Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Biopsia e lëngshme (LB) është një koncept që po fiton me shpejtësi popullaritet në fushën biomjekësore.Koncepti bazohet kryesisht në zbulimin e fragmenteve të ADN-së jashtëqelizore qarkulluese (ccfDNA), të cilat lëshohen kryesisht si fragmente të vogla pas vdekjes së qelizave në inde të ndryshme.Një pjesë e vogël e këtyre fragmenteve e kanë origjinën nga inde ose organizma të huaj (të huaj).Në punën aktuale, ne e kemi aplikuar këtë koncept për midhjet, një specie roje e njohur për kapacitetin e tyre të lartë të filtrimit të ujit të detit.Ne përdorim aftësinë e midhjeve për të vepruar si filtra natyrorë për të kapur fragmente të ADN-së mjedisore nga një shumëllojshmëri burimesh për të ofruar informacion rreth biodiversitetit të ekosistemeve bregdetare detare.Rezultatet tona tregojnë se hemolimfa e midhjes përmban fragmente të ADN-së që ndryshojnë shumë në madhësi, nga 1 në 5 kb.Sekuenca e pushkës së gjahut tregoi se një numër i madh i fragmenteve të ADN-së janë me origjinë mikrobike të huaj.Midis tyre, ne gjetëm fragmente të ADN-së nga bakteret, arkeat dhe viruset, duke përfshirë viruset që dihet se infektojnë një sërë strehësh që gjenden zakonisht në ekosistemet detare bregdetare.Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti i LB i aplikuar për midhjet përfaqëson një burim të pasur, por ende të paeksploruar njohurish rreth diversitetit mikrobik në ekosistemet bregdetare detare.
Ndikimi i ndryshimit të klimës (CC) në biodiversitetin e ekosistemeve detare është një zonë kërkimore në rritje të shpejtë.Ngrohja globale jo vetëm që shkakton strese të rëndësishme fiziologjike, por gjithashtu shtyn kufijtë evolucionar të stabilitetit termik të organizmave detarë, duke ndikuar në habitatin e një numri speciesh, duke i shtyrë ata të kërkojnë kushte më të favorshme [1, 2].Përveç ndikimit në biodiversitetin e metazoanëve, CC prish ekuilibrin delikat të ndërveprimeve pritëse-mikrobiale.Kjo dysbakteriozë mikrobike përbën një kërcënim serioz për ekosistemet detare pasi i bën organizmat detarë më të ndjeshëm ndaj patogjenëve infektivë [3, 4].Besohet se SS luajnë një rol të rëndësishëm në vdekjet masive, gjë që është një problem serioz për menaxhimin e ekosistemeve detare globale [5, 6].Kjo është një çështje e rëndësishme duke pasur parasysh ndikimet ekonomike, ekologjike dhe ushqyese të shumë specieve detare.Kjo është veçanërisht e vërtetë për bivalvët që jetojnë në rajonet polare, ku efektet e CK janë më të menjëhershme dhe të rënda [6, 7].Në fakt, bivalvët si Mytilus spp.përdoren gjerësisht për të monitoruar efektet e CC në ekosistemet detare.Nuk është për t'u habitur që një numër relativisht i madh biomarkerësh janë zhvilluar për të monitoruar shëndetin e tyre, shpesh duke përdorur një qasje me dy nivele që përfshin biomarkerët funksionalë të bazuar në aktivitetin enzimatik ose funksionet qelizore si qëndrueshmëria e qelizave dhe aktiviteti fagocitar [8].Këto metoda përfshijnë gjithashtu matjen e përqendrimit të treguesve specifikë të presionit që grumbullohen në indet e buta pas përthithjes së sasive të mëdha të ujit të detit.Megjithatë, kapaciteti i lartë i filtrimit dhe sistemi i qarkullimit gjysmë të hapur të bivalvëve ofrojnë një mundësi për të zhvilluar biomarkues të rinj hemolimfë duke përdorur konceptin e biopsisë së lëngshme (LB), një qasje e thjeshtë dhe minimalisht invazive për menaxhimin e pacientit.mostrat e gjakut [9, 10].Megjithëse disa lloje të molekulave qarkulluese mund të gjenden në LB-në e njeriut, ky koncept bazohet kryesisht në analizën e sekuencës së ADN-së të fragmenteve të ADN-së jashtëqelizore (ccfDNA) që qarkullojnë në plazmë.Në fakt, prania e ADN-së qarkulluese në plazmën e njeriut është e njohur që nga mesi i shekullit të 20-të [11], por vetëm në vitet e fundit shfaqja e metodave të renditjes me performancë të lartë ka çuar në diagnozën klinike të bazuar në ccfDNA.Prania e këtyre fragmenteve qarkulluese të ADN-së është pjesërisht për shkak të çlirimit pasiv të ADN-së gjenomike (bërthamore dhe mitokondriale) pas vdekjes së qelizave. Tek individët e shëndetshëm, përqendrimi i ccfDNA është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet me 5-10 herë në pacientët që vuajnë nga patologji të ndryshme ose i nënshtrohen stresit, duke rezultuar në dëmtim të indeve. Tek individët e shëndetshëm, përqendrimi i ccfDNA është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet me 5-10 herë në pacientët që vuajnë nga patologji të ndryshme ose i nënshtrohen stresit, duke rezultuar në dëmtim të indeve. Во здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), por mund të jetë në 5–10 herë në больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщденему. Tek njerëzit e shëndetshëm, përqendrimi i cccDNA është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet me 5-10 herë në pacientët me patologji të ndryshme ose nën stres që çon në dëmtim të indeve.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承在患有各种病理或承可加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Përqendrimet ccfDNA janë shumë të ulëta (<10 ng/ml) në njerëz të mirë, por mund të jenë të pandryshuara në 5-10 herë në pacientov me patogjene të ndryshme ose stresi, të cilat mund të ndiqen nga lakmia. Përqendrimet e ccfADNA janë zakonisht të ulëta (<10 ng/ml) te individët e shëndetshëm, por mund të rriten 5-10 herë në pacientët me patologji të ndryshme ose stres, duke rezultuar në dëmtim të indeve.Madhësia e fragmenteve ccfDNA ndryshon shumë, por zakonisht varion nga 150 në 200 bp.[12].Analiza e ccfDNA e vetë-përfituar, p.sh., ccfDNA nga qelizat pritëse normale ose të transformuara, mund të përdoret për të zbuluar ndryshimet gjenetike dhe epigjenetike të pranishme në gjenomën bërthamore dhe/ose mitokondriale, duke ndihmuar kështu mjekët të zgjedhin terapi specifike të synuara molekulare [13].Megjithatë, ccfDNA mund të merret nga burime të huaja si ccfDNA nga qelizat fetale gjatë shtatzënisë ose nga organet e transplantuara [14,15,16,17].ccfDNA është gjithashtu një burim i rëndësishëm informacioni për zbulimin e pranisë së acideve nukleike të një agjenti infektiv (të huaj), i cili lejon zbulimin joinvaziv të infeksioneve të përhapura që nuk identifikohen nga kulturat e gjakut, duke shmangur biopsinë invazive të indeve të infektuara [18].Studimet e fundit kanë treguar me të vërtetë se gjaku i njeriut përmban një burim të pasur informacioni që mund të përdoret për të identifikuar patogjenët viralë dhe bakterialë dhe se rreth 1% e ccfDNA-së që gjendet në plazmën e njeriut është me origjinë të huaj [19].Këto studime tregojnë se biodiversiteti i mikrobiomës qarkulluese të një organizmi mund të vlerësohet duke përdorur analizën ccfDNA.Sidoqoftë, deri vonë, ky koncept përdorej ekskluzivisht tek njerëzit dhe, në një masë më të vogël, në vertebrorët e tjerë [20, 21].
Në punimin aktual, ne përdorim potencialin LB për të analizuar ccfDNA të Aulacomya atra, një specie jugore që gjendet zakonisht në ishujt Kerguelen subantarktik, një grup ishujsh në majë të një pllajë të madhe që u formua 35 milionë vjet më parë.shpërthim vullkanik.Duke përdorur një sistem eksperimental in vitro, ne zbuluam se fragmentet e ADN-së në ujin e detit merren shpejt nga midhjet dhe hyjnë në ndarjen e hemolimfës.Sekuenca e armëve të gjahut ka treguar se ccfDNA e hemolimfës së midhjes përmban fragmente të ADN-së të origjinës së saj dhe jo-vetë, duke përfshirë bakteret simbiotike dhe fragmente të ADN-së nga biomet tipike të ekosistemeve bregdetare detare të ftohta vullkanike.ccfDNA e hemolimfës përmban gjithashtu sekuenca virale që rrjedhin nga viruse me diapazon të ndryshëm pritës.Ne gjetëm gjithashtu fragmente të ADN-së nga kafshët shumëqelizore si peshqit kockor, anemonet e detit, algat dhe insektet.Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti LB mund të zbatohet me sukses tek jovertebrorët detarë për të gjeneruar një repertor të pasur gjenomik në ekosistemet detare.
Të rriturit (55-70 mm të gjatë) Mytilus platensis (M. platensis) dhe Aulacomya atra (A. atra) u mblodhën nga brigjet shkëmbore ndërtidale të Port-au-France (049°21.235 J, 070°13.490 Lindore .).Ishujt Kerguelen në dhjetor 2018. Midhje të tjera blu të rritura (Mytilus spp.) u morën nga një furnizues tregtar (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dhe u vendosën në një rezervuar të gazuar me temperaturë të kontrolluar (4°C) që përmban 10-20 L shëllirë artificiale 32‰.(kripë artificiale e detit Reef Crystal, Instant Ocean, Virxhinia, SHBA).Për çdo eksperiment, u mat gjatësia dhe pesha e predhave individuale.
Një protokoll pa akses të hapur për këtë program është i disponueshëm në internet (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Shkurtimisht, hemolimfa LB u mblodh nga muskujt rrëmbyes siç përshkruhet [22].Hemolimfa u qartësua me centrifugim në 1200 × g për 3 minuta, supernatanti u ngri (-20 ° C) deri në përdorim.Për izolimin dhe pastrimin e cfDNA, mostrat (1,5-2,0 ml) u shkrinë dhe u përpunuan duke përdorur kompletin NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sipas udhëzimeve të prodhuesit.ccfDNA u ruajt në -80°C deri në analizë të mëtejshme.Në disa eksperimente, ccfDNA u izolua dhe u pastrua duke përdorur kompletin e hetuesit të ADN-së QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).ADN-ja e pastruar u mat duke përdorur një analizë standarde PicoGreen.Shpërndarja e fragmenteve të ccfDNA-së së izoluar u analizua me elektroforezë kapilar duke përdorur një bianalizues Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) duke përdorur një Kit të ADN-së me Ndjeshmëri të Lartë.Analiza u krye duke përdorur 1 µl të mostrës ccfDNA sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Për renditjen e fragmenteve të hemolimfës ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) përgatiti biblioteka me armë gjahu duke përdorur kompletin Illumina DNA Mix të kompletit Illumina MiSeq PE75.Është përdorur një përshtatës standard (BioO).Skedarët e të dhënave të papërpunuara disponohen nga Arkivi i Leximit të Sekuencës NCBI (SRR8924808 dhe SRR8924809).Cilësia bazë e leximit u vlerësua duke përdorur FastQC [23].Trimmomatic [24] është përdorur për prerje të përshtatësve dhe lexime me cilësi të dobët.Leximet me armë gjahu me skajet e çiftuara u bashkuan FLASH në lexime më të gjata të vetme me një mbivendosje minimale prej 20 bp për të shmangur mospërputhjet [25]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur një bazë të dhënash të Taksonomisë NCBI dyvalve (e vlera < 1e−3 dhe homologji 90%) dhe maskimi i sekuencave me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur një bazë të dhënash të Taksonomisë NCBI dyvalve (e vlera < 1e−3 dhe homologji 90%) dhe maskimi i sekuencave me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26]. Объединенные чтения были annotirovanы me ndihmën e BLASTN me përdorim të plotë të taksonimit dvuscreatыh моллюсков NCBI (domethënia e < 1e-3 dhe 90% e plotë e matjes së ndikimit), dhe maksimumin со использованием PLUHUR [26]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur bazën e të dhënave të taksonomisë bivalve NCBI (vlera e < 1e-3 dhe homologji 90%) dhe maskimi i sekuencës me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN me ndihmën e BLASTN me përdorimin e taksonomicheskoy bazы dannыh dvustorih mollyuskov NCBI (domethënia e <1e-3 dhe 90% e zvogëlimit të mundësisë), plote со использованием PLUHUR [26]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur bazën e të dhënave taksonomike bivalve NCBI (vlera e <1e-3 dhe homologjia 90%) dhe maskimi i sekuencës me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26].Leximet u ndanë në dy grupe: të lidhura me sekuencat bivalve (këtu të quajtura vetë-lexime) dhe të palidhura (jo-lexime vetë).Dy grupe u mblodhën veçmas duke përdorur MEGAHIT për të gjeneruar contigs [27].Ndërkohë, shpërndarja taksonomike e leximeve të mikrobiomës së huaj u klasifikua duke përdorur Kraken2 [28] dhe u përfaqësua grafikisht nga një grafik me byrek Krona në Galaxy [29, 30].Kmerët optimalë u përcaktuan të ishin kmers-59 nga eksperimentet tona paraprake. Vetë kontigjentet më pas u identifikuan nga përafrimi me BLASTN (baza e të dhënave NCBI bivalve, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji) për një shënim përfundimtar. Vetë kontigjentet më pas u identifikuan nga përafrimi me BLASTN (baza e të dhënave NCBI bivalve, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji) për një shënim përfundimtar. Për shkak të informacionit të përbashkët me BLASTN (baza e të dhënave të krijuara nga NCBI, kuptimi i <1e-10 dhe gjenologjia 60%) për vlerësimin e duhur. Vetë-ngjalljet u identifikuan më pas duke u përputhur me BLASTN (baza e të dhënave bivalve NCBI, vlera e <1e-10 dhe 60% homologji) për shënimin përfundimtar.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识菡别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Mbyllja e të dhënave të përbashkëta për anonacionet e parakohshme me BLASTN (baza e të dhënave të NCBI për dyshkruesit e viteve, vlera e <1e-10 dhe 6%). Vetë-ngjitjet më pas u identifikuan për shënimin përfundimtar duke u përputhur me BLASTN (baza e të dhënave bivalve NCBI, vlera e <1e-10 dhe homologji 60%). Paralelisht, lidhjet e grupeve jo-vetë u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e < 1e−10 dhe homologji 60%). Paralelisht, lidhjet e grupeve jo-vetë u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e < 1e−10 dhe homologji 60%). Paralelly chugerodnыe gruppovыe contigi bыly annotirovanы me pomoщью BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, kuptimi e <1e-10 dhe gjinia 60%). Paralelisht, kontigat e grupeve të huaja u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave NT NCBI, vlera e <1e-10 dhe homologjia 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Paralelly contigi, nuk относящиеся к substvennoy gruppe, po annotirovanы me pomoщью BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, kuptimi e <1e-10 dhe gjinia 60%). Paralelisht, lidhjet e grupeve jo-vetë u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e <1e-10 dhe homologji 60%). BLASTX u krye gjithashtu në lidhjet jo-vetë duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e < 1e−10 dhe homologji 60%). BLASTX u krye gjithashtu në lidhjet jo-vetë duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e < 1e−10 dhe homologji 60%). BLASTX также был shpallur në kontigah jo vetëmostojatelnыh me përdorimin e bazës së të dhënave nr dhe RefSeq NCBI (domethënia e <1e-10 dhe omologia 60%). BLASTX u krye gjithashtu në kontigjentë jo-vetë duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e < 1e-10 dhe homologji 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ア 怼性性Ｚ 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ア 怼性性Ｚ 和60% BLASTX është i plotësuar në kontiga të pakta me përdorimin e bazës së të dhënave nr dhe RefSeq NCBI (domethënia e <1e-10 dhe gjinia 60%). BLASTX u krye gjithashtu në kontigjentë jo-vetë duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e <1e-10 dhe homologji 60%).Grupet BLASTN dhe BLASTX të jo-vetë-kontigimeve përfaqësojnë kontigat përfundimtare (shih skedarin plotësues).
Primerët e përdorur për PCR janë renditur në Tabelën S1.Taq ADN polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) u përdor për të amplifikuar gjenet e synuara ccfDNA.U përdorën kushtet e mëposhtme të reagimit: denatyrimi në 95°C për 3 minuta, 95°C për 1 minutë, vendosja e temperaturës së pjekjes për 1 minutë, zgjatja në 72°C për 1 minutë, 35 cikle dhe në fund 72°C brenda 10 minutash..Produktet PCR u ndanë me elektroforezë në xhel agarozë (1.5%) që përmbanin SYBRTM Safe DNA Gel Gel (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) në 95 V.
Midhjet (Mytilus spp.) u ambientuan në 500 ml ujë deti të oksigjenuar (32 PSU) për 24 orë në 4°C.ADN-ja plazmide që përmban një insert që kodon sekuencën cDNA të galectin-7 të njeriut (numri i hyrjes NCBI L07769) u shtua në shishkë në një përqendrim përfundimtar prej 190 μg/μl.Midhjet e inkubuara në të njëjtat kushte pa shtim të ADN-së ishin kontrolli.Rezervuari i tretë i kontrollit përmbante ADN pa midhje.Për të monitoruar cilësinë e ADN-së në ujin e detit, mostrat e ujit të detit (20 μl; tre përsëritje) u morën nga çdo rezervuar në kohën e treguar.Për gjurmueshmërinë e ADN-së plazmidike, midhjet LB u mblodhën në kohën e treguar dhe u analizuan me qPCR dhe ddPCR.Për shkak të përmbajtjes së lartë të kripës në ujin e detit, pjesët e vogla u holluan në ujë të cilësisë PCR (1:10) përpara të gjitha analizave PCR.
PCR me pika dixhitale (ddPCR) u krye duke përdorur protokollin BioRad QX200 (Missauga, Ontario, Kanada).Përdorni profilin e temperaturës për të përcaktuar temperaturën optimale (Tabela S1).Pikat u krijuan duke përdorur një gjenerator të pikave QX200 (BioRad).ddPCR u krye si më poshtë: 95°C për 5 min, 50 cikle 95°C për 30 s dhe një temperaturë e caktuar pjekjeje për 1 min dhe 72°C për 30 s, 4°C për 5 min dhe 90°C brenda 5 minutave.Numri i pikave dhe reagimet pozitive (numri i kopjeve/µl) u matën duke përdorur një lexues të pikave QX200 (BioRad).Mostrat me më pak se 10,000 pika u refuzuan.Kontrolli i modelit nuk u krye sa herë që u ekzekutua ddPCR.
qPCR u krye duke përdorur Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australi) dhe abetare specifike LGALS7.Të gjitha PCR-të sasiore u kryen në 20 µl duke përdorur çantën QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).qPCR filloi me një inkubacion 15 min në 95°C të ndjekur nga 40 cikle në 95°C për 10 sekonda dhe në 60°C për 60 sekonda me një mbledhje të të dhënave.Lakoret e shkrirjes u krijuan duke përdorur matje të njëpasnjëshme në 95°C për 5 s, 65°C për 60 s dhe 97°C në fund të qPCR.Çdo qPCR u krye në tre kopje, me përjashtim të mostrave të kontrollit.
Meqenëse midhjet njihen për shkallën e tyre të lartë të filtrimit, ne fillimisht hetuam nëse ato mund të filtronin dhe mbanin fragmente të ADN-së të pranishme në ujin e detit.Ne ishim të interesuar gjithashtu nëse këto fragmente grumbullohen në sistemin e tyre limfatik gjysmë të hapur.Ne e zgjidhëm këtë çështje në mënyrë eksperimentale duke gjurmuar fatin e fragmenteve të tretshme të ADN-së të shtuara në rezervuarët blu të midhjeve.Për të lehtësuar gjurmimin e fragmenteve të ADN-së, ne përdorëm ADN plazmide të huaj (jo vetë) që përmban gjenin e njeriut galectin-7.ddPCR gjurmon fragmentet e ADN-së plazmide në ujin e detit dhe midhjet.Rezultatet tona tregojnë se nëse sasia e fragmenteve të ADN-së në ujin e detit mbeti relativisht konstante me kalimin e kohës (deri në 7 ditë) në mungesë të midhjeve, atëherë në prani të midhjeve ky nivel u zhduk pothuajse plotësisht brenda 8 orëve (Fig. 1a,b).Fragmentet e ADN-së ekzogjene u zbuluan lehtësisht brenda 15 minutave në lëngun intravalvular dhe hemolimfën (Fig. 1c).Këto fragmente mund të zbulohen ende deri në 4 orë pas ekspozimit.Ky aktivitet filtrues në lidhje me fragmentet e ADN-së është i krahasueshëm me aktivitetin filtrues të baktereve dhe algave [31].Këto rezultate sugjerojnë se midhjet mund të filtrojnë dhe grumbullojnë ADN-në e huaj në ndarjet e tyre të lëngjeve.
Përqendrimet relative të ADN-së plazmidike në ujin e detit në praninë (A) ose mungesën (B) të midhjeve, të matura me ddPCR.Në A, rezultatet shprehen në përqindje, ku kufijtë e kutive përfaqësojnë përqindjen e 75-të dhe të 25-të.Kurba logaritmike e përshtatur tregohet me të kuqe dhe zona e hijezuar në gri përfaqëson intervalin e besueshmërisë 95%.Në B, vija e kuqe përfaqëson mesataren dhe vija blu përfaqëson intervalin 95% të besimit për përqendrimin.C Akumulimi i ADN-së plazmidike në hemolimfën dhe lëngun valvular të midhjeve në kohë të ndryshme pas shtimit të ADN-së plazmidike.Rezultatet paraqiten si kopje absolute të zbuluara/mL (±SE).
Më pas, ne hetuam origjinën e ccfDNA në midhjet e mbledhura nga shtretërit e midhjeve në ishujt Kerguelen, një grup i largët ishujsh me ndikim të kufizuar antropogjen.Për këtë qëllim, cccDNA nga hemolimfat e midhjes u izolua dhe u pastrua me metoda që përdoren zakonisht për të pastruar cccDNA njerëzore [32, 33].Ne zbuluam se përqendrimet mesatare të ccfDNA të hemolimfës në midhje janë në intervalin e ulët të mikrogramëve për ml të hemolimfës (shih Tabelën S2, Informacioni Suplementar).Ky gamë përqendrimesh është shumë më i madh se te njerëzit e shëndetshëm (nanogramë të ulët për mililitër), por në raste të rralla, në pacientët me kancer, niveli i ccfDNA mund të arrijë disa mikrogramë për mililitër [34, 35].Një analizë e shpërndarjes së madhësisë së ccfDNA të hemolimfës tregoi se këto fragmente ndryshojnë shumë në madhësi, duke filluar nga 1000 bp në 1000 bp.deri në 5000 bp (Fig. 2).Rezultate të ngjashme u morën duke përdorur pajisjen me bazë silicë QIAamp Investigator, një metodë e përdorur zakonisht në shkencën e mjekësisë ligjore për të izoluar dhe pastruar me shpejtësi ADN-në gjenomike nga mostrat e ADN-së me përqendrim të ulët, duke përfshirë ccfDNA [36].
Elektroforegrama përfaqësuese ccfDNA e hemolimfës së midhjes.Ekstraktuar me NucleoSnap Plasma Kit (lart) dhe QIAamp DNA Investigator Kit.B Grafiku i violinës që tregon shpërndarjen e përqendrimeve të ccfDNA të hemolimfës (±SE) në midhje.Vijat e zeza dhe të kuqe përfaqësojnë përkatësisht mesataren dhe kuartilin e parë dhe të tretë.
Përafërsisht 1% e ccfDNA-së tek njerëzit dhe primatët ka një burim të huaj [21, 37].Duke pasur parasysh sistemin e qarkullimit gjysmë të hapur të bivalvëve, ujin e detit të pasur me mikrobi dhe shpërndarjen e madhësisë së ccfDNA të midhjes, ne supozuam se ccfDNA e hemolimfës së midhjes mund të përmbajë një grup të pasur dhe të larmishëm ADN-je mikrobike.Për të testuar këtë hipotezë, ne renditëm ccfDNA të hemolimfës nga mostrat e Aulacomya atra të mbledhura nga Ishujt Kerguelen, duke dhënë mbi 10 milionë lexime, 97.6% e të cilave kaluan kontrollin e cilësisë.Më pas leximet u klasifikuan sipas burimeve vetjake dhe jo-vetë duke përdorur bazat e të dhënave bivalve BLASTN dhe NCBI (Fig. S1, Informacion shtesë).
Tek njerëzit, ADN-ja bërthamore dhe mitokondriale mund të lëshohen në qarkullimin e gjakut [38].Megjithatë, në studimin aktual, nuk ishte e mundur të përshkruhej në detaje ADN-ja gjenomike bërthamore e midhjeve, duke qenë se gjenomi A. atra nuk është renditur apo përshkruar.Megjithatë, ne ishim në gjendje të identifikonim një sërë fragmentesh ccfDNA të origjinës sonë duke përdorur bibliotekën bivalve (Fig. S2, Informacion shtesë).Ne konfirmuam gjithashtu praninë e fragmenteve të ADN-së të origjinës sonë me amplifikimin e drejtuar PCR të atyre gjeneve A. atra që u sekuencuan (Fig. 3).Në mënyrë të ngjashme, duke pasur parasysh se gjenomi mitokondrial i A. atra është i disponueshëm në bazat e të dhënave publike, mund të gjejmë prova për praninë e fragmenteve të ccfADN-së mitokondriale në hemolimfën e A. atra.Prania e fragmenteve të ADN-së mitokondriale u konfirmua me amplifikimin PCR (Fig. 3).
Gjene të ndryshme mitokondriale ishin të pranishme në hemolimfën e A. atra (pika të kuqe – numri i gjendjes: SRX5705969) dhe M. platensis (pika blu – numri i gjendjes: SRX5705968) të përforcuar me PCR.Figura e përshtatur nga Breton et al., 2011 B Përforcimi i supernatantit të hemolimfës nga A. atra E ruajtur në letër FTA.Përdorni një punch 3 mm për ta shtuar direkt në tubin PCR që përmban përzierjen PCR.
Duke pasur parasysh përmbajtjen e bollshme mikrobike në ujin e detit, fillimisht u fokusuam në karakterizimin e sekuencave të ADN-së mikrobike në hemolimfë.Për ta bërë këtë, ne përdorim dy strategji të ndryshme.Strategjia e parë përdori Kraken2, një program klasifikimi i sekuencave të bazuara në algoritëm që mund të identifikojë sekuencat mikrobike me një saktësi të krahasueshme me BLAST dhe mjete të tjera [28].Më shumë se 6719 lexime u përcaktuan se ishin me origjinë bakteriale, ndërsa 124 dhe 64 ishin nga arkea dhe viruse, përkatësisht (Fig. 4).Fragmentet më të bollshme të ADN-së bakteriale ishin Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) dhe Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Kjo shpërndarje është në përputhje me studimet e mëparshme të mikrobiomës së midhjes blu detare [39, 40].Gamaproteobakteret ishin klasa kryesore e Proteobaktereve (44%), duke përfshirë shumë Vibrionale (Fig. 4b).Metoda ddPCR konfirmoi praninë e fragmenteve të ADN-së Vibrio në ccfDNA të hemolimfës A. atra (Fig. 4c) [41].Për të marrë më shumë informacion në lidhje me origjinën bakteriale të ccfDNA, u mor një qasje shtesë (Fig. S2, Informacion shtesë). Në këtë rast, leximet që mbivendosen u grumbulluan si lexime me fund të çiftuar dhe u klasifikuan si me origjinë vetjake (bivalve) ose jo-vetë duke përdorur BLASTN dhe një vlerë e 1e−3 dhe një ndërprerje me homologji >90%. Në këtë rast, leximet që mbivendosen u grumbulluan si lexime me fund të çiftuar dhe u klasifikuan si me origjinë vetjake (bivalve) ose jo-vetë duke përdorur BLASTN dhe një vlerë e 1e−3 dhe një ndërprerje me homologji >90%. Во этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными концами и были классифицированы како собственные (двустворчатые моллюски) ose чужие по происхольждени отсечения с омологией> 90%. Në këtë rast, leximet e mbivendosura u mblodhën si lexime me fund të çiftuar dhe u klasifikuan si origjinale (dyvalve) ose jo origjinale duke përdorur BLASTN dhe vlerën e 1e-3 dhe ndërprerje me homologji >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和歄怺怺怐皐e 倢%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 使 1-3 bla和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Në të njëjtën kohë, ju mund të bëni një gjë të tillë. Roga Gomologi> 90%. Në këtë rast, leximet e mbivendosura u mblodhën si lexime me fund të çiftuar dhe u klasifikuan si të veta (bivalve) ose jo origjinale duke përdorur vlerat e BLASTN dhe 1e-3 dhe një prag homologjie >90%.Meqenëse gjenomi A. atra nuk është renditur ende, ne përdorëm strategjinë e montimit de novo të asamblerit MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Gjithsej 147,188 kontigs janë identifikuar si të varur (bivalvë) të origjinës.Këto kontigjente më pas shpërthyen me e-vlera prej 1e-10 duke përdorur BLASTN dhe BLASTX.Kjo strategji na lejoi të identifikonim 482 fragmente jo bivalve të pranishme në A. atra ccfDNA.Më shumë se gjysma (57%) e këtyre fragmenteve të ADN-së janë marrë nga bakteret, kryesisht nga simbionet e gushës, duke përfshirë simbionet sulfotrofike, dhe nga simbionet e gushës Solemya velum (Fig. 5).
Bollëk relativ në nivelin e tipit.B Diversiteti mikrobik i dy filave kryesore (Firmicutes dhe Proteobacteria).Amplifikimi përfaqësues i ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmente të gjenit 16S rRNA (blu) në tre hemolimfa atra.
Janë analizuar gjithsej 482 kontigjentë të mbledhur.Profili i përgjithshëm i shpërndarjes taksonomike të shënimeve të kontigëve metagjenomike (prokariotët dhe eukariotët).B Shpërndarja e detajuar e fragmenteve të ADN-së bakteriale të identifikuara nga BLASTN dhe BLASTX.
Analiza Kraken2 tregoi gjithashtu se ccfDNA e midhjes përmbante fragmente të ADN-së arkeale, duke përfshirë fragmente të ADN-së të Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) dhe Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Prania e fragmenteve të ADN-së që rrjedhin nga Euryarchaeota dhe Crenarchaeota, të gjetura më parë në komunitetin mikrobik të midhjeve kaliforniane, nuk duhet të jetë befasuese [42].Megjithëse Euryarchaeota shpesh shoqërohet me kushte ekstreme, tani njihet se si Euryarchaeota ashtu edhe Crenarcheota janë ndër prokariotët më të zakonshëm në mjedisin kriogjen detar [43, 44].Prania e mikroorganizmave metanogjenë në midhje nuk është befasuese, duke pasur parasysh raportet e fundit të rrjedhjeve të gjera të metanit nga rrjedhjet e poshtme në Rrafshnaltën Kerguelen [45] dhe prodhimin e mundshëm të metanit mikrobik të vëzhguar në brigjet e ishujve Kerguelen [46].
Vëmendja jonë më pas u zhvendos te leximet nga viruset e ADN-së.Sipas njohurive tona, ky është studimi i parë jashtë objektivit i përmbajtjes së virusit të midhjeve.Siç pritej, ne gjetëm fragmente të ADN-së të bakterofagëve (Caudovirales) (Fig. 6b).Sidoqoftë, ADN-ja virale më e zakonshme vjen nga një grup nukleocitovirusesh, i njohur gjithashtu si virusi i madh i ADN-së citoplazmike bërthamore (NCLDV), i cili ka gjenomin më të madh nga çdo virus.Brenda këtij grupi, shumica e sekuencave të ADN-së i përkasin familjeve Mimimidoviridae (58%) dhe Poxviridae (21%), bujtësit natyrorë të të cilëve përfshijnë vertebrorët dhe artropodët, ndërsa një pjesë e vogël e këtyre sekuencave të ADN-së i përkasin algave të njohura virologjike.Infekton algat eukariote detare.Sekuencat u morën gjithashtu nga virusi Pandora, virusi gjigant me madhësinë më të madhe të gjenomit nga çdo gjini e njohur virale.Është interesante se diapazoni i strehuesve që dihet se janë të infektuar me virusin, siç përcaktohet nga sekuenca e hemolimfës ccfDNA, ishte relativisht i madh (Figura S3, Informacion shtesë).Ai përfshin viruse që infektojnë insektet si Baculoviridae dhe Iridoviridae, si dhe viruse që infektojnë ameba, algat dhe vertebrorët.Ne gjetëm gjithashtu sekuenca që përputhen me gjenomën e Pithovirus sibericum.Pitoviruset (të njohur edhe si "viruset e zombit") u izoluan për herë të parë nga ngrica e përhershme 30,000 vjeçare në Siberi [47].Kështu, rezultatet tona janë në përputhje me raportet e mëparshme që tregojnë se jo të gjitha llojet moderne të këtyre viruseve janë zhdukur [48] dhe se këta viruse mund të jenë të pranishëm në ekosistemet detare të largëta subarktike.
Më në fund, ne testuam për të parë nëse mund të gjenim fragmente të ADN-së nga kafshë të tjera shumëqelizore.Një total prej 482 kontigësh të huaj u identifikuan nga BLASTN dhe BLASTX me bibliotekat nt, nr dhe RefSeq (gjenomike dhe proteina).Rezultatet tona tregojnë se midis fragmenteve të huaja të ccfDNA të kafshëve shumëqelizore mbizotëron ADN-ja e kockave kockore (Fig. 5).Janë gjetur edhe fragmente të ADN-së nga insektet dhe specie të tjera.Një pjesë relativisht e madhe e fragmenteve të ADN-së nuk është identifikuar, ndoshta për shkak të nënpërfaqësimit të një numri të madh të specieve detare në bazat e të dhënave gjenomike në krahasim me speciet tokësore [49].
Në punimin aktual, ne aplikojmë konceptin LB për midhjet, duke argumentuar se sekuenca e goditjeve të hemolimfës ccfDNA mund të sigurojë një pasqyrë të përbërjes së ekosistemeve bregdetare detare.Në veçanti, ne zbuluam se 1) hemolimfa e midhjes përmban përqendrime relativisht të larta (nivele mikrogram) të fragmenteve të ADN-së qarkulluese relativisht të mëdha (~ 1-5 kb);2) këto fragmente të ADN-së janë edhe të pavarura edhe jo të pavarura. 3) Ndër burimet e huaja të këtyre fragmenteve të ADN-së, kemi gjetur ADN bakteriale, arkeale dhe virale, si dhe ADN të kafshëve të tjera shumëqelizore;4) Akumulimi i këtyre fragmenteve të huaja ccfADN në hemolimfë ndodh me shpejtësi dhe kontribuon në aktivitetin e brendshëm filtrues të midhjeve.Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti i LB, i cili deri më tani është aplikuar kryesisht në fushën e biomjekësisë, kodon një burim të pasur, por të paeksploruar njohurish që mund të përdoret për të kuptuar më mirë ndërveprimin midis specieve sentinel dhe mjedisit të tyre.
Përveç primatëve, izolimi i ccfDNA është raportuar te gjitarët, duke përfshirë minjtë, qentë, macet dhe kuajt [50, 51, 52].Megjithatë, sipas njohurive tona, studimi ynë është i pari që raporton zbulimin dhe renditjen e ccfDNA në speciet detare me një sistem qarkullimi të hapur.Kjo veçori anatomike dhe aftësia filtruese e midhjeve, të paktën pjesërisht, mund të shpjegojë karakteristikat e ndryshme të madhësisë së fragmenteve të ADN-së në qarkullim në krahasim me speciet e tjera.Tek njerëzit, shumica e fragmenteve të ADN-së që qarkullojnë në gjak janë fragmente të vogla që variojnë në madhësi nga 150 deri në 200 bp.me një kulm maksimal prej 167 bp [34, 53].Një pjesë e vogël por e rëndësishme e fragmenteve të ADN-së janë me madhësi ndërmjet 300 dhe 500 bp dhe rreth 5% janë më të gjata se 900 bp.[54].Arsyeja për këtë shpërndarje të madhësisë është se burimi kryesor i ccfDNA në plazmë ndodh si rezultat i vdekjes së qelizave, ose për shkak të vdekjes së qelizave ose për shkak të nekrozës së qelizave hematopoietike qarkulluese në individë të shëndetshëm ose për shkak të apoptozës së qelizave tumorale në pacientët me kancer (i njohur si ADN-ja e tumorit qarkullues)., ctDNA).Shpërndarja e madhësisë së ccfDNA të hemolimfës që gjetëm në midhje varionte nga 1000 në 5000 bp, duke sugjeruar që ccfDNA e midhjes ka një origjinë të ndryshme.Kjo është një hipotezë logjike, pasi midhjet kanë një sistem vaskular gjysmë të hapur dhe jetojnë në mjedise ujore detare që përmbajnë përqendrime të larta të ADN-së gjenomike mikrobike.Në fakt, eksperimentet tona laboratorike duke përdorur ADN ekzogjene kanë treguar se midhjet grumbullojnë fragmente të ADN-së në ujin e detit, të paktën pas disa orësh ato degradohen pas marrjes qelizore dhe/ose lirohen dhe/ose ruhen në organizata të ndryshme.Duke pasur parasysh rrallësinë e qelizave (si prokariote ashtu edhe eukariote), përdorimi i ndarjeve intravalvulare do të zvogëlojë sasinë e ccfDNA-së nga burime vetjake, si dhe nga burime të huaja.Duke marrë parasysh rëndësinë e imunitetit të lindur bivalv dhe numrin e madh të fagociteve qarkulluese, ne supozuam më tej se edhe ccfDNA e huaj pasurohet në fagocite qarkulluese që grumbullojnë ADN të huaj pas gëlltitjes së mikroorganizmave dhe/ose mbetjeve qelizore.Të marra së bashku, rezultatet tona tregojnë se ccfDNA e hemolimfës bivalve është një depo unike e informacionit molekular dhe përforcon statusin e tyre si një specie roje.
Të dhënat tona tregojnë se sekuenca dhe analiza e fragmenteve ccfDNA të hemolimfës me prejardhje bakteriale mund të sigurojë informacione kyçe rreth florës bakteriale pritëse dhe baktereve të pranishme në ekosistemin detar përreth.Teknikat e sekuencës së të shtënave kanë zbuluar sekuenca të baktereve komenzale A. atra gushë që do të kishin humbur nëse do të ishin përdorur metodat konvencionale të identifikimit të 16S rRNA, pjesërisht për shkak të një paragjykimi të bibliotekës së referencës.Në fakt, përdorimi ynë i të dhënave LB të mbledhura nga M. platensis në të njëjtën shtresë midhjesh në Kerguelen tregoi se përbërja e simbioneve bakteriale të lidhura me gushën ishte e njëjtë për të dy llojet e midhjeve (Fig. S4, Informacion shtesë).Kjo ngjashmëri e dy midhjeve gjenetikisht të ndryshme mund të pasqyrojë përbërjen e komuniteteve bakteriale në depozitat e ftohta, sulfurore dhe vullkanike të Kerguelenit [55, 56, 57, 58].Nivele më të larta të mikroorganizmave reduktues të squfurit janë përshkruar mirë gjatë korrjes së midhjeve nga zonat bregdetare të bioturbuara [59], të tilla si brigjet e Port-au-France.Një mundësi tjetër është që flora komenzale e midhjes mund të ndikohet nga transmetimi horizontal [60, 61].Nevojiten më shumë kërkime për të përcaktuar korrelacionin midis mjedisit detar, sipërfaqes së detit dhe përbërjes së baktereve simbiotike në midhje.Këto studime janë aktualisht në vazhdim.
Gjatësia dhe përqendrimi i ccfDNA i hemolimfës, lehtësia e pastrimit të saj dhe cilësia e lartë për të lejuar renditjen e shpejtë të armëve të gjahut janë disa nga avantazhet e shumta të përdorimit të ccfDNA të midhjes për të vlerësuar biodiversitetin në ekosistemet bregdetare detare.Kjo qasje është veçanërisht efektive për karakterizimin e komuniteteve virale (virome) në një ekosistem të caktuar [62, 63].Ndryshe nga bakteret, arkeat dhe eukariotët, gjenomet virale nuk përmbajnë gjene të ruajtura filogjenetikisht si sekuencat 16S.Rezultatet tona tregojnë se biopsi të lëngshme nga specie treguese si midhjet mund të përdoren për të identifikuar një numër relativisht të madh të fragmenteve të virusit ccfDNA të njohura për të infektuar hostet që zakonisht banojnë në ekosistemet detare bregdetare.Këtu përfshihen viruset që dihet se infektojnë protozoarët, artropodët, insektet, bimët dhe viruset bakteriale (p.sh. bakterofagët).Një shpërndarje e ngjashme u gjet kur ekzaminuam viromën e hemolimfës ccfDNA të midhjeve blu (M. platensis) të mbledhura në të njëjtën shtresë midhjesh në Kerguelen (Tabela S2, Informacion Shtesë).Sekuenca me armë gjahu e ccfDNA është me të vërtetë një qasje e re që po fiton vrull në studimin e viromes së njerëzve ose specieve të tjera [21, 37, 64].Kjo qasje është veçanërisht e dobishme për studimin e viruseve të ADN-së me dy zinxhirë, pasi asnjë gjen i vetëm nuk ruhet midis të gjithë viruseve të ADN-së me dy zinxhirë, që përfaqëson klasën më të ndryshme dhe më të gjerë të viruseve në Baltimore [65].Megjithëse shumica e këtyre viruseve mbeten të paklasifikuara dhe mund të përfshijnë viruse nga një pjesë krejtësisht e panjohur e botës virale [66], ne zbuluam se viromet dhe diapazoni i bujtësit të midhjeve A. atra dhe M. platensis bien midis dy specieve.në mënyrë të ngjashme (shih figurën S3, informacion shtesë).Kjo ngjashmëri nuk është befasuese, pasi mund të pasqyrojë mungesën e selektivitetit në marrjen e ADN-së të pranishme në mjedis.Studimet e ardhshme duke përdorur ARN të pastruar janë aktualisht të nevojshme për të karakterizuar viromën e ARN-së.
Në studimin tonë, ne përdorëm një tubacion shumë rigoroz të përshtatur nga puna e Kowarskit dhe kolegëve [37], të cilët përdorën një fshirje me dy hapa të leximeve dhe lidhjeve të bashkuara para dhe pas montimit të ccfDNA-së vendase, duke rezultuar në një përqindje të lartë të leximeve të pa hartë.Prandaj, nuk mund të përjashtojmë që disa nga këto lexime të paharta mund të kenë ende origjinën e tyre, kryesisht për shkak se ne nuk kemi një gjenom referues për këtë specie midhjesh.Ne e përdorëm gjithashtu këtë tubacion sepse ishim të shqetësuar për kimerat midis leximeve vetjake dhe jovetve dhe gjatësive të leximit të krijuara nga Illumina MiSeq PE75.Një arsye tjetër për shumicën e leximeve të paeksploruara është se shumë nga mikrobet detare, veçanërisht në zona të largëta si Kerguelen, nuk janë shënuar.Ne përdorëm Illumina MiSeq PE75, duke supozuar gjatësi të fragmenteve ccfDNA të ngjashme me ccfDNA njerëzore.Për studimet e ardhshme, duke pasur parasysh rezultatet tona që tregojnë se ccfDNA e hemolimfës ka lexime më të gjata se njerëzit dhe/ose gjitarët, ne rekomandojmë përdorimin e një platforme renditjeje më të përshtatshme për fragmente më të gjata ccfDNA.Kjo praktikë do ta bëjë shumë më të lehtë identifikimin e më shumë indikacioneve për analiza më të thella.Marrja e sekuencës së plotë të gjenomit bërthamor A. atra aktualisht të padisponueshme do të lehtësonte gjithashtu shumë diskriminimin e ccfDNA nga burimet vetjake dhe jo-vetë.Duke qenë se kërkimi ynë është fokusuar në mundësinë e aplikimit të konceptit të biopsisë së lëngshme tek midhjet, shpresojmë që me përdorimin e këtij koncepti në kërkimet e ardhshme, do të zhvillohen mjete dhe tubacione të reja për të rritur potencialin e kësaj metode për të studiuar diversitetin mikrobik të midhjeve.ekosistemi detar.
Si një biomarker klinik jo-invaziv, nivelet e ngritura të plazmës njerëzore të ccfDNA shoqërohen me sëmundje të ndryshme, dëmtime të indeve dhe kushte stresi [67,68,69].Kjo rritje shoqërohet me çlirimin e fragmenteve të ADN-së të origjinës së saj pas dëmtimit të indeve.Ne e trajtuam këtë çështje duke përdorur stresin akut të nxehtësisë, në të cilin midhjet u ekspozuan shkurtimisht në një temperaturë prej 30 °C.Ne e kryem këtë analizë në tre lloje të ndryshme midhjesh në tre eksperimente të pavarura.Megjithatë, ne nuk gjetëm ndonjë ndryshim në nivelet e ccfDNA pas stresit akut të nxehtësisë (shih Figurën S5, informacion shtesë).Ky zbulim mund të shpjegojë, të paktën pjesërisht, faktin se midhjet kanë një sistem qarkullues gjysmë të hapur dhe grumbullojnë sasi të mëdha të ADN-së së huaj për shkak të aktivitetit të tyre të lartë filtrues.Nga ana tjetër, midhjet, si shumë jovertebrorë, mund të jenë më rezistente ndaj dëmtimit të indeve të shkaktuara nga stresi, duke kufizuar kështu lirimin e ccfDNA në hemolimfën e tyre [70, 71].
Deri më sot, analiza e ADN-së e biodiversitetit në ekosistemet ujore është fokusuar kryesisht në metabarkodimin e ADN-së mjedisore (eDNA).Megjithatë, kjo metodë zakonisht është e kufizuar në analizën e biodiversitetit kur përdoren abetare.Përdorimi i sekuencës së armëve të gjahut shmang kufizimet e PCR dhe përzgjedhjen e njëanshme të grupeve të primerëve.Kështu, në një farë kuptimi, metoda jonë është më afër metodës së përdorur së fundmi me metodën e sekuencës së eDNA Shotgun me performancë të lartë, e cila është në gjendje të rendit drejtpërdrejt ADN-në e fragmentuar dhe të analizojë pothuajse të gjithë organizmat [72, 73].Megjithatë, ka një sërë çështjesh themelore që e dallojnë LB-në nga metodat standarde eDNA.Sigurisht, ndryshimi kryesor midis eDNA dhe LB është përdorimi i pritësve të filtrit natyror.Është raportuar përdorimi i specieve detare si sfungjerët dhe bivalvat (Dresseina spp.) si një filtër natyror për studimin e ADN-së [74, 75].Megjithatë, studimi i Dreissena përdori biopsi të indeve nga të cilat u nxorr ADN.Analiza e ccfDNA nga LB nuk kërkon biopsi të indeve, pajisje të specializuara dhe ndonjëherë të shtrenjta dhe logjistikë të lidhur me eDNA ose biopsi të indeve.Në fakt, kohët e fundit kemi raportuar se ccfDNA nga LB mund të ruhet dhe analizohet me mbështetjen e FTA pa mbajtur një zinxhir të ftohtë, gjë që është një sfidë e madhe për kërkimin në zona të largëta [76].Nxjerrja e ccfDNA nga biopsi të lëngshme është gjithashtu e thjeshtë dhe siguron ADN me cilësi të lartë për sekuencën e armëve gjahu dhe analizën PCR.Ky është një avantazh i madh duke pasur parasysh disa nga kufizimet teknike që lidhen me analizën eDNA [77].Thjeshtësia dhe kostoja e ulët e metodës së kampionimit është gjithashtu veçanërisht e përshtatshme për programet e monitorimit afatgjatë.Përveç aftësisë së tyre të lartë filtruese, një tjetër veçori e njohur e bivalvëve është përbërja kimike e mukopolisakaridit të mukusit të tyre, e cila promovon thithjen e viruseve [78, 79].Kjo i bën bivalvat një filtër natyror ideal për karakterizimin e biodiversitetit dhe ndikimin e ndryshimeve klimatike në një ekosistem të caktuar ujor.Megjithëse prania e fragmenteve të ADN-së me prejardhje nga bujtësi mund të shihet si një kufizim i metodës në krahasim me eDNA, kostoja e lidhur me të pasurit e një ccfDNA të tillë vendase në krahasim me eDNA është njëkohësisht e kuptueshme për sasinë e madhe të informacionit të disponueshëm për studimet shëndetësore.pritës i kompensuar.Kjo përfshin praninë e sekuencave virale të integruara në gjenomin e bujtësit.Kjo është veçanërisht e rëndësishme për midhjet, duke pasur parasysh praninë e retroviruseve leuçemike të transmetuara horizontalisht në bivalvë [80, 81].Një avantazh tjetër i LB ndaj eDNA është se ai shfrytëzon aktivitetin fagocitar të qelizave qarkulluese të gjakut në hemolimfë, e cila gëlltit mikroorganizmat (dhe gjenomet e tyre).Fagocitoza është funksioni kryesor i qelizave të gjakut në bivalvë [82].Së fundi, metoda përfiton nga kapaciteti i lartë filtrues i midhjeve (mesatarisht 1,5 l/h ujë deti) dhe qarkullimi dyditor, të cilat rrisin përzierjen e shtresave të ndryshme të ujit të detit, duke lejuar kapjen e eADN-së heterologe.[83, 84].Kështu, analiza ccfDNA e midhjeve është një rrugë interesante duke pasur parasysh ndikimet ushqyese, ekonomike dhe mjedisore të midhjeve.Ngjashëm me analizën e LB të mbledhur nga njerëzit, kjo metodë hap gjithashtu mundësinë e matjes së ndryshimeve gjenetike dhe epigjenetike në ADN-në e bujtësit në përgjigje të substancave ekzogjene.Për shembull, teknologjitë e sekuencës së gjeneratës së tretë mund të parashikohen për të kryer analizën e metilimit të gjenomit në ccfDNA vendase duke përdorur sekuencën e nanoporeve.Ky proces duhet të lehtësohet nga fakti se gjatësia e fragmenteve të ccfADN-së së midhjes është në mënyrë ideale e përputhshme me platformat e sekuencave të lexuara gjatë që lejojnë analizën e metilimit të ADN-së në të gjithë gjenomin nga një sekuencë e vetme, pa nevojën për transformime kimike.85,86] Kjo është një mundësi interesante, pasi është treguar se shumë modele të metilimit të ADN-së reflektojnë një reagim mjedisor ndaj modeleve të metilimit të mjedisit.Prandaj, ai mund të sigurojë një pasqyrë të vlefshme në mekanizmat themelorë që rregullojnë reagimin pas ekspozimit ndaj ndryshimeve klimatike ose ndotësve [87].Megjithatë, përdorimi i LB nuk është pa kufizime.Eshtë e panevojshme të thuhet se kjo kërkon praninë e specieve tregues në ekosistem.Siç u përmend më lart, përdorimi i LB për të vlerësuar biodiversitetin e një ekosistemi të caktuar kërkon gjithashtu një tubacion rigoroz të bioinformatikës që merr parasysh praninë e fragmenteve të ADN-së nga burimi.Një problem tjetër madhor është disponueshmëria e gjenomave referuese për speciet detare.Shpresohet që iniciativa të tilla si Projekti i Gjenomave të Gjitarëve Detarë dhe projekti Fish10k i themeluar së fundmi [88] do të lehtësojnë një analizë të tillë në të ardhmen.Zbatimi i konceptit LB për organizmat detarë që ushqehen me filtra është gjithashtu i pajtueshëm me përparimet më të fundit në teknologjinë e sekuencës, duke e bërë atë të përshtatshëm për zhvillimin e biomarkerëve shumë-ohm për të ofruar informacion të rëndësishëm për shëndetin e habitateve detare në përgjigje të stresit mjedisor.
Të dhënat e sekuencës së gjenomit janë depozituar në Arkivin e Leximit të Sekuencës NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 nën Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ndikimi i ndryshimit të klimës në jetën detare dhe ekosistemet.Biologjia Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Merrni parasysh ndikimet e kombinuara të ndryshimeve klimatike dhe faktorëve të tjerë stresues lokalë në mjedisin detar.mjedisi i përgjithshëm shkencor.2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Shkenca e 1 Marsit.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleranca e reduktuar ndaj nxehtësisë në kushte të përsëritura të stresit të nxehtësisë shpjegon vdekshmërinë e lartë verore të midhjeve blu.Raport shkencor 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, etj.Ndryshimet e fundit në frekuencën, shkaqet dhe shtrirjen e vdekjeve të kafshëve.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, etj.Patogjenë të shumtë jo specifikë për speciet mund të kenë shkaktuar vdekshmëri masive të Pinna nobilis.Jeta.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Ndikimi i mundshëm i ndryshimit të klimës në sëmundjet zoonotike të Arktikut.Int J Shëndeti Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Midhjet blu (Mytilus edulis spp.) si organizma sinjalizues në monitorimin e ndotjes bregdetare: një përmbledhje.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrimi i biopsisë së lëngshme në trajtimin e kancerit.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maturimi i biopsisë së lëngshme: Lejon ADN-në e tumorit të qarkullojë.Nat Rev Kanceri.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acidet nukleike në plazmën e njeriut.Procesverbalet e mbledhjeve të filialeve të Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Një rol i ri për ADN-në pa qeliza si një shënues molekular për trajtimin e kancerit.Kuantifikimi i analizës biomolare.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia e lëngshme hyn në klinikë – çështjet e zbatimit dhe sfidat e ardhshme.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dhe të tjerë.ADN-ja e fetusit është e pranishme në plazmën dhe serumin e nënës.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studimi i rrjedhës së shtatzënisë dhe komplikimeve të saj duke përdorur ARN ekstraqelizore qarkulluese në gjakun e grave gjatë shtatzënisë.Dopediatri.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsia e lëngshme: ADN-ja pa qeliza donatore përdoret për të zbuluar lezionet alogjene në një transplant të veshkave.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacione në diagnostikimin para lindjes: sekuenca e gjenomit të plazmës së nënës.Anna MD.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, etj.Zbulimi i shpejtë i patogjenit me sekuencën metagjenomike të gjeneratës së ardhshme të lëngjeve trupore të infektuara.Nat Mjekësi.2021; 27:115-24.