Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Morfogjeneza e zorrëve të njeriut vendos tiparet e kriptove të mikroarkitekturës 3D të epitelit dhe organizimit hapësinor. Kjo strukturë unike kërkohet për të ruajtur homeostazën e zorrëve duke mbrojtur zonën e qelizave burimore në kriptin bazale nga antigjenet mikrobiale ekzogjene dhe metabolitët e tyre. Sipërfaqja. Prandaj, rikrijimi i strukturave të epitelit 3D është vendimtar për ndërtimin e modeleve të zorrëve in vitro. Veçanërisht, zorra mimetike organike-në-një çip mund të nxisë morfogjenezën spontane 3D të epitelit të zorrëve me funksione fiziologjike të përmirësuara dhe biomekanikë të riprodhueshme protogjene. zorrë në një çip mikrofluidik si dhe në një çip hibrid të ngulitur Transwell. Ne përshkruajmë metoda të detajuara për fabrikimin e pajisjes, kultivimin e Caco-2 ose qelizave organoide të epitelit të zorrëve në mjedise konvencionale si dhe në një platformë mikrofluidike, induksionin e morfogjenezës 3D dhe karakterizimin e protokollimit të shumëfishtë të imazhit 3D të epitelit të epitelit. ure duke kontrolluar rrjedhën e lëngut bazolateral për 5 ditë. Metoda jonë e morfogjenezës in vitro përdor stresin e prerjes fiziologjike përkatëse dhe lëvizjen mekanike dhe nuk kërkon inxhinieri ose manipulim kompleks qelizor, i cili mund të jetë më i mirë se teknikat e tjera ekzistuese. , dhe aplikime farmaceutike.
Eksperimentet tregojnë se qelizat Caco-2 të epitelit të zorrëve të kultivuara në pajisje mikrofluidike të dyfishtë 6,7 mund t'i nënshtrohen morfogjenezës spontane 3D in vitro pa një kuptim të qartë të mekanizmit themelor. Në studimin tonë të fundit, ne zbuluam se heqja e pajisjeve nga kulturat e duhura 3D është e nevojshme për kultura të mjaftueshme për epiagonistët D. morfogjeneza in vitro, e cila është demonstruar nga Caco-2 dhe organoidet e zorrëve që rrjedhin nga pacienti.Qelizat epiteliale u vërtetuan. Në këtë studim, ne u fokusuam në mënyrë specifike në prodhimin e qelizave dhe shpërndarjen e përqendrimit të një antagonisti të fuqishëm Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), në pajisje mikrofluidike të modifikuara që përmbajnë inserte Transwell, të quajtur "Chip hibrid". Proteina e sekretuar e lidhur me kërcitjen 1, ose Soggy-1) në zorrën në çip pengon morfogjenezën ose prish shtresën e epitelit 3D të parastrukturuar, duke sugjeruar se stresi antagonist gjatë kulturës është përgjegjës për morfogjenezën intestinale in vitro. Prandaj, një qasje praktike për të arritur nivele të forta ose të qëndrueshme të ndërfaqes morfogjeniale të epitelit. ndarje anash me shpëlarje aktive (p.sh. në platformat gut-on-a-chip ose hibrid-on-një-chip) ose me difuzion. Media bazolaterale (p.sh. nga futjet Transwell në rezervuarë të mëdhenj bazolateral në puse).
Në këtë protokoll, ne ofrojmë një metodë të detajuar për fabrikimin e mikrodevices të zorrëve-në-a-chip dhe patate të skuqura hibride të pandashme transwell (hapat 1-5) për të kulturuar qelizat epiteliale të zorrëve në polydimethylsiloksan (PDMS) të bazuara në membrana (hapat 6A, 7A, 8, 9) ose membranat polydimetiloksane (PDMS) (Hapat 6B, 8B, 8B, 8B, 8B, 8B, 8B, 8B, 8B, 8B. ESIS in vitro (Hapi 10) .Ne gjithashtu identifikuar tiparet qelizore dhe molekulare treguese të histogjenezës specifike të indeve dhe diferencimit qelizor të varur nga linja duke aplikuar modalitete të shumta imazherie (hapat 11-24 Biokimik estinal dhe riprodhimi i mikro mjedisit biomekanik. Rritja, bashkë-kulturat gjatësore-mikrobiome, infeksioni patogjen, dëmtimi inflamator, mosfunksionimi i barrierës epiteliale dhe terapitë me bazë probiotike shembull.Influences.
Protokolli ynë mund të jetë i dobishëm për një gamë të gjerë shkencëtarësh në një ndikim të gjerë bazë (p.sh., biologjia e mukozës së zorrëve, biologjia e qelizave burimore dhe biologjia e zhvillimit) dhe kërkimi i aplikuar (p.sh. testimi paraklinik i barnave, modelimi i sëmundjeve, inxhinieria e indeve dhe gastroenterologjia). parashikojmë që strategjia jonë teknike mund t'i shpërndahet audiencës që studion dinamikën e sinjalizimit të qelizave gjatë zhvillimit të zorrëve, rigjenerimit ose homeostazës. Për më tepër, protokolli ynë është i dobishëm për marrjen në pyetje të infeksionit nën agjentë të ndryshëm infektivë si Norovirus 8, Sindroma e Rënda Akut Respiratore, Coronavirus 2 (SARS-CoV-Salle, striofiolla). kolera.Audiencat e patologjisë dhe patogjenezës së sëmundjes janë gjithashtu të dobishme. Përdorimi i një sistemi mikrofiziologjik të zorrëve në çip mund të lejojë bashkëkulturimin gjatësor 10 dhe vlerësimin pasues të mbrojtjes së bujtësit, përgjigjeve imune dhe riparimit të lëndimeve të lidhura me patogjenin në traktin gastrointestinal (GI) 11 . Çrregullime të tjera të traktit gastrointestinal të lidhura me sëmundjen sindromë të lëngjeve, sëmundjet cerroulike pouchiti, ose sindroma e zorrës së irrituar mund të simulohet kur shtresat epiteliale të zorrëve 3D përgatiten duke përdorur shtresat epitelit të zorrëve 3D të pacientit, këto sëmundje përfshijnë atrofinë e vileve, shkurtimin e kriptës, dëmtimin e mukozës ose dëmtimin e pengesës epiteliale. Biopsia1 ose kompleksi më i lartë i epitelit1 në testin e qelizave. mjedisi i sëmundjes, lexuesit mund të marrin në konsideratë shtimin e llojeve të qelizave të lidhura me sëmundjen, të tilla si qelizat mononukleare të gjakut periferik të pacientit (PBMCs), në modelet që përmbajnë mikroarkitektura 3D të vileve të zorrëve.qelizat imune specifike të indeve, 5.
Meqenëse mikrostruktura epiteliale 3D mund të fiksohet dhe vizualizohet pa procesin e seksionit, shikuesit që punojnë në transkriptomikën hapësinore dhe imazhet me rezolucion të lartë ose super-rezolucion mund të jenë të interesuar në hartimin tonë të dinamikës hapësinore-kohore të gjeneve dhe proteinave në nyjet epiteliale.I interesuar për teknologjinë. Përgjigjja ndaj stimujve mikrobialë ose imunitarë. Për më tepër, ndërthurja gjatësore strehuese-mikrobiome 10, 14 që koordinon homeostazën e zorrëve mund të vendoset në shtresën 3D të mukozës së zorrëve duke bashkëkulturuar specie të ndryshme mikrobike, komunitete mikrobike ose në zorrët mikrobiotike fekale.në platformë. Kjo qasje është veçanërisht tërheqëse për audiencën që studion imunologjinë e mukozës, gastroenterologjinë, mikrobiomën e njeriut, kulturomikën dhe mikrobiologjinë klinike që kërkojnë të kultivojnë mikrobiotë të zorrëve të pakulturuara më parë në laborator. Nëse protokolli ynë i morfogjenezës in vitro mund të përshtatet me formate të shkallëzueshme të kulturës 6 ose në formate të shumta kulture 2948, në mënyrë të përsëritur48. në ndarjet anash, protokolli mund të shpërndahet edhe tek ata që zhvillojnë platforma ekzaminimi ose vlefshmërie farmaceutike, biomjekësore ose me performancë të lartë për industrinë ushqimore. Si dëshmi e parimit, së fundmi ne demonstruam mundësinë e një sistemi morfogjenezë të shumëfishtë të përçueshmërisë së lartë të shkallëzueshme në një format komerciale1, të shtuara1, në një format të shumëfishtë pjatë. Prandaj, vërtetimi i metodës sonë të morfogjenezës in vitro mund të përshpejtohet dhe të miratohet potencialisht nga shumë laboratorë kërkimi, industri ose qeveri dhe agjenci rregullatore për të kuptuar riprogramimin qelizor të morfogjenezës in vitro të zorrëve në nivelin transkriptomik për të testuar barnat ose bioterapeutikë. riprodhueshmëria e procesit të morfogjenezës së zorrëve.
Një numër i kufizuar modelesh eksperimentale të lidhura me njerëzit janë përdorur për të studiuar morfogjenezën e epitelit të zorrëve, kryesisht për shkak të mungesës së protokolleve të zbatueshme për të nxitur morfogjenezën 3D in vitro. Në fakt, shumë nga njohuritë aktuale rreth morfogjenezës së zorrëve bazohen në studimet e kafshëve (p.sh., zebrafish20, mice21 ose pulat mund të jenë më të kushtueshme dhe më të kushtueshme, dhe pulat janë më të kushtueshme22). e rëndësishmja, mos i përcaktojnë saktësisht proceset e zhvillimit njerëzor. Këto modele janë gjithashtu shumë të kufizuara në aftësinë e tyre për t'u testuar në një mënyrë të shkallëzueshme shumë-mënyre. Prandaj, protokolli ynë për rigjenerimin e strukturave të indeve 3D in vitro tejkalon modelet e kafshëve in vivo, si dhe modelet e tjera tradicionale statike statike 2D, lejoi ekzaminimin e strukturave të ndryshme të kulturave qelizore 2D, të përshkruara më parë, boshti kripto-villus në përgjigje të stimujve të ndryshëm mukozale ose imune. Shtresat epiteliale 3D mund të ofrojnë një hapësirë ​​për të studiuar se si qelizat mikrobike konkurrojnë për të formuar nyjet hapësinore dhe evolucionin ekologjik në përgjigje të faktorëve strehues (p.sh., shtresat e brendshme kundrejt mukozës së jashtme, sekretimi i IgA-së dhe peptidet antimikrobiale mund të kuptojnë sesi mund të kuptojnë më shumë peptide antimikrobiale. strukturon bashkësitë e tij dhe prodhon në mënyrë sinergjike metabolitë mikrobiale (p.sh., acidet yndyrore me zinxhir të shkurtër) që formojnë organizimin qelizor dhe nyjet e qelizave burimore në kriptet bazale. Këto karakteristika mund të demonstrohen vetëm kur shtresat epiteliale 3D vendosen in vitro.
Përveç metodës sonë të krijimit të strukturave 3D të epitelit të zorrëve, ekzistojnë disa metoda in vitro. Kultura organoidale e zorrëve është një teknikë moderne e inxhinierisë së indeve e bazuar në kultivimin e qelizave staminale të zorrëve në kushte specifike morfogjene23,24,25. Megjithatë, përdorimi i modeleve organoide 3D është shpeshherë për analizën e përbashkët të strehuesit. të mbyllura brenda organoidit dhe, për rrjedhojë, futja e komponentëve luminal si qelizat mikrobike ose antigjenet ekzogjene është e kufizuar.Qasja në lumenët organoidë mund të përmirësohet duke përdorur një mikroinjektor,26,27, por kjo metodë është invazive dhe kërkon punë intensive dhe kërkon njohuri të specializuara për t'u kryer. Për më tepër, kulturat tradicionale organoide të mbajtura në skelat hidrogel në kushte statike nuk pasqyrojnë me saktësi biomekanikën aktive in vivo.
Qasje të tjera të përdorura nga disa grupe kërkimore përdorin skela 3D të parastrukturuara me hidrogel për të imituar strukturën epiteliale të zorrëve duke kultivuar qeliza të izoluara të zorrëve të njeriut në sipërfaqen e xhelit. Fabrikoni skela hidrogeli duke përdorur skela të printuara 3D, mikro të bluara ose litografike me kallëpe të prodhuara në mënyrë pitografike. gradientët, duke krijuar një strukturë të epitelit me raport të lartë të aspektit dhe ndërthurje stroma-epiteliale duke përfshirë qelizat stromale në skelë. Megjithatë, natyra e skelave të parastrukturuara mund të parandalojë shfaqjen e vetë procesit morfogjenetik spontan. Këto modele gjithashtu nuk sigurojnë rrjedhje dinamike luminale, apo stresuese për qelizat luminale dhe intersticiale që nuk kanë nevojë për rrjedhjen e qelizave nën testim. Funksioni fiziologjik.Një studim tjetër i fundit përdori skela hidrogeli në një platformë mikrofluidike dhe strukturat e epitelit të zorrëve të modeluara duke përdorur teknika të gdhendjes me lazer. Organoidet e zorrëve të miut ndjekin modele të gravuara për të formuar struktura tubulare të zorrëve dhe rrjedha e lëngut intraluminal nuk mund të ripërmbledhet duke përdorur një modul mikrofluidues spanjoll e gut. Lëvizjet mekanobiologjike. Teknikat e printimit 3D nga i njëjti grup ishin në gjendje të krijonin tuba të zorrëve në miniaturë me procese morfogjenetike spontane. Pavarësisht nga fabrikimi kompleks i segmenteve të ndryshme të zorrëve brenda tubit, këtij modeli i mungon gjithashtu rrjedha e lëngut luminal dhe deformimi mekanik. Për më tepër, funksionueshmëria e modelit mund të jetë e kufizuar, veçanërisht pas kushteve të plotësimit të procesit të printimit bqelizor. Në vend të kësaj, protokolli ynë i propozuar ofron morfogjenezë spontane të zorrëve, stres fiziologjikisht të rëndësishëm në prerje, biomekanikë që imitojnë lëvizshmërinë e zorrëve, aksesueshmërinë e ndarjeve të pavarura apikale dhe bazolaterale dhe rikrijimin e mikromjediseve komplekse biologjike të modularitetit. Prandaj, metodat tona in vitro të kompletimit 3D mund të ofrojnë një qasje të protokollit të kompletimit të morfogjenezës 3D ekzistuese.
Protokolli ynë është tërësisht i fokusuar në morfogjenezën epiteliale 3D, me vetëm qeliza epiteliale në kulturë dhe pa lloje të tjera qelizash përreth, si qelizat mezenkimale, qelizat endoteliale dhe qelizat imune. Siç u përshkrua më parë, thelbi i protokollit tonë është induksioni i morfogjenezës epiteliale duke hequr morfogjenin modulues në frenuesit bazë të mezeobusit anësor. gut-në-një-chip dhe hibrid-në-një-chip na lejon të rikrijojmë shtresën e valëzuar 3D epiteliale, kompleksitete shtesë biologjike si ndërveprimet epiteliale-mezenkimale33,34, depozitimi i Matricës jashtëqelizore (ECM) 35 dhe, në modelin tonë, kripto-villus kriptomë në qelizat e kripteve të qelizave, duke i konsideruar më tej tiparet e kriptograve. fibroblastet) në mesenkimë luajnë një rol kyç në prodhimin e proteinave ECM dhe rregullimin e morfogjenezës intestinale in vivo35,37,38. Shtimi i qelizave mezenkimale në modelin tonë rriti procesin morfogjenetik dhe efikasitetin e lidhjes qelizore. Shtresa endoteliale (dmth., kapilarët ose roli i rëndësishëm i transportit të qelizave limfatike490, kapilarët dhe limfatikët30 luan një rol të rëndësishëm transportues të qelizave mezenkimale). në mikromjedisin e zorrëve. Për më tepër, komponentët e enëve të gjakut që mund të lidhen midis modeleve të indeve janë një parakusht kur modelet e indeve janë krijuar për të demonstruar ndërveprime me shumë organe. Prandaj, qelizat endoteliale mund të kenë nevojë të përfshihen për të modeluar veçori fiziologjike më të sakta me rezolucion të nivelit të organit. k, dhe imuniteti specifik për indet në kontekstin e imitimit të sëmundjes së zorrëve.
Përdorimi i çipave hibride është më i thjeshtë se sa gut-on-a-chip sepse konfigurimi i pajisjes është më i thjeshtë dhe përdorimi i inserteve Transwell lejon kultivimin e shkallëzuar të epitelit të zorrëve. Megjithatë, futjet e transwellit të disponueshëm në treg me membrana poliester nuk janë elastike dhe nuk mund të simulojnë lëvizjet e ngjashme me peristaltikën, të vendosura në stacionin e mëtejshëm të pusit. pa sforcim prerës në anën apikale. Është e qartë se vetitë statike në ndarjen apikale rrallë mundësojnë bashkëkulturim afatgjatë bakterial në çipat hibride. Ndërsa ne mund të nxisim me forcë morfogjenezën 3D në futjet Transwell kur përdorim çipat hibride, mungesa e çipave hibride mund të kufizojë potencialin fiziologjikisht të përshtatshëm të platformës së biomekanikës dhe rrjedhës së lëngjeve.
Rindërtimet në shkallë të plotë të boshtit të kriptos-villus njerëzore në kulturat zorrë-në-chip dhe hibride-në-chip nuk janë krijuar plotësisht. Meqenëse morfogjeneza fillon nga një shtresë e vetme epiteliale, mikroarkitekturat 3D nuk ofrojnë domosdoshmërisht ngjashmëri morfologjike me kriptat në domenin e mikrokriptit në qelizën mikrokriptuese që kemi krijuar afër. epiteli 3D i injektuar, kripti dhe rajonet vilë nuk ishin të përcaktuara qartë. Megjithëse kanalet e sipërme më të larta në çip çojnë në rritjen e lartësisë së epitelit të mikroinxhinieruar, lartësia maksimale është ende e kufizuar në ~ 300-400 µm. Thellësia aktuale e lartësisë së zorrëve të njeriut në lidhje me lartësinë e zorrëve të njeriut në kriptin e vogël dhe 1 ~0 në testin e vogël dhe 1~0 e vileve të zorrëve të vogla është ~600 µm41.
Nga pikëpamja imazherike, imazhet in situ me rezolucion super të mikroarkitekturave 3D mund të kufizohen në zorrë në një çip, pasi distanca e kërkuar e punës nga thjerrëza objektive në shtresën epiteliale është në rendin e disa milimetrave. Për të kapërcyer këtë problem, mund të kërkohet një objektiv i largët. Për më tepër, bërja e seksioneve të hollësishme specifike të imazheve për shkak të PD është e nevojshme. për më tepër, duke qenë se mikrofabrikimi shtresë-pas-shtresë i zorrëve në një çip përfshin ngjitjen e përhershme midis secilës shtresë, është jashtëzakonisht sfiduese të hapet ose hiqet shtresa e sipërme për të ekzaminuar strukturën sipërfaqësore të shtresës epiteliale. Për shembull, duke përdorur një mikroskop elektronik skanues (SEM).
Hidrofobia e PDMS ka qenë një faktor kufizues në studimet me bazë mikrofluidike që kanë të bëjnë me molekula të vogla hidrofobike, pasi PDMS mund të absorbojë në mënyrë jospecifike molekula të tilla hidrofobike. Alternativat ndaj PDMS mund të konsiderohen me materiale të tjera polimerike. Përndryshe, modifikimi i sipërfaqes së PDMS (p.sh., mbulimi me polilipen 4) minimizuar adsorbimin e molekulave hidrofobike.
Së fundi, metoda jonë nuk është karakterizuar mirë në aspektin e ofrimit të një kontrolli të lartë të performancës ose një platforme eksperimentale miqësore për përdoruesit. Protokolli aktual kërkon një pompë shiringe për mikropajisje, e cila zë hapësirë ​​në një inkubator CO2 dhe parandalon eksperimentet në shkallë të gjerë. Ky kufizim mund të përmirësohet ndjeshëm nga shkallëzueshmëria e formateve 24 ose 8 Well, 9 Well, innov. inserte poroze që lejojnë rimbushjen dhe heqjen e vazhdueshme të mediave bazolaterale).
Për të nxitur morfogjenezën 3D të epitelit të zorrëve të njeriut in vitro, ne përdorëm një pajisje intestinale mikrofluidike me çip që përmban dy mikrokanale paralele dhe një membranë poroze elastike në mes, për të krijuar një ndërfaqe lumen-kapilar. Ne demonstrojmë gjithashtu përdorimin e një pajisjeje mikrofluidike me një kanal të vazhdueshëm (një çip hibrid në shtresat e poshtme të rritjes pohehelare) Në të dy platformat, morfogjeneza e qelizave të ndryshme të epitelit të zorrëve të njeriut mund të demonstrohet duke aplikuar manipulimin e drejtimit të rrjedhës për të hequr antagonistët morfogjen nga pjesa bazolaterale. E gjithë procedura eksperimentale (Figura 1) përbëhet nga pesë pjesë: (i) mikrofabrikimi i çipit të zorrëve ose preparati Transwellste insertable inpithel1 inpithel qelizat (qelizat Caco-2) ose organoidet e zorrëve të njeriut;kutitë 2-5), (iii) kultura e qelizave epiteliale të zorrëve në patate të skuqura të zorrëve ose patate të skuqura hibride (hapat 6-9), (iv) induksioni i morfogjenezës 3D in vitro (hapi 10) dhe (v)) për të karakterizuar mikrostrukturën e epitelit 3D (hapat 11-24 ishin të dizajnuara më tej efektivisht në grupin e duhur të epitelit). morfogjeneza in vitro duke krahasuar morfogjenezën epiteliale me kontrollet hapësinore, kohore, të kushtëzuara ose procedurale.
Ne përdorëm dy platforma të ndryshme kulture: gut-në-një çip me kanale të drejta ose kanale të ndërlikuara jolineare, ose çipa hibride që përmbajnë futje Transwell (TW) në një pajisje mikrofluidike, të fabrikuar siç përshkruhet në Kutinë 1, dhe hapi 1 -5 "Fabrikimi i pajisjes" tregon hapat kryesorë në bërjen e një çipi të vetëm ose të një çipi të vetëm celulin C të shpjeguar në "Celullin e çipeve". aco-2 ose organoidet intestinale të njeriut) dhe procedura e kultivimit të përdorur në këtë protokoll."Morfogjeneza in vitro" tregon hapat e përgjithshëm në të cilët Caco-2 ose qelizat epiteliale me prejardhje nga organoidet kultivohen në një çip të zorrëve ose në insertet Transwell të një çipi hibrid, të ndjekur nga induksioni i arkës 3D. shembuj se si mund të përdoren shtresat e epitelit të zorrëve të vendosura, për shembull, në karakterizimin e diferencimit të qelizave, studimet e fiziologjisë së zorrëve, krijimin e ekosistemeve të mikrobiomit bujtës dhe modelimin e sëmundjeve. Imazhet e imunofluoreshencës në "Diferencimi i qelizave" që tregojnë bërthamat, F-aktinën dhe MUC3D në shtresën e çipit të zorrëve2 të shprehura në çipin e cakut2. është e pranishme në qelizat kupë dhe mukusin e sekretuar nga sipërfaqet e mukozës. Imazhet fluoreshente në Fiziologjinë e zorrëve tregojnë mukusin e prodhuar nga ngjyrosja për mbetjet e acidit sialik dhe N-acetilglukozaminës duke përdorur aglutininën fluoreshente të embrionit të grurit. Dy imazhet e mbivendosura në "Paneli Host-Microbe" në "Paneli përfaqësues i mikrobit në co-kulturën e majtë" tregon bashkëkulturën e E. coli që shpreh proteinën e gjelbër fluoreshente (GFP) me qelizat epiteliale 3D Caco-2 të mikroinxhinierizuara. Paneli i djathtë tregon lokalizimin e GFP E. coli të bashkëkulturuar me qelizat epiteliale 3D Caco-2, e ndjekur nga ngjyrosja e imunofluoreshencës me F-modelin e shëndoshë. Inflamacioni i zorrëve në zorrë patate të skuqura nën sfidën fiziologjike me antigjenet bakteriale (p.sh., lipopolisakaridet, LPS) dhe qelizat imune (p.sh. PBMC;jeshile). Qelizat Caco-2 u kultivuan për të krijuar një shtresë epiteliale 3D. Shiriti i shkallës, 50 µm. Imazhet në rreshtin e poshtëm: "Diferencimi i qelizave" përshtatur me lejen nga referenca.2.Oxford University Press;Riprodhuar me leje nga Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” përshtatur me leje nga ref.3.NAS;“Modelimi i sëmundjes” i përshtatur me leje nga referenca.5.NAS.
Si çipat gut-në-çip ashtu edhe ato hibride janë fabrikuar duke përdorur kopje PDMS që janë çformuar nga kallëpe silikoni me litografi të butë1,44 dhe janë modeluar me SU-8. Dizajni i mikrokanaleve në secilin çip përcaktohet duke marrë parasysh hidrodinamikën si stresi i prerjes dhe presioni hidrodinamik1,4,12. Dizajni origjinal i të dhënave Figx1 të vendosura pranë mikrokanaleve të drejta paralele, është evoluar në një kompleks të zorrëve në një çip (Të dhënat e zgjeruara Fig. 1b) që përfshin një palë mikrokanale të lakuara për të nxitur rritjen e kohës së qëndrimit të lëngut, modele jolineare të rrjedhës dhe deformim shumëboshtor të qelizave të kultivuara (Fig. 2a. 2a. mund të zgjidhen on-a-chips. Ne kemi demonstruar se Gut-Chip i ndërlikuar gjithashtu indukton fuqishëm morfogjenezën 3D në një kornizë kohore të ngjashme me një shkallë të ngjashme të rritjes së epitelit krahasuar me origjinalin Gut-Chip, pavarësisht nga lloji i qelizës së kultivuar. Prandaj, për të nxitur morfogjenezën 3D. Modelet SU-8 dhanë karakteristika negative pas çmontimit (Fig.2a). Për të fabrikuar zorrët në një çip, shtresa e sipërme e përgatitur PDMS u lidh në mënyrë sekuenciale me një film transporoz PDMS dhe më pas u rreshtua me shtresën e poshtme PDMS me anë të lidhjes së pakthyeshme duke përdorur një trajtues korona (Fig. 2b–f). Për të fabrikuar çipat hibride, kopjet e PDMS të kuruara mund të lidheshin me pajisje mikro-flukse të vetme në qelq. s (Fig. 2h dhe të dhëna të zgjeruara Fig. 2). Procesi i lidhjes kryhet duke trajtuar sipërfaqet e replikës PDMS dhe qelqit me plazmën e oksigjenit ose trajtimin e koronës. Pas sterilizimit të pajisjes së mikrofabrikuar të bashkangjitur në tubin e silikonit, konfigurimi i pajisjes ishte gati për të kryer morfogjenezën 3D inpithelium të Fig.
a, ilustrim skematik i përgatitjes së pjesëve PDMS nga kallëpe silikoni me model SU-8. Tretësira e patrajtuar e PDMS u derdh në një kallëp silikoni (majtas), u tha në 60 °C (në mes) dhe u çformua (djathtas). PDMS e çformuar u pre në copa dhe u pastrua për përdorim të mëtejshëm. kallëp i përdorur për të fabrikuar membranën poroze PDMS.d, Një seri fotografish të përbërësve të sipërm dhe të poshtëm PDMS dhe pajisjes së montuar të zorrëve në çip.e, Skema e shtrirjes së komponentëve të sipërm, membranës dhe të poshtme PDMS. Çdo shtresë është e lidhur në mënyrë të pakthyeshme nga plazma, pajisja e volitshme e koronës. ed mikrokanalet dhe dhomat e vakumit.g, Vendosja e zorrëve në një çip për kulturën e qelizave mikrofluidike. Zorrët e fabrikuara në një çip të montuar me një tub silikoni dhe shiringë u vendosën në një kapak. dhe morfogjenezën 3D duke përdorur çipa hibride. Insertet Transwell të përgatitura në mënyrë të pavarur për të kultivuar monoshtresat 2D të qelizave epiteliale të zorrëve u futën në çipin hibrid për të nxitur morfogjenezën 3D të zorrëve. Mjeti perfuzohet përmes mikrokanaleve nën shtresën qelizore të vendosur në shtresën e referencës së pusit transmetues 1 cm1.Elsevier.
Në këtë protokoll, linja qelizore Caco-2 dhe organoidet e zorrëve u përdorën si burime epiteliale (Fig. 3a). Të dy llojet e qelizave u kultivuan në mënyrë të pavarur (Kutia 2 dhe Kutia 5) dhe u përdorën për të mbjellë mikrokanalet e veshura me ECM të inserteve të zorrëve në çip ose Transwell. pasazhet 10 dhe 50) në balonat T mblidhen për të përgatitur suspensione qelizore të disociuara me anë të lëngut tripsinizues (kutia 2). Organoidet intestinale të njeriut nga biopsitë intestinale ose rezeksionet kirurgjikale u kultivuan në kupolat e skelës Matrigel në pllaka me 24 pusi, për të mbështetur strukturën e strukturës mortore. pondin, dhe Noggin) dhe faktorët e rritjes të përgatitur siç përshkruhet në Kutinë 3 u plotësuan çdo ditë të dytë derisa organoidet u rritën në ~ 500 µm në diametër. Organoidet e rritura plotësisht mblidhen dhe shpërndahen në qeliza të vetme për t'u mbjellë në zorrë ose inserte Transwell në një çip (Kutia 5). Siç kemi raportuar më parë, sëmundja cerulative mund të jetë e ndryshme sipas llojit 13 sëmundje. , kanceri kolorektal ose dhuruesi normal), vendi i lezionit (p.sh., lezioni kundrejt zonës jo të dëmtuar) dhe vendndodhjen gastrointestinale në trakt (p.sh. duoden, jejunum, ileum, cekum, zorrë të trashë ose rektum). Ne ofrojmë një protokoll të optimizuar në Kutinë 5 për kultivimin e përqendrimeve të zorrëve të vogla që zakonisht kërkojnë organoidë të vegjël (koloidë) të organoideve më të vogla (koloide).
a, Rrjedha e punës për induktimin e morfogjenezës së zorrëve në çipin e zorrëve. Epiteli intestinal i njeriut Caco-2 dhe organoidet intestinale përdoren në këtë protokoll për të demonstruar morfogjenezën 3D. Qelizat e izoluara të epitelit u mbollën në pajisjen e përgatitur zorrë mbi një çip (përgatitja e çipit). Pasi qelizat MS janë ngjitur (mbi qelizat PD). membrana në ditën 0 (D0), fluksi apikal (AP) fillon dhe mbahet për 2 ditët e para (rrjedha, AP, D0-D2). Rrjedha bazolaterale (BL) fillon gjithashtu së bashku me lëvizjet ciklike të shtrirjes (shtrirje, rrjedhje, AP dhe BL) kur formohet një shtresë e plotë 2D spanjolle e një kulture të plotë 2D pas 3 ditëve mormogjene të fluksit intestinal. fogjeneza, D5). Imazhet e kontrastit të fazës tregojnë morfologjinë përfaqësuese të qelizave Caco-2 në çdo hap eksperimental ose pikë kohore (grafiku me shtylla, 100 μm). Katër diagrame skematike që ilustrojnë kaskadat përkatëse të morfogjenezës së zorrëve (lart djathtas). Shigjetat e ndërprera në skemën tregojnë drejtimin e vendosur në sipërfaqen S2 të imazhit të vendosur EMco. ft). Pjesa e brendshme që nxjerr në pah zonën e zmadhuar (kuti me pika të bardha) tregon mikrovilet e rigjeneruara në shtresën 3D Caco-2 (djathtas).c, pamje ballore horizontale e membranave të vendosura Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, e kuqe) dhe membranat kufitare të furçës së vazhdueshme të etiketuara F-aktini (imunofluorizimi i qelizave numerike) dhe çipa testi feta e marrë në ditën 7.f, Imazhe të mbivendosura të imunofluoreshencës që tregojnë shënues për qelizat staminale (LGR5;purpurtë), qelizat e kupës (MUC2; jeshile), F-aktina (gri) dhe bërthamat (cianike) të rritura në patate të skuqura të zorrëve për 3 ditë, përkatësisht (Majtas) dhe organoidë 13-ditore (në mes) në shtresën epitelit. ure (djathtas) e epitelit organoid 3D të vendosur në zorrë në një çip duke ngjyrosur membranën plazmatike me bojë CellMask (djathtas) në ditën e 13 të kulturës. Shiriti i shkallës është 50 μm përveç rasteve kur përcaktohet ndryshe.b Riprintuar me leje nga referenca.2.Oxford University Press;c Përshtatur me lejen nga Referenca.2.Oxford University Press;e dhe f të përshtatura me leje me referencë.12 Sipas licencës Creative Commons CC BY 4.0.
Në zorrë në një çip, është e nevojshme të modifikohet sipërfaqja hidrofobike e membranës poroze PDMS për veshje të suksesshme ECM. Në këtë protokoll, ne aplikojmë dy metoda të ndryshme për të modifikuar hidrofobicitetin e membranave PDMS. Për kultivimin e qelizave Caco-2, aktivizimi i sipërfaqes vetëm nga trajtimi UV/ozon ishte i mjaftueshëm për të reduktuar sipërfaqen e hidrofobisë së membranës PD-2 me membranat PDMS dhe ngjitjen e qelizave hidrofobike të PDMS-2. e.Sidoqoftë, kultura mikrofluidike e epitelit organoid kërkon funksionalizimin e sipërfaqes me bazë kimike për të arritur depozitimin efikas të proteinave ECM duke aplikuar në mënyrë sekuenciale polietileniminën (PEI) dhe glutaraldehidin në mikrokanalet PDMS. Pas modifikimit të sipërfaqes, proteinat ECM u depozituan për të mbuluar gropën e PDMS dhe më pas u futën në qelizat e funksionalizuara të PDMS kultura e qelizave mikrofluidike fillon duke perfuzuar vetëm mediumin në mikrokanalin e sipërm derisa qelizat të formojnë një monoshtresë të plotë, ndërsa mikrokanali i poshtëm ruan kushte statike. Kjo metodë e optimizuar për aktivizimin e sipërfaqes dhe veshjen ECM mundëson lidhjen e epitelit organoid për të nxitur morfogjenezën 3D në sipërfaqen PDMS.
Kulturat transwell gjithashtu kërkojnë veshje ECM përpara mbjelljes së qelizave;megjithatë, kulturat Transwell nuk kërkojnë hapa komplekse para-trajtimi për të aktivizuar sipërfaqen e inserteve poroze. Për rritjen e qelizave Caco-2 në insertet Transwell, veshja ECM në insertet poroze përshpejton ngjitjen e qelizave të disociuara Caco-2 (<1 orë) dhe formimin e barrierës së bashkimit të ngushtë (<1-2 ditë, organoidet e izoluara EC të izoluara në organoidë). inserte, ngjiten në sipërfaqen e membranës (<3 h) dhe ruhen derisa organoidet të formojnë një monoshtrese të plotë me integritet pengues. Kulturat transwell kryhen në pllaka 24 pusesh pa përdorimin e çipave hibride.
Morfogjeneza 3D in vitro mund të inicohet duke aplikuar rrjedhjen e lëngut në aspektin bazolateral të një shtrese të vendosur epiteliale. Në zorrë në një çip, morfogjeneza epiteliale filloi kur mediumi u perfuz në mikrokanalet e sipërme dhe të poshtme (Fig. 3a). Siç është përshkruar më parë, është kritike të futet rrjedhja e vazhdueshme e lëngut ose bit për heqjen e vazhdueshme. ors. Për të siguruar lëndë ushqyese dhe serum të mjaftueshëm për qelizat e lidhura në membranat poroze dhe për të gjeneruar stres të prerjes luminale, ne zakonisht aplikojmë rrjedhje të dyfishtë në zorrë në një çip. Në çipat hibride, insertet transwell që përmbajnë monoshtresa epiteliale u futën në çipat hibride. Më pas, mediumi u aplikua nën insertin e mikrokanalit 3 anësor 5 në anën e pusit bazolateral5. pas fillimit të rrjedhës bazolaterale në të dy platformat e kulturës.
Karakteristikat morfologjike të shtresave të epitelit 3D të mikro-inxhinierizuara mund të analizohen duke aplikuar modalitete të ndryshme imazherike, duke përfshirë mikroskopin e kontrastit fazor, mikroskopin e kontrastit me ndërhyrje diferenciale (DIC), SEM ose mikroskopin konfokal me imunofluoreshencë (Figurat 3 dhe 4). .Për shkak të transparencës optike të filmave PDMS dhe poliestër, të dyja platformat e çipit të zorrëve dhe ato hibride të çipit mund të ofrojnë imazhe në kohë reale në vend pa pasur nevojë për prerje ose çmontim të pajisjes. Kur kryeni imazhe me imunofluoreshencë (Figurat 1, 3c, f dhe 4b të fiksuara tipike me qeliza 4%w, f dhe 4b) e ndjekur nga Triton X-100 dhe 2% (wt/vol) ) albumina e serumit të gjedhit (BSA), sipas radhës. Në varësi të llojit të qelizës, mund të përdoren fiksues të ndryshëm, depërtues dhe agjentë bllokues. Antitrupat parësorë që synojnë shënjuesit e zonës ose qelizës së varur nga linjat e gjakut përdoren për të theksuar qelizat e dyta të imobilizuara së bashku me çipa të dyta, të ndjekura nga një antibiotik i dytë në vend. 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ose F-aktinë (p.sh., falloidina e etiketuar në mënyrë fluoreshente). Imazhi i drejtpërdrejtë i bazuar në fluoreshencë mund të kryhet gjithashtu in situ për të zbuluar prodhimin e mukusit (Fig.1, "Diferencimi i qelizave" dhe "Fiziologjia e zorrëve"), kolonizimi i rastësishëm i qelizave mikrobiale (Fig. 1, "Bashkëkultura pritëse-mikrobe"), rekrutimi i qelizave imune (Fig. 1, 'Modelimi i sëmundjes') ose konturet e 3D të epitelit të modifikuar, duke e ndarë morfologjinë e zorrëve (Fig. 43). për shtresë nga shtresa e poshtme e mikrokanalit, siç përshkruhet në ref. Siç tregohet në Fig. 2, morfologjia e epitelit 3D si dhe mikrovilet në kufirin e furçës apikale mund të vizualizohen me SEM (Fig. 3b). Shprehja e shënuesve të diferencimit mund të vlerësohet duke kryer PCR5 sasiore ose ARN me një qelizë të vetme, në këtë rast, ARN-në gropë të vetme ose ARN-në e qelizave rriten. patate të skuqura brid janë korrur nga tripsinizimi dhe më pas përdoren për analiza molekulare ose gjenetike.
a, Rrjedha e punës për induksionin e morfogjenezës së zorrëve në një çip hibrid. Caco-2 dhe organoidet e zorrëve përdoren në këtë protokoll për të demonstruar morfogjenezën 3D në një platformë çipi hibrid. Qelizat epitelike të disociuara u mbollën në futjet e përgatitura të Transwellit (TW prep; shih figurën e bashkangjitur në membranë dhe u ngjitën në membranë më poshtë). të gjitha qelizat u kulturuan në kushte statike (kultura TW). Pas 7 ditësh, një insert i vetëm Transwell që përmban një shtresë 2D të qelizave epiteliale u integrua në një çip hibrid për të futur një rrjedhje bazolaterale (Flow, BL), e cila përfundimisht çoi në gjenerimin e një epitelial 3D 3D (morfogjeneza e qelizave normale të epitelit të nxjerrë nga tiparet morfologjike të trupit të njeriut). 103 rresht) zorrës së trashë në ngjitje në çdo hap eksperimental ose pikë kohore. Skemat në shtresat e sipërme ilustrojnë konfigurimin eksperimental për çdo hap.b, çipat hibridë (skematika majtas) mund të çojnë në morfogjenezë 3D të qelizave epiteliale organoide me pamje të mikroskopisë konfokale nga lart-poshtë;shih skematikën e djathtë dhe vijat me pika përkatëse).tregoi karakteristika morfologjike të dukshme. F-aktina (cian), bërthama (gri).c, mikrografë konfokale me fluoreshencë (pamje me kënd 3D) të qelizave epiteliale me prejardhje organoide të kultivuara në Transwell statike (TW; futur brenda kutisë së bardhë të ndërprerë) kundrejt çipit hibrid (më e madhe). futur në këndin e sipërm djathtas; "XZ") tregon gjithashtu veçoritë 2D dhe 3D. Shiriti i shkallës, 100 µm.c Riprintuar me leje nga referenca.4.Elsevier.
Kontrollet mund të përgatiten duke kultivuar të njëjtat qeliza (qeliza epiteliale organoide CACO-2 ose zorrëve të zorrëve) në monolayer dy-dimensionale në kushte konvencionale të kulturës statike.
Procesi i litografisë së butë duhet të kryhet në një dhomë të pastër. Për secilën shtresë në çip (shtresat dhe membranat e sipërme dhe të poshtme) dhe çipat hibride, janë përdorur dhe fabrikuara fotomaska ​​të ndryshme në vafera të veçanta silikoni sepse lartësitë e mikrokanaleve ishin të ndryshme. Lartësitë e synuara të mikrokanaleve të sipërme dhe të poshtme të mikrokanaleve të zorrëve në çip janë 500 µm lartësia e kanalit dhe lartësia e objektivit hibrid është rreth 500 µm. 200 μm.
Vendosni një vaferë silikoni 3 inç në një enë me aceton. Rrotulloni butësisht pjatën për 30 sekonda, më pas thajeni me ajër vaferën. Transferoni meshë në një pjatë me IPA, më pas rrotullojeni pjatën për 30 sekonda për ta pastruar.
Një tretësirë ​​piranha (përzierje e peroksidit të hidrogjenit dhe acidit sulfurik të përqendruar, 1:3 (vol/vol)) mund të përdoret opsionalisht për të maksimizuar heqjen e mbetjeve organike nga sipërfaqja e vaferës së silikonit.
Solucioni Piranha është jashtëzakonisht gërryes dhe gjeneron nxehtësi. Janë të nevojshme masa paraprake shtesë të sigurisë. Për hedhjen e mbeturinave, lëreni tretësirën të ftohet dhe transferojeni në një enë mbetjesh të pastër e të thatë. Përdorni kontejnerë dytësorë dhe etiketoni siç duhet kontejnerët e mbetjeve. Ju lutemi ndiqni udhëzimet e sigurisë së objektit për procedura më të detajuara.
Dehidratoni vaferat duke i vendosur në një pjatë të nxehtë 200 °C për 10 minuta. Pas dehidrimit, vafera u tund pesë herë në ajër për t'u ftohur.
Hidhni ~ 10 g fotorezist SU-8 2100 në qendër të vaferës së pastruar të silikonit. Përdorni piskatore për ta përhapur fotorezistin në mënyrë të barabartë në vaferë. Herë pas here vendoseni vaferën në një pjatë të nxehtë 65°C për ta bërë fotorezistencën më pak ngjitëse dhe më të lehtë për t'u përhapur. Mos e vendosni vaferën direkt në pjatën e nxehtë.
SU-8 u shpërnda në mënyrë të barabartë në vaferë duke përdorur veshjen me centrifugim. Programoni një rrotullim hyrës të SU-8 për 5–10 s për t'u përhapur me 500 rpm me një nxitim prej 100 μm/s. Vendosni rrotullimin kryesor për 200 μm trashësi 200 μm, duke arritur modelin e një trashësie prej 1,500 μm (1,500 μm shtresa e sipërme e zorrëve në çip; shih "Hapat kritikë" më poshtë) e vendosur me një përshpejtim prej 300 rpm/s 30 sekonda në 1200 rpm.
Shpejtësia kryesore e centrifugimit mund të rregullohet sipas trashësisë së synuar të modelit SU-8 në vaferën e silikonit.
Për të fabrikuar modele SU-8 me lartësi 500 µm për shtresën e sipërme të zorrëve në çip, veshja e centrifugimit dhe hapat e pjekjes së butë të kësaj Kutie (hapat 7 dhe 8) u përsëritën në mënyrë të njëpasnjëshme (shih hapin 9) për të prodhuar dy shtresa prej 250 µm Një shtresë e trashë SU-8, e cila mund të shtrohet me një shtresë U20 në një shtresë U2 dhe në një shtresë prej U0. lartë.
Piqni butësisht vaferat e veshura me SU-8 duke i vendosur me kujdes vaferat në një pjatë të nxehtë në 65 °C për 5 minuta, më pas ndërroni cilësimin në 95 °C dhe inkuboni për 40 minuta të tjera.
Për të arritur një lartësi prej 500 μm të modelit SU-8 në mikrokanalin e sipërm, përsëritni hapat 7 dhe 8 për të gjeneruar dy shtresa SU-8 me trashësi 250 μm.
Duke përdorur UV Mask Aligner, kryeni një test të llambës sipas udhëzimeve të prodhuesit për të llogaritur kohën e ekspozimit të vaferit. (koha e ekspozimit, ms) = (doza e ekspozimit, mJ/cm2)/(fuqia e llambës, mW/cm2).
Pas përcaktimit të kohës së ekspozimit, vendoseni fotomaskën në mbajtësin e maskës së shtrirësit të maskës UV dhe vendoseni fotomaskën në vaferën e veshur me SU-8.
Vendoseni sipërfaqen e printuar të fotomaskës direkt në anën e veshur me SU-8 të vaferës së silikonit për të minimizuar shpërndarjen e UV-së.
Ekspozoni vaferën dhe fotomaskën e veshur me SU-8 vertikalisht në 260 mJ/cm2 dritë UV për kohën e paracaktuar të ekspozimit (shih hapin 10 të kësaj kutie).
Pas ekspozimit ndaj rrezeve ultraviolet, vaferat e silikonit të veshura me SU-8 u pjekën në 65°C për 5 minuta dhe 95°C për 15 minuta në secilën pjatë të nxehtë për të prodhuar modele me lartësi 200 μm. Zgjatni kohën e pas pjekjes në 95°C në 30 min për të prodhuar modele me lartësi 5000m.
Zhvilluesi derdhet në një enë qelqi dhe vafera e pjekur vendoset në enë. Vëllimi i zhvilluesit SU-8 mund të ndryshojë në varësi të madhësisë së pllakës së qelqit. Sigurohuni që të përdorni mjaftueshëm zhvillues SU-8 për të hequr plotësisht SU-8 të paekspozuar. Për shembull, kur përdorni një enë qelqi me diametër 150 mm me një kapacitet prej 1 L-20L me një kapacitet prej 1 L-20L. një rrotullim i butë.
Shpëlajeni mykun e zhvilluar me ~10 mL zhvillues të freskët të ndjekur nga IPA duke spërkatur tretësirën duke përdorur një pipetë.
Vendoseni vaferën në një pastrues plazma dhe ekspozojeni ndaj plazmës së oksigjenit (gazit atmosferik, presioni i synuar 1 × 10−5 Torr, fuqia 125 W) për 1,5 min.
Vendoseni vaferën në një tharëse me vakum me një rrëshqitës xhami brenda. Vaferat dhe rrëshqitësit mund të vendosen krah për krah. Nëse tharësi me vakum ndahet në disa shtresa nga një pjatë, vendosini rrëshqitësit në dhomën e poshtme dhe vaferat në dhomën e sipërme. Hidhni 100 μL tretësirë ​​triklorosil, 11H2, H2, 1per H) rrëshqitni xhamin dhe aplikoni vakum për silanizim.
Shkrini një shishkë me qeliza të ngrira Caco-2 në një banjë uji 37°C, më pas transferoni qelizat e shkrira në një balonë T75 që përmban 15 mL medium Caco-2 të ngrohur paraprakisht 37°C.
Për të kaluar qelizat e Caco-2 me ~ 90% konfluencë, fillimisht ngrohni mediumin Caco-2, PBS dhe 0,25% tripsinë/1 mM EDTA në një banjë uji 37°C.
Aspironi mjedisin me aspirim me vakum. Lani qelizat dy herë me 5 mL PBS të ngrohtë duke përsëritur aspirimin me vakum dhe duke shtuar PBS të freskët.