Faleminderit që vizituat Nature.com. Po përdorni një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Shfaq një karusel me tre diapozitiva njëherësh. Përdorni butonat "Më parë" dhe "Më pas" për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh, ose përdorni butonat e rrëshqitësit në fund për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh.
Barriera gjak-tru dhe barriera gjak-tru parandalojnë që agjentët bioterapeutikë të arrijnë objektivat e tyre në sistemin nervor qendror, duke penguar kështu trajtimin efektiv të sëmundjeve neurologjike. Për të zbuluar transportues të rinj të trurit in vivo, ne prezantuam një bibliotekë peptidesh të fagut T7 dhe mblodhëm në seri gjakun dhe lëngun cerebrospinal (LSF) duke përdorur një model të madh të vetëdijshëm të kanilatizuar të minjve. Klonet specifike të fagut u pasuruan shumë në LSF pas katër raundeve të përzgjedhjes. Testimi i peptideve individuale kandidate zbuloi më shumë se 1000-fishim të pasurimit në LSF. Bioaktiviteti i shpërndarjes së ndërmjetësuar nga peptidi në tru u konfirmua nga një ulje prej 40% e nivelit të amiloidit-β në lëngun cerebrospinal duke përdorur një frenues të peptidit BACE1 të lidhur me peptidin e ri të identifikuar të tranzitit. Këto rezultate sugjerojnë që peptidet e identifikuara nga metodat e përzgjedhjes së fagut in vivo mund të jenë mjete të dobishme për shpërndarjen sistemike të makromolekulave në tru me një efekt terapeutik.
Hulumtimi i terapisë së synuar në sistemin nervor qendror (SNQ) është përqendruar kryesisht në identifikimin e barnave dhe agjentëve të optimizuar që shfaqin veti të synuara në SNQ, me më pak përpjekje në zbulimin e mekanizmave që nxisin shpërndarjen aktive të barnave në tru. Kjo po fillon të ndryshojë tani, pasi shpërndarja e barnave, veçanërisht molekulave të mëdha, është një pjesë integrale e zhvillimit modern të barnave në neuroshkencë. Mjedisi i sistemit nervor qendror është i mbrojtur mirë nga sistemi i barrierave cerebrovaskulare, i përbërë nga barriera gjak-tru (BBB) ​​dhe barriera gjak-tru (BCBB)1, duke e bërë të vështirë shpërndarjen e barnave në tru1,2. Është vlerësuar se pothuajse të gjitha barnat me molekula të mëdha dhe më shumë se 98% e barnave me molekula të vogla eliminohen nga truri3. Kjo është arsyeja pse është shumë e rëndësishme të identifikohen sisteme të reja të transportit në tru që ofrojnë shpërndarje efikase dhe specifike të barnave terapeutike në SNQ4,5. Megjithatë, BBB dhe BCSFB gjithashtu paraqesin një mundësi të shkëlqyer për shpërndarjen e barnave pasi ato depërtojnë dhe hyjnë në të gjitha strukturat e trurit përmes enëve të tij të gjera. Kështu, përpjekjet aktuale për të përdorur metoda jo-invazive të administrimit në tru bazohen kryesisht në mekanizmin e transportit të ndërmjetësuar nga receptori (PMT) duke përdorur receptorin endogjen BBB6. Pavarësisht përparimeve të fundit kyçe duke përdorur rrugën e receptorit të transferrinës7,8, kërkohet zhvillimi i mëtejshëm i sistemeve të reja të administrimit me veti të përmirësuara. Për këtë qëllim, qëllimi ynë ishte të identifikonim peptide të afta për të ndërmjetësuar transportin e LSK-së, pasi ato në parim mund të përdoren për të administruar makromolekula në SNQ ose për të hapur rrugë të reja të receptorëve. Në veçanti, receptorët dhe transportuesit specifikë të sistemit cerebrovaskular (BBB dhe BSCFB) mund të shërbejnë si objektiva të mundshëm për administrimin aktiv dhe specifik të barnave bioterapeutike. Lëngu cerebrospinal (LSF) është një produkt sekretues i pleksusit koroid (CS) dhe është në kontakt të drejtpërdrejtë me lëngun intersticial të trurit përmes hapësirës subarachnoidale dhe hapësirës ventrikulare4. Kohët e fundit është treguar se lëngu cerebrospinal subarachnoid shpërndahet tepër në intersticiumin e trurit9. Shpresojmë të hyjmë në hapësirën parenkimale duke përdorur këtë trakt hyrës subarachnoid ose direkt përmes BBB-së. Për ta arritur këtë, ne zbatuam një strategji të fuqishme të përzgjedhjes së fagut in vivo që idealisht identifikon peptidet e transportuara nga njëra prej këtyre dy rrugëve të dallueshme.
Tani përshkruajmë një metodë sekuenciale të shqyrtimit të shfaqjes së fagut in vivo me marrjen e mostrave të LSH-së të shoqëruar me sekuencim me rendiment të lartë (HTS) për të monitoruar raundet fillestare të përzgjedhjes me diversitetin më të lartë të bibliotekës. Shqyrtimi u krye në minj të vetëdijshëm me një kanulë të madhe cisterne (CM) të implantuar përgjithmonë për të shmangur kontaminimin e gjakut. Është e rëndësishme të theksohet se kjo qasje zgjedh si shënjestrimin e trurit ashtu edhe peptidet me aktivitet transporti përtej barrierës cerebrovaskulare. Ne përdorëm fagët T7 për shkak të madhësisë së tyre të vogël (~60 nm)10 dhe sugjeruam që ato janë të përshtatshme për transportin e fshikëzave që lejojnë kalimin transqelizor të barrierës endoteliale dhe/ose epiteliale-medullare. Pas katër raundeve të panimit, popullatat e fagëve u izoluan duke treguar pasurim të fortë të LSH-së in vivo dhe shoqërim të mikroenëve cerebrale. Është e rëndësishme të theksohet se ne ishim në gjendje të konfirmonim gjetjet tona duke demonstruar se peptidet më të mira kandidate të preferuara dhe të sintetizuara kimikisht janë në gjendje të transportojnë ngarkesën e proteinave në lëngun cerebrospinal. Së pari, efektet farmakodinamike të SNQ-së u përcaktuan duke kombinuar një peptid kryesor tranziti me një frenues të peptidit BACE1. Përveç demonstrimit se strategjitë e shqyrtimit funksional in vivo mund të identifikojnë peptide të reja të transportit në tru si bartës efektivë të ngarkesës së proteinave, ne presim që qasje të ngjashme të përzgjedhjes funksionale të bëhen gjithashtu të rëndësishme në identifikimin e shtigjeve të reja të transportit në tru.
Bazuar në njësitë formuese të pllakës (PFU), pas hapit të paketimit të fagut, u projektua dhe u krijua një bibliotekë me peptide lineare 12-merëshe të rastësishme të fagut T7 me një diversitet prej afërsisht 109 (shih Materialet dhe Metodat). Është e rëndësishme të theksohet se ne e analizuam me kujdes këtë bibliotekë para panimit in vivo. Amplifikimi PCR i mostrave të bibliotekës së fagut duke përdorur prajmerë të modifikuar gjeneroi amplikone që ishin të zbatueshme drejtpërdrejt në HTS (Fig. 1a plotësuese). Për shkak të a) gabimeve të sekuencimit HTS11, b) ndikimit në cilësinë e prajmerëve (NNK)1-12, dhe c) pranisë së fagut të tipit të egër (wt) (futje skeleti) në bibliotekën rezervë, u zbatua një procedurë filtrimi sekuencash për të nxjerrë vetëm informacionin e verifikuar të sekuencës (Fig. 1b plotësuese). Këto hapa filtrimi zbatohen për të gjitha bibliotekat e sekuencimit HTS. Për bibliotekën standarde, u morën gjithsej 233,868 lexime, nga të cilat 39% kaluan kriteret e filtrit dhe u përdorën për analizën dhe përzgjedhjen e bibliotekës për raundet pasuese (Figura plotësuese 1c–e). Leximet ishin kryesisht shumëfisha të 3 çifteve bazë në gjatësi me një kulm në 36 nukleotide (Fig. 1c plotësuese), duke konfirmuar modelin e bibliotekës (NNK) 1-12. Veçanërisht, afërsisht 11% e anëtarëve të bibliotekës përmbanin një insert PAGISRELVDKL të tipit të egër (wt) 12-dimensional, dhe pothuajse gjysma e sekuencave (49%) përmbanin insertime ose fshirje. HTS e bibliotekës së bibliotekës konfirmoi diversitetin e lartë të peptideve në bibliotekë: më shumë se 81% e sekuencave peptide u gjetën vetëm një herë dhe vetëm 1.5% ndodhën në ≥4 kopje (Fig. 2a plotësuese). Frekuencat e aminoacideve (aa) në të gjitha 12 pozicionet në repertor korrelonin mirë me frekuencat e pritura për numrin e kodoneve të gjeneruara nga repertori i degjeneruar i NKK (Fig. 2b plotësuese). Frekuenca e vëzhguar e mbetjeve aa të koduara nga këto inserte korrelonte mirë me frekuencën e llogaritur (r = 0.893) (Fig. 2c plotësuese). Përgatitja e bibliotekave të fagëve për injeksion përfshin hapat e amplifikimit dhe heqjes së endotoksinës. Kjo është treguar më parë se potencialisht zvogëlon diversitetin e bibliotekave të fagëve12,13. Prandaj, ne renditëm një bibliotekë fagu të amplifikuar në pjatë që i ishte nënshtruar heqjes së endotoksinës dhe e krahasuam atë me bibliotekën origjinale për të vlerësuar frekuencën e AA. Një korrelacion i fortë (r = 0.995) u vu re midis grupit origjinal dhe grupit të amplifikuar dhe të pastruar (Fig. 2d plotësuese), duke treguar se konkurrenca midis kloneve të amplifikuar në pllaka duke përdorur fagun T7 nuk shkaktoi paragjykim të madh. Ky krahasim bazohet në frekuencën e motiveve tripeptide në secilën bibliotekë, pasi diversiteti i bibliotekave (~109) nuk mund të kapet plotësisht as me HTS. Analiza e frekuencës së aa në secilën pozicion zbuloi një paragjykim të vogël të varur nga pozicioni në tre pozicionet e fundit të repertorit të futur (Fig. 2e plotësuese). Si përfundim, ne arritëm në përfundimin se cilësia dhe diversiteti i bibliotekës ishin të pranueshme dhe vetëm ndryshime të vogla në diversitet u vunë re për shkak të amplifikimit dhe përgatitjes së bibliotekave të fagëve midis disa raundeve të përzgjedhjes.
Marrja serike e mostrave të lëngut cerebrospinal mund të kryhet duke implantuar kirurgjikalisht një kanulë në CM të minjve të vetëdijshëm për të lehtësuar identifikimin e fagut T7 të injektuar në mënyrë intravenoze (iv) nëpërmjet BBB dhe/ose BCSFB (Fig. 1a-b). Ne përdorëm dy krahë përzgjedhjeje të pavarura (krahët A dhe B) në tre raundet e para të përzgjedhjes in vivo (Fig. 1c). Ne gradualisht e rritëm ashpërsinë e përzgjedhjes duke ulur sasinë totale të fagut të futur në tre raundet e para të përzgjedhjes. Për raundin e katërt të panimit, ne kombinuam mostrat nga degët A dhe B dhe kryem tre përzgjedhje të tjera të pavarura. Për të studiuar vetitë in vivo të grimcave të fagut T7 në këtë model, fagu i tipit të egër (inserti kryesor PAGISRELVDKL) u injektua te minjtë nëpërmjet venës së bishtit. Rimëkëmbja e fagëve nga lëngu cerebrospinal dhe gjaku në pika të ndryshme kohore tregoi se fagët relativisht të vegjël ikosahedralë T7 kishin një fazë të shpejtë fillestare pastrimi nga ndarja e gjakut (Fig. 3 plotësuese). Bazuar në titrat e administruar dhe vëllimin e gjakut të minjve, ne llogaritëm se vetëm afërsisht 1% në peshë. Fagu nga doza e administruar u zbulua në gjak 10 minuta pas injektimit intravenoz. Pas kësaj rënieje të shpejtë fillestare, u mat një pastrim primar më i ngadaltë me një gjysmë-jetë prej 27.7 minutash. Është e rëndësishme të theksohet se vetëm shumë pak fagë u morën nga ndarja e LCS-së, duke treguar një sfond të ulët për migrimin e fagut të tipit të egër në ndarjen e LCS-së (Fig. Plotësuese 3). Mesatarisht, vetëm rreth 1 x 10-3% titra të fagut T7 në gjak dhe 4 x 10-8% e fagëve të infuzuar fillimisht u zbuluan në lëngun cerebrospinal gjatë gjithë periudhës së marrjes së mostrave (0-250 min). Veçanërisht, gjysmë-jeta (25.7 min) e fagut të tipit të egër në lëngun cerebrospinal ishte e ngjashme me atë të vëzhguar në gjak. Këto të dhëna tregojnë se barriera që ndan ndarjen e LCS-së nga gjaku është e paprekur në minjtë e kanuluar me CM, duke lejuar përzgjedhjen in vivo të bibliotekave të fagëve për të identifikuar klonet që transportohen lehtësisht nga gjaku në ndarjen e LCS-së.
(a) Vendosja e një metode për rimarrjen e mostrave të lëngut cerebrospinal (LSF) nga një pishinë e madhe. (b) Diagrama që tregon vendndodhjen qelizore të barrierës së sistemit nervor qendror (SNQ) dhe strategjinë e përzgjedhjes së përdorur për të identifikuar peptidet që kalojnë barrierën gjak-tru (BBB) ​​​​dhe barrierën gjak-tru. (c) Grafiku i rrjedhës së shqyrtimit të shfaqjes së fagut in vivo. Në çdo raund përzgjedhjeje, fagët (identifikuesit e kafshëve brenda shigjetave) u injektuan në mënyrë intravenoze. Dy degë alternative të pavarura (A, B) mbahen veçmas deri në raundin e 4-të të përzgjedhjes. Për raundet e përzgjedhjes 3 dhe 4, çdo klon fagu i nxjerrë nga LSF u sekuencua manualisht. (d) Kinetika e fagut të izoluar nga gjaku (rrathë të kuq) dhe lëngu cerebrospinal (trekëndësha të gjelbër) gjatë raundit të parë të përzgjedhjes në dy minj të kanuluar pas injektimit intravenoz të bibliotekës së peptideve T7 (2 x 1012 fagë/kafshë). Katrorët blu tregojnë përqendrimin mesatar fillestar të fagut në gjak, të llogaritur nga sasia e fagut të injektuar, duke marrë parasysh vëllimin total të gjakut. Katrorët e zinj tregojnë pikën e kryqëzimit të vijës y të ekstrapoluar nga përqendrimet e fagëve në gjak. (e,f) Paraqitni frekuencën dhe shpërndarjen relative të të gjitha motiveve të mundshme tripeptide mbivendosëse që gjenden në peptid. Tregohet numri i motiveve të gjetura në 1000 lexime. Motivet e pasuruara në mënyrë të konsiderueshme (p < 0.001) janë shënuar me pika të kuqe. (e) Grafiku i shpërndarjes së korrelacionit që krahason frekuencën relative të motivit tripeptid të bibliotekës së injektuar me fagun e nxjerrë nga gjaku nga kafshët #1.1 dhe #1.2. (f) Grafiku i shpërndarjes së korrelacionit që krahason frekuencat relative të motiveve tripeptide të fagut shtazor #1.1 dhe #1.2 të izoluara në gjak dhe lëng cerebrospinal. (g, h) Përfaqësimi i ID-së së sekuencës së fagut të pasuruar në gjak (g) kundrejt bibliotekave të injektuara dhe fagut të pasuruar në LCS (h) kundrejt gjakut pas një raundi përzgjedhjeje in vivo në të dy kafshët. Madhësia e kodit me një shkronjë tregon se sa shpesh ndodh ai aminoacid në atë pozicion. E gjelbra = polare, vjollca = neutrale, bluja = bazike, e kuqja = acidike dhe e zeza = aminoacide hidrofobe. Figura 1a, b u projektua dhe u prodhua nga Eduard Urich.
Ne injektuam një bibliotekë peptidesh fagu në dy minj të instrumentit CM (kladet A dhe B) dhe izoluam fagun nga lëngu cerebrospinal dhe gjaku (Figura 1d). Pastrimi fillestar i shpejtë i bibliotekës ishte më pak i theksuar krahasuar me fagun e tipit të egër. Gjysmë-jeta mesatare e bibliotekës së injektuar në të dy kafshët ishte 24.8 minuta në gjak, e ngjashme me fagun e tipit të egër, dhe 38.5 minuta në LCS. Mostrat e fagut të gjakut dhe lëngut cerebrospinal nga secila kafshë iu nënshtruan HTS dhe të gjitha peptidet e identifikuara u analizuan për praninë e një motivi të shkurtër tripeptidik. Motivet tripeptidike u zgjodhën sepse ato ofrojnë një bazë minimale për formimin e strukturës dhe ndërveprimet peptid-proteinë14,15. Ne gjetëm një korrelacion të mirë në shpërndarjen e motiveve midis bibliotekës së fagut të injektuar dhe kloneve të nxjerra nga gjaku i të dy kafshëve (Fig. 1e). Të dhënat tregojnë se përbërja e bibliotekës është pasuruar vetëm pak në ndarjen e gjakut. Frekuencat e aminoacideve dhe sekuencat e konsensusit u analizuan më tej në secilën pozicion duke përdorur një adaptim të softuerit Weblogo16. Është interesante se gjetëm një pasurim të fortë në mbetjet e glicinës në gjak (Fig. 1g). Kur gjaku u krahasua me klonet e përzgjedhura nga LCS, u vu re një përzgjedhje e fortë dhe njëfarë çpërzgjedhjeje e motiveve (Fig. 1f), dhe disa aminoacide ishin të pranishme në mënyrë preferenciale në pozicione të paracaktuara në 12-anëtarët (Fig. 1h). Veçanërisht, kafshët individuale ndryshonin ndjeshëm në lëngun cerebrospinal, ndërsa pasurimi i glicinës në gjak u vu re në të dy kafshët (Fig. 4a-j plotësuese). Pas filtrimit të rreptë të të dhënave të sekuencës në lëngun cerebrospinal të kafshëve #1.1 dhe #1.2, u morën gjithsej 964 dhe 420 peptide unike 12-mere (Fig. 1d-e plotësuese). Klonet e izoluara të fagut u amplifikuan dhe iu nënshtruan një raundi të dytë të përzgjedhjes in vivo. Fagu i nxjerrë nga raundi i dytë i përzgjedhjes iu nënshtrua HTS në secilën kafshë dhe të gjitha peptidet e identifikuara u përdorën si të dhëna hyrëse në një program njohjeje motivesh për të analizuar shfaqjen e motiveve tripeptide (Fig. 2a, b, ef). Krahasuar me ciklin e parë të fagut të rikuperuar nga LCS, ne vumë re përzgjedhje dhe çpërzgjedhje të mëtejshme të shumë motiveve në LCS në degët A dhe B (Fig. 2). Një algoritëm identifikimi rrjeti u aplikua për të përcaktuar nëse ato përfaqësonin modele të ndryshme të sekuencës konsistente. Një ngjashmëri e qartë u vu re midis sekuencave 12-dimensionale të rikuperuara nga LCS në kladën alternative A (Fig. 2c, d) dhe kladën B (Fig. 2g, h). Analiza e përbashkët në secilën degë zbuloi profile të ndryshme përzgjedhjeje për peptidet 12-mer (Fig. Plotësuese 5c, d) dhe një rritje në raportin titrit LCS/gjak me kalimin e kohës për klonet e bashkuara pas raundit të dytë të përzgjedhjes krahasuar me raundin e parë të përzgjedhjes (Fig. Plotësuese 5e).
Pasurimi i motiveve dhe peptideve në lëngun cerebrospinal me anë të dy raundeve të njëpasnjëshme të përzgjedhjes së shfaqjes funksionale të fagut in vivo.
Të gjithë fagët e lëngut cerebrospinal të rikuperuar nga raundi i parë i secilës kafshë (kafshët #1.1 dhe #1.2) u bashkuan, u amplifikuan, u sekuencuan me HT dhe u riinjektuan së bashku (2 x 1010 fagë/kafshë) 2 minj të kanuluar SM (#1.1 → #). 2.1 dhe 2.2, 1.2 → 2.3 dhe 2.4). (a,b,e,f) Grafikët e shpërndarjes së korrelacionit që krahasojnë frekuencën relative të motiveve tripeptide të të gjithë fagëve të derivuar nga CSF në raundin e parë dhe të dytë të përzgjedhjes. Frekuenca dhe shpërndarja relative e motiveve që përfaqësojnë të gjitha tripeptidet e mundshme mbivendosëse të gjetura në peptide në të dy orientimet. Tregohet numri i motiveve të gjetura në 1000 lexime. Motivet që u zgjodhën ose u përjashtuan në mënyrë të konsiderueshme (p < 0.001) në njërën nga bibliotekat e krahasuara janë theksuar me pika të kuqe. (c, d, g, h) Përfaqësimi i logos së sekuencës së të gjitha sekuencave të gjata të 12 aminoacideve të pasura me LSK bazuar në raundet 2 dhe 1 të përzgjedhjes in vivo. Madhësia e kodit me një shkronjë tregon se sa shpesh ndodh ai aminoacid në atë pozicion. Për të përfaqësuar logon, krahasohet frekuenca e sekuencave të LSK të nxjerra nga kafshët individuale midis dy raundeve të përzgjedhjes dhe tregohen sekuencat e pasuruara në raundin e dytë: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dhe (h) #1.2–#2.4. Aminoacidet më të pasuruara në një pozicion të caktuar në (c, d) kafshët nr. 2.1 dhe nr. 2.2 ose (g, h) në kafshët nr. 2.3 dhe nr. 2.4 tregohen me ngjyra. E gjelbra = polare, e purpurta = neutrale, blu = bazike, e kuqja = acidike dhe e zeza = aminoacide hidrofobike.
Pas raundit të tretë të përzgjedhjes, ne identifikuam 124 sekuenca unike peptidesh (#3.1 dhe #3.2) nga 332 klone fagu të rindërtuara në LSH të izoluara nga dy kafshë (Fig. Plotësuese 6a). Sekuenca LGSVS (18.7%) kishte përqindjen relative më të lartë, e ndjekur nga insertet e tipit të egër PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) dhe SARGSWREIVSLS (2.2%). Në raundin e katërt të fundit, ne bashkuam dy degë të zgjedhura në mënyrë të pavarur nga tre kafshë të veçanta (Fig. 1c). Nga 925 klonet e fagut të sekuencuar të rikuperuar nga LSH, në raundin e katërt gjetëm 64 sekuenca unike peptidesh (Fig. Plotësuese 6b), midis të cilave përqindja relative e fagut të tipit të egër ra në 0.8%. Klonet më të zakonshme të LSH-së në raundin e katërt ishin LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) dhe RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Diapazoni i gjatësisë së peptideve të përzgjedhura është për shkak të futjeve/fshirjeve të nukleotideve ose kodoneve të ndalimit të parakohshëm në prajmerët e bibliotekës kur përdoren kodone të degjeneruara për dizajnin e bibliotekës NNK. Kodonet e ndalimit të parakohshëm gjenerojnë peptide më të shkurtra dhe zgjidhen sepse përmbajnë motivin aa të favorshëm. Peptidet më të gjata mund të rezultojnë nga futjet/fshirjet në prajmerët e bibliotekave sintetike. Kjo e pozicionon kodonin e ndalimit të projektuar jashtë kornizës dhe e lexon atë derisa të shfaqet një kodon i ri ndalimi poshtë rrjedhës. Në përgjithësi, ne llogaritëm faktorët e pasurimit për të katër raundet e përzgjedhjes duke krahasuar të dhënat hyrëse me të dhënat dalëse të mostrës. Për raundin e parë të shqyrtimit, ne përdorëm titra të fagëve të tipit të egër si një referencë sfondi jo-specifike. Është interesante se përzgjedhja negative e fagut ishte shumë e fortë në ciklin e parë të LSH-së, por jo në gjak (Fig. 3a), gjë që mund të jetë për shkak të probabilitetit të ulët të difuzionit pasiv të shumicës së anëtarëve të bibliotekës së peptideve në ndarjen e LSH-së ose fagët relativë kanë tendencë të mbahen ose hiqen më me efikasitet nga qarkullimi i gjakut sesa bakteriofagët. Megjithatë, në raundin e dytë të panimit, një përzgjedhje e fortë e fagëve në LSH u vu re në të dy kladet, duke sugjeruar që raundi i mëparshëm ishte i pasuruar me fagë që shfaqnin peptide që nxisin thithjen e LSH-së (Fig. 3a). Përsëri, pa pasurim të konsiderueshëm të gjakut. Gjithashtu në raundin e tretë dhe të katërt, klonet e fagëve u pasuruan ndjeshëm në LSH. Duke krahasuar frekuencën relative të secilës sekuencë unike peptidesh midis dy raundeve të fundit të përzgjedhjes, zbuluam se sekuencat ishin edhe më të pasuruara në raundin e katërt të përzgjedhjes (Fig. 3b). Një total prej 931 motivesh tripeptidesh u nxorën nga të gjitha 64 sekuencat unike peptide duke përdorur të dy orientimet peptide. Motivet më të pasuruara në raundin e katërt u ekzaminuan më nga afër për profilet e tyre të pasurimit në të gjitha raundet krahasuar me bibliotekën e injektuar (kufiri: pasurim 10%) (Fig. 6c plotësuese). Modelet e përgjithshme të përzgjedhjes treguan se shumica e motiveve të studiuara u pasuruan në të gjitha raundet e mëparshme të të dy degëve të përzgjedhjes. Megjithatë, disa motive (p.sh. SGL, VSG, LGS GSV) ishin kryesisht nga klada alternative A, ndërsa të tjera (p.sh. FGW, RTN, WGF, NTR) u pasuruan në kladën alternative B.
Validimi i transportit në Lëndin Cerebrospinal të peptideve të shfaqura në fag të pasuruara me Lëndin Cerebrospinal dhe peptideve udhëheqëse të biotiniluara të konjuguara me ngarkesa streptavidine.
(a) Raportet e pasurimit të llogaritura në të katër raundet (R1-R4) bazuar në titrat e fagut të injektuar (hyrje = I) dhe titrat e fagut të përcaktuar në LCS (dalje = O). Faktorët e pasurimit për tre raundet e fundit (R2-R4) u llogaritën duke krahasuar me raundin e mëparshëm dhe raundin e parë (R1) me të dhëna peshe. Shiritat e hapur janë lëngu cerebrospinal, shiritat e hijezuar janë plazma. (***p<0.001, bazuar në testin t të Studentit). (b) Lista e peptideve më të bollshme të fagut, të renditura sipas proporcionit të tyre relativ me të gjithë fagët e mbledhur në LCS pas raundit 4 të përzgjedhjes. Gjashtë klonet më të zakonshme të fagut janë të theksuara me ngjyra, të numëruara dhe faktorët e tyre të pasurimit midis raundeve 3 dhe 4 të përzgjedhjes (futje). (c, d) Gjashtë klonet më të pasuruara të fagut, bibliotekat e fagut bosh dhe të peptideve të fagut prindëror nga raundi 4 u analizuan individualisht në një model mostrimi të LCS. Mostrat e LCS dhe të gjakut u mblodhën në pikat kohore të treguara. (c) Sasi të barabarta të 6 kloneve të fagut kandidat (2 x 1010 fagë/kafshë), fagëve bosh (#1779) (2 x 1010 fagë/kafshë) dhe bibliotekave të peptideve të fagut stok (2 x 1012 fagë/kafshë). Injektohen të paktën 3 CM tek kafsha e kanulizuar veçmas nëpërmjet venës së bishtit. Tregohet farmakokinetika e LSH-së së secilit klonit të fagut të injektuar dhe bibliotekës së peptideve të fagut me kalimin e kohës. (d) tregon raportin mesatar të LSH-së/gjak për të gjithë fagët e rikuperuar/mL gjatë kohës së marrjes së mostrave. (e) Katër peptide udhëheqëse sintetike dhe një kontroll i përzier u lidhën me biotinë me streptavidinën nëpërmjet N-terminusit të tyre (shfaqje tetramerike) e ndjekur nga injektimi (vena e bishtit iv, 10 mg streptavidinë/kg). Të paktën tre minj të intubuar (N = 3). ). Mostrat e LSH-së u mblodhën në pikat kohore të treguara dhe përqendrimet e streptavidinës u matën me anë të ELISA-s anti-streptavidinë në LSH (nd = nuk u zbulua). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bazuar në testin ANOVA). (f) Krahasimi i sekuencës së aminoacideve të klonit më të pasuruar të peptidit të fagut #2002 (vjollcë) me klone të tjera të zgjedhura të peptidit të fagut nga raundi i 4-të i përzgjedhjes. Fragmente aminoacidesh identike dhe të ngjashme janë të koduara me ngjyra.
Nga të gjithë fagët e pasuruar në raundin e katërt (Fig. 3b), u zgjodhën gjashtë klone kandidatë për analiza të mëtejshme individuale në modelin e marrjes së mostrave të LSH-së. Sasi të barabarta të gjashtë bibliotekave të fagëve kandidatë, fagëve bosh (pa futje) dhe peptideve të profilit u injektuan në tre kafshë CM të kanulizuara, dhe farmakokinetika u përcaktua në analizat e LSH-së (Fig. 3c) dhe gjakut (Fig. Plotësuese 7). Të gjithë klonet e fagëve të testuar shënjestruan ndarjen e LSH-së në një nivel 10-1000 herë më të lartë se ai i fagut të kontrollit bosh (#1779). Për shembull, klonet #2020 dhe #2077 kishin titre LSH-je rreth 1000 herë më të larta se fagu i kontrollit. Profili farmakokinetik i secilit peptid të zgjedhur është i ndryshëm, por të gjithë kanë një aftësi të lartë të lëvizjes në LSH. Ne vumë re një rënie të vazhdueshme me kalimin e kohës për klonet #1903 dhe #2011, ndërsa për klonet #2077, #2002 dhe #2009 një rritje gjatë 10 minutave të para mund të tregojë transport aktiv, por duhet të verifikohet. Klonet #2020, #2002 dhe #2077 u stabilizuan në nivele të larta, ndërsa përqendrimi i LSH-së së klonit #2009 u ul ngadalë pas rritjes fillestare. Pastaj krahasuam frekuencën relative të secilit kandidat për LSH me përqendrimin e tij në gjak (Fig. 3d). Korrelacioni i titrit mesatar të secilit kandidat për LSH me titrin e tij në gjak në të gjitha kohët e marrjes së mostrave tregoi se tre nga gjashtë kandidatët ishin të pasuruar ndjeshëm me LSH në gjak. Është interesante se kloni #2077 tregoi stabilitet më të lartë në gjak (Figura Plotësuese 7). Për të konfirmuar që vetë peptidet janë të afta të transportojnë në mënyrë aktive ngarkesë tjetër përveç grimcave të fagut në ndarjen e LSH-së, ne sintetizuam katër peptide udhëheqëse të derivatizuara me biotinë në skajin N ku peptidet ngjiten në grimcën e fagut. Peptidet e biotiniluara (nr. 2002, 2009, 2020 dhe 2077) u konjuguuan me streptavidinë (SA) për të marrë forma multimerike që imitojnë disi gjeometrinë e fagut. Ky format na lejoi gjithashtu të matnim ekspozimin ndaj streptavidinës në gjak dhe lëngun cerebrospinal si peptide proteinike transportuese të ngarkesës. Është e rëndësishme të theksohet se të dhënat e fagut shpesh mund të riprodhoheshin kur peptidet sintetike u administruan në këtë format të konjuguar me SA (Fig. 3e). Peptidet e përziera kishin më pak ekspozim fillestar dhe pastrim më të shpejtë nga LSH me nivele të pazbulueshme brenda 48 orëve. Për të fituar njohuri mbi rrugët e shpërndarjes së këtyre kloneve të fagut peptid në hapësirën LSH, ne analizuam lokalizimin e goditjeve individuale të peptideve të fagut duke përdorur imunohistokimi (IHC) për të zbuluar drejtpërdrejt grimcat e fagut 1 orë pas injektimit intravenoz in vivo. Veçanërisht, klonet #2002, #2077 dhe #2009 mund të zbuloheshin me anë të ngjyrosjes së fortë në kapilarët e trurit, ndërsa fagu i kontrollit (#1779) dhe kloni #2020 nuk u zbuluan (Figura Plotësuese 8). Kjo sugjeron që këto peptide kontribuojnë në efektin në tru pikërisht duke kaluar BBB-në. Nevojitet analizë e mëtejshme e detajuar për të testuar këtë hipotezë, pasi rruga BSCFB mund të jetë gjithashtu e përfshirë. Kur krahasohet sekuenca e aminoacideve të klonit më të pasuruar (#2002) me peptide të tjera të përzgjedhura, u vu re se disa prej tyre kanë zgjatime të ngjashme të aminoacideve, të cilat mund të tregojnë një mekanizëm të ngjashëm transporti (Fig. 3f).
Për shkak të profilit të tij unik në plazmë dhe rritjes së ndjeshme të LSK-së me kalimin e kohës, kloni #2077 i shfaqjes së fagut u eksplorua më tej gjatë një periudhe më të gjatë 48-orëshe dhe ishte në gjendje të riprodhonte rritjen e shpejtë të LSK-së të vëzhguar në lidhje me nivelet e qëndrueshme të SA-së (Fig. 4a). Lidhur me klonet e tjerë të identifikuar të fagut, #2077 u ngjyros fort për kapilarët e trurit dhe tregoi kolokalizim të konsiderueshëm me lektinën shënuese kapilare kur u pa me rezolucion më të lartë dhe ndoshta disa ngjyrosje në hapësirën parenkimale (Figura 4b). Për të hetuar nëse efektet farmakologjike të ndërmjetësuara nga peptidi mund të arriheshin në SNQ, ne kryem një eksperiment në të cilin versionet e biotiniluara të i) peptidit tranzit #2077 dhe ii) peptidit frenues BACE1 u përzien me SA në dy raporte të ndryshme. Për një kombinim përdorëm vetëm frenuesin e peptidit BACE1 dhe për tjetrin përdorëm një raport 1:3 të frenuesit të peptidit BACE1 me peptidin #2077. Të dy mostrat u administruan në mënyrë intravenoze dhe nivelet e peptidit beta-amiloid 40 (Abeta40) në gjak dhe lëng cerebrospinal u matën me kalimin e kohës. Abeta40 u mat në LCS pasi pasqyron frenimin e BACE1 në parenkimën e trurit. Siç pritej, të dy komplekset ulën ndjeshëm nivelet e Abeta40 në gjak (Fig. 4c, d). Megjithatë, vetëm mostrat që përmbanin një përzierje të peptidit nr. 2077 dhe një frenues të peptidit BACE1 të konjuguar me SA shkaktuan një rënie të konsiderueshme të Abeta40 në lëngun cerebrospinal (Fig. 4c). Të dhënat tregojnë se peptidi nr. 2077 është në gjendje të transportojë proteinën SA 60 kDa në SNQ dhe gjithashtu shkakton efekte farmakologjike me frenues të peptidit BACE1 të konjuguar me SA.
(a) Injektim klonal (2 × 10 fagë/kafshë) i fagut T7 që tregon profile farmakokinetike afatgjata të peptidit #2077 të LCS (RLSSVDSDLSGC) dhe fagut kontrollues të painjektuar (#1779) në të paktën tre minj të intubuar me CM. (b) Imazh mikroskopik konfokal i mikroenave kortikale përfaqësuese në minjtë e injektuar me fag (2 × 10 10 fagë/kafshë) që tregon kundërngjyrosjen e peptidit #2077 dhe enëve të gjakut (lektinë). Këto klone të fagut iu administruan 3 minjve dhe u lanë të qarkullonin për 1 orë para perfuzionit. Truri u pre dhe u ngjyros me antitrupa poliklonalë të shënuar me FITC kundër kapsidës së fagut T7. Dhjetë minuta para perfuzionit dhe fiksimit pasues, lektina e shënuar me DyLight594 u administrua në mënyrë intravenoze. Imazhe fluoreshente që tregojnë ngjyrosjen e lektinës (e kuqe) të anës luminale të mikroenave dhe fagëve (jeshile) në lumenin e kapilarëve dhe indit perivaskular të trurit. Shiriti i shkallës korrespondon me 10 µm. (c, d) Peptidi frenues i BACE1 i biotiniluar vetëm ose në kombinim me peptidin tranzit të biotiniluar #2077 u shoqërua me streptavidinë, e ndjekur nga injektimi intravenoz i të paktën tre minjve CM të kanulizuar (10 mg streptavidinë/kg). Ulja e ndërmjetësuar nga frenuesi i peptidit BACE1 në Aβ40 u mat me ELISA Aβ1-40 në gjak (e kuqe) dhe lëng cerebrospinal (portokalli) në pikat kohore të treguara. Për qartësi më të mirë, një vijë me pika është vizatuar në grafik në një shkallë prej 100%. (c) Ulja e përqindjes së Aβ40 në gjak (trekëndësha të kuq) dhe lëng cerebrospinal (trekëndësha portokalli) në minjtë e trajtuar me streptavidinë të konjuguar me peptidin tranzit #2077 dhe peptidin frenues BACE1 në një raport 3:1. (d) Ulja e përqindjes së Aβ40 në gjak (rrathë të kuq) dhe lëngut cerebrospinal (rrathë portokalli) të minjve të trajtuar vetëm me streptavidinë të shoqëruar me një peptid frenues të BACE1. Përqendrimi i Aβ në kontrollin ishte 420 pg/ml (devijimi standard = 101 pg/ml).
Shfaqja e fagut është aplikuar me sukses në disa fusha të kërkimit biomjekësor17. Kjo metodë është përdorur për studime të diversitetit vaskular in vivo18,19, si dhe për studime që synojnë enët cerebrale20,21,22,23,24,25,26. Në këtë studim, ne e zgjeruam zbatimin e kësaj metode përzgjedhjeje jo vetëm në identifikimin e drejtpërdrejtë të peptideve që synojnë enët cerebrale, por edhe në zbulimin e kandidatëve me veti transporti aktiv për të kaluar barrierën gjak-tru. Tani përshkruajmë zhvillimin e një procedure përzgjedhjeje in vivo në minjtë e intubuar CM dhe demonstrojmë potencialin e saj për të identifikuar peptidet me veti të zhvendosjes në LCS. Duke përdorur fagun T7 që shfaq një bibliotekë të peptideve të rastësishme 12-mer, ne ishim në gjendje të demonstronim se fagu T7 është mjaft i vogël (afërsisht 60 nm në diametër)10 për t'u përshtatur me barrierën gjak-tru, duke kaluar kështu drejtpërdrejt barrierën gjak-tru ose pleksusin koroid. Ne vumë re se mbledhja e LSH-së nga minjtë CM të kanuluar ishte një metodë e mirëkontrolluar e shqyrtimit funksional in vivo, dhe se fagu i nxjerrë jo vetëm që lidhej me enët e gjakut, por funksiononte edhe si transportues përtej barrierës hemato-tru. Për më tepër, duke mbledhur njëkohësisht gjak dhe duke aplikuar HTS në LSH dhe fagët e nxjerrë nga gjaku, ne konfirmuam se zgjedhja jonë e LSH-së nuk ishte ndikuar nga pasurimi i gjakut ose përshtatshmëria për zgjerim midis raundeve të përzgjedhjes. Megjithatë, ndarja e gjakut është pjesë e procedurës së përzgjedhjes, pasi fagët e aftë për të arritur ndarjen e LSH-së duhet të mbijetojnë dhe të qarkullojnë në qarkullimin e gjakut për aq kohë sa të pasurohen në tru. Për të nxjerrë informacion të besueshëm të sekuencës nga të dhënat e papërpunuara të HTS, ne zbatuam filtra të përshtatur për gabimet specifike të sekuencimit të platformës në rrjedhën e punës së analizës. Duke përfshirë parametrat kinetikë në metodën e shqyrtimit, ne konfirmuam farmakokinetikën e shpejtë të fagëve T7 të tipit të egër (t½ ~ 28 min) në gjak24, 27, 28 dhe gjithashtu përcaktuam gjysmë-jetën e tyre në lëngun cerebrospinal (t½ ~ 26 min) në minutë). Pavarësisht profileve të ngjashme farmakokinetike në gjak dhe LCS, vetëm 0.001% e përqendrimit të fagut në gjak mund të zbulohej në LCS, duke treguar lëvizshmëri të ulët në sfond të fagut T7 të tipit të egër përmes barrierës hemato-tru. Ky punim thekson rëndësinë e raundit të parë të përzgjedhjes kur përdoren strategjitë e panningut in vivo, veçanërisht për sistemet e fagëve që pastrohen shpejt nga qarkullimi, pasi pak klone janë në gjendje të arrijnë ndarjen e CNS. Kështu, në raundin e parë, zvogëlimi i diversitetit të bibliotekës ishte shumë i madh, pasi vetëm një numër i kufizuar klonesh u mblodhën përfundimisht në këtë model shumë të rreptë të LCS. Kjo strategji e panningut in vivo përfshinte disa hapa përzgjedhjeje siç janë akumulimi aktiv në ndarjen e LCS, mbijetesa e kloneve në ndarjen e gjakut dhe heqja e shpejtë e kloneve të fagut T7 nga gjaku brenda 10 minutave të para (Fig. 1d dhe Fig. Plotësuese 4M). Kështu, pas raundit të parë, klone të ndryshme të fagut u identifikuan në LCS, megjithëse i njëjti grup fillestar u përdor për kafshët individuale. Kjo sugjeron që hapa të shumëfishta të përzgjedhjes strikte për bibliotekat burimore me numër të madh anëtarësh të bibliotekës rezultojnë në një reduktim të ndjeshëm të diversitetit. Prandaj, ngjarjet e rastësishme do të bëhen një pjesë integrale e procesit fillestar të përzgjedhjes, duke ndikuar shumë në rezultat. Ka të ngjarë që shumë nga klonet në bibliotekën origjinale të kenë pasur një prirje shumë të ngjashme të pasurimit të LSH-së. Megjithatë, edhe në të njëjtat kushte eksperimentale, rezultatet e përzgjedhjes mund të ndryshojnë për shkak të numrit të vogël të secilit klon të veçantë në grupin fillestar.
Motivet e pasuruara në LCS ndryshojnë nga ato në gjak. Është interesante se ne vumë re zhvendosjen e parë drejt peptideve të pasura me glicinë në gjakun e kafshëve individuale. (Fig. 1g, Fig. Plotësuese 4e, 4f). Fagu që përmban peptide glicine mund të jetë më i qëndrueshëm dhe më pak i prirur të nxirret nga qarkullimi. Megjithatë, këto peptide të pasura me glicinë nuk u zbuluan në mostrat e lëngut cerebrospinal, duke sugjeruar që bibliotekat e kuruara kaluan nëpër dy hapa të ndryshëm përzgjedhjeje: njëri në gjak dhe tjetri u lejua të grumbullohej në lëngun cerebrospinal. Klonet e pasuruara me LCS që rezultuan nga raundi i katërt i përzgjedhjes janë testuar gjerësisht. Pothuajse të gjithë klonet e testuar individualisht u konfirmuan të pasuruar në LCS krahasuar me fagun e kontrollit bosh. Një goditje peptidi (#2077) u ekzaminua në më shumë detaje. Ai tregoi një gjysmë-jetë plazmatike më të gjatë krahasuar me goditjet e tjera (Figura 3d dhe Figura Plotësuese 7), dhe çuditërisht, ky peptid përmbante një mbetje cisteine ​​në C-terminal. Kohët e fundit është treguar se shtimi i cisteinës në peptide mund të përmirësojë vetitë e tyre farmakokinetike duke u lidhur me albuminën 29. Kjo është aktualisht e panjohur për peptidin #2077 dhe kërkon studime të mëtejshme. Disa peptide treguan një varësi nga valenca në pasurimin e LSH-së (të dhënat nuk janë paraqitur), e cila mund të lidhet me gjeometrinë e sipërfaqes së shfaqur të kapsidës T7. Sistemi T7 që përdorëm tregoi 5-15 kopje të secilit peptid për grimcë fagu. IHC u krye në klone kandidate të fagut kryesor të injektuar në mënyrë intravenoze në korteksin cerebral të minjve (Fig. Plotësuese 8). Të dhënat treguan se të paktën tre klone (Nr. 2002, Nr. 2009 dhe Nr. 2077) bashkëvepruan me BBB-në. Mbetet për t'u përcaktuar nëse ky bashkëveprim i BBB rezulton në akumulimin e LSH-së apo lëvizjen e këtyre kloneve direkt në BCSFB. Është e rëndësishme të tregojmë se peptidet e përzgjedhura ruajnë kapacitetin e tyre të transportit të LSH-së kur sintetizohen dhe lidhen me ngarkesën e proteinave. Lidhja e peptideve të biotiniluara N-terminale me SA në thelb përsërit rezultatet e marra me klonet e tyre përkatëse të fagut në gjak dhe lëngun cerebrospinal (Fig. 3e). Së fundmi, ne tregojmë se peptidi kryesor #2077 është në gjendje të nxisë veprimin në tru të një frenuesi të peptidit të biotiniluar të BACE1 të konjuguar me SA, duke shkaktuar efekte të theksuara farmakodinamike në SNQ duke ulur ndjeshëm nivelet e Abeta40 në LCS (Fig. 4). Ne nuk ishim në gjendje të identifikonim asnjë homolog në bazën e të dhënave duke kryer një kërkim të homologjisë së sekuencës peptide të të gjitha rezultateve. Është e rëndësishme të theksohet se madhësia e bibliotekës T7 është afërsisht 109, ndërsa madhësia teorike e bibliotekës për 12-meret është 4 x 1015. Prandaj, ne zgjodhëm vetëm një pjesë të vogël të hapësirës së diversitetit të bibliotekës së peptideve 12-mere, që mund të nënkuptojë se peptide më të optimizuara mund të identifikohen duke vlerësuar hapësirën e sekuencës ngjitur të këtyre rezultateve të identifikuara. Hipotetikisht, një nga arsyet pse nuk kemi gjetur asnjë homolog natyror të këtyre peptideve mund të jetë deselektimi gjatë evolucionit për të parandaluar hyrjen e pakontrolluar të motiveve të caktuara peptide në tru.
Të marra së bashku, rezultatet tona ofrojnë një bazë për punë të ardhshme për të identifikuar dhe karakterizuar sistemet e transportit të barrierës cerebrovaskulare in vivo në më shumë detaje. Konfigurimi bazë i kësaj metode bazohet në një strategji përzgjedhjeje funksionale që jo vetëm identifikon klonet me veti lidhëse vaskulare cerebrale, por gjithashtu përfshin një hap kritik në të cilin klonet e suksesshëm kanë aktivitet të brendshëm për të kaluar barrierat biologjike in vivo në ndarjen e CNS. Është të sqarohet mekanizmi i transportit të këtyre peptideve dhe preferenca e tyre për t'u lidhur me mikrovaskulaturën specifike për rajonin e trurit. Kjo mund të çojë në zbulimin e shtigjeve të reja për transportin e BBB-së dhe receptorëve. Ne presim që peptidet e identifikuara të mund të lidhen drejtpërdrejt me receptorët cerebrovaskularë ose me ligandët qarkullues të transportuar përmes BBB-së ose BCSFB-së. Vektorët peptidikë me aktivitet transporti në LCS të zbuluar në këtë punim do të hetohen më tej. Aktualisht po hetojmë specifikën e trurit të këtyre peptideve për aftësinë e tyre për të kaluar BBB-në dhe/ose BCSFB-në. Këto peptide të reja do të jenë mjete jashtëzakonisht të vlefshme për zbulimin e mundshëm të receptorëve ose shtigjeve të reja dhe për zhvillimin e platformave të reja shumë efikase për shpërndarjen e makromolekulave, të tilla si biologjikët, në tru.
Kanuloni cisternën e madhe (CM) duke përdorur një modifikim të metodës së përshkruar më parë. Minjtë Wistar të anestezuar (200-350 g) u montuan në një aparat stereotaksik dhe një prerje mesatare u bë mbi skalpin e rruar dhe të përgatitur aseptikisht për të ekspozuar kafkën. Hapni dy vrima në zonën e brezit të sipërm dhe fiksoni vidat e fiksimit në vrima. Një vrimë shtesë u shpua në kreshtën anësore okupitale për udhëzim stereotaktik të një kanule çeliku inox në CM. Vendosni çimento dentare rreth kanulës dhe sigurojeni me vida. Pas foto-shuarjes dhe forcimit të çimentos, plaga e lëkurës u mbyll me qepje supramid 4/0. Vendosja e duhur e kanulës konfirmohet nga rrjedhja spontane e lëngut cerebrospinal (CSF). Hiqeni miun nga aparati stereotaksik, merrni kujdesin e duhur postoperativ dhe menaxhimin e dhimbjes dhe lëreni të shërohet për të paktën një javë derisa të vërehen shenja gjaku në lëngun cerebrospinal. Minjtë Wistar (Crl:WI/Han) u morën nga Charles River (Francë). Të gjithë minjtë u mbajtën në kushte specifike pa patogjenë. Të gjitha eksperimentet me kafshë u miratuan nga Zyra Veterinare e Qytetit të Bazelit, Zvicër, dhe u kryen në përputhje me Licencën e Kafshëve Nr. 2474 (Vlerësimi i Transportit Aktiv të Trurit duke Matur Nivelet e Kandidatëve Terapeutikë në Lëngun Cerebrospinal dhe Trurin e Miut).
Mbajeni butësisht miun të vetëdijshëm me kanulën CM në dorë. Hiqeni Daturën nga kanula dhe mblidhni 10 µl lëng cerebrospinal që rrjedh spontanisht. Meqenëse kalueshmëria e kanulës përfundimisht u kompromentua, në këtë studim u përfshinë vetëm mostra të pastra të lëngut cerebrospinal pa shenja të kontaminimit të gjakut ose njollosjes. Paralelisht, afërsisht 10-20 μl gjak u morën nga një prerje e vogël në majë të bishtit në tuba me heparinë (Sigma-Aldrich). LSH dhe gjaku u mblodhën në pika të ndryshme kohore pas injektimit intravenoz të fagut T7. Përafërsisht 5-10 μl lëng u hodh para se të mblidhej çdo mostër e LSH-së, që korrespondon me vëllimin e vdekur të kateterit.
Bibliotekat u gjeneruan duke përdorur vektorin T7Select 10-3b siç përshkruhet në manualin e sistemit T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Shkurtimisht, një insert i rastësishëm i ADN-së 12-mer u sintetizua në formatin e mëposhtëm:
Kodi NNK u përdor për të shmangur kodonet e ndalimit të dyfishtë dhe mbishprehjen e aminoacideve në insert. N është një raport ekuimolar i përzier manualisht i secilit nukleotid, dhe K është një raport ekuimolar i përzier manualisht i nukleotideve të adeninës dhe citozinës. Rajonet njëvargore u shndërruan në ADN me dy vargje me anë të inkubimit të mëtejshëm me dNTP (Novagen) dhe enzimën Klenow (New England Biolabs) në tampon Klenow (New England Biolabs) për 3 orë në 37°C. Pas reagimit, ADN-ja me dy vargje u rikuperua nga reshjet e EtOH. ADN-ja që rezultoi u tret me enzimat e kufizimit EcoRI dhe HindIII (të dyja nga Roche). Inserti i copëtuar dhe i pastruar (QIAquick, Qiagen) (ligaza T4, New England Biolabs) u ligua më pas në kornizë në një vektor T7 të copëtuar paraprakisht pas aminoacidit 348 të gjenit të kapsidës 10B. Reaksionet e ligacionit u inkubuan në 16°C për 18 orë para paketimit in vitro. Paketimi i fagut in vitro u krye sipas udhëzimeve të dhëna me kitin e klonimit T7Select 10-3b (Novagen) dhe tretësira e paketimit u amplifikua një herë deri në lizë duke përdorur Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizatet u centrifuguan, titruan dhe u ngrinë në -80°C si një tretësirë ​​​​stok e glicerolit.
Amplifikim i drejtpërdrejtë PCR i rajoneve variabile të fagut të amplifikuara në lëng mishi ose pllakë duke përdorur prajmerë të bashkimit 454/Roche-amplicon të patentuar. Prajmeri i bashkimit përpara përmban sekuenca që rrethojnë rajonin variabël (NNK) 12 (specifik për shabllonin), Adaptuesin A të Titaniumit GS FLX dhe një sekuencë çelësi biblioteke me katër baza (TCAG) (Figura plotësuese 1a):
Prajmeri i bashkimit të kundërt përmban gjithashtu biotinë të bashkangjitur për të kapur sferat dhe Adaptuesin B të Titaniumit GS FLX të nevojshëm për amplifikimin klonal gjatë PCR-së së emulsionit:
Amplikonët iu nënshtruan më pas pirosekuencimit 454/Roche sipas protokollit 454 GS-FLX Titanium. Për sekuencimin manual të Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ADN-ja e fagut T7 u amplifikua me PCR dhe u sekuencua me çiftet e mëposhtme të prajmerëve:
Insertet nga pllakat individuale iu nënshtruan amplifikimit PCR duke përdorur Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sipas udhëzimeve të prodhuesit). Kryeni një fillim të nxehtë (10 minuta në 95 °C) dhe 35 cikle përforcuese (50 s në 95 °C, 1 minutë në 50 °C dhe 1 minutë në 72 °C).
Fagu nga bibliotekat, fagu i tipit të egër, fagu i shpëtuar nga LSK dhe gjaku, ose klone individuale u amplifikuan në Escherichia coli BL5615 në lëngun e TB (Sigma Aldrich) ose në enë 500 cm2 (Thermo Scientific) për 4 orë në 37°C. Fagu u nxor nga pllakat duke i shpëlarë me tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) ose duke i mbledhur pllakat me maja pipetash sterile. Fagu u izolua nga supernatanti i kulturës ose tamponi i nxjerrjes me një raund precipitimi të polietilenglikolit (PEG 8000) (Promega) dhe u resuspendua në tampon Tris-EDTA.
Fagu i amplifikuar iu nënshtrua 2-3 raundeve të heqjes së endotoksinës duke përdorur sfera për heqjen e endotoksinës (Miltenyi Biotec) para injektimit intravenoz (IV) (500 μl/kafshë). Në raundin e parë, u futën 2×1012 fagë; në të dytin, 2×1010 fagë; në raundin e tretë dhe të katërt të përzgjedhjes, 2×109 fagë për kafshë. Përmbajtja e fagut në LSH dhe mostrat e gjakut të mbledhura në pikat kohore të treguara u përcaktua me anë të numërimit të pllakave sipas udhëzimeve të prodhuesit (manuali i sistemit T7Select). Përzgjedhja e fagut u krye me injeksion intravenoz të bibliotekave të pastruara në venën e bishtit ose me ri-injeksion të fagut të nxjerrë nga LSH nga raundi i mëparshëm i përzgjedhjes, dhe mbledhjet pasuese u kryen në 10 minuta, 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 180 minuta dhe 240 minuta përkatësisht të mostrave të LSH dhe gjakut. U kryen gjithsej katër raunde të panimit in vivo, në të cilat dy degët e përzgjedhura u ruajtën dhe u analizuan veçmas gjatë tre raundeve të para të përzgjedhjes. Të gjitha insertet e fagëve të nxjerra nga LCS nga dy raundet e para të përzgjedhjes iu nënshtruan pirosekuencës 454/Roche, ndërsa të gjitha klonet e nxjerra nga LCS nga dy raundet e fundit të përzgjedhjes u sekuencuan manualisht. Të gjithë fagët e gjakut nga raundi i parë i përzgjedhjes iu nënshtruan gjithashtu pirosekuencës 454/Roche. Për injektimin e kloneve të fagëve, fagët e përzgjedhur u amplifikuan në E. coli (BL5615) në pllaka 500 cm2 në 37°C për 4 orë. Klonet e përzgjedhur individualisht dhe të sekuencuar manualisht u përhapën në mediumin TB. Pas nxjerrjes së fagut, pastrimit dhe heqjes së endotoksinës (siç përshkruhet më sipër), 2×1010 fagë/kafshë në 300 μl u injektuan në mënyrë intravenoze në njërën venë të bishtit.
Përpunimi paraprak dhe filtrimi cilësor i të dhënave të sekuencës. Të dhënat e papërpunuara 454/Roche u konvertuan nga një format binar standard i hartës së rrjedhës (sff) në një format të lexueshëm nga njeriu Pearson (fasta) duke përdorur softuerin e shitësit. Përpunimi i mëtejshëm i sekuencës së nukleotideve u krye duke përdorur programe dhe skripte C të patentuara (paketë softueri e papublikuar) siç përshkruhet më poshtë. Analiza e të dhënave parësore përfshin procedura të rrepta filtrimi me shumë faza. Për të filtruar leximet që nuk përmbanin një sekuencë të vlefshme ADN-je 12mer të futur, leximet u rreshtuan në mënyrë sekuenciale për etiketën fillestare (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etiketën e ndalimit (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dhe futjen në sfond (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) duke përdorur testin global Needleman-Wunsch. Rreshtimi lejon deri në 2 mospërputhje për rreshtim31. Prandaj, leximet pa etiketa fillimi dhe ndalimi dhe leximet që përmbajnë futje në sfond, d.m.th., rreshtimet që tejkalojnë numrin e lejuar të mospërputhjeve, u hoqën nga biblioteka. Sa i përket leximeve të mbetura, sekuenca e ADN-së N-mer që shtrihet nga shenja e fillimit dhe mbaron para shenjës së ndalimit u hoq nga sekuenca origjinale e leximit dhe u përpunua më tej (në tekstin e mëtejmë i referuar si "futje"). Pas përkthimit të futjes, pjesa pas kodonit të parë të ndalimit në skajin 5' të prajmerit hiqet nga futja. Përveç kësaj, nukleotidet që çojnë në kodone të paplota në skajin 3' të prajmerit u hoqën gjithashtu. Për të përjashtuar futjet që përmbajnë vetëm sekuenca sfondi, u hoqën edhe futjet e përkthyera që fillojnë me modelin e aminoacideve "PAG". Peptidet me një gjatësi post-përkthimi më pak se 3 aminoacide u hoqën nga biblioteka. Së fundmi, hiqet teprica në pishinën e futjeve dhe përcaktohet frekuenca e secilës futje unike. Rezultatet e kësaj analize përfshinin një listë të sekuencave të nukleotideve (futjeve) dhe frekuencave të tyre (të leximit) (Figurat Plotësuese 1c dhe 2).
Futjet e ADN-së N-mer të grupit sipas ngjashmërisë së sekuencës: Për të eliminuar gabimet e sekuencimit specifik 454/Roche (të tilla si problemet me sekuencimin e zgjatjeve homopolimere) dhe për të hequr tepricat më pak të rëndësishme, futjet e sekuencave të ADN-së N-mer të filtruara më parë (futjet) renditen sipas ngjashmërisë. Futjet (lejohen deri në 2 baza jo-përputhëse) duke përdorur një algoritëm përsëritës të përcaktuar si më poshtë: futjet renditen së pari sipas frekuencës së tyre (nga më e larta në më të ulëtën) dhe nëse janë të njëjta, sipas bazave të tyre dytësore (renditja sipas gjatësisë (nga më e gjata në më të shkurtër)). Kështu, futjet më të shpeshta dhe më të gjata përcaktojnë "grupin" e parë. Frekuenca e grupit vendoset në frekuencën kryesore. Pastaj, çdo futje e mbetur në listën e renditur u përpoq të shtohej në grup me anë të rreshtimit çift Needleman-Wunsch. Nëse numri i mospërputhjeve, futjeve ose fshirjeve në një rreshtim nuk tejkalon një prag prej 2, një futje shtohet në grup dhe frekuenca e përgjithshme e grupit rritet me sa shpesh është shtuar futja. Futjet e shtuara në një grup shënohen si të përdorura dhe përjashtohen nga përpunimi i mëtejshëm. Nëse sekuenca e futur nuk mund të shtohet në një grup ekzistues, sekuenca e futur përdoret për të krijuar një grup të ri me frekuencën e duhur të futjes dhe shënohet si e përdorur. Përsëritja përfundon kur çdo sekuencë futjeje është përdorur për të formuar një grup të ri ose mund të përfshihet në një grup ekzistues. Në fund të fundit, futjet e grupuara që përbëhen nga nukleotide përkthehen përfundimisht në sekuenca peptidesh (biblioteka peptidesh). Rezultati i kësaj analize është një grup futjesh dhe frekuencat e tyre përkatëse që përbëjnë numrin e leximeve të njëpasnjëshme (Fig. 2 plotësuese).
Gjenerimi i Motivit: Bazuar në një listë peptidesh unike, u krijua një bibliotekë që përmbante të gjitha modelet e mundshme të aminoacideve (aa) siç tregohet më poshtë. Çdo model i mundshëm me gjatësi 3 u nxor nga peptidi dhe modeli i tij invers u shtua së bashku me një bibliotekë të përbashkët motivesh që përmbante të gjitha modelet (tripeptidet). Bibliotekat e motiveve shumë përsëritëse u renditën dhe u hoq teprica. Pastaj, për secilin tripeptid në bibliotekën e motiveve, ne kontrolluam praninë e tij në bibliotekë duke përdorur mjete llogaritëse. Në këtë rast, frekuenca e peptidit që përmban tripeptidin e motivit të gjetur shtohet dhe i caktohet motivit në bibliotekën e motiveve ("numri i motiveve"). Rezultati i gjenerimit të motiveve është një varg dy-dimensional që përmban të gjitha shfaqjet e tripeptideve (motiveve) dhe vlerat e tyre përkatëse, të cilat janë numri i leximeve të renditjes që rezultojnë në motivin përkatës kur leximet filtrohen, grupohen dhe përkthehen. Metrikat siç përshkruhen në detaje më sipër.
Normalizimi i numrit të motiveve dhe grafikëve përkatës të shpërndarjes: Numri i motiveve për secilën mostër u normalizua duke përdorur
ku ni është numri i leximeve që përmbajnë temën i. Kështu, vi përfaqëson frekuencën përqindjeje të leximeve (ose peptideve) që përmbajnë motivin i në mostër. Vlerat P për numrin jo të normalizuar të motiveve u llogaritën duke përdorur testin e saktë të Fisherit. Lidhur me korelogramet e numrit të motiveve, korrelacionet e Spearman u llogaritën duke përdorur numrin e normalizuar të motiveve me R.
Për të vizualizuar përmbajtjen e aminoacideve në secilën pozicion në bibliotekën e peptideve, u krijuan logogramet web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Së pari, përmbajtja e aminoacideve në secilën pozicion të peptidit 12-mer ruhet në një matricë 20×12. Pastaj, një grup prej 1000 peptidesh që përmbajnë të njëjtën përmbajtje relative të aminoacideve në secilën pozicion gjenerohet në formatin fasta-sequence dhe ofrohet si input në web-logo 3, i cili gjeneron një paraqitje grafike të përmbajtjes relative të aminoacideve në secilën pozicion për një bibliotekë të caktuar peptidesh. Për të vizualizuar grupet e të dhënave shumëdimensionale, hartat e nxehtësisë u krijuan duke përdorur një mjet të zhvilluar brenda R (biosHeatmap, një paketë R që ende nuk është publikuar). Dendrogramet e paraqitura në hartat e nxehtësisë u llogaritën duke përdorur metodën e grupimit hierarkik të Ward me metrikën e distancës Euklidiane. Për analizën statistikore të të dhënave të pikëzimit të motiveve, vlerat P për pikëzimin e panormalizuar u llogaritën duke përdorur testin e saktë të Fisher. Vlerat P për grupe të tjera të të dhënave u llogaritën në R duke përdorur testin t të Studentit ose ANOVA-n.
Klonet e përzgjedhura të fagëve dhe fagët pa futje u injektuan në mënyrë intravenoze nëpërmjet venës së bishtit (2×1010 fagë/kafshë në 300 μl PBS). Dhjetë minuta para perfuzionit dhe fiksimit pasues, të njëjtave kafshë iu injektua në mënyrë intravenoze 100 μl lektinë të shënuar me DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuta pas injektimit të fagut, minjtë u perfuzuan nëpërmjet zemrës me 50 ml PBS të ndjekur nga 50 ml 4% PFA/PBS. Mostrat e trurit u fiksuan gjithashtu gjatë natës në 4% PFA/PBS dhe u zhytën në 30% sukrozë gjatë natës në 4°C. Mostrat ngrihen menjëherë në përzierjen OCT. Analiza imunohistokimike e mostrave të ngrira u krye në temperaturë ambienti në krioseksione 30 µm të bllokuara me 1% BSA dhe të inkubuara me antitrupa poliklonalë të shënuar me FITC kundër fagut T7 (Novus NB 600-376A) në 4°C. Inkubojeni gjatë natës. Së fundmi, seksionet u lanë 3 herë me PBS dhe u ekzaminuan me një mikroskop lazer konfokal (Leica TCS SP5).
Të gjitha peptidet me një pastërti minimale prej 98% u sintetizuan nga GenScript USA, u biotiniluan dhe u liofilizuan. Biotina lidhet nëpërmjet një ndarësi shtesë të trefishtë të glicinës në skajin N. Kontrolloni të gjitha peptidet duke përdorur spektrometrinë e masës.
Streptavidina (Sigma S0677) u përzie me një tepricë 5-fish ekuimolare të peptidit të biotiniluar, peptidit frenues të BACE1 të biotiniluar, ose një kombinim (raporti 3:1) të peptidit frenues të BACE1 të biotiniluar dhe peptidit frenues të BACE1 në 5-10% DMSO/të inkubuar në PBS. 1 orë në temperaturën e dhomës para injektimit. Peptidet e konjuguara me streptavidinë u injektuan në mënyrë intravenoze në një dozë prej 10 mg/kg në njërën nga venat e bishtit të minjve me zgavër cerebrale.
Përqendrimi i komplekseve streptavidinë-peptid u vlerësua me anë të ELISA-s. Pllakat e mikrotitrimit Nunc Maxisorp (Sigma) u veshën gjatë natës në 4°C me 1.5 μg/ml antitrup anti-streptavidinë miu (Thermo, MA1-20011). Pas bllokimit (tampon bllokues: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% xhelatinë, 1% BSA) në temperaturë ambienti për 2 orë, pllaka u la me 0.05% Tween-20/PBS (tampon larës) për 3 sekonda, mostrat e LSH-së dhe plazmës u shtuan në puse të holluara me tampon bllokues (plazma 1:10,000, CSF 1:115). Pllaka u inkubua më pas gjatë natës në 4°C me antitrupin e zbulimit (1 μg/ml, anti-streptavidinë-HRP, Novus NB120-7239). Pas tre hapave të larjes, streptavidina u zbulua me anë të inkubimit në tretësirën e substratit TMB (Roche) për deri në 20 minuta. Pas ndalimit të zhvillimit të ngjyrës me 1M H2SO4, matni absorbimin në 450 nm.
Funksioni i kompleksit frenues streptavidin-peptid-BACE1 u vlerësua me anë të ELISA-s Aβ(1-40) sipas protokollit të prodhuesit (Wako, 294-64701). Shkurtimisht, mostrat e LSH-së u holluan në tretës standard (1:23) dhe u inkubuan gjatë natës në 4°C në pllaka me 96 puseta të veshura me antitrupin kapës BNT77. Pas pesë hapave të larjes, u shtua antitrupi BA27 i konjuguar me HRP dhe u inkubua për 2 orë në 4°C, i ndjekur nga pesë hapa larjeje. Aβ(1–40) u zbulua me anë të inkubimit në tretësirë ​​TMB për 30 minuta në temperaturën e dhomës. Pasi zhvillimi i ngjyrës është ndaluar me tretësirën ndaluese, matni thithjen në 450 nm. Mostrat e plazmës iu nënshtruan nxjerrjes së fazës së ngurtë para ELISA-s Aβ(1–40). Plazma u shtua në 0.2% DEA (Sigma) në pllaka me 96 puseta dhe u inkubua në temperaturën e dhomës për 30 minuta. Pas larjes së njëpasnjëshme të pllakave SPE (Oasis, 186000679) me ujë dhe 100% metanol, mostrat e plazmës u shtuan në pllakat SPE dhe i gjithë lëngu u hoq. Mostrat u lanë (së pari me 5% metanol pastaj me 30% metanol) dhe u eluuan me 2% NH4OH/90% metanol. Pas tharjes së eluatit në 55°C për 99 minuta në rrymë konstante N2, mostrat u reduktuan në hollues standardë dhe Aβ(1–40) u mat siç përshkruhet më sipër.
Si ta citoni këtë artikull: Urich, E. et al. Dorëzimi i ngarkesës në tru duke përdorur peptide tranziti të identifikuara in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dhe Moos T. Dhënia e barnave makromolekulare në tru duke përdorur terapi të synuar. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dhe Martinez-Martinez, P. Dërgimi i barnave peptide dhe proteinike përmes barrierës hemato-tru. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Barriera gjak-tru: një pengesë në zhvillimin e barnave në tru. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dhe Byrd, A. Perspektiva për përmirësimin e administrimit dhe shënjestrimit të barnave në tru nëpërmjet rrugës pleksus koroid-lcf. Kërkime Farmaceutike 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizimi i biofarmaceutikëve me kuaj molekularë Trojan për shpërndarjen në tru. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Transporti i peptideve të ndërmjetësuara nga receptori WM i Pardridge-it përmes barrierës hemato-tru. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Rritja e depërtimit në tru dhe efikasitetit të antitrupave terapeutikë duke përdorur transportues molekularë monovalentë. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transporti i receptorit të transferrinës (TfR) përcakton thithjen nga truri të varianteve të afinitetit të antitrupave TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).