Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Nove imunološke in masnospektrometrične metode za kompleksno analizo perzistentnih oligosaharidov v koruznih steblih, predhodno obdelanih z AFEX. Lignocelulozna biomasa je trajnostna alternativa fosilnim gorivom in se pogosto uporablja za razvoj biotehnologij za proizvodnjo izdelkov, kot so hrana, krma, goriva in kemikalije. Ključ do teh tehnologij je razvoj stroškovno konkurenčnih postopkov za pretvorbo kompleksnih ogljikovih hidratov, prisotnih v rastlinskih celičnih stenah, v preproste sladkorje, kot so glukoza, ksiloza in arabinoza. Ker je lignocelulozna biomasa zelo trdovratna, jo je treba za pridobitev želenega produkta podvrči termokemični obdelavi (npr. luščenje amonijevih vlaken (AFEX), razredčene kisline (DA), ionske tekočine (IL)) in biološki obdelavi (npr. encimski hidrolizi in mikrobni fermentaciji). Vendar pa je pri uporabi komercialnih glivičnih encimov v procesu hidrolize le 75–85 % nastalih topnih sladkorjev monosaharidov, preostalih 15–25 % pa so topni, neobvladljivi oligosaharidi, ki mikroorganizmom niso vedno na voljo. Predhodno smo uspešno izolirali in očistili topne trdovratne oligosaharide z uporabo kombinacije ločevanja ogljika in diatomejske zemlje ter izključitvene kromatografije po velikosti ter raziskali tudi njihove inhibitorne lastnosti za encime. Ugotovili smo, da je oligosaharide, ki vsebujejo metilirane uronske kisline z višjo stopnjo polimerizacije (DP), težje obdelati s komercialnimi mešanicami encimov kot oligosaharide z nizko DP in nevtralne oligosaharide. Tukaj poročamo o uporabi več dodatnih metod, vključno s profiliranjem glikanov z uporabo monoklonskih protiteles (mAb), specifičnih za glikane rastlinske biomase, za karakterizacijo glikanskih vezi v celičnih stenah rastlin in encimskih hidrolizatih, ionizacijo z lasersko desorpcijo s pomočjo matrice in masno spektrometrijo s časom preleta. MALDI-TOF-MS uporablja strukturno informativne diagnostične vrhove, pridobljene s spektroskopijo po sekundarnem razpadu negativnih ionov, plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC-MS) za karakterizacijo oligosaharidnih vezi z derivatizacijo in brez nje. Zaradi majhnosti oligosaharidov (DP 4–20) je te molekule težko uporabiti za vezavo in karakterizacijo mAb. Da bi premagali to težavo, smo uporabili novo metodo imobilizacije oligosaharidov na osnovi konjugacije z biotinom, ki je uspešno označila večino oligosaharidov, topnih z nizko DP, na površini mikroplošče, nato pa smo jo uporabili v visokozmogljivem sistemu monoklonskih protiteles za specifično ligacijsko analizo. Ta nova metoda bo v prihodnosti olajšala razvoj naprednejših visokozmogljivih testov glikoma, ki jih bomo lahko uporabili za izolacijo in karakterizacijo oligosaharidov, prisotnih v biomarkerjih, v diagnostične namene.
Lignocelulozna biomasa, sestavljena iz kmetijskih, gozdarskih, travnih in lesnih materialov, je potencialna surovina za proizvodnjo bioloških izdelkov, vključno s hrano, krmo, gorivom in kemičnimi predhodniki za proizvodnjo izdelkov z višjo vrednostjo1. Ogljikovi hidrati (kot sta celuloza in hemiceluloza), prisotni v rastlinskih celičnih stenah, se s kemično obdelavo in biotransformacijo (kot sta encimska hidroliza in mikrobna fermentacija) depolimerizirajo v monosaharide. Pogoste predobdelave vključujejo ekspanzijo amonijevih vlaken (AFEX), razredčeno kislino (DA), ionsko tekočino (IL) in parno eksplozijo (SE), ki uporabljajo kombinacijo kemikalij in toplote za zmanjšanje proizvodnje lignoceluloze z odpiranjem rastlinskih celičnih sten3,4. trdovratnost snovi,5. Encimska hidroliza se izvaja pri visoki obremenitvi s trdnimi snovmi z uporabo komercialnih encimov, ki vsebujejo aktivne ogljikove hidrate (CAZymes), in mikrobne fermentacije z uporabo transgenih kvasovk ali bakterij za proizvodnjo bioloških goriv in kemikalij6.
CAZimi v komercialnih encimih so sestavljeni iz kompleksne mešanice encimov, ki sinergistično cepijo kompleksne vezi med ogljikovimi hidrati in sladkorji ter tvorijo monosaharide2,7. Kot smo že poročali, jih kompleksna mreža aromatskih polimerov lignina z ogljikovimi hidrati zelo otežuje obdelavo, kar vodi v nepopolno pretvorbo sladkorja, pri čemer se kopiči 15–25 % spolnih oligosaharidov, ki se ne proizvedejo med encimsko hidrolizo predhodno obdelane biomase. To je pogosta težava pri različnih metodah predobdelave biomase. Med razlogi za to ozko grlo so zaviranje encimov med hidrolizo ali odsotnost ali nizke ravni esencialnih encimov, ki so potrebni za prekinitev sladkornih vezi v rastlinski biomasi. Razumevanje sestave in strukturnih značilnosti sladkorjev, kot so sladkorne vezi v oligosaharidih, nam bo pomagalo izboljšati pretvorbo sladkorja med hidrolizo, s čimer bodo biotehnološki procesi stroškovno konkurenčni proizvodom, pridobljenim iz nafte.
Določanje strukture ogljikovih hidratov je zahtevno in zahteva kombinacijo metod, kot so tekočinska kromatografija (LC)11,12, jedrska magnetna resonančna spektroskopija (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 in masna spektrometrija (MS)17. ,osemnajst. MS metode, kot je masna spektrometrija s časom preleta z lasersko desorpcijo in ionizacijo z uporabo matrice (MALDI-TOF-MS), so vsestranska metoda za identifikacijo ogljikohidratnih struktur. V zadnjem času se za identifikacijo prstnih odtisov, ki ustrezajo pritrdilnim položajem oligosaharidov, anomernim konfiguracijam, zaporedjem in položajem razvejanosti 20, 21, najpogosteje uporablja tandemska MS z disociacijo, povzročeno s trki (CID), ki jo povzročajo adukti natrijevih ionov.
Analiza glikanov je odlično orodje za poglobljeno identifikacijo ogljikohidratnih vezi22. Ta metoda uporablja monoklonska protitelesa (mAb), usmerjena proti glikanu v rastlinski celični steni, kot sonde za razumevanje kompleksnih ogljikohidratnih povezav. Po vsem svetu je na voljo več kot 250 mAb, zasnovanih proti različnim linearnim in razvejanim oligosaharidom z uporabo različnih saharidov24. Več mAb se pogosto uporablja za karakterizacijo strukture, sestave in modifikacij rastlinske celične stene, saj obstajajo pomembne razlike glede na vrsto rastlinske celice, organ, starost, razvojno stopnjo in rastno okolje25,26. V zadnjem času se ta metoda uporablja za razumevanje populacij veziklov v rastlinskih in živalskih sistemih in njihovih vlog pri transportu glikanov, kot jih določajo subcelični markerji, razvojne stopnje ali okoljski dražljaji, ter za določanje encimske aktivnosti. Nekatere različne strukture glikanov in ksilanov, ki so bile identificirane, vključujejo pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), glukane z mešanimi vezmi (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsko kislino-arabinoksilan (GArbX) in arabino-galaktan (ArbG)29.
Vendar pa se je kljub vsem tem raziskovalnim prizadevanjem le nekaj študij osredotočilo na naravo kopičenja oligosaharidov med hidrolizo z visoko vsebnostjo trdnih snovi (HSL), vključno s sproščanjem oligosaharidov, spremembami dolžine oligomernih verig med hidrolizo, različnimi polimeri z nizkim DP in njihovimi krivuljami porazdelitve 30,31,32. Medtem, čeprav se je analiza glikanov izkazala za uporabno orodje za celovito analizo strukture glikanov, je težko oceniti vodotopne oligosaharide z nizkim DP z uporabo metod s protitelesi. Manjši DP oligosaharidi z molekulsko maso manj kot 5-10 kDa se ne vežejo na ELISA plošče 33, 34 in se pred dodatkom protiteles sperejo.
Tukaj prvič prikazujemo ELISA test na ploščah, prevlečenih z avidinom, z uporabo monoklonskih protiteles, ki združuje enostopenjski postopek biotinilacije za topne refraktorne oligosaharide z analizo glikoma. Naš pristop k analizi glikoma je bil potrjen z analizo komplementarnih oligosaharidnih vezi na osnovi MALDI-TOF-MS in GC-MS z uporabo derivatizacije hidroliziranih sladkornih sestavkov s trimetilsililom (TMS). Ta inovativen pristop se lahko v prihodnosti razvije kot visokozmogljiva metoda in najde širšo uporabo v biomedicinskih raziskavah35.
Posttranslacijske modifikacije encimov in protiteles, kot je glikozilacija,36 vplivajo na njihovo biološko aktivnost. Na primer, spremembe v glikozilaciji serumskih beljakovin igrajo pomembno vlogo pri vnetnem artritisu, spremembe v glikozilaciji pa se uporabljajo kot diagnostični označevalci37. V literaturi so poročali o različnih glikanih, ki se zlahka pojavijo pri različnih boleznih, vključno s kroničnimi vnetnimi boleznimi prebavil in jeter, virusnimi okužbami, rakom jajčnikov, dojk in prostate38,39,40. Razumevanje strukture glikanov z uporabo metod ELISA za določanje glikanov na osnovi protiteles bo zagotovilo dodatno zaupanje pri diagnosticiranju bolezni brez uporabe kompleksnih metod MS.
Naša prejšnja študija je pokazala, da trdovratni oligosaharidi po predobdelavi in ​​encimski hidrolizi ostanejo nehidrolizirani (slika 1). V našem predhodno objavljenem delu smo razvili metodo ekstrakcije z aktivnim ogljem v trdni fazi za izolacijo oligosaharidov iz hidrolizata koruznih stebel (ACSH)8, predhodno obdelanega z AFEX. Po začetni ekstrakciji in ločitvi smo oligosaharide nadalje frakcionirali z izključitveno kromatografijo po velikosti (SEC) in zbrali po vrstnem redu molekulske mase. Sladkorne monomere in oligomere, sproščene iz različnih predobdelav, smo analizirali z analizo sestave sladkorja. Pri primerjavi vsebnosti sladkornih oligomerov, pridobljenih z različnimi metodami predobdelave, je prisotnost trdovratnih oligosaharidov pogosta težava pri pretvorbi biomase v monosaharide in lahko povzroči zmanjšanje izkoristka sladkorja za vsaj 10–15 % in celo do 18 % v ZDA. Ta metoda se uporablja za nadaljnjo obsežno proizvodnjo oligosaharidnih frakcij. Nastali ACH in njegove nadaljnje frakcije z različnimi molekulskimi masami so bili uporabljeni kot eksperimentalni material za karakterizacijo oligosaharidov v tem delu.
Po predobdelavi in ​​encimski hidrolizi so obstojni oligosaharidi ostali nehidrolizirani. Tukaj (A) je metoda ločevanja oligosaharidov, pri kateri se oligosaharidi izolirajo iz hidrolizata koruznih stebel (ACSH), predhodno obdelanih z AFEX, z uporabo polne plasti aktivnega oglja in diatomejske zemlje; (B) Metoda za ločevanje oligosaharidov. Oligosaharidi so bili nadalje ločeni z izključitveno kromatografijo (SEC); (C) Saharidni monomeri in oligomeri, sproščeni iz različnih predobdelav (razredčena kislina: DA, ionska tekočina: IL in AFEX). Pogoji encimske hidrolize: visoka vsebnost trdnih snovi 25 % (m/m) (približno 8 % vsebnost glukana), 96 ur hidrolize, količina komercialnega encima 20 mg/g (razmerje Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) in (D) Sladkorni monomeri in oligomeri glukoze, ksiloze in arabinoze, sproščeni iz koruznih stebel, predhodno obdelanih z AFEX (ACS).
Analiza glikanov se je izkazala za uporabno orodje za celovito strukturno analizo glikanov v ekstraktih, izoliranih iz ostankov trdne biomase. Vendar pa so vodotopni saharidi s to tradicionalno metodo premalo zastopani,41 ker je oligosaharide z nizko molekulsko maso težko imobilizirati na ELISA ploščah in se pred dodajanjem protiteles izperejo. Zato je bila za vezavo in karakterizacijo protiteles uporabljena enostopenjska metoda biotinilacije za premaz topnih, neskladnih oligosaharidov na ELISA ploščah, prevlečenih z avidinom. To metodo smo preizkusili z uporabo našega predhodno proizvedenega ACSH in frakcije, ki temelji na njegovi molekulski masi (ali stopnji polimerizacije, DP). Enostopenjska biotinilacija je bila uporabljena za povečanje afinitete vezave oligosaharidov z dodajanjem biotin-LC-hidrazida na reducirni konec ogljikovega hidrata (slika 2). V raztopini hemiacetalna skupina na reducirnem koncu reagira s hidrazidno skupino biotin-LC-hidrazida in tvori hidrazonsko vez. V prisotnosti redukcijskega sredstva NaCNBH3 se hidrazonska vez reducira v stabilen biotiniliran končni produkt. Z modifikacijo konca, ki reducira sladkor, je postala mogoča vezava oligosaharidov z nizkim DP na plošče ELISA, v naši študiji pa smo to storili na ploščah, prevlečenih z avidinom, z uporabo glikansko usmerjenih monoklonskih protiteles.
Presejalni test monoklonskih protiteles za biotinilirane oligosaharide na osnovi testa ELISA. Tukaj (A) kombinirana biotinilacija oligosaharidov in naknadni presejalni test ELISA z monoklonskimi protitelesi, usmerjenimi proti glikanom, na ploščah, prevlečenih z NeutrAvidinom, (B) pa prikazuje enostopenjski postopek za biotinilacijo reakcijskih produktov.
Plošče, prevlečene z avidinom in oligosaharidno konjugiranimi protitelesi, so bile nato dodane primarnim in sekundarnim protitelesom ter oprane v svetlobno in časovno občutljivem mediju. Po končani vezavi protiteles je bil dodan substrat TMB za inkubacijo plošče. Reakcija je bila dokončno ustavljena z žveplovo kislino. Inkubirane plošče so bile analizirane z ELISA čitalnikom, da bi določili vezavno moč vsakega protitelesa in odkrili zamreženje, specifično za protitelesa. Za podrobnosti in parametre poskusa glejte ustrezni razdelek »Materiali in metode«.
Uporabnost te novo razvite metode za specifične aplikacije prikazujemo z karakterizacijo topnih oligosaharidov, prisotnih v ACSH, kot tudi v surovih in prečiščenih oligosaharidnih frakcijah, izoliranih iz lignoceluloznih hidrolizatov. Kot je prikazano na sliki 3, so najpogostejši epitopno substituirani ksilani, identificirani v ACSH z uporabo metod bioaciliranega glikoma, običajno uronski (U) ali metiluronski (MeU) in pektinski arabinogalaktani. Večina jih je bila najdena tudi v naši prejšnji študiji o analizi glikanov nehidroliziranih trdnih snovi (UHS)43.
Detekcija rekalcitrantnih oligosaharidnih epitopov z uporabo monoklonskega protitelesa, usmerjenega proti glikanu celične stene. "Nevtralna" frakcija je frakcija ACN, "kisla" frakcija pa frakcija FA. Svetlejše rdeče barve na toplotnem zemljevidu označujejo višjo vsebnost epitopov, svetlejše modre pa prazno ozadje. Barvne vrednosti na lestvici temeljijo na surovih vrednostih optične gostote (OD) za formulacije N=2. Glavni epitopi, ki jih prepoznajo protitelesa, so prikazani na desni.
Teh neceluloznih struktur najpogostejše celulaze in hemicelulaze v testirani komercialni mešanici encimov, ki vključuje najpogosteje uporabljene komercialne encime, niso mogle cepiti. Zato so za njihovo hidrolizo potrebni novi pomožni encimi. Brez potrebnih neceluloznih pomožnih encimov te necelulozne vezi preprečujejo popolno pretvorbo v monosaharide, tudi če se njihovi matični sladkorni polimeri obsežno hidrolizirajo v krajše fragmente in raztopijo z uporabo komercialnih mešanic encimov.
Nadaljnja študija porazdelitve signala in njegove vezavne moči je pokazala, da so bili vezavni epitopi nižji v sladkornih frakcijah z visokim DP (A, B, C, DP do 20+) kot v frakcijah z nizkim DP (D, E, F, DP) v dimerjih) (slika 1). Kislinski fragmenti so pogostejši v neceluloznih epitopih kot v nevtralnih fragmentih. Ti pojavi so skladni z vzorcem, opaženim v naši prejšnji študiji, kjer so bili visoki DP in kisli deli bolj odporni na encimsko hidrolizo. Zato lahko prisotnost neceluloznih glikanskih epitopov ter substitucij U in MeU močno prispeva k stabilnosti oligosaharidov. Treba je opozoriti, da je lahko učinkovitost vezave in detekcije problematična pri oligosaharidih z nizkim DP, zlasti če je epitop dimerni ali trimerni oligosaharid. To je mogoče preizkusiti z uporabo komercialnih oligosaharidov različnih dolžin, od katerih vsak vsebuje le en epitop, ki se veže na specifično mAb.
Uporaba strukturno specifičnih protiteles je tako razkrila določene vrste trdovratnih vezi. Glede na vrsto uporabljenega protitelesa, ustrezen vzorec ligacije in moč signala, ki ga proizvaja (največji in najmanjši), je mogoče identificirati nove encime in jih delno kvantitativno dodati mešanici encimov za popolnejšo glikokonverzijo. Na primeru analize oligosaharidov ACSH lahko ustvarimo bazo podatkov glikanskih vezi za vsak biomasni material. Tukaj je treba opozoriti, da je treba upoštevati različno afiniteto protiteles, in če njihova afiniteta ni znana, bo to povzročilo določene težave pri primerjavi signalov različnih protiteles. Poleg tega je lahko primerjava glikanskih vezi med vzorci za isto protitelo najboljša. Te trdovratne vezi lahko nato povežemo z bazo podatkov CAZyme, iz katere lahko identificiramo encime, izberemo kandidatne encime in testiramo encime, ki prekinjajo vezi, ali pa razvijemo mikrobne sisteme za izražanje teh encimov za uporabo v biorafinerijah44.
Da bi ocenili, kako imunološke metode dopolnjujejo alternativne metode za karakterizacijo oligosaharidov z nizko molekulsko maso, prisotnih v lignoceluloznih hidrolizatih, smo izvedli MALDI (slika 4, S1-S8) in analizo saharidov, pridobljenih s TMS, na podlagi GC-MS na istem panelu (slika 5) oligosaharidnega dela. MALDI se uporablja za primerjavo, ali se masna porazdelitev molekul oligosaharidov ujema z načrtovano strukturo. Slika 4 prikazuje MS nevtralnih komponent ACN-A in ACN-B. Analiza ACN-A je potrdila vrsto pentoznih sladkorjev od DP 4–8 (slika 4) do DP 22 (slika S1), katerih teže ustrezajo MeU-ksilanskim oligosaharidom. Analiza ACN-B je potrdila serijo pentoz in gluoksilanov z DP 8–15. V dodatnem gradivu, kot je slika S3, zemljevidi porazdelitve mase kislih delcev FA-C prikazujejo vrsto pentoznih sladkorjev, substituiranih z (Me)U, z DP 8–15, kar je skladno s substituiranimi ksilani, najdenimi pri presejanju monoklonskih protiteles na osnovi ELISA. Epitopi so skladni.
MALDI-MS spekter topnih neskladnih oligosaharidov, prisotnih v ACS. Tukaj (A) frakcije ACN-A z nizko maso, ki vsebujejo metilirane uronske kisline (DP 4-8), substituirane z glukuroksilanskim oligosaharidom, in (B) ksilan ACN-B in metilirane uronske kislinske oligosaharide, substituirane z glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sestave glikanskega ostanka refraktornih oligosaharidov. Tukaj (A) Sestava saharidov TMS različnih oligosaharidnih frakcij, pridobljenih z analizo GC-MS. (B) Strukture različnih sladkorjev, pridobljenih iz TMS, prisotnih v oligosaharidih. ACN – acetonitrilna frakcija, ki vsebuje nevtralne oligosaharide, in FA – frakcija ferulne kisline, ki vsebuje kisle oligosaharide.
Še en zanimiv zaključek je bil izpeljan iz LC-MS analize oligosaharidne frakcije, kot je prikazano na sliki S9 (metode si lahko ogledate v dodatnem elektronskem gradivu). Med ligacijo frakcije ACN-B so bili večkrat opaženi fragmenti heksoznih in -OAc skupin. Ta ugotovitev ne le potrjuje fragmentacijo, opaženo pri analizi glikoma in MALDI-TOF, temveč tudi zagotavlja nove informacije o potencialnih derivatih ogljikohidratov v predhodno obdelani lignocelulozni biomasi.
Izvedli smo tudi analizo sestave glikanov oligosaharidnih frakcij z uporabo derivatizacije glikanov s TMS. Z uporabo GC-MS smo določili sestavo nevronskih (nederivatnih) in kislih sladkorjev (GluA in GalA) v oligosaharidni frakciji (slika 5). Glukuronska kislina se nahaja v kislih komponentah C in D, medtem ko se galakturonska kislina nahaja v kislih komponentah A in B, ki sta obe komponenti kislih sladkorjev z visokim DP. Ti rezultati ne le potrjujejo naše podatke ELISA in MALDI, temveč so tudi skladni z našimi prejšnjimi študijami kopičenja oligosaharidov. Zato menimo, da so sodobne imunološke metode z biotinilacijo oligosaharidov in poznejšim presejanjem z ELISA zadostne za odkrivanje topnih rekalcitrantnih oligosaharidov v različnih bioloških vzorcih.
Ker so bile metode presejanja monoklonskih protiteles na osnovi ELISA validirane z več različnimi metodami, smo želeli podrobneje raziskati potencial te nove kvantitativne metode. Nabavili smo dva komercialna oligosaharida, ksiloheksasaharid oligosaharid (XHE) in 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotriozo (A2XX), in jih testirali z novim pristopom monoklonskih protiteles, ki cilja na glikan celične stene. Slika 6 prikazuje linearno korelacijo med signalom vezave biotinila in logaritemsko koncentracijo oligosaharida, kar kaže na možen Langmuirjev model adsorpcije. Med monoklonskimi protitelesi so CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 in CCRC-M151 korelirali z XHE, CCRC-M108, CCRC-M109 in LM11 pa z A2XX v območju od 1 nm do 100 nano. Zaradi omejene razpoložljivosti protiteles med poskusom so bili z vsako koncentracijo oligosaharida izvedeni omejeni poskusi. Pri tem je treba opozoriti, da nekatera protitelesa reagirajo zelo različno na isti oligosaharid kot substrat, verjetno zato, ker se vežejo na nekoliko drugačne epitope in imajo lahko zelo različno afiniteto vezave. Mehanizmi in posledice natančne identifikacije epitopov bodo veliko bolj zapleteni, ko bo nov pristop monoklonskih protiteles uporabljen na resničnih vzorcih.
Za določitev območja detekcije različnih monoklonskih protiteles, ki ciljajo na glikane, sta bila uporabljena dva komercialna oligosaharida. Tukaj linearne korelacije z logaritemsko koncentracijo oligosaharida kažejo na Langmuirove adsorpcijske vzorce za (A) XHE z monoklonskim protitelesom in (B) A2XX z monoklonskim protitelesom. Ustrezni epitopi kažejo na strukture komercialnih oligosaharidov, uporabljenih kot substrati v testu.
Uporaba monoklonskih protiteles, usmerjenih proti glikanom (glikomska analiza ali presejanje monoklonskih protiteles na osnovi ELISA), je močno orodje za poglobljeno karakterizacijo večine glavnih glikanov celične stene, ki sestavljajo rastlinsko biomaso. Vendar pa klasična analiza glikanov karakterizira le večje glikane celične stene, saj večina oligosaharidov ni učinkovito imobilizirana na ploščah ELISA. V tej študiji so bile koruzne steblice, predhodno obdelane z AFEX, encimsko hidrolizirane pri visoki vsebnosti trdnih snovi. Analiza sladkorja je bila uporabljena za določitev sestave odpornih ogljikovih hidratov celične stene v hidrolizatu. Vendar pa je analiza monoklonskih protiteles manjših oligosaharidov v hidrolizatih podcenjena in za učinkovito imobilizacijo oligosaharidov na ploščah ELISA so potrebna dodatna orodja.
V tem članku predstavljamo novo in učinkovito metodo imobilizacije oligosaharidov za presejanje monoklonskih protiteles, ki združuje biotinilacijo oligosaharidov, ki ji sledi presejalni test ELISA na ploščah, prevlečenih z NeutrAvidin™. Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi so pokazali zadostno afiniteto za protitelo, da so omogočili hitro in učinkovito odkrivanje trdovratnih oligosaharidov. Analiza sestave teh trdovratnih oligosaharidov na podlagi masne spektrometrije je potrdila rezultate tega novega pristopa k imunološkemu presejanju. Te študije tako dokazujejo, da se lahko kombinacija biotinilacije oligosaharidov in presejalnega testa ELISA z monoklonskimi protitelesi, usmerjenimi proti glikanom, uporabi za odkrivanje zamreženj v oligosaharidih in se lahko široko uporablja v drugih biokemijskih študijah, ki označujejo strukturo oligosaharidov.
Ta metoda profiliranja glikanov na osnovi biotina je prvo poročilo, ki lahko razišče trdovratne ogljikohidratne vezi topnih oligosaharidov v rastlinski biomasi. To pomaga razumeti, zakaj so nekateri deli biomase tako trdovratni, ko gre za proizvodnjo biogoriv. Ta metoda zapolnjuje pomembno vrzel v metodah analize glikoma in razširja njeno uporabo na širši spekter substratov, ki presegajo rastlinske oligosaharide. V prihodnosti bomo morda za biotinilacijo uporabili robotiko in metodo, ki smo jo razvili, uporabili za visokozmogljivo analizo vzorcev z uporabo ELISA.
Koruzna slama (CS), vzgojena iz hibridnih semen Pioneer 33A14, je bila pobrana leta 2010 na kmetiji Kramer v Rayu v Koloradu. Z dovoljenjem lastnika zemljišča se lahko ta biomasa uporabi za raziskave. Vzorci so bili shranjeni suhi, z manj kot 6 % vlage, v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi. Vzorci so bili shranjeni suhi, z manj kot 6 % vlage, v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi. Obrazci so bili shranjeni suhi pri vlažnosti < 6% v paketih z zadrževalno-molnico pri sobni temperaturi. Vzorci so bili shranjeni suhi pri vlažnosti <6 % v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Obrazci hranijo v paketu z zaščitno-molnico pri sobni temperaturi z vlažnostjo < 6%. Vzorci so shranjeni v vrečkah z zadrgo pri sobni temperaturi z vlažnostjo < 6 %.Študija je bila izvedena v skladu z lokalnimi in nacionalnimi smernicami. Analiza sestave je bila izvedena z uporabo protokola NREL. Ugotovljeno je bilo, da sestava vsebuje 31,4 % glukana, 18,7 % ksilana, 3,3 % arabinana, 1,2 % galaktana, 2,2 % acetila, 14,3 % lignina, 1,7 % beljakovin in 13,4 % pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg beljakovin/ml, serija VCNI 0001) je kompleksna mešanica celulaze, β-glukozidaze in Cellic® HTec2 (157 mg beljakovin/ml, serija VHN00001) podjetja Novozymes (Franklinton, NC, ZDA). Multifect Pectinase® (72 mg beljakovin/ml), kompleksna mešanica encimov za razgradnjo pektina, je doniralo podjetje DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Kalifornija, ZDA). Koncentracije encimskih beljakovin so bile določene z oceno vsebnosti beljakovin (in odštevanjem prispevka nebeljakovinskega dušika) z uporabo Kjeldahl analize dušika (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ZDA). Diatomejska zemlja 545 je bila kupljena pri podjetju EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivno oglje (DARCO, granule 100 mesh), Avicel (PH-101), bukov ksilan in vse druge kemikalije so bile kupljene pri podjetju Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Predobdelava z AFEX je bila izvedena v GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ZDA). Predobdelava je bila izvedena pri 140 °C 15 minut. Čas zadrževanja je bil 46 pri razmerju 1:1 med brezvodnim amoniakom in biomaso ter 60 % (m/m) obremenitvi v namiznem šaržnem reaktorju iz nerjavečega jekla (Parr Instruments Company). Trajala je 30 minut. Reaktor je bil segret na 140 °C in amonijak se je hitro sprostil, kar je omogočilo, da se je biomasa hitro vrnila na sobno temperaturo. Sestava predobdelanih koruznih stebel z AFEX (ACS) je bila podobna sestavi neobdelanih koruznih stebel (UT-CS).
Kot izhodni material za obsežno proizvodnjo oligosaharidov je bil pripravljen ACSH z visoko vsebnostjo trdnih snovi 25 % (m/m) (približno 8 % dekstrana). Encimska hidroliza ACS je bila izvedena z uporabo komercialne mešanice encimov, ki je vključevala Cellic® Ctec2 10 mg beljakovin/g glukana (v predhodno obdelani biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg beljakovin/g glukana in Multifect Pectinase (Genencor Inc, ZDA). ). ), 5 mg beljakovin/g dekstrana. Encimska hidroliza je bila izvedena v 5-litrskem bioreaktorju z delovno prostornino 3 litre, pH 4,8, 50 °C in 250 vrt/min. Po 96 urah hidrolize je bil hidrolizat zbran s centrifugiranjem pri 6000 vrt/min 30 minut in nato pri 14000 vrt/min 30 minut, da so odstranili nehidrolizirane trdne snovi. Hidrolizat smo nato sterilno filtrirali skozi 0,22 mm filtrirno čašo. Filtrirani hidrolizat smo shranili v sterilnih steklenicah pri 4 °C in nato frakcionirali na oglju.
Analiza sestave vzorcev biomase na osnovi ekstraktov v skladu z laboratorijskimi analitičnimi postopki NREL: priprava vzorcev za analizo sestave (NREL/TP-510-42620) in določanje strukturnih ogljikovih hidratov in lignina v biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligosaharidov v hidrolizatnem toku je bila izvedena v 2 ml merilu z metodo kislinske hidrolize na osnovi avtoklava. Vzorec hidrolizata smo zmešali z 69,7 µl 72 % žveplove kisline v 10 ml epruveti z navojnim zamaškom in inkubirali 1 uro na mizi pri 121 °C, ohladili na ledu in filtrirali v vialo za visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC). Koncentracijo oligosaharidov smo določili tako, da smo od skupne koncentracije sladkorja v kislinsko hidroliziranem vzorcu odšteli koncentracijo monosaharidov v nehidroliziranem vzorcu.
Koncentracije glukoze, ksiloze in arabinoze v kislinsko hidrolizirani biomasi so bile analizirane z uporabo sistema Shimadzu HPLC, opremljenega z avtosamplerjem, grelnikom kolone, izokratsko črpalko in detektorjem lomnega količnika na koloni Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolono so vzdrževali pri 50 °C in eluirali s pretokom 5 mM H2SO4 v vodi s pretokom 0,6 ml/min.
Supernatant hidrolizata smo razredčili in analizirali na vsebnost monomerov in oligosaharidov. Monomerne sladkorje, pridobljene po encimski hidrolizi, smo analizirali s HPLC, opremljeno s kolono Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P in kolono za zaščito pred pepelom. Temperatura kolone se je vzdrževala pri 80 °C, kot mobilna faza pa je bila uporabljena voda s pretokom 0,6 ml/min. Oligosaharide smo določili s hidrolizo v razredčeni kislini pri 121 °C po metodah, opisanih v ref. 41, 48, 49.
Analiza saharida je bila izvedena na surovih, z AFEX predhodno obdelanih in vseh nehidroliziranih ostankih biomase (vključno s proizvodnjo serijskih ekstraktov celičnih sten in njihovim presejanjem monoklonskih protiteles) z uporabo prej opisanih postopkov 27, 43, 50, 51. Za analizo glikoma so iz ostankov biomase pripravljeni v alkoholu netopni ostanki materiala rastlinskih celičnih sten in podvrženi serijski ekstrakciji z vse bolj agresivnimi reagenti, kot so amonijev oksalat (50 mM), natrijev karbonat (50 mM in 0,5 % m/v), CON. (1M in 4M, oba z 1 % m/v natrijevega borohidrida) in kisli klorit, kot je bilo opisano prej 52,53. Izvlečki so bili nato podvrženi ELISA testu proti kompleksnemu panelu monoklonskih protiteles 50, usmerjenih proti glikanu celične stene, reakcije vezave monoklonskih protiteles pa so bile predstavljene kot toplotni zemljevid. Monoklonska protiteles, ki ciljajo na glikan rastlinskih celičnih sten, so bila kupljena iz laboratorijskih zalog (serije CCRC, JIM in MAC).
Enostopenjska biotinilacija oligosaharidov. Konjugacija ogljikovih hidratov z biotin-LC-hidrazidom je bila izvedena po naslednjem postopku. Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) je bil raztopljen v dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) z močnim mešanjem in segrevanjem pri 65 °C 1 minuto. Dodana je bila ledena ocetna kislina (30 µl) in zmes je bila vlita na natrijev cianoborohidrid (6,4 mg/100 µmol) in popolnoma raztopljena po segrevanju pri 65 °C približno 1 minuto. Nato je bilo od 5 do 8 μl reakcijske zmesi dodanih posušenemu oligosaharidu (1-100 nmol), da je bil dosežen 10-kratni ali večji molski presežek oznake nad reducirnim koncem. Reakcija je bila izvedena pri 65 °C 2 uri, nakar so bili vzorci takoj očiščeni. V poskusih označevanja brez redukcije ni bil uporabljen natrijev cianoborohidrid, vzorci pa so reagirali pri 65 °C 2,5 ure.
Premaz z ELISA in izpiranje vzorcev biotiniliranih oligosaharidov. V vsako vdolbinico plošče, prevlečene z avidinom, smo dodali 25 μl biotiniliranih vzorcev (100 μl vsakega koncentriranega vzorca, razredčenega v 5 ml 0,1 M Tris pufrske raztopine (TBS)). Kontrolne vdolbinice smo premazali s 50 μl biotina v koncentraciji 10 μg/ml v 0,1 M TBS. Za slepe meritve smo kot premaz uporabili deionizirano vodo. Tableto smo 2 uri inkubirali pri sobni temperaturi v temi. Ploščo smo 3-krat sprali z 0,1 % posnetim mlekom v 0,1 M TBS z uporabo programa št. 11 za Grenier flat 3A.
Dodajanje in izpiranje primarnih protiteles. V vsako vdolbinico dodajte 40 µl primarnega protitelesa. Mikroploščo inkubirajte 1 uro pri sobni temperaturi v temi. Plošče smo nato 3-krat sprali z 0,1 % mlekom v 0,1 M TBS z uporabo programa pranja št. 11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno protitelo in sperite. V vsako vdolbinico dodajte 50 µl mišjega/podganjega sekundarnega protitelesa (razredčenega 1:5000 v 0,1 % mleku v 0,1 M TBS). Mikroploščo inkubirajte 1 uro pri sobni temperaturi v temi. Mikroplošče smo nato 5-krat sprali z 0,1 % mlekom v 0,1 M TBS z uporabo programa za pranje plošč Grenier Flat 5A št. 12.
Dodajanje substrata. Osnovnemu substratu dodajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (z dodajanjem 2 kapljic pufra, 3 kapljic TMB, 2 kapljic vodikovega peroksida v 15 ml deionizirane vode). Pripravite substrat TMB in ga pred uporabo premešajte v vrtincu. Mikroploščo inkubirajte pri sobni temperaturi 30 minut. V temi.
Dokončajte korak in odčitajte tableto. V vsako vdolbinico dodajte 50 µl 1 N žveplove kisline in z ELISA čitalnikom zabeležite absorbanco od 450 do 655 nm.
V deionizirani vodi pripravite 1 mg/ml raztopine naslednjih analitov: arabinoze, ramnoze, fukoze, ksiloze, galakturonske kisline (GalA), glukuronske kisline (GlcA), manoze, glukoze, galaktoze, laktoze, N-acetilmanozamina (manNAc), N-acetilglukozamina (glcNAc), N-acetilgalaktozamina (galNAc), inozitola (interni standard). Dva standarda sta bila pripravljena z dodatkom 1 mg/ml raztopin sladkorja, prikazanih v tabeli 1. Vzorce zamrznemo in liofiliziramo pri -80 °C, dokler se ne odstrani vsa voda (običajno približno 12–18 ur).
V epruvete z navojnim zamaškom na analitski tehtnici dodajte 100–500 µg vzorca. Zapišite dodano količino. Najbolje je, da vzorec raztopite v topilu določene koncentracije in ga dodate v epruveto kot tekoči alikvot. Za vsako epruveto z vzorcem uporabite 20 µl inozitola z koncentracijo 1 mg/ml kot interni standard. Količina internega standarda, dodanega vzorcu, mora biti enaka količini internega standarda, dodanega v standardno epruveto.
V vialo z navojnim zamaškom dodajte 8 ml brezvodnega metanola. Nato dodajte 4 ml 3 N. metanolne raztopine HCl, zaprite in pretresite. Pri tem postopku se voda ne uporablja.
Vzorcem oligosaharidov in standardnim TMS epruvetam dodajte 500 µl 1 M raztopine HCl v metanolu. Vzorce inkubirajte čez noč (168 ur) pri 80 °C v termičnem bloku. Produkt metanolize posušite pri sobni temperaturi s sušilnim kolektorjem. Dodajte 200 µl MeOH in ponovno posušite. Ta postopek ponovite dvakrat. Vzorcu dodajte 200 µl metanola, 100 µl piridina in 100 µl anhidrida ocetne kisline ter dobro premešajte. Vzorce inkubirajte pri sobni temperaturi 30 minut. Vzorce inkubirajte pri sobni temperaturi in ponovno posušite. Dodajte 200 µl metanola in ponovno posušite.
Dodajte 200 µl Tri-Sila in pokrito epruveto segrevajte 20 minut. 80 °C, nato ohladite na sobno temperaturo. Za nadaljnje sušenje vzorca do prostornine približno 50 µl uporabite sušilni kolektor. Pomembno je omeniti, da vzorcev nismo pustili, da se popolnoma posušijo.
Dodajte 2 ml heksana in dobro premešajte z vrtinčenjem. Konice Pasteurjevih pipet (5–8 mm) napolnite s koščkom steklene volne tako, da stekleno volno vstavite na vrh pipete s premerom 5-3/4 palca. Vzorce centrifugirajte pri 3000 g 2 minuti. Vsi netopni ostanki se oborijo. Vzorec posušite na 100–150 µl. V GC-MS je bil pri začetni temperaturi 80 °C in začetnem času 2,0 minuti vbrizgan volumen približno 1 μl (tabela 2).