Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta paraqesim faqen pa stile dhe JavaScript.
Biopsia e lëngshme (LB) është një koncept që po fiton me shpejtësi popullaritet në fushën biomjekësore. Koncepti bazohet kryesisht në zbulimin e fragmenteve të ADN-së jashtëqelizore që qarkullon (ccfDNA), të cilat lirohen kryesisht si fragmente të vogla pas vdekjes së qelizave në inde të ndryshme. Një pjesë e vogël e këtyre fragmenteve burojnë nga inde ose organizma të huaj (të huaj). Në punën aktuale, ne e kemi aplikuar këtë koncept te midhjet, një specie roje e njohur për kapacitetin e tyre të lartë të filtrimit të ujit të detit. Ne përdorim aftësinë e midhjeve për të vepruar si filtra natyrorë për të kapur fragmente të ADN-së mjedisore nga një sërë burimesh për të ofruar informacion në lidhje me biodiversitetin e ekosistemeve bregdetare detare. Rezultatet tona tregojnë se hemolimfa e midhjeve përmban fragmente ADN-je që ndryshojnë shumë në madhësi, nga 1 deri në 5 kb. Sekuencimi me armë zjarri tregoi se një numër i madh i fragmenteve të ADN-së janë me origjinë mikrobike të huaj. Midis tyre, gjetëm fragmente ADN-je nga bakteret, arkeat dhe viruset, duke përfshirë viruset e njohura për të infektuar një sërë strehuesish që gjenden zakonisht në ekosistemet bregdetare detare. Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti i LB-së i aplikuar te midhjet përfaqëson një burim të pasur, por ende të pashkelur, njohurish rreth diversitetit mikrobik në ekosistemet bregdetare detare.
Ndikimi i ndryshimeve klimatike (NK) në biodiversitetin e ekosistemeve detare është një fushë kërkimore në rritje të shpejtë. Ngrohja globale jo vetëm që shkakton strese të rëndësishme fiziologjike, por gjithashtu shtyn kufijtë evolucionarë të stabilitetit termik të organizmave detarë, duke ndikuar në habitatin e një numri speciesh, duke i shtyrë ata të kërkojnë kushte më të favorshme [1, 2]. Përveç ndikimit në biodiversitetin e metazoanëve, NK prish ekuilibrin delikat të ndërveprimeve mikpritës-mikrob. Kjo disbakteriozë mikrobike përbën një kërcënim serioz për ekosistemet detare pasi i bën organizmat detarë më të ndjeshëm ndaj patogjenëve infektivë [3, 4]. Besohet se SS luajnë një rol të rëndësishëm në vdekjet masive, gjë që është një problem serioz për menaxhimin e ekosistemeve globale detare [5, 6]. Kjo është një çështje e rëndësishme duke pasur parasysh ndikimet ekonomike, ekologjike dhe ushqyese të shumë specieve detare. Kjo është veçanërisht e vërtetë për bivalvët që jetojnë në rajonet polare, ku efektet e NK janë më të menjëhershme dhe të rënda [6, 7]. Në fakt, bivalvët si Mytilus spp. përdoren gjerësisht për të monitoruar efektet e NK në ekosistemet detare. Nuk është çudi që një numër relativisht i madh biomarkerash janë zhvilluar për të monitoruar shëndetin e tyre, shpesh duke përdorur një qasje me dy nivele që përfshin biomarkera funksionalë bazuar në aktivitetin enzimatik ose funksionet qelizore siç janë qëndrueshmëria e qelizave dhe aktiviteti fagocitik [8]. Këto metoda përfshijnë gjithashtu matjen e përqendrimit të treguesve specifikë të presionit që grumbullohen në indet e buta pas thithjes së sasive të mëdha të ujit të detit. Megjithatë, kapaciteti i lartë i filtrimit dhe sistemi gjysmë i hapur i qarkullimit të gjakut të bivalvave ofrojnë një mundësi për të zhvilluar biomarkera të rinj hemolimfë duke përdorur konceptin e biopsisë së lëngshme (LB), një qasje e thjeshtë dhe minimalisht invazive për menaxhimin e pacientëve. Edhe pse disa lloje molekulash qarkulluese mund të gjenden në LB njerëzore, ky koncept bazohet kryesisht në analizën e sekuencimit të ADN-së të fragmenteve të ADN-së jashtëqelizore (ccfDNA) që qarkullojnë në plazmë. Në fakt, prania e ADN-së që qarkullon në plazmën njerëzore është e njohur që nga mesi i shekullit të 20-të [11], por vetëm vitet e fundit ardhja e metodave të sekuencimit me rendiment të lartë ka çuar në diagnozën klinike bazuar në ccfDNA. Prania e këtyre fragmenteve të ADN-së në qarkullim është pjesërisht për shkak të çlirimit pasiv të ADN-së gjenomike (bërthamore dhe mitokondriale) pas vdekjes qelizore. Tek individët e shëndetshëm, përqendrimi i ccfADN-së është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet 5-10 herë tek pacientët që vuajnë nga patologji të ndryshme ose i nënshtrohen stresit, duke rezultuar në dëmtim të indeve. Tek individët e shëndetshëm, përqendrimi i ccfADN-së është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet 5-10 herë tek pacientët që vuajnë nga patologji të ndryshme ose i nënshtrohen stresit, duke rezultuar në dëmtim të indeve. Во здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), por mund të jetë në 5–10 herë në больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводаврщденему. Tek njerëzit e shëndetshëm, përqendrimi i cccADN-së është normalisht i ulët (<10 ng/mL), por mund të rritet 5-10 herë tek pacientët me patologji të ndryshme ose nën stres që çon në dëmtim të indeve.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。损伤Përqendrimet ccfDNA janë shumë të ulëta (<10 ng/ml) në njerëz të mirë, por mund të jenë të pandryshuara në 5-10 herë në pacientov me patogjene të ndryshme ose stresi, të cilat mund të ndiqen nga lakmia. Përqendrimet e ccfADN-së janë zakonisht të ulëta (<10 ng/ml) te individët e shëndetshëm, por mund të rriten 5-10 herë te pacientët me patologji të ndryshme ose stres, duke rezultuar në dëmtim të indeve.Madhësia e fragmenteve të ccfADN-së ndryshon shumë, por zakonisht varion nga 150 deri në 200 bp. [12]. Analiza e ccfADN-së së vetë-nxjerur, d.m.th., ccfADN-së nga qelizat pritëse normale ose të transformuara, mund të përdoret për të zbuluar ndryshimet gjenetike dhe epigjenetike të pranishme në gjenomën bërthamore dhe/ose mitokondriale, duke ndihmuar kështu klinicistët të zgjedhin terapi specifike molekulare [13]. Megjithatë, ccfADN-ja mund të merret nga burime të huaja si ccfADN-ja nga qelizat fetale gjatë shtatzënisë ose nga organet e transplantuara [14,15,16,17]. ccfADN-ja është gjithashtu një burim i rëndësishëm informacioni për zbulimin e pranisë së acideve nukleike të një agjenti infektiv (të huaj), i cili lejon zbulimin jo-invaziv të infeksioneve të përhapura që nuk identifikohen nga kulturat e gjakut, duke shmangur biopsinë invazive të indeve të infektuara [18]. Studimet e fundit kanë treguar me të vërtetë se gjaku i njeriut përmban një burim të pasur informacioni që mund të përdoret për të identifikuar patogjenët viralë dhe bakterialë, dhe se rreth 1% e ccfADN-së që gjendet në plazmën njerëzore është me origjinë të huaj [19]. Këto studime tregojnë se biodiversiteti i mikrobiomës qarkulluese të një organizmi mund të vlerësohet duke përdorur analizën e ccfDNA-së. Megjithatë, deri vonë, ky koncept është përdorur ekskluzivisht tek njerëzit dhe, në një masë më të vogël, tek vertebrorët e tjerë [20, 21].
Në këtë punim, ne përdorim potencialin LB për të analizuar ccfADN-në e Aulacomya atra, një specie jugore që gjendet zakonisht në Ishujt Kerguelen subantarktik, një grup ishujsh në majë të një pllaje të madhe që u formua 35 milion vjet më parë. Shpërthim vullkanik. Duke përdorur një sistem eksperimental in vitro, zbuluam se fragmentet e ADN-së në ujin e detit kapen shpejt nga midhjet dhe hyjnë në ndarjen e hemolimfës. Sekuencimi me armë zjarri ka treguar se hemolimfa ccfADN e midhjes përmban fragmente ADN-je me origjinë të vetin dhe jo-vetjake, duke përfshirë bakteret simbiotike dhe fragmente ADN-je nga bioma tipike të ekosistemeve bregdetare detare vullkanike të ftohta. Hemolimfa ccfADN gjithashtu përmban sekuenca virale të nxjerra nga viruse me diapazon të ndryshëm pritësish. Ne gjithashtu gjetëm fragmente ADN-je nga kafshë shumëqelizore si peshqit kockorë, anemonat e detit, algat dhe insektet. Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti LB mund të zbatohet me sukses tek jovertebrorët detarë për të gjeneruar një repertor të pasur gjenomik në ekosistemet detare.
Të rriturit (55-70 mm të gjatë) Mytilus platensis (M. platensis) dhe Aulacomya atra (A. atra) u mblodhën nga brigjet shkëmbore intertidale të Port-au-France (049°21.235 J, 070°13.490 E). Ishujt Kerguelen në dhjetor 2018. Midhje të tjera blu të rritura (Mytilus spp.) u morën nga një furnizues komercial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dhe u vendosën në një rezervuar të ajrosur me temperaturë të kontrolluar (4°C) që përmbante 10-20 L shëllirë artificiale 32‰. (kripë deti artificiale Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SHBA). Për secilin eksperiment, u matën gjatësia dhe pesha e guaskave individuale.
Një protokoll falas me qasje të hapur për këtë program është i disponueshëm në internet (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Shkurtimisht, hemolimfa LB u mblodh nga muskujt abduktorë siç përshkruhet [22]. Hemolimfa u sqarua me anë të centrifugimit në 1200×g për 3 minuta, supernatanti u ngri (-20°C) deri në përdorim. Për izolimin dhe pastrimin e cfADN-së, mostrat (1.5-2.0 ml) u shkrinë dhe u përpunuan duke përdorur kitin NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sipas udhëzimeve të prodhuesit. ccfADN-ja u ruajt në -80°C deri në analiza të mëtejshme. Në disa eksperimente, ccfADN-ja u izolua dhe u pastrua duke përdorur Kitin e Hetuesit të ADN-së QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). ADN-ja e pastruar u përcaktua sasiore duke përdorur një analizë standarde PicoGreen. Shpërndarja e fragmenteve të ccfADN-së së izoluar u analizua me anë të elektroforezës kapilare duke përdorur një bioanalizues Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) duke përdorur një Kit ADN-je me Ndjeshmëri të Lartë. Analiza u krye duke përdorur 1 µl të mostrës së ccfADN-së sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Për sekuencimin e fragmenteve të hemolimfës ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) përgatiti biblioteka shotgun duke përdorur kitin Illumina DNA Mix të kitit Illumina MiSeq PE75. U përdor një përshtatës standard (BioO). Skedarët e të dhënave të papërpunuara janë të disponueshëm nga Arkivi i Leximit të Sekuencave NCBI (SRR8924808 dhe SRR8924809). Cilësia bazë e leximit u vlerësua duke përdorur FastQC [23]. Trimmomatic [24] është përdorur për prerjen e përshtatësve dhe leximeve me cilësi të dobët. Leximet shotgun me skaje të çiftëzuara u bashkuan FLASH në lexime më të gjata të vetme me një mbivendosje minimale prej 20 bp për të shmangur mospërputhjet [25]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur një bazë të dhënash të Taksonomisë NCBI të dyvalvulave (vlera e < 1e-3 dhe 90% homologji), dhe maskimi i sekuencave me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26]. Leximet e bashkuara u shënuan me BLASTN duke përdorur një bazë të dhënash të Taksonomisë NCBI të dyvalvulave (vlera e < 1e-3 dhe 90% homologji), dhe maskimi i sekuencave me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26]. BLASTN me ndihmën e BLASTN-së me të dhëna të thjeshta në NCBI (domethënia e < 1e-3 dhe 90% më e ulët), dhe mjeshtëri было выполнено со использованием DUST [26]. Leximet e grumbulluara u shënuan me BLASTN duke përdorur bazën e të dhënave të taksonomisë së dyvalvulave NCBI (vlera e < 1e-3 dhe 90% homologji), dhe maskimi i sekuencës me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN me ndihmën e BLASTN me përdorimin e taksonomicheskoy bazы dannыh dvuschatыh molluskov NCBI (domethënia e <1e-3 dhe 90% zvogëlueshmëria), dhe было выполнено со использованием DUST [26]. Leximet e grumbulluara u shënuan me BLASTN duke përdorur bazën e të dhënave taksonomike të dyvalvëve NCBI (vlera e <1e-3 dhe 90% homologji), dhe maskimi i sekuencës me kompleksitet të ulët u krye duke përdorur DUST [26].Leximet u ndanë në dy grupe: të lidhura me sekuencat bivalvore (këtu të quajtura vetëlexime) dhe të palidhura (jo-vetëlexime). Dy grupe u mblodhën veçmas duke përdorur MEGAHIT për të gjeneruar kontigje [27]. Ndërkohë, shpërndarja taksonomike e leximeve të mikrobiomës aliene u klasifikua duke përdorur Kraken2 [28] dhe u paraqit grafikisht nga një diagram rrethor Krona në Galaxy [29, 30]. Kmer-ët optimalë u përcaktuan të ishin kmers-59 nga eksperimentet tona paraprake. Vetëkontigjet u identifikuan më pas duke u përshtatur me BLASTN (baza e të dhënave NCBI e dyvalvulave, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji) për një shënim përfundimtar. Vetëkontigjet u identifikuan më pas duke u përshtatur me BLASTN (baza e të dhënave NCBI e dyvalvulave, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji) për një shënim përfundimtar. Për shkak të informacionit të përbashkët me BLASTN (baza e të dhënave të krijuara nga NCBI, kuptimi i <1e-10 dhe gjenologjia 60%) për vlerësimin e duhur. Vetë-kontigjet u identifikuan më pas duke u krahasuar me BLASTN (baza e të dhënave e NCBI bivalvore, vlera e <1e-10 dhe 60% homologji) për shënimin përfundimtar.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Mbyllja e të dhënave të përbashkëta për anonacionet e parakohshme me BLASTN (baza e të dhënave të NCBI për dyshkruesit e viteve, vlera e <1e-10 dhe 6%). Vetë-kontigjet u identifikuan më pas për shënimin përfundimtar duke u krahasuar me BLASTN (baza e të dhënave NCBI bivalvore, vlera e <1e-10 dhe 60% homologji). Paralelisht, kontigjet e grupeve jo-vetjake u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji). Paralelisht, kontigjet e grupeve jo-vetjake u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji). Paralelly chugerodnыe gruppovыe contigi bыly annotirovanы me pomoщью BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, kuptimi e <1e-10 dhe gjinia 60%). Paralelisht, kontigjet e grupeve të huaja u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave NT NCBI, vlera e <1e-10 dhe 60% homologji).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Paralelly contigi, nuk относящиеся к substvennoy gruppe, po annotirovanы me pomoщью BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, kuptimi e <1e-10 dhe gjinia 60%). Paralelisht, kontigjet jo-grupore u shënuan me BLASTN (baza e të dhënave nt NCBI, vlera e <1e-10 dhe 60% homologji). BLASTX u krye gjithashtu në kontigje jo-vetjake duke përdorur bazat e të dhënave NCBI të proteinave nr dhe RefSeq (vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji). BLASTX u krye gjithashtu në kontigje jo-vetjake duke përdorur bazat e të dhënave NCBI të proteinave nr dhe RefSeq (vlera e < 1e−10 dhe 60% homologji). BLASTX также был shpallur në kontigah jo vetëmostojatelnыh me përdorimin e bazës së të dhënave nr dhe RefSeq NCBI (domethënia e <1e-10 dhe omologia 60%). BLASTX u krye gjithashtu në kontigje jo-vetjake duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e < 1e-10 dhe 60% homologji).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ア 怼性性Ｚ 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ア 怼性性Ｚ 和60% BLASTX është i plotësuar në kontiga të pakta me përdorimin e bazës së të dhënave nr dhe RefSeq NCBI (domethënia e <1e-10 dhe gjinia 60%). BLASTX u krye gjithashtu në kontigje jo-vetjake duke përdorur bazat e të dhënave të proteinave nr dhe RefSeq NCBI (vlera e <1e-10 dhe 60% homologji).Pishinat BLASTN dhe BLASTX të kontigjeve jo-vetë-kontigjeve përfaqësojnë kontigjet përfundimtare (shih skedarin plotësues).
Prajmerët e përdorur për PCR janë renditur në Tabelën S1. Polimeraza e ADN-së Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) u përdor për të amplifikuar gjenet e synuara të ccfDNA-së. U përdorën kushtet e mëposhtme të reagimit: denaturimi në 95°C për 3 minuta, 95°C për 1 minutë, temperatura e caktuar e kalitjes për 1 minutë, zgjatimi në 72°C për 1 minutë, 35 cikle dhe së fundmi 72°C brenda 10 minutave. Produktet e PCR u ndanë me anë të elektroforezës në xhel agaroze (1.5%) që përmbanin SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) në 95 V.
Midhjet (Mytilus spp.) u aklimatizuan në 500 ml ujë deti të oksigjenuar (32 PSU) për 24 orë në 4°C. ADN-ja plazmidike që përmbante një futje që kodonte sekuencën e ADN-së c të galektinës-7 njerëzore (numri i hyrjes në NCBI L07769) u shtua në shishe në një përqendrim përfundimtar prej 190 μg/μl. Midhjet e inkubuara në të njëjtat kushte pa shtimin e ADN-së ishin kontrolli. Rezervuari i tretë i kontrollit përmbante ADN pa midhje. Për të monitoruar cilësinë e ADN-së në ujin e detit, mostrat e ujit të detit (20 μl; tre përsëritje) u morën nga secili rezervuar në kohën e treguar. Për gjurmueshmërinë e ADN-së plazmidike, midhjet LB u mblodhën në kohët e treguara dhe u analizuan me qPCR dhe ddPCR. Për shkak të përmbajtjes së lartë të kripës së ujit të detit, alikuotat u holluan në ujë me cilësi PCR (1:10) para të gjitha analizave PCR.
PCR dixhitale me pika (ddPCR) u krye duke përdorur protokollin BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Përdorni profilin e temperaturës për të përcaktuar temperaturën optimale (Tabela S1). Pikat u gjeneruan duke përdorur një gjenerator pikash QX200 (BioRad). ddPCR u krye si më poshtë: 95°C për 5 minuta, 50 cikle 95°C për 30 s dhe një temperaturë e caktuar kalitjeje për 1 minutë dhe 72°C për 30 s, 4°C për 5 minuta dhe 90°C brenda 5 minutave. Numri i pikave dhe reaksioneve pozitive (numri i kopjeve/µl) u mat duke përdorur një lexues pikash QX200 (BioRad). Mostrat me më pak se 10,000 pika u refuzuan. Kontrolli i modelit nuk u krye sa herë që u krye ddPCR.
qPCR u krye duke përdorur Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australi) dhe prajmerë specifikë LGALS7. Të gjitha PCR-të sasiore u kryen në 20 µl duke përdorur QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR filloi me një inkubacion 15-minutësh në 95°C, i ndjekur nga 40 cikle në 95°C për 10 sekonda dhe në 60°C për 60 sekonda me një mbledhje të dhënash. Kurbat e shkrirjes u gjeneruan duke përdorur matje të njëpasnjëshme në 95°C për 5 s, 65°C për 60 s dhe 97°C në fund të qPCR. Çdo qPCR u krye në trefish, përveç mostrave të kontrollit.
Meqenëse midhjet njihen për shkallën e tyre të lartë të filtrimit, ne së pari hetuam nëse ato mund të filtronin dhe të mbanin fragmente të ADN-së të pranishme në ujin e detit. Ne ishim gjithashtu të interesuar nëse këto fragmente grumbullohen në sistemin e tyre limfatik gjysmë të hapur. Ne e zgjidhëm këtë çështje eksperimentalisht duke gjurmuar fatin e fragmenteve të tretshme të ADN-së të shtuara në rezervuarët e midhjeve blu. Për të lehtësuar gjurmimin e fragmenteve të ADN-së, ne përdorëm ADN plazmid të huaj (jo të vetën) që përmban gjenin njerëzor galektinë-7. ddPCR gjurmon fragmente të ADN-së plazmid në ujin e detit dhe midhjet. Rezultatet tona tregojnë se nëse sasia e fragmenteve të ADN-së në ujin e detit mbeti relativisht konstante me kalimin e kohës (deri në 7 ditë) në mungesë të midhjeve, atëherë në prani të midhjeve ky nivel u zhduk pothuajse plotësisht brenda 8 orëve (Fig. 1a, b). Fragmentet e ADN-së ekzogjene u zbuluan lehtësisht brenda 15 minutave në lëngun intravalvular dhe hemolimfën (Fig. 1c). Këto fragmente mund të zbuloheshin ende deri në 4 orë pas ekspozimit. Ky aktivitet filtrimi në lidhje me fragmentet e ADN-së është i krahasueshëm me aktivitetin filtrues të baktereve dhe algave [31]. Këto rezultate sugjerojnë që midhjet mund të filtrojnë dhe grumbullojnë ADN-në e huaj në ndarjet e tyre të lëngjeve.
Përqendrimet relative të ADN-së plazmidike në ujin e detit në prani (A) ose mungesë (B) të midhjeve, të matura me ddPCR. Në A, rezultatet shprehen si përqindje, me kufijtë e kutive që përfaqësojnë percentilet e 75-të dhe të 25-të. Kurba logaritmike e përshtatur tregohet me të kuqe, dhe zona e hijezuar me gri përfaqëson intervalin e besimit 95%. Në B, vija e kuqe përfaqëson mesataren dhe vija blu përfaqëson intervalin e besimit 95% për përqendrimin. C Grumbullimi i ADN-së plazmidike në hemolimfën dhe lëngun valvular të midhjeve në kohë të ndryshme pas shtimit të ADN-së plazmidike. Rezultatet paraqiten si kopje absolute të zbuluara/mL (±SE).
Më pas, ne hetuam origjinën e ccfADN-së në midhjet e mbledhura nga shtretërit e midhjeve në Ishujt Kerguelen, një grup i largët ishujsh me ndikim të kufizuar antropogjen. Për këtë qëllim, cccADN nga hemolimfat e midhjeve u izolua dhe u pastrua me metoda të përdorura zakonisht për të pastruar cccADN-në njerëzore [32, 33]. Ne zbuluam se përqendrimet mesatare të hemolimfës ccfADN në midhje janë në intervalin e ulët të mikrogramëve për ml të hemolimfës (shih Tabelën S2, Informacion Plotësues). Ky diapazon përqendrimesh është shumë më i madh se tek njerëzit e shëndetshëm (nanogramë të ulët për mililitër), por në raste të rralla, tek pacientët me kancer, niveli i ccfADN-së mund të arrijë disa mikrogramë për mililitër [34, 35]. Një analizë e shpërndarjes së madhësisë së hemolimfës ccfADN tregoi se këto fragmente ndryshojnë shumë në madhësi, duke filluar nga 1000 bp në 1000 bp deri në 5000 bp (Fig. 2). Rezultate të ngjashme u morën duke përdorur Kit-in e Investigatorit QIAamp me bazë silici, një metodë e përdorur zakonisht në shkencën mjeko-ligjore për të izoluar dhe pastruar me shpejtësi ADN-në gjenomike nga mostrat e ADN-së me përqendrim të ulët, duke përfshirë CCFADN-në [36].
Elektroforegrama përfaqësuese e ccfADN-së së hemolimfës së midhjes. Ekstraktuar me NucleoSnap Plasma Kit (sipër) dhe QIAamp DNA Investigator Kit. B Grafiku i violinës që tregon shpërndarjen e përqendrimeve të ccfADN-së së hemolimfës (±SE) në midhje. Vijat e zeza dhe të kuqe përfaqësojnë përkatësisht medianën dhe kuartilet e para dhe të treta.
Përafërsisht 1% e CCFADN-së tek njerëzit dhe primatët ka një burim të huaj [21, 37]. Duke pasur parasysh sistemin qarkullues gjysmë të hapur të bivalvave, ujin e detit të pasur me mikrobe dhe shpërndarjen e madhësisë së ccfADN-së së midhjeve, ne hipotetizuam se ccfADN-ja e hemolimfës së midhjeve mund të përmbajë një grup të pasur dhe të larmishëm të ADN-së mikrobike. Për të testuar këtë hipotezë, ne sekuencuam ccfADN-në e hemolimfës nga mostrat e Aulacomya atra të mbledhura nga Ishujt Kerguelen, duke dhënë mbi 10 milionë lexime, 97.6% e të cilave kaluan kontrollin e cilësisë. Leximet u klasifikuan më pas sipas burimeve vetjake dhe jo-vetjake duke përdorur bazat e të dhënave të bivalvave BLASTN dhe NCBI (Fig. S1, Informacion Plotësues).
Tek njerëzit, si ADN-ja bërthamore ashtu edhe ajo mitokondriale mund të lirohen në qarkullimin e gjakut [38]. Megjithatë, në studimin e tanishëm, nuk ishte e mundur të përshkruhej në detaje ADN-ja gjenomike bërthamore e midhjeve, duke pasur parasysh se gjenomi i A. atra nuk është renditur ose përshkruar. Megjithatë, ne ishim në gjendje të identifikonim një numër fragmentesh të ADN-së ccf me origjinë tonën duke përdorur bibliotekën e bivalvave (Fig. S2, Informacion Plotësues). Ne gjithashtu konfirmuam praninë e fragmenteve të ADN-së me origjinë tonën me anë të amplifikimit të drejtuar PCR të atyre gjeneve të A. atra që u renditën (Fig. 3). Në mënyrë të ngjashme, duke pasur parasysh se gjenomi mitokondrial i A. atra është i disponueshëm në bazat e të dhënave publike, mund të gjenden prova për praninë e fragmenteve të ADN-së ccf mitokondriale në hemolimfën e A. atra. Prania e fragmenteve të ADN-së mitokondriale u konfirmua me anë të amplifikimit PCR (Fig. 3).
Gjene të ndryshme mitokondriale ishin të pranishme në hemolimfën e A. atra (pika të kuqe – numri i stokut: SRX5705969) dhe M. platensis (pika blu – numri i stokut: SRX5705968) të amplifikuara me PCR. Figura e adaptuar nga Breton et al., 2011 B Amplifikimi i supernatantit të hemolimfës nga A. atra. Ruajtur në letër FTA. Përdorni një shpues 3 mm për ta shtuar direkt në tubin PCR që përmban përzierjen PCR.
Duke pasur parasysh përmbajtjen e bollshme mikrobike në ujin e detit, fillimisht u përqendruam në karakterizimin e sekuencave të ADN-së mikrobike në hemolimfë. Për ta bërë këtë, përdorim dy strategji të ndryshme. Strategjia e parë përdori Kraken2, një program klasifikimi sekuencash të bazuar në algoritëm që mund të identifikojë sekuencat mikrobike me një saktësi të krahasueshme me BLAST dhe mjete të tjera [28]. Më shumë se 6719 lexime u përcaktuan të ishin me origjinë bakteriale, ndërsa 124 dhe 64 ishin nga arkeat dhe viruset, përkatësisht (Fig. 4). Fragmentet më të bollshme të ADN-së bakteriale ishin Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) dhe Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Kjo shpërndarje është në përputhje me studimet e mëparshme të mikrobiomës së midhjes blu detare [39, 40]. Gammaproteobacteria ishin klasa kryesore e Proteobacteria (44%), duke përfshirë shumë Vibrionales (Fig. 4b). Metoda ddPCR konfirmoi praninë e fragmenteve të ADN-së Vibrio në ccfDNA-në e hemolimfës A. atra (Fig. 4c) [41]. Për të marrë më shumë informacion rreth origjinës bakteriale të ccfDNA-së, u ndërmor një qasje shtesë (Fig. S2, Informacion Plotësues). Në këtë rast, leximet që mbivendoseshin u mblodhën si lexime me çifte dhe u klasifikuan si me origjinë vetjake (bivalvore) ose jo-vetjake duke përdorur BLASTN dhe një vlerë e prej 1e-3 dhe një kufi me homologji >90%. Në këtë rast, leximet që mbivendoseshin u mblodhën si lexime me çifte dhe u klasifikuan si me origjinë vetjake (bivalvore) ose jo-vetjake duke përdorur BLASTN dhe një vlerë e prej 1e-3 dhe një kufi me homologji >90%. Në të njëjtën kohë, ju mund të bëni një gjë të tillë. 1e-3 и отсечения со гомологией> 90%. Në këtë rast, leximet mbivendosëse u mblodhën si lexime me çifte dhe u klasifikuan si native (bivalvore) ose jo-origjinale duke përdorur BLASTN dhe vlerën e 1e-3 dhe kufirin me homologji >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒e > 值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 猿 1-3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 Në të njëjtën kohë, ju mund të bëni një gjë të tillë. 1e-3 и порога гумологии> 90%. Në këtë rast, leximet mbivendosëse u mblodhën si lexime me çifte dhe u klasifikuan si të veta (bivalva) ose jo-origjinale duke përdorur vlerat e BLASTN dhe 1e-3 dhe një prag homologjie >90%.Meqenëse gjenomi i A. atra nuk është renditur ende, ne përdorëm strategjinë e montimit de novo të asamblerit MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Një total prej 147,188 kontigjesh janë identifikuar si të varura (bivalvore) të origjinës. Këto kontigje u shpërthyen më pas me vlera e 1e-10 duke përdorur BLASTN dhe BLASTX. Kjo strategji na lejoi të identifikonim 482 fragmente jo-bivalvore të pranishme në ADN-në ccf të A. atra. Më shumë se gjysma (57%) e këtyre fragmenteve të ADN-së u morën nga bakteret, kryesisht nga simbiontët e gushave, duke përfshirë simbiontët sulfotrofikë, dhe nga simbiontët e gushave Solemya velum (Fig. 5).
Bollëku relativ në nivelin e tipit. B Diversiteti mikrobial i dy filave kryesore (Firmicutes dhe Proteobacteria). Amplifikimi përfaqësues i ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmente të gjenit 16S rRNA (blu) në tre hemolimfa atra.
U analizuan gjithsej 482 kontigje të mbledhura. Profili i përgjithshëm i shpërndarjes taksonomike të shënimeve të kontigjeve metagjenomike (prokariotë dhe eukariote). B Shpërndarja e detajuar e fragmenteve të ADN-së bakteriale të identifikuara nga BLASTN dhe BLASTX.
Analiza Kraken2 tregoi gjithashtu se ADN-ja ccf e midhjeve përmbante fragmente të ADN-së arkeale, duke përfshirë fragmente të ADN-së të Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) dhe Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Prania e fragmenteve të ADN-së të nxjerra nga Euryarchaeota dhe Crenarchaeota, të gjetura më parë në komunitetin mikrobik të midhjeve kaliforniane, nuk duhet të vijë si surprizë [42]. Edhe pse Euryarchaeota shpesh shoqërohet me kushte ekstreme, tani njihet se si Euryarchaeota ashtu edhe Crenarcheota janë ndër prokariotët më të zakonshëm në mjedisin detar kriogjenik [43, 44]. Prania e mikroorganizmave metanogjenikë në midhje nuk është e habitshme, duke pasur parasysh raportet e fundit për rrjedhje të gjera të metanit nga rrjedhjet e poshtme në Rrafshnaltën Kerguelen [45] dhe prodhimin e mundshëm mikrobik të metanit të vëzhguar në brigjet e Ishujve Kerguelen [46].
Vëmendja jonë më pas u zhvendos te leximet nga viruset e ADN-së. Sipas njohurive tona më të mira, ky është studimi i parë jashtë objektivit i përmbajtjes së virusit të midhjeve. Siç pritej, gjetëm fragmente ADN-je të bakteriofagëve (Caudovirales) (Fig. 6b). Megjithatë, ADN-ja virale më e zakonshme vjen nga një filum nukleocitovirusesh, i njohur edhe si virusi bërthamor citoplazmatik i ADN-së së madhe (NCLDV), i cili ka gjenomin më të madh të çdo virusi. Brenda këtij filumi, shumica e sekuencave të ADN-së i përkasin familjeve Mimimidoviridae (58%) dhe Poxviridae (21%), strehuesit natyrorë të të cilëve përfshijnë vertebrorët dhe artropodët, ndërsa një pjesë e vogël e këtyre sekuencave të ADN-së i përkasin algave të njohura virologjike. Infekton algat eukariotike detare. Sekuencat u morën gjithashtu nga virusi Pandora, virusi gjigant me madhësinë më të madhe të gjenomit të çdo gjinie të njohur virale. Është interesante se diapazoni i strehuesve të njohur për t'u infektuar me virusin, siç përcaktohet nga sekuencimi i hemolimfës ccfDNA, ishte relativisht i madh (Figura S3, Informacion Plotësues). Ai përfshin viruse që infektojnë insekte të tilla si Baculoviridae dhe Iridoviridae, si dhe viruse që infektojnë amebën, algat dhe vertebrorët. Ne gjithashtu gjetëm sekuenca që përputhen me gjenomin e Pithovirus sibericum. Pitoviruset (të njohura edhe si "viruse zombi") u izoluan për herë të parë nga ngrica e përhershme 30,000 vjeçare në Siberi [47]. Kështu, rezultatet tona janë në përputhje me raportet e mëparshme që tregojnë se jo të gjitha speciet moderne të këtyre viruseve janë zhdukur [48] dhe se këto viruse mund të jenë të pranishme në ekosistemet detare subarktike të largëta.
Së fundmi, ne testuam për të parë nëse mund të gjenim fragmente ADN-je nga kafshë të tjera shumëqelizore. Një total prej 482 kontigësh të huaj u identifikuan nga BLASTN dhe BLASTX me biblioteka nt, nr dhe RefSeq (gjenomike dhe proteinike). Rezultatet tona tregojnë se midis fragmenteve të huaja të CCFADN-së së kafshëve shumëqelizore mbizotëron ADN-ja e kockave kockore (Fig. 5). Janë gjetur gjithashtu fragmente ADN-je nga insektet dhe specie të tjera. Një pjesë relativisht e madhe e fragmenteve të ADN-së nuk është identifikuar, ndoshta për shkak të nën-përfaqësimit të një numri të madh të specieve detare në bazat e të dhënave gjenomike krahasuar me speciet tokësore [49].
Në këtë punim, ne e zbatojmë konceptin LB te midhjet, duke argumentuar se sekuencimi i hemolimfës ccfDNA mund të ofrojë informacion mbi përbërjen e ekosistemeve bregdetare detare. Në veçanti, ne zbuluam se 1) hemolimfa e midhjes përmban përqendrime relativisht të larta (nivele mikrogramësh) të fragmenteve relativisht të mëdha (~1-5 kb) të ADN-së që qarkullojnë; 2) këto fragmente ADN-je janë si të pavarura ashtu edhe jo të pavarura. 3) Ndër burimet e huaja të këtyre fragmenteve të ADN-së, ne gjetëm ADN bakteriale, arkeale dhe virale, si dhe ADN të kafshëve të tjera shumëqelizore; 4) Grumbullimi i këtyre fragmenteve të huaja të ccfDNA-së në hemolimfë ndodh me shpejtësi dhe kontribuon në aktivitetin e filtrimit të brendshëm të midhjeve. Si përfundim, studimi ynë tregon se koncepti i LB, i cili deri më tani është zbatuar kryesisht në fushën e biomjekësisë, kodon një burim të pasur, por të pashkelur njohurish që mund të përdoret për të kuptuar më mirë ndërveprimin midis specieve roje dhe mjedisit të tyre.
Përveç primatëve, izolimi i ccfADN-së është raportuar te gjitarët, duke përfshirë minjtë, qentë, macet dhe kuajt [50, 51, 52]. Megjithatë, sipas njohurive tona, studimi ynë është i pari që raporton zbulimin dhe sekuencimin e ccfADN-së te speciet detare me një sistem qarkullimi të hapur. Kjo veçori anatomike dhe aftësia filtruese e midhjeve mund të shpjegojë, të paktën pjesërisht, karakteristikat e ndryshme të madhësisë së fragmenteve të ADN-së që qarkullojnë në krahasim me speciet e tjera. Tek njerëzit, shumica e fragmenteve të ADN-së që qarkullojnë në gjak janë fragmente të vogla që variojnë në madhësi nga 150 deri në 200 bp me një kulm maksimal prej 167 bp [34, 53]. Një pjesë e vogël por e rëndësishme e fragmenteve të ADN-së janë midis 300 dhe 500 bp në madhësi, dhe rreth 5% janë më të gjata se 900 bp. [54]. Arsyeja për këtë shpërndarje madhësie është se burimi kryesor i ccfADN-së në plazmë ndodh si rezultat i vdekjes qelizore, ose për shkak të vdekjes qelizore ose për shkak të nekrozës së qelizave hematopoietike në qarkullim tek individë të shëndetshëm ose për shkak të apoptozës së qelizave tumorale tek pacientët me kancer (e njohur si ADN tumorale në qarkullim). Shpërndarja e madhësisë së hemolimfës ccfADN që gjetëm tek midhjet varionte nga 1000 deri në 5000 bp, duke sugjeruar që ccfADN-ja e midhjeve ka një origjinë të ndryshme. Kjo është një hipotezë logjike, pasi midhjet kanë një sistem vaskular gjysmë të hapur dhe jetojnë në mjedise ujore detare që përmbajnë përqendrime të larta të ADN-së gjenomike mikrobike. Në fakt, eksperimentet tona laboratorike duke përdorur ADN ekzogjene kanë treguar se midhjet grumbullojnë fragmente ADN-je në ujin e detit, të paktën pas disa orësh ato degradohen pas thithjes qelizore dhe/ose lirohen dhe/ose ruhen në organizata të ndryshme. Duke pasur parasysh rrallësinë e qelizave (si prokariotike ashtu edhe eukariote), përdorimi i ndarjeve intravalvulare do të zvogëlojë sasinë e CCFADN-së nga burimet vetjake, si dhe nga burimet e huaja. Duke marrë parasysh rëndësinë e imunitetit të lindur të dyvalvulave dhe numrin e madh të fagociteve në qarkullim, ne hipotetizuam më tej se edhe ccfADN-ja e huaj është e pasuruar në fagocitet në qarkullim që grumbullojnë ADN të huaj pas gëlltitjes së mikroorganizmave dhe/ose mbetjeve qelizore. Të marra së bashku, rezultatet tona tregojnë se ccfADN-ja e hemolimfës dyvalvulare është një depo unike e informacionit molekular dhe përforcon statusin e tyre si një specie roje.
Të dhënat tona tregojnë se sekuencimi dhe analiza e fragmenteve të hemolimfës ccfDNA të derivuar nga bakteret mund të ofrojnë informacione kyçe rreth florës bakteriale pritëse dhe baktereve të pranishme në ekosistemin detar përreth. Teknikat e sekuencimit me goditje kanë zbuluar sekuenca të baktereve komensale A. atra në gushë që do të ishin humbur nëse do të ishin përdorur metodat konvencionale të identifikimit të ARN-së 16S r, pjesërisht për shkak të një paragjykimi të bibliotekës referuese. Në fakt, përdorimi ynë i të dhënave LB të mbledhura nga M. platensis në të njëjtën shtresë midhjesh në Kerguelen tregoi se përbërja e simbiontëve bakterialë të shoqëruar me gushë ishte e njëjtë për të dy llojet e midhjeve (Fig. S4, Informacion Plotësues). Kjo ngjashmëri e dy midhjeve gjenetikisht të ndryshme mund të pasqyrojë përbërjen e komuniteteve bakteriale në depozitat e ftohta, squfurore dhe vullkanike të Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Nivele më të larta të mikroorganizmave që reduktojnë squfurin janë përshkruar mirë kur mblidhen midhje nga zonat bregdetare të bioturbuara [59], siç është bregu i Port-au-France. Një tjetër mundësi është që flora e midhjeve komensale mund të preket nga transmetimi horizontal [60, 61]. Nevojiten më shumë kërkime për të përcaktuar korrelacionin midis mjedisit detar, sipërfaqes së shtratit të detit dhe përbërjes së baktereve simbiotike në midhje. Këto studime janë aktualisht në vazhdim.
Gjatësia dhe përqendrimi i hemolimfës ccfDNA, lehtësia e pastrimit të saj dhe cilësia e lartë për të lejuar sekuencimin e shpejtë të shotgun janë disa nga shumë avantazhet e përdorimit të ccfDNA-së së midhjeve për të vlerësuar biodiversitetin në ekosistemet bregdetare detare. Kjo qasje është veçanërisht efektive për karakterizimin e komuniteteve virale (viromave) në një ekosistem të caktuar [62, 63]. Ndryshe nga bakteret, arkeat dhe eukariotët, gjenomet virale nuk përmbajnë gjene të konservuara filogjenetikisht siç janë sekuencat 16S. Rezultatet tona tregojnë se biopsitë e lëngshme nga speciet treguese siç janë midhjet mund të përdoren për të identifikuar një numër relativisht të madh të fragmenteve të virusit ccfDNA të njohura për infektimin e strehuesve që zakonisht banojnë në ekosistemet bregdetare detare. Kjo përfshin viruse të njohura për infektimin e protozoarëve, artropodëve, insekteve, bimëve dhe viruseve bakteriale (p.sh., bakteriofagëve). Një shpërndarje e ngjashme u gjet kur shqyrtuam viromën e hemolimfës ccfDNA të midhjeve blu (M. platensis) të mbledhura në të njëjtën shtresë midhjesh në Kerguelen (Tabela S2, Informacion Plotësues). Sekuencimi i shpejtë i ccfADN-së është me të vërtetë një qasje e re që po fiton vrull në studimin e viromës së njerëzve ose specieve të tjera [21, 37, 64]. Kjo qasje është veçanërisht e dobishme për studimin e viruseve me ADN me dy fije, pasi asnjë gjen i vetëm nuk është i ruajtur midis të gjithë viruseve me ADN me dy fije, duke përfaqësuar klasën më të larmishme dhe të gjerë të viruseve në Baltimore [65]. Edhe pse shumica e këtyre viruseve mbeten të paklasifikuara dhe mund të përfshijnë viruse nga një pjesë krejtësisht e panjohur e botës virale [66], ne zbuluam se viromat dhe diapazoni pritës i midhjeve A. atra dhe M. platensis bien midis dy specieve. Në mënyrë të ngjashme (shih figurën S3, informacion shtesë). Kjo ngjashmëri nuk është për t'u habitur, pasi mund të pasqyrojë një mungesë selektiviteti në thithjen e ADN-së së pranishme në mjedis. Studime të ardhshme duke përdorur ARN të pastruar janë aktualisht të nevojshme për të karakterizuar viromën e ARN-së.
Në studimin tonë, ne përdorëm një kanal shumë rigoroz të adaptuar nga puna e Kowarskit dhe kolegëve të tij [37], të cilët përdorën një fshirje dy-hapëshe të leximeve të grumbulluara dhe kontigjeve para dhe pas montimit të ccfADN-së vendase, duke rezultuar në një përqindje të lartë të leximeve të pahartuara. Prandaj, nuk mund të përjashtojmë që disa nga këto lexime të pahartuara mund të kenë ende origjinën e tyre, kryesisht sepse nuk kemi një gjenom reference për këtë specie midhjesh. Ne gjithashtu përdorëm këtë kanal sepse ishim të shqetësuar për kimerat midis leximeve vetjake dhe jo-vetjake dhe gjatësitë e leximit të gjeneruara nga Illumina MiSeq PE75. Një arsye tjetër për shumicën e leximeve të pahartuara është se shumë nga mikrobet detare, veçanërisht në zona të largëta si Kerguelen, nuk janë shënuar. Ne përdorëm Illumina MiSeq PE75, duke supozuar gjatësi të fragmenteve të ccfADN-së të ngjashme me ccfADN-në njerëzore. Për studime të ardhshme, duke pasur parasysh rezultatet tona që tregojnë se hemolimfa ccfADN ka lexime më të gjata se njerëzit dhe/ose gjitarët, ne rekomandojmë përdorimin e një platforme sekuencimi më të përshtatshme për fragmente më të gjata të ccfADN-së. Kjo praktikë do ta bëjë shumë më të lehtë identifikimin e më shumë indikacioneve për analiza më të thella. Marrja e sekuencës së plotë të gjenomit bërthamor të A. atra, e cila aktualisht nuk është e disponueshme, do të lehtësonte shumë dallimin e ccfADN-së nga burimet vetjake dhe jo-vetjake. Duke pasur parasysh që hulumtimi ynë është përqendruar në mundësinë e zbatimit të konceptit të biopsisë së lëngshme te midhjet, shpresojmë që, ndërsa ky koncept përdoret në hulumtimet e ardhshme, do të zhvillohen mjete dhe kanale të reja për të rritur potencialin e kësaj metode për të studiuar diversitetin mikrobik të midhjeve. Ekosistemi detar.
Si një biomarkues klinik jo-invaziv, nivelet e larta të CCFADN-së në plazmën njerëzore shoqërohen me sëmundje të ndryshme, dëmtime të indeve dhe kushte stresi [67,68,69]. Kjo rritje shoqërohet me lëshimin e fragmenteve të ADN-së me origjinë të vetën pas dëmtimit të indeve. Ne e trajtuam këtë çështje duke përdorur stresin akut të nxehtësisë, në të cilin midhjet u ekspozuan shkurtimisht në një temperaturë prej 30 °C. Ne e kryem këtë analizë në tre lloje të ndryshme midhjesh në tre eksperimente të pavarura. Megjithatë, nuk gjetëm ndonjë ndryshim në nivelet e ccfADN-së pas stresit akut të nxehtësisë (shih Figurën S5, informacion shtesë). Ky zbulim mund të shpjegojë, të paktën pjesërisht, faktin se midhjet kanë një sistem qarkullimi gjysmë të hapur dhe grumbullojnë sasi të mëdha të ADN-së së huaj për shkak të aktivitetit të tyre të lartë të filtrimit. Nga ana tjetër, midhjet, si shumë jovertebrorë, mund të jenë më rezistente ndaj dëmtimit të indeve të shkaktuar nga stresi, duke kufizuar kështu lëshimin e ccfADN-së në hemolimfën e tyre [70, 71].
Deri më sot, analiza e ADN-së e biodiversitetit në ekosistemet ujore është përqendruar kryesisht në metabarkodimin e ADN-së mjedisore (eADN). Megjithatë, kjo metodë zakonisht është e kufizuar në analizën e biodiversitetit kur përdoren prajmerë. Përdorimi i sekuencimit me metodën shotgun anashkalon kufizimet e PCR dhe përzgjedhjen e paragjykuar të grupeve të prajmerëve. Kështu, në një farë mënyre, metoda jonë është më afër metodës së sekuencimit me metodën shotgun të eADN-së me rendiment të lartë të përdorur së fundmi, e cila është në gjendje të sekuencojë drejtpërdrejt ADN-në e fragmentuar dhe të analizojë pothuajse të gjithë organizmat [72, 73]. Megjithatë, ekzistojnë një numër çështjesh themelore që dallojnë LB nga metodat standarde të eADN-së. Sigurisht, ndryshimi kryesor midis eADN-së dhe LB-së është përdorimi i pritësve natyrorë të filtrit. Është raportuar përdorimi i specieve detare si sfungjerët dhe bivalvët (Dresseina spp.) si një filtër natyror për studimin e eADN-së [74, 75]. Megjithatë, studimi i Dreissena-s përdori biopsi indesh nga të cilat u nxor ADN-ja. Analiza e ccfADN-së nga LB nuk kërkon biopsi indesh, pajisje dhe logjistikë të specializuar dhe ndonjëherë të shtrenjtë që lidhen me eADN-në ose biopsinë e indeve. Në fakt, kohët e fundit kemi raportuar se ccfADN-ja nga LB mund të ruhet dhe analizohet me mbështetje FTA pa mbajtur një zinxhir të ftohtë, gjë që është një sfidë e madhe për kërkimin në zona të largëta [76]. Nxjerrja e ccfADN-së nga biopsitë e lëngshme është gjithashtu e thjeshtë dhe ofron ADN me cilësi të lartë për sekuencimin shotgun dhe analizën PCR. Ky është një avantazh i madh duke pasur parasysh disa nga kufizimet teknike që lidhen me analizën e eADN-së [77]. Thjeshtësia dhe kostoja e ulët e metodës së marrjes së mostrave është gjithashtu veçanërisht e përshtatshme për programet e monitorimit afatgjatë. Përveç aftësisë së tyre të lartë të filtrimit, një tjetër tipar i njohur i bivalvëve është përbërja kimike e mukopolisakarideve të mukusit të tyre, e cila nxit thithjen e viruseve [78, 79]. Kjo i bën bivalvët një filtër natyror ideal për karakterizimin e biodiversitetit dhe ndikimin e ndryshimeve klimatike në një ekosistem të caktuar ujor. Edhe pse prania e fragmenteve të ADN-së të nxjerra nga strehuesi mund të shihet si një kufizim i metodës krahasuar me ADN-në elektronike, kostoja e lidhur me të paturit e një ADN-je të tillë ccf vendase krahasuar me ADN-në elektronike është njëkohësisht e kuptueshme për sasinë e madhe të informacionit të disponueshëm për studimet shëndetësore. Kjo përfshin praninë e sekuencave virale të integruara në gjenomën e strehuesit pritës. Kjo është veçanërisht e rëndësishme për midhjet, duke pasur parasysh praninë e retroviruseve leukemike të transmetuara horizontalisht në bivalva [80, 81]. Një avantazh tjetër i LB mbi ADN-në elektronike është se ai shfrytëzon aktivitetin fagocitik të qelizave të gjakut që qarkullojnë në hemolimfë, e cila përfshin mikroorganizmat (dhe gjenomet e tyre). Fagocitoza është funksioni kryesor i qelizave të gjakut në bivalva [82]. Së fundmi, metoda përfiton nga kapaciteti i lartë i filtrimit të midhjeve (mesatarisht 1.5 l/orë ujë deti) dhe qarkullimi dy-ditor, të cilat rrisin përzierjen e shtresave të ndryshme të ujit të detit, duke lejuar kapjen e ADN-së elektronike heterologe. [83, 84]. Kështu, analiza e CCFADN-së së midhjeve është një rrugë interesante duke pasur parasysh ndikimet ushqyese, ekonomike dhe mjedisore të midhjeve. Ngjashëm me analizën e LB-së të mbledhur nga njerëzit, kjo metodë hap gjithashtu mundësinë e matjes së ndryshimeve gjenetike dhe epigjenetike në ADN-në pritëse në përgjigje të substancave ekzogjene. Për shembull, teknologjitë e sekuencimit të gjeneratës së tretë mund të parashikohen për të kryer analizën e metilimit në të gjithë gjenomin në ccfADN-në native duke përdorur sekuencimin e nanoporeve. Ky proces duhet të lehtësohet nga fakti se gjatësia e fragmenteve të ccfADN-së së midhjeve është idealisht e pajtueshme me platformat e sekuencimit me lexim të gjatë që lejojnë analizën e metilimit të ADN-së në të gjithë gjenomin nga një sekuencim i vetëm pa nevojën për transformime kimike.85,86] Kjo është një mundësi interesante, pasi është treguar se modelet e metilimit të ADN-së pasqyrojnë një përgjigje ndaj stresit mjedisor dhe vazhdojnë gjatë shumë brezave. Prandaj, mund të ofrojë një pasqyrë të vlefshme të mekanizmave themelorë që rregullojnë përgjigjen pas ekspozimit ndaj ndryshimeve klimatike ose ndotësve [87]. Megjithatë, përdorimi i LB nuk është pa kufizime. Pa dyshim, kjo kërkon praninë e specieve treguese në ekosistem. Siç u përmend më sipër, përdorimi i LB për të vlerësuar biodiversitetin e një ekosistemi të caktuar kërkon gjithashtu një kanal rigoroz bioinformatik që merr në konsideratë praninë e fragmenteve të ADN-së nga burimi. Një problem tjetër i madh është disponueshmëria e gjenomeve referuese për speciet detare. Shpresohet që iniciativa të tilla si Projekti i Gjenomeve të Gjitarëve Detarë dhe projekti i krijuar së fundmi Fish10k [88] do të lehtësojnë analiza të tilla në të ardhmen. Zbatimi i konceptit LB në organizmat detarë që ushqehen me filtra është gjithashtu i pajtueshëm me përparimet më të fundit në teknologjinë e sekuencimit, duke e bërë atë të përshtatshëm për zhvillimin e biomarkuesve shumë-ohmë për të ofruar informacion të rëndësishëm në lidhje me shëndetin e habitateve detare në përgjigje të stresit mjedisor.
Të dhënat e sekuencimit të gjenomit janë depozituar në Arkivin e Leximit të Sekuencave të NCBI-së https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 nën Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ndikimi i ndryshimeve klimatike në jetën detare dhe ekosistemet. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Merrni në konsideratë ndikimet e kombinuara të ndryshimeve klimatike dhe faktorëve të tjerë të stresit lokal në mjedisin detar. mjedisi i përgjithshëm shkencor. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Shkenca e 1 Marsit. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleranca e reduktuar ndaj nxehtësisë në kushte të stresit të përsëritur të nxehtësisë shpjegon vdekshmërinë e lartë të midhjeve blu gjatë verës. Raporti shkencor 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, etj. Ndryshimet e fundit në frekuencën, shkaqet dhe shkallën e vdekjeve të kafshëve. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, etj. Patogjenë të shumtë jo specifikë për speciet mund të kenë shkaktuar vdekshmëri masive të Pinna nobilis. Jeta. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Ndikimi i mundshëm i ndryshimeve klimatike në sëmundjet zoonotike të Arktikut. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Midhjet blu (Mytilus edulis spp.) si organizma sinjalizues në monitorimin e ndotjes bregdetare: një përmbledhje. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrimi i biopsisë së lëngshme në trajtimin e kancerit. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, etj. Maturimi i biopsisë së lëngshme: Lejon që ADN-ja e tumorit të qarkullojë. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acidet nukleike në plazmën njerëzore. Protokolli i mbledhjeve të degëve të Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Një rol i ri për ADN-në pa qeliza si një shënues molekular për trajtimin e kancerit. Kuantifikimi i analizës biomolare. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia e lëngshme hyn në klinikë - problemet e zbatimit dhe sfidat e ardhshme. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dhe të tjerë. ADN-ja fetale është e pranishme në plazmën dhe serumin e nënës. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studimi i rrjedhës së shtatzënisë dhe ndërlikimeve të saj duke përdorur ARN-në jashtëqelizore që qarkullon në gjakun e grave gjatë shtatzënisë. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, etj. Biopsia e lëngshme: ADN-ja pa qeliza të donatorit përdoret për të zbuluar lezione alogjenike në një transplant veshke. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacione në diagnostikën prenatale: sekuencimi i gjenomit të plazmës së nënës. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Zbulimi i shpejtë i patogjenëve me sekuencimin metagenomik të gjeneratës së ardhshme të lëngjeve trupore të infektuara. Nat Medicine. 2021;27:115-24.