Disa tema për zgjidhjen e problemeve me LC nuk janë kurrë të vjetruara, pasi ka probleme në praktikën e LC-së, edhe pse teknologjia e instrumenteve përmirësohet me kalimin e kohës. Ka shumë mënyra se si mund të lindin probleme në një sistem LC dhe të përfundojnë në formë të dobët të majës. Kur lindin probleme që lidhen me formën e majës, një listë e shkurtër e shkaqeve të mundshme për këto rezultate ndihmon në thjeshtimin e përvojës sonë të zgjidhjes së problemeve.
Ka qenë kënaqësi të shkruaj këtë rubrikë "Zgjidhja e Problemeve të LC" dhe të mendoj për temat çdo muaj, sepse disa tema nuk dalin kurrë nga moda. Ndërsa në fushën e kërkimit të kromatografisë, disa tema ose ide bëhen të vjetëruara pasi zëvendësohen nga ide më të reja dhe më të mira, në fushën e zgjidhjes së problemeve, që nga artikulli i parë i zgjidhjes së problemeve që u shfaq në këtë revistë (Revista LC në atë kohë) pasi disa tema janë ende relevante) në vitin 1983 (1). Gjatë viteve të fundit, kam përqendruar disa seksione të Zgjidhjes së LC në trendet bashkëkohore që ndikojnë në kromatografinë e lëngshme (LC) (për shembull, krahasimi relativ i kuptimit tonë të efektit të presionit në mbajtjen [2] Përparime të Reja) Interpretimi ynë i rezultateve të LC dhe si të zgjidhim problemet me instrumentet moderne LC. Në këstin e këtij muaji, po vazhdoj serinë time (3), e cila filloi në dhjetor 2021, e cila u përqendrua në disa nga temat "jetë dhe vdekje" të problemeve të LC - elementët që janë të shkëlqyeshëm për çdo zgjidhës problemesh janë thelbësorë, pavarësisht nga mosha e sistemit që po përdorim. Tema kryesore e kësaj serie është shumë e rëndësishme për murin e famshëm "Udhëzuesi i Zgjidhjes së Problemeve LC" të LCGC. grafiku (4) varet në shumë laboratorë. Për pjesën e tretë të kësaj serie, zgjodha të përqendrohem në çështjet që lidhen me formën ose karakteristikat e majave. Çuditërisht, grafiku i murit liston 44 shkaqe të ndryshme të mundshme të formës së dobët të majave! Nuk mund t'i shqyrtojmë të gjitha këto çështje në detaje në një artikull, kështu që në këtë pjesë të parë mbi këtë temë, do të përqendrohem në disa nga ato që i shoh më shpesh. Shpresoj që përdoruesit e rinj dhe të vjetër të LC do të gjejnë disa këshilla dhe kujtesa të dobishme mbi këtë temë të rëndësishme.
E gjej veten duke iu përgjigjur gjithnjë e më shumë pyetjeve për zgjidhjen e problemeve me "çdo gjë është e mundur". Kjo përgjigje mund të duket e lehtë kur merren në konsideratë vëzhgime që janë të vështira për t'u interpretuar, por shpesh e gjej të përshtatshme. Me shumë shkaqe të mundshme të formës së dobët të majës, është e rëndësishme të mbash një mendje të hapur kur merr në konsideratë se cili mund të jetë problemi dhe të jesh në gjendje të përcaktosh përparësitë e shkaqeve të mundshme për të filluar përpjekjet tona për zgjidhjen e problemeve, duke u përqendruar në ato mundësi më të zakonshme, kjo pikë është shumë e rëndësishme.
Një hap kyç në çdo ushtrim zgjidhjeje problemesh - por një që mendoj se është nënvlerësuar - është pranimi se ekziston një problem që duhet zgjidhur. Të pranosh se ekziston një problem shpesh do të thotë të pranosh se ajo që i ndodh mjetit është e ndryshme nga pritjet tona, të cilat formohen nga teoria, njohuritë empirike dhe përvoja (5). "Forma e majës" e përmendur këtu në fakt i referohet jo vetëm formës së majës (simetrike, asimetrike, e lëmuar, e butë, me skaj kryesor, me bisht, etj.), por edhe gjerësisë. Pritjet tona për formën aktuale të majës janë të thjeshta. Teoria (6) mbështet mirë pritjen e librit shkollor se, në shumicën e rasteve, majat kromatografike duhet të jenë simetrike dhe të përputhen me formën e një shpërndarjeje Gausiane, siç tregohet në Figurën 1a. Ajo që presim nga gjerësitë e majave është një çështje më komplekse dhe do ta diskutojmë këtë temë në një artikull të ardhshëm. Format e tjera të majave në Figurën 1 tregojnë disa nga mundësitë e tjera që mund të vërehen - me fjalë të tjera, disa nga mënyrat se si gjërat mund të shkojnë keq. Në pjesën tjetër të këtij kapitulli, do të kalojmë kohë duke diskutuar disa shembuj specifikë të situatave që mund të çojnë në këto lloje formash.
Ndonjëherë majat nuk vërehen fare në kromatogram ku pritet të eluohen. Grafiku i mësipërm tregon se mungesa e një maje (duke supozuar se mostra përmban në të vërtetë analitin e synuar në një përqendrim që duhet ta bëjë përgjigjen e detektorit të mjaftueshme për ta parë atë mbi zhurmën) zakonisht lidhet me ndonjë problem të instrumentit ose kushte të pasakta të fazës mobile (nëse vërehen fare). majat, zakonisht shumë "të dobëta"). Një listë e shkurtër e problemeve dhe zgjidhjeve të mundshme në këtë kategori mund të gjendet në Tabelën I.
Siç u përmend më sipër, pyetja se sa zgjerim i majave duhet të tolerohet përpara se t'i kushtohet vëmendje dhe të përpiqemi ta rregullojmë atë është një temë komplekse që do ta diskutoj në një artikull të ardhshëm. Përvoja ime është se zgjerimi i konsiderueshëm i majave shpesh shoqërohet me një ndryshim të rëndësishëm në formën e majave, dhe bishti i majave është më i zakonshëm sesa para-majës ose ndarja. Megjithatë, majat nominalisht simetrike zgjerohen gjithashtu, të cilat mund të shkaktohen nga disa arsye të ndryshme:
Secila prej këtyre çështjeve është diskutuar në detaje në numrat e mëparshëm të Zgjidhjes së Problemeve me LC-në, dhe lexuesit e interesuar për këto tema mund t'i referohen këtyre artikujve të mëparshëm për informacion mbi shkaqet rrënjësore dhe zgjidhjet e mundshme për këto probleme. Më shumë detaje.
Vendosja e majave në bisht, vendosja e majave në ballë dhe ndarja mund të shkaktohen të gjitha nga fenomene kimike ose fizike, dhe lista e zgjidhjeve të mundshme për këto probleme ndryshon shumë, varësisht nëse kemi të bëjmë me një problem kimik apo fizik. Shpesh, duke krahasuar majat e ndryshme në një kromatogram, mund të gjeni të dhëna të rëndësishme se cili është fajtori. Nëse të gjitha majat në një kromatogram shfaqin forma të ngjashme, shkaku ka shumë të ngjarë të mos jetë fizik. Nëse vetëm një ose disa maja preken, por pjesa tjetër duken mirë, shkaku ka shumë të ngjarë të jetë kimik.
Shkaqet kimike të rënies së kulmit janë shumë komplekse për t'u diskutuar shkurtimisht këtu. Lexuesi i interesuar mund t'i referohet numrit të fundit të "Zgjidhja e problemeve të LC" për një diskutim më të thelluar (10). Megjithatë, një gjë e lehtë për t'u provuar është të zvogëlohet masa e analitit të injektuar dhe të shihet nëse forma e kulmit përmirësohet. Nëse po, atëherë ky është një tregues i mirë se problemi është "mbingarkesa e masës". Në këtë rast, metoda duhet të kufizohet në injektimin e masave të vogla të analitit, ose kushtet kromatografike duhet të ndryshohen në mënyrë që të merren forma të mira të kulmit edhe me masa më të mëdha të injektuara.
Ekzistojnë gjithashtu shumë arsye të mundshme fizike për uljen e kulmit. Lexuesit e interesuar për një diskutim të hollësishëm të mundësive mund të referohen në një numër tjetër të kohëve të fundit të "Zgjidhja e problemeve të kulmit" (11). Një nga shkaqet më të zakonshme fizike të uljes së kulmit është një lidhje e dobët në një pikë midis injektorit dhe detektorit (12). Një shembull ekstrem është treguar në Figurën 1d, të marrë në laboratorin tim disa javë më parë. Në këtë rast, ne ndërtuam një sistem me një valvul të ri injeksioni që nuk e kishim përdorur më parë dhe instaluam një lak injeksioni me vëllim të vogël me një unazë që ishte formuar në një kapilar çeliku inox. Pas disa eksperimenteve fillestare të zgjidhjes së problemeve, kuptuam se thellësia e portit në statorin e valvulës së injektimit ishte shumë më e thellë se sa ishim mësuar, duke rezultuar në një vëllim të madh të vdekur në fund të portit. Ky problem zgjidhet lehtësisht duke zëvendësuar lakun e injektimit me një tub tjetër, ne mund ta rregullojmë unazën në pozicionin e duhur për të eliminuar vëllimin e vdekur në fund të portit.
Frontet e majave si ato të paraqitura në Figurën 1e mund të shkaktohen gjithashtu nga probleme fizike ose kimike. Një shkak i zakonshëm fizik i skajit kryesor është se shtrati i grimcave të kolonës nuk është i paketuar mirë, ose se grimcat janë riorganizuar me kalimin e kohës. Ashtu si me uljen e majave të shkaktuar nga ky fenomen fizik, mënyra më e mirë për ta rregulluar këtë është të zëvendësoni kolonën dhe të vazhdoni. Në thelb, format e majave të skajit kryesor me origjinë kimike shpesh lindin nga ajo që ne e quajmë kushte mbajtjeje "jo-lineare". Nën kushte ideale (lineare), sasia e analitit të mbajtur nga faza stacionare (pra, faktori i mbajtjes) është e lidhur linearisht me përqendrimin e analitit në kolonë. Kromatografikisht, kjo do të thotë që ndërsa masa e analitit të injektuar në kolonë rritet, maja bëhet më e lartë, por jo më e gjerë. Kjo marrëdhënie prishet kur sjellja e mbajtjes është jo-lineare, dhe majat jo vetëm që bëhen më të larta, por edhe më të gjera ndërsa injektohet më shumë masë. Përveç kësaj, format jolineare përcaktojnë formën e majave kromatografike, duke rezultuar në skaje kryesore ose prapa. Ashtu si me mbingarkesën e masës që shkakton uljen e majave. (10), maja kryesuese e shkaktuar nga mbajtja jolineare mund të diagnostikohet edhe duke zvogëluar masën e analitit të injektuar. Nëse forma e majës përmirësohet, metoda duhet të modifikohet për të mos tejkaluar cilësinë e injektimit që shkakton skajin kryesues, ose kushtet kromatografike duhet të ndryshohen për të minimizuar këtë sjellje.
Ndonjëherë vërejmë atë që duket të jetë një kulm "i ndarë", siç tregohet në Figurën 1f. Hapi i parë në zgjidhjen e këtij problemi është të përcaktohet nëse forma e kulmit është për shkak të bashkë-elucionit të pjesshëm (domethënë, prania e dy komponimeve të dallueshme, por që eluohen ngushtë). Nëse në të vërtetë ka dy analit të ndryshëm që eluohen afër njëri-tjetrit, atëherë është çështje përmirësimi i rezolucionit të tyre (për shembull, duke rritur selektivitetin, mbajtjen ose numrin e pllakave), dhe majat e dukshme "të ndara" lidhen me performancën fizike. Performanca nuk ka të bëjë fare me vetë kolonën. Shpesh, çelësi më i rëndësishëm për këtë vendim është nëse të gjitha majat në kromatogram shfaqin forma të ndara, apo vetëm një ose dy. Nëse është vetëm një ose dy, ndoshta është një problem bashkë-elucioni; nëse të gjitha majat janë të ndara, ndoshta është një problem fizik, me shumë gjasa i lidhur me vetë kolonën.
Majat e ndara që lidhen me vetitë fizike të vetë kolonës zakonisht shkaktohen nga fritat e hyrjes ose daljes pjesërisht të bllokuara, ose riorganizimi i grimcave në kolonë, duke lejuar që faza mobile të rrjedhë më shpejt se faza mobile në zona të caktuara të formimit të kanalit të kolonës në rajone të tjera (11). Frita pjesërisht e bllokuar ndonjëherë mund të pastrohet duke e kthyer rrjedhën përmes kolonës; megjithatë, sipas përvojës sime, kjo është zakonisht një zgjidhje afatshkurtër sesa afatgjatë. Kjo është shpesh fatale me kolonat moderne nëse grimcat rikombinohen brenda kolonës. Në këtë pikë, është më mirë të zëvendësohet kolona dhe të vazhdohet.
Maja në Figurën 1g, gjithashtu nga një rast i kohëve të fundit në laboratorin tim, zakonisht tregon se sinjali është aq i lartë sa ka arritur fundin e lartë të diapazonit të përgjigjes. Për detektorët optikë të absorbimit (UV-vis në këtë rast), kur përqendrimi i analitit është shumë i lartë, analiti thith pjesën më të madhe të dritës që kalon nëpër qelizën e rrjedhës së detektorit, duke lënë shumë pak dritë për t'u zbuluar. Nën këto kushte, sinjali elektrik nga fotodetektori ndikohet shumë nga burime të ndryshme zhurme, të tilla si drita e shpërndarë dhe "rryma e errët", duke e bërë sinjalin shumë "të paqartë" në pamje dhe të pavarur nga përqendrimi i analitit. Kur kjo ndodh, problemi shpesh mund të zgjidhet lehtësisht duke zvogëluar vëllimin e injektimit të analitit - duke zvogëluar vëllimin e injektimit, duke holluar mostrën ose të dyja.
Në shkollën e kromatografisë, ne përdorim sinjalin e detektorit (domethënë, boshtin y në kromatogram) si një tregues të përqendrimit të analitit në mostër. Pra, duket e çuditshme të shohësh një kromatogram me një sinjal nën zero, pasi interpretimi i thjeshtë është se kjo tregon një përqendrim negativ të analitit - gjë që sigurisht nuk është fizikisht e mundur. Sipas përvojës sime, majat negative vërehen më shpesh kur përdoren detektorë optikë të absorbimit (p.sh., UV-vis).
Në këtë rast, një kulm negativ thjesht do të thotë që molekulat që eluojnë nga kolona thithin më pak dritë sesa vetë faza mobile menjëherë para dhe pas kulmit. Kjo mund të ndodhë, për shembull, kur përdoren gjatësi vale zbulimi relativisht të ulëta (<230 nm) dhe aditivë të fazës mobile që thithin pjesën më të madhe të dritës në këto gjatësi vale. Aditivë të tillë mund të jenë përbërës tretës të fazës mobile si metanoli ose përbërës tampon si acetati ose formati. Në fakt, majat negative mund të përdoren për të përgatitur një kurbë kalibrimi dhe për të marrë informacion të saktë sasior, kështu që nuk ka asnjë arsye themelore për t'i shmangur ato në vetvete (kjo metodë nganjëherë quhet "zbulim indirekt UV") (13). Megjithatë, nëse duam vërtet të shmangim majat negative krejtësisht, në rastin e zbulimit të absorbimit, zgjidhja më e mirë është të përdorim një gjatësi vale zbulimi të ndryshme në mënyrë që analiti të thithë më shumë se faza mobile, ose të ndryshojmë përbërjen e fazës mobile në mënyrë që ato të thithin më pak dritë sesa analitët.
Majat negative mund të shfaqen gjithashtu kur përdoret zbulimi i indeksit të thyerjes (RI) kur indeksi i thyerjes së përbërësve të tjerë përveç analitit në mostër, siç është matrica e tretësit, është i ndryshëm nga indeksi i thyerjes së fazës mobile. Kjo ndodh edhe me zbulimin UV-vis, por ky efekt tenton të zbutet në krahasim me zbulimin RI. Në të dyja rastet, majat negative mund të minimizohen duke përputhur më ngushtë përbërjen e matricës së mostrës me atë të fazës mobile.
Në pjesën e tretë mbi temën bazë të zgjidhjes së problemeve me LC, diskutova situatat në të cilat forma e vëzhguar e majës ndryshon nga forma e pritur ose normale e majës. Zgjidhja efektive e problemeve të tilla fillon me njohjen e formave të pritura të majës (bazuar në teori ose përvojën e mëparshme me metodat ekzistuese), kështu që devijimet nga këto pritje janë të dukshme. Problemet e formës së majës kanë shumë shkaqe të ndryshme të mundshme (shumë të gjera, me bisht të hapur, me skaj kryesor, etj.). Në këtë pjesë, diskutoj në detaje disa nga arsyet që shoh më shpesh. Njohja e këtyre detajeve ofron një vend të mirë për të filluar zgjidhjen e problemeve, por nuk kap të gjitha mundësitë. Lexuesit e interesuar për një listë më të thelluar të shkaqeve dhe zgjidhjeve mund t'i referohen tabelës murale "Udhëzuesi i Zgjidhjes së Problemeve me LC" të LCGC.
(4) Grafiku mural “Udhëzuesi i Zgjidhjes së Problemeve LC” i LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza e të Dhënave dhe Përpunimi i Sinjalit në Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), f. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF dhe Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.