Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Obstaja potreba po zanesljivem in vitro sistemu, ki lahko natančno reproducira fiziološko okolje srca za testiranje zdravil.Omejena razpoložljivost sistemov kulture človeškega srčnega tkiva je povzročila netočne interpretacije učinkov zdravil na srce.Tu smo razvili model kulture srčnega tkiva (CTCM), ki elektromehansko stimulira rezine srca in je podvržen fiziološkemu raztezanju med sistolično in diastolično fazo srčnega cikla.Po 12 dneh kulture je ta pristop delno izboljšal sposobnost preživetja srčnih delov, vendar ni v celoti ohranil njihove strukturne celovitosti.Zato smo po presejanju majhnih molekul ugotovili, da je dodatek 100 nM trijodotironina (T3) in 1 μM deksametazona (Dex) našemu mediju ohranil mikrostrukturo odsekov 12 dni.V kombinaciji z zdravljenjem s T3/Dex je sistem CTCM 12 dni vzdrževal transkripcijske profile, sposobnost preživetja, presnovno aktivnost in strukturno celovitost na enaki ravni kot sveže srčno tkivo.Poleg tega prekomerno raztezanje srčnega tkiva v kulturi inducira hipertrofično srčno signalizacijo, kar dokazuje sposobnost CTCM, da posnema hipertrofična stanja, ki jih povzroča srčno raztezanje.Skratka, CTCM lahko modelira fiziologijo in patofiziologijo srca v kulturi v dolgih časovnih obdobjih, kar omogoča zanesljiv pregled zdravil.
Pred kliničnimi raziskavami so potrebni zanesljivi in ​​vitro sistemi, ki lahko natančno reproducirajo fiziološko okolje človeškega srca.Takšni sistemi bi morali posnemati spremenjeno mehansko raztezanje, srčni utrip in elektrofiziološke lastnosti.Živalski modeli se običajno uporabljajo kot presejalna platforma za srčno fiziologijo z omejeno zanesljivostjo pri odražanju učinkov zdravil na človeško srce1,2.Navsezadnje je eksperimentalni model kulture idealnega srčnega tkiva (CTCM) model, ki je zelo občutljiv in specifičen za različne terapevtske in farmakološke posege ter natančno reproducira fiziologijo in patofiziologijo človeškega srca3.Odsotnost takega sistema omejuje odkrivanje novih zdravljenj srčnega popuščanja4,5 in je povzročila kardiotoksičnost zdravil kot glavni razlog za izstop s trga6.
V zadnjem desetletju je bilo osem nekardiovaskularnih zdravil umaknjenih iz klinične uporabe, ker povzročajo podaljšanje intervala QT, kar vodi do ventrikularnih aritmij in nenadne smrti7.Zato obstaja vedno večja potreba po zanesljivih predkliničnih presejalnih strategijah za oceno srčno-žilne učinkovitosti in toksičnosti.Nedavna uporaba človekovih induciranih pluripotentnih kardiomiocitov, ki izhajajo iz matičnih celic (HIPS-CM) pri presejanju zdravil in testiranju toksičnosti, zagotavlja delno rešitev za to težavo.Vendar sta nezrela narava hiPS-CM in pomanjkanje večcelične kompleksnosti srčnega tkiva glavni omejitvi te metode.Nedavne študije so pokazale, da je mogoče to omejitev delno premagati z uporabo zgodnjega HIPS-CM za tvorbo hidrogelov srčnega tkiva kmalu po začetku spontane kontrakcije in postopoma povečevanjem električne stimulacije sčasoma.Vendar mi mikrotisanje HIPS-CM nimajo zrele elektrofiziološke in kontraktilne lastnosti miokarda za odrasle.Poleg tega ima človeško srčno tkivo bolj zapleteno strukturo, ki je sestavljena iz heterogene mešanice različnih vrst celic, vključno z endotelnimi celicami, nevroni in stromalnimi fibroblasti, medsebojno povezani s specifičnimi sklopi zunajceličnih matričnih beljakovin.Ta heterogenost populacij, ki niso znaki-cardiomiocitov11,12,13 v srcu odraslih sesalcev, je glavna ovira za modeliranje srčnega tkiva z uporabo posameznih vrst celic.Te glavne omejitve poudarjajo pomen razvoja metod za gojenje nedotaknjenega miokardnega tkiva v fizioloških in patoloških pogojih.
Gojeni tanki (300 µm) deli človeškega srca so se izkazali za obetaven model nedotaknjenega človeškega miokarda.Ta metoda omogoča dostop do celotnega 3D večceličnega sistema, podobnega tkivu človeškega srca.Vendar je bila do leta 2019 uporaba gojenih delov srca omejena s kratkim (24-urnim) preživetjem kulture.To je posledica številnih dejavnikov, vključno s pomanjkanjem fizikalno-mehaničnega raztezanja, zračno-tekočim vmesnikom in uporabo preprostih medijev, ki ne podpirajo potreb srčnega tkiva.V letu 2019 je več raziskovalnih skupin pokazalo, da lahko vključitev mehanskih dejavnikov v sisteme srčne tkivne kulture podaljša življenje kulture, izboljša srčno izražanje in posnema srčno patologijo.Dve elegantni študiji 17 in 18 kažeta, da ima enoosna mehanska obremenitev pozitiven učinek na srčni fenotip med kulturo.Vendar te študije niso uporabile dinamične tridimenzionalne fizikalno-mehanske obremenitve srčnega cikla, saj so bili srčni odseki obremenjeni bodisi z izometričnimi nateznimi silami 17 ali linearne auksotonske obremenitve 18.Te metode raztezanja tkiva so povzročile zatiranje številnih srčnih genov ali prekomerno izražanje genov, povezanih z nenormalnimi odzivi na raztezanje.Predvsem Pitoulis et al.19 je razvil dinamično kopel za kulturo srčnih rezin za rekonstrukcijo srčnega cikla z uporabo povratne informacije pretvornika sile in pogonov napetosti.Čeprav ta sistem omogoča natančnejše in vitro modeliranje srčnega cikla, zapletenost in nizka pretočnost metode omejujeta uporabo tega sistema.Naš laboratorij je pred kratkim razvil poenostavljen sistem kulture z uporabo električne stimulacije in optimiziranega medija za ohranjanje sposobnosti preživetja delov prašičjega in človeškega srčnega tkiva do 6 dni 20,21.
V trenutnem rokopisu opisujemo model kulture srčnega tkiva (CTCM) z uporabo odsekov prašičjega srca, ki vključuje humoralne znake za povzetek tridimenzionalne srčne fiziologije in patofiziološke distenzije med srčnim ciklom.Ta CTCM lahko poveča natančnost predklinične napovedi zdravil na raven, ki je še nikoli ni bila dosežena z zagotavljanjem stroškovno učinkovitega srčnega sistema srednje zmogljivosti, ki posnema fiziologijo/patofiziologijo srca sesalcev za predklinično testiranje zdravil.
Hemodinamski mehanski signali igrajo ključno vlogo pri ohranjanju delovanja kardiomiocitov in vitro 22,23,24.V trenutnem rokopisu smo razvili CTCM (slika 1a), ki lahko posnema srčno okolje odraslih z induciranjem električne in mehanske stimulacije pri fizioloških frekvencah (1,2 Hz, 72 utripov na minuto).Da bi se izognili čezmernemu raztezanju tkiva med diastolo, je bila uporabljena naprava za 3D tiskanje za povečanje velikosti tkiva za 25% (slika 1b).Električni tempo, ki ga je povzročil sistem C-Pace, je bil časovno nameščen za začetek 100 ms pred sistolo z uporabo sistema za zajem podatkov za popolno reprodukcijo srčnega cikla.Sistem tkivne kulture uporablja programabilni pnevmatski aktuator (LB Engineering, Nemčija) za ciklično razširitev prožne silikonske membrane, da povzroči razširitev srčnih rezin v zgornji komori.Sistem je bil povezan z zunanjim zračnim vodom preko tlačnega pretvornika, ki je omogočal natančno nastavitev tlaka (± 1 mmHg) in časa (± 1 ms) (slika 1c).
A tkivni odsek pritrdite na 7 mm podporni obroč, prikazan v modri barvi, znotraj kulturne komore naprave.Kulturna komora je od zračne komore ločena s tanko fleksibilno silikonsko membrano.Med vsako komoro postavite tesnilo, da preprečite puščanje.Pokrov naprave vsebuje grafitne elektrode, ki zagotavljajo električno stimulacijo.B Shematski prikaz velike naprave za tkivo, vodilni obroč in podporni obroč.Odseki tkiva (rjava) so nameščeni na preveliki napravi z vodilnim obročem, nameščenim v utoru na zunanjem robu naprave.S pomočjo vodnika previdno postavite nosilski obroč, prevlečen z akrilnim lepilom tkiva na del srčnega tkiva.C Graf, ki prikazuje čas električne stimulacije kot funkcije tlaka zračne komore, ki ga nadzira programabilni pnevmatski aktuator (PPD).Naprava za pridobivanje podatkov je bila uporabljena za sinhronizacijo električne stimulacije z uporabo tlačnih senzorjev.Ko tlak v komori za kulturo doseže nastavljeni prag, se pulzni signal pošlje v C-PACE-EM, da sproži električno stimulacijo.d Slika štirih CTCM, postavljenih na polico inkubatorja.Štiri naprave so povezane z enim PPD prek pnevmatskega vezja, tlačni senzorji pa se vstavijo v hemostatski ventil za spremljanje tlaka v pnevmatskem vezju.Vsaka naprava vsebuje šest odsekov tkiva.
Z enim samim pnevmatskim aktuatorjem smo lahko krmilili 4 naprave CTCM, od katerih je vsaka lahko vsebovala 6 delov tkiva (slika 1d).V CTCM se zračni tlak v zračni komori pretvori v sinhroni tlak v tekočinski komori in povzroči fiziološko razširitev rezine srca (slika 2a in dodatni film 1).Vrednotenje raztezanja tkiva pri 80 mm Hg.Umetnost.pokazala raztezanje tkivnih odsekov za 25 % (slika 2b).Pokazalo se je, da ta odstotek raztezanja ustreza fiziološki dolžini sarkomera 2,2–2,3 µm za normalno kontraktilnost srčnega dela17,19,25.Amplituda in hitrost gibanja tkiva (sl. 2c, d) sta ustrezali raztezanju med srčnim ciklom in času med sistolo in diastolo (sl. 2b).Raztezanje in hitrost srčnega tkiva med kontrakcijo in sprostitvijo sta ostala konstantna 12 dni v kulturi (slika 2f).Da bi ocenili učinek električne stimulacije na kontraktilnost med kulturo, smo razvili metodo za določanje aktivne deformacije z algoritmom za senčenje (dodatna slika 2a, b) in smo lahko razlikovali med deformacijami z in brez električne stimulacije.Isti del srca (slika 2F).V premičnem predelu reza (R6-9) je bila napetost med električno stimulacijo za 20 % višja kot v odsotnosti električne stimulacije, kar kaže na prispevek električne stimulacije k kontraktilni funkciji.
Reprezentativni sledi tlaka zračne komore, tlaka tekočine in merjenja gibanja tkiv potrjujejo, da tlak komore spreminja tlak tekočine, kar povzroči ustrezno gibanje rezine tkiva.B reprezentativne sledi v odstotkih (modrih) odsekov tkiv, ki ustrezajo odstotkom raztezanja (oranžna).C Izmerjeno gibanje srčne rezine je skladno z izmerjeno hitrostjo gibanja.(d) Reprezentativne usmeritve cikličnega gibanja (modra črta) in hitrosti (oranžna pikčasta črta) v rezini srca.E Kvantifikacija časa cikla (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), čas krčenja (n = 19 rezin na skupino), čas sprostitve (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), gibanje tkiv (n = 25).rezine)/skupina iz različnih prašičev), najvišja sistolična hitrost (n = 24 (d0), 25 (d12) rezine/skupina iz različnih prašičev) in najvišja hitrost sprostitve (n = 24 (d0), 25 (d12) rezine/skupina iz različnih prašičev).T-test z dvotirnim študentom ni pokazal bistvene razlike v katerem koli parametru.F Reprezentativna analiza seva sledi tkivnih odsekov z (rdečo) in brez (modre) električne stimulacije, deset regionalnih območij tkivnih odsekov z istega odseka.Spodnje plošče prikazujejo količinsko določitev odstotne razlike v obremenitvi tkiv z in brez električne stimulacije na desetih območjih z različnih odsekov. (n = 8 rezin/skupino različnih prašičev, izveden je dvorepi Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezin/skupino različnih prašičev, izveden je dvorepi Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezov/skupino od različnih svinj, izveden dvostranski t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 odsekov/skupine iz različnih prašičev, dvotirni študentov t-test; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 rezov/skupino, od različnih svinj, dvostranski kriterij Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 odsekov/skupino, iz različnih prašičev, dvostranski Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
V našem prejšnjem statičnem biomimetičnem sistemu kulture rezin srca [20, 21] smo vzdrževali sposobnost preživetja, delovanje in strukturno celovitost rezin srca 6 dni z uporabo električne stimulacije in optimizacijo sestave medija.Sklicevali se bomo na odseke, gojene v našem prejšnjem statičnem biomimetičnem sistemu kulture 20, 21 kontrolnih pogojih (Ctrl) in uporabili bomo naš predhodno optimiziran medij kot pogoje MC in kulturo pod sočasno mehansko in električno stimulacijo (CTCM).poklical.Najprej smo ugotovili, da mehanska stimulacija brez električne stimulacije ne zadostuje za vzdrževanje sposobnosti preživetja tkiva 6 dni (dodatna slika 3a, b).Zanimivo je, da je z uvedbo fizio-mehanske in električne stimulacije z uporabo STCM sposobnost preživetja 12-dnevnih srčnih odsekov ostala enaka kot pri svežih srčnih odsekih v pogojih MS, ne pa tudi v pogojih Ctrl, kot je pokazala analiza MTT (slika 1).3a).To nakazuje, da lahko mehanska stimulacija in simulacija srčnega cikla ohranita dele tkiva sposobni preživetja dvakrat dlje, kot je bilo navedeno v našem prejšnjem sistemu statične kulture.Vendar pa je ocena strukturne celovitosti tkivnih odsekov z imunskim označevanjem srčnega troponina T in koneksina 43 pokazala, da je bila ekspresija koneksina 43 bistveno višja v tkivih MC 12. dan kot pri kontrolah na isti dan.Uporabljamo okvir umetne inteligence (AI) za kvantifikacijo strukturne celovitosti tkiva26, cevovod globokega učenja na podlagi slike, ki temelji na obarvanju s troponinom-T in koneksinom43 za samodejno kvantifikacijo strukturne celovitosti in fluorescence srčnih rezin v smislu moči lokalizacije.Ta metoda uporablja konvolucijsko nevronsko mrežo (CNN) in ogrodje globokega učenja za zanesljivo kvantifikacijo strukturne celovitosti srčnega tkiva na avtomatiziran in nepristranski način, kot je opisano v referenci.Poleg tega je Massonovo trikromno obarvanje razkrilo znatno nižji odstotek fibroze v pogojih MS v primerjavi s kontrolnimi pogoji na 12. dan kulture (slika 3c).Medtem ko je CTCM povečal sposobnost preživetja odsekov srčnega tkiva 12. dan na raven, podobno ravni svežega srčnega tkiva, ni bistveno izboljšal strukturne celovitosti odsekov srca.
Črtni graf prikazuje kvantifikacijo MTT sposobnost preživetja svežega srca (D0) ali kulture srčnih rezin 12 dni bodisi v statični kulturi (D12 Ctrl) bodisi v CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), ki se izvajajo; D12 Ctrl). Črtni graf prikazuje kvantifikacijo MTT sposobnost preživetja svežega srca (D0) ali kulture srčnih rezin 12 dni bodisi v statični kulturi (D12 Ctrl) bodisi v CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), ki se izvajajo; D12 Ctrl).histogram prikazuje kvantifikacijo sposobnosti preživetja MTT svežih rezov srca (D0) ali kulture rezov srca 12 dni bodisi v statični kulturi (kontrola D12) ali CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). ), 12 (D12 MC) rezih/skupina iz različnih prašičev, izvede se enosmerni test ANOVA;#### p <0.0001 o SCRAVNENIю S D0 I ** P <0,01 OPOR SHRAVNENIю S D12 CTRL). ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比；**p。)histogram, ki prikazuje kvantifikacijo viabilnosti MTT v svežih odsekih srca (D0) ali odsekih srca, gojenih 12 dni v statični kulturi (D12 kontrola) ali CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) odsekih/skupinah različnih prašičev, enosmerni test ANOVA;####p < 0,0001 v primerjavi z D0, **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). ####p < 0,0001 v primerjavi z D0, **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl).b Troponin-T (zelen), koneksin 43 (rdeč) in DAPI (moder) v sveže izoliranih odsekih srca (D0) ali odsekih srca, gojenih v statičnih pogojih (Ctrl) ali pogojih CTCM (MC) 12 dni) reprezentativnih imunofluorescenčnih slik (prazna lestvica = 100 µm). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupina, vsaka iz drugega prašiča, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupina vsake od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Količinska ocena strukturne celostnosti srčnega tkiva umetnega intelekta (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupin od različnih svinj, izveden enofaktorni test ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) odsekov/skupin različnih prašičev, opravljen enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl).人工 智能量化 心脏 组织 结构 结构 完整性 （n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) rezine/skupina vsakega od različnih prašičev, enosmerni test ANOVA; #### p <0,0001 与 d0 相比 ， **** P <0,0001 与 D12 Ctrl 相比 相比。人工 智能量化 心脏 组织 结构 结构 完整性 （n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) rezine/skupina vsakega od različnih prašičev, enosmerni test ANOVA; #### p <0,0001 与 d0 相比 ， **** p <0,0001 与 d12 ctrl 相比。。。。。。。 与 与 与 d12 ctrl 相比。 Iskusni intelekt za količinsko oceno strukturne celostnosti srčnega tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupine vsake od različnih svinj, enostranski test ANOVA; ####p <0,0001 v primerjavi z D0 Za uskladitev ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Umetna inteligenca za količinsko opredelitev strukturne celovitosti srčnega tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) odsekov/skupin vsakega od različnih prašičev, enosmerni ANOVA test; ####p<0,0001 proti .D0 Za primerjavo ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromnim madežem (gola lestvica = 500 µm) (n = 10 rezin/skupina vsake od drugega prašiča, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromnim madežem (gola lestvica = 500 µm) (n = 10 rezin/skupina vsake od različnih prašičev, izveden je enosmerni test ANOVA; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (slika) in količinska ocena (popravek) rez srca, okrašenega s trikromatskim krasiteljem Massona (štab brez pokritja = 500 mkm) (n = 10 rezov/skupina od različnih svinj, izveden je dvostranski test ANOVA; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) odsekov srca, obarvanih z Massonovim trikromnim madežem (neprevlečena lestvica = 500 µm) (n = 10 odsekov/skupina iz različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (slika) in količinska analiza (popravek) rezov srca, okrašenega s trikromatskim krasiteljem Massona (čista lestvica = 500 mkm) (n = 10 rezov/skupina, vsaka od druge svinje, testirano s pomočjo enofaktorske disperzijske analize ;### #p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) odsekov srca, obarvanih z Massonovim trikromnim madežem (prazno = 500 µm) (n = 10 odsekov/skupina, vsak od drugega prašiča, testirano z enosmerno analizo variance; ### # p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl).Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Domnevali smo, da bi z dodajanjem majhnih molekul v gojišče lahko izboljšali integriteto kardiomiocitov in zmanjšali razvoj fibroze med kulturo CTCM.Te majhne molekule so bile prej uporabljene v kulturah hiPSC-CM za induciranje zorenja kardiomiocitov s povečanjem dolžine sarkomera, T-tubulov in hitrosti prevodnosti.Poleg tega je znano, da tako Dex (glukokortikoid) kot SB zavirata vnetje29,30.Zato smo preizkusili, ali bi vključitev ene ali kombinacije teh majhnih molekul izboljšala strukturno celovitost delov srca.Za začetni pregled je bil odmerek vsake spojine izbran na podlagi koncentracij, ki se običajno uporabljajo v modelih celične kulture (1 μM Dex27, 100 nM T327 in 2,5 μM SB31).Po 12 dneh kulture je kombinacija T3 in Dex povzročila optimalno strukturno celovitost kardiomiocitov in minimalno preoblikovanje vlaken (dopolnilni sliki 4 in 5).Poleg tega je uporaba dvojnih ali dvojnih teh koncentracij T3 in Dex povzročila škodljive učinke v primerjavi z običajnimi koncentracijami (dodatna slika 6a, b).
Po začetnem presejanju smo izvedli neposredno primerjavo 4 pogojev kulture (slika 4a): Ctrl: odseki srca, gojeni v naši prej opisani statični kulturi z uporabo našega optimiziranega medija;20.21 TD: T3 in CTRL S sta v sredo dodala Dex;MC: deli srca, gojeni v CTCM z uporabo našega predhodno optimiziranega medija;in MT: CTCM s T3 in Dexom, dodanim mediju.Po 12 dneh gojenja je sposobnost preživetja tkiv MS in MT ostala enaka kot v svežih tkivih, ocenjenih z MTT testom (slika 4b).Zanimivo je, da dodajanje T3 in Dex transwell kulturam (TD) ni povzročilo pomembnega izboljšanja sposobnosti preživetja v primerjavi s pogoji Ctrl, kar kaže na pomembno vlogo mehanske stimulacije pri ohranjanju sposobnosti preživetja srčnih odsekov.
diagram eksperimentalne zasnove, ki prikazuje štiri pogoje gojenja, uporabljene za oceno učinkov mehanske stimulacije in dodatka T3/Dex na gojišče 12 dni. b Palični graf prikazuje kvantifikacijo sposobnosti preživetja 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi deli srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), 12 (D12 MC) rezov/skupine različnih prašičev, enosmerni test ANOVA; ####p < 0,0 001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogram, ki prikazuje vse 4 pogoje kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), od različnih svinj 12 (D12 MC) rezi/skupina, enostranski test ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0, **p <0,01 v primerjavi z D12). c Palični graf prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupino različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Palični graf prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupino različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Gistogram prikazuje izmerjeno oceno toka glukoze v 12 dneh po kultiviranju v vseh 4 pogojih kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 6 rezov/skupino od različnih svinj, enostranski Izvaja se test ANOVA; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Histogram prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju pri vseh 4 pogojih gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi deli srca (D0) (n = 6 rezov/skupina iz različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c gshistogRamma, pokaзыvaющasAryчastveю ццeNKUTOCO Ovani (Kontrolь, td, mc in mt) o sranneniю soyinimi svrey sser. л aproveDedы thestы ANOVA; ### p <0,001 o Shratniniю °, *** P <0,001 o -o scravoniю с D12 (KONTORO). c Histogram, ki prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju za vse 4 pogoje gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi deli srca (D0) (n = 6 rezov/skupina, iz različnih prašičev, enostransko. Če so bili izvedeni ANOVA testi, ###p < 0,001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 (kontrola).f Toplotni zemljevid genov sarkomere za dele srca, gojene v vsakem od pogojev kulture.Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Presnovna odvisnost od prehoda z oksidacije maščobnih kislin na glikolizo je značilnost dediferenciacije kardiomiocitov.Nezreli kardiomiociti primarno uporabljajo glukozo za proizvodnjo ATP in imajo hipoplastične mitohondrije z nekaj kristami 5,32.Analize porabe glukoze so pokazale, da je bila v pogojih MC in MT poraba glukoze podobna tisti v tkivih na dan 0 (slika 4c).Vendar so vzorci Ctrl pokazali znatno povečanje porabe glukoze v primerjavi s svežim tkivom.To kaže, da kombinacija CTCM in T3/Dex poveča sposobnost preživetja tkiva in ohrani presnovni fenotip 12-dnevno kultiviranih delov srca.
Vendar, kot smo že pokazali, so rezine Ctrl prikazale 1229 različno izraženih genov po 10–12 dneh v kulturi (slika 4e).Ti podatki so bili potrjeni s qRT-PCR genov srca in fibroblastov (dopolnilna slika 7a-c).Zanimivo je, da so odseki Ctrl pokazali znižano regulacijo genov srčnega in celičnega cikla ter aktivacijo vnetnih genskih programov.
Te transkripcijske ugotovitve podpira dejstvo, da se strukturna celovitost kardiomiocitov v odsekih srca najbolje ohrani v pogojih MT 12 dni, kot je prikazano z nepoškodovanim in lokaliziranim koneksinom 43 (slika 5a).Poleg tega se je fibroza v odsekih srca v pogojih MT znatno zmanjšala v primerjavi s Ctrl in podobno kot pri svežih odsekih srca (slika 5b).Ti podatki kažejo, da kombinacija mehanske stimulacije in zdravljenja s T3/Dex učinkovito ohranja strukturo srca v odsekih srca v kulturi.
). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezin/skupina različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D 12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezin/skupina različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D 12 Ctrl). Količinska ocena strukturne celostnosti tkiva srca s pomočjo umetnega intelekta (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezov/skupine od različnih svinj, izveden enofaktorski test ANOVA; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D1 2 Ctrl). Kvantifikacija strukturne celovitosti srčnega tkiva z uporabo umetne inteligence (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) odsekov/skupin različnih prašičev, opravljen enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D1 2 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl相比）。#### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比， ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Končno je bila sposobnost CTCM, da posnema srčno hipertrofijo, ocenjena s povečanjem raztezanja srčnega tkiva.V CTCM se je največji tlak v zračni komori povečal z 80 mmHg na 80 mmHg.Umetnost.(Običajni raztežaj) do 140 mmHg umetnosti.(slika 6a).To ustreza 32 -odstotnemu povečanju raztezanja (slika 6B), kar je bilo prej prikazano kot ustrezen odstotek raztežaja, ki je potreben za srčne odseke, da doseže dolžino sarcomera, podobno kot v hipertrofiji.Raztezanje in hitrost srčnega tkiva med kontrakcijo in sprostitvijo sta ostala konstantna v šestih dneh kulture (slika 6c).Srčno tkivo iz stanj MT je bilo šest dni podvrženo normalnemu raztezanju (MT (normalno)) ali pogojem preraztezanja (MT (OS)).Že po štirih dneh v kulturi je bil hipertrofični biomarker NT-proBNP v mediju v pogojih MT (OS) v primerjavi z MT (normalnimi) pogoji znatno povišan (slika 7A).Poleg tega se je po šestih dneh gojenja velikost celic v MT (OS) (slika 7b) znatno povečala v primerjavi z deli srca MT (normalno).Poleg tega se je jedrska translokacija NFATC4 znatno povečala v preraztegnjenih tkivih (slika 7c).Ti rezultati kažejo progresivni razvoj patološkega preoblikovanja po hiperdistenziji in podpirajo koncept, da se lahko naprava CTCM uporabi kot platformo za preučevanje signalizacije srčne hipertrofije, ki jo povzroča raztegnjenje.
Reprezentativni sledi tlaka zračne komore, tlaka tekočine in merjenja gibanja tkiv potrjujejo, da tlak komore spreminja tlak tekočine, kar povzroči ustrezno gibanje rezine tkiva.b Reprezentativne krivulje odstotka raztezanja in stopnje raztezanja za normalno raztegnjene (oranžne) in preraztegnjene (modre) dele tkiva.c črtni graf, ki prikazuje čas cikla (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), čas krčenja (n = 18-19 rezin na skupino, od različnih prašičev), čas sprostitve (n = 19 rezin na skupino, iz različnih prašičev)), amplituda gibanja tkiva (n = 14 rezin/skupina, ki se razlikuje (različna prašičja), in od n = 14 relaksov) (N = 14 relaks) in 15-reksa (N = 14 Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/Slices/SPORCES/PEAK IN = 14 SLICES/SLICE) Oddelki/skupine) od različnih prašičev) dvotirni študentov t-test ni pokazal pomembne razlike v nobenem parametru, kar kaže, da so ti parametri ostali konstantni v 6 dneh kulture s pretirano ceno.Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Kvantifikacija črtnega grafa koncentracije NT-proBNP v kulturnih medijih iz srčnih rezin, gojenih pod MT Normal Stretch (Norm) ali pretirano raztezanjem (OS) (n = 4 (d2 mTnorm), 3 (d2 mtos, D4 mTnorm in d4 mtos) rezine/skupino iz različnih prašičev. Kvantifikacija črtnega grafa koncentracije NT-proBNP v kulturnih medijih iz srčnih rezin, gojenih pod MT Normal Stretch (Norm) ali pretirano raztezanjem (OS) (n = 4 (d2 mTnorm), 3 (d2 mtos, D4 mTnorm in d4 mtos) rezine/skupino iz različnih prašičev.Kvantitativni histogram koncentracije NT-proBNP v kulturnem mediju iz srčnih rezin, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (NORM) ali Overstertch (N = 4 (D2 MTNORM), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM in D4). MTOS) Slice /Skupina iz različnih prašičev;**p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). ** p <0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < 0,01). Kvantifikacija koncentracije NT-proBNP v rezinah srca, gojenih pod MT normalnim raztezanjem (NORM) ali pogoji (N = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mTnorm 和 d4 ms) od različnih 猪 的 切片/组 可以 可以 双向 发动 发动;Kvantifikacija histograma koncentracij NT-proBNP v srčnih rezinah, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (NORM) ali prekomernejtečev (OS) (N = 4 (D2 MTNORM), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM) in D4 MTO) rezin/skupine iz različnih prašičev, dvosmerna analiza odstopanja;**p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). ** p <0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). B reprezentativne slike za srčne rezine, obarvane s troponinom-T in WGA (levo) in količinsko določanje velikosti celice (desno) (n = 330 (d6 MTOS), 369 (d6 mtnorm) celic/skupine iz 10 različnih rezin različnih prašičev, ki se izvajajo z dvotirnim študentskim t-testom; **** P <0,0001 v primerjavi z normalnim raztežajem). B reprezentativne slike za rezine srca, obarvane s troponinom-T in WGA (levo) in količinsko določanje velikosti celice (desno) (n = 330 (d6 MTOS), 369 (d6 mtnarm) celic/skupine iz 10 različnih rezin različnih prašičev, dvotirni študent t-test se v primerjavi z normalnim raztežajem). BrEpReENTIVENыE ISOBERSENI SERDERDE eTok (scrAVa) (n = 330 (d6 mtos), 369 (d6 mtnorm) Klentok/grUPPu jEз Сtюdenja; **** p <0.0001 o -ovneniю ° с njormalьnыm rastinyжerniem). b Reprezentativne slike delov srca, obarvanih s troponinom-T in AZP (levo) in kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celic/skupino iz 10 različnih delov različnih prašičev, izveden je bil dvorepi Studentov t-test; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim sevom). B reprezentativne slike srčnih rezin, obarvanih z kalcarein-T in WGA (levo) in velikostjo celice (desno) (n = 330 (d6 mtos), 369 iz 10 različnih rezin (d6 mtnirm)) celic/组 ， 两 方法 方法 有尾 t test ； v primerjavi z normalnim raztezanjem ， **** p <0,0001). b Reprezentativne slike rezov srca, okrašenih s troponinom-T in AZP (levo) in količinska ocena velikosti celic (popravek) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različnih rezov iz različnih svinjskih kletk/skupine, dvostranski kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim razporejanjem). b Reprezentativne slike delov srca, obarvanih s troponinom-T in AZP (levo) in kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različnih rezov različnih prašičev) Celice/skupina, dvostranski kriterij Studentov t;**** p <0,0001 v primerjavi z normalnim sevom). C reprezentativne slike za dan 0 in 6. dan Srčne rezine Imuno označene za troponin-T in NFATC4 in kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedra CMS (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) rezine/skupine iz različnih prašičev, dvotirni študent t-test se izvaja; *p <0,05). c Reprezentativne slike za dan 0 in dan 6 rezine srca MTOS, imunsko označene za troponin-T in NFATC4, in kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedra CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina iz različnih prašičev, izveden je dvorepi Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za reze srca 0 in 6 dni MTOS, imunomehirane za troponin-T in NFATC4, in količinsko oceno translokacij NFATC4 v celicah kavernoznih celic (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezov/skupine od različnih svinj, izvaja se dvostranski t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za odseke srca pri 0 in 6 dneh MTOS, imunsko označene za troponin-T in NFATC4, in kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedru kavernoznih celic (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina iz različnih prašičev) izvedejo dvostranski Studentov t-test;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentativne slike rezov srca MTOS na 0 in 6 dni za imunomarkiranje troponinom-T in NFATC4 ter količinsko oceno translokacij NFATC4 v jadra CM od različnih svinj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rez/skupina, dva-hvostatski t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike rezin srca MTOS na dan 0 in 6 za imunsko označevanje troponina-T in NFATC4 ter kvantifikacijo translokacije NFATC4 v jedru CM iz različnih prašičev (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupino, dvostranski t-kriterij Student; *p < 0,05).Vrstice napak predstavljajo srednjo vrednost ± standardni odklon.
Translacijske raziskave srca in ožilja zahtevajo celične modele, ki natančno reproducirajo srčno okolje.V tej študiji je bila razvita in označena naprava CTCM, ki lahko stimulira ultratanke dele srca.Sistem CTCM vključuje fiziološko sinhronizirano elektromehansko stimulacijo ter obogatitev s tekočino T3 in Dex.Ko so bili deli prašičjega srca izpostavljeni tem dejavnikom, so njihova sposobnost preživetja, strukturna celovitost, presnovna aktivnost in transkripcijska ekspresija ostali enaki kot v svežem srčnem tkivu po 12 dneh gojenja.Poleg tega lahko prekomerno raztezanje srčnega tkiva povzroči hipertrofijo srca, ki jo povzroči hiperekstenzija.Na splošno ti rezultati podpirajo kritično vlogo pogojev fiziološke kulture pri ohranjanju normalnega srčnega fenotipa in zagotavljajo platformo za presejanje zdravil.
Številni dejavniki prispevajo k ustvarjanju optimalnega okolja za delovanje in preživetje kardiomiocitov.Najbolj očitni od teh dejavnikov so povezani z (1) medceličnimi interakcijami, (2) elektromehansko stimulacijo, (3) humoralnimi dejavniki in (4) presnovnimi substrati.Fiziološke interakcije med celicami zahtevajo kompleksne tridimenzionalne mreže več vrst celic, ki jih podpira zunajcelični matriks.Takšne zapletene celične interakcije je težko rekonstruirati in vitro s sokulturo posameznih vrst celic, vendar jih je mogoče zlahka doseči z uporabo organotipske narave srčnih delov.
Mehansko raztezanje in električna stimulacija kardiomiocitov sta ključnega pomena za vzdrževanje srčnega fenotipa33,34,35.Medtem ko se mehanska stimulacija pogosto uporablja za kondicioniranje in zorenje hiPSC-CM, je več elegantnih študij nedavno poskušalo mehansko stimulirati srčne rezine v kulturi z uporabo enoosne obremenitve.Te študije kažejo, da ima 2D enoosna mehanska obremenitev pozitiven učinek na fenotip srca med kulturo.V teh študijah so bili deli srca bodisi obremenjeni z izometričnimi nateznimi silami17, linearno avksotonično obremenitvijo18 ali pa je bil srčni cikel poustvarjen z uporabo povratne informacije pretvornika sile in pogonov napetosti.Vendar te metode uporabljajo enoosno raztezanje tkiva brez optimizacije okolja, kar ima za posledico zatiranje številnih srčnih genov ali prekomerno izražanje genov, povezanih z nenormalnimi odzivi na raztezanje.Tukaj opisani CTCM zagotavlja 3D elektromehanski dražljaj, ki posnema naravni srčni cikel v smislu časa cikla in fiziološkega raztezanja (25 % raztezanja, 40 % sistole, 60 % diastole in 72 utripov na minuto).Čeprav ta tridimenzionalna mehanska stimulacija sama po sebi ne zadošča za ohranitev celovitosti tkiva, je za ustrezno vzdrževanje sposobnosti preživetja, delovanja in celovitosti tkiva potrebna kombinacija humoralne in mehanske stimulacije z uporabo T3/Dex.
Humoralni dejavniki igrajo pomembno vlogo pri modulaciji srčnega fenotipa odraslega.To je bilo poudarjeno v študijah HiPS-CM, v katerih sta bila T3 in Dex dodana gojišču za pospešitev zorenja celic.T3 lahko vpliva na transport aminokislin, sladkorjev in kalcija skozi celične membrane36.Poleg tega T3 spodbuja izražanje MHC-α in znižanje regulacije MHC-β, kar spodbuja tvorbo hitro trzajočih se miofibril v zrelih kardiomiocitih v primerjavi s počasnimi trzajočimi se miofibrili v fetalni CM.Pomanjkanje T3 pri hipotiroidnih bolnikih povzroči izgubo miofibrilarnih pasov in zmanjšano stopnjo razvoja tonusa37.Dex deluje na glukokortikoidne receptorje in dokazano poveča kontraktilnost miokarda v izoliranih prekrvljenih srcih;38 domneva se, da je to izboljšanje povezano z učinkom na vnos kalcija zaradi depozitov (SOCE) 39,40.Poleg tega se Dex veže na svoje receptorje in povzroči širok znotrajcelični odziv, ki zavira delovanje imunskega sistema in vnetje30.
Naši rezultati kažejo, da je fizikalna mehanska stimulacija (MS) izboljšala splošno delovanje kulture v primerjavi s Ctrl, vendar ni uspela ohraniti sposobnosti preživetja, strukturne celovitosti in srčnega izražanja v 12 dneh kulture.V primerjavi s Ctrl je dodatek T3 in Dex kulturam CTCM (MT) izboljšal sposobnost preživetja in ohranil podobne transkripcijske profile, strukturno celovitost in presnovno aktivnost s svežim srčnim tkivom 12 dni.Poleg tega je bil z nadzorom stopnje raztezanja tkiva s pomočjo STCM ustvarjen model srčne hipertrofije, povzročene s hiperekstenzijo, ki ponazarja vsestranskost sistema STCM.Opozoriti je treba, da čeprav preoblikovanje srca in fibroza običajno vključujeta nedotaknjene organe, katerih celice v obtoku lahko zagotovijo ustrezne citokine, pa tudi fagocitozo in druge dejavnike preoblikovanja, lahko deli srca še vedno posnemajo fibrotični proces kot odziv na stres in travmo.v miofibroblaste.To je bilo predhodno ovrednoteno v tem modelu rezine srca.Upoštevati je treba, da je mogoče parametre CTCM modulirati s spreminjanjem tlaka/električne amplitude in frekvence za simulacijo številnih stanj, kot so tahikardija, bradikardija in mehanska cirkulatorna podpora (mehansko neobremenjeno srce).Zaradi tega je sistem srednje zmogljiv za testiranje zdravil.Sposobnost CTCM za modeliranje srčne hipertrofije, ki jo povzroča preobremenitev, utira pot testiranju tega sistema za prilagojeno terapijo.Skratka, ta študija dokazuje, da sta mehansko raztezanje in humoralna stimulacija kritični za ohranjanje kulture delov srčnega tkiva.
Čeprav tukaj predstavljeni podatki kažejo, da je CTCM zelo obetavna platforma za modeliranje nedotaknjenega miokarda, ima ta metoda kulture nekaj omejitev.Glavna omejitev kulture CTCM je, da povzroča stalne dinamične mehanske obremenitve na rezinah, kar onemogoča možnost aktivnega spremljanja kontrakcij srčnih rezin med vsakim ciklom.Poleg tega je zaradi majhne velikosti srčnih odsekov (7 mm) omejena zmožnost vrednotenja sistolične funkcije zunaj sistemov kulture z uporabo tradicionalnih senzorjev sile.V trenutnem rokopisu to omejitev delno premagamo z vrednotenjem optične napetosti kot indikatorja kontraktilne funkcije.Vendar pa bo ta omejitev zahtevala nadaljnje delo in jo bo mogoče obravnavati v prihodnosti z uvedbo metod za optično spremljanje delovanja srčnih rezin v kulturi, kot je optično kartiranje z uporabo kalcija in napetostno občutljivih barvil.Druga omejitev CTCM je, da delovni model ne manipulira s fiziološkim stresom (predobremenitvijo in naknadno obremenitvijo).V CTCM je bil pritisk induciran v nasprotnih smereh za reprodukcijo 25 % fiziološkega raztezanja v diastoli (polno raztezanje) in sistoli (dolžina kontrakcije med električno stimulacijo) v zelo velikih tkivih.To omejitev je treba odpraviti v prihodnjih načrtih CTCM z ustreznim pritiskom na srčno tkivo z obeh strani in z uporabo natančnih razmerij med tlakom in prostornino, ki se pojavljajo v srčnih komorah.
Preoblikovanje, povzročeno s prekomernim raztezanjem, o katerem poročajo v tem rokopisu, je omejeno na posnemanje signalov hipertrofičnega hiperraztezanja.Tako lahko ta model pomaga pri preučevanju hipertrofične signalizacije, ki jo povzroča raztezanje, brez potrebe po humoralnih ali nevronskih dejavnikih (ki v tem sistemu ne obstajajo).Potrebne so nadaljnje študije za povečanje množice CTCM, na primer so-kultiviranje z imunskimi celicami, krožečimi plazemskimi humoralnimi faktorji in inervacijo, ko bo so-kultiviranje z nevronskimi celicami izboljšalo možnosti modeliranja bolezni s CTCM.
V tej raziskavi je bilo uporabljenih trinajst prašičev.Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu z institucionalnimi smernicami in jih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze Louisville.Aortni lok smo zaklenili in srce perfuzirali z 1 L sterilne kardioplegike (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH do 7,4); srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini do transporta v laboratorij na ledu, kar je običajno <10 min. srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini do transporta v laboratorij na ledu, kar je običajno <10 min. srca so bila shranjena v ledeni kardioplegični raztopini za prenos v laboratorij na ledu, kar običajno traja <10 min. srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini do transporta v laboratorij na ledu, kar običajno traja <10 minut.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Držite srce v ledjani kardioplegiji do transportiranja v laboratoriju na ldu, običajno <10 min. Hranite srca na ledu kardioplegija do transporta v laboratorij na ledu, običajno <10 min.
Naprava CTCM je bila razvita v programski opremi za računalniško podprto načrtovanje (CAD) SolidWorks.Kulturne komore, delilniki in zračne komore so izdelani iz CNC prozorne akrilne plastike.Podporni obroč s premerom 7 mm je v sredini izdelan iz polietilena visoke gostote (HDPE) in ima utor za tesnilni obroček za namestitev silikonskega tesnilnega obročka, ki se uporablja za tesnjenje medija pod njim.Tanka membrana iz silicijevega dioksida ločuje komoro za kulturo od ločevalne plošče.Silikonska membrana je lasersko izrezana iz 0,02″ debele silikonske plošče in ima trdoto 35A.Spodnje in zgornje silikonsko tesnilo sta lasersko izrezana iz 1/16″ debele silikonske plošče in imata trdoto 50A.Vijaki iz nerjavečega jekla 316L in krilne matice se uporabljajo za pritrditev bloka in ustvarjanje nepredušnega tesnila.
Namensko tiskano vezje (PCB) je zasnovano za integracijo s sistemom C-PACE-EM.Vtičnice švicarskega strojnega konektorja na tiskanem vezju so povezane z grafitnimi elektrodami s posrebrenimi bakrenimi žicami in bronastimi vijaki 0-60, privitimi v elektrode.Tiskano vezje je nameščeno v pokrovu 3D tiskalnika.
Napravo CTCM krmili programabilni pnevmatski aktuator (PPD), ki ustvarja nadzorovan krvni tlak, podoben srčnemu ciklu.Ko se tlak v zračni komori poveča, se fleksibilna silikonska membrana razširi navzgor in potisne medij pod mesto tkiva.Območje tkiva se bo nato raztegnilo zaradi tega izgona tekočine, kar posnema fiziološko širjenje srca med diastolo.Na vrhuncu relaksacije je bila izvedena električna stimulacija preko grafitnih elektrod, ki je zmanjšala tlak v zračni komori in povzročila krčenje delov tkiva.V notranjosti cevi je hemostatski ventil s tlačnim senzorjem za zaznavanje tlaka v zračnem sistemu.Tlak, ki ga zazna senzor tlaka, se prenese na zbiralnik podatkov, ki je povezan s prenosnikom.To omogoča stalno spremljanje tlaka v plinski komori.Ko je bil dosežen najvišji tlak v komori (standardni 80 mmHg, 140 mmHg OS), je bilo napravi za pridobivanje podatkov naročeno, naj pošlje signal sistemu C-PACE-EM, da ustvari dvofazni napetostni signal za 2 ms, nastavljen na 4 V.
Dobili smo odseke srca in izvedli pogoje gojenja v 6 vdolbinicah, kot sledi: Prenesite pobrana srca iz posode za prenos na pladenj, ki vsebuje hladno (4°C) kardioplegijo.Levi prekat smo izolirali s sterilnim rezilom in razrezali na koščke 1-2 cm3.Ti tkivni bloki so bili pritrjeni na nosilce tkiva s tkivnim adhezivom in postavljeni v vibrirajočo mikrotomov tkivno kopel, ki vsebuje tirodovo raztopino, in neprekinjeno oksigenirano (3 g/L 2,3-butanedionski monooksim (BDM), 140 mm NaCl (8,18 g). g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 m raztopina), 1,8 mM Cacl2 (1,8 ml 1 m raztopina), do 1 L DDH2O).Vibrirajoči mikrotom je bil nastavljen za rezanje rezin debeline 300 µm pri frekvenci 80 Hz, horizontalni amplitudi vibracij 2 mm in hitrosti napredovanja 0,03 mm/s.Tkivna kopel je bila obdana z ledom, da je raztopina hladna, temperatura pa je bila vzdrževana pri 4 ° C.Prenesite dele tkiva iz mikrotomske kopeli v inkubacijsko kopel, ki vsebuje stalno oksigenirano raztopino Tyrode na ledu, dokler ne dobite dovolj odrezkov za eno ploščo s kulturo.Za transwell kulture so bili tkivni odseki pritrjeni na sterilne 6 mm široke poliuretanske nosilce in postavljeni v 6 ml optimiziranega medija (medij 199, 1x ITS dodatek, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalen in 2X antibiotik-protigliv).Električna stimulacija (10 V, frekvenca 1,2 Hz) je bila uporabljena na odsekih tkiva skozi C-Pace.Za pogoje TD smo dodali svež T3 in Dex pri 100 nM in 1 μM pri vsaki spremembi medija.Medij je nasičen s kisikom pred zamenjavo 3-krat na dan.Tkivne odseke smo gojili v inkubatorju pri 37 ° C in 5% CO2.
Za kulture CTCM so bili tkivni odseki postavljeni na 3D tiskalnik po meri v petriji, ki vsebuje spremenjeno Tyrodejevo raztopino.Naprava je zasnovana tako, da poveča velikost rezine srca za 25% površine podpornega obroča.To naredimo tako, da se deli srca po prenosu iz Tyrodove raztopine v medij in med diastolo ne raztegnejo.Z uporabo histoakrilnega lepila so bili odseki debeline 300 µm pritrjeni na podporni obroč s premerom 7 mm.Po pritrditvi delov tkiva na podporni obroč odrežite odvečne dele tkiva in postavite pritrjene dele tkiva nazaj v kopel z raztopino Tyrode na ledu (4 °C), dokler ne pripravite dovolj delov za eno napravo.Skupni čas obdelave za vse naprave ne sme presegati 2 uri.Potem ko je bilo 6 delov tkiva pritrjenih na njihove podporne obroče, je bila naprava CTCM sestavljena.Komora za kulturo CTCM je predhodno napolnjena z 21 ml predhodno oksigeniranega medija.Odseke tkiva prenesite v komoro za kulturo in s pipeto previdno odstranite vse zračne mehurčke.Odsek tkiva se nato usmeri v luknjo in nežno pritisne na svoje mesto.Nazadnje namestite pokrovček elektrode na napravo in prenesite napravo v inkubator.Nato povežite CTCM z zračno cevjo in sistemom C-PACE-EM.Pnevmatski aktuator se odpre in zračni ventil odpre CTCM.Sistem C-Pace-EM je bil konfiguriran tako, da je med dvofaznim korakom za 2 ms dostavil 4 V pri 1,2 Hz.Medij je bil spremenjen dvakrat na dan in elektrode so bile spremenjene enkrat na dan, da se izognemo kopičenju grafita na elektrodah.Po potrebi lahko tkivne odseke odstranimo iz svojih kulturnih vrtin, da izženejo vse zračne mehurčke, ki so morda padli pod njimi.Za pogoje zdravljenja z MT je bil T3/Dex dodan svež z vsako spremembo medija s 100 nM T3 in 1 μM Dex.Naprave CTCM smo gojili v inkubatorju pri 37 ° C in 5% CO2.
Za pridobitev raztegnjenih trajektorij rezin srca je bil razvit poseben sistem kamer.Fotoaparat SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonska) je bil uporabljen z makro objektivom Navitar Zoom 7000 18–108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizacija je bila izvedena pri sobni temperaturi po zamenjavi medija s svežim medijem.Kamera je postavljena pod kotom 51°, video pa se snema s hitrostjo 30 sličic na sekundo.Najprej je bila z Image-J uporabljena odprtokodna programska oprema (MUSCLEMOTION43) za kvantificiranje gibanja rezin srca.Maska je bila ustvarjena z uporabo MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ZDA) za določitev območij, ki so zanimiva za bitje rezin srca, da bi se izognili hrupu.Ročno segmentirane maske se uporabijo za vse slike v zaporedju okvirjev in se nato posredujejo v vtičnik MUSCLEMOTION.Muscle Motion uporablja povprečno intenzivnost slikovnih pik v vsakem okvirju, da kvantificira svoje gibanje glede na referenčni okvir.Podatki so bili zabeleženi, filtrirani in uporabljeni za količinsko določitev časa cikla in ocenjevanje raztezanja tkiva med srčnim ciklom.Posneti video je bil naknadno obdelan z digitalnim filtrom prvega reda.Za količinsko določitev raztezanja tkiv (vrhovni do vrha) je bila izvedena analiza vrha do vrha, da se razlikuje med vrhovi in ​​korita v zabeleženem signalu.Poleg tega se odstrani s pomočjo polinoma 6. reda za odpravo signala.Programska koda je bila razvita v MATLAB za določanje globalnega gibanja tkiva, časa cikla, časa sprostitve in časa krčenja (koda dodatnega programa 44).
Za analizo obremenitve smo z uporabo istih videoposnetkov, ustvarjenih za oceno mehanskega raztezanja, najprej izsledili dve sliki, ki predstavljata vrhove gibanja (najvišjo (zgornjo) in najnižjo (spodnjo) točko gibanja) v skladu s programsko opremo MUSCLEMOTION.Nato smo segmentirali tkiva in uporabili obliko algoritma senčenja na segmentirano tkivo (dodatna slika 2A).Segmentirano tkivo je bilo nato razdeljeno na deset podpovršin in napetost na vsaki površini je bila izračunana z naslednjo enačbo: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kjer sta Sup in Sdown razdalji oblike od zgornje oziroma spodnje sence tkanine (dopolnilna slika .2b).
Odseke srca smo fiksirali v 4% paraformaldehidu 48 ur.Fiksna tkiva smo 1 uro dehidrirali v 10% in 20% saharozi, nato pa čez noč v 30% saharozi.Odseke smo nato vdelali v spojino za optimalno rezalno temperaturo (spojina OCT) in postopoma zamrznili v kopeli izopentan/suh led.Shranjujte bloke vdelave OCT pri -80 ° C do ločitve.Predmetna stekelca smo pripravili kot odseke debeline 8 μm.
Če želite odstraniti OCT iz srčnih odsekov, 5 minut na 95 ° C segrejte diapozitive na ogrevalnem bloku pri 95 ° C.Dodajte 1 ml PBS na vsako stekelce in inkubirajte 30 minut pri sobni temperaturi, nato prepojite odseke tako, da nastavite 0,1 % Triton-X v PBS za 15 minut pri sobni temperaturi.Da preprečite, da bi se nespecifična protitelesa vezala na vzorec, dodajte 1 ml 3 % raztopine BSA na stekelca in inkubirajte 1 uro pri sobni temperaturi.BSA smo nato odstranili in stekelca sprali s PBS.Vsak vzorec označite s svinčnikom.Primarna protitelesa (razredčena 1:200 v 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) in troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) so bila dodana v 90 minutah, nato pa še sekundarna protitelesa (razredčena 1:200 v 1% BSA) proti mišji Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), proti zajčji Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) dodatnih 90 minut. 3-krat sprano s PBS. Za razlikovanje ciljnega obarvanja od ozadja smo kot kontrolo uporabili samo sekundarno protitelo. Nazadnje smo dodali jedrsko barvanje DAPI in stekelca postavili v vectashield (Vector Laboratories) in zapečatena z lakom za nohte.-x povečava) in mikroskop Keyence s 40-kratno povečavo.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pri 5 μg/ml v PBS smo uporabili za barvanje z WGA in nanesli na fiksne odseke za 30 minut pri sobni temperaturi.Stekelca smo nato sprali s PBS in vsakemu stekelcu dodali sudansko črno ter inkubirali 30 minut.Diapozitive smo nato oprali s PBS in dodali smo medij za vgradnjo Vectashield.Diapozitivi so bili vizualizirani na Keyence mikroskopu pri 40 -kratni povečavi.
OCT je bil odstranjen iz vzorcev, kot je opisano zgoraj.Po odstranitvi OCT potopite diapozitive v Bouinovi raztopini čez noč.Predmetna stekelca smo nato 1 uro izpirali z destilirano vodo in jih nato za 10 minut dali v raztopino fuksina aloe kisline Bibrich.Nato stekelca speremo z destilirano vodo in postavimo v raztopino 5 % fosfomolibdena/5 % fosfovolframove kisline za 10 minut.Brez izpiranja stekelca za 15 minut prenesite neposredno v raztopino anilinsko modre barve.Nato stekelca speremo z destilirano vodo in damo v 1% raztopino ocetne kisline za 2 minuti.Predmetna stekelca smo posušili v 200 N etanolu in prenesli v ksilen.Obarvana preparata smo vizualizirali z uporabo mikroskopa Keyence z 10-kratnim objektivom.Odstotek površine fibroze je bil kvantificiran s programsko opremo Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloška številka V13154, v skladu s protokolom proizvajalca z nekaterimi spremembami.Zlasti je bil uporabljen kirurški luknjač s premerom 6 mm, da se med analizo MTT zagotovi enotna velikost tkiva.Tkiva so bila posamično nanesena v vdolbinice plošče z 12 vdolbinicami, ki je vsebovala substrat MTT, v skladu s protokolom proizvajalca.Odseki se 3 ure inkubirajo pri 37 ° C in živo tkivo presnavlja podlago MTT, da tvori vijolično spojino formazan.Raztopino MTT zamenjajte z 1 ml DMSO in inkubirajte pri 37 ° C 15 minut, da iz srčnih odsekov izvlečete vijolični formazan.Vzorce smo razredčili 1:10 v DMSO v ploščah s prozornim dnom s 96 vdolbinicami in izmerili intenzivnost vijolične barve pri 570 nm z bralnikom plošč Cytation (BioTek).Odčitki so bili normalizirani na težo vsake rezine srca.
Medij za srčne rezine je bil nadomeščen z medijem, ki je vseboval 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ZDA) za preskus izkoriščanja glukoze, kot je opisano prej.Po 4 urah inkubacije dodajte 100 ul medija v odprto cev mikrocentrifuge, ki vsebuje 100 µL 0,2 N HCl.Nato smo cev postavili v scintilacijsko cev, ki vsebuje 500 μl DH2O, da izhlapimo [3H] 2O 72 ur pri 37 ° C.Nato odstranite mikrocentrifugirno cev iz scintilacijske epruvete in dodajte 10 ml scintilacijske tekočine.Scintilacijsko štetje je bilo izvedeno z uporabo tekočega scintilacijskega analizatorja Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ZDA).Uporabo glukoze smo nato izračunali ob upoštevanju specifične aktivnosti [5-3H]-glukoze, nepopolnega ravnovesja in ozadja, razredčitve [5-3H]-na neoznačeno glukozo in učinkovitosti scintilacijskega števca.Podatki so normalizirani na maso delov srca.
Po homogenizaciji tkiva v Trizolu smo RNA izolirali iz delov srca z uporabo Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 v skladu s protokolom proizvajalca.Priprava knjižnice RNAsec, sekvenciranje in analiza podatkov so bili izvedeni na naslednji način:
Kot izhodiščni material za pripravo knjižnice RNA smo uporabili 1 μg RNA na vzorec.Knjižnice sekvenciranja so bile ustvarjene z uporabo NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit za Illumina (NEB, ZDA) po priporočilih proizvajalca, indeksne kode pa so bile dodane zaporedjem atributov za vsak vzorec.Na kratko smo mRNA očistili iz skupne RNA z uporabo magnetnih kroglic, pritrjenih s poli-oligonukleotidi.Fragmentacija se izvaja z uporabo dvovalentnih kationov pri visoki temperaturi v reakcijskem puferju za sintezo prvega niza v nebnektu (5x).Prvo verigo cDNA smo sintetizirali z uporabo naključnih heksamernih začetnikov in M-MuLV reverzne transkriptaze (RNase H-).Drugo verigo cDNA nato sintetiziramo z uporabo DNA polimeraze I in RNaze H. Preostale previse pretvorimo v tope konce z eksonukleazno/polimerazno aktivnostjo.Po adenilaciji 3′ konca fragmenta DNK se nanj pritrdi adapter NEBNext s strukturo lasne zanke, da se pripravi na hibridizacijo.Za izbiro fragmentov cDNA prednostne dolžine 150-200 bp.fragmenti knjižnice so bili prečiščeni s sistemom AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, ZDA).Nato smo uporabili 3 μl encima USER (NEB, ZDA) z velikostno izbrano cDNA, povezano z adapterjem, 15 minut pri 37 °C in nato 5 minut pri 95 °C pred PCR.PCR je bil nato izveden z uporabo Phusion High-Fidelity DNA polimeraze, univerzalnih PCR primerjev in Index (X) primerjev.Končno smo produkte PCR očistili (sistem AMPure XP) in kakovost knjižnice ocenili na sistemu Agilent Bioanalyzer 2100.Knjižnico cDNA smo nato sekvencirali z uporabo sekvencerja Novaseq.Neobdelane slikovne datoteke iz Illumine so bile pretvorjene v neobdelane odčitke z uporabo CASAVA Base Calling.Neobdelani podatki so shranjeni v datotekah formata FASTQ(fq), ki vsebujejo bralna zaporedja in ustrezne osnovne kakovosti.Izberite HISAT2, da ujemate filtrirane odčitke zaporedja z referenčnim genomom Sscrofa11.1.Na splošno HISAT2 podpira genome vseh velikosti, vključno z genomi, večjimi od 4 milijard baz, in privzete vrednosti so nastavljene za večino parametrov.Spajanje odčitkov iz podatkov RNA Seq je mogoče učinkovito uskladiti z uporabo HISAT2, najhitrejšega sistema, ki je trenutno na voljo, z enako ali boljšo natančnostjo kot katera koli druga metoda.
Število transkriptov neposredno odraža raven izražanja genov.Ravni ekspresije genov se ocenjujejo z številčnostjo transkriptov (število zaporedja), povezanih z genomom ali eksoni.Število odčitkov je sorazmerno s stopnjam ekspresije genov, dolžino genov in globino zaporedja.FPKM (fragmenti na tisoč baznih parov transkripta, sekvencirani na milijon baznih parov) so bili izračunani in P-vrednosti diferencialne ekspresije so bile določene z uporabo paketa DESeq2.Nato smo izračunali stopnjo lažnega odkrivanja (FDR) za vsako vrednost P z uporabo Benjamini-Hochbergove metode9 na podlagi vgrajene R-funkcije »p.adjust«.
RNA, izolirana iz delov srca, je bila pretvorjena v cDNA pri koncentraciji 200 ng/μl z uporabo mešanice SuperScript IV Vilo Master podjetja Thermo (Thermo, kat. št. 11756050).Kvantitativno RT-PCR smo izvedli z uporabo prozorne reakcijske plošče Applied Biosystems Endura Plate Microamp s 384 jamicami (Thermo, kat. št. 4483319) in optičnega lepila microamp (Thermo, kat. št. 4311971).Reakcijska zmes je bila sestavljena iz 5 µl mešanice Taqman Fast Advanced Master (Thermo, kat. št. 4444557), 0,5 µl Taqman Primerja in 3,5 µl H2O, pomešanih na vdolbinico.Izvedeni so bili standardni cikli qPCR in vrednosti CT so bile izmerjene z uporabo instrumenta Applied Biosystems Quantstudio 5 za PCR v realnem času (modul s 384 vdolbinicami; izdelek št. A28135).Primerji Taqman so bili kupljeni pri Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_m) H), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Vrednosti CT vseh vzorcev so bile normalizirane na gospodinjski gen GAPDH.
Sproščanje NT-ProBNP v medije je bilo ocenjeno s kompletom NT-ProBNP (prašič) (kat. št. MBS2086979, MyBioSource) v skladu s protokolom proizvajalca.Na kratko, 250 µl vsakega vzorca in standarda smo dodali v dvojniku v vsako vdolbinico.Takoj po dodajanju vzorca v vsako jamico dodajte 50 µl testnega reagenta A.Plošče nežno pretresite in tesnilo s tesnilno maso.Nato smo 1 uro inkubirali tablete pri 37 ° C.Nato raztopino aspiracijo in vrtine operete 4-krat z 350 µL raztopine 1x pranja, pri čemer vsakič inkubirate raztopino za pranje 1-2 minut.Nato dodajte 100 ul testnega reagenta B na vrtino in tesnilo s tesnilno maso.Tableto smo 30 minut nežno pretresli in inkubirali pri 37 ° C.Raztopino aspirate in vrtine operete 5 -krat z 350 µL raztopine 1x pranja.V vsako vrtino dodajte 90 ul raztopine substrata in zatesnite ploščo.Plošče inkubirajte pri 37 ° C 10-20 minut.V vsako vrtino dodajte 50 ul raztopine za zaustavitev.Plošča je bila takoj izmerjena s pomočjo čitalnika citacije (BioTek), ki je nastavljen pri 450 nm.
Izvedene so bile analize moči za izbiro velikosti skupin, ki bodo zagotovile >80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra s 5 % stopnjo napak tipa I. Izvedene so bile analize moči za izbiro velikosti skupin, ki bodo zagotovile >80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra s 5 % stopnjo napak tipa I. Analiza moči je bila izvedena za izbiro velikosti skupine, ki zagotavlja >80 % moči za odkrite spremembe 10 % absolutnega parametra s 5 % pogoste napake tipa I. Izvedena je bila analiza moči za izbiro velikosti skupin, ki bi zagotovile >80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra s 5 % stopnjo napak tipa I.进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 参数 参数 中 10 ％ ％ 绝对 变化 和 5 ％ i 型 型 错误率 错误率 的 组。。。。。。。。。。。。。。。。。。。进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 参数 参数 中 10 ％ ％ 绝对 变化 和 5 ％ i 型 型 错误率 错误率 的 组。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Izvedena je bila analiza moči za izbiro velikosti skupine, ki je zagotavljala > 80 % moči za odkrite spremembe 10 % absolutnih parametrov in 5 % frekvence napak tipa I. Izvedena je bila analiza moči, da bi izbrali velikost skupine, ki bi zagotovila >80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra in 5 % stopnje napak tipa I.Pred poskusom so bili naključno izbrani tkivni odseki.Vse analize so bile slepe in vzorci so bili dekodirani šele potem, ko so bili vsi podatki analizirani.Za izvajanje vseh statističnih analiz je bila uporabljena programska oprema GraphPad Prism (San Diego, CA). Pri vseh statističnih podatkih so bile vrednosti P pri vrednostih <0,05 ocenjene kot pomembne. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05. Za celotno statistiko so se p-značilnosti štele za pomembne pri pomenih <0,05. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za celotno statistiko so se p-značilnosti štele za pomembne pri pomenih <0,05. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05.Dvostranski Studentov t-test je bil izveden na podatkih z le 2 primerjavama.Za določitev pomembnosti med več skupinami je bila uporabljena enosmerna ali dvosmerna ANOVA.Pri izvajanju post hoc testov je bil uporabljen Tukeyjev popravek za upoštevanje večkratnih primerjav.Podatki RNAsec imajo posebne statistične vidike pri izračunu FDR in p.adjust, kot je opisano v razdelku Metode.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek Nature Research Report, ki je povezan s tem člankom.