optično mizo Mastersizer. Termogravimetrična analiza se izvaja s hitrostjo 5 °C na minuto v temperaturnem območju od 30 do 800 °C.
Ozke kolone iz nerjavečega jekla z obloženimi steklenimi vlakni in dimenzijami (ID 100 × 1,8 mm) so bile polnjene z metodo polnjenja z brozgo po istem postopku kot v referenci 31. Kolona iz nerjavečega jekla (obložena s steklenimi vlakni, ID 100 × 1,8 mm) in izhod, ki je vseboval frito velikosti 1 µm, je bila priključena na stroj za pakiranje z brozgo (Alltech Deerfield, IL, ZDA). Suspenzijo stacionarne faze pripravite tako, da 150 mg stacionarne faze suspendirate v 1,2 ml metanola in jo dovedete v kolono z rezervoarjem. Kot topilo za brozgo in kontrolno topilo je bil uporabljen metanol. Kolono polnimo z zaporednim pritiskom 100 MP 10 minut, 80 MP 15 minut in 60 MP 30 minut. V postopku polnjenja sta bila uporabljena dva vibratorja za plinsko kromatografijo (Alltech, Deerfield, IL, ZDA) za mehansko vibriranje, da se zagotovi enakomerno pakiranje kolone. Zaprite pakirnik z brozgo in počasi sproščajte tlak, da preprečite poškodbo niza. Kolono so odklopili od šobe za gnojevko, na vhod pa so priključili drug priključek in ga priključili na sistem LC, da bi preizkusili njegovo delovanje.
MLC po meri je bil zgrajen z uporabo LC črpalke (10AD Shimadzu, Japonska), vzorčevalnika s 50 nL injekcijsko zanko (Valco (ZDA) C14 W.05), membranskega razplinjevalnika (Shimadzu DGU-14A) in UV-VIS kapilarnega okna. Detektorska naprava (UV-2075) in emajlirana mikrokolona. Za zmanjšanje učinka dodatnega širjenja kolone uporabite zelo ozke in kratke povezovalne cevi. Po polnjenju kolone namestite kapilaro (50 µm notraje 365) na izhod redukcijskega spoja 1/16″ in namestite kapilaro (50 µm) redukcijskega spoja. Zbiranje podatkov in obdelava kromatograma se izvedeta s programsko opremo Multichro 2000. Pri 254 nm je bila UV absorbanca analitov spremljana pri 0. Kromatografski podatki so bili analizirani z uporabo OriginPro8 (Northampton, MA).
Človeški serumski albumin, liofiliziran prašek, ≥ 96 % (elektroforeza v agaroznem gelu) 3 mg, zmešan s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M sečnino (1 ml) in 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 ml). Raztopino smo mešali 10 minut in jo 6 ur hranili v vodni kopeli pri 37 °C, nato pa smo reakcijo pogasili z 1 ml 0,1 % TFA. Raztopino smo filtrirali in shranili pri temperaturi pod 4 °C.
Ločitev mešanice peptidov in tripsinsko prebavljenega HSA na PMP koloni je bila ocenjena ločeno. Preverite tripsinsko hidrolizo mešanice peptidov in HSA, ločenih s PMP kolono, in primerjajte rezultate z Ascentis Express RP-Amide kolono. Število teoretičnih plošč se izračuna z naslednjo enačbo:
SEM slike čistih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligand, so prikazane na sliki 2. SEM slike čistih delcev silicijevega dioksida (A, B) kažejo kroglasto obliko, v kateri so delci podolgovati ali imajo nepravilno simetrijo v primerjavi z našimi prejšnjimi študijami. Površina delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligand (C, D), je bolj gladka kot površina čistih delcev silicijevega dioksida, kar je lahko posledica polistirenskih verig, ki prekrivajo površino delcev silicijevega dioksida.
Vrstične elektronske mikrografije čistih delcev silicijevega dioksida (A, B) in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande (C, D).
Porazdelitev velikosti delcev čistega silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande, je prikazana na sliki 2.3(A). Krivulje porazdelitve velikosti volumetričnih delcev so pokazale, da se je velikost delcev silicijevega dioksida po kemijski modifikaciji povečala (slika 3A). Podatki o porazdelitvi velikosti delcev silicijevega dioksida iz trenutne in prejšnje študije so primerjani v tabeli 1(A). Volumetrična velikost delcev d(0,5) PMP je bila 3,36 µm v primerjavi z vrednostjo ad(0,5) 3,05 µm v naši prejšnji študiji (delci silicijevega dioksida, vezani na polistiren)34. Zaradi spremembe razmerja PEG, sečnine, TMOS in ocetne kisline v reakcijski mešanici je bila porazdelitev velikosti delcev te serije ožja v primerjavi z našo prejšnjo študijo. Velikost delcev faze PMP je nekoliko večja od velikosti delcev faze silicijevega dioksida, vezanega na polistiren, ki smo jo preučevali prej. To pomeni, da je površinska funkcionalizacija delcev silicijevega dioksida s stirenom na površino silicijevega dioksida nanesla le polistirensko plast (0,97 µm), medtem ko je bila v fazi PMP debelina plasti 1,38 µm.
Porazdelitev velikosti delcev (A) in porazdelitev velikosti por (B) čistih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande.
Velikost por, volumen por in površina delcev silicijevega dioksida, uporabljenih v tej študiji, so prikazani v tabeli 1 (B). Profili PSD čistih delcev silicijevega dioksida in delcev silicijevega dioksida, vezanih na ligande, so prikazani na sliki 3 (B). Rezultati so bili primerljivi z našo prejšnjo študijo34. Velikosti por čistih in ligandom vezanih delcev silicijevega dioksida so bile 310 Å oziroma 241 Å, kar kaže, da se je velikost por po kemični modifikaciji zmanjšala za 69 Å, kot je prikazano v tabeli 1 (B), krivulja premika pa je prikazana na sliki. Specifična površina delcev silicijevega dioksida v trenutni študiji je 116 m2/g, kar je primerljivo z našo prejšnjo študijo (124 m2/g). Kot je prikazano v tabeli 1 (B), se je površina (m2/g) delcev silicijevega dioksida po kemični modifikaciji prav tako zmanjšala s 116 m2/g na 105 m2/g.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze so predstavljeni v tabeli 2. Vsebnost ogljika v trenutni stacionarni fazi je 6,35 %, kar je manj kot v naši prejšnji študiji (delci silicijevega dioksida, povezani s polistirenom, 7,93 %35 oziroma 10,21 %)42. Vsebnost ogljika v trenutni stacionarni fazi je nižja, saj so bili pri pripravi SP poleg stirena uporabljeni tudi nekateri polarni ligandi, kot sta fenilmaleimid metil vinil izocianat (PCMP) in 4-hidroksi-TEMPO. Masni odstotek dušika v trenutni stacionarni fazi je 2,21 % v primerjavi z 0,1735 in 0,85 % v prejšnjih študijah42. To pomeni, da ima trenutna stacionarna faza visok masni odstotek dušika zaradi fenilmaleimida. Podobno imata produkta (4) in (5) vsebnost ogljika 2,7 % oziroma 2,9 %, medtem ko ima končni produkt (6) vsebnost ogljika 6,35 %, kot je prikazano v tabeli 2. Za testiranje izgube teže je bila uporabljena termogravimetrična analiza (TGA) na stacionarni fazi PMP, krivulja TGA pa je prikazana na sliki 4. Krivulja TGA kaže izgubo teže 8,6 %, kar se dobro ujema z vsebnostjo ogljika (6,35 %), saj ligandi ne vsebujejo le C, temveč tudi N, O in H.
Za modifikacijo površine delcev silicijevega dioksida je bil izbran ligand fenilmaleimid-metilvinil izocianat zaradi svojih polarnih fenilmaleimidnih in vinilizocianatnih skupin. Vinil izocianatne skupine lahko nadalje reagirajo s stirenom z živo radikalno polimerizacijo. Drugi razlog je vstavitev skupine, ki ima zmerne interakcije z analitom in nima močnih elektrostatičnih interakcij med analitom in stacionarno fazo, saj fenilmaleimidni del pri normalnem pH nima virtualnega naboja. Polarnost stacionarne faze je mogoče nadzorovati z optimalno količino stirena in reakcijskim časom polimerizacije prostih radikalov. Zadnji korak reakcije (polimerizacija prostih radikalov) je ključnega pomena, saj spremeni polarnost stacionarne faze. Izvedena je bila elementarna analiza za preverjanje vsebnosti ogljika v teh stacionarnih fazah. Ugotovljeno je bilo, da povečanje količine stirena in reakcijskega časa poveča vsebnost ogljika v stacionarni fazi in obratno. SP, pripravljeni z različnimi koncentracijami stirena, imajo različno količino ogljika. Podobno so bile te stacionarne faze nameščene na kolone iz nerjavečega jekla in preverjene so bile njihove kromatografske značilnosti (selektivnost, ločljivost, vrednost N itd.). Na podlagi teh poskusov je bila izbrana optimizirana sestava za pripravo stacionarne faze PMP, ki zagotavlja nadzorovano polarnost in dobro zadrževanje analita.
PMP kolona je bila ocenjena tudi za analizo petih mešanic peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, levcin-enkefalin) z uporabo kapacitete mobilne faze 60/40 (v/v) ACN/voda (0,1 % TFA) pri pretoku 80 µl/min. Pri optimalnih pogojih elucije (200.000 plošč/m²) je število teoretičnih plošč (N) na kolono (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. Vrednosti N za tri PMP kolone so prikazane v tabeli 3, kromatogrami pa so prikazani na sliki 5A. Hitra analiza pri visoki hitrosti pretoka (700 µl/min) na koloni PMP, pet peptidov eluiranih v eni minuti, odlična vrednost N 13.500 ± 330 na kolono (premer 100 x 1,8 mm), kar ustreza 135.000 ploščam/m (slika 5B). Tri kolone enake velikosti (notranji premer 100 x 1,8 mm) so bile napolnjene s tremi različnimi serijami stacionarne faze PMP za preizkus ponovljivosti. Analiti so bili zabeleženi za vsako kolono z ločevanjem iste testne mešanice na vsaki koloni z uporabo optimalnih pogojev elucije, števila teoretičnih plošč N in retencijskega časa. Podatki o ponovljivosti za kolone PMP so prikazani v tabeli 4. Ponovljivost kolone PMP se je dobro ujemala z zelo nizkimi vrednostmi %RSD, kot je prikazano v tabeli 3.
Ločevanje peptidnih zmesi na koloni PMP (B) in koloni Ascentis Express RP-Amide (A), mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), dimenzije kolone PMP (100 x 1,8 mm notranji premer), analiza. Vrstni red eluiranja spojin: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) in 5 (levcinska kislina enkefalin).
Za ločevanje tripsinskega hidrolizata humanega serumskega albumina s HPLC je bila ovrednotena PMP kolona (notranji premer 100 x 1,8 mm). Kromatogram na sliki 6 kaže, da so vzorci dobro ločeni z zelo dobro ločljivostjo. Raztopine HSA so bile analizirane s pretokom 100 μl/min, mobilno fazo acetonitril/voda 70/30 in 0,1 % TFA. Cepitev HSA je bila razdeljena na 17 vrhov, kot je prikazano na kromatogramu (slika 6), kar ustreza 17 peptidom. Izračunane so bile učinkovitosti ločevanja posameznih vrhov od hidrolizata HSA, vrednosti pa so prikazane v tabeli 5.
Triptične hidrolizate HSA smo ločili na koloni PMP (notranji premer 100 x 1,8 mm), pretočna hitrost (100 μl/min), mobilna faza acetonitril/voda 60/40 in 0,1 % TFA.
kjer je L dolžina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP protitlak kolone in u linearna hitrost mobilne faze. Prepustnost kolone PMP je bila 2,5 × 10–14 m2, pretok 25 µl/min, uporabljen je bil ACN/voda v razmerju 60/40 v/v. Prepustnost kolone PMP (ID 100 × 1,8 mm) je bila podobna kot v naši prejšnji študiji Ref.34. Prepustnost kolone, napolnjene s površinsko poroznimi delci, je 1,7 × 10,6 µm, za delce velikosti 5 µm pa 2,5 × 10-14 m243. Zato je prepustnost faze PMP podobna prepustnosti delcev z jedrom in lupino velikosti 5 μm.
kjer je Wx masa kolone, napolnjene s kloroformom, Wy masa kolone, napolnjene z metanolom, in ρ gostota topila. Gostota metanola (ρ = 0,7866) in kloroforma (ρ = 1,484). Skupna poroznost kolone z delci silicijevega dioksida-C18 (100 × 1,8 mm notranji premer)34 in naše prej preučene kolone C18-sečnina31 je bila 0,63 oziroma 0,55. To pomeni, da prisotnost ligandov sečnine zmanjša prepustnost stacionarne faze. Po drugi strani pa je skupna poroznost kolone PMP (notranji premer 100 × 1,8 mm) 0,60. Kolone PMP so manj prepustne kot kolone, napolnjene z delci silicijevega dioksida, vezanimi na C18, ker so v stacionarnih fazah tipa C18 ligandi C18 vezani na delce silicijevega dioksida v linearnih verigah, medtem ko se v stacionarnih fazah tipa polistirena okoli delcev tvori relativno debel polimer. plast A. V tipičnem poskusu se poroznost kolone izračuna na naslednji način:
Na sliki 7A in B so prikazani Van Deemterjevi diagrami za kolono PMP (notranji premer 100 x 1,8 mm) in kolono Ascentis Express RP-Amide (notranji premer 100 x 1,8 mm) pod enakimi pogoji elucije, 60/40 ACN/H2O in 0,1 % TFA od 20 µl/min do 800 µl/min na obeh kolonah. Najmanjše vrednosti HETP pri optimalni hitrosti pretoka (80 µl/min) so bile 2,6 µm za kolono PMP oziroma 3,9 µm za kolono Ascentis Express RP-Amide. Vrednosti HETP kažejo, da je učinkovitost ločevanja kolone PMP (notranji premer 100 x 1,8 mm) veliko višja kot pri komercialno dostopni koloni Ascentis Express RP-Amide (notranji premer 100 x 1,8 mm). Van Deemterjev graf na sliki 7(A) kaže, da zmanjšanje vrednosti N ni bistveno večje z naraščajočim pretokom v primerjavi z našo prejšnjo študijo. Višja učinkovitost ločevanja kolone PMP (id 100 × 1,8 mm) v primerjavi s kolono Ascentis Express RP-Amide temelji na izboljšani obliki in velikosti delcev ter sofisticiranem postopku pakiranja kolone, ki se uporablja v trenutnem delu34.
(A) Van Deemterjev diagram (HETP glede na linearno hitrost mobilne faze), pridobljen na koloni PMP (notranji premer 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O z 0,1 % TFA. (B) Van Deemterjev diagram (HETP glede na linearno hitrost mobilne faze), pridobljen na koloni Ascentis Express RP-Amide (notranji premer 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O z 0,1 % TFA.
Pripravljena in ovrednotena je bila polarna stacionarna faza interkaliranega polistirena za ločevanje mešanice sintetičnih peptidov in tripsinskega hidrolizata humanega serumskega albumina (HSA) v visokozmogljivi tekočinski kromatografiji. Kromatografska učinkovitost PMP kolon za peptidne mešanice je odlična glede učinkovitosti ločevanja in ločljivosti. Izboljšana učinkovitost ločevanja PMP kolon je posledica več razlogov, kot so velikost delcev silicijevega dioksida in velikost por, nadzorovana sinteza stacionarnih faz in kompleksni materiali za polnjenje kolon. Poleg visoke učinkovitosti ločevanja je še ena prednost te stacionarne faze nizek protitlak kolone pri visokih pretokih. PMP kolone so zelo ponovljive in se lahko uporabljajo za analizo mešanic peptidov in tripsinsko razgradnjo različnih beljakovin. To kolono nameravamo uporabiti za ločevanje bioaktivnih spojin iz naravnih produktov, izvlečkov zdravilnih rastlin in gob v tekočinski kromatografiji. V prihodnosti bodo PMP kolone ovrednotene tudi za ločevanje beljakovin in monoklonskih protiteles.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za značilnosti kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za značilnosti kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. in Petersson, P. Raziskava sistemov za ločevanje peptidov z reverzno fazno kromatografijo, 1. del: Razvoj protokola za karakterizacijo kolone.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Metode za ustvarjanje izboljšanih aktivnih peptidov za zdravljenje nalezljivih bolezni. Biotehnologija. Dosežki 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. in Khrestchatisky, M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. in Khrestchatisky, M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg.Vliege P, Lisowski V, Martinez J in Chreschatyski M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg.Vliege P, Lisowski V, Martinez J in Khreschatsky M. Sintetični terapevtski peptidi: znanost in trg. Odkrivanje zdravil. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD in Shen, Y. Napredna proteomska tekočinska kromatografija. Xie, F., Smith, RD in Shen, Y. Napredna proteomska tekočinska kromatografija.Glej F., Smith RD in Shen Yu. Napredna proteomska tekočinska kromatografija. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredna beljakovinska sestava 液相色谱。Glej F., Smith RD in Shen Yu. Napredna proteomska tekočinska kromatografija.J. Kromatografija. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Napredna tekočinska kromatografija-masna spektrometrija lahko združuje široko zasnovano metabolomiko in proteomiko. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM in Salisbury, JJ Vloga UHPLC v farmacevtskem razvoju. Chesnut, SM in Salisbury, JJ Vloga UHPLC v farmacevtskem razvoju.Chesnut, SM in Salisbury, JJ Vloga UHPLC pri farmacevtskem razvoju.Chesnut, SM in Salisbury, JJ Vloga UHPLC pri razvoju zdravil. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. in Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki ultravisokotlačne tekočinske kromatografije za hitre ločitve. Wu, N. in Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki ultravisokotlačne tekočinske kromatografije za hitre ločitve.Wu, N. in Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki visokotlačne tekočinske kromatografije za hitro ločevanje. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. in Clausen, AM Osnovni in praktični vidiki ultravisokotlačne tekočinske kromatografije za hitro ločevanje.Wu, N. in Clausen, AM Temeljni in praktični vidiki visokotlačne tekočinske kromatografije za hitro ločevanje.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA in Tchelitcheff, P. Uporaba ultrazmogljive tekočinske kromatografije v farmacevtskem razvoju. Wren, SA in Tchelitcheff, P. Uporaba ultrazmogljive tekočinske kromatografije v farmacevtskem razvoju.Ren, SA in Chelischeff, P. Uporaba ultra visokozmogljive tekočinske kromatografije v farmacevtskem razvoju. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA in Tchelitcheff, P.Ren, SA in Chelischeff, P. Uporaba ultrazmogljive tekočinske kromatografije pri razvoju zdravil.J. Kromatografija. 1119(1–2), 140–146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitni makroporozni hidrogel, pridobljen iz emulzije olje v vodi z visoko notranjo fazo za učinkovito čiščenje enterovirusa 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. in Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. in Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. in Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. in Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. in Wilkins, JA Vloga tekočinske kromatografije v proteomiki.J. Kromatografija. A 1053 (1–2), 27–36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Novi trendi v ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov s tekočinsko kromatografijo z reverzno fazo: teorija in uporaba. & Guillarme, D. Novi trendi v ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov s tekočinsko kromatografijo z reverzno fazo: teorija in uporaba. & Guillarme, D. Nove tendence v razdelitvi terapevtskih peptidov in beljakovin s pomočjo tekočinske kromatografije z naslovljeno fazo: teorija in aplikacije. & Guillarme, D. Novi trendi pri ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov z reverzno fazno tekočinsko kromatografijo: teorija in uporaba. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.in Guillarmé, D. Novi trendi pri ločevanju terapevtskih peptidov in proteinov z reverzno fazno tekočinsko kromatografijo: teorija in uporaba.Farmacevtski časopis za biomedicinske znanosti. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE in Gebler, JC Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo sistema RP-RP-HPLC z različnim pH v prvi in ​​drugi ločevalni dimenziji. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE in Gebler, JC Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo sistema RP-RP-HPLC z različnim pH v prvi in ​​drugi ločevalni dimenziji.Gilar M., Olivova P., Dali AE in Gebler JK Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo sistema RP-RP-HPLC z različnim pH v prvi in ​​drugi ločevalni dimenziji.Gilar M., Olivova P., Dali AE in Gebler JK Dvodimenzionalno ločevanje peptidov z uporabo različnih vrednosti pH v prvi in ​​drugi ločevalni dimenziji z uporabo sistema RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. idr. Raziskava prenosa mase in kinetičnih značilnosti visokozmogljivih kromatografskih kolon, napolnjenih s popolnoma poroznimi in površinsko poroznimi delci C18, manjšimi od 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nedavni trendi in analitični izzivi pri izolaciji, identifikaciji in validaciji rastlinskih bioaktivnih peptidov. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomska pokrajina kraljestva življenja. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Naknadna obdelava terapevtskih peptidov s preparativno tekočinsko kromatografijo. Molecules (Basel, Švica) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. in Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba v biopolimerih. Yang, Y. in Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba v biopolimerih.Yang, Yu. in Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba pri biopolimerih. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. in Geng, X. Mešana kromatografija in njena uporaba v biopolimerih.Yang, Yu. in Gene, X. Mešana kromatografija in njena uporaba pri biopolimerih.J. Kromatografija. A 1218(49), 8813–8825 (2011).