Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O le su'esu'ega o lo'o e fa'aogaina e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).I le taimi nei, ina ia mautinoa le faʻaauauina o le lagolago, matou te tuʻuina atu le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Liquid biopsy (LB) o se manatu e vave ona maua le lauiloa i le biomedical field.O le manatu e fa'avae i luga o le su'esu'eina o vaega o le DNA extracellular (ccfDNA) o lo'o fa'asalalauina, lea e masani ona fa'asa'olotoina o ni vaega laiti pe a mavae le oti o sela i totonu o masini eseese.O se vaega la'ititi o nei fasi mea e afua mai i aano mai fafo (mai fafo) po'o meaola.I le galuega o lo'o i ai nei, ua matou fa'aogaina lenei manatu i mussel, o se ituaiga o leoleo e lauiloa i le maualuga o le fa'amamaina o le suasami.Matou te fa'aogaina le agava'a o mussel e fai ai ni filiga fa'anatura e pu'eina ai vaega DNA o le si'osi'omaga mai fa'apogai eseese e maua ai fa'amatalaga e uiga i meaola eseese o le gataifale.O a matou fa'ai'uga o lo'o fa'aalia ai o le mussel hemolymph o lo'o iai ni vaega DNA e matua'i fesuisuia'i le lapopo'a, mai le 1 i le 5 kb.O le fa'asologa o fana na fa'aalia ai o le tele o vaega o DNA e mafua mai i meaola ninii mai fafo.Faatasi ai ma i latou, na matou maua ai vaega DNA mai siama, archaea, ma viruses, e aofia ai siama ua iloa e aʻafia ai ituaiga eseese e masani ona maua i le gataifale o le gataifale.I le fa'ai'uga, o la matou su'esu'ega o lo'o fa'aalia ai o le manatu o le LB o lo'o fa'aoga i mussel o lo'o fa'atusalia ai se puna'oa mauoa ae le'i su'esu'eina e uiga i le tele o meaola ninii i le gataifale.
O le aʻafiaga o suiga o le tau (CC) i luga o meaola eseese o meaola faanatura o le gataifale o se vaega faʻatupulaia vave o suʻesuʻega.O le mafanafana o le lalolagi e le gata ina mafua ai le mamafa o le physiological, ae o loʻo tuleia ai foʻi le faʻalauteleina o tapulaʻa o le faʻamautuina o le vevela o meaola o le gataifale, e aʻafia ai le nofoaga o le tele o ituaiga, faʻaosofia ai i latou e suʻe ni tulaga sili atu ona lelei [1, 2].E le gata i le a'afiaina o meaola eseese o metazoans, e fa'alavelaveina e CC le paleni ma'ale'ale o feso'ota'iga a le talimalo-microbial.O lenei microbial dysbacteriosis o loʻo avea ma se faʻamataʻu mataʻutia i le gataifale faʻanatura ona e faʻateleina ai meaola o le gataifale e sili atu ona aʻafia i faʻamaʻi pipisi [3, 4].E talitonuina o le SS o loʻo i ai se sao taua i le tele o maliu, o se faʻafitauli ogaoga mo le puleaina o le gataifale o le lalolagi [5, 6].Ose matā'upu tāua lea ona ole a'afiaga ole tamaoaiga, si'osi'omaga ma mea'ai ole tele o meaola o le gataifale.E moni lava lenei mea mo pivalves o loʻo nonofo i le polar regions, lea o aʻafiaga o le CK e sili atu ona vave ma ogaoga [6, 7].O le mea moni, o pivalves e pei o Mytilus spp.o lo'o fa'aaogaina lautele e mata'ituina ai a'afiaga o le CC i fa'alapotopotoga o le gataifale.E le o se mea e ofo ai, o se numera tele o biomarkers ua atiaʻe e mataʻituina ai lo latou soifua maloloina, e masani ona faʻaogaina se auala e lua-vaega e aofia ai biomarkers galue e faʻavae i luga o le enzymatic gaioiga poʻo le telefoni feaveaʻi e pei ole cell viability ma le phagocytic activity [8].O nei metotia e aofia ai foʻi le fuaina o le faʻamaualuga o faʻailoga faʻapitoa o le mamafa o loʻo faʻaputuina i masini vaivai pe a maeʻa le faʻaogaina o le tele o vai sami.Ae ui i lea, o le maualuga o le faʻamamaina ma le semi-tatala faʻaogaina o le bivalves e maua ai le avanoa e atiaʻe ai ni faʻailoga fou o le hemolymph e faʻaaoga ai le manatu o le biopsy vai (LB), o se auala faigofie ma laʻititi i le puleaina o maʻi.toto faataitai [9, 10].E ui lava o le tele o ituaiga o molelaʻau feʻaveaʻi e mafai ona maua i totonu o le tagata LB, o lenei manatu e faʻavae i luga ole suʻesuʻega faʻasologa o DNA o faʻasalalauga DNA extracellular (ccfDNA) i le plasma.O le mea moni, o le i ai o le DNA faʻasalalau i totonu o le plasma o le tagata ua iloa talu mai le ogatotonu o le 20th seneturi [11], ae naʻo tausaga talu ai nei na oʻo mai ai auala faʻasolosolo maualuga e taʻitaʻia ai suʻesuʻega faʻapitoa e faʻavae i luga o le ccfDNA.O le i ai o nei vaega DNA taamilo e mafua ona o le tuʻuina atu o le genomic DNA (nuclear ma mitochondrial) pe a maeʻa le oti. I tagata soifua maloloina, o le faʻaogaina o le ccfDNA e masani lava ona maualalo (<10 ng / mL) ae mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i tagata mamaʻi o loʻo mafatia i faʻamaʻi eseese poʻo le faʻalavelaveina, e mafua ai le faaleagaina o le tino. I tagata soifua maloloina, o le faʻaogaina o le ccfDNA e masani lava ona maualalo (<10 ng / mL) ae mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i tagata mamaʻi o loʻo mafatia i faʻamaʻi eseese poʻo le faʻalavelaveina, e mafua ai le faaleagaina o le tino. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухлоч или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. I tagata soifua maloloina, o le faʻaogaina o le cccDNA e masani lava ona maualalo (<10 ng/mL), ae e mafai ona faʻateleina i le 5-10 taimi i tagata mamaʻi e iai faʻamaʻi eseese poʻo lalo o le atuatuvale e oʻo atu ai i le faʻaleagaina o le tino.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受受压动1从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 或 承受加 5-10 ， 从而 组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у млица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA concentrations e masani lava ona maualalo (<10 ng/ml) i tagata soifua maloloina, ae mafai ona faʻateleina 5-10-paiga i tagata mamaʻi ma faʻamaʻi eseese poʻo le atuatuvale, e mafua ai le faaleagaina o le tino.Ole tele ole vaega ole ccfDNA e eseese lautele, ae e masani lava e mai le 150 i le 200 bp.[12].O suʻesuʻega o le ccfDNA e maua mai e le tagata lava ia, o lona uiga, ccfDNA mai sela masani poʻo le suia o le talimalo, e mafai ona faʻaaogaina e iloa ai suiga o le kenera ma epigenetic o loʻo i ai i le genome faaniukilia ma / poʻo le mitochondrial, ma fesoasoani ai i fomaʻi e filifili ni togafitiga faʻapitoa mole mole [13].Ae ui i lea, o le ccfDNA e mafai ona maua mai punaoa mai fafo e pei o le ccfDNA mai sela fetal i le taimi o le maitaga poʻo mai totoga toto [14,15,16,17].O le ccfDNA o se punaʻoa taua foi o faʻamatalaga mo le suʻesuʻeina o le i ai o nucleic acids o se faʻamaʻi pipisi (mai fafo), lea e mafai ai ona maua le le faʻaleagaina o faʻamaʻi pipisi e leʻo faʻaalia e aganuu toto, aloese mai le biopsy invasive o le tino [18].O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia moni lava o le toto o le tagata o loʻo i ai se punaʻoa tele o faʻamatalaga e mafai ona faʻaaogaina e faʻamaonia ai siama ma siama siama, ma e tusa ma le 1% o le ccfDNA o loʻo maua i le plasma tagata e tupuga mai fafo [19].O nei su'esu'ega ua fa'aalia ai e mafai ona su'esu'eina le olaola o le microbiome o lo'o ta'amilo i le fa'aogaina ole su'esu'ega ccfDNA.Ae ui i lea, seʻia oʻo mai talu ai nei, o lenei manatu na faʻaaogaina naʻo tagata ma, i se tulaga maualalo, i isi vertebrates [20, 21].
I le pepa o loʻo i ai nei, matou te faʻaogaina le LB gafatia e faʻavasega ai le ccfDNA o Aulacomya atra, o se ituaiga i saute e masani ona maua i le subantarctic Kerguelen Islands, o se vaega o motu i luga o se laufanua tele na fausia i le 35 miliona tausaga talu ai.mauga mu.I le fa'aogaina o se faiga fa'ata'ita'i in vitro, na matou iloa ai o fasi DNA i le suasami e vave ona ave e mussel ma ulu atu i le vaega o le hemolymph.O le fa'asologa o fana ua fa'aalia ai o le mussel hemolymph ccfDNA o lo'o i ai vaega o le DNA o lona lava tupu'aga ma e le o ia lava, e aofia ai siama symbiotic ma vaega DNA mai meaola fa'apitoa o le malulu malulu o le gataifale.O le Hemolymph ccfDNA o lo'o iai fo'i fa'asologa viral e maua mai i fa'ama'i ma 'ese'ese nofoaga e talimalo ai.Na matou maua fo'i fasi vaega DNA mai manu fe'avea'i e pei o i'a ivi, anemone o le sami, algae ma iniseti.I le fa'ai'uga, o la matou su'esu'ega e fa'aalia ai e mafai ona fa'aoga lelei le manatu o le LB i invertebrates o le gataifale e fa'atupuina ai se fa'asologa o le genomic mauoa i le fa'anatura o le gataifale.
O tagata matutua (55-70 mm le umi) Mytilus platensis (M. platensis) ma Aulacomya atra (A. atra) na aoina mai i matafaga papa intertidal o Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kerguelen Islands ia Tesema 2018. O isi museli lanumoana matutua (Mytilus spp.) na maua mai se kamupani faʻatau pisinisi (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanata) ma tuʻu i totonu o se pusa vevela (4°C) e maua ai le 10-20 L o le 32‰ brine faʻaoga.(masima fagogo a'a o le A'au Crystal, Vasa vave, Virginia, ISA).Mo fa'ata'ita'iga ta'itasi, sa fuaina le umi ma le mamafa o atigi ta'itasi.
O lo'o maua i luga ole laiga i luga ole laiga (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).I se faapuupuuga, LB hemolymph na aoina mai maso faomea e pei ona faamatalaina [22].O le hemolymph na faʻamalamalamaina e le centrifugation i le 1200 × g mo le 3 minute, o le supernatant na faʻamaisa (-20 ° C) seia faʻaaogaina.Mo le faʻaesea ma le faʻamamaina o le cfDNA, faʻataʻitaʻiga (1.5-2.0 ml) na faʻafefe ma faʻaogaina e faʻaaoga ai le NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) e tusa ai ma faʻatonuga a le gaosiga.ccfDNA na teuina ile -80°C se'ia toe su'esu'e.I nisi o suʻesuʻega, ccfDNA na faʻaesea ma faʻamamāina e faʻaaoga ai le QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanata).O le DNA fa'amamāina na fa'atatauina i le fa'aaogaina o se su'esu'ega masani a PicoGreen.O le tufaina o vaega o le ccfDNA tu'ufua na su'esu'eina e le capillary electrophoresis e fa'aaoga ai le Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) e fa'aaoga ai le High Sensitivity DNA Kit.O le su'ega na faia i le fa'aaogaina o le 1 µl o le fa'ata'ita'iga o le ccfDNA e tusa ai ma fa'atonuga a le gaosi oloa.
Mo le fa'asologa o vaega o le hemolymph ccfDNA, na saunia e Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanata) faletusi fana e fa'aaoga ai le pusa Illumina DNA Mix o le pusa Illumina MiSeq PE75.Sa fa'aogaina se fa'aoga masani (BioO).O lo'o maua faila fa'amaumauga mai le NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ma SRR8924809).Sa su'esu'eina le tulaga lelei o le faitau tusi e fa'aaoga ai le FastQC [23].Trimmomatic [24] ua fa'aaogaina mo mea fa'apipi'i fa'apipi'i ma le lelei o faitauga.Faitau fana fa'atasi ma pito fa'alua na tu'ufa'atasia le FLASH i faitauga ta'itasi umi ma se la'ititi la'ititi o le 20 bp e 'alofia ai le le fetaui [25]. O faitauga faʻatasi na faʻamatalaina i le BLASTN e faʻaaoga ai le NCBI Taxonomy database (e tau <1e-3 ma 90% homology), ma le faʻaogaina o faʻasologa o laʻititi lavelave na faia e faʻaaoga ai le DUST [26]. O faitauga faʻatasi na faʻamatalaina i le BLASTN e faʻaaoga ai le NCBI Taxonomy database (e tau <1e-3 ma 90% homology), ma le faʻaogaina o faʻasologa o laʻititi lavelave na faia e faʻaaoga ai le DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчозлылюм 3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием PEBU [26]. O faitauga faʻapipiʻi na faʻamatalaina i le BLASTN e faʻaaoga ai le NCBI bivalve taxonomy database (e tau <1e-3 ma le 90% homology), ma le lavelave faʻasolosolo faʻasolosolo faʻapipiʻi na faia e faʻaaoga ai le DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 众< 1e-3 和90% 同源性）用 BLASTN 注释合并的读使，用并说使，并使，2并并使用 BLASTN复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 迡数 ， 6用复杂度 序列 的。。。蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуство NCючат <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием PEBU [26]. O faitauga faʻapipiʻi na faʻamatalaina i le BLASTN e faʻaaoga ai le NCBI bivalve taxonomic database (e tau <1e-3 ma 90% homology), ma le lavelave faʻasolosolo faʻasolosolo faʻapipiʻi na faia e faʻaaoga ai le DUST [26].Na vaevaeina faitauga i ni vaega se lua: e feso'ota'i ma fa'asologa o lua (i'inei e ta'ua o le faitau a le tagata lava ia) ma le le feso'ota'i (e le o le faitau a le tagata lava ia).E lua vaega na faʻapotopoto faʻatasi e faʻaaoga ai le MEGAHIT e faʻatupu ai faʻalavelave [27].I le taimi nei, o le tufatufaina o lafoga o microbiome mai fafo faitau na faʻavasegaina e faʻaaoga ai le Kraken2 [28] ma faʻataʻitaʻiina e le Krona pie siata i le Galaxy [29, 30].O kmers sili ona lelei na faʻamoemoe e avea ma kmers-59 mai a matou faʻataʻitaʻiga muamua. O faʻamatalaga a le tagata lava ia na faʻaalia e ala i le faʻaogaina ma le BLASTN (bivalve NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology) mo se faʻamatalaga mulimuli. O faʻamatalaga a le tagata lava ia na faʻaalia e ala i le faʻaogaina ma le BLASTN (bivalve NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology) mo se faʻamatalaga mulimuli. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых мовлюбиски, 1 мозлюбиск, 1 мозлюбиск, 1 мозлюбиск ология 60%) для окончательной аннотации. O fa'amatalaga a le tagata lava ia na fa'ailoaina e ala i le fetaui ma le BLASTN (NCBI bivalve database, e tau <1e-10 ma le 60% homology) mo fa'amatalaga mulimuli.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 众< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别量自终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал дхдмун оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). O fa'amatalaga a le tagata lava ia na fa'ailoaina mo fa'amatalaga mulimuli e ala i le fetaui ma le BLASTN (NCBI bivalve database, e tau <1e-10 ma le 60% homology). I se tulaga tutusa, o faʻasalalauga faʻapitoa e le o ia lava na faʻamatalaina i le BLASTN (nt NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology). I se tulaga tutusa, o faʻasalalauga faʻapitoa e le o ia lava na faʻamatalaina i le BLASTN (nt NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 %) I se tulaga tutusa, o faʻasalalauga faʻalapotopotoga mai fafo na faʻamatalaina i le BLASTN (NT NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 1< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 1< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даNCных ночих 1 60%). I se tulaga tutusa, o faʻasalalauga e le o le tagata lava ia na faʻamatalaina i le BLASTN (nt NCBI database, e tau <1e-10 ma 60% homology). BLASTX sa faia foi i luga o nonself contigs e faaaoga ai le nr ma RefSeq protein NCBI databases (e tau <1e-10 ma 60% homology). BLASTX sa faia foi i luga o nonself contigs e faaaoga ai le nr ma RefSeq protein NCBI databases (e tau <1e-10 ma 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение e <1e.0%) BLASTX sa faia foi i luga ole contigs e le o le tagata lava ia e faaaoga ai le nr ma RefSeq NCBI protein databases (e tau <1e-10 ma 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧Ｚ 同60% 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧Ｚ 同60% 。 BLASTX также выполняли i несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) BLASTX sa faia foi i luga ole contigs e le o le tagata lava ia e faaaoga ai le nr ma RefSeq NCBI protein databases (e tau <1e-10 ma 60% homology).O le BLASTN ma le BLASTX vaituloto o non-self-contigs e fai ma sui o contigs mulimuli (silasila i le faila Faaopoopo).
O fa'amatalaga fa'aaoga mo le PCR o lo'o lisiina ile Laulau S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) na faʻaaogaina e faʻalautele ai le ccfDNA faʻasologa o kenera.O tulaga faʻaalia nei na faʻaaogaina: denaturation i le 95 ° C mo le 3 minute, 95 ° C mo le 1 minute, seti le vevela o le annealing mo le 1 minute, elongation i le 72 ° C mo le 1 minute, 35 taamilosaga, ma mulimuli ane 72 ° C i totonu o le 10 minute..O oloa PCR na tuueseeseina e le electrophoresis i gels agarose (1.5%) o loʻo iai le SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanata) ile 95 V.
O Mussels (Mytilus spp.) sa fa'aacclimatized i le 500 ml suasami fa'asalaina (32 PSU) mo le 24 itula ile 4°C.Plasmid DNA o loʻo i ai se mea faʻapipiʻi faʻapipiʻiina le galectin-7 cDNA faʻasologa o le tagata (NCBI numera o le L07769) na faʻaopoopoina i le vial i se faʻasalaga mulimuli o le 190 μg / μl.O museli na fa'atupu i lalo o tulaga lava e tasi e aunoa ma le fa'aopoopoina o le DNA na fa'atonutonuina.O le tane fa'atonutonu lona tolu o lo'o iai DNA e aunoa ma ni mussel.Ina ia mataʻituina le tulaga lelei o le DNA i le sami, faʻataʻitaʻiga o le sami (20 μl; tolu toe fai) na ave mai tane taʻitasi i le taimi faʻaalia.Mo plasmid DNA traceability, LB mussels na seleseleina i taimi faʻaalia ma suʻesuʻeina e qPCR ma ddPCR.Ona o le maualuga o le masima o lo'o i totonu o le sami, o aliquots na fa'afefeteina ile PCR lelei vai (1:10) a'o le'i faia uma su'ega PCR.
O le PCR matāua numera (ddPCR) na faia i le fa'aogaina o le BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Kanata).Fa'aaoga le fa'amatalaga o le vevela e iloa ai le maualuga o le vevela (Laulau S1).O matau'a na gaosia e fa'aaoga ai le QX200 drop generator (BioRad).ddPCR na faia e pei ona taua i lalo: 95 ° C mo le 5 min, 50 taamilosaga o le 95 ° C mo le 30 s ma se vevela faʻafefeteina mo le 1 min ma le 72 ° C mo le 30 s, 4 ° C mo le 5 min ma le 90 ° C i totonu ole 5 minute.Ole numera o mataua ma tali lelei (numera o kopi/µl) na fuaina ile fa'aogaina ole QX200 drop reader (BioRad).O faʻataʻitaʻiga e i lalo ifo o le 10,000 matāua na teena.E leʻi faia le faʻatonutonuina o mamanu i taimi uma na faʻatautaia ai le ddPCR.
qPCR na faʻatinoina i le faʻaaogaina o Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ausetalia) ma LGals7 faʻapitoa faʻapitoa.O PCR fa'atusatusa uma na faia i le 20 µl e fa'aaoga ai le QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR na amata ile 15 min incubation ile 95°C sosoo ai ma le 40 cycles ile 95°C mo le 10 sekone ma ile 60°C mo le 60 sekone ma le tasi le aoina o faamatalaga.O le faʻafefeteina faʻafefe na gaosia e faʻaaoga ai fua faʻasolosolo i le 95 ° C mo le 5 s, 65 ° C mo le 60 s, ma le 97 ° C i le pito o le qPCR.O qPCR ta'itasi sa fa'atino i fa'atolu, se'i vagana ai fa'ata'ita'iga fa'atonutonu.
Talu ai e lauiloa le mussel i le maualuga o le fa'amama, na matou su'esu'e muamua pe mafai ona latou fa'amama ma taofi vaega DNA o lo'o i totonu o le sami.Sa matou fiafia foi pe faʻaputuina nei vaega i totonu o latou faʻaogaina o le lymphatic system.Na matou fo'ia fa'ata'ita'i lenei fa'afitauli e ala i le su'esu'eina o le i'uga o fasi vaega DNA soluble ua fa'aopoopo i tane mussel lanumoana.Ina ia faafaigofie le siakiina o vaega DNA, matou te faʻaogaina le DNA plasmid mai fafo (e le o le tagata lava ia) o loʻo i ai le galectin-7 gene.ddPCR su'esu'e vaega plasmid DNA i le sami ma mussel.O a matou faʻaiʻuga e faʻaalia ai afai o le aofaʻi o fasi DNA i totonu o le sami e tumau pea le tumau i le taimi (e oʻo atu i le 7 aso) i le leai o ni mussels, ona i ai lea i le i ai o mussel e toetoe lava a mou atu le maualuga i totonu ole 8 itula (Fig 1a,b).O fasi vaega o le DNA mai fafo na faigofie ona iloa i totonu ole 15 min ile intravalvular fluid ma le hemolymph (Fig. 1c).O nei vaega e mafai lava ona iloa i le 4 itula talu ona fa'aalia.O lenei gaioiga fa'amama e fa'atatau i vaega DNA e fa'atusatusa i le fa'amamaina o gaioiga o siama ma algae [31].O fa'ai'uga nei e fa'ailoa mai e mafai e mussel ona fa'amama ma fa'aputuina DNA mai fafo i totonu o latou vaega vai.
Fua'iga fa'atatau ole DNA plasmid ile suasami ile iai (A) po'o le to'esea (B) o mussel, fuaina ile ddPCR.I le A, o faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia o pasene, ma tuaoi o pusa e fai ma sui o le 75th ma le 25th percentile.O lo'o fa'apipi'i logarithmic curve o lo'o fa'aalia i le mumu, ma o le vaega o lo'o paolo i le lanu efuefu o lo'o fa'atusalia ai le 95% le taimi fa'alagolago.I le B, o le laina mumu o loʻo faʻatusalia le uiga ma le laina lanumoana o loʻo faʻatusalia ai le 95% taimi faʻalagolago mo le faʻatonuga.C Fa'aputuina o le DNA plasmid i le hemolymph ma le vai valvular o mussels i taimi eseese pe a uma le fa'aopoopoina o le DNA plasmid.O fa'ai'uga o lo'o tu'uina atu o ni kopi atoatoa na maua/mL (±SE).
Na sosoo ai, na matou suʻesuʻeina le amataga o le ccfDNA i mussel na aoina mai i mussel moega i luga o le Kerguelen Islands, o se vaega mamao o motu e faʻatapulaʻaina aafiaga anthropogenic.Mo lenei faʻamoemoe, cccDNA mai mussel hemolymphs na faʻamavaeina ma faʻamamāina i auala masani e faʻaaogaina e faʻamamā ai tagata cccDNA [32, 33].Na matou iloa o le averesi o le toto o le hemolymph ccfDNA i mussel o loʻo i le maualalo micrograms i le ml hemolymph range (silasila i le Laulau S2, Faʻamatalaga Faaopoopo).O lenei vaega o faʻatonuga e sili atu le tele nai lo tagata soifua maloloina (maualalo nanograms per milliliter), ae i se mea e seasea tupu, i gasegase o le kanesa, o le maualuga o le ccfDNA e mafai ona oʻo atu i le tele o micrograms i le mililita [34, 35].O se au'ili'iliga o le tele o le tufatufaina o le hemolymph ccfDNA na fa'aalia ai o nei vaega e eseese tele i le lapopoa, mai le 1000 bp i le 1000 bp.e oo atu i le 5000 bp (Fig. 2).O fa'ai'uga tutusa na maua mai i le fa'aaogaina o le QIAamp Investigator Kit, o se metotia e masani ona fa'aaogaina i le su'esu'ega fa'asaienisi e vave fa'aesea ma fa'amamāina genomic DNA mai fa'ata'ita'iga DNA maualalo, e aofia ai le ccfDNA [36].
Sui ccfDNA electrophoregram o mussel hemolymph.Aveese ma NucleoSnap Plasma Kit (pito i luga) ma QIAamp DNA Investigator Kit.B fuala'au vaiolini o lo'o fa'aalia ai le fa'asoaina o fa'aputuga ole hemolymph ccfDNA (±SE) i mussel.O laina uliuli ma lanu mumu e fai ma sui o le vaeluagalemu ma le quartile muamua ma le tolu, i le faasologa.
E tusa ma le 1% o le ccfDNA i tagata ma primates ei ai se puna mai fafo [21, 37].Ona o le ta'amilosaga semi-matala o pivalves, suasami e tele microbial, ma le tele o le tufaina o mussel ccfDNA, na matou manatu ai o mussel hemolymph ccfDNA atonu o loʻo i ai se vaitaele mauoa ma eseese ole DNA microbial.Ina ia faʻataʻitaʻiina lenei manatu, matou te faʻasologaina le hemolymph ccfDNA mai faʻataʻitaʻiga Aulacomya atra na aoina mai Atumotu o Kerguelen, ma maua ai le silia ma le 10 miliona faitau, 97.6% na pasia le faʻatonuga lelei.O faitauga na faʻavasegaina e tusa ai ma faʻamatalaga a le tagata lava ia ma le le faʻaaogaina o le BLASTN ma le NCBI bivalve databases (Fig. S1, Faʻamatalaga Faʻaopoopo).
I totonu o tagata, o DNA faaniukilia ma mitochondrial e mafai ona tuʻuina atu i totonu o le toto [38].Ae ui i lea, i le suʻesuʻega nei, e leʻi mafai ona faʻamatalaina auiliili le DNA genomic faaniukilia o mussels, ona o le A. atra genome e leʻi faʻasolosolo pe faʻamatalaina.Ae ui i lea, na mafai ona matou iloa le tele o vaega o le ccfDNA o matou lava tupuaga e faʻaaoga ai le faletusi bivalve (Fig. S2, Faʻamatalaga Faʻaopoopo).Na matou faʻamaonia foʻi le iai o vaega DNA o lo matou lava tupuaga e ala i le faʻatonuina o le PCR faʻalauteleina o na genes A. atra na faʻasolosolo (Fig. 3).E faapena foi, ona o le mitochondrial genome o A. atra o loʻo maua i faʻamaumauga a le lautele, e mafai e se tasi ona maua faʻamaoniga mo le i ai o vaega o le mitochondrial ccfDNA i le hemolymph o A. atra.O le i ai o vaega o le DNA mitochondrial na faʻamaonia e le PCR amplification (Fig 3).
O kenera eseese mitochondrial sa i ai i le hemolymph o A. atra (mea mumu - numera o oloa: SRX5705969) ma M. platensis (mea lanumoana - numera o oloa: SRX5705968) faʻateleina e le PCR.Fa'atusa fa'atusa mai Breton et al., 2011 B Fa'ateleina o le hemolymph supernatant mai le A. atra Fa'asaoina i luga o pepa FTA.Fa'aaoga se tu'i 3 mm e fa'aopoopo sa'o i le paipa PCR o lo'o iai le paluga PCR.
Ona o le tele o mea e maua i le suasami, na matou taulaʻi muamua i le faʻavasegaina o faʻasologa o DNA microbial i le hemolymph.Ina ia faia lenei mea, matou te faʻaaogaina ni taʻiala eseese se lua.O le taʻiala muamua na faʻaaogaina Kraken2, o se polokalame faʻavasega faʻasologa faʻavae algorithm e mafai ona iloa ai faʻasologa o microbial ma se saʻo faʻatusatusa i le BLAST ma isi meafaigaluega [28].E sili atu nai lo le 6719 faitau na faʻamoemoe e mafua mai i siama, ae 124 ma 64 e mai archaea ma viruses, i le faasologa (Fig. 4).O vaega sili ona tele o DNA siama o Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ma Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).O lenei tufatufaga e ogatasi ma suʻesuʻega muamua o le microbiome mussel moana moana [39, 40].Gammaproteobacteria o le vasega autu o Proteobacteria (44%), e aofia ai le tele o Vibrionales (Fig. 4b).O le auala ddPCR na faʻamaonia ai le i ai o vaega o le DNA Vibrio i le ccfDNA o le A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Ina ia maua nisi faʻamatalaga e uiga i le siama siama o le ccfDNA, na faia se isi auala faʻaopoopo (Fig. S2, Faʻamatalaga Faʻaopoopo). I lenei tulaga, faitau na faʻapipiʻiina na faʻapipiʻiina e pei o faitauga faʻatasi ma sa faʻavasegaina o oe lava (bivalves) poʻo le le faʻaaogaina o le BLASTN ma le tau e o le 1e-3 ma se tipi ma> 90% homology. I lenei tulaga, faitau na faʻapipiʻiina na faʻapipiʻiina e pei o faitauga faʻatasi ma sa faʻavasegaina o oe lava (bivalves) poʻo le le faʻaaogaina o le BLASTN ma le tau e o le 1e-3 ma se tipi ma> 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированыестости юски) ae ole чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. I le tulaga lea, o le faitau fa'alava na aoina e pei o le faitau fa'ai'u fa'alua ma sa fa'avasegaina o ni tagata (bivalve) po'o le fa'aaogaina o le BLASTN ma le e tau o le 1e-3 ma tipi i le> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用 BLASTN 和1e-3 的e 众咐>90% 我們和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 1 % 和 和 9>同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстовленски ma) po'o le leai o se fa'atonuga fa'atasi ma le fa'atonuga o le BLASTN ma le 1e-3 ma le 90%. I lenei tulaga, o faitauga faʻapipiʻi na aoina e pei o faitauga faʻatasi ma faʻavasegaina e pei o oe lava (bivalves) poʻo le le faʻaaogaina e BLASTN ma 1e-3 tau ma se faʻamaufaʻailoga homology> 90%.Talu ai o le A. atra genome e leʻi faʻatulagaina, na matou faʻaogaina le taʻiala o le fono a le MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.E 147,188 le aofa'i o fa'ama'i ua fa'amaonia e fa'alagolago (bivalves) na tupuga mai ai.O nei contigs na faʻafefeina i e-values ​​​​o 1e-10 faʻaaoga BLASTN ma BLASTX.O lenei fuafuaga na mafai ai ona matou iloa 482 vaega e le o ni bivalve o loʻo iai i le A. atra ccfDNA.E sili atu ma le afa (57%) o nei vaega DNA na maua mai siama, aemaise lava mai gill symbionts, e aofia ai sulfotrophic symbionts, ma mai gill symbionts Solemya velum (Fig. 5).
Fa'ato'a fa'atatau i le ituaiga tulaga.B Tulaga fa'ama'i 'ese'ese o phyla autu e lua (Firmicutes ma Proteobacteria).Fa'aaupuina fa'atusa o le ddPCR C Vibrio spp.A. Vaega o le 16S rRNA gene (lanu moana) i le tolu atra hemolymphs.
E 482 le aofa'i o contigs na aoina na su'esu'eina.Fa'amatalaga lautele o le tufatufaina o lafoga o fa'amatalaga fa'atasi metagenomic (prokaryotes ma eukaryotes).B Tufatufaina auiliili o vaega DNA siama ua faailoa mai e BLASTN ma BLASTX.
O le au'ili'iliga a Kraken2 na fa'aalia ai fo'i o le mussel ccfDNA o lo'o i ai vaega o DNA archaeal, e aofia ai vaega DNA o Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ma Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).O le i ai o vaega DNA na maua mai Euryarchaeota ma Crenarchaeota, na maua muamua i le microbial community of Californian mussels, e le tatau ona avea ma se mea e faateia ai [42].E ui o le Euryarchaeota e masani ona fesoʻotaʻi ma tulaga ogaoga, ua iloa nei o Euryarchaeota ma Crenarcheota o loʻo iai i totonu o prokaryotes sili ona taatele i le gataifale cryogenic environment [43, 44].E le o se mea e ofo ai le i ai o meaola ninii o le methanogenic i mussels, ona o lipoti lata mai o le tele o methane tafe mai lalo ifo i luga o le Kerguelen Plateau [45] ma ono mafai ona gaosia methane microbial na matauina mai le talafatai o le Atu Kerguelen [46].
Ona liliu atu lea o matou mafaufau i faitauga mai siama DNA.E tusa ai ma lo matou iloa, o le suʻesuʻega muamua lea i fafo atu o le siama o le mussels.E pei ona faʻamoemoeina, na matou maua ni vaega DNA o bacteriophages (Caudovirales) (Fig. 6b).Ae ui i lea, o le DNA viral sili ona taatele e sau mai se phylum o nucleocytoviruses, e lauiloa foi o le nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), lea e sili ona tele le genome o soʻo se siama.I totonu o lenei phylum, o le tele o fa'asologa o DNA e patino i aiga Mimimidoviridae (58%) ma Poxviridae (21%), o latou 'au faanatura e aofia ai vertebrates ma arthropods, ae o se vaega itiiti o nei fa'asologa DNA e a'afia i algae virological.E a'afia ai algae eukaryotic marine.O fa'asologa na maua mai fo'i mai le Pandora virus, le virus tele e sili ona tele le genome o so'o se genera viral e iloa.O le mea e malie ai, o le tele o 'au e iloa ua a'afia i le siama, e pei ona fuafuaina e le hemolymph ccfDNA sequencing, sa fai si tele (Ata S3, Fa'amatalaga Faaopoopo).E aofia ai fa'ama'i e a'afia ai iniseti e pei o Baculoviridae ma Iridoviridae, fa'apea fo'i siama e a'afia ai le amoeba, algae ma vertebrates.Na matou maua fo'i fa'asologa e fetaui ma le Pithovirus sibericum genome.Pitoviruses (lea e taʻua o "zombie viruses") na muamua vavae ese mai le 30,000 tausaga le matua maaaisa i Siberia [47].O lea la, o a matou fa'ai'uga o lo'o ogatasi ma lipoti talu ai e fa'aalia ai e le o fa'aonaponei ituaiga uma o nei virusi ua fa'aumatia [48] ma e ono iai nei fa'ama'i i totonu o le gataifale subarctic fa'anatura.
Mulimuli ane, na matou suʻesuʻeina pe mafai ona matou mauaina ni vaega o DNA mai isi meaola tele.O le aofaʻi o 482 contigs mai fafo na faʻamaonia e BLASTN ma BLASTX faʻatasi ai ma faletusi nt, nr ma RefSeq (genomic ma protein).O a matou fa'ai'uga o lo'o fa'aalia ai i totonu o vaega mai fafo o le ccfDNA o manu multicellular DNA o ponaivi ponaivi e sili ona maualuga (Ata. 5).Ua maua fo'i vaega o DNA mai iniseti ma isi ituaiga.O se vaega tele o vaega o le DNA e leʻi faʻamaonia, atonu ona o le faʻaalia o le tele o ituaiga o meaola o le gataifale i faʻamaumauga genomic pe a faʻatusatusa i ituaiga eleele [49].
I le pepa o lo'o i ai nei, matou te fa'aogaina le manatu LB i mussels, ma finau e mafai e le hemolymph ccfDNA fana fa'asologa e mafai ona maua ai le malamalama i le tu'ufa'atasiga o meaola faanatura o le gataifale.Aemaise lava, na matou maua ai o le 1) mussel hemolymph o loʻo i ai ni faʻasalalauga maualuga (microgram levels) o ni vaega tetele (~1-5 kb) faʻasalalau DNA fragments;2) o nei vaega DNA e tutoʻatasi ma e le tutoʻatasi 3) Faatasi ai ma punaoa mai fafo o nei vaega DNA, na matou maua ai siama, archaeal ma viral DNA, faʻapea foʻi ma DNA o isi manu multicellular;4) O le faaputuputuina o nei vaega mai fafo ccfDNA i totonu o le hemolymph e tupu vave ma fesoasoani i le faʻaogaina o totonu ole mussels.I le faaiuga, o la matou suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai o le manatu o le LB, lea na faʻaaogaina i le taimi nei i le tulaga o le biomedicine, e faʻapipiʻi ai se punaoa mauoa ae leʻi suʻesuʻeina e mafai ona faʻaaogaina e malamalama atili ai i fegalegaleaiga i le va o ituaiga o meaola ma lo latou siosiomaga.
I le faaopoopo atu i primates, ccfDNA vavaeeseina ua lipotia i mammals, e aofia ai isumu, maile, pusi, ma solofanua [50, 51, 52].Ae ui i lea, i lo matou iloa, o la matou suʻesuʻega o le mea muamua lea e lipotia ai le suʻesuʻeina ma le faʻasologa o le ccfDNA i meaola o le gataifale ma se faiga faʻasalalau matala.O lenei vaega fa'apitoa ma le mafai ona fa'amamaina o mussel e mafai, a itiiti mai i se vaega, ona fa'amatalaina le tele o uiga eseese o le ta'amilosaga o vaega DNA pe a fa'atusatusa i isi ituaiga.I totonu o tagata, o le tele o vaega DNA o loʻo faʻasalalau i totonu o le toto o ni vaega laiti e amata i le lapopoa mai le 150 i le 200 bp.faʻatasi ai ma le maualuga maualuga o le 167 bp [34, 53].O se vaega itiiti ae taua o fasi vaega DNA e i le va o le 300 ma le 500 bp le lapopoa, ma e tusa ma le 5% e umi atu nai lo le 900 bp.[54].O le mafuaʻaga o lenei tufatufa tele ona o le puna autu o le ccfDNA i le plasma e tupu ona o le oti o le sela, pe ona o le oti o le sela pe ona o le necrosis o sela hematopoietic taamilo i tagata soifua maloloina poʻo ona o le apoptosis o sela tuma i tagata mamaʻi kanesa (ua taʻua o DNA tumo taamilo)., ctDNA).O le tele o le tufatufaina o le hemolymph ccfDNA na matou maua i mussels e amata mai i le 1000 i le 5000 bp, e fa'ailoa mai ai e ese le amataga o le mussel ccfDNA.Ose manatu talafeagai lea, talu ai o mussel e i ai se faiga fa'apalapala semi-matala ma ola i si'osi'omaga vai o le gataifale o lo'o i ai le maualuga o le microbial genomic DNA.O le mea moni, o a matou suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai DNA mai fafo ua faʻaalia ai o mussels e faʻaputuina vaega DNA i le sami, a itiiti ifo pe a maeʻa ni nai itula e faʻaleagaina pe a maeʻa le faʻaogaina ma / pe faʻamalolo ma / pe teuina i totonu o faʻalapotopotoga eseese.Ona o le seasea o sela (prokaryotic ma eukaryotic), o le faʻaaogaina o vaega intravalvular o le a faʻaitiitia ai le aofaʻi o le ccfDNA mai punaʻoa faʻapitoa faʻapea foʻi ma punaoa mai fafo.Mafaufau i le taua o le puipuia o le bivalve ma le tele o phagocytes taamilo, matou te toe manatu e oo lava i le ccfDNA mai fafo e faʻatamaoaigaina i phagocytes faʻasalalau e faʻaputuina DNA mai fafo i luga o le taumafaina o microorganisms ma / poʻo otaota feaveaʻi.A tu'ufa'atasia, o a tatou fa'ai'uga o lo'o fa'aalia ai o le bivalve hemolymph ccfDNA o se fa'aputuga tulaga ese o fa'amatalaga mole mole ma fa'amalosia lo latou tulaga o se ituaiga o leoleo.
O a matou fa'amaumauga o lo'o fa'aalia ai o le fa'asologa ma le au'ili'iliga o vaega o le hemolymph ccfDNA e maua mai siama e mafai ona maua ai fa'amatalaga autu e uiga i la'au fa'ama'i ma siama o lo'o iai i le si'osi'omaga o le gataifale.O metotia fa'asologa o fana na fa'aalia ai fa'asologa o siama fa'amaonia A. atra gill semanu e misi pe ana fa'aaoga auala masani e iloagofie ai 16S rRNA, ona o se vaega ona o le fa'aituau o le faletusi.O le mea moni, o lo matou fa'aogaina o fa'amaumauga a le LB na aoina mai le M. platensis i le fa'asusu e tasi i Kerguelen na fa'aalia ai o le tu'ufa'atasiga o symbionts siama e feso'otai i le gill e tutusa mo ituaiga uma e lua (Fig. S4, Fa'amatalaga Faaopoopo).O lenei tutusa o mussel e lua e ese mai le kenera e mafai ona atagia mai ai le tuʻufaʻatasia o nuʻu faʻamaʻi i totonu o le malulu, sulfur, ma volcanic deposits o Kerguelen [55, 56, 57, 58].O le maualuga o le maualuga o le sulfur-reducing microorganisms ua lelei ona faamatalaina i le seleseleina o mussel mai i le gataifale bioturbated [59], e pei o le talafatai o Port-au-France.O le isi mea e ono mafai ona a'afia ai le fuga o le mussel i le felauaiga faalava [60, 61].E mana'omia nisi su'esu'ega e iloa ai le feso'ota'iga o le si'osi'omaga o le gataifale, i luga o le sami, ma le tu'ufa'atasiga o siama fa'atusa i mussels.O lo'o fa'aauau nei su'esu'ega.
O le umi ma le fa'aogaina o le hemolymph ccfDNA, o lona faigofie o le fa'amamāina, ma le maualuga e fa'ataga ai le vave fa'asologa o fana o nisi ia o le tele o mea lelei o le fa'aogaina o le mussel ccfDNA e iloilo ai meaola eseese i le gataifale.O lenei faiga e sili ona aoga mo le faʻamalamalamaina o nuʻu viral (virome) i totonu o se faʻalapotopotoga faʻanatura [62, 63].E le pei o siama, archaea, ma eukaryotes, o genomes viral e le o iai ni kenera fa'asao fa'apolopolo e pei ole 16S fa'asologa.O a matou fa'ai'uga o lo'o fa'ailoa mai ai e mafai ona fa'aoga su'esu'ega vai mai fa'ailoga e pei o mussel e fa'ailoa ai le tele o vaega o siama o le ccfDNA e iloa e a'afia ai 'au e masani ona nofoia fa'anatura o le gataifale.E aofia ai fa'ama'i e iloa e a'afia ai protozoa, arthropods, iniseti, la'au, ma fa'ama'i siama (fa'ata'ita'iga, bacteriophages).Na maua se tufatufaga tutusa ina ua matou suʻesuʻeina le hemolymph ccfDNA virome o mussel lanumoana (M. platensis) o loʻo aoina i totonu o le mussel layer tutusa i Kerguelen (Table S2, Faʻamatalaga Faʻaopoopo).O le faʻasologa o fana o le ccfDNA o se auala fou e maua ai le malosi i le suʻesuʻeina o le virome o tagata poʻo isi ituaiga [21, 37, 64].O lenei faiga e sili ona aoga mo le suʻesuʻeina o faʻamaʻi DNA faʻalua, talu ai e leai se kenera e tasi e faʻasaoina i totonu o faʻamaʻi DNA uma e lua, e fai ma sui o le vasega sili ona eseese ma lautele o siama i Baltimore [65].E ui lava o le tele o nei siama e tumau pea le le fa'avasegaina ma e ono aofia ai siama mai se vaega e matua le iloa o le lalolagi viral [66], na matou iloa ai o viromes ma vaega talimalo o mussels A. atra ma M. platensis e pa'ū i le va o ituaiga e lua.fa'apena (silasila i le ata S3, fa'amatalaga fa'aopoopo).O lenei tutusa e le o se mea e ofo ai, aua e ono atagia mai ai le le lava o le filifilia o le DNA o loʻo iai i le siosiomaga.O suʻesuʻega i le lumanaʻi e faʻaaoga ai le RNA mama o loʻo manaʻomia nei e faʻamaonia ai le RNA virome.
I la matou suʻesuʻega, sa matou faʻaaogaina se paipa sili ona faigata na faʻafetaui mai le galuega a Kowarski ma paʻaga [37], oe na faʻaaogaina se lua-laasaga faʻamalo o faitauga faʻatasi ma contigs i luma ma ina ua maeʻa le faʻapotopotoga o le ccfDNA masani, ma mafua ai le maualuga o le faitau aofaʻi o le faitau.O le mea lea, e le mafai ona matou fa'ailoaina o nisi o nei faitauga e le'i fa'afanua e ono iai lava o latou tupuaga, aemaise lava ona e leai so matou genome fa'asino mo lenei ituaiga mussel.Na matou faʻaogaina foi lenei paipa ona sa matou popole e uiga i chimeras i le va o le tagata lava ia ma le le o le faitau faitau ma le umi faitau na gaosia e le Illumina MiSeq PE75.O le isi mafua'aga o le tele o faitauga e le'i fa'asalalauina ona o le tele o microbes o le gataifale, aemaise lava i nofoaga mamao e pei o Kerguelen, e le'i fa'amatalaina.Na matou faʻaaogaina le Illumina MiSeq PE75, faʻapea o le ccfDNA vaega umi e tutusa ma le ccfDNA tagata.Mo su'esu'ega i le lumana'i, ona o a matou fa'ai'uga o lo'o fa'aalia ai o le hemolymph ccfDNA e umi atu le faitau nai lo tagata ma/po'o mamame, matou te fautuaina le fa'aogaina o se fa'asologa fa'asologa e sili atu ona talafeagai mo vaega uumi ccfDNA.O lenei faiga o le a sili atu ona faigofie le iloa atili o faʻamatalaga mo suʻesuʻega loloto.O le mauaina o le A. atra nuclear genome sequence e le'i maua i le taimi nei o le a faafaigofieina ai foi le faailoga tagata o le ccfDNA mai le tagata lava ia ma mea e le o le tagata lava ia.Talu ai o la matou suʻesuʻega ua taulaʻi i le avanoa e faʻaogaina ai le manatu o le biopsy vai i mussels, matou te faʻamoemoe a o faʻaaogaina lenei manatu i suʻesuʻega i le lumanaʻi, o le a fausia ni meafaigaluega fou ma paipa e faʻateleina ai le gafatia o lenei metotia e suʻesuʻe ai le microbial diversity o mussels.fa'anatura o le gataifale.
I le avea ai o se biomarker falemaʻi e le faʻaleagaina, o le maualuga o le plasma tagata o le ccfDNA e fesoʻotaʻi ma faʻamaʻi eseese, faʻaleagaina o le tino, ma tulaga faʻalavelave [67,68,69].O lenei faʻaopoopoga e fesoʻotaʻi ma le tuʻuina atu o vaega DNA o lona lava tupuaga pe a maeʻa faʻaleagaina aano.Na matou fa'atalanoaina lenei mataupu i le fa'aogaina o le vevela vevela, lea na fa'apuupuu ai mussel i le vevela o le 30 °C.Na matou faia lenei su'esu'ega i ituaiga o mussel eseese se tolu i ni su'ega tutoatasi se tolu.Ae ui i lea, matou te leʻi mauaina se suiga i le ccfDNA maualuga ina ua maeʻa le vevela vevela (silasila i le Ata S5, faʻamatalaga faaopoopo).O lenei su'esu'ega e mafai ona fa'amatalaina, a itiiti mai i se vaega, le mea moni o mussels o lo'o i ai se faiga fa'atosina semi-matala ma fa'aputuina le tele o DNA mai fafo ona o le maualuga o le fa'amamaina.I le isi itu, o mussels, pei o le tele o invertebrates, atonu e sili atu ona tetee atu i le faʻaleagaina o le tino, ma faʻatapulaʻaina ai le tuʻuina atu o le ccfDNA i la latou hemolymph [70, 71].
E o'o mai i le taimi nei, o su'esu'ega a le DNA o meaola eseese i totonu o fa'alapotopotoga fa'anatura o le vai o lo'o fa'atatau tonu ile DNA ole siosiomaga (eDNA) metabarcoding.Peita'i, e masani lava ona fa'atapula'aina lenei metotia ile su'esu'ega o meaola eseese pe a fa'aogaina fa'amuamua.O le fa'aogaina o le fa'asologa o fana e fa'afefe ai tapula'a o le PCR ma le fa'aituau o le filifilia o seti muamua.O le mea lea, i se isi itu, o la tatou metotia e latalata i le faʻaogaina lata mai o le eDNA Shotgun sequencing method, lea e mafai ona faʻasolosolo saʻo le DNA vaevaega ma suʻesuʻeina toetoe o meaola uma [72, 73].Ae ui i lea, o loʻo i ai le tele o mataupu faʻavae e iloagofie ai le LB mai metotia masani eDNA.O le mea moni, o le eseesega tele i le va o le eDNA ma le LB o le faʻaogaina lea o 'au faamama faʻanatura.O le faʻaaogaina o meaola o le gataifale e pei o sponges ma bivalves (Dresseina spp.) e avea o se faamama masani mo le suʻesuʻeina o le eDNA ua lipotia [74, 75].Ae ui i lea, o suʻesuʻega a Dreissena na faʻaogaina ai biopsies o mea na maua mai ai le DNA.Ole su'esu'ega ole ccfDNA mai le LB e le mana'omia ai le biopsy o le tino, mea fa'apitoa ma o nisi taimi taugata ma mea fa'aoga e feso'ota'i ma le eDNA po'o le biopsy.O le mea moni, na matou lipotia talu ai nei o le ccfDNA mai le LB e mafai ona teuina ma auʻiliʻili i le lagolago a le FTA e aunoa ma le tausia o se filifili malulu, o se luʻitau tele mo suʻesuʻega i nofoaga mamao [76].Ole su'ega ole ccfDNA mai su'esu'ega vai e faigofie ma maua ai le DNA maualuga mo le fa'asologa o fana ma su'esu'ega PCR.O se avanoa sili lea ona o nisi o tapulaʻa faʻapitoa e fesoʻotaʻi ma suʻesuʻega eDNA [77].O le faigofie ma le maualalo o le tau o le auala faʻataʻitaʻiga e faʻapitoa foi mo polokalame mataʻituina umi.I le faaopoopo atu i lo latou gafatia maualuga o le faamamaina, o le isi mea lauiloa o bivalves o le vailaʻau mucopolysaccharide o loʻo tuʻufaʻatasia o latou mucus, lea e faʻamalosia ai le faʻaogaina o siama [78, 79].O le mea lea ua avea ai pivalves ma faamama fa'anatura lelei mo le fa'avasegaina o meaola eseese ma le a'afiaga o suiga o le tau i se fa'anatura fa'anatura o le vai.E ui lava o le i ai o vaevaega DNA e maua mai e le talimalo e mafai ona vaʻaia o se tapulaʻa o le metotia pe a faʻatusatusa i le eDNA, o le tau e fesoʻotaʻi ma le i ai o sea ccfDNA faʻatusatusa i le eDNA e malamalama i le taimi lava e tasi mo le tele o faʻamatalaga avanoa mo suʻesuʻega faʻalesoifua maloloina.fa'atautaiga talimalo.E aofia ai le i ai o faʻasologa viral faʻapipiʻi i totonu o le genome o le talimalo talimalo.E taua tele lenei mea mo mussels, ona o le i ai o faʻamaʻi pipisi o le leukemic retrovirus i totonu ole bivalves [80, 81].O le isi tulaga lelei o le LB i luga o le eDNA o le faʻaaogaina lea o le gaioiga o le phagocytic o le faʻasalalauina o sela toto i totonu o le hemolymph, lea e lofia ai microorganisms (ma o latou genomes).O le Phagocytosis o le galuega autu lea o sela toto i bivalves [82].Mulimuli ane, o le auala e faʻaogaina ai le maualuga o le faʻamamaina o mussels (pe tusa 1.5 l / h o le suasami) ma le lua aso taʻavale, lea e faʻateleina ai le faʻafefiloi o vaega eseese o le sami, faʻatagaina le puʻeina o le eDNA heterologous.[83, 84].O lea la, o le su'esu'ega o le mussel ccfDNA ose auala mata'ina ona o a'afiaga tau mea'ai, tamaoaiga, ma le si'osi'omaga o mussel.E tutusa ma le auiliiliga o le LB na aoina mai tagata, o lenei metotia e tatalaina ai foi le avanoa e fuaina ai suiga o le kenera ma le epigenetic i le DNA talimalo e tali atu ai i mea mai fafo.Mo se faʻataʻitaʻiga, e mafai ona faʻatulagaina tekinolosi faʻasologa lona tolu e faʻatino ai suʻesuʻega methylation genome-lautele i le ccfDNA faʻapitoa e faʻaaoga ai le nanopore sequencing.O lenei faagasologa e tatau ona faafaigofieina e le mea moni e faapea o le umi o le mussel ccfDNA fragments e fetaui lelei ma le umi-faitau sequencing platforms e mafai ai le genome-lautele DNA methylation auiliiliga mai se tasi sequencing tamoe e aunoa ma le manaomia mo transformations kemikolo.85,86] O se mea manaia lenei, e pei ona faaalia ai o DNA methylation mamanu ma atagia ai se tali atu i le maʻi faʻafitauli o le siosiomaga.O le mea lea, e mafai ona maua ai se faʻamatalaga taua i faiga faʻavae e pulea ai le tali pe a uma ona faʻaalia i suiga o le tau poʻo mea filogia [87].Ae ui i lea, o le faʻaaogaina o le LB e leʻo aunoa ma ni tapulaʻa.E le tau ta'ua, e mana'omia ai le iai o fa'ailoga ituaiga i totonu o le si'osi'omaga.E pei ona taʻua i luga, o le faʻaaogaina o le LB e suʻesuʻe ai meaola eseese o se meaola faanatura e manaʻomia ai foi se paipa bioinformatics malosi e amanaia ai le iai o vaega DNA mai le puna.O le isi fa'afitauli tele o le maua lea o genome fa'asino mo meaola o le gataifale.O lo'o fa'amoemoe o fa'atinoga e pei o le Marine Mammal Genomes Project ma le poloketi Fish10k talu ai nei na fa'atuina [88] o le a faafaigofieina ai ia su'esu'ega i le lumana'i.O le faʻaogaina o le manatu o le LB i meaola faʻamama o le gataifale e fetaui foi ma le alualu i luma lata mai i tekinolosi faʻasologa, e fetaui lelei mo le atinaʻeina o multi-ohm biomarkers e tuʻuina atu ai faʻamatalaga taua e uiga i le soifua maloloina o nofoaga o le gataifale e tali atu ai i faʻafitauli tau le siosiomaga.
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