Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Shfaq një karusel me tre rrëshqitje njëherësh.Përdorni butonat Previous dhe Next për të lëvizur nëpër tre rrëshqitje në të njëjtën kohë, ose përdorni butonat rrëshqitës në fund për të lëvizur nëpër tre rrëshqitje në të njëjtën kohë.
Barriera gjaku-tru dhe barriera gjak-tru parandalojnë agjentët bioterapeutikë që të arrijnë objektivat e tyre në sistemin nervor qendror, duke penguar kështu trajtimin efektiv të sëmundjeve neurologjike.Për të zbuluar transportues të rinj të trurit in vivo, ne prezantuam një bibliotekë të peptideve të fagut T7 dhe grumbulluam gjak dhe lëng cerebrospinal (CSF) në mënyrë serike duke përdorur një model të kanuluar të ndërgjegjshëm të grupit të madh të minjve.Klonet specifike të fagut u pasuruan shumë në CSF pas katër raundeve të përzgjedhjes.Testimi i peptideve kandidate individuale zbuloi pasurim më shumë se 1000-fish në CSF.Bioaktiviteti i shpërndarjes së ndërmjetësuar nga peptidi në tru u konfirmua nga një reduktim 40% i nivelit të amiloid-β në lëngun cerebrospinal duke përdorur një frenues peptid BACE1 të lidhur me peptidin e ri transit të identifikuar.Këto rezultate sugjerojnë se peptidet e identifikuara nga metodat e përzgjedhjes së fagut in vivo mund të jenë mjete të dobishme për shpërndarjen sistematike të makromolekulave në tru me një efekt terapeutik.
Hulumtimi i terapisë në shënjestër të sistemit nervor qendror (CNS) është fokusuar kryesisht në identifikimin e barnave dhe agjentëve të optimizuar që shfaqin vetitë e synimit të CNS, me më pak përpjekje për zbulimin e mekanizmave që drejtojnë shpërndarjen aktive të barnave në tru.Kjo ka filluar të ndryshojë tani pasi shpërndarja e barnave, veçanërisht molekulat e mëdha, është një pjesë integrale e zhvillimit të ilaçeve moderne të neuroshkencës.Mjedisi i sistemit nervor qendror është i mbrojtur mirë nga sistemi i barrierës cerebrovaskulare, i përbërë nga barriera gjaku-tru (BBB) ​​dhe barriera gjak-tru (BCBB)1, duke e bërë të vështirë dërgimin e barnave në tru1,2.Është vlerësuar se pothuajse të gjitha barnat me molekula të mëdha dhe më shumë se 98% e barnave me molekula të vogla eliminohen nga truri3.Kjo është arsyeja pse është shumë e rëndësishme të identifikohen sisteme të reja të transportit të trurit që ofrojnë shpërndarje efikase dhe specifike të barnave terapeutike në CNS 4,5.Megjithatë, BBB dhe BCSFB paraqesin gjithashtu një mundësi të shkëlqyer për shpërndarjen e barnave pasi ato depërtojnë dhe hyjnë në të gjitha strukturat e trurit përmes enëve të gjakut të tij të gjerë.Kështu, përpjekjet aktuale për të përdorur metoda jo-invazive të shpërndarjes në tru bazohen kryesisht në mekanizmin e transportit të ndërmjetësuar nga receptorët (PMT) duke përdorur receptorin endogjen BBB6.Pavarësisht përparimeve kryesore të kohëve të fundit duke përdorur rrugën e receptorit të transferinës7,8, nevojitet zhvillim i mëtejshëm i sistemeve të reja të shpërndarjes me veti të përmirësuara.Për këtë qëllim, qëllimi ynë ishte të identifikonim peptide të afta për të ndërmjetësuar transportin CSF, pasi ato në parim mund të përdoren për të shpërndarë makromolekulat në SNQ ose për të hapur rrugë të reja receptore.Në veçanti, receptorët dhe transportuesit specifikë të sistemit cerebrovaskular (BBB dhe BSCFB) mund të shërbejnë si objektiva të mundshëm për shpërndarjen aktive dhe specifike të barnave bioterapeutike.Lëngu cerebrospinal (CSF) është një produkt sekretues i pleksusit koroid (CS) dhe është në kontakt të drejtpërdrejtë me lëngun intersticial të trurit përmes hapësirës subaraknoidale dhe hapësirës ventrikulare4.Kohët e fundit është treguar se lëngu cerebrospinal subaraknoid difuzon tepër në intersticin e trurit9.Shpresojmë të aksesojmë hapësirën parenkimale duke përdorur këtë trakt të hyrjes subaraknoidale ose direkt përmes BBB.Për ta arritur këtë, ne zbatuam një strategji të fuqishme të përzgjedhjes së fagut in vivo që identifikon në mënyrë ideale peptidet e transportuara nga njëra prej këtyre dy rrugëve të dallueshme.
Ne përshkruajmë tani një metodë sekuenciale të shfaqjes së fagut in vivo me marrjen e mostrave CSF të shoqëruar me sekuencën e xhiros së lartë (HTS) për të monitoruar raundet fillestare të përzgjedhjes me diversitetin më të lartë të bibliotekës.Ekzaminimi u krye te minjtë e vetëdijshëm me një kanulë të vendosur përgjithmonë të cisternës së madhe (CM) për të shmangur kontaminimin e gjakut.E rëndësishmja, kjo qasje zgjedh si synimin e trurit ashtu edhe peptidet me aktivitet transportues përgjatë barrierës cerebrovaskulare.Ne përdorëm fagët T7 për shkak të madhësisë së tyre të vogël (~60 nm)10 dhe sugjeruam që ata janë të përshtatshëm për transportin e vezikulave që lejojnë kalimin ndërqelizor të barrierës endoteliale dhe/ose epiteliale-medullës.Pas katër raundeve panning, popullatat e fagut u izoluan duke treguar pasurim të fortë in vivo të CSF-së dhe lidhje të mikrovazeve cerebrale.E rëndësishmja, ne ishim në gjendje të konfirmonim gjetjet tona duke demonstruar se peptidet kandidate më të mira të preferuara dhe të sintetizuara kimikisht janë në gjendje të transportojnë ngarkesën e proteinave në lëngun cerebrospinal.Së pari, efektet farmakodinamike të SNQ-së u krijuan duke kombinuar një peptid kryesor tranzit me një frenues të peptidit BACE1.Përveç demonstrimit se strategjitë funksionale të shqyrtimit in vivo mund të identifikojnë peptidet e reja të transportit të trurit si transportues efektiv të ngarkesave të proteinave, ne presim që qasjet e ngjashme të përzgjedhjes funksionale të bëhen gjithashtu të rëndësishme në identifikimin e rrugëve të reja të transportit të trurit.
Bazuar në njësitë e formimit të pllakës (PFU), pas hapit të paketimit të fagut, u projektua dhe u krijua një bibliotekë e rastësishme e peptideve lineare të fagut T7 12-mer me një diversitet prej afërsisht 109 (shih Materialet dhe Metodat).Është e rëndësishme të theksohet se ne e kemi analizuar me kujdes këtë bibliotekë përpara se të analizojmë in vivo.Përforcimi PCR i mostrave të bibliotekës së fagut duke përdorur primerë të modifikuar gjeneroi amplikone që ishin drejtpërdrejt të zbatueshëm për HTS (Fig. Suplementare 1a).Për shkak të a) gabimeve të renditjes HTS11, b) ndikimit në cilësinë e primerëve (NNK) 1-12 dhe c) pranisë së fagut të llojit të egër (wt) (insertet e skeletit) në bibliotekën e gatishmërisë, u zbatua një procedurë filtrimi sekuencash për të nxjerrë vetëm informacionin e sekuencës së verifikuar (Figura suplementare 1b).Këto hapa filtri zbatohen për të gjitha bibliotekat e renditjes HTS.Për bibliotekën standarde, u përftuan gjithsej 233,868 lexime, nga të cilat 39% kaluan kriteret e filtrit dhe u përdorën për analizën e bibliotekës dhe përzgjedhjen për raundet pasuese (Figura plotësuese 1c–e).Leximet ishin kryesisht shumëfisha të 3 çifteve bazë në gjatësi me një kulm në 36 nukleotide (Fig. Suplementare 1c), duke konfirmuar modelin e bibliotekës (NNK) 1-12.Veçanërisht, afërsisht 11% e anëtarëve të bibliotekës përmbanin një insert PAGISRELVDKL të tipit të egër (wt) 12-dimensionale dhe pothuajse gjysma e sekuencave (49%) përmbanin futje ose fshirje.HTS e bibliotekës së bibliotekës konfirmoi diversitetin e lartë të peptideve në bibliotekë: më shumë se 81% e sekuencave peptide u gjetën vetëm një herë dhe vetëm 1,5% u shfaqën në ≥4 kopje (Figura plotësuese 2a).Frekuencat e aminoacideve (aa) në të gjitha 12 pozicionet në repertor korreluan mirë me frekuencat e pritshme për numrin e kodoneve të gjeneruara nga repertori i degjeneruar NKK (Figura plotësuese 2b).Frekuenca e vëzhguar e mbetjeve aa të koduara nga këto inserte lidhet mirë me frekuencën e llogaritur (r = 0,893) (Figura plotësuese 2c).Përgatitja e bibliotekave të fagut për injeksion përfshin hapat e amplifikimit dhe heqjes së endotoksinës.Kjo më parë është treguar se redukton potencialisht diversitetin e bibliotekave të fagëve12,13.Prandaj, ne renditëm një bibliotekë fagu të përforcuar me pjatë që i ishte nënshtruar heqjes së endotoksinës dhe e krahasuam atë me bibliotekën origjinale për të vlerësuar frekuencën e AA.Një korrelacion i fortë (r = 0,995) u vu re midis grupit origjinal dhe grupit të përforcuar dhe të pastruar (Fig. Suplementare 2d), duke treguar se konkurrenca midis kloneve të përforcuara në pllaka duke përdorur fagun T7 nuk shkaktoi paragjykime të mëdha.Ky krahasim bazohet në frekuencën e motiveve tripeptide në secilën bibliotekë, pasi diversiteti i bibliotekave (~ 109) nuk mund të kapet plotësisht as me HTS.Analiza e frekuencës së aa në çdo pozicion zbuloi një paragjykim të vogël të varur nga pozicioni në tre pozicionet e fundit të repertorit të futur (Figura plotësuese 2e).Si përfundim, arritëm në përfundimin se cilësia dhe diversiteti i bibliotekës ishin të pranueshme dhe u vërejtën vetëm ndryshime të vogla në diversitet për shkak të amplifikimit dhe përgatitjes së bibliotekave të fagëve midis disa raundeve të përzgjedhjes.
Marrja serike e mostrave të lëngut cerebrospinal mund të kryhet duke implantuar në mënyrë kirurgjikale një kanulë në CM të minjve të vetëdijshëm për të lehtësuar identifikimin e fagut T7 të injektuar në mënyrë intravenoze (iv) nëpërmjet BBB dhe/ose BCSFB (Fig. 1a-b).Ne përdorëm dy krahë të pavarur përzgjedhës (krahët A dhe B) në tre raundet e para të përzgjedhjes in vivo (Fig. 1c).Ne rritëm gradualisht ashpërsinë e përzgjedhjes duke ulur sasinë totale të fagut të futur në tre raundet e para të përzgjedhjes.Për raundin e katërt të panimit, ne kombinuam mostrat nga degët A dhe B dhe kryem tre përzgjedhje shtesë të pavarura.Për të studiuar vetitë in vivo të grimcave të fagut T7 në këtë model, fagu i tipit të egër (PAGISRELVDKL master insert) u injektua te minjtë nëpërmjet venës së bishtit.Rikuperimi i fagëve nga lëngu cerebrospinal dhe gjaku në momente të ndryshme kohore tregoi se fagët ikozaedralë T7 relativisht të vegjël kishin një fazë të shpejtë pastrimi fillestar nga kompartimenti i gjakut (Fig. 3 plotësuese).Bazuar në titrat e administruar dhe vëllimin e gjakut të minjve, ne llogaritëm se vetëm afërsisht 1% wt.fag nga doza e administruar u zbulua në gjak 10 minuta pas injektimit intravenoz.Pas kësaj rënie të shpejtë fillestare, u mat një pastrim primar më i ngadalshëm me një gjysmë jetë prej 27.7 minutash.E rëndësishmja, vetëm shumë pak fagë u morën nga ndarja CSF, duke treguar një sfond të ulët për migrimin e fagut të tipit të egër në ndarjen CSF (Fig. 3 plotësuese).Mesatarisht, vetëm rreth 1 x 10-3% titra të fagut T7 në gjak dhe 4 x 10-8% të fagëve të injektuar fillimisht u zbuluan në lëngun cerebrospinal gjatë gjithë periudhës së kampionimit (0-250 min).Veçanërisht, gjysma e jetës (25.7 min) e fagut të tipit të egër në lëngun cerebrospinal ishte e ngjashme me atë të vërejtur në gjak.Këto të dhëna tregojnë se pengesa që ndan ndarjen CSF nga gjaku është e paprekur te minjtë e kanuluar me CM, duke lejuar zgjedhjen in vivo të bibliotekave të fagut për të identifikuar klonet që transportohen lehtësisht nga gjaku në ndarjen CSF.
(a) Vendosja e një metode për rimarrjen e mostrave të lëngut cerebrospinal (CSF) nga një pishinë e madhe.(b) Diagrami që tregon vendndodhjen qelizore të pengesës së sistemit nervor qendror (CNS) dhe strategjinë e përzgjedhjes së përdorur për të identifikuar peptidet që kalojnë pengesën gjaku-tru (BBB) ​​dhe barrierën gjak-tru.(c) Skema e rrjedhës së shqyrtimit të shfaqjes së fagut in vivo.Në çdo raund të përzgjedhjes, fagët (identifikuesit e kafshëve brenda shigjetave) u injektuan në mënyrë intravenoze.Dy degë alternative të pavarura (A, B) mbahen veçmas deri në raundin e 4-të të përzgjedhjes.Për raundet e përzgjedhjes 3 dhe 4, çdo klon fag i nxjerrë nga CSF u sekuencua manualisht.(d) Kinetika e fagut të izoluar nga gjaku (rrathët e kuq) dhe lëngu cerebrospinal (trekëndëshat e gjelbër) gjatë raundit të parë të përzgjedhjes në dy minj të kanuluar pas injektimit intravenoz të bibliotekës së peptideve T7 (2 x 1012 fagë/kafshë).Sheshat blu tregojnë përqendrimin mesatar fillestar të fagut në gjak, i llogaritur nga sasia e fagut të injektuar, duke marrë parasysh vëllimin total të gjakut.Sheshet e zeza tregojnë pikën e kryqëzimit të vijës y të ekstrapoluar nga përqendrimet e fagut të gjakut.(e,f) Paraqisni frekuencën dhe shpërndarjen relative të të gjitha motiveve të mundshme të mbivendosjes së tripeptideve që gjenden në peptid.Tregohet numri i motiveve të gjetura në 1000 lexime.Në mënyrë domethënëse (p < 0,001) motivet e pasuruara janë shënuar me pika të kuqe.(e) Skaterploti i korrelacionit që krahason frekuencën relative të motivit të tripeptidit të bibliotekës së injektuar me fagun e prejardhur nga gjaku nga kafshët #1.1 dhe #1.2.(f) Skaterploti i korrelacionit që krahason frekuencat relative të motiveve të tripeptideve të fagut të kafshëve #1.1 dhe #1.2 të izoluara në gjak dhe lëngun cerebrospinal.(g, h) Përfaqësimi i ID-së së sekuencës së fagut të pasuruar me gjak (g) kundrejt bibliotekave të injektuara dhe fagut të pasuruar në CSF (h) kundrejt gjakut pas një raundi përzgjedhjeje in vivo në të dy kafshët.Madhësia e kodit me një shkronjë tregon se sa shpesh ndodh ky aminoacid në atë pozicion.E gjelbër = polare, vjollcë = neutrale, blu = bazë, e kuqe = acidike dhe e zezë = aminoacide hidrofobike.Figura 1a, b është projektuar dhe prodhuar nga Eduard Urich.
Ne injektuam një bibliotekë të peptideve të fagut në dy minjtë e instrumenteve CM (clades A dhe B) dhe izoluam fagun nga lëngu cerebrospinal dhe gjaku (Figura 1d).Pastrimi i shpejtë fillestar i bibliotekës ishte më pak i theksuar në krahasim me fagun e tipit të egër.Gjysma e jetës mesatare të bibliotekës së injektuar në të dy kafshët ishte 24.8 minuta në gjak, e ngjashme me fagun e tipit të egër dhe 38.5 minuta në CSF.Mostrat e fagut të gjakut dhe të lëngut cerebrospinal nga secila kafshë iu nënshtruan HTS dhe të gjitha peptidet e identifikuara u analizuan për praninë e një motivi të shkurtër tripeptid.Motivet tripeptide u zgjodhën sepse ato ofrojnë një bazë minimale për formimin e strukturës dhe ndërveprimet peptide-proteinë14,15.Ne gjetëm një korrelacion të mirë në shpërndarjen e motiveve midis bibliotekës së fagut të injektuar dhe kloneve të nxjerra nga gjaku i të dy kafshëve (Fig. 1e).Të dhënat tregojnë se përbërja e bibliotekës është pasuruar vetëm pak në ndarjen e gjakut.Frekuencat e aminoacideve dhe sekuencat e konsensusit u analizuan më tej në çdo pozicion duke përdorur një përshtatje të softuerit Weblogo16.Është interesante se kemi gjetur një pasurim të fortë në mbetjet e glicinës në gjak (Fig. 1g).Kur gjaku u krahasua me klone të përzgjedhur nga CSF, u vu re një përzgjedhje e fortë dhe disa mospërzgjedhje të motiveve (Fig. 1f), dhe aminoacide të caktuara ishin preferenciale të pranishme në pozicione të paracaktuara në 12-anëtarësh (Fig. 1h).Veçanërisht, kafshët individuale ndryshonin ndjeshëm në lëngun cerebrospinal, ndërsa pasurimi i glicinës në gjak u vu re në të dy kafshët (Figura plotësuese 4a-j).Pas filtrimit të rreptë të të dhënave të sekuencës në lëngun cerebrospinal të kafshëve #1.1 dhe #1.2, u përftuan gjithsej 964 dhe 420 peptide unike 12-mere (Figura suplementare 1d-e).Klonet e fagut të izoluar u përforcuan dhe iu nënshtruan një raundi të dytë përzgjedhjeje in vivo.Fagët e nxjerrë nga raundi i dytë i përzgjedhjes iu nënshtruan HTS në secilën kafshë dhe të gjitha peptidet e identifikuara u përdorën si hyrje në një program të njohjes së motivit për të analizuar shfaqjen e motiveve të tripeptideve (Fig. 2a, b, ef).Krahasuar me ciklin e parë të fagut të rikuperuar nga CSF, ne vërejtëm përzgjedhje të mëtejshme dhe çzgjedhje të shumë motiveve në CSF në degët A dhe B (Fig. 2).Një algoritëm identifikimi i rrjetit u aplikua për të përcaktuar nëse ato përfaqësonin modele të ndryshme të sekuencës së qëndrueshme.U vu re një ngjashmëri e qartë midis sekuencave 12-dimensionale të rikuperuara nga CSF në kladin alternativ A (Fig. 2c, d) dhe kladin B (Fig. 2g, h).Analiza e bashkuar në secilën degë zbuloi profile të ndryshme përzgjedhjeje për peptidet 12-mere (Fig. suplementare 5c, d) dhe një rritje në raportin CSF/titër gjaku me kalimin e kohës për klonet e grumbulluara pas raundit të dytë të përzgjedhjes në krahasim me raundin e parë të përzgjedhjes (Fig. suplementare 5e).).
Pasurimi i motiveve dhe peptideve në lëngun cerebrospinal me dy raunde të njëpasnjëshme të përzgjedhjes së shfaqjes funksionale të fagut in vivo.
Të gjithë fagët e lëngut cerebrospinal të rikuperuar nga raundi i parë i secilës kafshë (kafshët #1.1 dhe #1.2) u grumbulluan, u përforcuan, u sekuencuan me HT dhe u riinjektuan së bashku (2 x 1010 fagë/kafshë) 2 minj SM të kanuluar (#1.1 → #).2.1 dhe 2.2, 1.2 → 2.3 dhe 2.4).(a,b,e,f) Skaterplote korrelacioni që krahasojnë frekuencën relative të motiveve të tripeptideve të të gjithë fagëve që rrjedhin nga CSF në raundin e parë dhe të dytë të përzgjedhjes.Frekuenca dhe shpërndarja relative e motiveve që përfaqësojnë të gjitha tripeptidet e mundshme të mbivendosura të gjetura në peptide në të dy orientimet.Tregohet numri i motiveve të gjetura në 1000 lexime.Motivet që janë përzgjedhur ose përjashtuar në mënyrë të konsiderueshme (p < 0,001) në një nga bibliotekat e krahasuara janë theksuar me pika të kuqe.(c, d, g, h) Paraqitja e logos së sekuencës së të gjitha sekuencave të gjata me 12 aminoacide të pasura me CSF bazuar në raundet 2 dhe 1 të përzgjedhjes in vivo.Madhësia e kodit me një shkronjë tregon se sa shpesh ndodh ky aminoacid në atë pozicion.Për të përfaqësuar logon, krahasohet frekuenca e sekuencave CSF të nxjerra nga kafshët individuale midis dy raundeve të përzgjedhjes dhe sekuencat e pasuruara në raundin e dytë tregohen: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dhe (h) #1.2–#2.4.Aminoacidet më të pasuruara në një pozicion të caktuar në (c, d) kafshët nr.2.1 dhe nr.2.2 ose (g, h) në kafshët nr.2.3 dhe nr.2.4 tregohen me ngjyra.E gjelbër = polare, vjollcë = neutrale, blu = bazë, e kuqe = acidike dhe e zezë = aminoacide hidrofobike.
Pas raundit të tretë të përzgjedhjes, ne identifikuam 124 sekuenca peptide unike (#3.1 dhe #3.2) nga 332 klone fag të rindërtuar nga CSF të izoluar nga dy kafshë (Fig. suplementare 6a).Sekuenca LGSVS (18.7%) kishte përqindjen më të lartë relative, e ndjekur nga insertet e tipit të egër PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) dhe SARGSWREIVSLS (2.2%).Në raundin e katërt të fundit, ne bashkuam dy degë të zgjedhura në mënyrë të pavarur nga tre kafshë të veçanta (Fig. 1c).Nga 925 klonet e sekuencës së fagut të rikuperuar nga CSF, në raundin e katërt ne gjetëm 64 sekuenca peptide unike (Fig. 6b plotësuese), ndër të cilat përqindja relative e fagut të tipit të egër ra në 0.8%.Klonet më të zakonshme të CSF-së në raundin e katërt ishin LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%VSDGLS) dhe 3.6%).%)).Gama e gjatësisë së peptideve të zgjedhur është për shkak të futjeve/fshirjeve të nukleotideve ose kodoneve të ndalimit të parakohshëm në primerët e bibliotekës kur përdoren kodone të degjeneruara për dizajnin e bibliotekës NNK.Kodonet e ndalimit të parakohshëm gjenerojnë peptide më të shkurtra dhe zgjidhen sepse përmbajnë motivin e favorshëm aa.Peptide më të gjata mund të rezultojnë nga futjet/fshirjet në primerët e bibliotekave sintetike.Kjo e pozicionon kodonin e projektuar të ndalimit jashtë kornizës dhe e lexon atë derisa një kodon i ri ndalues ​​të shfaqet në rrjedhën e poshtme.Në përgjithësi, ne kemi llogaritur faktorët e pasurimit për të katër raundet e përzgjedhjes duke krahasuar të dhënat hyrëse me të dhënat e prodhimit të mostrës.Për raundin e parë të shqyrtimit, ne përdorëm titrat e fagut të tipit të egër si një referencë jo specifike të sfondit.Është interesante se përzgjedhja negative e fagut ishte shumë e fortë në ciklin e parë CSF, por jo në gjak (Fig. 3a), gjë që mund të jetë për shkak të probabilitetit të ulët të difuzionit pasiv të shumicës së anëtarëve të bibliotekës së peptideve në ndarjen CSF ose fagët relativë priren të mbahen ose hiqen në mënyrë më efikase nga qarkullimi i gjakut sesa bakterofagët.Megjithatë, në raundin e dytë të panazhimit, u vu re një përzgjedhje e fortë e fagëve në CSF në të dy kladet, duke sugjeruar që raundi i mëparshëm ishte pasuruar me fagë që shfaqnin peptide që nxisin marrjen e CSF (Fig. 3a).Përsëri, pa pasurim domethënës të gjakut.Gjithashtu në raundin e tretë dhe të katërt, klonet e fagut u pasuruan ndjeshëm në CSF.Duke krahasuar frekuencën relative të secilës sekuencë peptide unike midis dy raundeve të fundit të përzgjedhjes, zbuluam se sekuencat u pasuruan edhe më shumë në raundin e katërt të përzgjedhjes (Fig. 3b).Një total prej 931 motivesh tripeptide u nxorën nga të gjitha 64 sekuencat unike peptide duke përdorur të dy orientimet peptide.Motivet më të pasuruara në raundin e katërt u shqyrtuan më nga afër për profilet e tyre të pasurimit në të gjitha raundet krahasuar me bibliotekën e injektuar (prerje: 10% pasurim) (Fig. suplementare 6c).Modelet e përgjithshme të përzgjedhjes treguan se shumica e motiveve të studiuara u pasuruan në të gjitha raundet e mëparshme të të dy degëve përzgjedhëse.Megjithatë, disa motive (p.sh. SGL, VSG, LGS GSV) ishin kryesisht nga kladi alternativ A, ndërsa të tjerët (p.sh. FGW, RTN, WGF, NTR) u pasuruan në kladin alternativ B.
Vërtetimi i transportit CSF të peptideve të shfaqura me fagë të pasuruara me CSF dhe peptideve udhëheqëse të biotiniluara të konjuguara me ngarkesat e dobishme të streptavidinës.
(a) Raportet e pasurimit të llogaritura në të katër raundet (R1-R4) bazuar në titrat e fagut të injektuar (hyrje = I) (PFU) dhe titrat e përcaktuar të fagut CSF (dalja = O).Faktorët e pasurimit për tre raundet e fundit (R2-R4) u llogaritën duke krahasuar me raundin e mëparshëm dhe raundin e parë (R1) me të dhënat e peshës.Shiritat e hapur janë lëng cerebrospinal, shufrat me hije janë plazma.(***p<0.001, bazuar në T-testin Student).(b) Lista e peptideve të fagut më të shumtë, të renditur sipas proporcionit të tyre relativ me të gjithë fagët e mbledhur në CSF pas raundit 4 të përzgjedhjes.Gjashtë klonet më të zakonshme të fagut janë të theksuara me ngjyra, të numëruara dhe me faktorët e pasurimit të tyre midis raundeve 3 dhe 4 të përzgjedhjes (inset).(c, d) Gjashtë klonet e fagut më të pasuruar, fagu bosh dhe bibliotekat e peptideve të fagut prindëror nga raundi 4 u analizuan individualisht në një model kampionimi CSF.CSF dhe mostrat e gjakut u mblodhën në pikat kohore të treguara.(c) Sasi të barabarta prej 6 klone fagësh kandidatë (2 x 1010 fagë/kafshë), fagë bosh (#1779) (2 x 1010 fagë/kafshë) dhe biblioteka të peptideve të fagut (2 x 1012 fagë/kafshë) Injektohen të paktën 3 CM në kafshë të ndara në bisht.Tregohet farmakokinetika CSF e secilit klon të fagut të injektuar dhe bibliotekës së peptideve të fagut me kalimin e kohës.(d) tregon raportin mesatar CSF/gjak për të gjithë fagët e rikuperuar/mL gjatë kohës së marrjes së mostrave.(e) Katër peptide udhëheqëse sintetike dhe një kontroll i fërguar u lidhën me biotinën me streptavidinën përmes terminalit të tyre N (shfaqja e tetramerit) e ndjekur nga injeksioni (vena e bishtit iv, 10 mg streptavidin/kg).Të paktën tre minj të intubuar (N = 3).).Mostrat e CSF u mblodhën në pikat e treguara kohore dhe përqendrimet e streptavidinës u matën me ELISA anti-streptavidin CSF (nd = nuk u zbulua).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bazuar në testin ANOVA).(f) Krahasimi i sekuencës aminoacide të klonit më të pasuruar të peptidit fag #2002 (vjollcë) me klone të tjerë të përzgjedhur të peptidit fag nga raundi i 4-të i përzgjedhjes.Fragmentet identike dhe të ngjashme të aminoacideve janë të koduara me ngjyra.
Nga të gjithë fagët e pasuruar në raundin e katërt (Fig. 3b), gjashtë klone kandidatë u zgjodhën për analiza të mëtejshme individuale në modelin e kampionimit CSF.Sasi të barabarta të gjashtë fagëve kandidatë, fagut të zbrazët (pa futur) dhe bibliotekave peptide profage u injektuan në tre kafshë CM të kanuluara dhe farmakokinetika u përcaktua në analizat CSF (Fig. 3c) dhe gjaku (Fig. 7 plotësuese).Të gjithë klonet e fagut të testuar synuan ndarjen CSF në një nivel 10-1000 herë më të lartë se ai i fagut të kontrollit bosh (#1779).Për shembull, klonet #2020 dhe #2077 kishin rreth 1000 herë më shumë titra CSF sesa fagu i kontrollit.Profili farmakokinetik i secilit peptid të përzgjedhur është i ndryshëm, por të gjithë kanë një aftësi të lartë të kthimit të CSF.Ne kemi vërejtur një rënie konstante me kalimin e kohës për klonet #1903 dhe #2011, ndërsa për klonet #2077, #2002 dhe #2009 një rritje gjatë 10 minutave të para mund të tregojë transport aktiv, por duhet verifikuar.Klonet #2020, #2002 dhe #2077 u stabilizuan në nivele të larta, ndërsa përqendrimi CSF i klonit #2009 u ul ngadalë pas rritjes fillestare.Më pas krahasuam frekuencën relative të secilit kandidat për LCS me përqendrimin e tij në gjak (Fig. 3d).Korrelacioni i titrit mesatar të çdo kandidati për CSF me titrin e tij të gjakut në të gjitha kohët e marrjes së mostrave tregoi se tre nga gjashtë kandidatët ishin pasuruar ndjeshëm në CSF të gjakut.Interesante, kloni #2077 tregoi stabilitet më të lartë të gjakut (Figura plotësuese 7).Për të konfirmuar që vetë peptidet janë të afta të transportojnë në mënyrë aktive ngarkesë të ndryshme nga grimcat e fagut në ndarjen CSF, ne sintetizuam katër peptide udhëheqëse të derivatuara me biotinë në skajin N ku peptidet lidhen me grimcën e fagut.Peptidet e biotiniluara (nr. 2002, 2009, 2020 dhe 2077) u konjuguan me streptavidinën (SA) për të marrë forma multimerike që imitojnë disi gjeometrinë e fagut.Ky format na lejoi gjithashtu të matim ekspozimin e SA në gjak dhe lëngun cerebrospinal si peptide proteinike që transportojnë ngarkesë.E rëndësishmja, të dhënat e fagut shpesh mund të riprodhoheshin kur peptidet sintetike administroheshin në këtë format të konjuguar me SA (Fig. 3e).Peptidet e fërguara kishin më pak ekspozim fillestar dhe pastrim më të shpejtë CSF me nivele të pazbulueshme brenda 48 orëve.Për të fituar njohuri mbi rrugët e shpërndarjes së këtyre kloneve të fagut peptid në hapësirën CSF, ne analizuam lokalizimin e goditjeve individuale të peptideve të fagut duke përdorur imunohistokiminë (IHC) për të zbuluar drejtpërdrejt grimcat e fagut 1 orë pas injektimit intravenoz in vivo.Veçanërisht, klonet #2002, #2077 dhe #2009 mund të zbuloheshin nga ngjyrosja e fortë në kapilarët e trurit, ndërsa fagu i kontrollit (#1779) dhe kloni #2020 nuk u zbuluan (Figura plotësuese 8).Kjo sugjeron që këto peptide kontribuojnë në efektin në tru pikërisht duke kaluar BBB.Kërkohet analiza e mëtejshme e detajuar për të testuar këtë hipotezë, pasi mund të përfshihet edhe rruga BSCFB.Kur krahasohet sekuenca e aminoacideve të klonit më të pasuruar (#2002) me peptide të tjera të përzgjedhura, u vu re se disa prej tyre kanë shtrirje të ngjashme aminoacide, të cilat mund të tregojnë një mekanizëm të ngjashëm transporti (Fig. 3f).
Për shkak të profilit të tij unik të plazmës dhe rritjes së ndjeshme të CSF me kalimin e kohës, kloni i shfaqjes së fagut #2077 u hulumtua më tej gjatë një periudhe më të gjatë 48-orëshe dhe ishte në gjendje të riprodhonte rritjen e shpejtë të CSF të vërejtur në lidhje me nivelet e qëndrueshme të SA (Fig. 4a).Lidhur me klonet e tjerë të fagut të identifikuar, #2077 u ngjyros fort për kapilarët e trurit dhe tregoi kolokalizim domethënës me lektinën e markerit kapilar kur shihej me rezolucion më të lartë dhe ndoshta disa ngjyrosje në hapësirën parenkimale (Figura 4b).Për të hetuar nëse efektet farmakologjike të ndërmjetësuara nga peptide mund të arriheshin në SNQ, ne kryem një eksperiment në të cilin versionet e biotiniluara të i) peptidit transit #2077 dhe ii) peptidit frenues BACE1 u përzien me SA në dy raporte të ndryshme.Për njërin kombinim kemi përdorur vetëm frenuesin e peptidit BACE1 dhe për tjetrin kemi përdorur një raport 1:3 të frenuesit të peptidit BACE1 me peptidin #2077.Të dy mostrat u administruan në mënyrë intravenoze dhe nivelet e gjakut dhe lëngut cerebrospinal të peptidit beta-amiloide 40 (Abeta40) u matën me kalimin e kohës.Abeta40 u mat në CSF pasi pasqyron frenimin e BACE1 në parenkimën e trurit.Siç pritej, të dy komplekset reduktuan ndjeshëm nivelet e Abeta40 në gjak (Fig. 4c, d).Megjithatë, vetëm mostrat që përmbajnë një përzierje të peptidit nr.2077 dhe një frenues i peptidit BACE1 i konjuguar me SA shkaktoi një rënie të konsiderueshme të Abeta40 në lëngun cerebrospinal (Fig. 4c).Të dhënat tregojnë se peptidi nr.2077 është në gjendje të transportojë proteinën SA 60 kDa në CNS dhe gjithashtu shkakton efekte farmakologjike me frenuesit e konjuguar SA të peptidit BACE1.
(a) Injeksion klonal (2 × 10 fagë/kafshë) i fagut T7 që tregon profile farmakokinetike afatgjatë të peptidit CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) dhe fagut të kontrollit të painjektuar (#1779) në të paktën tre minj të intubuar me CM.(b) Imazhi mikroskopik konfokal i mikro enëve kortikale përfaqësuese në minjtë e injektuar me fag (2 × 10 10 fagë/kafshë) që tregon kundërngjyrosje të peptidit #2077 dhe enëve (lektinë).Këta klone fag iu administruan 3 minjsh dhe u lanë të qarkullonin për 1 orë përpara perfuzionit.Trurët u prenë dhe u ngjyrosën me antitrupa poliklonalë të etiketuar me FITC kundër kapsidës së fagut T7.Dhjetë minuta para perfuzionit dhe fiksimit pasues, lektina e etiketuar me DyLight594 u administrua në mënyrë intravenoze.Imazhet fluoreshente që tregojnë ngjyrosjen e lektinës (të kuqe) të anës luminale të mikroenëve dhe fagëve (jeshile) në lumenin e kapilarëve dhe indit perivaskular të trurit.Shiriti i shkallës korrespondon me 10 µm.(c, d) Peptid frenues BACE1 i biotiniluar i vetëm ose në kombinim me peptidin transit të biotiniluar #2077 u bashkua me streptavidinën e ndjekur nga injeksioni intravenoz i të paktën tre minjve CM të kanuluar (10 mg streptavidin/kg).Reduktimi i ndërmjetësuar nga frenuesi i peptidit BACE1 në Aβ40 u mat me Aβ1-40 ELISA në gjak (e kuqe) dhe lëngun cerebrospinal (portokalli) në pikat e treguara kohore.Për qartësi më të mirë, një vijë me pika vizatohet në grafik në një shkallë prej 100%.(c) Reduktimi i përqindjes së Aβ40 në gjak (trekëndëshat e kuq) dhe lëngun cerebrospinal (trekëndëshat portokalli) te minjtë e trajtuar me streptavidinë të konjuguar me peptidin transit #2077 dhe peptidin frenues BACE1 në një raport 3:1.(d) Reduktimi i përqindjes në gjakun Aβ40 (rrathët e kuq) dhe lëngun cerebrospinal (rrathët portokalli) te minjtë e trajtuar me streptavidinë të shoqëruar vetëm me një peptid frenues BACE1.Përqendrimi i Aβ në kontroll ishte 420 pg/ml (devijimi standard = 101 pg/ml).
Shfaqja e fagut është aplikuar me sukses në disa fusha të kërkimit biomjekësor17.Kjo metodë është përdorur për studime in vivo të diversitetit vaskular18,19 si dhe studime që synojnë enët cerebrale20,21,22,23,24,25,26.Në këtë studim, ne e zgjeruam aplikimin e kësaj metode përzgjedhjeje jo vetëm në identifikimin e drejtpërdrejtë të peptideve që synojnë enët cerebrale, por edhe në zbulimin e kandidatëve me veti aktive transportuese për të kapërcyer barrierën gjak-tru.Ne tani përshkruajmë zhvillimin e një procedure përzgjedhjeje in vivo në minjtë e intubuar me CM dhe demonstrojmë potencialin e tij për të identifikuar peptidet me vetitë e kthimit të CSF.Duke përdorur fagun T7 që shfaq një bibliotekë të peptideve të rastësishme 12-mere, ne ishim në gjendje të demonstronim se fagu T7 është mjaft i vogël (rreth 60 nm në diametër)10 për t'u përshtatur me pengesën gjaku-tru, duke kaluar kështu drejtpërdrejt pengesën gjaku-tru ose pleksusin koroid.Ne vumë re se mbledhja e CSF nga minjtë CM të kanuluar ishte një metodë e kontrolluar mirë in vivo funksionale dhe se fagu i nxjerrë jo vetëm që lidhej me enët e gjakut, por gjithashtu funksiononte si një transportues përtej barrierës gjaku-tru.Për më tepër, duke mbledhur gjak në të njëjtën kohë dhe duke aplikuar HTS në CSF dhe fagët me prejardhje nga gjaku, ne konfirmuam se zgjedhja jonë e CSF nuk u ndikua nga pasurimi i gjakut ose përshtatshmëria për zgjerim midis raundeve të përzgjedhjes.Megjithatë, ndarja e gjakut është pjesë e procedurës së përzgjedhjes, pasi fagët e aftë për të arritur në ndarjen CSF duhet të mbijetojnë dhe të qarkullojnë në qarkullimin e gjakut aq gjatë sa të pasurohen në tru.Për të nxjerrë informacione të besueshme të sekuencës nga të dhënat e papërpunuara HTS, ne kemi implementuar filtra të përshtatur për gabimet e renditjes specifike të platformës në rrjedhën e punës së analizës.Duke përfshirë parametrat kinetikë në metodën e shqyrtimit, ne konfirmuam farmakokinetikën e shpejtë të fagëve T7 të tipit të egër (t½ ~ 28 min) në gjak24, 27, 28 dhe përcaktuam gjithashtu gjysmën e jetës së tyre në lëngun cerebrospinal (t½ ~ 26 min) në minutë).Pavarësisht profileve të ngjashme farmakokinetike në gjak dhe CSF, vetëm 0.001% e përqendrimit të fagut në gjak mund të zbulohej në CSF, duke treguar lëvizshmëri të ulët të sfondit të fagut T7 të tipit të egër përgjatë barrierës gjak-tru.Kjo punë thekson rëndësinë e raundit të parë të përzgjedhjes kur përdoren strategjitë e panimit in vivo, veçanërisht për sistemet e fagut që pastrohen me shpejtësi nga qarkullimi, pasi pak klone janë në gjendje të arrijnë në ndarjen CNS.Kështu, në raundin e parë, reduktimi i diversitetit të bibliotekës ishte shumë i madh, pasi vetëm një numër i kufizuar klone u mblodhën përfundimisht në këtë model shumë të rreptë CSF.Kjo strategji e panimit in vivo përfshinte disa hapa përzgjedhjeje si akumulimi aktiv në ndarjen CSF, mbijetesa e klonit në ndarjen e gjakut dhe heqja e shpejtë e kloneve të fagut T7 nga gjaku brenda 10 minutave të para (Fig. 1d dhe Fig. Suplementare 4M).).Kështu, pas raundit të parë, klone të ndryshëm fag u identifikuan në CSF, megjithëse i njëjti grup fillestar u përdor për kafshë individuale.Kjo sugjeron që hapa të shumtë të rreptë të përzgjedhjes për bibliotekat burimore me numër të madh anëtarësh të bibliotekës rezultojnë në një reduktim të ndjeshëm të diversitetit.Prandaj, ngjarjet e rastësishme do të bëhen pjesë integrale e procesit fillestar të përzgjedhjes, duke ndikuar shumë në rezultat.Ka të ngjarë që shumë nga klonet në bibliotekën origjinale të kishin një prirje shumë të ngjashme për pasurimin e CSF.Megjithatë, edhe në të njëjtat kushte eksperimentale, rezultatet e përzgjedhjes mund të ndryshojnë për shkak të numrit të vogël të secilit klon të veçantë në grupin fillestar.
Motivet e pasuruara në CSF ndryshojnë nga ato në gjak.Interesante, ne vumë re zhvendosjen e parë drejt peptideve të pasura me glicinë në gjakun e kafshëve individuale.(Fig. 1g, Fig. Suplementare 4e, 4f).Peptidet e glicinës që përmbajnë fagë mund të jenë më të qëndrueshme dhe më pak të ngjarë të hiqen nga qarkullimi.Megjithatë, këto peptide të pasura me glicinë nuk u zbuluan në mostrat e lëngut cerebrospinal, duke sugjeruar që bibliotekat e kuruara kaluan nëpër dy hapa të ndryshëm përzgjedhjeje: një në gjak dhe një tjetër u lejua të grumbullohej në lëngun cerebrospinal.Klonet e pasuruara me CSF që rezultojnë nga raundi i katërt i përzgjedhjes janë testuar gjerësisht.Pothuajse të gjithë klonet e testuar individualisht u konfirmuan se ishin pasuruar në CSF në krahasim me fagun e kontrollit bosh.Një goditje peptide (#2077) u ekzaminua më në detaje.Tregoi një gjysmë jetë më të gjatë të plazmës në krahasim me goditjet e tjera (Figura 3d dhe Figura plotësuese 7), dhe interesant është se ky peptid përmbante një mbetje cisteine ​​në fundin C.Kohët e fundit është treguar se shtimi i cisteinës në peptide mund të përmirësojë vetitë e tyre farmakokinetike duke u lidhur me albuminën 29.Kjo është aktualisht e panjohur për peptidin #2077 dhe kërkon studim të mëtejshëm.Disa peptide treguan një varësi nga valenca në pasurimin CSF (të dhënat nuk tregohen), e cila mund të lidhet me gjeometrinë e sipërfaqes së shfaqur të kapsidës T7.Sistemi T7 që përdorëm tregoi 5-15 kopje të secilit peptid për grimcë fag.IHC u krye në klone kandidate të fagut të plumbit të injektuar në mënyrë intravenoze në korteksin cerebral të minjve (Fig. Suplementare 8).Të dhënat treguan se të paktën tre klone (Nr. 2002, Nr. 2009 dhe Nr. 2077) ndërvepruan me BBB.Mbetet për t'u përcaktuar nëse ky ndërveprim BBB rezulton në akumulimin e CSF ose lëvizjen e këtyre kloneve drejtpërdrejt në BCSFB.Më e rëndësishmja, ne tregojmë se peptidet e përzgjedhura ruajnë kapacitetin e tyre të transportit CSF kur sintetizohen dhe lidhen me ngarkesën e proteinave.Lidhja e peptideve të biotiniluara N-terminale me SA në thelb përsërit rezultatet e marra me klonet e tyre përkatëse të fagut në gjak dhe lëngun cerebrospinal (Fig. 3e).Së fundi, ne tregojmë se peptidi i plumbit #2077 është në gjendje të promovojë veprimin e trurit të një frenuesi peptid të biotiniluar të BACE1 të konjuguar me SA, duke shkaktuar efekte të theksuara farmakodinamike në SNQ duke ulur ndjeshëm nivelet e Abeta40 në CSF (Fig. 4).Ne nuk ishim në gjendje të identifikonim asnjë homolog në bazën e të dhënave duke kryer një kërkim homologjik të sekuencës peptide të të gjitha goditjeve.Është e rëndësishme të theksohet se madhësia e bibliotekës T7 është përafërsisht 109, ndërsa madhësia teorike e bibliotekës për 12-mers është 4 x 1015. Prandaj, ne zgjodhëm vetëm një pjesë të vogël të hapësirës së diversitetit të bibliotekës së peptideve 12-mere, që mund të nënkuptojë se peptide më të optimizuara mund të identifikohen duke goditur hapësirën e duhur nga këto sekuenca.Hipotetikisht, një nga arsyet pse nuk kemi gjetur homologë natyralë të këtyre peptideve mund të jetë moszgjedhja gjatë evolucionit për të parandaluar hyrjen e pakontrolluar të disa motiveve peptide në tru.
Të marra së bashku, rezultatet tona ofrojnë një bazë për punën e ardhshme për të identifikuar dhe karakterizuar sistemet e transportit të barrierës cerebrovaskulare in vivo në më shumë detaje.Konfigurimi bazë i kësaj metode bazohet në një strategji përzgjedhjeje funksionale që jo vetëm identifikon klone me veti lidhëse vaskulare cerebrale, por gjithashtu përfshin një hap kritik në të cilin klonet e suksesshme kanë aktivitet të brendshëm për të kapërcyer barrierat biologjike in vivo në ndarjen CNS.është të sqarojë mekanizmin e transportit të këtyre peptideve dhe preferencën e tyre për t'u lidhur me mikrovaskulaturën specifike për rajonin e trurit.Kjo mund të çojë në zbulimin e rrugëve të reja për transportin e BBB dhe receptorëve.Ne presim që peptidet e identifikuara mund të lidhen drejtpërdrejt me receptorët cerebrovaskular ose me ligandët qarkullues të transportuar përmes BBB ose BCSFB.Vektorët peptidë me aktivitet transporti CSF të zbuluar në këtë punë do të hetohen më tej.Aktualisht po hetojmë specifikën e trurit të këtyre peptideve për aftësinë e tyre për të kaluar BBB dhe/ose BCSFB.Këto peptide të reja do të jenë mjete jashtëzakonisht të vlefshme për zbulimin e mundshëm të receptorëve ose shtigjeve të reja dhe për zhvillimin e platformave të reja shumë efikase për shpërndarjen e makromolekulave, të tilla si biologjike, në tru.
Kanuloni cisternën e madhe (CM) duke përdorur një modifikim të metodës së përshkruar më parë.Minjtë Wistar të anestezuar (200-350 g) u montuan në një aparat stereotaksik dhe u bë një prerje mesatare mbi kokën e rruar dhe të përgatitur në mënyrë aseptike për të ekspozuar kafkën.Shponi dy vrima në zonën e brezit të sipërm dhe lidhni vidhat e fiksimit në vrima.Një vrimë shtesë u shpua në kreshtën okupitale anësore për drejtimin stereotaktik të një kanule çeliku inox në CM.Aplikoni çimento dentare rreth kanulës dhe sigurojeni me vida.Pas fotokurimit dhe ngurtësimit me çimento, plaga e lëkurës u mbyll me qepje supramide 4/0.Vendosja e duhur e kanulës konfirmohet nga rrjedhja spontane e lëngut cerebrospinal (CSF).Hiqeni miun nga aparati stereotaksik, merrni kujdesin e duhur postoperativ dhe menaxhimin e dhimbjes dhe lëreni të rikuperohet për të paktën një javë derisa të vërehen shenja gjaku në lëngun cerebrospinal.Minjtë Wistar (Crl:WI/Han) u morën nga lumi Charles (Francë).Të gjithë minjtë u mbajtën në kushte specifike pa patogjen.Të gjitha eksperimentet e kafshëve u miratuan nga Zyra Veterinare e Qytetit të Bazelit, Zvicër, dhe u kryen në përputhje me Licencën e Kafshëve Nr. 2474 (Vlerësimi i Transportit aktiv të trurit nga Matja e niveleve të kandidatëve terapeutikë në lëngun cerebrospinal dhe trurin e miut).
Mbani butësisht miun të ndërgjegjshëm me kanulën CM në dorë.Hiqeni Datura nga kanula dhe mblidhni 10 µl lëngu cerebrospinal që rrjedh spontanisht.Meqenëse kalueshmëria e kanulës u komprometua përfundimisht, në këtë studim u përfshinë vetëm mostra të qarta të lëngut cerebrospinal pa prova të kontaminimit të gjakut ose njollës.Paralelisht, afërsisht 10-20 μl gjaku u mor nga një prerje e vogël në majë të bishtit në tuba me heparinë (Sigma-Aldrich).CSF dhe gjaku u mblodhën në pika të ndryshme kohore pas injektimit intravenoz të fagut T7.Përafërsisht 5-10 μl lëngu u hodh përpara se të mblidhej çdo mostër CSF, që korrespondon me vëllimin e vdekur të kateterit.
Bibliotekat u krijuan duke përdorur vektorin T7Select 10-3b siç përshkruhet në manualin e sistemit T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Shkurtimisht, një insert i rastësishëm 12-mer i ADN-së u sintetizua në formatin e mëposhtëm:
Kodoni NNK u përdor për të shmangur kodonet e ndalimit të dyfishtë dhe mbishprehjen e aminoacideve në insert.N është një raport ekuimolar i përzier manualisht i secilit nukleotid dhe K është një raport ekuimolar i përzier manualisht i nukleotideve të adeninës dhe citozinës.Rajonet me një zinxhir u shndërruan në ADN me dy zinxhirë me inkubacion të mëtejshëm me dNTP (Novagen) dhe enzimën Klenow (New England Biolabs) në tampon Klenow (New England Biolabs) për 3 orë në 37°C.Pas reagimit, ADN-ja me dy zinxhirë u gjet nga precipitimi EtOH.ADN-ja që rezulton u tret me enzimat kufizuese EcoRI dhe HindIII (të dyja nga Roche).Inserti i copëtuar dhe i pastruar (QIAquick, Qiagen) (T4 ligaza, New England Biolabs) u lidh më pas në kornizë në një vektor T7 të para-çarë pas aminoacidit 348 të gjenit kapsid 10B.Reaksionet e lidhjes u inkubuan në 16° C. për 18 orë përpara paketimit in vitro.Paketimi i fagut in vitro u krye sipas udhëzimeve të dhëna me çantën e klonimit T7Select 10-3b (Novagen) dhe solucioni i paketimit u përforcua një herë për lizë duke përdorur Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizatet u centrifuguan, u titruan dhe u ngrinë në -80° C. si një tretësirë ​​rezervë e glicerinës.
Amplifikim i drejtpërdrejtë PCR i rajoneve të ndryshueshme të fagut të përforcuar në lëng mishi ose pjatë duke përdorur primerët e fuzionit të pronarit 454/Roche-amplicon.Abetarja e shkrirjes së përparme përmban sekuenca në krahun e rajonit të ndryshueshëm (NNK) 12 (specifike për shabllonin), GS FLX Titanium Adapter A dhe një sekuencë kyçe të bibliotekës me katër baza (TCAG) (Figura plotësuese 1a):
Primeri i shkrirjes së kundërt përmban gjithashtu biotinë të bashkangjitur për kapjen e rruazave dhe përshtatësin B të Titaniumit GS FLX që kërkohet për amplifikimin klonal gjatë emulsionit PCR:
Më pas, amplikonët iu nënshtruan pirosekuencës 454/Roche sipas protokollit 454 GS-FLX Titanium.Për sekuencën manuale të Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ADN Analyzer), ADN-ja e fagut T7 u përforcua me PCR dhe u rendit me çiftet e mëposhtme të primerëve:
Insertet nga pllaka individuale iu nënshtruan amplifikimit PCR duke përdorur Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sipas udhëzimeve të prodhuesit).Kryeni një fillim të nxehtë (10 min në 95 °C) dhe 35 cikle nxitjeje (50 sekonda në 95 °C, 1 minutë në 50 °C dhe 1 minutë në 72 °C).
Fagu nga bibliotekat, fagu i tipit të egër, fagu i shpëtuar nga CSF dhe gjaku, ose klone individuale u përforcuan në Escherichia coli BL5615 në lëngun e TB (Sigma Aldrich) ose në enë 500 cm2 (Thermo Scientific) për 4 orë në 37°C.Fagët u nxorrën nga pllakat duke i shpëlarë pllakat me bufer Tris-EDTA (Fluka Analytical) ose duke mbledhur pllakat me majat e pipetës sterile.Fagët u izoluan nga supernatanti i kulturës ose buferi i ekstraktimit me një raund precipitimi të polietilen glikolit (PEG 8000) (Promega) dhe u risuspenduan në tampon Tris-EDTA.
Fagu i përforcuar iu nënshtrua 2-3 raundeve të heqjes së endotoksinës duke përdorur rruaza për heqjen e endotoksinës (Miltenyi Biotec) përpara injektimit intravenoz (IV) (500 μl/kafshë).Në raundin e parë u prezantuan 2×1012 fagë;në të dytin, 2×1010 fagë;në raundin e tretë dhe të katërt të përzgjedhjes, 2×109 fagë për kafshë.Përmbajtja e fagut në CSF dhe mostrat e gjakut të mbledhura në pikat e treguara kohore u përcaktua me numërimin e pllakave sipas udhëzimeve të prodhuesit (manuali i sistemit T7Select).Përzgjedhja e fagut u krye me injeksion intravenoz të bibliotekave të pastruara në venën e bishtit ose me ri-injektim të fagut të nxjerrë nga CSF nga raundi i mëparshëm i përzgjedhjes, dhe korrjet pasuese u kryen në 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min dhe mostrat e gjakut përkatësisht 240 min dhe 240 min.Janë kryer gjithsej katër raunde të panimit in vivo në të cilat dy degët e përzgjedhura janë ruajtur dhe analizuar veçmas gjatë tre raundeve të para të përzgjedhjes.Të gjitha futjet e fagut të nxjerra nga CSF nga dy raundet e para të përzgjedhjes iu nënshtruan pirosekuencës 454/Roche, ndërsa të gjitha klonet e nxjerra nga CSF nga dy raundet e fundit të përzgjedhjes u renditën manualisht.Të gjithë fagët e gjakut nga raundi i parë i përzgjedhjes iu nënshtruan gjithashtu pirosekuencës 454/Roche.Për injektimin e kloneve të fagut, fagët e përzgjedhur u amplifikuan në E. coli (BL5615) në pllaka 500 cm2 në 37°C për 4 orë.Klonet e zgjedhura individualisht dhe të sekuencave manuale u përhapën në mjedisin e TB.Pas nxjerrjes së fagut, pastrimit dhe heqjes së endotoksinës (siç përshkruhet më sipër), 2×1010 fagë/kafshë në 300 μl u injektuan në mënyrë intravenoze në një venë bishti.
Parapërpunimi dhe filtrimi cilësor i të dhënave të sekuencës.Të dhënat e papërpunuara 454/Roche u konvertuan nga një format binar standard i hartës së transmetimit (sff) në një format të lexueshëm nga njeriu Pearson (fasta) duke përdorur softuerin e shitësit.Përpunimi i mëtejshëm i sekuencës së nukleotideve u krye duke përdorur programe dhe skripta të pronarit C (paketë softuerike të papublikuar) siç përshkruhet më poshtë.Analiza e të dhënave parësore përfshin procedura strikte filtrimi me shumë faza.Për të filtruar leximet që nuk përmbanin një sekuencë të vlefshme ADN-je të futur 12-mere, leximet u rreshtuan në mënyrë sekuenciale me etiketën fillestare (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etiketën e ndalimit (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) dhe futjen e sfondit (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT, duke përdorur testin global, duke përdorur testin globalschmansch.shtrirje që lejon deri në 2 mospërputhje për rreshtim31.Prandaj, leximet pa etiketa fillimi dhe ndalimi dhe leximet që përmbajnë inserte në sfond, p.sh., rreshtime që tejkalojnë numrin e lejuar të mospërputhjeve, u hoqën nga biblioteka.Për sa i përket leximeve të mbetura, sekuenca e ADN-së N-mer që shtrihet nga shenja e fillimit dhe përfundon përpara pikës së ndalimit u shkëput nga sekuenca origjinale e leximit dhe u përpunua më tej (në tekstin e mëtejmë "insert").Pas përkthimit të insertit, pjesa pas kodonit të parë të ndalimit në fundin 5′ të primerit hiqet nga futja.Përveç kësaj, u hoqën gjithashtu nukleotidet që çonin në kodone jo të plota në fundin 3' të primerit.Për të përjashtuar futjet që përmbajnë vetëm sekuenca të sfondit, u hoqën gjithashtu futjet e përkthyera që fillonin me modelin e aminoacideve "PAG".Peptidet me një gjatësi pas përkthimit prej më pak se 3 aminoacide u hoqën nga biblioteka.Së fundi, hiqni tepricën në grupin e futjeve dhe përcaktoni frekuencën e çdo futjeje unike.Rezultatet e kësaj analize përfshinin një listë të sekuencave nukleotide (inserteve) dhe frekuencave të tyre (të lexuara) (Figura plotësuese 1c dhe 2).
Insertet e ADN-së të grupit N-mer sipas ngjashmërisë së sekuencës: Për të eliminuar gabimet e sekuencës specifike të 454/Roche (siç janë problemet me shtrirjet e sekuencës së homopolimerëve) dhe për të hequr tepricat më pak të rëndësishme, futjet e sekuencës së ADN-së N-mer të filtruar më parë (insertet) renditen sipas ngjashmërisë.futjet (lejohen deri në 2 baza që nuk përputhen) duke përdorur një algoritëm përsëritës të përcaktuar si më poshtë: futjet renditen së pari sipas frekuencës së tyre (më e larta te më e ulëta), dhe nëse janë të njëjta, sipas renditjes dytësore sipas gjatësisë (më e gjata tek më e shkurtra) ).Kështu, futjet më të shpeshta dhe më të gjata përcaktojnë "grupin" e parë.Frekuenca e grupit vendoset në frekuencën kryesore.Më pas, çdo futje e mbetur në listën e renditur u përpoq të shtohej në grup me anë të rreshtimit Needleman-Wunsch në çift.Nëse numri i mospërputhjeve, futjeve ose fshirjeve në një shtrirje nuk e kalon pragun prej 2, një futje i shtohet grupit dhe frekuenca e përgjithshme e grupit rritet nga sa shpesh është shtuar futja.Futjet e shtuara në një grup shënohen si të përdorura dhe përjashtohen nga përpunimi i mëtejshëm.Nëse sekuenca e futjes nuk mund të shtohet në një grup tashmë ekzistues, sekuenca e futjes përdoret për të krijuar një grup të ri me frekuencën e duhur të futjes dhe shënohet si i përdorur.Përsëritja përfundon kur çdo sekuencë e futjes ose është përdorur për të formuar një grup të ri ose mund të përfshihet në një grup tashmë ekzistues.Në fund të fundit, futjet e grupuara të përbëra nga nukleotide përfundimisht përkthehen në sekuenca peptide (biblioteka peptide).Rezultati i kësaj analize është një grup futjesh dhe frekuencat e tyre përkatëse që përbëjnë numrin e leximeve të njëpasnjëshme (Fig. 2 plotësuese).
Gjenerimi i motiveve: Bazuar në një listë të peptideve unike, u krijua një bibliotekë që përmban të gjitha modelet e mundshme të aminoacideve (aa) siç tregohet më poshtë.Çdo model i mundshëm i gjatësisë 3 u nxor nga peptidi dhe modeli i tij i kundërt u shtua së bashku me një bibliotekë të përbashkët motivesh që përmban të gjitha modelet (tripeptidet).Bibliotekat me motive shumë të përsëritura u renditën dhe u hoqën tepricat.Më pas, për çdo tripeptid në bibliotekën e motiveve, ne kontrolluam praninë e tij në bibliotekë duke përdorur mjete llogaritëse.Në këtë rast, frekuenca e peptidit që përmban tripeptidin e motivit të gjetur i shtohet dhe i caktohet motivit në bibliotekën e motiveve (“numri i motiveve”).Rezultati i gjenerimit të motiveve është një grup dydimensional që përmban të gjitha shfaqjet e tripeptideve (motiveve) dhe vlerat e tyre përkatëse, të cilat janë numri i leximeve të renditjes që rezultojnë në motivin përkatës kur leximet filtrohen, grupohen dhe përkthehen.Metrikë siç përshkruhet në detaje më sipër.
Normalizimi i numrit të motiveve dhe skicave përkatëse: Numri i motiveve për çdo mostër u normalizua duke përdorur
ku ni është numri i leximeve që përmbajnë temën i.Kështu, vi përfaqëson frekuencën e përqindjes së leximeve (ose peptideve) që përmbajnë motivin i në kampion.Vlerat P për numrin jo të normalizuar të motiveve u llogaritën duke përdorur testin e saktë të Fisher.Lidhur me korrelogramet e numrit të motiveve, korrelacionet e Spearman u llogaritën duke përdorur numrin e normalizuar të motiveve me R.
Për të vizualizuar përmbajtjen e aminoacideve në çdo pozicion në bibliotekën e peptideve, u krijuan logogramet e internetit 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Së pari, përmbajtja e aminoacideve në çdo pozicion të peptidit 12-mer ruhet në një matricë 20×12.Më pas, një grup prej 1000 peptidesh që përmbajnë të njëjtën përmbajtje relative të aminoacideve në çdo pozicion gjenerohet në formatin e sekuencës së shpejtë dhe ofrohet si hyrje në logon e internetit 3, e cila gjeneron një paraqitje grafike të përmbajtjes relative të aminoacideve në çdo pozicion.për një bibliotekë të caktuar peptide.Për të vizualizuar grupet e të dhënave shumëdimensionale, hartat e nxehtësisë u krijuan duke përdorur një mjet të zhvilluar brenda në R (biosHeatmap, një paketë R që ende nuk do të publikohet).Dendrogramet e paraqitura në hartat e nxehtësisë janë llogaritur duke përdorur metodën e grupimit hierarkik të Ward me metrikën e distancës Euklidiane.Për analizën statistikore të të dhënave të pikësimit të motivit, vlerat P për pikëzimin e panormalizuar u llogaritën duke përdorur testin e saktë të Fisher.Vlerat P për grupet e tjera të të dhënave u llogaritën në R duke përdorur testin t Student ose ANOVA.
Klonet e përzgjedhura të fagut dhe fagët pa inserte u injektuan në mënyrë intravenoze nëpërmjet venës së bishtit (2×1010 fagë/kafshë në 300 μl PBS).Dhjetë minuta para perfuzionit dhe fiksimit pasues, të njëjtave kafshë u injektuan në mënyrë intravenoze 100 μl lektinë të etiketuar me DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuta pas injektimit të fagut, minjtë u perfuzuan përmes zemrës me 50 ml PBS të ndjekur nga 50 ml 4% PFA/PBS.Mostrat e trurit u fiksuan gjithashtu gjatë natës në 4% PFA/PBS dhe u zhytën në 30% saharozë gjatë natës në 4°C.Mostrat ngrihen me shpejtësi në përzierjen OCT.Analiza imunohistokimike e mostrave të ngrira u krye në temperaturën e dhomës në krioseksione 30 μm të bllokuara me 1% BSA dhe të inkubuara me antitrupa poliklonalë të etiketuar me FITC kundër fagut T7 (Novus NB 600-376A) në 4 °C.Inkuboni gjatë natës.Në fund, seksionet u lanë 3 herë me PBS dhe u ekzaminuan me një mikroskop lazer konfokal (Leica TCS SP5).
Të gjitha peptidet me një pastërti minimale prej 98% u sintetizuan nga GenScript USA, u biotiniluan dhe u liofilizuan.Biotina lidhet nëpërmjet një hapësire shtesë të trefishtë të glicinës në skajin N.Kontrolloni të gjitha peptidet duke përdorur spektrometrinë e masës.
Streptavidina (Sigma S0677) u përzie me një tepricë ekuimolar 5-fish të peptidit të biotiniluar, peptidit frenues të biotiniluar BACE1 ose një kombinimi (raporti 3:1) i peptidit frenues BACE1 të biotiniluar dhe peptidit frenues BACE1 në DM5-10% inhibitor BACE1.1 orë në temperaturën e dhomës para injektimit.Peptidet e konjuguara me streptavidin u injektuan në mënyrë intravenoze në një dozë prej 10 mg/kg në një nga venat e bishtit të minjve me një zgavër cerebrale.
Përqendrimi i komplekseve streptavidin-peptid u vlerësua me ELISA.Pllakat e mikrotitrave Nunc Maxisorp (Sigma) u mbuluan gjatë natës në 4°C me 1.5 μg/ml antitrup anti-streptavidin të miut (Thermo, MA1-20011).Pas bllokimit (bufer bllokues: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% xhelatinë, 1% BSA) në temperaturën e dhomës për 2 orë, lani pjatën me 0.05% Tween-20/PBS (bufer larës) për 3 sekonda, u shtuan 1 mostra në puset e plazmës me bllokim 1 mostër dhe CSF. 0,000, CSF 1:115).Pllaka më pas u inkubua gjatë natës në 4°C me antitrupa zbulues (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Pas tre hapave të larjes, streptovidina u zbulua me inkubacion në tretësirën e substratit TMB (Roche) deri në 20 minuta.Pas ndalimit të zhvillimit të ngjyrës me 1 M H2SO4, matni absorbimin në 450 nm.
Funksioni i kompleksit inhibitor streptavidin-peptid-BACE1 u vlerësua me Aβ(1-40) ELISA sipas protokollit të prodhuesit (Wako, 294-64701).Shkurtimisht, mostrat e CSF u holluan në hollues standard (1:23) dhe u inkubuan gjatë natës në 4°C në pllaka 96 pusesh të veshura me antitrup kapës BNT77.Pas pesë hapave të larjes, u shtua antitrupi BA27 i konjuguar me HRP dhe u inkubua për 2 orë në 4° C., i ndjekur nga pesë hapa larjeje.Aβ (1-40) u zbulua me inkubacion në tretësirën TMB për 30 minuta në temperaturën e dhomës.Pasi të jetë ndërprerë zhvillimi i ngjyrës me tretësirën ndaluese, matni absorbimin në 450 nm.Mostrat e plazmës iu nënshtruan nxjerrjes së fazës së ngurtë përpara ELISA-s Aβ (1-40).Plazma u shtua në 0.2% DEA (Sigma) në pllaka 96 pusesh dhe u inkubua në temperaturën e dhomës për 30 minuta.Pas larjes së njëpasnjëshme të pllakave SPE (Oasis, 186000679) me ujë dhe 100% metanol, mostrat e plazmës u shtuan në pllakat SPE dhe i gjithë lëngu u hoq.Mostrat u lanë (së pari me 5% metanol pastaj 30% metanol) dhe u eluan me 2% NH4OH/90% metanol.Pas tharjes së eluatit në 55°C për 99 minuta me rrymë konstante N2, mostrat u reduktuan në hollues standardë dhe Aβ(1-40) u mat siç përshkruhet më sipër.
Si të citojmë këtë artikull: Urich, E. et al.Dorëzimi i ngarkesës në tru duke përdorur peptide tranzite të identifikuara in vivo.shkenca.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dhe Moos T. Dorëzimi i barnave makromolekulare në tru duke përdorur terapi të synuar.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dhe Martinez-Martinez, P. Dorëzimi i barnave peptide dhe proteinike përmes barrierës gjaku-tru.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Pengesa gjaku-tru: një pengesë në zhvillimin e ilaçeve të trurit.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG dhe Byrd, A. Perspektivat për shpërndarjen e përmirësuar të barnave dhe shënjestrimin drejt trurit nëpërmjet rrugës plexus koroid-CSF.Kërkime Farmaceutike 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizimi i biofarmaceutikëve me kuaj trojanë molekularë për shpërndarjen e trurit.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transport peptid i ndërmjetësuar nga receptori WM nëpër barrierën gjak-tru.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Rritja e depërtimit të trurit dhe efikasitetit të antitrupave terapeutikë duke përdorur anije molekulare monovalente.Neuroni 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transporti i receptorit të transferrinës (TfR) përcakton marrjen e trurit të varianteve të afinitetit të antitrupave TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).