Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Morfogjeneza e zorrëve njerëzore krijon tipare të kript-vileve të mikroarkitekturës epiteliale 3D dhe organizimit hapësinor. Kjo strukturë unike është e nevojshme për të ruajtur homeostazën e zorrëve duke mbrojtur vendndodhjen e qelizave staminale në kriptën bazale nga antigjenet mikrobike ekzogjene dhe metabolitët e tyre. Përveç kësaj, vilet e zorrëve dhe mukusi sekretues paraqesin qeliza epiteliale funksionalisht të diferencuara me një barrierë mbrojtëse në sipërfaqen e mukozës së zorrëve. Prandaj, rikrijimi i strukturave epiteliale 3D është thelbësor për ndërtimin e modeleve të zorrëve in vitro. Veçanërisht, zorrët organike mimetike në një çip mund të shkaktojnë morfogjenezë spontane 3D të epitelit të zorrëve me funksione fiziologjike dhe biomekanikë të përmirësuara. Këtu, ne ofrojmë një protokoll të riprodhueshëm për të nxitur fuqishëm morfogjenezën e zorrëve në zorrë në një çip mikrofluidik, si dhe në një çip hibrid të ngulitur Transwell. Ne përshkruajmë metoda të hollësishme për prodhimin e pajisjeve, kultivimin e qelizave epiteliale organoide Caco-2 ose të zorrëve në mjedise konvencionale, si dhe në një platformë mikrofluidike, induksionin e morfogjenezës 3D dhe karakterizimin e qelizave 3D të vendosura. epitelin duke përdorur modalitete të shumëfishta imazherie. Ky protokoll arrin rigjenerimin e mikroarkitekturës funksionale të zorrëve duke kontrolluar rrjedhën e lëngjeve bazolaterale për 5 ditë. Metoda jonë e morfogjenezës in vitro përdor stres prerës fiziologjikisht të rëndësishëm dhe lëvizje mekanike dhe nuk kërkon inxhinieri ose manipulim kompleks qelizor, i cili mund të tejkalojë teknikat e tjera ekzistuese. Ne parashikojmë që protokolli ynë i propozuar mund të ketë implikime të gjera për komunitetin e kërkimit biomjekësor, duke ofruar një metodë për të rigjeneruar shtresat epiteliale 3D të zorrëve in vitro për aplikime biomjekësore, klinike dhe farmaceutike.
Eksperimentet tregojnë se qelizat epiteliale Caco-2 të zorrëve të kultivuara në pajisje mikrofluidike gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ose dyshtresore6,7 mund t'i nënshtrohen morfogjenezës spontane 3D in vitro pa një kuptim të qartë të mekanizmit themelor. Në studimin tonë të fundit, zbuluam se heqja e antagonistëve të morfogjenit të sekretuar bazolateralisht nga pajisjet e kulturës është e nevojshme dhe e mjaftueshme për të nxitur morfogjenezën epiteliale 3D in vitro, gjë që është demonstruar nga Caco-2 dhe organoidet e zorrëve të nxjerra nga pacientët. Qelizat epiteliale u validuan. Në këtë studim, ne u përqendruam posaçërisht në prodhimin qelizor dhe shpërndarjen e përqendrimit të një antagonisti të fuqishëm Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), në zorrën në çip dhe pajisjet mikrofluidike të modifikuara që përmbajnë inserte Transwell, të quajtura "Çip Hibrid". Ne demonstrojmë se shtimi i antagonistëve ekzogjenë Wnt (si DKK-1, represori Wnt 1, proteina 1 e sekretuar e lidhur me frizzled, ose Soggy-1) në zorrën në çip pengon morfogjenezën ose prish shtresën epiteliale 3D të parastrukturuar, duke sugjeruar që stresi antagonist gjatë kulturës është përgjegjës për morfogjenezën e zorrëve in vitro. Prandaj, një qasje praktike për të arritur morfogjenezë të fuqishme në ndërfaqen epiteliale është të hiqen ose të ruhen minimalisht nivelet e antagonistëve Wnt në ndarjen bazolaterale duke shpëlarë aktivisht (p.sh., në platformat zorrë në çip ose hibrid në çip) ose difuzion. Media bazolaterale (p.sh., nga insertet Transwell në rezervuarë të mëdhenj bazolateralë në puse).
Në këtë protokoll, ne ofrojmë një metodë të detajuar për prodhimin e mikropajisjeve gut-on-a-chip dhe çipave hibridë të futshëm në Transwell (hapat 1-5) për të kultivuar qelizat epiteliale të zorrëve në membranat poroze të bazuara në polidimetilsiloksan (PDMS) (hapat 6A, 7A, 8, 9) ose membranat poliester të futjeve Transwell (hapat 6B, 7B, 8, 9) dhe për të induktuar morfogjenezën 3D in vitro (hapi 10). Ne gjithashtu identifikuam tipare qelizore dhe molekulare që tregojnë histogjenezën specifike të indeve dhe diferencimin qelizor të varur nga linja duke aplikuar modalitete të shumëfishta imazherie (hapat 11-24). Ne induktojmë morfogjenezën duke përdorur qeliza epiteliale të zorrëve njerëzore, të tilla si Caco-2 ose organoide të zorrëve, në dy formate kulture me detaje teknike duke përfshirë modifikimin sipërfaqësor të membranave poroze, krijimin e monoshtresave 2D dhe biokimike dhe riprodhimin e mikroambientit biomekanik të zorrëve in vitro. Për të induktuar morfogjenezën 3D nga monoshtresat epiteliale 2D, ne hoqëm. antagonistët e morfogjenit në të dy format e kultivuara duke e derdhur mediumin në ndarjen bazolaterale të kulturës. Së fundmi, ne ofrojmë një përfaqësim të dobisë së një shtrese epiteliale 3D të rigjenerueshme që mund të përdoret për të modeluar rritjen epiteliale të varur nga morfogjeni, bashkëkulturat gjatësore të mikrobiomës pritëse, infeksionin e patogjenit, dëmtimin inflamator, mosfunksionimin e barrierës epiteliale dhe terapitë me bazë probiotike. Shembull. ndikime.
Protokolli ynë mund të jetë i dobishëm për një gamë të gjerë shkencëtarësh në kërkimin bazë (p.sh., biologjia e mukozës së zorrëve, biologjia e qelizave staminale dhe biologjia zhvillimore) dhe kërkimin e aplikuar (p.sh., testimi paraklinik i barnave, modelimi i sëmundjeve, inxhinieria e indeve dhe gastroenterologjia) me ndikim të gjerë. Për shkak të riprodhueshmërisë dhe qëndrueshmërisë së protokollit tonë për të nxitur morfogjenezën 3D të epitelit të zorrëve in vitro, ne parashikojmë që strategjia jonë teknike mund të shpërndahet tek audiencat që studiojnë dinamikën e sinjalizimit qelizor gjatë zhvillimit, rigjenerimit ose homeostazës së zorrëve. Përveç kësaj, protokolli ynë është i dobishëm për hetimin e infeksionit nën agjentë të ndryshëm infektivë si Norovirusi 8, Sindroma e Rëndë Akute Respiratore Koronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ose Vibrio cholerae. Audiencat e patologjisë dhe patogjenezës së sëmundjes janë gjithashtu të dobishme. Përdorimi i një sistemi mikrofiziologjik të zorrëve në çip mund të lejojë bashkë-kulturën gjatësore 10 dhe vlerësimin pasues të mbrojtjes së strehuesit, përgjigjet imune dhe riparimin e dëmtimeve të lidhura me patogjenin në traktin gastrointestinal (GI) 11. Çrregullime të tjera GI të shoqëruara me sindromën e zorrës së rrjedhshme, sëmundjen celiake, sëmundjen e Crohn, kolitin ulceroz, poucitis ose sindromën e zorrës së irritueshme mund të simulohen kur shtresat epiteliale 3D të zorrëve përgatiten duke përdorur shtresat epiteliale 3D të zorrëve të pacientit, këto sëmundje përfshijnë atrofi të vileve, shkurtim të kriptave, dëmtim të mukozës ose barrierë epiteliale të dëmtuar. Biopsi ose organoide të zorrëve të nxjerra nga qelizat staminale 12,13. Për të modeluar më mirë kompleksitetin më të lartë të mjedisit të sëmundjes, lexuesit mund të marrin në konsideratë shtimin e llojeve të qelizave përkatëse të sëmundjes, të tilla si qelizat mononukleare të gjakut periferik të pacientit (PBMC), në modelet që përmbajnë mikroarkitektura 3D të vileve-kriptave të zorrëve. Qeliza imune specifike për indet, 5.
Meqenëse mikrostruktura epiteliale 3D mund të fiksohet dhe vizualizohet pa procesin e prerjes, shikuesit që punojnë në transkriptominë hapësinore dhe imazhe me rezolucion të lartë ose super-rezolucion mund të jenë të interesuar në hartëzimin tonë të dinamikës hapësinore-kohore të gjeneve dhe proteinave në kamare epiteliale. Të interesuar në teknologji. Përgjigje ndaj stimujve mikrobikë ose imunitarë. Për më tepër, kryqëzimi gjatësor mikpritës-mikrobiomë 10, 14 që koordinon homeostazën e zorrëve mund të vendoset në shtresën mukozale 3D të zorrëve duke bashkë-kulturuar specie të ndryshme mikrobike, komunitete mikrobike ose mikrobiotë fekale, veçanërisht në zorrën në çip. në platformë. Kjo qasje është veçanërisht tërheqëse për audiencën që studion imunologjinë mukozale, gastroenterologjinë, mikrobiomën njerëzore, kulturomikën dhe mikrobiologjinë klinike që kërkon të kultivojë mikrobiotën e zorrëve të pakultivuar më parë në laborator. Nëse protokolli ynë i morfogjenezës in vitro mund të përshtatet në formate të shkallëzueshme të kulturës, siç janë futjet me shumë puse në pllaka me 24, 96 ose 384 puse që vazhdimisht plotësojnë ndarjet bazolaterale, protokolli mund të shpërndahet edhe tek ata që zhvillojnë platforma farmaceutike, biomjekësore ose të shqyrtimit ose validimit me rendiment të lartë për industrinë ushqimore. Si një provë e parimit, kohët e fundit demonstruam fizibilitetin e një sistemi të shumëfishtë të morfogjenezës me rendiment të lartë të shkallëzueshëm në një format pllake me 24 puse. Përveç kësaj, produkte të shumëfishta organ-në-çip janë komercializuar16,17,18. Prandaj, validimi i metodës sonë të morfogjenezës in vitro mund të përshpejtohet dhe potencialisht të miratohet nga shumë laboratorë kërkimorë, industri ose qeveri dhe agjenci rregullatore për të kuptuar riprogramimin qelizor të morfogjenezës së zorrëve in vitro në nivelin transkriptomik për të testuar ilaçet ose bioterapeutikë. Thithja dhe transporti i kandidatëve për ilaçe u vlerësua duke përdorur zëvendësues 3D të zorrëve ose duke përdorur modele të personalizuara ose komerciale të organit në çip për të vlerësuar riprodhueshmërinë e procesit të morfogjenezës së zorrëve.
Një numër i kufizuar modelesh eksperimentale relevante për njeriun janë përdorur për të studiuar morfogjenezën epiteliale të zorrëve, kryesisht për shkak të mungesës së protokolleve të zbatueshme për të nxitur morfogjenezën 3D in vitro. Në fakt, shumica e njohurive aktuale rreth morfogjenezës së zorrëve bazohen në studimet mbi kafshët (p.sh., peshqit zebra20, minjtë21 ose pulat22). Megjithatë, ato kërkojnë shumë punë dhe kosto, mund të jenë etikisht të dyshimta dhe, më e rëndësishmja, nuk përcaktojnë saktësisht proceset e zhvillimit njerëzor. Këto modele janë gjithashtu shumë të kufizuara në aftësinë e tyre për t'u testuar në një mënyrë të shkallëzueshme shumëpalëshe. Prandaj, protokolli ynë për rigjenerimin e strukturave të indeve 3D in vitro tejkalon modelet shtazore in vivo, si dhe modelet e tjera tradicionale statike të kulturës qelizore 2D. Siç është përshkruar më parë, përdorimi i strukturave epiteliale 3D na lejoi të shqyrtojmë lokalizimin hapësinor të qelizave të diferencuara në boshtin kript-vilus në përgjigje të stimujve të ndryshëm mukozalë ose imunitarë. Shtresat epiteliale 3D mund të ofrojnë një hapësirë ​​për të studiuar se si qelizat mikrobike konkurrojnë për të formuar kamare hapësinore dhe evolucionin ekologjik në përgjigje të faktorëve pritës (p.sh., të brendshëm kundrejt të jashtëm). shtresat e mukusit, sekretimi i IgA dhe peptidet antimikrobike). Për më tepër, morfologjia epiteliale 3D mund të na lejojë të kuptojmë se si mikrobiota e zorrëve strukturon komunitetet e saj dhe prodhon në mënyrë sinergjike metabolite mikrobike (p.sh., acide yndyrore me zinxhir të shkurtër) që formojnë organizimin qelizor dhe nicat e qelizave staminale në kriptet bazale. Këto karakteristika mund të demonstrohen vetëm kur shtresat epiteliale 3D krijohen in vitro.
Përveç metodës sonë të krijimit të strukturave epiteliale 3D të zorrëve, ekzistojnë disa metoda in vitro. Kultura organoide e zorrëve është një teknikë e inxhinierisë së indeve e teknologjisë së fundit e bazuar në kultivimin e qelizave staminale të zorrëve në kushte specifike të morfogjenit23,24,25. Megjithatë, përdorimi i modeleve organoide 3D për analizën e transportit ose bashkëkulturat mikpritëse-mikrobiomë është shpesh sfiduese sepse lumeni i zorrëve është i mbyllur brenda organoidit dhe, për këtë arsye, futja e komponentëve luminalë si qelizat mikrobike ose antigjenet ekzogjene është e kufizuar. Qasja në lumenët e organoideve mund të përmirësohet duke përdorur një mikroinjektor,26,27 por kjo metodë është invazive dhe kërkon shumë punë dhe kërkon njohuri të specializuara për t'u kryer. Për më tepër, kulturat tradicionale organoide të mbajtura në skela hidrogeli në kushte statike nuk pasqyrojnë me saktësi biomekanikën aktive in vivo.
Qasje të tjera të përdorura nga disa grupe kërkimore përdorin skela hidrogeli 3D të parastrukturuara për të imituar strukturën epiteliale të zorrëve duke kultivuar qeliza të izoluara të zorrëve njerëzore në sipërfaqen e xhelit. Fabrikoni skela hidrogeli duke përdorur forma të printuara në 3D, të mikro-bluara ose të fabrikuara litografikisht. Kjo metodë tregon rregullimin e vetëorganizuar të qelizave epiteliale të izoluara in vitro me gradiente morfogjene fiziologjikisht të rëndësishme, duke krijuar një strukturë epiteliale me raport të lartë aspekti dhe kryqëzim stroma-epitelial duke përfshirë qelizat stromale në skelë. Megjithatë, natyra e skelave të parastrukturuara mund të parandalojë shfaqjen e vetë procesit morfogjenetik spontan. Këto modele gjithashtu nuk ofrojnë rrjedhë dinamike luminale ose intersticiale, duke mos pasur stresin e prerjes së lëngut që qelizat e zorrëve kanë nevojë për t'iu nënshtruar morfogjenezës dhe për të fituar funksion fiziologjik. Një studim tjetër i kohëve të fundit përdori skela hidrogeli në një platformë mikrofluidike dhe modeloi strukturat epiteliale të zorrëve duke përdorur teknika të gdhendjes me lazer. Organoidet e zorrëve të miut ndjekin modele të gdhendura për të formuar struktura tubulare të zorrëve, dhe rrjedha intraluminale e lëngjeve mund të rikapitulohet duke përdorur një moduli i mikrofluidikës. Megjithatë, ky model nuk shfaq as procese morfogjenetike spontane dhe as nuk përfshin lëvizje mekanobiologjike të zorrëve. Teknikat e printimit 3D nga i njëjti grup ishin në gjendje të krijonin tuba miniaturë të zorrëve me procese morfogjenetike spontane. Pavarësisht fabrikimit kompleks të segmenteve të ndryshme të zorrëve brenda tubit, këtij modeli gjithashtu i mungon rrjedha e lëngut luminal dhe deformimi mekanik. Përveç kësaj, funksionueshmëria e modelit mund të jetë e kufizuar, veçanërisht pasi të përfundojë procesi i bioprintimit, duke shqetësuar kushtet eksperimentale ose ndërveprimet qelizë-me-qelizë. Në vend të kësaj, protokolli ynë i propozuar ofron morfogjenezë spontane të zorrëve, stres prerës fiziologjikisht të rëndësishëm, biomekanikë që imiton lëvizshmërinë e zorrëve, aksesueshmërinë e ndarjeve të pavarura apikale dhe bazolaterale dhe rikrijimin e mikroambienteve komplekse biologjike të modularitetit. Prandaj, protokolli ynë i morfogjenezës 3D in vitro mund të ofrojë një qasje plotësuese për të kapërcyer sfidat e metodave ekzistuese.
Protokolli ynë është tërësisht i fokusuar në morfogjenezën epiteliale 3D, me vetëm qeliza epiteliale në kulturë dhe pa lloje të tjera qelizash përreth, siç janë qelizat mezenkimale, qelizat endoteliale dhe qelizat imune. Siç është përshkruar më parë, thelbi i protokollit tonë është induksioni i morfogjenezës epiteliale duke hequr frenuesit e morfogjenit të sekretuar në anën bazolaterale të mjedisit të futur. Ndërsa modulariteti i fuqishëm i zorrës sonë në çip dhe hibridit në çip na lejon të rikrijojmë shtresën epiteliale 3D të valëzuar, kompleksitete të tjera biologjike, siç janë ndërveprimet epiteliale-mezenkimale33,34, depozitimi i Matricës Jashtëqelizore (ECM)35 dhe, në modelin tonë, tiparet e kript-vileve që përcjellin kamare të qelizave staminale në kriptet bazale, mbeten për t'u konsideruar më tej. Qelizat stromale (p.sh., fibroblastet) në mezenkimë luajnë një rol kyç në prodhimin e proteinave ECM dhe rregullimin e morfogjenezës së zorrëve në vivo35,37,38. Shtimi i mezenkimës Qelizat në modelin tonë përmirësuan procesin morfogjenetik dhe efikasitetin e ngjitjes së qelizave. Shtresa endoteliale (domethënë, kapilarët ose limfatikët) luan një rol të rëndësishëm në rregullimin e transportit molekular39 dhe rekrutimin e qelizave imune40 në mikroambientin e zorrëve. Për më tepër, komponentët e enëve të gjakut që mund të lidhen midis modeleve të indeve janë një parakusht kur modelet e indeve janë të dizajnuara për të demonstruar ndërveprime shumë-organesh. Prandaj, qelizat endoteliale mund të duhet të përfshihen për të modeluar tipare më të sakta fiziologjike me rezolucion në nivel organi. Qelizat imune të nxjerra nga pacienti janë gjithashtu thelbësore për shfaqjen e përgjigjeve imune të lindura, prezantimit të antigjenit, ndërveprimit imunitar adaptiv të lindur dhe imunitetit specifik të indeve në kontekstin e imitimit të sëmundjes së zorrëve.
Përdorimi i çipave hibride është më i drejtpërdrejtë sesa sistemi "gut-on-a-chip" sepse konfigurimi i pajisjes është më i thjeshtë dhe përdorimi i inserteve Transwell lejon kulturë të shkallëzuar të epitelit të zorrëve. Megjithatë, insertet Transwell të disponueshme në treg me membrana poliesteri nuk janë elastike dhe nuk mund të simulojnë lëvizje të ngjashme me peristaltikën. Për më tepër, ndarja apikale e insertit Transwell të vendosur në çipin hibrid mbeti stacionare pa stres prerës në anën apikale. Është e qartë se vetitë statike në ndarjen apikale rrallë mundësojnë bashkëkulturë bakteriale afatgjatë në çipat hibride. Ndërsa ne mund të nxisim fuqishëm morfogjenezën 3D në insertet Transwell kur përdorim çipa hibride, mungesa e biomekanikës fiziologjikisht të rëndësishme dhe rrjedhës së lëngut apikal mund të kufizojë mundësinë e platformave të çipave hibride për aplikime të mundshme.
Rindërtimet në shkallë të plotë të boshtit kript-vilus njerëzor në kulturat gut-on-a-chip dhe hibride-on-a-chip nuk janë vërtetuar plotësisht. Meqenëse morfogjeneza fillon nga një shtresë monoepiteliale, mikroarkitekturat 3D nuk ofrojnë domosdoshmërisht ngjashmëri morfologjike me kriptet in vivo. Megjithëse ne karakterizuam popullatën qelizore në rritje pranë domenit bazal të kriptit në epitelin 3D të mikroinxhinieruar, rajonet e kriptit dhe vileve nuk u kufizuan qartë. Megjithëse kanalet e sipërme më të larta në çip çojnë në një lartësi më të madhe të epitelit të mikroinxhinieruar, lartësia maksimale është ende e kufizuar në ~300-400 µm. Thellësia aktuale e kripteve të zorrëve njerëzore në zorrët e holla dhe të mëdha është ~135 µm dhe ~400 µm, përkatësisht, dhe lartësia e vileve të zorrëve të holla është ~600 µm41.
Nga pikëpamja e imazherisë, imazheria in situ me rezolucion super të mikroarkitekturave 3D mund të kufizohet në zorrën në një çip, pasi distanca e kërkuar e punës nga lentja objektive deri te shtresa epiteliale është rreth disa milimetra. Për të kapërcyer këtë problem, mund të kërkohet një objektiv i largët. Për më tepër, krijimi i seksioneve të holla për përgatitjen e mostrës së imazherisë është sfiduese për shkak të elasticitetit të lartë të PDMS. Për më tepër, meqenëse mikrofabrikimi shtresë për shtresë i zorrës në një çip përfshin ngjitje të përhershme midis secilës shtresë, është jashtëzakonisht sfiduese të hapet ose hiqet shtresa e sipërme për të ekzaminuar strukturën sipërfaqësore të shtresës epiteliale. Për shembull, duke përdorur një mikroskop elektronik skanues (SEM).
Hidrofobiciteti i PDMS ka qenë një faktor kufizues në studimet e bazuara në mikrofluid që merren me molekula të vogla hidrofobe, pasi PDMS mund të adsorbojë në mënyrë jo specifike molekula të tilla hidrofobe. Alternativa ndaj PDMS mund të merren në konsideratë me materiale të tjera polimerike. Si alternativë, modifikimi sipërfaqësor i PDMS (p.sh., veshja me materiale lipofile 42 ose poli(etilen glikol) 43) mund të merret në konsideratë për të minimizuar adsorbimin e molekulave hidrofobe.
Së fundmi, metoda jonë nuk është karakterizuar mirë në aspektin e ofrimit të një platforme eksperimentale miqësore për përdoruesit me rendiment të lartë ose "një madhësi për të gjithë". Protokolli aktual kërkon një pompë shiringe për mikropajisje, e cila zë hapësirë ​​në një inkubator CO2 dhe parandalon eksperimentet në shkallë të gjerë. Ky kufizim mund të përmirësohet ndjeshëm nga shkallëzueshmëria e formateve inovative të kulturës (p.sh., futje poroze me 24 puse, 96 puse ose 384 puse që lejojnë rimbushjen dhe heqjen e vazhdueshme të mediave bazolaterale).
Për të nxitur morfogjenezën 3D të epitelit të zorrëve njerëzore in vitro, ne përdorëm një pajisje intestinale me çip mikrofluidik që përmbante dy mikrokanale paralele dhe një membranë poroze elastike midis tyre për të krijuar një ndërfaqe lumen-kapilar. Ne gjithashtu demonstrojmë përdorimin e një pajisjeje mikrofluidike me një kanal të vetëm (një çip hibrid) që siguron rrjedhje të vazhdueshme bazolaterale nën shtresat epiteliale të polarizuara të rritura në insertet Transwell. Në të dyja platformat, morfogjeneza e qelizave të ndryshme epiteliale të zorrëve njerëzore mund të demonstrohet duke aplikuar manipulim të drejtuar të rrjedhës për të hequr antagonistët e morfogjenit nga ndarja bazolaterale. E gjithë procedura eksperimentale (Figura 1) përbëhet nga pesë pjesë: (i) mikrofabrikimi i çipit të zorrëve ose çipit hibrid të insertueshëm Transwell (hapat 1-5; Kutia 1), (ii) përgatitja e qelizave epiteliale të zorrëve (qelizat Caco-2) ose organoideve të zorrëve njerëzore; kutitë 2-5), (iii) kultura e qelizave epiteliale të zorrëve në copa të zorrëve ose copa hibride (hapat 6-9), (iv) induksioni i morfogjenezës 3D in vitro (hapi 10) dhe (v)) për të karakterizuar mikrostrukturën epiteliale 3D (hapat 11-24). Së fundmi, një grup kontrolli i përshtatshëm (i diskutuar më tej më poshtë) u krijua për të vërtetuar efektivitetin e morfogjenezës in vitro duke krahasuar morfogjenezën epiteliale me kontrollet hapësinore, kohore, kushtëzuese ose procedurale.
Ne përdorëm dy platforma të ndryshme kulture: zorrë në çip me kanale të drejta ose kanale jolineare të ndërlikuara, ose çipa hibride që përmbajnë futje Transwell (TW) në një pajisje mikrofluidike, të prodhuara siç përshkruhet në Kutinë 1, dhe hapi 1-5. "Prodhimi i Pajisjes" tregon hapat kryesorë në krijimin e një çipi të vetëm ose një çipi hibrid. "Kultura e Qelizave Epiteliale të Zorrëve të Njeriut" shpjegon burimin e qelizave (Caco-2 ose organoide të zorrëve të njeriut) dhe procedurën e kulturës së përdorur në këtë protokoll. "Morfogjeneza in vitro" tregon hapat e përgjithshëm në të cilët qelizat epiteliale të derivuara nga Caco-2 ose organoide kultivohen në një çip të zorrëve ose në futje Transwell të një çipi hibrid, e ndjekur nga induksioni i morfogjenezës 3D dhe formimi i një strukture epiteliale të karakterizuar. Numri i hapit të programit ose numri i kutisë shfaqet nën çdo shigjetë. Aplikacioni ofron shembuj se si shtresat epiteliale të zorrëve të vendosura mund të përdoren, për shembull, në karakterizimin e diferencimit të qelizave, studimet e fiziologjisë së zorrëve, krijimin e ekosistemeve të mikrobiomës pritëse dhe modelimin e sëmundjeve. Imunofluoreshenca imazhe në "Diferencimi i Qelizave" që tregojnë bërthamat, F-aktinën dhe MUC2 të shprehura në shtresën epiteliale 3D Caco-2 të gjeneruar në çipin e zorrëve. Sinjalizimi MUC2 është i pranishëm në qelizat gotë dhe mukusin e sekretuar nga sipërfaqet mukozale. Imazhet fluoreshente në Fiziologjinë e Zorrëve tregojnë mukusin e prodhuar nga ngjyrosja për acidin sialik dhe mbetjet e N-acetilglukozaminës duke përdorur aglutininën fluoreshente të embrionit të grurit. Dy imazhet mbivendosëse në "Bashkëkulturat e Mikrobit Pritës" tregojnë bashkëkultura përfaqësuese të mikrobiomës pritëse në zorrë në një çip. Paneli i majtë tregon bashkëkulturën e E. coli që shpreh proteinën fluoreshente jeshile (GFP) me qeliza epiteliale 3D Caco-2 të mikroinxhinieruara. Paneli i djathtë tregon lokalizimin e GFP E. coli të bashkë-kultivuar me qeliza epiteliale 3D Caco-2, e ndjekur nga ngjyrosja imunofluoreshente me F-aktinën (e kuqe) dhe bërthamat (blu). Modelimi i sëmundjes ilustron zorrë të shëndetshme kundrejt asaj me rrjedhje në çipat e inflamacionit të zorrëve nën sfidën fiziologjike me antigjene bakteriale (p.sh., lipopolisakaridi, LPS) dhe qelizat imune (p.sh., PBMC; jeshile). Qelizat Caco-2 u kultivuan për të krijuar një shtresë epiteliale 3D. Shiriti i shkallës, 50 µm. Imazhet në rreshtin e poshtëm: "Diferencimi i qelizave" i përshtatur me leje nga referenca.2. Oxford University Press; Riprodhuar me leje nga Ref.5. NAS; "Bashkëkultura Mikrob-Pritës" e përshtatur me leje nga ref.3. NAS; "Modelimi i Sëmundjeve" i përshtatur me leje nga referenca.5. NAS.
Si çipat gut-on-chip ashtu edhe ato hibride u prodhuan duke përdorur kopje PDMS që u çformuluan nga format e silikonit me anë të litografisë së butë1,44 dhe u modeluan me SU-8. Dizajni i mikrokanaleve në secilin çip përcaktohet duke marrë parasysh hidrodinamikën siç janë stresi i prerjes dhe presioni hidrodinamik1,4,12. Dizajni origjinal gut-on-a-chip (Të dhëna të zgjeruara Fig. 1a), i cili përbëhej nga dy mikrokanale të drejta paralele të vendosura pranë njëri-tjetrit, ka evoluar në një gut-on-a-chip kompleks (Të dhëna të zgjeruara Fig. 1b) që përfshin një palë mikrokanale të lakuara për të nxitur kohëzgjatjen e qëndrimit të lëngut në rritje, modele rrjedhjeje jolineare dhe deformim shumëaksial të qelizave të kultivuara (Fig. 2a-f)12. Kur duhet të rikrijohen biomekanika më komplekse të zorrëve, mund të zgjidhen gut-on-a-chip kompleks. Ne kemi demonstruar se Gut-Chip i ndërlikuar gjithashtu nxit fuqishëm morfogjenezën 3D në një kornizë kohore të ngjashme me një shkallë të ngjashme të rritjes epiteliale krahasuar me origjinalin. Gut-Chip, pavarësisht nga lloji i qelizës së kultivuar. Prandaj, për të nxitur morfogjenezën 3D, modelet lineare dhe komplekse të zorrëve në çip janë të këmbyeshme. Replikat e PDMS të kuruara në kallëpe silikoni me modele SU-8 ofruan karakteristika negative pas çmontimit (Fig. 2a). Për të prodhuar zorrën në një çip, shtresa e sipërme e përgatitur e PDMS u lidh në mënyrë sekuenciale me një film poroz PDMS dhe më pas u rreshtua me shtresën e poshtme PDMS me anë të lidhjes së pakthyeshme duke përdorur një trajtues korona (Fig. 2b-f). Për të prodhuar çipa hibridë, replikat e kuruara PDMS u lidhën me rrëshqitëse qelqi për të krijuar pajisje mikrofluidike me një kanal të vetëm që mund të akomodonin futjet Transwell (Fig. 2h dhe të dhëna të zgjeruara Fig. 2). Procesi i lidhjes kryhet duke trajtuar sipërfaqet e replikës PDMS dhe qelqit me plazmë oksigjeni ose trajtim korona. Pas sterilizimit të pajisjes së mikrofabrikuar të bashkangjitur në tubin e silikonit, konfigurimi i pajisjes ishte gati për të kryer morfogjenezën 3D të epitelit të zorrëve (Figura 2g).
a, Ilustrim skematik i përgatitjes së pjesëve PDMS nga kallëpe silikoni me model SU-8. Tretësira e papjekur PDMS u derdh në një kallëp silikoni (majtas), u pjekur në 60 °C (në mes) dhe u çmontua (djathtas). PDMS e çmontuar u pre në copa dhe u pastrua për përdorim të mëtejshëm. b, Fotografi e kallëpit të silikonit të përdorur për të përgatitur shtresën e sipërme të PDMS. c, Fotografi e kallëpit të silikonit të përdorur për të prodhuar membranën poroze PDMS. d, Një seri fotografish të komponentëve të sipërm dhe të poshtëm të PDMS dhe pajisjes së zorrëve të montuar në çip. e, Skema e shtrirjes së komponentëve të sipërm, të membranës dhe të poshtëm të PDMS. Çdo shtresë është e lidhur në mënyrë të pakthyeshme me trajtim plazme ose korona. f, Skema e pajisjes së prodhuar "gut-on-a-chip" me mikrokanale të ndërlikuara të mbivendosura dhe dhoma vakumi. g, Vendosja e "gut-on-a-chip" për kulturën qelizore mikrofluidike. Zorra e prodhuar në një çip të montuar me një tub silikoni dhe shiringë u vendos në një mbulesë. Pajisja e çipit u vendos në kapakun e një enë Petri 150 mm për përpunim. Lidhësi përdoret për të mbyllur tubin e silikonit. h, Pamje vizuale të fabrikimit të çipave hibride dhe morfogjenezës 3D duke përdorur çipa hibridë. Insertet Transwell të përgatitura në mënyrë të pavarur për të kultivuar monoshtresa 2D të qelizave epiteliale të zorrëve u futën në çipin hibrid për të nxitur morfogjenezën 3D të zorrëve. Mediumi perfuzohet përmes mikrokanaleve nën shtresën qelizore të vendosur në insertin Transwell. Shiriti i shkallës, 1 cm. h Ribotuar me leje nga referenca. 4. Elsevier.
Në këtë protokoll, linja qelizore Caco-2 dhe organoidet e zorrëve u përdorën si burime epiteliale (Fig. 3a). Të dy llojet e qelizave u kultivuan në mënyrë të pavarur (Kutia 2 dhe Kutia 5) dhe u përdorën për të mbjellë mikrokanalet e veshura me ECM të zorrëve në çip ose inserteve Transwell. Kur qelizat janë konfluente (>95% mbulim në shishe), qelizat Caco-2 të kultivuara në mënyrë rutinore (midis pasazheve 10 dhe 50) në shishe T mblidhen për të përgatitur pezullime qelizore të disociuara nga lëngu i tripsinizimit (kutia 2). Organoidet e zorrëve njerëzore nga biopsitë e zorrëve ose rezeksionet kirurgjikale u kultivuan në kupola skeleti Matrigel në pllaka me 24 puseta për të mbështetur mikroambientin strukturor. Mjedisi që përmban morfogjene thelbësore (si Wnt, R-spondin dhe Noggin) dhe faktorë rritjeje të përgatitur siç përshkruhet në Kutinë 3 u plotësua çdo ditë tjetër derisa organoidet u rritën në ~500 µm në diametër. Organoidet e rritura plotësisht mblidhen dhe disociohen në qeliza të vetme për mbjellje në zorrë ose futje Transwell në një çip (Kutia 5). Siç e kemi raportuar më parë, mund të diferencohet sipas llojit të sëmundjes12,13 (p.sh. kolit ulceroz, sëmundja e Crohn, kanceri kolorektal ose donatori normal), vendi i lezionit (p.sh., lezioni kundrejt zonës jo të lezionuar) dhe vendndodhjes gastrointestinale në trakt (p.sh., duodenumi, jejunumi, ileumi, cekumi, koloni ose rektumi). Ne ofrojmë një protokoll të optimizuar në Kutinë 5 për kultivimin e organoideve të zorrës së trashë (koloideve) që zakonisht kërkojnë përqendrime më të larta të morfogjenëve sesa organoidet e zorrës së hollë.
a, Rrjedha e punës për induksionin e morfogjenezës së zorrëve në çipin e zorrëve. Epiteli i zorrëve njerëzore Caco-2 dhe organoidet e zorrëve përdoren në këtë protokoll për të demonstruar morfogjenezën 3D. Qelizat epiteliale të izoluara u mbjellën në pajisjen e përgatitur zorrë-në-çip (përgatitja e çipit). Pasi qelizat mbillen (mbjellen) dhe bashkangjiten (bashkëngjiten) në membranën poroze PDMS në ditën 0 (D0), rrjedha apikale (AP) fillon dhe mbahet për 2 ditët e para (rrjedha, AP, D0-D2). Rrjedha bazolaterale (BL) gjithashtu fillon së bashku me lëvizjet ciklike shtrirëse (shtrirje, rrjedha, AP dhe BL) kur formohet një shtresë monolitike e plotë 2D. Morfogjeneza 3D e zorrëve ndodhi spontanisht pas 5 ditësh kulture mikrofluidike (morfogjeneza, D5). Imazhet e kontrastit të fazave tregojnë morfologjinë përfaqësuese të qelizave Caco-2 në çdo hap eksperimental ose pikë kohore (grafik me shufra, 100 µm). Katër diagrama skematike që ilustrojnë kaskadat përkatëse të morfogjenezës së zorrëve (sipër djathtas). Shigjetat e ndërprera në skemë përfaqësojnë drejtimin e rrjedhjes së lëngut. b, Imazh SEM që tregon topologjinë sipërfaqësore të epitelit 3D të vendosur Caco-2 (majtas). Futja që nxjerr në pah zonën e zmadhuar (kutia e bardhë me pika) tregon mikrovilet e rigjeneruara në shtresën 3D Caco-2 (djathtas). c, Pamje horizontale ballore e membranave të Caco-2 3D të vendosura, klaudinës (ZO-1, e kuqe) dhe kufirit të vazhdueshëm me furçë të etiketuar F-aktinë (jeshile) dhe bërthamave (blu). Vizualizimi konfokal i imunofluoreshencës së qelizave epiteliale në çipat e zorrëve. Shigjetat që tregojnë skemën e mesme tregojnë vendndodhjen e planit fokal për secilën pamje konfokale. d, Ecuria kohore e ndryshimeve morfologjike në organoide të kultivuara në një çip të marrë nga mikroskopia me kontrast faze në ditët 3, 7, 9, 11 dhe 13. Futja (sipër djathtas) tregon zmadhimin e lartë të imazhit të dhënë. e, Fotomikrografi DIC e epitelit 3D organoide të vendosur në zorrë në prerjen e marrë në ditën 7. f, Imazhe të mbivendosura të imunofluoreshencës që tregojnë shënjues për qelizat staminale (LGR5; magenta), qelizat gotë (MUC2; jeshile), F-aktinën (gri) dhe bërthamat (cian) të rritura në çipa të zorrëve për 3 ditë, përkatësisht (majtas) dhe organoide 13-ditore (të mesme) në shtresën epiteliale. Shih gjithashtu Figurën 3 të të Dhënave të Zgjeruara, e cila nxjerr në pah sinjalizimin LGR5 pa sinjalizimin MUC2. Imazhe fluoreshente që tregojnë mikrostrukturën epiteliale (djathtas) të epitelit organoid 3D të vendosur në zorrë në një çip duke ngjyrosur membranën plazmatike me ngjyrën CellMask (djathtas) në ditën e 13-të të kulturës. Shiriti i shkallës është 50 μm përveç nëse përcaktohet ndryshe.b Ribotuar me leje nga referenca.2. Oxford University Press; c Përshtatur me leje nga Referenca.2. Oxford University Press; e dhe f përshtatur me leje nga referenca.12 Nën Licencën Creative Commons CC BY 4.0.
Në zorrën e një çipi, është e nevojshme të modifikohet sipërfaqja hidrofobike e membranës poroze PDMS për një veshje të suksesshme të ECM-së. Në këtë protokoll, ne aplikojmë dy metoda të ndryshme për të modifikuar hidrofobicitetin e membranave PDMS. Për kultivimin e qelizave Caco-2, aktivizimi sipërfaqësor vetëm me trajtim UV/ozon ishte i mjaftueshëm për të zvogëluar hidrofobicitetin e sipërfaqes së PDMS-së, për të veshur ECM-në dhe për të bashkangjitur qelizat Caco-2 në membranën PDMS. Megjithatë, kultura mikrofluidike e epitelit organoid kërkon funksionalizim sipërfaqësor të bazuar në kimikate për të arritur depozitim efikas të proteinave ECM duke aplikuar në mënyrë sekuenciale polietileiminë (PEI) dhe glutaraldehidë në mikrokanalet PDMS. Pas modifikimit të sipërfaqes, proteinat ECM u depozituan për të mbuluar sipërfaqen e funksionalizuar të PDMS-së dhe më pas u futën në epitelin e izoluar organoid. Pasi qelizat të jenë bashkangjitur, kultura qelizore mikrofluidike fillon duke perfuzuar vetëm mediumin në mikrokanalin e sipërm derisa qelizat të formojnë një monoshtresë të plotë, ndërsa mikrokanali i poshtëm ruan kushte statike. Kjo metodë e optimizuar për aktivizimin sipërfaqësor dhe veshjen e ECM-së mundëson bashkëngjitjen e epitelit organoid për të induktuar 3D. morfogjeneza në sipërfaqen e PDMS-së.
Kulturat Transwell kërkojnë gjithashtu veshje me ECM para mbjelljes së qelizave; megjithatë, kulturat Transwell nuk kërkojnë hapa komplekse paraprakë trajtimi për të aktivizuar sipërfaqen e inserteve poroze. Për rritjen e qelizave Caco-2 në insertet Transwell, veshja me ECM në insertet poroze përshpejton ngjitjen e qelizave Caco-2 të disociuara (<1 orë) dhe formimin e barrierës së lidhjes së ngushtë (<1-2 ditë). Për të kultivuar organoidet në insertet Transwell, organoidet e izoluara mbillen në inserte të veshura me ECM, ngjiten në sipërfaqen e membranës (<3 orë) dhe mbahen derisa organoidet të formojnë një shtresë të plotë monolitike me integritet barriere. Kulturat Transwell kryhen në pllaka me 24 puseta pa përdorimin e çipave hibride.
Morfogjeneza 3D in vitro mund të fillohet duke aplikuar rrjedhën e lëngjeve në aspektin bazolateral të një shtrese epiteliale të vendosur. Në zorrë në një çip, morfogjeneza epiteliale filloi kur mediumi u perfuzua në mikrokanalet e sipërme dhe të poshtme (Fig. 3a). Siç është përshkruar më parë, është thelbësore të futet rrjedha e lëngjeve në ndarjen e poshtme (bazolaterale) për heqjen e vazhdueshme të frenuesve të morfogjenit të sekretuar në mënyrë të drejtuar. Për të siguruar lëndë ushqyese dhe serum të mjaftueshëm për qelizat e lidhura në membranat poroze dhe për të gjeneruar stres prerës luminal, ne zakonisht aplikojmë rrjedhë të dyfishtë në zorrë në një çip. Në çipat hibride, futjet Transwell që përmbajnë shtresa monoepiteliale u futën në çipat hibride. Pastaj, mediumi u aplikua nën anën bazolaterale të futjes poroze Transwell përmes mikrokanalit. Morfogjeneza intestinale ndodhi 3-5 ditë pas fillimit të rrjedhës bazolaterale në të dy platformat e kulturës.
Karakteristikat morfologjike të shtresave epiteliale 3D të mikroinxhinieruara mund të analizohen duke aplikuar modalitete të ndryshme imazherie, duke përfshirë mikroskopinë me kontrast faze, mikroskopinë me kontrast interference diferenciale (DIC), SEM ose mikroskopinë konfokale me imunofluoreshencë (Figurat 3 dhe 4). Imazhet me kontrast faze ose DIC mund të kryhen lehtësisht në çdo kohë gjatë kulturës për të monitoruar formën dhe zgjatjen e shtresave epiteliale 3D. Për shkak të transparencës optike të filmave PDMS dhe poliester, si platformat gut-on-a-chip ashtu edhe ato hibride të çipit mund të ofrojnë imazhe in situ në kohë reale pa pasur nevojë për prerje ose çmontim të pajisjes. Kur kryhet imazheria me imunofluoreshencë (Figurat 1, 3c, f dhe 4b, c), qelizat zakonisht fiksohen me 4% (p/vol) paraformaldehidë (PFA), e ndjekur nga Triton X-100 dhe 2% (p/vol) albuminë serumi të gjedhit (BSA), sipas radhës. Në varësi të llojit të qelizës, mund të përdoren fiksues, përshkues dhe agjentë bllokues të ndryshëm. të përdorura. Antitrupat primarë që synojnë shënuesit e qelizave ose rajoneve të varura nga linja përdoren për të nxjerrë në pah qelizat e imobilizuara in situ në çip, të ndjekura nga antitrupa sekondarë së bashku me një ngjyrë kundërngjyrosëse që synon ose bërthamën (p.sh., 4′,6-diamidino-2-fenilen) indole, DAPI) ose F-aktinë (p.sh., faloidinë e etiketuar me fluoreshencë). Imazheria e drejtpërdrejtë e bazuar në fluoreshencë mund të kryhet gjithashtu in situ për të zbuluar prodhimin e mukusit (Fig. 1, "Diferencimi qelizor" dhe "Fiziologjia e zorrëve"), kolonizimin e rastësishëm të qelizave mikrobike (Fig. 1, "Bashkëkultura mikpritëse-mikrob"), rekrutimin e qelizave imune (Fig. 1, 'Modelimi i Sëmundjeve') ose konturet e morfologjisë epiteliale 3D (Fig. 3c, f dhe 4b, c). Kur modifikohet zorra në çip për të ndarë shtresën e sipërme nga shtresa e poshtme e mikrokanalit, siç përshkruhet në ref. Siç tregohet në Fig. 2, morfologjia epiteliale 3D, si dhe mikrovilet në apikal. Kufiri me furçë mund të vizualizohet me anë të SEM (Fig. 3b). Shprehja e shënuesve të diferencimit mund të vlerësohet duke kryer sekuencimin sasior të PCR5 ose të ARN-së me një qelizë të vetme. Në këtë rast, shtresat 3D të qelizave epiteliale të rritura në copa të zorrëve ose copa hibride mblidhen me anë të tripsinizimit dhe më pas përdoren për analiza molekulare ose gjenetike.
a, Rrjedha e punës për induksionin e morfogjenezës së zorrëve në një çip hibrid. Caco-2 dhe organoidet e zorrëve përdoren në këtë protokoll për të demonstruar morfogjenezën 3D në një platformë çipi hibrid. Qelizat epiteliale të disociuara u mbjellën në insertet e përgatitura Transwell (përgatitja TW; shih figurën më poshtë). Pasi qelizat u mbjellën (mbjellën) dhe u ngjitën në membranat poliester në insertet Transwell, të gjitha qelizat u kultivuan në kushte statike (kultura TW). Pas 7 ditësh, një insert i vetëm Transwell që përmbante një shtresë monolaterale 2D të qelizave epiteliale u integrua në një çip hibrid për të futur një rrjedhë bazolaterale (Flow, BL), e cila përfundimisht çoi në gjenerimin e një shtrese epiteliale 3D (morfogjeneza). Mikrografitë me kontrast faze tregojnë tiparet morfologjike të qelizave epiteliale të organeve njerëzore të nxjerra nga koloni ngjitës i donatorit normal (linja C103) në çdo hap ose pikë kohore eksperimentale. Skemat në shtresat e sipërme ilustrojnë konfigurimin eksperimental për secilin hap. b, Çipat hibridë (skema majtas) mund të çojnë në morfogjenezën 3D të qelizave epiteliale organoide me Pamje të mikroskopisë konfokale nga lart-poshtë të marra në pozicione të ndryshme Z (sipërme, të mesme dhe të poshtme; shih skemën djathtas dhe vijat përkatëse me pika). treguan karakteristika morfologjike të dukshme. F-aktina (cian), bërthama (gri).c, Mikrografi konfokale fluoreshente (pamje këndore 3D) e qelizave epiteliale të derivuara nga organoide të kultivuara në Transwell statik (TW; futje brenda kutisë së bardhë me pika) kundrejt çipit hibrid (fotoja më e madhe e plotë) duke krahasuar morfologjinë 2D kundrejt asaj 3D, përkatësisht. Një palë pamjesh vertikale 2D me prerje tërthore (futja në këndin e sipërm të djathtë; "XZ") gjithashtu tregojnë karakteristika 2D dhe 3D. Shiriti i shkallës, 100 µm.c Ribotuar me leje nga referenca.4. Elsevier.
Kontrollet mund të përgatiten duke kultivuar të njëjtat qeliza (Caco-2 ose qeliza epiteliale organoide të zorrëve) në monoshtresa dy-dimensionale në kushte konvencionale të kulturës statike. Veçanërisht, pakësimi i lëndëve ushqyese mund të rezultojë për shkak të kapacitetit të kufizuar të vëllimit të mikrokanaleve (domethënë ~4 µL në kanalin e sipërm në modelin origjinal të çipit të zorrëve). Prandaj, morfologjia epiteliale para dhe pas aplikimit të rrjedhës bazolaterale mund të krahasohet gjithashtu.
Procesi i litografisë së butë duhet të kryhet në një dhomë të pastër. Për secilën shtresë në çip (shtresat e sipërme dhe të poshtme dhe membranat) dhe çipat hibridë, u përdorën fotomaska ​​të ndryshme dhe u prodhuan në pllaka silikoni të veçanta sepse lartësitë e mikrokanaleve ishin të ndryshme. Lartësitë e synuara të mikrokanaleve të sipërme dhe të poshtme të zorrës në çip janë përkatësisht 500 µm dhe 200 µm. Lartësia e synuar e kanalit të çipit hibrid është 200 µm.
Vendosni një pllakë silikoni 3 inç në një enë me aceton. Përziejeni butësisht pllakën për 30 sekonda, pastaj thajeni në ajër. Transferoni pllakëzën në një pjatë me IPA, pastaj rrotullojeni pllakën për 30 sekonda për ta pastruar.
Një tretësirë ​​piranje (përzierje e peroksidit të hidrogjenit dhe acidit sulfurik të përqendruar, 1:3 (vol/vol)) mund të përdoret opsionalisht për të maksimizuar heqjen e mbetjeve organike nga sipërfaqja e pllakës së silikonit.
Tretësira e Piranhas është jashtëzakonisht gërryese dhe gjeneron nxehtësi. Masa paraprake shtesë sigurie janë të nevojshme. Për asgjësimin e mbeturinave, lëreni tretësirën të ftohet dhe transferojeni në një enë mbeturinash të pastër dhe të thatë. Përdorni enë dytësore dhe etiketoni siç duhet enët e mbeturinave. Ju lutemi ndiqni udhëzimet e sigurisë së objektit për procedura më të hollësishme.
Dehidratoni napolitanat duke i vendosur në një pjatë të nxehtë 200 °C për 10 minuta. Pas dehidratimit, napolitani u tund pesë herë në ajër për t'u ftohur.
Hidhni ~10 g fotorezist SU-8 2100 në qendër të pllakës së silikonit të pastruar. Përdorni piskatore për ta shpërndarë fotorezistin në mënyrë të barabartë mbi pllakë. Herë pas here vendoseni pllakën në një pjatë të nxehtë 65°C për ta bërë fotorezistin më pak ngjitës dhe për ta përhapur më lehtë. Mos e vendosni pllakën direkt mbi pllakën e nxehtë.
SU-8 u shpërnda në mënyrë të barabartë në pllakë duke përdorur veshje me spin coating. Programoni një rrotullim hyrës të SU-8 për 5-10 s për t'u përhapur në 500 rpm me një përshpejtim prej 100 rpm/s. Vendosni spinimin kryesor për modelim me trashësi 200 µm në 1,500 rpm, ose arrini një trashësi prej 250 µm (duke krijuar një lartësi 500 µm për shtresën e sipërme të zorrës në çip; shih "Hapat kritikë" më poshtë) vendoseni në një përshpejtim prej 300 rpm/s për 30 sekonda në 1,200 rpm.
Shpejtësia kryesore e rrotullimit mund të rregullohet sipas trashësisë së synuar të modelit SU-8 në pllakë silikoni.
Për të prodhuar modele SU-8 me lartësi 500 µm për shtresën e sipërme të zorrës në çip, hapat e veshjes me spin dhe pjekjes së butë të kësaj Kutie (hapat 7 dhe 8) u përsëritën në mënyrë sekuenciale (shih hapin 9) për të prodhuar dy shtresa me trashësi 250 µm të SU-8, të cilat mund të shtresohen dhe të bashkohen me anë të ekspozimit ndaj rrezeve UV në hapin 12 të kësaj kutie, duke krijuar një shtresë 500 µm të lartë.
Piqni butësisht napolitanet e veshura me SU-8 duke i vendosur me kujdes në një pjatë të nxehtë në 65 °C për 5 minuta, më pas ndryshoni temperaturën në 95 °C dhe inkubojini për 40 minuta të tjera.
Për të arritur një lartësi prej 500 μm të modelit SU-8 në mikrokanalin e sipërm, përsëritni hapat 7 dhe 8 për të gjeneruar dy shtresa SU-8 me trashësi 250 μm.
Duke përdorur rregulluesin e maskave UV, kryeni një provë me llambë sipas udhëzimeve të prodhuesit për të llogaritur kohën e ekspozimit të pllakës së mbështjelljes. (koha e ekspozimit, ms) = (doza e ekspozimit, mJ/cm2)/(fuqia e llambës, mW/cm2).
Pasi të keni përcaktuar kohën e ekspozimit, vendosni fotomaskën në mbajtësen e maskës së rregulluesit të maskës UV dhe vendoseni fotomaskën në pllakëzën e veshur me SU-8.
Vendosni sipërfaqen e printuar të fotomaskës direkt në anën e veshur me SU-8 të pllakës së silikonit për të minimizuar shpërndarjen e rrezeve UV.
Ekspozoni pllakëzën dhe fotomaskën e veshur me SU-8 vertikalisht ndaj 260 mJ/cm2 dritë UV për kohën e paracaktuar të ekspozimit (shih hapin 10 të kësaj kutie).
Pas ekspozimit ndaj rrezeve UV, napolitanet e silikonit të veshura me SU-8 u pjekën në 65°C për 5 minuta dhe në 95°C për 15 minuta në secilën pllakë të nxehtë për të prodhuar modele me një lartësi prej 200 μm. Zgjatni kohën pas pjekjes në 95 °C në 30 minuta për të prodhuar modele me një lartësi prej 500 µm.
Zhvilluesi derdhet në një enë qelqi dhe napolitana e pjekur vendoset në enë. Vëllimi i zhvilluesit SU-8 mund të ndryshojë në varësi të madhësisë së pllakës së qelqit. Sigurohuni që të përdorni mjaftueshëm zhvillues SU-8 për të hequr plotësisht SU-8 të paekspozuar. Për shembull, kur përdorni një enë qelqi me diametër 150 mm me kapacitet 1 L, përdorni ~300 mL zhvillues SU-8. Zhvilloni mykun për 25 minuta me rrotullim të lehtë herë pas here.
Shpëlajeni mykun e zhvilluar me ~10 mL zhvillues të freskët, të ndjekur nga IPA duke e spërkatur tretësirën me një pipetë.
Vendoseni napolitanën në një pastrues plazme dhe ekspozojeni ndaj plazmës së oksigjenit (gaz atmosferik, presioni i synuar 1 × 10−5 Torr, fuqia 125 W) për 1.5 minuta.
Vendoseni napolitanën në një tharëse vakumi me një lamë qelqi brenda. Napolitanat dhe lamëzat mund të vendosen krah për krah. Nëse tharësja vakumi është e ndarë në disa shtresa nga një pllakë, vendosni lamëzat në dhomën e poshtme dhe napolitanat në dhomën e sipërme. Hidhni 100 μL tretësirë ​​trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silani në një lamë qelqi dhe aplikoni vakum për silanizim.
Shkrini një flakon me qeliza të ngrira Caco-2 në një banjë uji 37°C, pastaj transferoni qelizat e shkrira në një balonë T75 që përmban 15 mL medium Caco-2 të parangrohur në 37°C.
Për të kaluar qelizat Caco-2 në një konfluencë prej ~90%, së pari ngrohni mjedisin Caco-2, PBS dhe 0.25% tripsinë/1 mM EDTA në një banjë uji 37°C.
Aspironi mjedisin me anë të aspirimit me vakum. Lani qelizat dy herë me 5 mL PBS të ngrohtë duke përsëritur aspirimin me vakum dhe duke shtuar PBS të freskët.