Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O lo'o e fa'aogaina se su'esu'ega e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).E le gata i lea, ina ia mautinoa le lagolago faifaipea, matou te faʻaalia le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Fa'aali atu se carousel e tolu fa'asolo i le taimi e tasi.Fa'aoga fa'amau muamua ma le soso'o e fa'agasolo ai fa'ase'e se tolu i le taimi, pe fa'aoga fa'aa'a fa'asolo i le pito e fa'asolo ai fa'ase'e se tolu i le taimi.
O le pa puipui o le toto-faiʻai ma le pa puipui o le toto-faiʻai e puipuia ai le biotherapeutic agents mai le oʻo atu i a latou sini i totonu o le fatugalemu o le tino, ma faʻalavelave ai togafitiga lelei o faʻamaʻi o le neura.Ina ia su'esu'eina mea fou e feavea'i fai'ai i vivo, na matou fa'ailoaina se faletusi T7 phage peptide ma fa'aputu fa'asolosolo toto ma sua o le cerebrospinal (CSF) e fa'aaoga ai se fa'ata'ita'iga vaita'ele tele o isumu.Fa'ato'a fa'atamaoaigaina phage fa'apitoa i le CSF ina ua mae'a ta'amilosaga e fa o filifiliga.O su'esu'ega o peptide sui ta'ito'atasi na fa'aalia ai le sili atu i le 1000 fa'atamaoaigaina ile CSF.O le bioactivity o le peptide-mediated delivery i le faiʻai na faʻamaonia e le 40% faʻaitiitiga i le maualuga o le amyloid-β i le cerebrospinal fluid e faʻaaoga ai le BACE1 peptide inhibitor e fesoʻotaʻi ma le peptide transit novel ua iloa.O nei fa'ai'uga ua fa'ailoa mai ai o peptide ua fa'ailoa mai e ala ile in vivo phage e mafai ona avea ma ta'avale aoga mo le tu'uina atu o macromolecules i le fai'ai ma se a'afiaga.
O suʻesuʻega faʻapitoa e faʻatatau i le faʻaogaina o le tino (CNS) e faʻatatau i le faʻailoaina o vailaʻau ma vailaʻau faʻapitoa e faʻaalia ai mea e faʻatatau i le CNS, ma le itiiti ifo o taumafaiga i le sailia o auala e faʻaosoina ai fualaau faʻamalosi i le faiʻai.O lenei ua amata ona suia i le taimi nei ona o le tuʻuina atu o vailaʻau, aemaise lava mole lapopoa, o se vaega taua o le atinaʻeina o vailaʻau faʻaonaponei neuroscience.O le siʻosiʻomaga o le fatugalemu o loʻo puipuia lelei e le cerebrovascular barrier system, e aofia ai le paʻu toto-faiʻai (BBB) ​​​​ma le paʻu toto-faiʻai (BCBB)1, ma avea ai ma luʻitau le tuʻuina atu o vailaʻau i le faiʻai1,2.E fa'atatau e toetoe lava o vaila'au mole lapopo'a uma ma sili atu i le 98% o vaila'au mole mole laiti e aveese mai le fai'ai3.O le mafuaʻaga lea e taua tele ai le faʻailoaina o faiga fou o felauaiga o faiʻai e tuʻuina atu lelei ma faʻapitoa le tuʻuina atu o vailaʻau faʻapitoa ile CNS 4,5.Ae ui i lea, o le BBB ma le BCSFB o loʻo tuʻuina atu foʻi se avanoa sili mo le tuʻuina atu o vailaʻau aʻo latou ulu ma ulu i totonu o fausaga uma o le faiʻai e ala i lona vasculature lautele.O le mea lea, o taumafaiga o loʻo i ai nei e faʻaogaina ai auala e le faʻafefe ai le tuʻuina atu i le faiʻai e tele lava ina faʻavae i luga o le masini o le faʻaogaina o felauaiga faʻafeiloaʻi (PMT) e faʻaaoga ai le faʻaogaina ole BBB6.E ui lava i le alualu i luma lata mai nei i le faʻaaogaina o le transferrin receptor pathway7,8, e manaʻomia le faʻalauteleina o le faʻaleleia o faiga fou faʻatasi ma faʻaleleia meatotino.I lenei tulaga, o la matou sini o le faailoaina lea o peptide e mafai ona faʻatalanoaina felauaiga CSF, aua e mafai ona faʻaaogaina e tuʻuina atu macromolecules i le CNS poʻo le tatalaina o ni auala fou.Aemaise lava, faʻapitoa faʻafeiloaʻi ma felauaiga o le cerebrovascular system (BBB ma le BSCFB) e mafai ona avea ma faʻamoemoega faʻamoemoe mo le tuʻuina atu ma le faʻapitoa o vailaʻau biotherapeutic.O le sua o le cerebrospinal (CSF) ose oloa faalilolilo a le choroid plexus (CS) ma o loʻo faʻafesoʻotaʻi tuusaʻo ma le vai vavalo o le faiʻai e ala i le subarachnoid space ma le ventricular space4.Talu ai nei na faʻaalia ai o le subarachnoid cerebrospinal fluid e sosolo tele i totonu o le interstitium o le faiʻai9.Matou te faʻamoemoe e maua le avanoa parenchymal e faʻaaoga ai lenei subarachnoid inflow tract pe tuusaʻo i le BBB.Ina ia ausia lenei mea, matou te faʻatinoina se taʻiala malosi i le vivo phage filifilia e faʻamaonia lelei ai peptides o loʻo feaveaia e se tasi o nei auala maʻoti e lua.
O lea ua matou fa'amatalaina se fa'asologa i vivo phage fa'aaliga su'esu'e auala fa'atasi ai ma fa'ata'ita'iga CSF fa'atasi ma le fa'asologa maualuga (HTS) e mata'ituina ai ulua'i ta'amilosaga filifilia ma le maualuga o le eseesega o faletusi.Sa faia le su'esu'ega i isumu matala ma se alavai tele (CM) ua totoina tumau e aloese ai mai le afaina o le toto.O le mea taua, o lenei auala e filifilia uma ai le faiʻai-faʻatatau ma peptides faʻatasi ai ma felauaiga i luga o le pa puipui o le cerebrovascular.Na matou faʻaaogaina T7 phages ona o lo latou laʻititi (~ 60 nm) 10 ma fautua mai e talafeagai mo le felauaiga o vesicles e faʻatagaina ai le sopoia o le endothelial ma / poʻo le epithelial-medulla pa puipui.Ina ua maeʻa taʻamilosaga e fa o le panning, na faʻaesea le faitau aofaʻi o tagata faʻaalia le malosi i vivo CSF ​​​​faʻatamaoaigaina ma le cerebral microvessel association.O le mea taua, na mafai ona matou fa'amaonia a matou su'esu'ega e ala i le fa'aalia o peptide sili ona lelei ma fa'apipi'iina fa'ama'i fa'ata'ita'i e mafai ona feavea'i uta polotini i totonu o le sua o le cerebrospinal.Muamua, o le pharmacodynamic aʻafiaga o le CNS na faʻavaeina e ala i le tuʻufaʻatasia o se peptide feʻaveaʻi taʻutaʻua ma se inhibitor ole BACE1 peptide.I le faaopoopo atu i le faʻaalia o faʻataʻitaʻiga suʻesuʻega faʻatino i vivo e mafai ona iloa ai peptides felauaiga o faiʻai fou e avea ma mea e ave ai uta porotini lelei, matou te faʻamoemoe o auala faʻapitoa e filifili ai e taua foi i le faailoaina o auala fou o felauaiga o faiʻai.
Faʻavae i luga o iunite faʻapipiʻi (PFU), ina ua maeʻa le laasaga o le afifiina o le phage, o se faletusi o 12-mer linear T7 phage peptides faʻatasi ma se eseesega e tusa ma le 109 na mamanuina ma faia (silasila i Mea ma Metotia).E taua le maitauina na matou suʻesuʻeina ma le totoa lenei faletusi aʻo leʻi faia i vivo panning.PCR fa'alauteleina o fa'ata'ita'iga faletusi phage e fa'aaoga ai fa'asologa fa'afou fa'atupu amplicons e fa'atatau tonu ile HTS (Fa'aopoopo Ata 1a).Ona o le a) HTS11 sequencing sese, b) aafiaga i luga o le tulaga lelei o primers (NNK) 1-12, ma c) le i ai o le vao-ituaiga (wt) phage (skeleton inserts) i totonu o le faletusi standby, sa faatinoina se faiga faamama faasologa e aveese mai na o faamatalaga faasologa faamaonia (Faaopoopo Ata 1b).O nei la'asaga faamama e fa'aoga i faletusi fa'asologa uma a le HTS.Mo le faletusi masani, o le aofaʻi o le 233,868 faitau na maua, lea na pasia ai le 39% i le faʻavasegaina o le faamama ma sa faʻaaogaina mo le suʻesuʻeina o faletusi ma filifiliga mo taʻamilosaga mulimuli (Ata Faʻaopoopo 1c-e).O le faitau e sili atu le tele o le 3 base pairs i le umi ma se tumutumu i 36 nucleotides (Faʻaopoopo Ata 1c), faʻamaonia le mamanu faletusi (NNK) 1-12.O le mea moni, e tusa ma le 11% o sui o le faletusi o loʻo i ai se 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL faʻaofi, ma toetoe o le afa o faʻasologa (49%) o loʻo i ai faʻapipiʻi poʻo tape.O le HTS o le faletusi faletusi na faʻamaonia ai le maualuga o le eseesega o peptides i totonu o le faletusi: sili atu i le 81% o faʻasologa o peptide na maua naʻo le tasi ma na o le 1.5% na tupu i ≥4 kopi (Faʻaopoopo Ata 2a).O laina ole amino acids (aa) i tulaga uma e 12 i totonu o le repertoire e fetaui lelei ma laina o loʻo faʻamoemoeina mo le numera o codons e gaosia e le NKK repertoire degenerate (Faʻaopoopo Ata 2b).O le va'aiga mata'utia o toega aa ua fa'aigoaina e nei fa'aofi fa'apipi'i fa'atasi lelei ma le fua fa'atatau (r = 0.893) (Fa'aopoopo Ata 2c).O le tapenaga o faletusi phage mo tui e aofia ai laasaga o le faʻalauteleina ma le aveeseina o le endotoxin.O lenei mea na faʻaalia muamua e ono faʻaitiitia ai le eseesega o faletusi phage12,13.O le mea lea, na matou faʻasolosolo ai se faletusi phage faʻapipiʻi ipu ua uma ona aveese endotoxin ma faʻatusatusa i le faletusi muamua e faʻatusatusa ai le tele o le AA.O se fesoʻotaʻiga malosi (r = 0.995) na matauina i le va o le vaitaele muamua ma le vaitaele faʻateleina ma faʻamamaina (Faʻaopoopo Ata 2d), e faʻaalia ai o le tauvaga i le va o clones faʻateleina i luga o papatusi e faʻaaoga ai le T7 phage e leʻi mafua ai le faʻaituau tele.O lenei faʻatusatusaga e faʻavae i luga ole taimi ole tripeptide motifs i faletusi taʻitasi, talu ai o le eseesega o faletusi (~ 109) e le mafai ona puʻeina atoa e oʻo lava ile HTS.Ole su'esu'ega ole aa i tulaga ta'itasi na fa'aalia ai se fa'aituau la'ititi fa'alagolago ile tulaga i tulaga mulimuli e tolu o le lisi na tu'uina atu (Fa'aopoopo Ata 2e).I le fa'ai'uga, na matou fa'ai'uina o le lelei ma le 'ese'ese o le faletusi na talia ma na'o nai suiga laiti i le eseesega na matauina ona o le fa'alauteleina ma le tapenaina o faletusi phage i le va o le tele o taamilosaga o filifiliga.
E mafai ona faia se fa'ata'ita'iga o le sua o le cerebrospinal serial e ala i le fa'apipi'iina o se cannula i totonu o le CM o isumu malamalama e fa'afaigofie ai le fa'ailoaina o le T7 phage na tui tui (iv) e ala i le BBB ma/po'o le BCSFB (Fig. 1a-b).Na matou faʻaogaina ni lima filifilia tutoʻatasi e lua (lima A ma le B) i le tolu taamilosaga muamua o le filifiliga i vivo (Fig. 1c).Na faasolosolo malie ona matou faʻateleina le saʻo o le filifiliga e ala i le faʻaitiitia o le aofaʻi o le phage na faʻaofiina i le tolu taamilosaga muamua o filifiliga.Mo le taamilosaga lona fa o panning, matou tuʻufaʻatasia faʻataʻitaʻiga mai lala A ma B ma faia ni filifiliga tutoatasi faaopoopo se tolu.Ina ia su'esu'e le in vivo meatotino o T7 phage particles i lenei fa'ata'ita'iga, o le vao-type phage (PAGISRELVDKL master insert) na tui i isumu e ala i le vein si'usi'u.Toe fa'aleleia o phages mai le sua o le cerebrospinal ma le toto i taimi eseese na fa'aalia ai e la'ititi la'ititi T7 icosahedral phages sa vave ona fa'amama le vaega o le toto (Fa'aopoopo Ata 3).Fa'atatau i titers na fa'atinoina ma le toto o isumu, na matou fuafuaina e na'o le 1% wt.phage mai le fua fa'atonu na iloa i totonu o le toto i le 10 minute talu ona tui tui.Ina ua maeʻa lenei faʻaitiitia vave vave, o le kilia muamua lemu na fuaina i le afa-ola o le 27.7 minute.O le mea taua, e na'o ni nai phages na maua mai i le vaega CSF, e fa'ailoa mai ai se tulaga maualalo mo le femalaga'iga o le vao-type phage i totonu o le CSF vaega (Fa'aopoopo Ata 3).I le averesi, e na o le 1 x 10-3% titers o le T7 phage i le toto ma le 4 x 10-8% o faʻamaʻi muamua na maua i totonu o le cerebrospinal fluid i le taimi atoa o faʻataʻitaʻiga (0-250 min).Ae maise lava, o le afa-ola (25.7 min) o le vao-ituaiga phage i le sua o le cerebrospinal e tutusa ma le mea na matauina i le toto.O nei faʻamatalaga o loʻo faʻaalia ai o le pa puipui e vavae ese ai le CSF vaega mai le toto o loʻo tumau i totonu o le CM-cannulated rats, e mafai ai i vivo filifilia o faletusi phage e iloa ai clones e faigofie ona feaveaʻi mai le toto i totonu o le CSF vaega.
(a) Fa'atulaga se auala mo le toe su'eina ole sua ole cerebrospinal (CSF) mai se vaita'ele tele.(b) Ata o loʻo faʻaalia ai le nofoaga feaveaʻi o le paʻu o le fatugalemu (CNS) ma le auala filifilia e faʻaaogaina e iloa ai peptides e sopoia le pa puipui toto-faiʻai (BBB) ​​​​ma le pa puipui toto-faiʻai.(i) I vivo phage fa'aali siata o su'esu'ega.I ta'amilosaga ta'itasi o filifiliga, o phages (fa'ailoga manu i totonu o aū) na tui fa'amalosi.E lua isi lala tuto'atasi (A, B) o lo'o tu'u eseese se'ia o'o i le taamilosaga lona 4 o filifiliga.Mo le taamilosaga 3 ma le 4 filifilia, o phage clone taitasi na aumai mai le CSF sa fa'asologa ma le lima.(d) Kinetics o le phage vavae ese mai le toto (li'o mumu) ma le sua o le cerebrospinal (tatolu lanumeamata) i le taimi o le taamilosaga muamua o le filifiliga i isumu cannulated e lua ina ua uma ona tui tui o le faletusi T7 peptide (2 x 1012 phages / manu).O sikuea lanumoana o loʻo faʻaalia ai le averesi muamua o le faʻaogaina o le phage i totonu o le toto, fuafua mai le aofaʻi o le phage tui, ma amanaʻia le aofaʻi atoa o le toto.O sikuea uliuli o loʻo faʻaalia ai le pito o le vaeluaga o le laina y faʻapipiʻi mai le faʻaogaina o le toto.(e,f) Tu'u mai le fa'asologa o taimi ma tufatufaga uma e mafai ona felavasa'i tripeptide motif e maua i le peptide.O le numera o faʻailoga o loʻo maua i le 1000 faitauga o loʻo faʻaalia.E iloga (p <0.001) fa'atamaoaigaina o lo'o fa'ailogaina i togitogi mumu.(e) Fa'asoa fa'asalalau fa'atusatusaga o le fa'asologa o le tripeptide motif o le faletusi tui fa'atasi ma le toto e maua mai i manu #1.1 ma le #1.2.(f) Fa'asoa fa'asalalau fa'atusatusaga o feso'ota'iga o manu faga tripeptide motifs #1.1 ma le #1.2 fa'aesea i le toto ma le sua o le cerebrospinal.(g, h) Fa'asologa ID fa'atusa o phage fa'atamaoaigaina i le toto (g) fa'asaga i faletusi tui ma phage fa'amaoaigaina i le CSF (h) fa'asaga i le toto pe a mae'a se taamilosaga o in vivo filifiliga i manu uma e lua.O le lapo'a o le fa'ailoga mataitusi e tasi e fa'ailoa ai le tele o taimi e tupu ai le amino acid i lea tulaga.Green = polar, viole = le faaituau, lanumoana = faavae, mumu = acidic ma uliuli = hydrophobic amino acids.Ata 1a, b na mamanuina ma gaosia e Eduard Urich.
Na matou tuiina se faletusi peptide phage i iole meafaigaluega CM e lua (clades A ma B) ma vavae ese phage mai le sua o le cerebrospinal ma le toto (Ata 1d).O le uluai kilia vave o le faletusi na itiiti le taʻutaʻua pe a faʻatusatusa i le wild-type phage.O le uiga o le afa-ola o le faletusi tui i manu uma e lua o 24.8 minute i le toto, tutusa ma le vao-ituaiga phage, ma 38.5 minute i le CSF.Ole toto ma le cerebrospinal fluid phage samples mai manu taʻitasi na faʻaogaina i le HTS ma faʻamaonia uma peptides sa suʻesuʻeina mo le i ai o se motif tripeptide puupuu.Tripeptide motifs na filifilia ona latou maua ai se faʻavae laʻititi mo le faʻatulagaina o fausaga ma fegalegaleaiga peptide-protein14,15.Na matou maua se faʻamaopoopo lelei i le tufatufaina o faʻailoga i le va o le faletusi phage tui ma clones na maua mai le toto o manu uma e lua (Fig. 1e).O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai o le tuufaatasiga o le faletusi e naʻo le faʻatamaoaigaina i totonu o le toto.Amino acid frequencies ma maliega autasi na toe suʻesuʻeina i tulaga taʻitasi e faʻaaoga ai se fetuunaiga o le Weblogo16 software.O le mea e malie ai, na matou maua se faʻatamaoaigaina malosi i toega glycine toto (Fig. 1g).Ina ua faʻatusatusaina le toto ma clones filifilia mai le CSF, o le filifiliga malosi ma nisi o le faʻateʻaina o mafuaʻaga na matauina (Fig. 1f), ma o nisi amino acids na sili atu ona i ai i tulaga na muai fuafuaina i le 12-member (Fig. 1h).O le mea moni, o manu taʻitasi e matua ese lava i le sua o le cerebrospinal, ae o le faʻatamaoaigaina o le glycine toto na matauina i manu uma e lua (Faʻaopoopo Ata 4a-j).Ina ua maeʻa le faʻamamaina o faʻamaumauga faʻasologa i le sua o le cerebrospinal o manu #1.1 ma le #1.2, o le aofaʻi o 964 ma 420 tulaga ese 12-mer peptides na maua (Faʻaopoopo Ata 1d-e).Na fa'amālosia fa'ato'a fa'ato'a fa'ato'a fa'ato'a fa'asaga i le ta'amilosaga lona lua o filifiliga i vivo.O le Phage na maua mai le taamilosaga lona lua o le filifiliga na faʻaogaina i le HTS i manu taʻitasi ma o peptides uma na faʻaalia na faʻaaogaina e fai ma faʻaoga i se polokalame faʻaalia o le motif e iloilo ai le tupuga o tripeptide motifs (Fig. 2a, b, ef).Pe a faatusatusa i le taamilosaga muamua o le phage toe maua mai le CSF, na matou matauina le filifilia atili ma le soloia o le tele o mafuaaga i le CSF i lala A ma B (Fig. 2).Na fa'aogaina se algorithm e iloagofie ai feso'ota'iga e iloa ai pe fa'atusaina ni mamanu eseese o le fa'asologa faifaipea.O se tulaga tutusa manino na matauina i le va o le 12-dimensional sequences toe maua mai e le CSF i le isi clade A (Fig. 2c, d) ma le clade B (Fig. 2g, h).O suʻesuʻega faʻapipiʻi i lala taʻitasi na faʻaalia ai faʻamatalaga filifilia eseese mo 12-mer peptides (Faʻaopoopo Fig. 5c, d) ma le faʻaopoopoga o le CSF / toto titer ratio i le taimi mo clones faʻapipiʻi pe a maeʻa le taamilosaga lona lua o filifiliga faʻatusatusa i le taamilosaga muamua o le filifiliga (Faʻaopoopo Ata 5e).).
Fa'atamaoaigaina o motifs ma peptides i le sua o le cerebrospinal e ala i ta'amilosaga soso'o se lua o in vivo functional phage fa'aaliga filifiliga.
O phages sua uma o le cerebrospinal toe maua mai le taamilosaga muamua o manu ta'itasi (manu #1.1 ma #1.2) sa fa'apotopotoina, fa'ateleina, HT-fa'asologa ma toe tu'i fa'atasi (2 x 1010 phages/manu) 2 SM cannulated rats (#1.1 → #).2.1 ma le 2.2, 1.2 → 2.3 ma le 2.4).(a, b, e, f) Faʻasalalauga faʻasalalau e faʻatusatusa ai le faʻaogaina o taimi ole tripeptide motifs uma CSF e maua mai phages i le taamilosaga muamua ma le lua filifiliga.Fegalegaleaiga masani ma le tufatufaina o motif e fai ma sui o tripeptides felavasa'i uma e mafai ona maua i peptides i tulaga uma e lua.O le numera o faʻailoga o loʻo maua i le 1000 faitauga o loʻo faʻaalia.O fa'ailoga sa matua'i (p <0.001) na filifilia pe fa'ate'aina i se tasi o faletusi fa'atusatusa e fa'amamafaina i togitogi mumu.(c, d, g, h) Fa'asologa o tagavai fa'atusa o le CSF-oa 12 amino acid umi fa'asologa e fa'atatau i le taamilosaga 2 ma le 1 o filifiliga i vivo.O le lapo'a o le fa'ailoga mataitusi e tasi e fa'ailoa ai le tele o taimi e tupu ai le amino acid i lea tulaga.Mo le fa'atusaina o le logo, o le fa'asologa o fa'asologa o le CSF e maua mai i manu ta'itasi i le va o ta'amilosaga filifilia e lua e fa'atusalia ma fa'asologa fa'atamaoaigaina i le ta'amilosaga lona lua o lo'o fa'aalia: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ma (h) #1.2–#2.4.Ole amino acids e sili ona fa'atamaoaigaina ile tulaga tu'ufa'atasi ile (c, d) manu nu.2.1 ma leai.2.2 poʻo (g, h) i manu Nu.2.3 ma le leai.2.4 o loʻo faʻaalia i lanu.Green = polar, viole = le faaituau, lanumoana = faavae, mumu = acidic ma uliuli = hydrophobic amino acids.
Ina ua maeʻa le taamilosaga lona tolu o le filifiliga, na matou iloa ai 124 tulaga ese peptide sequences (#3.1 ma #3.2) mai 332 CSF-reconstituted phage clones vavae ese mai manu e lua (Faaopoopo Ata 6a).O le faasologa o LGSVS (18.7%) sa i ai le maualuga sili ona maualuga, sosoo ai ma le faʻapipiʻi faʻapipiʻi PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ma SARGSWREIVSLS (2.2%).I le taamilosaga lona fa mulimuli, na matou tuufaatasia ni lala se lua na filifilia mai ni manu eseese se tolu (Ata 1c).Mai le 925 sequenced phage clones na toe maua mai le CSF, i le taamilosaga lona fa na matou maua ai le 64 peptide sequences tulaga ese (Faaopoopo Ata 6b), lea na pa'ū ai le fua faatatau o le vao-ituaiga phage i le 0.8%.O clones CSF sili ona taatele i le taamilosaga lona fa o LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ma RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ole umi ole peptides ua filifilia e mafua ile fa'aofiina/tapē'ese ole nucleotide po'o codon e taofi vave ile faletusi pe a fa'aogaina codon fa'aleagaina mo le mamanu o le faletusi NNK.O codon e taofi vave e maua ai peptide pupuu ma e filifilia ona o lo'o i ai le motif aa lelei.O peptide uumi e mafai ona maua mai i fa'aofiina/tapē'ese i totonu o fa'amuamua o faletusi synthetic.O le mea lea e tu'u ai le codon taofi ua fuafuaina i fafo o le faavaa ma faitau i ai seia oo ina aliali mai se codon taofi fou i lalo.I se tulaga lautele, na matou fuafuaina mea fa'atamaoaigaina mo ta'amilosaga filifiliga uma e fa e ala i le fa'atusatusaina o fa'amaumauga tu'ufa'atasi ma fa'amaumauga fa'ata'ita'iga.Mo le taamilosaga muamua o suʻesuʻega, sa matou faʻaogaina faʻailoga phage ituaiga vao e fai ma faʻamatalaga e le faʻapitoa.O le mea e malie ai, o le filifilia o le phage leaga na matua malosi i le taamilosaga muamua o le CSF, ae le o le toto (Fig 3a), atonu e mafua mai i le maualalo o le avanoa o le faʻasalalau pasi o le tele o tagata o le faletusi peptide i totonu o le CSF compartment poʻo phages vavalalata e foliga mai e sili atu ona lelei le taofia pe aveesea mai le toto nai lo bacteriophages.Ae ui i lea, i le taamilosaga lona lua o panning, o le filifilia malosi o phages i le CSF na matauina i clades uma e lua, o loʻo fautua mai ai o le taamilosaga muamua na faʻatamaoaigaina i phages faʻaalia peptides e faʻaleleia ai le CSF uptake (Fig. 3a).Toe, e aunoa ma se faʻatamaoaigaina toto taua.E le gata i lea i le taamilosaga lona tolu ma le fa, o clones phage na matua faʻatamaoaigaina i le CSF.O le fa'atusatusaina o le fa'asologa masani o fa'asologa peptide tulaga ese ta'itasi i le va o ta'amilosaga mulimuli e lua o le filifiliga, na matou iloa ai na sili atu le fa'atamaoaigaina o fa'asologa i le fa'asologa o filifiliga (Fig. 3b).O le aofaʻi o 931 tripeptide motifs na maua mai uma 64 faʻasologa peptide tulaga ese e faʻaaoga uma ai le peptide orientations.O autu sili ona faʻatamaoaigaina i le taamilosaga lona fa na sili atu ona suʻesuʻeina mo a latou talaaga faʻatamaoaigaina i luga o taʻamilosaga uma pe a faʻatusatusa i le faletusi tui (tipi: 10% faʻatamaoaigaina) (Faʻaopoopo Ata 6c).O fa'ata'ita'iga lautele o filifiliga na fa'aalia ai o le tele o mafua'aga su'esu'e na fa'atamaoaigaina i ta'amilosaga uma na muamua atu o lala filifilia e lua.Peita'i, o nisi fa'ailoga (fa'ata'ita'iga SGL, VSG, LGS GSV) sa tele lava mai le isi vaega A, a'o isi (fa'ata'ita'iga FGW, RTN, WGF, NTR) sa fa'atamaoaigaina ile isi vaega B.
Fa'amaoniaina ole felauaiga o le CSF ole peptide fa'aalia phage fa'atamaoaigaina ole CSF ma peptide ta'ita'i biotinylated fa'atasi i uta streptavidin.
(a) Fa'atamaoaigaina fua faatatau fuafuaina i ta'amilosaga uma e fa (R1-R4) e fa'avae i luga ole tui (input = I) phage (PFU) titers ma le CSF phage titers (output = O).Fa'atamaoaigaina mo ta'amilosaga mulimuli e tolu (R2-R4) sa fa'atusatusa i le ta'amilosaga muamua ma le ta'amilosaga muamua (R1) fa'atasi ai ma fa'amaumauga o le mamafa.O pa matala o le sua o le cerebrospinal, o pa faʻafefe o le plasma.(***p<0.001, fa'atatau i le su'ega-t a Tamaiti).(b) Lisi o phage peptides sili ona tele, fa'avasega e tusa ai ma lo latou fa'atusatusaga i phages uma na aoina i le CSF pe a mae'a le taamilosaga 4 o filifiliga.O phage e ono e masani ona fa'ailoaina i le lanu, faanumera ma o latou fa'atamaoaigaina i le va o ta'amilosaga 3 ma le 4 o filifiliga (insets).(c, d) O le ono sili ona fa'atamaoaigaina clones phage, phage gaogao ma matua phage peptide faletusi mai le taamilosaga 4 sa su'esu'eina ta'ito'atasi i se CSF sampling model.CSF ma faʻataʻitaʻiga toto na aoina i taimi faʻaalia.(c) Aofa'i tutusa o 6 clones phage sui tauva (2 x 1010 phages/manu), phages gaogao (#1779) (2 x 1010 phages/manu) ma faletusi phage peptide stock (2 x 1012 phages/manu) tui a itiiti ifo i le 3 CM e mafai ona tuuina atu i le si'usi'u manu e le itiiti ifo i le 3 CMO le CSF pharmacokinetics o phage clone tui taitasi ma le phage peptide faletusi i le aluga o taimi o loʻo faʻaalia.(d) o lo'o fa'aalia ai le fua faatatau o le CSF/toto mo phages/mL uma ua toe maua mai ile taimi ole fa'ata'ita'iga.(e) E fa peptides taʻitaʻi faʻapipiʻi ma le tasi faʻataʻitaʻiga faʻasolosolo na fesoʻotaʻi ma le biotin i le streptavidin e ala i la latou N-terminus (faʻaaliga tetramer) sosoo ai ma le tui (vein siʻusiʻu iv, 10 mg streptavidin / kg).E le itiiti ifo ma le tolu iole fa'a'a'ai (N = 3).).O faʻataʻitaʻiga o le CSF na aoina i taimi faʻaalia ma faʻamautu streptavidin na fuaina e le CSF anti-streptavidin ELISA (nd = le iloa).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, fa'avae ile su'ega ANOVA).(f) Fa'atusatusaga o le fa'asologa o le amino acid o le phage peptide clone sili ona fa'atamaoaigaina #2002 (lanu viole) fa'atasi ai ma isi fa'ailoga phage peptide clone ua filifilia mai le taamilosaga lona 4 o filifiliga.O fasi amino acid e tutusa ma tutusa e lanu-coded.
Mai phages fa'atamaoaigaina uma i le taamilosaga lona fa (Fig. 3b), e ono clones sui na filifilia mo nisi su'esu'ega a le tagata lava ia i le CSF sampling model.E tutusa le aofaʻi o le ono sui tauva, phage gaogao (leai se mea faʻapipiʻi) ma faletusi peptide prophage na tui i totonu o manu CM cannulated tolu, ma pharmacokinetics na fuafuaina i le CSF (Fig. 3c) ma le toto (Faʻaopoopo Fig. 7) suʻega.O phage clones uma na fa'ata'ita'iina na fa'atatau i le vaega o le CSF i se tulaga 10-1000 taimi maualuga atu nai lo le fa'aoga avanoa (#1779).Mo se faʻataʻitaʻiga, o clones #2020 ma #2077 e tusa ma le 1000 taimi maualuga CSF titers nai lo control phage.Ole tala'aga ole pharmacokinetic ole peptide filifilia ta'itasi e eseese, ae oi latou uma e iai le maualuga ole CSF ile fa'aogaina.Na matou matauina le fa'aitiitia faifaipea i le taimi mo clones #1903 ma #2011, ae mo clones #2077, #2002 ma #2009 o se fa'atuputeleina i le 10 minute muamua e ono fa'ailoa mai ai le felauaiga malosi ae e mana'omia le fa'amaonia.Clones #2020, #2002, ma #2077 mautu i tulaga maualuga, ae o le CSF concentration o clone #2009 na faʻaitiitia malie ina ua maeʻa le faʻaopoopoga muamua.Ona matou faʻatusatusaina lea o le tele o taimi o sui taʻitoʻatasi o le CSF ma lona toto (Fig. 3d).O le fa'amaopoopoina o le fua fa'atatau o sui ta'ito'atasi o le CSF ma lona toto i taimi uma e fai ai fa'ata'ita'iga na fa'aalia ai e tolu o sui e ono na matua fa'atamaoaigaina ile toto CSF.O le mea e malie ai, o le clone #2077 na faʻaalia ai le maualuga o le toto (Ata Faaopoopo 7).Ina ia faʻamaonia e mafai e peptides latou lava ona felauaiga uta e ese mai i vaega o le phage i totonu o le CSF vaega, matou te faʻapipiʻiina peptides taʻitaʻi e fa e maua mai i le biotin i le N-terminus lea e pipii ai peptides i le vaega o le phage.Biotinylated peptides (nos. 2002, 2009, 2020 ma 2077) na faʻapipiʻiina ma streptavidin (SA) e maua ai le tele o ituaiga faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le phage geometry.O lenei faatulagaga na mafai ai foʻi ona matou fuaina le faʻaalia o le SA i le toto ma le sua o le cerebrospinal e pei o peptides protein e feaveaʻi uta.O le mea e sili ona taua, e masani ona toe faia fa'amaumauga phage pe a fa'atinoina peptides synthetic i lenei SA-conjugated format (Fig. 3e).O peptide ua si'itia e itiiti le fa'aaliga muamua ma fa'avave le kilia CSF ma tulaga e le mafai ona iloa i totonu ole 48 itula.Ina ia maua se faʻamatalaga i le auala e tuʻuina atu ai nei peptide phage clones i totonu o le CSF space, matou te suʻesuʻeina le faʻaogaina o phage peptide taʻitasi e faʻaogaina ai le immunohistochemistry (IHC) e iloa saʻo ai vaega o le phage 1 itula talu ona tui tui i vivo.Ae maise, o clones #2002, #2077, ma #2009 e mafai ona iloa e ala i le malosi o le pisia i le faiʻai capillaries, ae o le control phage (#1779) ma le clone #2020 e leʻi iloa (Faaopoopo Ata 8).E taʻu mai ai o nei peptides e saofagā i le aʻafiaga i luga o le faiʻai tonu e ala i le sopoia o le BBB.E mana'omia nisi su'esu'ega au'ili'ili e fa'ata'ita'i ai lenei manatu, aua e ono a'afia ai fo'i le ala BSCFB.Pe a faʻatusatusa le faʻasologa o le amino acid o le clone sili ona faʻatamaoaigaina (#2002) ma isi peptides filifilia, na maitauina o nisi oi latou e iai faʻaopoopoga tutusa amino acids, lea e ono faʻaalia ai se masini feaveaʻi tutusa (Fig 3f).
Ona o lona talaaga tulaga ese o le plasma ma le tele o le faateleina o le CSF i le aluga o taimi, o le phage display clone #2077 na toe suʻesuʻeina i luga ole 48-itula umi atu ma mafai ai ona toe faʻaleleia le televave o le CSF na matauina i le fesoʻotaʻiga ma tulaga SA tumau (Fig 4a).E tusa ai ma isi phage clones ua iloa, #2077 na pisia malosi mo capillaries o le faiʻai ma faʻaalia ai le colocalization taua ma le capillary marker lectin pe a vaʻaia i le maualuga maualuga ma atonu o ni pisia i le parenchymal space (Ata 4b).Ina ia suʻesuʻe pe mafai ona maua aʻafiaga faʻafomaʻi faʻamaʻi peptide i le CNS, na matou faia se faʻataʻitaʻiga lea na faʻafefiloi ai biotinylated versions o i) le #2077 transit peptide ma ii) le BACE1 inhibitor peptide na faʻafefiloi ma SA i fua eseese e lua.Mo le tasi tu'ufa'atasi na matou fa'aaogaina na'o le BACE1 peptide inhibitor ma mo le isi sa matou fa'aogaina le 1:3 ratio o le BACE1 peptide inhibitor i le #2077 peptide.O faʻataʻitaʻiga uma e lua na tuʻuina atu ile toto ma le toto ma le cerebrospinal sua o le beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) na fuaina ile taimi.O le Abeta40 na fuaina i le CSF ona o loʻo atagia mai ai le taofia o le BACE1 ile parenchyma ole faiʻai.E pei ona faʻamoemoeina, o faʻalavelave uma e lua na faʻaitiitia ai le maualuga o le toto o Abeta40 (Fig. 4c, d).Ae ui i lea, naʻo faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai se faʻafefiloi ole peptide no.2077 ma se inhibitor o le BACE1 peptide faʻapipiʻiina i le SA na mafua ai le faʻaitiitia o le Abeta40 i le sua o le cerebrospinal (Fig. 4c).O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai le peptide no.2077 e mafai ona feaveaʻi le 60 kDa SA protein i totonu o le CNS ma faʻaosoina ai aʻafiaga faʻafomaʻi faʻatasi ma SA-conjugated inhibitors o le BACE1 peptide.
(a) Clonal tui (2 × 10 phages / manu) o le T7 phage o loʻo faʻaalia ai talaʻaga pharmacokinetic umi o le CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ma le faʻatonuina o le phage (#1779) i le itiiti ifo ma le tolu CM-intubated rats.(b) Fa'ata'otoga fa'ata'ita'i fa'ata'ita'i o va'a la'au fa'asolo i isumu ua tui i le phage (2 × 10 10 phages/manu) o lo'o fa'aalia ai le fa'afeagai o le peptide #2077 ma va'a (lectin).O nei phage clones na tu'uina atu i iole e 3 ma fa'ataga e ta'amilo mo le 1 itula a'o le'i fa'ainu.O fai'ai na vaevae ma pisia ile polyclonal FITC-label antibodies faasaga ile T7 phage capsid.Sefulu minute aʻo leʻi faʻauluina ma mulimuli ane faʻapipiʻiina, DyLight594-labeled lectin na faʻaaogaina i totonu.O ata felanulanua'i o lo'o fa'aalia ai le pisia o le lectin (mumu) o le itu malamalama o va'a laiti ma faga (lanu meamata) i le lumen o capillaries ma peivascular brain tissue.Ole fua fua e fetaui ile 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide naʻo ia poʻo le tuʻufaʻatasia ma le biotinylated transit peptide #2077 na faʻapipiʻiina i le streptavidin sosoo ai ma le tui faʻafefe o le itiiti ifo ma le tolu cannulated CM rats (10 mg streptavidin / kg).BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction in Aβ40 na fuaina e le Aβ1-40 ELISA i le toto (mumu) ma le cerebrospinal fluid (lanu moli) i taimi faʻaalia.Mo le manino atili, o se laina togitogi e tusia i luga o le kalafi i le fua o le 100%.(c) Fa'aitiitiga pasene i le Aβ40 i totonu o le toto (tafatolu mumu) ma le sua o le cerebrospinal (tafatolu moli) i isumu e togafitia i le streptavidin fa'atasi i le transit peptide #2077 ma le BACE1 inhibitory peptide i le 3: 1 ratio.(d) Fa'aitiitiga pasene o le toto Aβ40 (li'o mumu) ma le sua o le cerebrospinal (li'o moli) o isumu na togafitia i le streptavidin fa'atasi ma le BACE1 inhibitory peptide na'o.O le maualuga o le Aβ i le pule o le 420 pg / ml (tulaga masani = 101 pg / ml).
O le fa'aaliga o le Phage ua fa'aaoga lelei i le tele o vaega o su'esu'ega fa'aolaola17.O lenei metotia na faʻaaogaina mo suʻesuʻega eseese o vailaʻau i vivo18,19 faʻapea foʻi ma suʻesuʻega e faʻatatau i vaʻa cerebral20,21,22,23,24,25,26.I lenei suʻesuʻega, na matou faʻalauteleina le faʻaogaina o lenei auala filifilia e le gata i le faʻamaonia saʻo o peptides e faʻatatau i vaʻa cerebral, ae faʻapea foʻi i le mauaina o sui tauva o loʻo i ai meatotino felauaiga malosi e sopoia le pa puipui o le toto-faiʻai.Ua matou faʻamatalaina nei le atinaʻeina o se faiga filifiliga in vivo i CM intubated rats ma faʻaalia lona gafatia e iloa ai peptides ma CSF fale faʻapitoa.I le faʻaaogaina o le T7 phage o loʻo faʻaalia ai se faletusi o 12-mer random peptides, na mafai ai ona matou faʻaalia o le T7 phage e laʻititi (pe tusa ma le 60 nm le lautele) 10 e faʻafetaui i le pa puipui o le toto-faiʻai, ma faʻafefea saʻo ai le pa puipui toto-faiʻai poʻo le choroid plexus.Na matou matauina o le seleseleina o le CSF mai imoa CM cannulated o se auala lelei e pulea lelei i vivo, ma o le phage na maua mai e le gata e noatia i le vasculature ae o loʻo galue foi o se felauaiga i luga o le pa puipui o le toto-faiʻai.E le gata i lea, e ala i le aoina mai o le toto i le taimi lava e tasi ma faʻaogaina le HTS i le CSF ​​ma le toto e maua mai i phages, na matou faʻamaonia ai o la matou filifiliga o le CSF e leʻi aʻafia i le faʻatamaoaigaina o le toto poʻo le malosi mo le faʻalauteleina i le va o taamilosaga o filifiliga.Peitaʻi, o le vaega o le toto o se vaega o le faiga filifiliga, talu ai o phages e mafai ona oʻo atu i le vaega CSF e tatau ona ola ma taamilo i totonu o le toto e lava le umi e faʻatamaoaigaina ai i latou lava i le faiʻai.Ina ia maua mai faʻamatalaga faʻasologa faʻamaoni mai faʻamatalaga mataʻutia HTS, matou faʻatinoina filiga faʻafetaui i tulaga faʻapitoa faʻasologa o mea sese i le suʻesuʻega o galuega.E ala i le tuʻufaʻatasia o taʻaloga kinetic i le metotia suʻesuʻe, na matou faʻamaonia ai le vave pharmacokinetics o le vao-type T7 phages (t½ ~ 28 min) i le toto24, 27, 28 ma faʻamautu foi lo latou afa-ola i le sua o le cerebrospinal (t½ ~ 26 min) i le minute).E ui lava i tala fa'atusa fa'afoma'i i totonu o le toto ma le CSF, e na'o le 0.001% o le fa'amauina o le toto o le phage e mafai ona iloa i le CSF, e fa'aalia ai le maualalo o le gaioiga o le T7 phage i luga o le pa puipui toto-fai'ai.O lenei galuega o loʻo faʻamamafaina ai le taua o le taamilosaga muamua o filifiliga pe a faʻaogaina i vivo panning taʻiala, aemaise lava mo faiga faʻapipiʻi e vave ona kilia mai le taamilosaga, ona o nai clones e mafai ona oʻo atu i le CNS compartment.O le mea lea, i le taamilosaga muamua, o le faʻaitiitia o le eseesega o faletusi na matua tele lava, ona naʻo se numera faʻatapulaʻa o clones na iu lava ina aoina i lenei faʻataʻitaʻiga CSF saʻo.O lenei in vivo panning strategy e aofia ai le tele o laʻasaga filifilia e pei o le faʻaputuina malosi i totonu o le CSF vaega, ola clone i totonu o le toto, ma le vave aveese o T7 phage clones mai le toto i totonu o le 10 minute muamua (Fig. 1d ma le Faʻaopoopoga Ata 4M).).O le mea lea, ina ua maeʻa le taamilosaga muamua, na faʻaalia ai clones phage eseese i le CSF, e ui lava o le vaitaele muamua na faʻaaogaina mo manu taʻitasi.E ta'u mai ai o le tele o la'asaga sa'o filifiliga mo faletusi fa'apogai ma le to'atele o tagata o le faletusi e i'u ai i se fa'aitiitiga tele o le eseesega.O le mea lea, o mea tutupu faʻafuaseʻi o le a avea ma vaega taua o le faʻagasologa muamua o filifiliga, e matua aʻafia ai le iʻuga.E foliga mai o le tele o clones i totonu o le faletusi muamua e tutusa lelei le fa'atamaoaigaina o le CSF.Ae ui i lea, e tusa lava pe i lalo o tulaga faʻataʻitaʻi tutusa, e ono eseese iʻuga o filifiliga ona o le laʻititi o numera o clone faʻapitoa i le vaitaele muamua.
O mafuaʻaga e faʻatamaoaigaina i le CSF e ese mai i latou i totonu o le toto.O le mea e malie ai, na matou matauina le suiga muamua i glycine-rich peptides i le toto o manu taʻitasi.(Ata 1g, Ata Faaopoopo 4e, 4f).O le phage o lo'o iai glycine peptides atonu e sili atu ona mautu ma fa'aitiitia le aveesea mai le ta'amilosaga.Ae ui i lea, o nei glycine-rich peptides e leʻi iloa i totonu o faʻataʻitaʻiga o le sua o le cerebrospinal, e faʻapea o faletusi faʻapitoa na faia ni laasaga eseese se lua: tasi i totonu o le toto ma le isi faʻatagaina e faʻaputu i le sua o le cerebrospinal.O clones fa'atamaoaigaina CSF na maua mai i le taamilosaga lona fa o filifiliga ua fa'ata'ita'iina tele.Toeitiiti lava o clones uma na fa'ata'ita'iina ta'ito'atasi na fa'amaonia e fa'atamaoaigaina i le CSF pe a fa'atusatusa i le avanoa e pulea phage.E tasi le peptide na lavea (#2077) na suʻesuʻeina atili auiliili.Na faʻaalia ai le umi o le plasma afa-ola pe a faʻatusatusa i isi faʻailoga (Ata 3d ma Faʻamatalaga Faʻaopoopo 7), ma le manaia, o lenei peptide o loʻo i ai se cysteine ​​​​residue i le C-terminus.Talu ai nei na faʻaalia ai o le faʻaopoopoga o le cysteine ​​​​i peptides e mafai ona faʻaleleia atili a latou mea tau vailaʻau e ala i le fusifusia i le albumin 29.E le o iloa nei mo le peptide #2077 ma e manaʻomia nisi suʻesuʻega.O nisi peptides na faʻaalia ai le valence-dependency i le faʻatamaoaigaina o le CSF (faʻamatalaga e le o faʻaalia), lea e mafai ona fesoʻotaʻi ma le faʻaalia o foliga o le T7 capsid.O le T7 system na matou faʻaogaina na faʻaalia ai kopi 5-15 o peptide taʻitasi i le fasi vaega o le phage.O le IHC na faia i luga o le sui tauva o le phage clones tui tui i totonu o le cerebral cortex o isumu (Faaopoopo Ata 8).O faʻamaumauga na faʻaalia ai e le itiiti ifo ma le tolu clones (Nu. 2002, Nu. 2009 ma Nu. 2077) faʻatasi ma le BBB.O loʻo tumau pea le faʻamoemoeina pe o lenei fegalegaleaiga BBB e mafua ai le faʻaputuina o le CSF poʻo le faʻaogaina o nei clones saʻo i le BCSFB.O le mea taua, matou te faʻaalia o peptides filifilia o loʻo tumau pea a latou gafatia felauaiga CSF pe a faʻapipiʻiina ma fusifusia i uta porotini.O le fusifusia o N-terminal biotinylated peptides i le SA e toe faʻafoʻi mai ai iʻuga na maua mai a latou faʻailoga phage i le toto ma le sua o le cerebrospinal (Ata 3e).Ma le mea mulimuli, matou te faʻaalia o le taʻitaʻi peptide #2077 e mafai ona faʻaleleia le gaioiga o le faiʻai a le biotinylated peptide inhibitor o le BACE1 faʻapipiʻiina i le SA, ma mafua ai le faʻaalia o le pharmacodynamic i le CNS e ala i le faʻaitiitia o le maualuga o le Abeta40 i le CSF (Fig 4).Sa le mafai ona matou iloa soʻo se faʻataʻitaʻiga i totonu o faʻamaumauga e ala i le faia o se peptide sequence homology search of all hits.E taua le maitauina o le tele o le faletusi T7 e tusa ma le 109, ae o le tele o le faletusi a le 12-mers o le 4 x 1015. O le mea lea, matou te filifilia naʻo se vaega itiiti o le avanoa eseese o le faletusi 12-mer peptide, lea e mafai ona faʻapea e mafai ona iloa le sili atu optimized peptides e ala i le iloiloina o le avanoa o nei faʻasologa lata ane.O le mea moni, o se tasi o mafuaʻaga matou te leʻi mauaina ai soʻo se faʻataʻitaʻiga masani o nei peptides atonu o le faʻateʻaina i le taimi o le evolusione e puipuia ai le le pulea o le ulufale atu o nisi o peptide motifs i totonu o le faiʻai.
Ile tu'ufa'atasia, o a tatou fa'ai'uga e maua ai se fa'avae mo galuega i le lumana'i e fa'ailoa ma fa'ailoa ai faiga felauaiga o le pa puipui o le cerebrovascular in vivo i fa'amatalaga atili.O le seti faavae o lenei metotia e faʻavae i luga o se taʻiala filifilia e le gata ina faʻamaonia ai clones ma mea faʻapipiʻi vascular cerebral, ae aofia ai foi ma se laasaga taua lea e maua ai e clones manuia le gaioiga e sopoia ai pa puipui olaola i vivo i totonu o le CNS vaega.o le faʻamalamalamaina o le faiga o felauaiga o nei peptides ma o latou manaʻoga mo le fusia i le microvasculature faʻapitoa i le faiʻai itulagi.E ono mafua ai ona maua ni auala fou mo le felauaiga o le BBB ma tali.Matou te faʻamoemoe o peptide faʻamaonia e mafai ona faʻapipiʻi saʻo i le cerebrovascular receptors poʻo le faʻasalalau solo o loʻo feaveaʻi i le BBB poʻo le BCSFB.Ole peptide vectors ma CSF felauaiga gaioioiga maua i lenei galuega o le a toe suʻesuʻeina.O loʻo matou suʻesuʻeina nei le faʻapitoa o le faiʻai o nei peptides mo lo latou gafatia e sopoia le BBB ma / poʻo le BCSFB.O nei peptides fou o le a avea ma meafaigaluega sili ona taua mo le mauaina o ni tali fou poʻo auala ma mo le atinaʻeina o tulaga fou sili ona lelei mo le tuʻuina atu o macromolecules, e pei o meaola, i le faiʻai.
Cannulate le cisterna tele (CM) e faʻaaoga ai se suiga o le auala na faʻamatalaina muamua.O isumu Wistar fa'ama'i (200-350 g) sa fa'ae'e i luga o se mea fa'aoga ma fa'apipi'i le vaeluagalemu i luga o le pa'u ua sele ma saunia lelei e fa'aalia ai le ulupo'o.Tu'u ni pu se lua i le vaega o le fusi pito i luga ma fa'amau fa'amau fa'amau i pu.O se pu faaopoopo na viliina i le pito pito i tua mo le ta'ita'iga fa'ata'ita'iga o se cannula uamea i totonu o le CM.Fa'apipi'i sima nifo fa'ata'amilo i le cannula ma fa'amau i fa'avili.Ina ua mae'a le fa'amaloloina o ata ma le fa'ama'a'aina o le sima, ona tapuni lea o le manu'a o le pa'u ile su'i 4/0 supramid.O le tu'uina lelei o le cannula e fa'amaonia e ala i le tafe fa'afuase'i ole sua ole cerebrospinal (CSF).Ave'ese le isumu mai le mea e fa'aogaina, maua le tausiga talafeagai pe a uma le taotoga ma le puleaina o tiga, ma fa'ataga e toe fa'aleleia mo le itiiti ifo ma le tasi le vaiaso se'ia va'aia fa'ailoga o le toto i le sua o le cerebrospinal.O iole Wistar (Crl:WI/Han) na maua mai le Vaitafe o Charles (Farani).O iole uma na tausia i lalo o tulaga patino e leai se pathogen.O faʻataʻitaʻiga uma o manu na faʻamaonia e le Veterinary Office of the City of Basel, Suiselani, ma sa faia e tusa ai ma le Laisene Manu Numera 2474 (Suʻesuʻeina o le Avetaʻavale Faʻamalosi Faʻamalosi e ala i le Fuaina o Laʻasaga o Sui Faʻataʻitaʻi ile Cerebrospinal Fluid ma Brain of Rat).
Taofi lemu le iole ma le CM cannula i le lima.Aveese le Datura mai le cannula ma aoina le 10 µl o le sua o le cerebrospinal tafe fa'afuase'i.Talu ai o le pateni o le cannula na iu lava ina faʻafefe, naʻo faʻataʻitaʻiga manino o le sua o le cerebrospinal e aunoa ma se faʻamaoniga o le faʻaleagaina o le toto poʻo le faʻaleagaina na aofia i totonu o lenei suʻesuʻega.I se tulaga tutusa, e tusa ma le 10-20 μl o le toto na ave mai i se tipi laʻititi i le pito o le siʻusiʻu i totonu o paipa ma le heparin (Sigma-Aldrich).O le CSF ma le toto na aoina i taimi eseese ina ua maeʻa tui tui ole T7 phage.E tusa ma le 5-10 μl o le vai na lafoai aʻo leʻi aoina faʻataʻitaʻiga CSF taʻitasi, lea e fetaui ma le tele o le mate o le faʻamama.
O faletusi na gaosia e faʻaaoga ai le T7Select 10-3b vector e pei ona faʻamatalaina i le T7Select system manual (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).I se faapuupuuga, o se faʻaofiina DNA 12-mer faʻafuaseʻi na faʻapipiʻiina i le faatulagaga lenei:
O le NNK codon na fa'aaogaina e aloese ai mai fa'agata fa'alua fa'apea ma le fa'aupuga o le amino acid i totonu o le fa'aofi.O le N o se fua faatatau equimolar fefiloi limalima o nucleotide taitasi, ma K o se fua faatatau equimolar fefiloi lima o adenine ma cytosine nucleotides.O itulagi nofofua nofofua na liua i le fa'aluaina o DNA e ala i le fa'aogaina atili i le dNTP (Novagen) ma Klenow enzyme (New England Biolabs) i Klenow buffer (New England Biolabs) mo le 3 itula ile 37°C.Ina ua maeʻa le tali, na toe maua mai le DNA faʻalua e ala ile EtOH precipitation.O le DNA na maua mai na fa'ama'i fa'atasi ma fa'atapula'aina enzymes EcoRI ma HindIII (mai Roche uma).O le faʻapipiʻiina ma faʻamamāina (QIAquick, Qiagen) faʻapipiʻi (T4 ligase, New England Biolabs) na faʻapipiʻiina i totonu o le faʻavaa i totonu o le T7 vector muamua i le maeʻa o le amino acid 348 o le 10B capsid gene.Sa fa'a'a'ofuina fa'a'auga o le Ligation i le 16° C. mo le 18 itula a'o le'i fa'apipi'iina in vitro.O le afifiina o le Phage in vitro na faia e tusa ai ma faatonuga o loʻo tuʻuina atu i le T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ma le faʻapipiʻi fofo na faʻateleina i le taimi e tasi e faʻaaoga ai le Escherichia coli (BLT5615, Novagen).O lysates sa fa'a'ese'ese, titrated ma fa'aisa i le -80° C. e fai ma vaifofo fa'asoa o le glycerol.
Fa'asa'o le PCR fa'aola ole phage fa'aola fa'asili e fa'asili i le susu po'o le ipu e fa'aaoga ai le 454/Roche-amplicon fusion primers.O le fusu'aga muamua o lo'o i ai fa'asologa o lo'o fa'asaga i le itulagi fesuia'i (NNK) 12 (fa'ata'ita'iga-fa'apitoa), GS FLX Titanium Adapter A, ma se fa'asologa o ki faletusi fa'avae (TCAG) (Ata Fa'aopoopo 1a):
O lo'o iai fo'i le biotin fa'apipi'i e pu'e ai lopa ma le GS FLX Titanium Adapter B e mana'omia mo le fa'ateleina o clonal i le taimi ole emulsion PCR:
O amplicons na tuʻuina atu i le 454 / Roche pyrosequencing e tusa ai ma le 454 GS-FLX Titanium protocol.Mo le Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA na faʻateleina e le PCR ma faʻasolosolo faʻatasi ma taʻi taʻimua nei:
O mea fa'apipi'i mai fa'ailoga ta'itasi na fa'apipi'iina i le PCR fa'ateleina e fa'aaoga ai le Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi).Faia se amataga vevela (10 min i le 95 °C) ma le 35 fa'aoso cycles (50 s i le 95 °C, 1 min i le 50 °C, ma le 1 min i le 72 °C).
Phage mai faletusi, vao-type phage, phage laveai mai le CSF ma le toto, poʻo clones taʻitasi na faʻateleina i le Escherichia coli BL5615 i le TB broth (Sigma Aldrich) poʻo le 500 cm2 ipu (Thermo Scientific) mo le 4 h i le 37 ° C.O le Phage na maua mai i papatusi e ala i le fufuluina o papatusi i le Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) poʻo le aoina o faʻamau i pito paipa paipa.O le Phage na vavae ese mai le aganuu supernatant poʻo le faʻapipiʻi faʻapipiʻi faʻatasi ma le tasi taamilosaga o le polyethylene glycol (PEG 8000) timuga (Promega) ma toe tuʻu i le Tris-EDTA buffer.
O le phage faʻateleina na tuʻuina atu i le 2-3 taamilosaga o le faʻaogaina o le endotoxin i le faʻaaogaina o le endotoxin removal beads (Miltenyi Biotec) aʻo leʻi faia le tui (IV) tui (500 μl / manu).I le taamilosaga muamua, 2 × 1012 phages na faʻaalia;i le lona lua, 2×1010 phages;i le taamilosaga lona tolu ma le fa, 2 × 109 phages i manu.O mea o lo'o iai i totonu o le CSF ma fa'ata'ita'iga o le toto na aoina i taimi fa'ailo na fa'amauina e ala i le faitauina o fa'ailoga e tusa ai ma fa'atonuga a le fale gaosi oloa (T7Select system manual).O le filifiliga o le Phage na faia e ala i le tui tui o faletusi mama i totonu o le siʻusiʻu vein poʻo le toe tuiina o le phage na maua mai le CSF mai le taamilosaga filifilia muamua, ma o le seleselega mulimuli na faia i le 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ma le 240 min samples toto.E fa ta'amilosaga in vivo panning na fa'atautaia lea na tu'u eseese ai lala filifilia e lua ma su'esu'eina i le ulua'i tolu taamilosaga o filifiliga.O fa'apipi'i phage uma na maua mai le CSF mai ta'amilosaga muamua e lua o le filifiliga na fa'atonuina i le 454/Roche pyrosequencing, ae o clones uma na maua mai le CSF mai ta'amilosaga mulimuli e lua o le filifiliga sa fa'asologa ma le lima.O phages toto uma mai le taamilosaga muamua o le filifiliga na faʻaogaina foi i le 454/Roche pyrosequencing.Mo le tui o clones phage, phages filifilia na faʻateleina i le E. coli (BL5615) i luga o 500 cm2 ipu i le 37 ° C mo le 4 itula.Na fa'asolo fa'asolo ile ala ole TB.A maeʻa le faʻaaogaina o le phage, faʻamamaina ma le aveeseina o le endotoxin (e pei ona faʻamatalaina i luga), 2 × 1010 phages / manu i le 300 μl na tui i totonu o le tasi vein siʻusiʻu.
Fa'asologa muamua ma le fa'avasegaina lelei o fa'amaumauga fa'asologa.Raw 454/Roche fa'amaumauga na fa'aliliuina mai le fa'asologa o fa'afanua fa'afanua masani (sff) i se fa'asologa e mafai ona faitau tagata (fasta) a Pearson e fa'aaoga ai le polokalama fa'atau.O isi gaioiga o le fa'asologa o le nucleotide na fa'atinoina i le fa'aaogaina o polokalama fa'apitoa C ma fa'amaumauga (polokalame polokalama e le'i fa'asalalauina) e pei ona fa'amatalaina i lalo.O le au'ili'iliga o fa'amaumauga autu e aofia ai faiga fa'ama'oti e tele-vaega fa'amama.Ina ia fa'amama le faitau e le'i i ai se fa'asologa fa'amautu 12mer fa'amautu DNA, sa fa'asolosolo fa'asologa o faitauga e amata fa'ailoga (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), taofi fa'ailoga (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ma fa'aofi i tua (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) e fa'aaoga ai le global Needleman-Wunsch test.alignment e mafai ai ona o'o atu i le 2 fe'ese'esea'iga ile alignment31.O le mea lea, faitau e aunoa ma le amataga ma taofi pine ma faitau o loʻo i ai faʻapipiʻi i tua, faʻataʻitaʻiga, alignments e sili atu i le faʻatagaina numera o le fetaui, na aveese mai le faletusi.Ae mo isi faitauga, o le N-mer DNA sequence e amata mai le amataga ma faaiʻu aʻo leʻi oʻo i le faʻailoga taofi na aveese mai le uluaʻi faʻasologa o le faitau ma faʻasolosolo atili (e taʻua mulimuli ane o le "faaofi").A mae'a le fa'aliliuga o le fa'aofi, o le vaega pe a mae'a le codon taofi muamua i le pito 5' o le fa'avae e aveese mai le fa'aofi.E le gata i lea, o nucleotides e tau atu i codons le atoatoa i le 3' pito o le mea muamua na aveese foi.Ina ia le aofia ai fa'apipi'i o lo'o iai na'o fa'asologa o tua'oi, fa'apipi'i fa'aliliu e amata i le mamanu amino acid “PAG” na aveese fo'i.Peptides o lo'o iai le umi o le fa'aliliuga e itiiti ifo i le 3 amino acids na aveese mai le faletusi.Ma le mea mulimuli, aveese le toe faʻaaogaina i totonu o le vaitaele faʻapipiʻi ma fuafua le tele o taimi o faʻapipiʻi tulaga ese taʻitasi.O taunuʻuga o lenei suʻesuʻega na aofia ai se lisi o faʻasologa o nucleotide (faʻaofi) ma latou (faitau) alalaupapa (Ata Faaopoopo 1c ma 2).
Vaega N-mer DNA faʻapipiʻi e ala i le faʻasologa tutusa: Ina ia faʻaumatia 454 / Roche faʻasologa faʻasologa o mea sese (e pei o faʻafitauli i le faʻasologa o faʻaopoopoga o le homopolymer) ma aveese faʻaitiitiga taua, faʻapipiʻi muamua N-mer DNA faʻapipiʻi faʻapipiʻi (faʻapipiʻi) faʻavasega e tutusa.fa'aofi (e o'o atu i le 2 fa'avae e le fetaui e fa'atagaina) e fa'aaoga ai se fa'asologa algorithm fa'amatalaina e pei ona taua i lalo: fa'aofiina e fa'avasega muamua i o latou taimi (maualuga i lalo), ma afai e tutusa, i la latou fa'asologa lona lua i le umi (sili ona umi i le pu'upu'u) ).O le mea lea, o faʻapipiʻi masani ma sili ona umi e faʻamatalaina ai le "vaega" muamua.O le fa'asologa o fa'alapotopotoga e fa'atulaga i le fa'aupuga autu.Ona taumafai lea e fa'aopoopo fa'atasiga ta'itasi o lo'o totoe i le lisi fa'aopoopo i le kulupu e ala i le fa'aoga tutusa o Needleman-Wunsch.Afai e le sili atu le aofa'i o le fetaui, fa'aofi, po'o le tapeina i se fa'aoga e 2, e fa'aopoopo le fa'aofi i le kulupu, ma fa'atuputeleina le fa'atuputeleina o vaega i le fa'afia ona fa'aopoopoina o le fa'aofi.O mea fa'aofi fa'aopoopo i se kulupu ua fa'ailogaina ua fa'aoga ma fa'ate'aina mai nisi gaioiga.Afai e le mafai ona fa'aopoopo le fa'asologa fa'aofi i se kulupu ua uma ona iai, e fa'aoga le fa'asologa fa'aofi e fatu ai se vaega fou ma le fa'aofi fa'asolo talafeagai ma fa'ailoga e pei ona fa'aaoga.E muta le su'esu'ega pe a fa'aogaina fa'asologa fa'aofi ta'itasi e fai ai se kulupu fou pe mafai fo'i ona fa'aofi i totonu o se kulupu ua iai.A uma mea uma, faʻapipiʻi faʻapipiʻi e aofia ai nucleotides e iu lava ina faaliliuina i peptide sequences (peptide faletusi).O le taunu'uga o lenei au'ili'iliga o se seti o fa'aofi ma a latou laina tutusa e maua ai le numera o faitauga soso'o (Fa'aopoopo Ata 2).
Fausiaina o Motif: Fa'avae i luga o se lisi o peptide tulaga ese, na fausia ai se faletusi e iai uma fa'asologa o le amino acids (aa) e pei ona fa'aalia i lalo.O faʻataʻitaʻiga taʻitasi o le umi 3 na maua mai le peptide ma faʻaopoopoina lona mamanu faʻatasi ma se faletusi autu masani o loʻo i ai mamanu uma (tripeptides).O faletusi o le tele o mea e fai soo na fa'asolosolo fa'asologa ma aveese le toe fa'aaogaina.Ma, mo tripeptide taʻitasi i totonu o le faletusi autu, matou te siakiina lona i ai i totonu o le faletusi e faʻaaoga ai meafaigaluega faʻapitoa.I lenei tulaga, o le tele o le peptide o loʻo i ai le motif tripeptide ua faʻaopoopoina ma tuʻuina atu i le motif i le motif library ("numera o motifs").O le i'uga o le fa'atupuina o le fa'atupu o se fa'asologa e lua-dimensional o lo'o i ai mea uma e tutupu o tripeptides (motifs) ma o latou tulaga taua, o le numera o le fa'asologa o faitauga e i'u ai i le motif tutusa pe a fa'amama le faitau, fa'avasega, ma fa'aliliu.Fuafuaga e pei ona faamatalaina auiliili i luga.
Fa'atonuga o le numera o fa'ailoga ma ta'ape fa'atatau: O le aofa'i o fa'ata'ita'iga mo fa'ata'ita'iga ta'itasi na fa'avasegaina e fa'aoga ai.
o le ni o le numera o faitauga o loʻo i ai le autu i.O le mea lea, o le vi o loʻo faʻatusalia le pasene o taimi o faitau (poʻo peptides) o loʻo iai le motif i i le faʻataʻitaʻiga.P-taua mo le numera e le masani ai o mafuaʻaga na fuafuaina e faʻaaoga ai le suʻega saʻo a Fisher.E tusa ai ma correlograms o le numera o mafuaʻaga, o fesoʻotaʻiga a Spearman na fuafuaina e faʻaaoga ai le numera masani o mafuaʻaga ma R.
Ina ia vaai faalemafaufau i le anotusi o amino acids i tulaga taitasi i le faletusi peptide, web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) na faia.Muamua, o mea o loʻo i totonu o amino acids i tulaga taʻitasi o le 12-mer peptide o loʻo teuina i totonu o le 20 × 12 matrix.Ma, o se seti o 1000 peptides o loʻo i ai le mea tutusa amino acid i tulaga taʻitasi e gaosia i le faʻasologa vave ma tuʻuina atu e fai ma faʻaoga i le web-logo 3, lea e maua ai se faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o mea e aofia ai amino acid i tulaga taʻitasi.mo se faletusi peptide ua tuuina atu.Ina ia va'ava'ai i fa'amaumauga tu'ufa'atasi, na faia fa'afanua vevela e fa'aaoga ai se meafaigaluega fa'alotoifale i totonu o le R (biosHeatmap, o se pusa R e le'i tu'uina atu).O dendrograms o lo'o tu'uina atu i fa'afanua vevela na fa'atatauina i le fa'aogaina o le fa'aputuga fa'avasegaina a Ward ma le Euclidean distance metric.Mo su'esu'ega fa'afuainumera o fa'amatalaga sikoa motif, P tau mo sikoa e le masani ai na fa'atatau i le su'ega sa'o a Fisher.P-values ​​​​mo isi faʻamaumauga na fuafuaina i le R faʻaaogaina le suʻega a Tamaiti poʻo le ANOVA.
phage clones filifilia ma phages e aunoa ma ni mea faʻapipiʻi na tui i totonu e ala i le vein siʻusiʻu (2 × 1010 phages / manu i le 300 μl PBS).Sefulu minute aʻo leʻi faʻafefeteina ma faʻapipiʻi mulimuli ane, o manu lava e tasi na tui faʻatasi ma le 100 μl o le DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minute ina ua uma le tui o le phage, o isumu na faʻafefe i totonu o le fatu ma le 50 ml PBS sosoo ai ma le 50 ml 4% PFA / PBS.O fa'ata'ita'iga fai'ai na fa'aopoopoina i le po i le 4% PFA/PBS ma fa'asusu i le 30% sucrose i le po i le 4°C.O fa'ata'ita'iga o lo'o fa'a'aisa emo ile paluga OCT.Imunohistochemical su'esu'ega o fa'a'aisa fa'ata'ita'iga na faia i le vevela o le potu i luga o le 30 µm cryosections poloka i le 1% BSA ma fa'asusu i polyclonal FITC-label antibodies e faasaga i le T7 phage (Novus NB 600-376A) i le 4 °C.Fa'afu i le po.Mulimuli ane, o vaega na fufulu 3 taimi i le PBS ma suʻesuʻeina i se microscope laser confocal (Leica TCS SP5).
O peptide uma e iai le mama maualalo o le 98% na faʻapipiʻiina e GenScript USA, biotinylated ma lyophilized.O le biotin o lo'o fusifusia e ala i se fa'aopoopoga tolu glycine spacer i le N-terminus.Siaki uma peptide e faʻaaoga ai le tele o spectrometry.
Streptavidin (Sigma S0677) na faʻafefiloi ma le 5-fold equimolar sili atu o le biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, poʻo le tuʻufaʻatasia (3: 1 ratio) o le biotinylated BACE1 inhibitory peptide ma le BACE1 inhibitory peptide i le 5-10% DMSO / incubated i le PBSO.1 itula ile vevela ole potu a'o le'i tui.Streptavidin-conjugated peptides na tui tui i se fua o le 10 mg / kg i totonu o se tasi o veins siʻusiʻu o isumu ma le cerebral cavity.
Ole maualuga ole streptavidin-peptide complexes na iloiloina e le ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) na ufiufi i le po i le 4 ° C ma le 1.5 μg / ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).A maeʻa le poloka (polokalame pa puipui: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) i le vevela o le potu mo 2 itula, fufuluina le ipu ma le 0.05% Tween-20 / PBS (fufulu pa puipui) mo le 3 Lua, CSF ma le plasma bufferlu faʻapipiʻi lelei10 faʻataʻitaʻiga: 0.05% Tween-20. CSF 1:115).O le ipu na faʻapipiʻiina i le po i le 4 ° C faʻatasi ai ma le antibody detection (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).I le maeʻa ai o laasaga fufulu e tolu, na iloa ai le streptavidin e ala i le faʻaogaina i le TMB substrate solution (Roche) mo le 20 min.A uma ona taofi le atinaʻeina o lanu ma le 1M H2SO4, fua le miti ile 450 nm.
O le galuega a le streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex na suʻesuʻeina e le Aβ (1-40) ELISA e tusa ai ma le tulafono a le gaosiga (Wako, 294-64701).I se faapuupuuga, o faʻataʻitaʻiga CSF sa faʻafefeteina ile faʻamaʻi masani (1:23) ma faʻafefe i le po i le 4 ° C i 96-well plates ua ufiufi ile BNT77 puʻeina antibody.A mae'a la'asaga fufulu e lima, ona fa'aopoopoina lea o le antibody BA27 fa'apipi'i HRP ma fa'a'afi mo le 2 itula i le 4° C., soso'o ai ma la'asaga fufulu e lima.Aβ(1-40) na maua e ala i le incubation i le TMB solution mo 30 minute i le vevela o le potu.A maeʻa ona taofi le atinaʻeina o lanu ile fofo taofi, fua le miti ile 450 nm.O faʻataʻitaʻiga o le Plasma na faʻataʻitaʻiina i le suʻeina o vaega mautu aʻo leʻi faia le Aβ (1-40) ELISA.Plasma na faʻaopoopoina ile 0.2% DEA (Sigma) ile 96-well plates ma faʻapipiʻi ile vevela ole potu mo le 30 minute.Ina ua uma ona fufulu faasolosolo ipu SPE (Oasis, 186000679) i le vai ma le 100% methanol, na faʻaopoopoina faʻataʻitaʻiga plasma i ipu SPE ma aveese uma vai.Sa fufulu fa'ata'ita'iga (muamua i le 5% methanol ona 30% methanol) ma fa'asusu ile 2% NH4OH/90% methanol.A maeʻa ona faʻamago le luate i le 55 ° C mo le 99 min i le N2 tumau, o faʻataʻitaʻiga na faʻaititia i faʻamaʻi masani ma Aβ (1-40) na fuaina e pei ona faʻamatalaina i luga.
E faʻapefea ona taʻua lenei tusiga: Urich, E. et al.Tuuina atu o uta i le faiʻai e faʻaaoga ai peptides feʻaveaʻi na faʻaalia i vivo.le faasaienisi.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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