Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Waxaad isticmaalaysa nooc browser ah oo leh taageero CSS xaddidan.Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho browser-ka la cusboonaysiiyay (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Intaa waxaa dheer, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan ku tusineynaa goobta aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Waxa uu soo bandhigayaa carousel ka kooban saddex slide hal mar.Isticmaal badhamada hore iyo kan ku xiga si aad ugu gudubto saddex sawir markiiba, ama isticmaal badhamada slider-ka ee dhamaadka si aad ugu gudubto saddex sawir markiiba.
Caqabadda maskaxda-maskaxda iyo xannibaadda maskaxda-maskaxda waxay ka hortagtaa wakiilada biotherapeutic si ay u gaaraan bartilmaameedkooda habka dhexe ee neerfayaasha, taas oo caqabad ku ah daaweynta waxtarka leh ee cudurrada neerfaha.Si aan u ogaano gaadiidleyda maskaxda ee cusub gudaha vivo, waxaan soo saarnay maktabada T7 phage peptide iyo si isdaba joog ah dhiiga iyo dareeraha cerebrospinal (CSF) la soo aruuriyay anagoo adeegsanayna qaab barkad weyn oo miyir leh oo la cannulated.Xirmooyinka phage-ga gaarka ah ayaa si aad ah loogu hodmay CSF ka dib afar wareeg oo doorasho ah.Tijaabada musharraxiinta shakhsi ahaaneed ee peptides waxay muujisay in ka badan 1000-laab kobcinta CSF.Dhaqdhaqaaqa noole ee gaarsiinta dhexdhexaadinta peptide-ka ee maskaxda waxaa lagu xaqiijiyay hoos u dhac 40% ah heerka amyloid-β ee dareeraha cerebrospinal iyadoo la adeegsanayo BACE1 peptide inhibitor oo ku xiran peptide transit-ka cusub ee la aqoonsaday.Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in peptides-ka lagu aqoonsaday hababka xulashada vivo phage ay noqon karaan gaadiid waxtar u leh gaarsiinta nidaamka macromolecules maskaxda oo leh saameyn daweyn.
Nidaamka dhexe ee neerfayaasha (CNS) ee cilmi-baarista daawaynta ee bartilmaameedka ah ayaa si weyn diiradda u saaray aqoonsiga daawooyinka la hagaajiyay iyo wakiilada soo bandhigay sifooyinka CNS-bartilmaameedka, iyada oo dadaal yar lagu ogaanayo hababka keena bixinta daroogada firfircoon ee maskaxda.Tani waxay hadda bilaabeysaa inay isbedesho maadaama gaarsiinta daroogada, gaar ahaan molecules waaweyn, ay tahay qayb muhiim ah oo ka mid ah horumarinta dawada casriga ah ee cilmiga neerfaha.Deegaanka habka dhexe ee neerfayaasha waxaa si fiican u ilaaliya nidaamka xannibaadda maskaxda, oo ka kooban xannibaadda dhiigga-maskaxda (BBB) ​​iyo xannibaadda dhiigga-maskaxda (BCBB) 1, taas oo ka dhigaysa mid adag in la gaarsiiyo daroogada maskaxda1,2.Waxaa lagu qiyaasaa in ku dhawaad ​​dhammaan dawooyinka molecule-ka waaweyn iyo in ka badan 98% daawooyinka molecule-yada yaryar laga tirtiro maskaxda3.Taasi waa sababta ay aad muhiim ugu tahay in la aqoonsado hababka gaadiidka maskaxda ee cusub ee bixiya si hufan oo gaar ah daawooyinka daweynta ee CNS 4,5.Si kastaba ha ahaatee, BBB iyo BCSFB waxay sidoo kale soo bandhigaan fursad aad u fiican oo loogu talagalay bixinta daroogada marka ay galaan oo galaan dhammaan dhismayaasha maskaxda iyada oo loo marayo vasculature ballaaran.Sidaa darteed, dadaallada hadda jira ee lagu isticmaalo hababka aan fiicneyn ee gaarsiinta maskaxda waxay inta badan ku saleysan yihiin habka gaadiidka dhexdhexaadiyaha ah (PMT) iyadoo la adeegsanayo soo-dhoweynta BBB6 ee endogenous.In kasta oo horumarradii ugu dambeeyay ee muhiimka ahaa ee la adeegsanayo marinka receptor transferrin7,8, horumarinta dheeraadka ah ee hababka gaarsiinta cusub ee leh guryaha la hagaajiyay ayaa loo baahan yahay.Si taas loo gaaro, hadafkeenu wuxuu ahaa inaan aqoonsanno peptides awood u leh inay dhexdhexaadiyaan gaadiidka CSF, maadaama mabda' ahaan loo isticmaali karo in lagu gaarsiiyo macromolecules CNS ama in la furo dariiqyo cusub oo soo-qabasho ah.Gaar ahaan, soo-dhoweeyayaasha gaarka ah iyo gaadiidleyda habka maskaxda (BBB iyo BSCFB) waxay u adeegi karaan bartilmaameedyo suurtagal ah oo loogu talagalay bixinta firfircoon iyo kuwa gaarka ah ee daawooyinka biotherapeutic.Dareeraha cerebrospinal (CSF) waa wax soo saar sir ah oo ka mid ah xuubka choroid (CS) wuxuuna si toos ah ula xiriiraa dareeraha interstitial ee maskaxda iyada oo loo marayo booska subarachnoid iyo booska ventricular space4.Dhawaan waxaa la muujiyay in dareeraha maskaxda ee subarachnoid uu si xad dhaaf ah ugu firdhiyo interstitium ee maskaxda9.Waxaan rajeyneynaa inaan galno booska parenchymal anagoo adeegsanayna marinka qulqulka subachnoid ama si toos ah BBB.Si taas loo gaaro, waxaan hirgelinay istiraatiijiyad xulashada vivo phage adag oo si fiican u tilmaamaysa peptides-ka ay qaadeen mid ka mid ah labadan waddo ee kala duwan.
Waxaan hadda ku sifeyneynaa habka soo bandhigida taxanaha ee vivo phage oo leh muunad CSF oo ay weheliso taxanaha wax soo saarka sare (HTS) si loola socdo wareegyada xulashada bilowga ah oo leh kala duwanaanta maktabadda ugu sareysa.Baaritaanka waxaa lagu sameeyay jiirar miyir qaba oo si joogto ah loogu dhejiyay cisterna weyn (CM) cannula si looga fogaado wasakhowga dhiigga.Muhiimad ahaan, habkani wuxuu dooranayaa bartilmaameedka maskaxda iyo peptides labadaba dhaqdhaqaaqa gaadiidka ee xannibaadda maskaxda.Waxaan u isticmaalnay T7 phages sababtoo ah cabbirkooda yar (~ 60 nm) 10 waxaanan soo jeedinay inay ku habboon yihiin qaadista xuubka xididdada u oggolaanaya ka gudubka transcellular ee xannibaadda endothelial iyo / ama epithelial-medulla.Ka dib afar wareeg oo foorarsi ah, dadka phage-ga waa la go'doomiyay oo muujinaya inay ku xooggan yihiin kobcinta CSF iyo ururka microvessel maskaxda.Muhiimad ahaan, waxaan awoodnay inaan xaqiijino natiijooyinkayaga anagoo muujinayna in doorbidista iyo kiimikooyinka la soo saaray ee musharaxa ugu fiican ee peptides ay awoodaan inay xamuulka borotiinka ku qaadaan dareeraha maskaxda.Marka hore, saamaynta farmashiyaha ee CNS waxaa la aasaasay iyada oo la isku daray peptide-ka gaadiidka horseedka ah iyo horjoogaha BACE1 peptide.Marka laga soo tago muujinta in in Vivo xeeladaha baadhista shaqaynaysa ay aqoonsan karaan peptides-ka gaadiidka maskaxda ee cusub inay yihiin xamuul qaada borotiinka wax ku oolka ah, waxaanu filaynaa in habab doorasho oo la mid ah ay sidoo kale muhiim u noqdaan aqoonsiga dariiqooyinka gaadiidka maskaxda ee cusub.
Iyada oo ku saleysan cutubyada samaynta huurada (PFU), ka dib tillaabada xirmada phage, maktabad ka kooban 12-mer linear T7 phage peptides oo kala duwan ayaa la naqshadeeyay oo la abuuray (eeg Qalabka iyo Hababka).Waxaa muhiim ah in la ogaado in aan si taxadar leh u falanqeynay maktabaddan ka hor intaanan vivo feengin.Kordhinta PCR ee muunadaha maktabadda phage iyada oo la isticmaalayo qalab-saldhigyo la beddelay ayaa soo saaray amplikoon si toos ah loogu dabaqi karo HTS (Jaantuska Dheeraadka ah 1a).Sababo la xiriira a) khaladaadka isku xigxiga ee HTS11, b) saamaynta tayada asaasiga ah (NNK)1-12, iyo c) joogitaanka nooca duurjoogta ah (wt) phage (lafaha qalfoofka) ee maktabadda heegan, nidaamka shaandhaynta taxanaha ah ayaa la fuliyay si loo soo saaro oo kaliya macluumaadka isku xigxiga la xaqiijiyay (Jaantuska Dheeraadka ah. 1b).Tallaabooyinkan shaandhaynta waxay khuseeyaan dhammaan maktabadaha isku xigxiga ee HTS.Maktabaddii caadiga ahayd, wadar dhan 233,868 akhrin ayaa la helay, kuwaas oo 39% ay dhaafeen shuruudaha shaandhaynta oo loo isticmaalay falanqaynta maktabadda iyo xulashada wareegyada xiga (Jaantuska Dheeraadka ah 1c-e).Akhrisyadu waxay u badnaayeen dhufashada 3 lammaane oo dherer ah oo dhererkoodu yahay 36 nucleotides (Jaantuska Dheeraadka ah. 1c), oo xaqiijinaya naqshadaynta maktabadda (NNK) 1-12.Waxaa xusid mudan, ku dhawaad ​​11% xubnaha maktabadda waxa ku jiray 12-cabbir-nooca duurjoogta ah (wt) laf dhabarta PAGISRELVDKL, iyo ku dhawaad ​​kala badh taxanaha (49%) ayaa ka koobnaa gelinta ama tirtiridda.HTS ee maktabadda maktabadda ayaa xaqiijisay kala duwanaanshaha sare ee peptides ee maktabadda: in ka badan 81% ee taxanaha peptide ayaa la helay hal mar kaliya 1.5% oo kaliya ayaa ka dhacay ≥4 koobiyada (Jaantuska Dheeraadka ah 2a).Inta jeer ee acids amino (aa) ee dhamaan 12ka boos ee repertoire waxay si wanagsan ula xidhiidheen inta jeer ee laga filayo tirada codons-ka ee ay soo saartay NKK repertoire xumaaday (Jaantuska Dheeriga ah 2b).Inta jeer ee la arkay ee hadhaaga aa ee lagu dhejiyay dhejisyadan ayaa si fiican ula xidhiidha inta jeer ee la xisaabiyay (r = 0.893) (Jaantuska Dheeraadka ah 2c).Diyaarinta maktabadaha phage ee duritaanka waxaa ka mid ah tillaabooyinka xoojinta iyo ka saarista endotoxin.Tan hore ayaa loo muujiyay inay suurtogal tahay inay hoos u dhigto kala duwanaanshaha maktabadaha phage12,13.Sidaa darteed, waxaanu taxnay laybareeri phage ah oo saxan ah oo lagu sameeyay saarista endotoxin waxaana barbar dhignay maktabadii asalka ahayd si loo qiyaaso inta jeer ee AA.Xidhiidh adag (r = 0.995) ayaa lagu arkay inta u dhaxaysa barkada asalka ah iyo barkadda la xoojiyay oo la nadiifiyay (Jaantuska Dheeraadka ah 2d), taas oo muujinaysa in tartanka u dhexeeya clones lagu kordhiyay taarikada iyadoo la isticmaalayo T7 phage ma keenin eex weyn.Isbarbardhiggani wuxuu ku salaysan yahay inta jeer ee mawduucyada tripeptide ee maktabad kasta, maadaama kala duwanaanshaha maktabadaha (~ 109) aan si buuxda loo qabsan karin xitaa HTS.Falanqaynta soo noqnoqda ee aa ee boos kasta ayaa muujisay eex ku-tiirsanaan yar oo ku-tiirsanaan ah saddexda boos ee ugu dambeeya ee riwaayadda la galiyay (Jaantuska Dheeraadka ah 2e).Gabagabadii, waxaan ku soo gabagabeynay in tayada iyo kala duwanaanta maktabadda la aqbali karo oo kaliya isbedel yar oo kala duwanaansho ah ayaa la arkay iyadoo ay ugu wacan tahay kordhinta iyo diyaarinta maktabadaha phage inta u dhaxaysa dhowr wareeg oo xulasho ah.
Muunad dheecaanka maskaxda ee taxanaha ah waxaa lagu samayn karaa iyada oo qalliin lagu geliyo cannula CM ee jiirka miyirka leh si loo fududeeyo aqoonsiga T7 phage ee xididka laga duro (iv) iyada oo loo sii marayo BBB iyo/ama BCSFB (Jaantus. 1a-b).Waxaan isticmaalnay laba hub oo kala madax bannaan (gacmaha A iyo B) saddexdii wareeg ee hore ee xulashada vivo (Jaantus. 1c).Waxaan si tartiib tartiib ah u kordhinay xajinta xulashada anagoo yareynayna tirada guud ee phage-ga ee lagu soo bandhigay saddexda wareeg ee hore ee xulashada.Wareeggii afraad ee digsiga, waxaanu isku darnay muunado laga soo qaaday laamaha A iyo B waxaana aanu samaynay saddex doorasho oo madaxbannaan oo dheeraad ah.Si loo daraaseeyo sifooyinka in vivo ee qaybaha T7 phage ee qaabkan, phage-ga nooca duurjoogta ah (PAGISRELVDKL master insert) ayaa lagu duray jiirka iyada oo loo sii marayo xididka dabada.Ka soo kabashada fagesyada dheecaanka maskaxda iyo dhiigga waqtiyo kala duwan ayaa muujiyay in wax yar oo yar oo T7 icosahedral phages ah ay leeyihiin waji nadiifin degdeg ah oo ka yimid qaybta dhiigga (Jaantuska Dheeraadka ah 3).Iyada oo ku saleysan titer-yada la maamulay iyo mugga dhiigga ee jiirarka, waxaan xisaabinay in kaliya ku dhawaad ​​1% wt.phage ka soo qaadashada qiyaasta la maamulay ayaa lagu ogaaday dhiiga 10 daqiiqo ka dib cirbadeynta xididada.Kadib hoos u dhacan bilawga ah ee degdega ah, nadiifinta aasaasiga ah oo gaabis ah ayaa lagu qiyaasay nolol badhkeed oo ah 27.7 daqiiqo.Muhiimad ahaan, in yar oo fages ah ayaa laga soo saaray qaybta CSF, taas oo muujinaysa asalka hoose ee u haajiridda nooca duurjoogta ah ee qaybta CSF (Jaantuska Dheeraadka ah 3).Celcelis ahaan, kaliya qiyaastii 1 x 10-3% titer of T7 phage ee dhiiga iyo 4 x 10-8% ee fagesyada bilowga ah ee la galiyay ayaa laga helay dareeraha maskaxda ee inta lagu jiro muunada (0-250 min).Gaar ahaan, nolosha nuska ah (25.7 min) ee nooca duurjoogta ah ee dareeraha cerebrospinal waxay la mid tahay tan lagu arkay dhiigga.Xogtaasi waxay muujineysaa in xannibaadda kala soocida qaybta CSF ee dhiigga ay ku xiran tahay jiirka CM-cannulated, taas oo u oggolaanaysa in vivo xulashada maktabadaha phage si loo aqoonsado clones kuwaas oo si sahal ah looga soo qaado dhiigga qaybta CSF.
(a) Dejinta habka dib-u-samaynta dareeraha maskaxda (CSF) ee barkadda weyn.(b) Jaantuska muujinaya meesha gacanta ee habka dhexe ee neerfayaasha (CNS) xannibaadaha iyo istaraatiijiyada xulashada ee loo isticmaalo in lagu aqoonsado peptides ka gudba xannibaadda dhiigga-maskaxda (BBB) ​​iyo xannibaadda dhiigga-maskaxda.(c) In vivo phage bandhigay shaxda socodka socodka.Wareeg kasta oo doorashada ah, phages (aqooniyeyaasha xayawaanka ee gudaha falaadhaha) ayaa la muday xididka.Laba laamood oo kale oo madax banaan (A, B) ayaa gooni loo hayaa ilaa wareega 4aad ee doorashada.Xulashada wareegyada 3 iyo 4, nooc kasta oo phage clone ah oo laga soo saaray CSF ayaa gacanta lagu habeeyay.(d) Kinetics of phage oo ka go'an dhiiga (goobaha cas) iyo dareeraha cerebrospinal (saddex xagal cagaaran) inta lagu guda jiro wareega koowaad ee doorashada ee laba jiir oo qasacadaysan kadib duritaanka xididka ee maktabadda peptide T7 (2 x 1012 phages / xayawaan).Laba geesoodka buluuga ah ayaa tilmaamaya celceliska fiirsashada hore ee phage ee dhiiga, laga soo xisaabiyay cadadka phage-ga la duray, iyada oo la tixgelinayo wadarta mugga dhiigga.Labada geesood ee madow waxay tilmaamayaan barta isgoysyada xariiqa y ee laga soo saaray uruurinta dhiiga dhiiga.(e,f) Soo bandhig inta jeer ee qaraabada ah iyo qaybinta dhammaan suurtogalnimada isku-dhafan ee tripeptide ee laga helay peptide-ka.Tirada motifs ee laga helay 1000 akhris ayaa la muujiyay.Muhiimad gaar ah (p <0.001) motifyada la hodmay waxaa lagu calaamadeeyay dhibco guduudan.(e) Kala firdhinta isku xidhka isbarbardhigga inta jeer ee qaraabada mawduuca tripeptide ee maktabadda la duray oo leh phage ka soo jeeda dhiiga xoolaha #1.1 iyo #1.2.(f) Kala firdhinta isku-xidhka isbarbardhigga isbarbardhigga celceliska qaraabada ee noocyada phage tripeptide motifs #1.1 iyo #1.2 ee ku go'doonsan dhiiga iyo dareeraha maskaxda.(g, h) Aqoonsiga isku xigxiga ee phage ee dhiiga ku hodmay (g) ka soo horjeedka laybareeriyada la duray iyo phage lagu hodmay CSF (h) iyo dhiiga kadib wareeggii in vivo ee labada xayawaan.Baaxadda koodka hal xarafku waxa uu tilmaamayaa inta jeer ee ay amino acid ku dhacdo booskaas.Cagaar = polar, guduud = dhexdhexaad ah, buluug = aasaasiga ah, cas = acidic iyo madow = hydrophobic amino acids.Jaantuska 1a, b waxa naqshadeeyay oo soo saaray Eduard Urich.
Waxaan ku duray maktabada phage peptide laba jiir oo qalab CM ah (clades A iyo B) iyo fage ka go'doon dheecaanka maskaxda iyo dhiiga (Jaantuska 1d).Nadiifinta degdega ah ee bilawga ah ee maktabadda ayaa ahayd mid aad u yar marka loo eego phage-ga nooca duurjoogta ah.Celceliska nolosha nuska ah ee maktabadda la duray ee labada xayawaan waxay ahayd 24.8 daqiiqo oo dhiig ah, oo la mid ah phage-ga duurjoogta ah, iyo 38.5 daqiiqo gudaha CSF.Dhiiga iyo dareeraha dareeraha maskaxda ee laga soo qaado xayawaan kasta ayaa lagu sammeeyay HTS iyo dhammaan peptides-ka la aqoonsaday ayaa lagu falanqeeyay joogitaanka motif tripeptide gaaban.Tripeptide motifs ayaa la doortay sababtoo ah waxay bixiyaan aasaaska ugu yar ee qaab dhismeedka iyo isdhexgalka peptide-protein14,15.Waxaan helnay xiriir wanaagsan oo ku saabsan qaybinta motifs ee u dhexeeya maktabadda phage-ga ee la isku duray iyo kloonnada laga soo saaray dhiigga labada xayawaan (Jaantus. 1e).Xogtu waxay tilmaamaysaa in ka kooban yahay maktabaddu ay si yar u hodmeen qaybta dhiigga.Inta jeer ee Amino acid iyo isku xigxiga la isku raacsan yahay ayaa si dheeraad ah loo falanqeeyay boos kasta iyadoo la adeegsanayo laqabsiga barnaamijka Weblogo16.Waxa xiisaha lihi leh, waxa aanu ka helnay hodmin xoog leh hadhaaga glycine ee dhiiga (Jaantus. 1g).Marka dhiiga la barbar dhigo kloonyada laga soo xushay CSF, doorasho xoogan iyo qaar ka mid ah xushaynta motifs ayaa la arkay (Jaantus. 1f), iyo asiidhyada amino-yada qaarkood ayaa si gaar ah u jooga boosaska la sii go'aamiyay ee 12-xubnaha (Jaantus. 1h).Waxaa xusid mudan, xayawaannada gaarka ah waxay si weyn ugu kala duwan yihiin dareeraha maskaxda, halka kobcinta glycine dhiigga lagu arkay labadaba xayawaanka (Jaantuska Dheeraadka ah. 4a-j).Kadib shaandhaynta adag ee xogta isku xigta ee dareeraha maskaxda ee xayawaanka #1.1 iyo #1.2, wadar ahaan 964 iyo 420 peptides 12-mer gaar ah ayaa la helay (Jaantuska Dheeraadka ah 1d-e).Xirmooyinka go'doonsan ee phage clones waa la xoojiyay waxaana la marsiiyay wareegii labaad ee xulashada vivo.Marxaladda laga soo saaray wareegga labaad ee xulashada ayaa lagu sammeeyay HTS xayawaan kasta iyo dhammaan peptides la aqoonsaday ayaa loo isticmaalay sidii loo geli lahaa barnaamijka aqoonsiga motif si loo falanqeeyo dhacdada motifs tripeptide (Jaantus. 2a, b, ef).Marka la barbar dhigo wareeggii ugu horreeyay ee phage-ga laga soo kabsaday CSF, waxaan aragnay xulasho dheeraad ah iyo xulashada motifs badan ee CSF ee laamaha A iyo B (Jaantus. 2).Algorithm aqoonsi shabakad ayaa la dabaqay si loo go'aamiyo haddii ay matalaan qaabab kala duwan oo isku xigxig ah.Isku ekaanshaha cad ayaa lagu arkay inta u dhaxaysa taxanaha 12-cabbirka ee ay soo celisay CSF ee kala duwan A (Jaantus. 2c, d) iyo clade B (Jaantus. 2g, h).Falanqaynta la isku daray ee laan kasta ayaa muujisay noocyo kala duwan oo xulasho ah oo loogu talagalay 12-mer peptides (Jaantuska Dheeraadka ah 5c, d) iyo korodhka saamiga CSF/dhiigga ee waqti ka dib markii wareegga labaad ee xulashada marka la barbar dhigo wareegga koowaad ee xulashada (Jaantuska Dheeraadka ah. 5e).).
Kobcinta motifs iyo peptides ee dareeraha cerebrospinal laba wareeg oo isku xigta oo ah xulashada bandhiga fage ee vivo.
Dhammaan fagagyada dareeraha maskaxda ee laga soo kabsaday wareegii koowaad ee xayawaan kasta (xayawaan #1.1 iyo #1.2) ayaa la isku daray, la xoojiyay, HT-isku xigxigay oo dib loo duray (2 x 1010 phages / xayawaan) 2 SM jiirka cannulated (#1.1 → #).2.1 iyo 2.2, 1.2 → 2.3 iyo 2.4).(a,b,e,f) Qaybaha kala firdhisan ee isku xidhka isbarbardhigga inta jeer ee isbarbardhigga qaababka tripeptide ee dhammaan phages-ka CSF-ta ee wareegyada doorashada koowaad iyo labaad.Inta jeer ee qaraabada ah iyo qaybinta motifs ka dhigan dhammaan suurtogalka ah ee tripeptides ee isku dhafan ee laga helay peptides ee labada jiho.Tirada motifs ee laga helay 1000 akhris ayaa la muujiyay.Motifs si weyn loo doortay ama laga saaray mid ka mid ah maktabadaha la barbar dhigay ayaa lagu muujiyay dhibco cas.(c, d, g, h) Taxanaha astaanta astaanta dhammaan 12 amino acid ee taxanaha dhaadheer ee CSF hodon ku ah kuna salaysan wareegyada 2 iyo 1 ee xulashada vivo.Baaxadda koodka hal xarafku waxa uu tilmaamayaa inta jeer ee ay amino acid ku dhacdo booskaas.Si loo matalo astaanta, inta jeer ee taxanaha CSF ee laga soo saaro xayawaanka gaarka ah ee u dhexeeya labada wareeg ee xulashada ayaa la is barbar dhigayaa waxaana la muujiyay taxanaha kobcinta wareegga labaad: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.2 (g) #1.2–#2.3 iyo (h) #1.2–#2.4.Asiidhyada amino-ka ugu qanisan ee boos la siiyay (c, d) xayawaanka no.2.1 iyo maya.2.2 ama (g, h) ee xoolaha No.2.3 iyo maya.2.4 ayaa lagu muujiyay midab.Cagaar = polar, guduud = dhexdhexaad ah, buluug = aasaasiga ah, cas = acidic iyo madow = hydrophobic amino acids.
Kadib wareegii saddexaad ee doorashada, waxaanu aqoonsanay 124 isku xigxiga peptide gaar ah (#3.1 iyo #3.2) laga soo bilaabo 332 CSF-clones oo dib loo habeeyay oo ka soocan laba xayawaan ah (Jaantuska Dheeraadka ah 6a).Isku xigxiga LGSVS (18.7%) ayaa lahaa saamiga ugu sarreeya ee qaraabada, oo ay ku xigto gelinta nooca duurjoogta ah PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), iyo SARGSWREIVSLS (2.2%).Wareegii afraad ee u dambeeyay, waxaanu isku geynay laba laamood oo madax banaan oo laga soo doortay saddex xayawaan ah (Jaantus 1c).925 ka mid ah phage clones ee taxanaha ah ee laga soo kabsaday CSF, wareegii afraad waxaan helnay 64 taxane peptide gaar ah (Jaantuska Dheeraadka ah. 6b), kaas oo ka mid ah saamiga qaraabada ee nooca duurjoogta ah uu hoos ugu dhacay 0.8%.Xirmooyinka CSF ee ugu caansan wareegii afraad waxay ahaayeen LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) iyo RLSSVDSDLSGC%) (3.%)).Dhererka dhererka peptides-ka la doortay waxaa sabab u ah gelinta/tirtiridda nucleotide ama codons joojinta degdega ah ee ku dhex jira aasaasayaasha maktabadda marka la isticmaalayo codons xumaaday naqshadeynta maktabadda NNK.Codons joogsiga degdega ah waxay dhaliyaan peptides gaaban waxaana la doortay sababtoo ah waxay ka kooban yihiin motif aa wanaagsan.peptides-ka dheer ayaa laga yaabaa inay ka dhashaan gelinta/tirtiridda asaasiga ah ee maktabadaha synthetic.Tani waxay dhigaysaa koodka joogsiga ee nashqadeysan ee bannaanka jirridda oo akhriya ilaa uu ka soo baxo cod-joojin cusub.Guud ahaan, waxaanu xisaabinay qodobbada kobcinta dhammaan afarta wareeg ee doorashada anagoo is barbar dhignay xogta wax-soo-gelinta iyo xogta muunadda.Wareeggii koowaad ee baadhista, waxaanu isticmaalnay titers-ka nooca duurjoogta ah sida tixraaca asalka ah ee aan gaarka ahayn.Waxa xiiso leh, xulashada phage-ka taban waxay ahayd mid aad u xoog badan wareegga ugu horreeya ee CSF, laakiin aan ku jirin dhiigga (Jaantus. 3a), taas oo laga yaabo inay sabab u tahay suurtogalnimada hoose ee faafinta dadban ee inta badan xubnaha maktabadda peptide ee qaybta CSF ama phages qaraabada waxay u muuqdaan inay si hufan u hayaan ama laga saaro dhiigga marka loo eego bacteriophages.Si kastaba ha ahaatee, wareegii labaad ee feejigan, xulashada adag ee phages ee CSF ayaa lagu arkay labada qayboodba, taasoo soo jeedinaysa in wareegii hore lagu tayeeyey phages muujinaya peptides kuwaas oo kor u qaadaya qaadashada CSF (Jaantus. 3a).Mar labaad, iyada oo aan la helin hodmin dhiig oo muhiim ah.Sidoo kale wareegyadii saddexaad iyo afraad, xirmooyinka phage-ga ayaa si weyn loogu hodmay CSF.Isbarbardhigga inta jeer ee isku xigxiga peptide kasta oo gaar ah inta u dhaxaysa labadii wareeg ee ugu dambeeyay ee xulashada, waxaan ogaanay in taxanaha xitaa aad loo kobciyay wareega afaraad ee xulashada (Jaantus. 3b).Wadar ah 931 tripeptide motifs ayaa laga soo saaray dhammaan 64 tixood ee peptide ee gaarka ah iyadoo la adeegsanayo labada jihooyinka peptide.Ujeedooyinka aadka loo hodmay ee wareegii afraad ayaa si dhow loogu baadhay muuqaalkooda kobcinta ee wareegyada oo dhan marka la barbar dhigo maktabadda la duray (goynta: 10% kobcinta) (Jaantuska Dheeraadka ah 6c).Nidaamyada guud ee xulashada ayaa muujiyay in inta badan ujeedooyinka la daraaseeyay ay ku hodmeen dhammaan wareegyadii hore ee labada laamood ee xulashada.Si kastaba ha ahaatee, qaar ka mid ah motifs (tusaale SGL, VSG, LGS GSV) ayaa u badnaa kuwa ka duwan clade A, halka kuwa kale (tusaale FGW, RTN, WGF, NTR) lagu hodmay clade B kale.
Ansixinta gaadiidka CSF ee peptides-ka muuqda ee CSF-ku hodmay iyo peptides hogaamiyaha biotinylated ee isku xidhan streptavidin.
(a) Saamiyada kobcinta ee lagu xisaabiyay dhammaan afarta wareeg (R1-R4) iyadoo lagu salaynayo duritaan ( gelin = I) titer phage (PFU) iyo la go'aamiyay CSF phage titers (wax soo saarka = O).Qodobbada kobcinta saddexdii wareeg ee ugu dambeeyay (R2-R4) ayaa lagu xisaabiyay marka la barbardhigo wareeggii hore iyo wareegga koowaad (R1) ee xogta miisaanka.Baararka furan waa dareeraha cerebrospinal, baararka hadhsan waa balasma.(***p<0.001, oo ku salaysan t-imtixaanka Ardayga).(b) Liiska peptides-ka phage-ga ugu badan, oo loo kala qiimeeyay marka loo eego saamigoodu marka loo eego dhammaan wajiyada laga soo ururiyay CSF kadib wareegga 4 ee doorashada.Lixda qaybood ee ugu caansan ee loo yaqaan 'phage clone' ayaa lagu muujiyay midab, la tiriyey iyo arrimo kobcintooda inta u dhaxaysa wareegyada 3 iyo 4 ee xulashada (insets).(c,d) Lixda phage clone ee ugu qanisan, fage madhan iyo maktabadaha peptide ee waalidka ee wareega 4 ayaa si gaar ah loogu lafaguray qaabka muunada CSF.CSF iyo shaybaarrada dhiigga ayaa laga soo qaaday waqtiyada la tilmaamay.(c) Qadar isku mid ah oo ah 6 musharrax phage clones (2 x 1010 phages / xayawaan), faashado madhan (#1779) (2 x 1010 phages / xayawaanka) iyo kaydka phage peptide maktabadaha (2 x 1012 phages / xoolaha) Duri ugu yaraan 3 CM ayaa si gooni ah loogu duraa xayawaanka.Pharmacokinetics-ka CSF ee mid kasta oo la isku duro phage clone iyo phage peptide maktabadda waqti ka dib ayaa la muujiyay.(d) waxay tusinaysaa celceliska saamiga CSF/dhiiga ee dhammaan faajisyada/mL ee la soo kabsaday muddada muunada.(e) Afar peptides-hogaamiyeyaasha synthetic iyo hal kantarool oo la xoqay ayaa lagu xidhay biotin ilaa streptavidin iyada oo loo marayo N-terminus (muujinta tetramer) oo ay ku xigto cirbadeynta (xididka dabada iv, 10 mg streptavidin/kg).Ugu yaraan saddex jiir oo gudaha ku jira (N = 3).).Muunado CSF ​​ah ayaa la soo ururiyey xilliyada la tilmaamay iyo fiirsashada streptavidin waxaa lagu qiyaasay CSF anti-streptavidin ELISA (nd = lama ogaan).(* p <0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ku salaysan imtixaanka ANOVA).(f) Isbarbardhigga taxanaha amino acid ee phage peptide clone ee aadka u hodmay #2002 (guduud) iyo phage peptide clones kale oo la doortay oo ka yimid wareega 4aad ee doorashada.Qaybaha amino acid isku midka ah iyo kuwa la midka ah ayaa midab leh.
Dhammaan wejiyada hodanka ah ee wareegii afraad (Jaantus. 3b), lix musharrax oo musharraxiin ah ayaa loo doortay falanqaynta shakhsi ahaaneed ee qaabka muunada CSF.Xaddi le'eg oo ah lix musharax phage, faaruq madhan (aan la gelin) iyo maktabadaha peptide prophage ayaa lagu duray saddex xayawaan CM ah oo qasacadaysan, iyo pharmacokinetics ayaa lagu go'aamiyay CSF (Jaantus. 3c) iyo dhiig (Jaantuska Dheeraadka 7) ee qiimaynta.Dhammaan xayndaabyada phage-ga ee la tijaabiyay ayaa lagu beegsaday qaybta CSF heer 10-1000 jeer ka sarreeya kan phage-ka kantaroolka madhan (#1779).Tusaale ahaan, clones #2020 iyo #2077 waxay lahaayeen qiyaastii 1000 jeer ka sarreeya titers CSF marka loo eego heerka xakamaynta.Muuqaalka farmashiyaha ee peptide kasta oo la doortay wuu ka duwan yahay, laakiin dhammaantood waxay leeyihiin awood sare oo CSF ​​ah.Waxaan ku aragnay hoos u dhac joogto ah waqti ka dib marka loo eego clones #1903 iyo #2011, halka clone #2077, #2002 iyo #2009 ay kordheen inta lagu jiro 10 daqiiqo ee ugu horeeya waxay muujin kartaa gaadiid firfircoon laakiin loo baahan yahay in la xaqiijiyo.Xirmooyinka #2020, #2002, iyo #2077 waxay xasiliyeen heerar sare, halka uruurinta CSF ee clone #2009 ay si tartiib tartiib ah hoos ugu dhacday kororka bilowga ah ka dib.Waxaan markaa is barbar dhignay inta jeer ee musharax kasta CSF iyo diiradda dhiigga (Jaantus. 3d).Isku xirka celceliska titer musharrax kasta CSF iyo cabbirkiisa dhiigga ee dhammaan waqtiyada muunad-qaadista ayaa muujisay in saddex ka mid ah lixda murashax ay si weyn ugu hodmeen dhiigga CSF.Waxa xiiso leh, clone #2077 waxay muujisay xasilloonida dhiigga oo sarreeya (Jaantuska Dheeraadka ah 7).Si loo xaqiijiyo in peptides laftoodu ay awood u leeyihiin inay si firfircoon ugu raraan xamuulka aan ahayn walxaha phage-ga ee qaybta CSF, waxaan ku soo saarnay afar peptides hoggaamiyeyaal ah oo laga soo saaray biotin ee N-terminus halkaasoo peptides-ku ay ku xiran yihiin qaybta phage.Biotinylated peptides ( no. 2002, 2009, 2020 iyo 2077) ayaa lagu daray streptavidin (SA) si loo helo foomamka multimeric oo xoogaa la ekaysiiyay joomatari phage-ga.Qaabkani waxa kale oo uu noo oggolaaday in aan cabbirno soo-gaadhista SA ee dhiigga iyo dareeraha maskaxda sida peptides borotiinka xamuulka qaada.Muhiimad ahaan, xogta phage inta badan waa la soo saari karaa marka peptides synthetic lagu maamulo qaabkan SA-isku-xidhan (Jaantus. 3e).Peptides-ka la ruxay waxay lahaayeen soo-gaadhis yar oo bilaw ah iyo nadiifin degdeg ah oo CSF ​​ah oo leh heerar aan la ogaan karin 48 saacadood gudahood.Si aan u helno fahanka dariiqooyinka gaarsiinta ee peptide phage clones ee booska CSF, waxaan falanqeynay degenaansho ee hits peptide shaqsiyeed anagoo adeegsanayna immunohistochemistry (IHC) si aan si toos ah u ogaano qaybaha phage 1 saac kadib duritaanka xididka ee vivo.Waxaa xusid mudan, clones #2002, #2077, iyo #2009 waxaa lagu ogaan karaa wasakh xoog leh oo ku dhaca xididada maskaxda, halka xakameynta phage (#1779) iyo clone #2020 aan la helin (Jaantuska Dheeraadka 8).Tani waxay soo jeedinaysaa in peptides-yadani ay gacan ka geystaan ​​saameynta maskaxda si sax ah iyagoo ka gudbaya BBB.Falanqaynta faahfaahsan oo dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo tijaabiyo mala-awaalkan, maadaama dariiqa BCFB ay sidoo kale ku lug yeelan karto.Marka la barbar dhigo isku xigxiga amino acid ee clone ugu hodmin (#2002) iyo peptides kale la doortay, waxaa la ogaaday in qaar ka mid ah iyaga ka mid ah ay leeyihiin ballaarinta amino acid la mid ah, taas oo laga yaabaa in ay muujinayaan habka gaadiidka la mid ah (Jaantus. 3f).
Sababtoo ah astaanta balaasmaha gaarka ah iyo kororka weyn ee CSF waqti ka dib, bandhiga phage clone #2077 ayaa lagu sii sahamiyey muddo dheer oo 48-saac ah waxayna awood u yeelatay inay soo saarto kororka degdega ah ee CSF ee lagu arkay iyadoo lala xiriirinayo heerarka SA ee joogtada ah (Jaantus. 4a).Marka laga hadlayo xayndaabyada kale ee la aqoonsaday, #2077 waxay si adag u walaaqday xididada maskaxda waxayna muujisay xinjir la taaban karo oo leh lectin calameeyaha capillary markii la eego xallinta sare iyo suurtogalnimada xoogaa midab ah oo ku yaal booska parenchymal (Jaantus 4b).Si loo baadho bal in saamaynta dawooyinka ee peptide-dhexdhexaadin laga heli karo CNS, waxaanu samaynay tijaabo ay ku jiraan noocyada biotinylated ee i) #2077 transit peptide iyo ii) peptide inhibitor BACE1 lagu qaso SA laba qaybood oo kala duwan.Mid ka mid ah isku darka waxaan u isticmaalnay kaliya BACE1 peptide inhibitor kan kalena waxaan u isticmaalnay saamiga 1:3 ee BACE1 peptide inhibitor ilaa #2077 peptide.Labada shayba waxa lagu maamulay xididada dhiiga iyo heerka dareeraha maskaxda ee beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ayaa la qiyaasay wakhti ka dib.Abeta40 waxaa lagu cabiray CSF maadaama ay ka tarjumayso joojinta BACE1 ee parenchyma maskaxda.Sida la filayo, labada dhisme waxay si weyn u yareeyeen heerarka dhiigga Abeta40 (Jaantus. 4c, d).Si kastaba ha ahaatee, kaliya muunado ka kooban isku dhafka peptide no.2077 iyo horjoogaha BACE1 peptide ee isku xira SA ayaa sababay hoos u dhac weyn oo ku yimid Abeta40 ee dareeraha cerebrospinal (Jaantus. 4c).Xogtu waxay muujinaysaa in peptide no.2077 wuxuu awood u leeyahay inuu qaado borotiinka 60 kDa SA ee CNS wuxuuna sidoo kale keenaa saameynaha dawooyinka ee SA-conjugated inhibitors ee BACE1 peptide.
(a) Clonal cirbadeynta (2 × 10 phages / xayawaan) ee T7 phage oo muujinaya profiles farmashiyaha muddada-dheer ee CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) iyo phage kantaroolka aan la durin (#1779) ugu yaraan saddex jiir oo CM-ku-xidhan.(b) Sawirka konfocal ee microvessels cortical cortical microvessels ee jiirka phage-lagu duray (2 × 10 10 phages/xayawaan) oo muujinaya iska ilaalinta peptide #2077 iyo weelasha (lectin).Xirmooyinkan phage-ga ayaa la maamulay 3 jiir waxaana loo oggolaaday inay wareegaan 1 saac ka hor dhiigbax.Maskaxda ayaa la kala qaybiyey oo lagu dheehday unugyada ka hortagga unugyada FITC ee polyclonal ee lidka ku ah T7 phage capsid.Toban daqiiqo ka hor dhiigbaxa iyo hagaajinta ku xigta, DyLight594-ku calaamadeeyay lectin ayaa la mariyay xididka.Sawirada fluorescent ee muujinaya lectin midabaynta (casaan) ee dhinaca iftiinka ee microvessels iyo fages (cagaar) ee lumen ee xididada iyo unugyada maskaxda ee xididdada dhiigga.Barka cabbirku wuxuu u dhigmaa 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide kaligiis ama lagu daro biotinylated transit peptide #2077 waxaa lagu daray streptavidin oo ay ku xigto cirbadeynta xididada ee ugu yaraan saddex jiir CM ah oo qasacadaysan (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptide inhibitor-dhexdhexaadinta hoos u dhigista Aβ40 waxaa lagu qiyaasay Aβ1-40 ELISA ee dhiiga (casaan) iyo dareeraha cerebrospinal (orange) ee dhibcaha wakhtiga la tilmaamay.Si loo caddeeyo, xariiq dhibco leh ayaa lagu sawiray garaafka cabirkiisu yahay 100%.(c) Hoos u dhigista boqolkiiba Aβ40 ee dhiiga (saddex xagalka cas) iyo dareeraha cerebrospinal (saddex xagal orange) ee jiirka lagu daweeyay streptavidin oo isku xira peptide transit #2077 iyo BACE1 peptide inhibitory ee 3: 1 saamiga.(d) Hoos u dhaca boqolkiiba ee dhiiga Aβ40 (goobab cas) iyo dareeraha cerebrospinal (goobaha orange) ee jiirka oo lagu daweeyay streptavidin oo ay weheliso BACE1 peptide inhibitory kaliya ah.Xoojinta Aβ ee xakamaynta waxay ahayd 420 pg / ml (qiyaastii caadiga ahayd = 101 pg / ml).
Bandhiga wejiga ayaa si guul leh looga dabaqay dhowr meelood oo cilmi-baarista biomedical17.Habkan ayaa loo adeegsaday daraasadaha kala duwanaanshaha xididdada dhiigga18,19 iyo sidoo kale daraasadaha lagu beegsanayo maraakiibta maskaxda20,21,22,23,24,25,26.Daraasaddan, waxaan ku kordhinay codsiga habkan xulashada ma aha oo kaliya aqoonsiga tooska ah ee peptides ee lagu beegsanayo maraakiibta maskaxda, laakiin sidoo kale helitaanka musharraxiinta leh hantida gaadiidka firfircoon si ay uga gudbaan xannibaadda dhiigga-maskaxda.Waxaan hadda sharaxnay horumarinta habka xulashada in vivo ee CM jiirka oo aan muujino kartideeda lagu aqoonsanayo peptides ee guryaha CSF.Isticmaalka T7 phage oo soo bandhigaya maktabad ah 12-mer random peptides, waxaan awoodnay inaan muujino in T7 phage uu yar yahay oo ku filan (qiyaastii 60 nm dhexroorka)10 si loogu habeeyo xannibaadda maskaxda-maskaxda, taas oo si toos ah uga gudubta xannibaadda dhiigga-maskaxda ama choroid plexus.Waxaan aragnay in CSF ka soo goynta jiirka CM ee cannulated ay tahay hab si wanaagsan loo xakameeyay oo ku jira habka baaritaanka shaqada ee vivo, iyo in phage-ga la soo saaray aanu ku xidhnayn oo keliya xididdada dhiigga laakiin uu sidoo kale u shaqeeyo sidii gudbiye guud ahaan xannibaadda maskaxda-maskaxda.Intaa waxaa dheer, annagoo isla mar ahaantaana uruurinayna dhiigga oo codsanaya HTS CSF iyo fagesyada dhiigga, waxaan xaqiijinnay in doorashadayada CSF aysan saameyn ku yeelan kobcinta dhiigga ama fayaqabka ballaarinta wareegyada xulashada.Si kastaba ha ahaatee, qaybta dhiigu waa qayb ka mid ah nidaamka xulashada, mar haddii wejiyada awood u leh inay gaaraan qaybta CSF waa inay noolaadaan oo ku wareegaan dhiigga muddo dheer si ay naftooda ugu hodmaan maskaxda.Si looga soo saaro xogta isku xigxiga ee la isku halayn karo xogta HTS cayriin, waxaanu hirgelinay filtarrada ku habboon khaladaadka isku xigxiga ee gaarka ah ee socodka shaqada falanqaynta.Marka lagu daro cabbirada kinetic ee habka baarista, waxaan xaqiijinay farmashiyaha degdega ah ee nooca duurjoogta ah ee phages T7 (t½ ~ 28 min) ee dhiiga24, 27, 28 iyo sidoo kale waxay go'aamiyeen noloshooda nuska ah ee dareeraha maskaxda (t½ ~ 26 min) daqiiqadii).In kasta oo ay jiraan astaamo dawooyin isku mid ah oo ku jira dhiigga iyo CSF, kaliya 0.001% ee fiirsashada dhiigga ee phage ayaa laga ogaan karaa CSF, taas oo muujinaysa dhaqdhaqaaqa asalka ah ee nooca duurjoogta ah ee T7 phage ee guud ahaan xannibaadda dhiigga-maskaxda.Shaqadani waxay muujinaysaa muhiimada wareegga koowaad ee xulashada marka la isticmaalayo in vivo xeeladaha panning, gaar ahaan hababka phage-ga oo si degdeg ah looga nadiifiyo wareegga, maadaama dhowr clones ay awoodaan inay gaaraan qaybta CNS.Sidaa darteed, wareegii koowaad, hoos u dhaca kala duwanaanshaha maktabadda aad buu u weynaa, maadaama tiro xaddidan oo clones ah aakhirkii lagu soo ururiyay qaabkan CSF ee aad u adag.Istaraatiijiyadan in vivo-du waxay ku jirtay dhowr tillaabo oo xulashada ah sida ururinta firfircoon ee qaybta CSF, badbaadada clone ee qaybta dhiigga, iyo ka saarista degdega ah ee T7 phage clones ee dhiigga 10 daqiiqo ee ugu horreeya (Jaantus. 1d iyo Jaantuska Dheeraadka ah. 4M).).Sidaa darteed, wareegii koowaad ka dib, waxaa lagu aqoonsaday CSF-ta noocyada kala duwan ee xayndaabyada, in kasta oo isla barkada bilowga ah loo isticmaalay xayawaannada gaarka ah.Tani waxay soo jeedinaysaa in tillaabooyin kala duwan oo adag ee xulashada maktabadaha isha oo tiro badan oo xubno ka ah maktabadda ay keenaan hoos u dhac weyn oo ku yimaada kala duwanaanshaha.Sidaa darteed, dhacdooyinka aan kala sooca lahayn waxay noqon doonaan qayb muhiim ah oo ka mid ah habka xulashada bilowga ah, oo si weyn u saameeya natiijada.Waxay u badan tahay in qaar badan oo ka mid ah xayeysiisyada maktabadda asalka ah ay lahaayeen kobcinta kobcinta CSF ee la mid ah.Si kastaba ha ahaatee, xitaa xaaladaha isku midka ah ee tijaabada ah, natiijooyinka xulashada way kala duwanaan karaan sababtoo ah tirada yar ee mid kasta oo gaar ah oo ku jira barkada hore.
Ujeedooyinka lagu hodmay CSF way ka duwan yihiin kuwa dhiigga ku jira.Waxa xiiso leh, waxaan ogaanay isbeddelkii ugu horreeyay ee ku wajahan peptides-ka hodanka ah ee glycine ee dhiigga xayawaanka gaarka ah.(Jaantus. 1g, Sawirada Dheeraadka ah. 4e, 4f).Wejiga ay ku jiraan glycine peptides ayaa laga yaabaa inay aad u xasilloon oo ay yar tahay in wareegga dhiigga laga saaro.Si kastaba ha noqotee, peptides-ka hodanka ah ee glycine laguma helin shaybaarada dareeraha cerebrospinal, taasoo soo jeedinaysa in maktabadaha la daaweeyay ay soo mareen laba tillaabo oo kala duwan oo xulasho ah: mid ku jira dhiigga iyo mid kale oo loo oggol yahay inuu ku ururo dareeraha cerebrospinal.CSF-ku-xoojisay clones-ka ka dhashay wareegga afraad ee doorashada ayaa si weyn loo tijaabiyey.Ku dhawaad ​​​​dhammaan kareemada gaarka ah ee la tijaabiyay ayaa la xaqiijiyay inay ku hodmeen CSF marka la barbar dhigo phage-ka kantaroolka maran.Hal peptide ku dhuftay (#2077) ayaa si faahfaahsan loo baadhay.Waxay muujisay nolol badhkeed balaasmaha dheer marka la barbar dhigo hits kale (Jaantuska 3d iyo Jaantuska Dheeraadka ah 7), waxaana xiiso leh, peptide-kan waxa ku jira hadhaaga cysteine ​​ee C-terminus.Waxaa dhawaan la muujiyay in ku darida cysteine ​​​​in peptides ay hagaajin karto sifooyinkooda farmashiyaha iyagoo ku xiraya albumin 29.Tani hadda lagama garanayo peptide #2077 waxayna u baahan tahay daraasad dheeri ah.Qaar ka mid ah peptides-ku waxay muujiyeen ku-tiirsanaanta kobcinta CSF (xogta aan la muujin), taas oo laga yaabo inay la xiriirto joomatari dusha sare ee T7 capsid.Nidaamka T7 ee aan isticmaalnay wuxuu muujiyay 5-15 koobi oo ka mid ah peptide kasta qayb kasta oo phage ah.IHC waxaa lagu sameeyay musharraxiinta phage clones oo xididka laga duray kiliyaha maskaxda ee jiirka (Jaantuska Dheeraadka ah 8).Xogtu waxay muujisay in ugu yaraan saddex clone (No. 2002, No. 2009 iyo No. 2077) ay la falgaleen BBB.Waa la go'aamin doonaa in isdhexgalka BBB uu keenayo ururinta CSF ama dhaqdhaqaaqa kloonyadan si toos ah BCSFB.Muhiimad ahaan, waxaan tuseynaa in peptides-ka la doortay ay heystaan ​​awooddooda gaadiid ee CSF marka la isku daro oo lagu xiro xamuulka borotiinka.Ku-xidhka N-terminal biotinylated peptides ee SA asal ahaan waxay ku celisaa natiijooyinka la helay iyada oo la adeegsanayo clones-ka phage-ka ee dhiigga iyo dareeraha maskaxda (Jaantus. 3e).Ugu dambeyntii, waxaan muujineynaa in peptide rasaasta #2077 ay awood u leedahay inay kor u qaaddo ficilka maskaxda ee biotinylated peptide inhibitor ee BACE1 oo ku xiran SA, taasoo keenta saameynaha farmasiga ee CNS iyada oo si weyn u yareyneysa Abeta40 heerarka CSF (Jaantus. 4).Waanu kari waynay in aan ku aqoonsano homologues kasta oo ku jira xogta anagoo samaynayna isku xigxiga peptide-ka isku xigxiga raadinta dhammaan hits.Waxaa muhiim ah in la ogaado in cabbirka maktabadda T7 ay ku dhowdahay 109, halka cabbirka maktabadda aragtida ee 12-mers ay tahay 4 x 1015. Sidaa darteed, waxaan kaliya doorannay qayb yar oo ka mid ah booska kala duwanaanta ee maktabadda 12-mer peptide, taas oo macnaheedu noqon karo in peptides dheeraad ah oo la hagaajiyay lagu aqoonsan karo iyada oo la qiimeeyo meelaha ku xiga ee la aqoonsaday.Mala-awaal ahaan, mid ka mid ah sababaha aynaan u helin wax isku-dhafka dabiiciga ah ee peptides-kan ayaa laga yaabaa inay noqoto door-soo-bax inta lagu jiro horumarinta si looga hortago gelitaanka aan la xakameyn ee maadooyinka peptide qaarkood ee maskaxda.
Isku soo wada duuboo, natiijooyinkayagu waxay aasaas u yihiin shaqada mustaqbalka si loo aqoonsado loona garto hababka gaadiidka ee xannibaadda maskaxda ee vivo si faahfaahsan.Habaynta aasaasiga ah ee habkani waxa uu ku salaysan yahay istaraatijiyad doorasho shaqaynaysa oo aan kaliya aqoonsanayn clones leh sifooyinka xidhidhiyaha xididada maskaxda, laakiin sidoo kale waxaa ku jira tallaabo muhiim ah kaas oo clones-ka guuleysta ay leeyihiin waxqabad gudaha ah si ay uga gudbaan caqabadaha noolaha ee vivo ee qaybta CNS.waa in la caddeeyo habka gaadiidka ee peptides-kan iyo doorbidkooda ku-xidhka microvasculature ee gaarka ah ee gobolka maskaxda.Tani waxay horseedi kartaa in la helo dariiqyo cusub oo loogu talagalay gaadiidka BBB iyo reseptors.Waxaan filaynaa in peptides-ka la aqoonsaday ay si toos ah ugu xidhi karaan reseptors cerebrovascular ama ligands wareeg ah oo lagu qaado BBB ama BCSFB.Falalka peptide ee leh dhaqdhaqaaqa gaadiidka CSF ee lagu ogaaday shaqadan ayaa si dheeraad ah loo baari doonaa.Waxaan hadda baaraynaa gaar ahaan maskaxda ee peptides-kan awooddooda ay uga gudbaan BBB iyo/ama BCSFB.peptides-ka cusubi waxa ay u noqon doonaan qalab aad u qiimo badan oo lagu heli karo soo dhawaynta cusub ama dariiqyada iyo horumarinta habab cusub oo tayo sare leh oo loogu talagalay gudbinta makromolecules, sida bayooloji, maskaxda.
Cannule godka weyn (CM) adoo isticmaalaya wax ka beddelka habka hore loo sifeeyay.Jiirka Wistar ee la suuxiyay (200-350 g) ayaa lagu rakibay qalab stereotaxic ah iyo jeex dhexdhexaad ah ayaa laga sameeyay madaxa la xiiray oo si la yaab leh loo diyaariyey si loo muujiyo madaxa.Ka qodo laba god oo ku yaal aagga saqafka sare oo ku xidh furayaasha hagaajinta godadka.Dalool dheeri ah ayaa lagu daloolay cirifka dambe ee occipital-ka si loogu hago stereotactic of cannula bir aan lahayn gudaha CM.Marso sibidhka ilkaha agagaarka cannula oo ku xidh boolal.Ka dib markii sawir-qaadista iyo adkeynta sibidhka, nabarka maqaarka ayaa lagu xidhay 4/0 supramid supramid.Meelaynta saxda ah ee cannula waxaa lagu xaqiijiyaa dareeraha iskiis ah ee dareeraha maskaxda (CSF).Ka saar jiirka qalabka stereotaxic, hel daryeelka ku habboon qalliinka ka dib iyo maareynta xanuunka, una ogolow inuu ka soo kabsado ugu yaraan hal toddobaad ilaa calaamadaha dhiigga lagu arko dareeraha maskaxda.Jiirka Wistar (Crl: WI/Han) waxaa laga helay Charles River (France).Dhammaan jiirarka waxaa lagu hayay xaalado gaar ah oo ka madax bannaan cudur-sidaha.Dhammaan tijaabooyinka xayawaanka waxaa ansixiyay Xafiiska Caafimaadka Xoolaha ee Magaalada Basel, Switzerland, waxaana lagu sameeyay si waafaqsan shatiga Xoolaha No. 2474 (Qiimaynta Gaadiidka Maskaxda ee Firfircoon ee Cabbirka Heerarka Musharixiinta Daweynta ee dareeraha Cerebrospinal iyo Maskaxda ee Rat).
Si tartiib ah u ilaali jiirka oo miyir qaba cannula CM oo gacanta ku jira.Ka saar Datura cannula oo soo qaado 10 µl oo dareere maskaxeed oo iskiis u socda.Maaddaama patency ee cannula ugu dambeyntii la jabsaday, kaliya shaybaarada dareeraha cerebrospinal cad oo aan lahayn caddayn dhiig wasakhaysan ama midab ayaa lagu daray daraasaddan.Isla barbar dhig, qiyaastii 10-20 μl oo dhiig ah ayaa laga soo qaaday jeexitaan yar oo ku taal cidhifka dabada oo la geliyey tuubo leh heparin (Sigma-Aldrich).CSF iyo dhiig ayaa la ururiyey waqtiyo kala duwan ka dib markii xididada laga duray T7 phage.Ku dhawaad ​​5-10 μl oo dareere ah ayaa la tuuray ka hor inta aan la qaadin muunad kasta oo CSF ​​ah, taas oo u dhiganta mugga dhintay ee tuubada.
Maktabadaha waxaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo habka T7Select 10-3b sida lagu qeexay buug-gacmeedka T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Si kooban, gal-gal DNA ah oo aan kala sooc lahayn oo 12-mer ah ayaa loo habeeyey qaabkan soo socda:
Codka NNK waxaa loo adeegsaday si looga fogaado codons-ka joogsiga labajibaaran iyo amino acid-ka xad-dhaafka ah ee gelinta.N waa saamiga gacanta isku dhafan ee nucleotide kasta, iyo K waa saamiga gacanta isku dhafan ee adenine iyo cytosine nucleotide.Gobollada kelida ah ee go'doonsan ayaa loo beddelay DNA-ga laba-jibbaaran iyadoo lagu sii kordhinayo dNTP (Novagen) iyo Klenow enzyme (New England Biolabs) ee Klenow buffer (New England Biolabs) muddo 3 saacadood ah 37°C.Falcelinta ka dib, DNA laba-geesood ah ayaa dib u helay roobab EtOH.DNA-da ka soo baxday waxaa lagu dheefshiiday enzymes xaddidan EcoRI iyo HindIII (labadaba Roche).jeexjeexan oo la nadiifiyey (QIAquick, Qiagen) gelinta (T4 ligase, New England Biolabs) ayaa markaa lagu dhejiyay qaab-dhismeedka T7 vector-ka hor-jeexan ka dib amino acid 348 ee hidda-wadaha 10B capsid.Dareen-celinta ligation-ka waxaa lagu duray 16 ° C. 18 saacadood ka hor baakadaha in vitro.Baakadaha wajiga ee vitro waxaa la sameeyay iyadoo la raacayo tilmaamaha lagu bixiyay xirmada T7Select 10-3b cloning (Novagen) iyo xalka baakadaha ayaa la xoojiyay hal mar si lysis loo isticmaalo Escherichia coli (BLT5615, Novagen).lysates-yada ayaa la isku daray, titrated oo la qaboojiyey at -80 ° C. sida xal kayd ah glycerol.
Kordhinta tooska ah ee PCR ee gobollada kala duwan ee phage-ga oo lagu kordhiyey maraq ama saxan iyada oo la isticmaalayo 454/Roche-amplicon fusion primers.Fiyuuska hore waxa uu ka kooban yahay taxane garab socda gobolka doorsoomayaasha (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, iyo afar-saldhig maktabadda taxanaha muhiimka ah (TCAG) (Jaantuska Dheeraadka 1a):
Fiyuuska gadaasha ayaa sidoo kale ka kooban biotin ku xiran qabashada kuul iyo GS FLX Titanium Adapter B ee looga baahan yahay kordhinta clonal inta lagu jiro emulsion PCR:
Amplicons-yada ayaa markaa la hoos geeyey 454/Roche pyrosequencing iyadoo loo eegayo borotokoolka 454 GS-FLX Titanium.Isku xigxiga buug-gacmeedka Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA waxaa xoojiyay PCR waxaana lagu taxaabay lamaanaha soo socda:
Galinta taarikada gaarka ah ayaa lagu sammeeyay kor u qaadida PCR iyadoo la isticmaalayo Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha).Samee bilow kulul (10 daqiiqo at 95 °C) iyo 35 wareegyada kor u qaadista (50 s at 95 °C, 1 min at 50 °C, iyo 1 min at 72 °C).
Marxaladda maktabadaha, nooca duurjoogta ah, phage laga badbaadiyay CSF iyo dhiigga, ama clones-ka gaarka ah ayaa lagu kordhiyey Escherichia coli BL5615 ee maraq TB (Sigma Aldrich) ama 500 cm2 suxuunta (Thermo Scientific) 4 h at 37 ° C.Wajiga waxaa laga soo saaray taarikada iyadoo saxannada lagu maydho Tris-EDTA baffer (Fluka Analytical) ama iyadoo la ururinayo taarikada talooyinka pipette-ka ee nadiifka ah.Marxalada ayaa laga go'doomiyay dhaqameedka sareynta ama soo saarista hal wareeg oo ah polyetylen glycol (PEG 8000) roobab (Promega) oo dib ayaa loogu hakiyay kaydka Tris-EDTA.
Fage-ka la xoojiyay ayaa lagu sakhiray 2-3 wareeg oo ka saarista endotoxin iyadoo la isticmaalayo kuul ka saarista endotoxin (Miltenyi Biotec) ka hor duritaanka xididka (IV) (500 μl / xayawaan).Wareegii koowaad, 2×1012 phages ayaa la soo bandhigay;kan labaadna, 2×1010 phages;wareegyada doorashada saddexaad iyo afraad, 2×109 phages neefkiiba.Nuxurka wejiga ee CSF iyo shaybaarrada dhiigga ee la soo ururiyey waqtiyada la tilmaamay waxaa lagu go'aamiyey tirinta huurada iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha (T7Select system Buugga).Xulashada wejiga waxaa lagu duray xididada xididada ee maktabadaha la safeeyey ee xididka dabada ama dib-u-duridda phage laga soo saaray CSF wareegii hore ee xulashada, iyo goosashada ku xigta waxaa lagu sameeyay 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, iyo 240 min siday u kala horreeyaan C.SFIsku geyn afar wareeg oo in vivo panning ah ayaa la sameeyay iyadoo labada laamood ee la soo xulay si gooni gooni ah loo kaydiyay laguna falanqeeyay saddexdii wareeg ee hore ee xulashada.Dhammaan gelinta phage ee laga soo saaray CSF labadii wareeg ee hore ee xulashada waxaa lagu sammeeyay 454/Roche pyrosequencing, halka dhammaan clone-ka laga soo saaray CSF labadii wareeg ee ugu dambeeyay ee xulashada lagu sameeyay gacanta.Dhammaan heerarka dhiigga ee wareegga koowaad ee xulashada ayaa sidoo kale la sammeeyay 454/Roche pyrosequencing.Duritaannada phage clones, fagesyada la doortay ayaa lagu kordhiyey E. coli (BL5615) ee 500 cm2 taarikada 37 ° C ilaa 4 saacadood.Xirmooyinka si gaar ah loo xushay iyo kuwa gacanta lagu sameeyay ayaa lagu faafiyay dhexda TB.Ka dib markii phage la soo saaro, nadiifinta iyo ka saarida endotoxin (sida kor lagu sharaxay), 2 × 1010 phages / xayawaanka 300 μl ayaa xididka laga duray hal xidid oo dabada ah.
Diyaarinta iyo shaandhaynta tayada leh ee xogta taxanaha ah.Xogta ceeriin 454/Roche waxaa laga beddelay qaab khariidad qulqulka caadiga ah ee binary-ga ah (sff) oo loo beddelay qaab la akhriyi karo Pearson (fasta) iyadoo la isticmaalayo software iibiyaha.Nidaaminta dheeraadka ah ee isku xigxiga nucleotide ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijyada C iyo qoraallada gaarka ah (xirmo software aan la sii deyn) sida hoos lagu sharraxay.Falanqaynta xogta aasaasiga ah waxaa ku jira habab shaandhaynta heerar badan oo adag.Si loo shaandheeyo akhristayaasha aan ku jirin 12mer gelin sax ah oo DNA ah, akhriyayaashu waxay si isdaba joog ah ula jaan qaadeen inay bilaabaan summada (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), summada joogsiga (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) iyo gelinta asalka (CCCTGCAGGATATCCCGeedGGAGCTCGTCGAC) iyadoo la adeegsanayo tijaabada caalamiga ahalignment ogolaanaya ilaa 2 iswaafaqayn halkii alignment31.Sidaa darteed, wax akhriya bilaa bilaaw oo jooji tags iyo akhrinta ay ku jiraan gelinta asalka ah, ie, toosinta ka badan tirada la ogolyahay ee isbarbardhiga, ayaa laga saaray maktabadda.Xagga akhrinta soo hadhay, taxanaha DNA-da N-mer oo ka bilaabmaya calaamadda bilawga oo dhammaanaysa ka hor inta aan calaamadda joogsiga laga saarin taxanaha akhriska ee asalka ah oo si dheeraad ah loo farsameeyey (haddan loo tixraaco "geli").Ka dib marka la tarjumo gelinta, qaybta ka dambeysa koodka joogsiga koowaad ee 5′ dhamaadka furaha ayaa laga saarayaa gelinta.Intaa waxaa dheer, nucleotides oo keenaya codons aan dhamaystirnayn oo ku yaal 3′ dhamaadka asaasiga ah ayaa sidoo kale laga saaray.Si meesha looga saaro gelinta ka kooban taxanaha asalka ah oo keliya, gelisyada la turjumay ee ka bilaabmaya qaabka amino acid "PAG" ayaa sidoo kale meesha laga saaray.Peptides oo leh dherer tarjumaad ka dib oo ka yar 3 amino acids ayaa laga saaray maktabadda.Ugu dambeyntii, ka saar dib-u-celinta barkadda gelinta oo go'aami inta jeer ee gelinta kasta oo gaar ah.Natiijooyinka falanqayntan waxaa ka mid ahaa liis taxane ah oo nucleotide ah (lagu daray) iyo (akhri) soo noqnoqoshooda (Tirooyinka Dheeraadka ah 1c iyo 2).
Kooxda N-mer DNA waxay gelisaa isku ekaanshaha isku xigxiga: Si meesha looga saaro 454/Roche khaladaadka isku xigxiga ee gaarka ah (sida dhibaatooyinka isku xigxiga kordhinta homopolymer) oo meesha laga saaro dib-u-celinta muhiimka ah, N-mer hore ee DNA-da isku xigxiga ayaa la shaandheeyay (gelisyada) waxaa lagu kala soocaa isku mid.gelinta (ilaa 2 saldhig oo aan isku mid ahayn waa la oggol yahay) iyadoo la adeegsanayo algorithm istaraatiijiyadeed oo lagu qeexay sida soo socota: gelinta waxaa lagu kala soocaa marka hore inta jeer (ugu sarreeya ilaa ugu hooseeya), iyo haddii ay isku mid yihiin, nooca labaad ee dhererka (ugu dheer ilaa ugu gaaban) ).Sidaa darteed, gelinta ugu badan iyo kuwa ugu dheer ayaa qeexaya "kooxda".Inta jeer ee kooxda waxa loo dejiyay inta jeer ee muhiimka ah.Dabadeed, gelid kasta oo ku hadhay liiska la soocay ayaa la isku dayay in lagu daro kooxda iyadoo la isku dhejinayo Needleman-Wunsch.Haddii tirada is-daba-marin-waaga, gelinta, ama tirtiridda isku-xidhka aanay ka badnayn xadka 2, gelinta ayaa lagu daraa kooxda, guud ahaan inta jeer ee kooxda waxa la kordhiyaa inta jeer ee gelinta lagu daray.Galinta lagu daray koox waxaa loo calaamadeeyay sidii loo isticmaalay waxaana laga saaray habsocod dheeri ah.Haddi isku xigxiga aan lagu dari karin koox horay u jirtay, isku xigxiga waxa loo isticmaalaa in lagu abuuro koox cusub oo leh inta jeer ee la geliyo habboon oo loo calaamadeeyay sidii loo isticmaalay.Soo-celinta waxay dhammaanaysaa marka isku xigxig kasta oo geliyo la isticmaalo si loo sameeyo koox cusub ama lagu dari karo koox hore u jirtay.Ka dib oo dhan, gelinta kooxeed ee ka kooban nucleotide ayaa ugu dambeyntii loo tarjumay taxanaha peptide (maktabadihii peptide).Natiijadii falanqayntani waa isku-darka gelinta iyo soo noqnoqoshooda u dhigma ee ka kooban tirada akhrinta isku xigta (Jaantuska Dheeraadka ah 2).
Jiilka Motif: Iyada oo ku saleysan liiska peptides gaar ah, maktabad ayaa la sameeyay oo ka kooban dhammaan qaababka amino acids (aa) ee suurtogalka ah sida hoos ku cad.Nidaam kasta oo suurtogal ah oo dhererkiisu yahay 3 ayaa laga soo saaray peptide-ka waxaana lagu daray qaabkeeda ka soo horjeeda maktabadda motif ee caadiga ah oo ka kooban dhammaan qaababka (tripeptides).Maktabadaha ujeedooyinka aadka u soo noqnoqda ayaa la isku xig-xigay oo dib-u-celinta ayaa laga saaray.Dabadeed, tripeptide kasta oo ku yaal maktabadda motif, waxaan hubinnay joogitaankeeda maktabadda annaga oo adeegsanayna aaladaha xisaabinta.Xaaladdan oo kale, inta jeer ee peptide oo ay ku jiraan motif tripeptide ee la helay ayaa lagu daraa oo loo qoondeeyaa motif maktabadda motif ("tirada motifs").Natiijada jiilka motif waa qaab laba-geesood ah oo ka kooban dhammaan dhacdooyinka tripeptides (motifs) iyo qiyamkooda, kuwaas oo ah tirada isku xigxiga ee akhrinta taas oo keenta naqshad u dhiganta marka akhrinta la sifeeyo, la kooxeeyo, oo la turjumo.Metrics sida si faahfaahsan kor loogu sharaxay.
Caadiyan tirada motifs iyo firdhinta u dhiganta: Tirada motifs ee muunad kasta waa la caadiyeeyay iyadoo la isticmaalayo
meesha ni ay tahay tirada akhrinta ka kooban mawduuc i.Markaa, vi waxa ay matalaysaa inta jeer ee la akhriyo (ama peptides) ka kooban motif i muunadda.P-qiimaha tirada aan caadiga ahayn ee motifs ayaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo imtixaanka saxda ah ee Fisher.Marka la eego jaangooyooyinka tirada ujeedooyinka, isku xidhka Spearman ayaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo tirada caadiga ah ee ujeeddooyinka R.
Si loo sawiro waxa ku jira asiidhyada amino-ka meel kasta oo ku yaal maktabadda peptide, waxaa la sameeyay logograms webka 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Marka hore, waxa ku jira asiidhyada amino-ka meel kasta oo ka mid ah 12-mer peptide waxa lagu kaydiyaa matrix 20×12 ah.Ka dib, 1000 peptides oo ka kooban isla amino acid qaraabo ah oo ku jira boos kasta ayaa loo soo saaray qaab isku xigxig ah oo fasta ah waxaana loo bixiyaa sida gelitaanka web-logo 3, kaas oo soo saara muuqaal garaaf ahaan nuxurka amino acid qaraabo ah boos kasta.Maktabad peptide ah oo la siiyay.Si loo sawiro jaangooyooyinka kala duwan ee xogta, khariidado kulaylka ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo qalab gudaha lagu horumariyay oo ku jira R (biosHeatmap, xirmo R aan wali la sii deyn).Dendrogram-yada lagu soo bandhigay khariidadaha kulaylka ayaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo habka ururinta kala sareynta ee Ward oo leh mitirka fogaanta Euclidean.Falanqaynta tirakoobka xogta dhibcaha motif, qiimaha P ee dhibcaha aan caadiga ahayn ayaa la xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo imtixaanka saxda ah ee Fisher.P-qiimaha kaydinta xogta kale ayaa lagu xisaabiyay R iyadoo la isticmaalayo t-tijaabka Ardayga ama ANOVA.
Xididdada phage ee la xushay iyo phages-ka iyada oo aan la gelin ayaa xididka laga duray xididka dabada (2×1010 phages/ xayawaan ku jira 300 μl PBS).Toban daqiiqo ka hor dhiig karka iyo hagaajinta ku xigtay, isla xayawaanka ayaa xididka laga duray 100 μl ee DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 daqiiqo ka dib duritaanka phage, jiirka ayaa lagu shubay wadnaha 50 ml PBS oo ay ku xigto 50 ml 4% PFA/PBS.Muunada maskaxda ayaa sidoo kale lagu hagaajiyay habeenkii 4% PFA/PBS waxaana lagu qooyay 30% sukrose habeenkii 4°C.Muunado ayaa si toos ah u barafoobay isku dhafka OCT.Falanqaynta Immunohistochemical ee shaybaarada la qaboojiyey ayaa lagu sameeyay heerkulka qolka 30 µm cryosections oo lagu xannibay 1% BSA waxaana lagu dhejiyay unugyada ka hortagga polyclonal FITC ee ka soo horjeeda T7 phage (Novus NB 600-376A) at 4 ° C.Ku shub habeen dhaxa.Ugu dambeyntii, qaybaha waxaa lagu dhaqay 3 jeer PBS waxaana lagu baaray mikroskoob laser confocal (Leica TCS SP5).
Dhammaan peptides ee leh nadiifinta ugu yar ee 98% waxaa soo saaray GenScript USA, biotinylated iyo lyophilized.Biotin waxay ku xidhan tahay booska glycine ee saddex-laaban ee dheeraadka ah ee N-terminus.Hubi dhammaan peptides adiga oo isticmaalaya spectrometry mass.
Streptavidin (Sigma S0677) ayaa lagu qasi jiray 5-laab oo u dhigma xad-dhaaf ah biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, ama isku-dar ah (3: 1 ratio) ee biotinylated BACE1 inhibitory peptide iyo BACE1 inhibitory peptide in 5-10% DMSO / incu.1 saac heerkulka qolka kahor duritaanka.Streptavidin-conjugated peptides waxaa lagu duray xididdada 10 mg/kg mid ka mid ah xididdada dabada ee jiirka oo leh dalool maskaxeed.
Isku-duubnaanta dhismayaasha streptavidin-peptide waxaa qiimeeyay ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) ayaa lagu dahaadhay habeenkii 4°C oo leh 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).Ka dib marka la xannibo (xeerka xannibaadda: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) heerkulka qolka 2 saacadood, ku dhaq saxanka leh 0.05% Tween-20 / PBS (dhaqidda dhaqidda) ee 3 Second, CSF iyo 0 shaybaarka plasma, si fiican ayaa loogu daray 0. SF 1:115).Saxanka ayaa markaas lagu duray habeenki 4°C iyada oo la raacayo antibody-ka (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Saddex tillaabo oo dhaqid ah ka dib, streptavidin waxaa lagu ogaadey ku-jiidashada TMB substrate solution (Roche) ilaa 20 daqiiqo.Ka dib joojinta horumarinta midabka 1M H2SO4, cabbir nuugista 450 nm.
Shaqada streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex waxaa lagu qiimeeyay Aβ (1-40) ELISA iyadoo loo eegayo nidaamka soo saaraha (Wako, 294-64701).Si kooban, muunadaha CSF waxaa lagu qasi jiray dareeraha caadiga ah (1:23) waxaana lagu shubay habeenkii 4°C ee taarikada 96-ceelka ah ee lagu dahaadhay BNT77 antibody.Shan tallaabo oo dhaqid ka dib, HRP-conjugated antibody BA27 ayaa lagu daray oo lagu duray 2 saacadood at 4° C., oo ay ku xigto shan tallaabo oo dhaqid ah.Aβ (1-40) waxaa lagu ogaadey ku-tiirsanaanta xalka TMB ee 30 daqiiqo heerkulka qolka.Ka dib markii horumarka midabka lagu joojiyo xalinta joojinta, cabbir nuugista 450 nm.Shaybaarada Plasma-ga ayaa lagu sakhiray soo saarista weji adag ka hor Aβ(1-40) ELISA.Plasma waxaa lagu daray 0.2% DEA (Sigma) oo ku jira saxannada ceelka 96 waxaana lagu duray heerkulka qolka 30 daqiiqo.Ka dib markii si isdaba joog ah loogu dhaqay taarikada SPE (Oasis, 186000679) biyo iyo 100% methanol, shaybaarada balaasmaha ayaa lagu daray taarikada SPE waxaana laga saaray dhammaan dareeraha.Muunado ayaa la dhaqay (marka hore 5% methanol ka dibna 30% methanol) waxaana lagu soo saaray 2% NH4OH/90% methanol.Ka dib markii la qalajiyo eluate ee 55 ° C ee 99 min ee joogtada ah ee N2, shaybaarada ayaa lagu yareeyay dareeraha caadiga ah iyo Aβ (1-40) ayaa lagu qiyaasay sida kor lagu sharaxay.
Sida loo tixraaco maqaalkan: Urich, E. et al.Gaadhida xamuulka ee maskaxda iyadoo la isticmaalayo peptides transit peptides oo lagu aqoonsaday vivo.cilmiga.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB iyo Moos T. U-diridda dawooyinka makromolecular maskaxda iyadoo la isticmaalayo daawaynta la beegsaday.Joornaalka Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., iyo Martinez-Martinez, P. Bixinta daawooyinka peptide iyo borotiinka guud ahaan xannibaadda dhiigga-maskaxda.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Caqabadda dhiigga-maskaxda: cilad ku ah horumarka maandooriyaha maskaxda.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, iyo Byrd, A. Rajada laga qabo hagaajinta gaarsiinta maandooriyaha iyo bartilmaameedka maskaxda iyada oo loo marayo waddada choroid plexus-CSF.Cilmi-baarista Dawooyinka 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Casriyeynta biopharmaceuticals oo leh fardaha Trojan-molecular ee gaarsiinta maskaxda.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-dhexdhexaadinta peptide-ka ee dhex dhexaadinta xannibaadda dhiigga-maskaxda.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. iyo al.Kordhi dhexgalka maskaxda iyo waxtarka unugyada ka-hortagga daweynta iyadoo la adeegsanayo shuttles molecular monovalent.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. iyo al.Transferrin receptor (TfR) gaadiidka ayaa go'aamiya qaadashada maskaxda ee noocyada kala duwanaanshiyaha TfR unugyada difaaca jirka.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).