Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Pjelloria e zogjve varet nga aftësia e tyre për të ruajtur mjaftueshëm spermë të qëndrueshme për një periudhë të gjatë kohore në tubulat e ruajtjes së spermës (SST).Mekanizmi i saktë me të cilin spermatozoidet hyjnë, banojnë dhe largohen nga SST mbetet i diskutueshëm.Sperma e pulave sharkasi tregoi një tendencë të lartë për aglutinim, duke formuar tufa filamentoze të lëvizshme që përmbajnë shumë qeliza.Për shkak të vështirësisë së vëzhgimit të lëvizshmërisë dhe sjelljes së spermatozoideve në një tub fallopian të errët, ne përdorëm një pajisje mikrofluidike me një seksion kryq të mikrokanalit të ngjashëm me atë të spermatozoideve për të studiuar aglutinimin dhe lëvizshmërinë e spermatozoideve.Ky studim diskuton se si formohen tufat e spermës, si lëvizin dhe rolin e tyre të mundshëm në zgjerimin e qëndrimit të spermës në SST.Ne hetuam shpejtësinë e spermës dhe sjelljen reologjike kur rrjedha e lëngut u krijua brenda një kanali mikrofluidik nga presioni hidrostatik (shkalla e rrjedhjes = 33 µm/s).Spermatozoidet priren të notojnë kundër rrymës (reologji pozitive) dhe shpejtësia e grupit të spermatozoideve është reduktuar ndjeshëm në krahasim me spermatozoidet e vetme.Është vërejtur se tufat e spermës lëvizin në një spirale dhe rriten në gjatësi dhe trashësi ndërsa rekrutohen më shumë spermatozoide të vetme. Tufat e spermës u vunë re duke u afruar dhe ngjitur në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur fshirjen me shpejtësi të rrjedhës së lëngut > 33 µm/s. Tufat e spermës u vunë re duke u afruar dhe ngjitur në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur fshirjen me shpejtësi të rrjedhës së lëngut > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Është vërejtur se tufat e spermës afrohen dhe ngjiten në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur fshirjen me shpejtësi të rrjedhjes së lëngut >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 μm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Është vërejtur se tufat e spermës afrohen dhe ngjiten në muret anësore të kanalit mikrofluidik për të shmangur fshirjen nga rrjedha e lëngut me >33 µm/s.Skanimi dhe mikroskopi elektronik i transmetimit zbuloi se tufat e spermës mbështeteshin nga një material i bollshëm i dendur.Të dhënat e marra demonstrojnë lëvizshmërinë unike të spermatozoideve të pulës Sharkazi, si dhe aftësinë e spermatozoideve për të aglutinuar dhe formuar tufa të lëvizshme, gjë që kontribuon në një kuptim më të mirë të ruajtjes afatgjatë të spermatozoideve në SMT.
Për të arritur fekondimin tek njerëzit dhe shumica e kafshëve, sperma dhe vezët duhet të arrijnë në vendin e fekondimit në kohën e duhur.Prandaj, çiftëzimi duhet të ndodhë para ose në kohën e ovulacionit.Nga ana tjetër, disa gjitarë, si qentë, si dhe specie jo-gjitarësh, si insektet, peshqit, zvarranikët dhe zogjtë, ruajnë spermën në organet e tyre riprodhuese për një periudhë të gjatë kohore derisa vezët e tyre të jenë gati për fekondim (fertilizimi asinkron 1 ).Zogjtë janë në gjendje të ruajnë qëndrueshmërinë e spermatozoideve të aftë për të fekonduar vezët për 2-10 javë2.
Kjo është një veçori unike që i dallon zogjtë nga kafshët e tjera, pasi siguron një probabilitet të lartë fekondimi pas një inseminimi të vetëm për disa javë pa çiftëzim dhe ovulim të njëkohshëm.Organi kryesor i ruajtjes së spermës, i quajtur tubuli i ruajtjes së spermës (SST), ndodhet në palosjet e brendshme të mukozës në kryqëzimin uterovaginal.Deri më sot, mekanizmat me të cilët spermatozoidet hyjnë, banojnë dhe dalin nga banka e spermës nuk janë kuptuar plotësisht.Në bazë të studimeve të mëparshme, janë hedhur shumë hipoteza, por asnjëra prej tyre nuk është konfirmuar.
Forman4 hipotezoi se spermatozoidet ruajnë qëndrimin e tyre në zgavrën SST përmes lëvizjes së vazhdueshme osciluese kundër drejtimit të rrjedhës së lëngut përmes kanaleve proteinike të vendosura në qelizat epiteliale SST (rheologji).ATP është varfëruar për shkak të aktivitetit të vazhdueshëm flagellar të nevojshëm për të mbajtur spermatozoidin në lumenin SST dhe lëvizshmëria përfundimisht zvogëlohet derisa spermatozoidi të largohet nga banka e spermës me rrjedhën e lëngjeve dhe të fillojë një udhëtim të ri poshtë tubit fallopian në ngjitje për të fekonduar spermën.Veza (Forman4).Ky model i ruajtjes së spermës mbështetet nga zbulimi me anë të imunocitokimisë së akuaporinave 2, 3 dhe 9 të pranishme në qelizat epiteliale SST.Deri më sot, mungojnë studimet mbi reologjinë e spermës së pulës dhe rolin e saj në ruajtjen e SST, përzgjedhjen vaginale të spermës dhe konkurrencën e spermës.Tek pulat, sperma hyn në vaginë pas çiftëzimit natyral, por më shumë se 80% e spermatozoideve nxirren nga vagina menjëherë pas çiftëzimit.Kjo sugjeron që vagina është vendi kryesor për përzgjedhjen e spermës tek zogjtë.Përveç kësaj, është raportuar se më pak se 1% e spermatozoideve të fekonduara në vaginë përfundojnë në SST2.Në inseminimin artificial të pulave në vaginë, numri i spermatozoideve që arrijnë SST tenton të rritet 24 orë pas inseminimit.Deri më tani, mekanizmi i përzgjedhjes së spermës gjatë këtij procesi është i paqartë dhe lëvizshmëria e spermës mund të luajë një rol të rëndësishëm në marrjen e spermës SST.Për shkak të mureve të trasha dhe të errëta të tubave fallopiane, është e vështirë të monitorohet drejtpërdrejt lëvizshmëria e spermës në tubat fallopiane të shpendëve.Prandaj, na mungojnë njohuritë bazë se si spermatozoa kalon në SST pas fekondimit.
Reologjia kohët e fundit është njohur si një faktor i rëndësishëm që kontrollon transportin e spermës në organet gjenitale të gjitarëve.Bazuar në aftësinë e spermatozoideve lëvizëse për të migruar në mënyrë të kundërt, Zaferani et al8 përdorën një sistem mikrofluidik corra për të izoluar në mënyrë pasive spermatozoidet lëvizëse nga mostrat e spermës së shkruar.Ky lloj klasifikimi i spermës është thelbësor për trajtimin mjekësor të infertilitetit dhe kërkimin klinik, dhe preferohet mbi metodat tradicionale që kërkojnë kohë dhe punë intensive dhe mund të rrezikojnë morfologjinë dhe integritetin strukturor të spermës.Megjithatë, deri më sot, nuk janë kryer studime mbi efektin e sekrecioneve nga organet gjenitale të pulave në lëvizshmërinë e spermës.
Pavarësisht nga mekanizmi që ruan spermën e ruajtur në SST, shumë kërkues kanë vërejtur se spermatozoidet rezidente aglutinohen kokë më kokë në SST të pulave 9, 10, thëllëzave 2 dhe gjelave 11 për të formuar tufa të aglutinuara të spermës.Autorët sugjerojnë se ekziston një lidhje midis këtij aglutinimi dhe ruajtjes afatgjatë të spermatozoideve në SST.
Tingari dhe Lake12 raportuan një lidhje të fortë midis spermatozoideve në gjëndrën që merr spermatozoidin e pulës dhe vunë në dyshim nëse spermatozoidet e shpendëve aglutinohen në të njëjtën mënyrë si spermatozoidet e gjitarëve.Ata besojnë se lidhjet e thella midis spermatozoideve në vas deferens mund të jenë për shkak të stresit të shkaktuar nga prania e një numri të madh të spermatozoideve në një hapësirë ​​të vogël.
Kur vlerësohet sjellja e spermatozoideve në rrëshqitjet e xhamit të varura të freskëta, mund të shihen shenja kalimtare të aglutinimit, veçanërisht në skajet e pikave të spermës.Megjithatë, aglutinimi shpesh shqetësohej nga veprimi rrotullues i shoqëruar me lëvizje të vazhdueshme, gjë që shpjegon natyrën kalimtare të këtij fenomeni.Studiuesit vunë re gjithashtu se kur holluesi u shtua në spermë, u shfaqën agregate qelizore të zgjatura "si fije".
Përpjekjet e hershme për të imituar një spermatozoid u bënë duke hequr një tel të hollë nga një pikë e varur, e cila rezultoi në një vezikulë të zgjatur të ngjashme me spermën që dilte nga pika e spermës.Spermatozoidet u rreshtuan menjëherë në mënyrë paralele brenda vezikulës, por e gjithë njësia u zhduk shpejt për shkak të kufizimit 3D.Prandaj, për të studiuar aglutinimin e spermatozoideve, është e nevojshme të vëzhgoni lëvizshmërinë dhe sjelljen e spermatozoideve drejtpërdrejt në tubulat e izoluara të ruajtjes së spermës, gjë që është e vështirë të arrihet.Prandaj, është e nevojshme të zhvillohet një instrument që imiton spermatozoidet për të mbështetur studimet e lëvizshmërisë së spermës dhe sjelljes së aglutinimit.Brillard et al13 raportuan se gjatësia mesatare e tubave të ruajtjes së spermës tek zogjtë e rritur është 400-600 μm, por disa SST mund të jenë deri në 2000 μm.Mero dhe Ogasawara14 i ndanë gjëndrat seminifere në tuba të zmadhuar dhe jo të zmadhuar të ruajtjes së spermës, që të dyja ishin të njëjta në gjatësi (~ 500 µm) dhe gjerësi të qafës (~ 38 µm), por diametri mesatar i lumenit të tubave ishte 56.6 dhe 56.6 µm.., përkatësisht 11.2 μm, përkatësisht.Në studimin aktual, ne përdorëm një pajisje mikrofluidike me një madhësi kanali prej 200 µm × 20 µm (W × H), seksioni kryq i të cilit është disi i afërt me atë të SST të përforcuar.Përveç kësaj, ne ekzaminuam lëvizshmërinë e spermës dhe sjelljen e aglutinimit në lëngun që rrjedh, gjë që është në përputhje me hipotezën e Foreman-it se lëngu i prodhuar nga qelizat epiteliale SST e mban spermën në lumen në një drejtim kundërrrymës (reologjik).
Qëllimi i këtij studimi ishte tejkalimi i problemeve të vëzhgimit të lëvizshmërisë së spermatozoideve në tubin fallopian dhe shmangia e vështirësive të studimit të reologjisë dhe sjelljes së spermatozoideve në një mjedis dinamik.Është përdorur një pajisje mikrofluidike që krijon presion hidrostatik për të simuluar lëvizshmërinë e spermës në organet gjenitale të një pule.
Kur një pikë e një kampioni të holluar sperme (1:40) u ngarkua në pajisjen e mikrokanalit, mund të identifikoheshin dy lloje të lëvizshmërisë së spermës (sperma e izoluar dhe sperma e lidhur).Përveç kësaj, spermatozoidet priren të notojnë kundër rrymës (reologji pozitive; video 1, 2). Megjithëse tufat e spermës kishin shpejtësi më të ulët se ajo e spermës së vetmuar (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermës që shfaqte reotaksi pozitive (p <0,001; Tabela 2). Megjithëse tufat e spermës kishin shpejtësi më të ulët se ajo e spermës së vetmuar (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermës që shfaqte reotaksi pozitive (p <0,001; Tabela 2). Хотя пучки spermatozoidov emërtohen më shumë se shpejt, чем у gonochnыh spermatozoidov (p < 0,001), они uvelichivali procent spermatozoidov, demonstriruющих poложительный reotaxis (p < 0,001; Megjithëse tufat e spermatozoideve kishin një shpejtësi më të ulët se ajo e spermatozoideve të vetme (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermatozoideve që tregonin reotaksi pozitive (p <0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显独精子的速度（p分比（p <0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显独 的 速度 （p分比 (p <0,001 ； 2…………………………..) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент на сперматозоидов положительной реологией (p < 0,001; tab 2). Megjithëse shpejtësia e tufave të spermës ishte më e ulët se ajo e spermatozoideve të vetme (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermatozoideve me reologji pozitive (p < 0,001; Tabela 2).Reologjia pozitive për spermatozoidet e vetme dhe tufat vlerësohet në afërsisht 53% dhe 85%, respektivisht.
Është vënë re se spermatozoidet e pulave sharkazi menjëherë pas ejakulimit formojnë tufa lineare, të përbëra nga dhjetëra individë.Këto tufa rriten në gjatësi dhe trashësi me kalimin e kohës dhe mund të qëndrojnë in vitro për disa orë përpara se të shpërndahen (video 3).Këto tufa filamentoze kanë formë si spermatozoidet e echidna që formohen në fund të epididymis.Sperma e pulës Sharkashi është gjetur të ketë një tendencë të lartë për t'u aglutinuar dhe për të formuar një tufë rrjeti në më pak se një minutë pas grumbullimit.Këto trarë janë dinamikë dhe në gjendje të ngjiten në çdo mur afër ose objekt statik.Edhe pse tufat e spermës zvogëlojnë shpejtësinë e qelizave të spermës, është e qartë se makroskopikisht ato rrisin linearitetin e tyre.Gjatësia e tufave ndryshon në varësi të numrit të spermës së mbledhur në tufa.Dy pjesë të tufës u izoluan: pjesa fillestare, duke përfshirë kokën e lirë të spermës së aglutinuar dhe pjesa terminale, duke përfshirë bishtin dhe të gjithë skajin distal të spermës.Duke përdorur një kamerë me shpejtësi të lartë (950 fps), në pjesën fillestare të paketës u vunë re koka të lira të spermatozoideve të aglutinuara, përgjegjëse për lëvizjen e paketës për shkak të lëvizjes së tyre lëkundëse, duke i tërhequr ato të mbetura në pako me një lëvizje spirale (Video 4).Megjithatë, në tufat e gjata, është vërejtur se disa koka të lira sperme të ngjitura në trup dhe pjesa përfundimtare e tufës veprojnë si fletë për të ndihmuar në lëvizjen e tufës.
Ndërsa në një rrjedhje të ngadaltë të lëngjeve, tufat e spermës lëvizin paralelisht me njëra-tjetrën, megjithatë, ato fillojnë të mbivendosen dhe ngjiten me gjithçka që është ende, në mënyrë që të mos lahen nga rrjedha aktuale ndërsa shpejtësia e rrjedhës rritet.Tufat formohen kur një grusht qelizash spermatozoide i afrohen njëra-tjetrës, ato fillojnë të lëvizin në mënyrë sinkronike dhe mbështillen rreth njëra-tjetrës, dhe më pas ngjiten në një substancë ngjitëse.Figura 1 dhe 2 tregojnë se si spermatozoidet afrohen me njëri-tjetrin, duke formuar një bashkim ndërsa bishtat mbështillen rreth njëri-tjetrit.
Studiuesit aplikuan presion hidrostatik për të krijuar rrjedhjen e lëngjeve në një mikrokanal për të studiuar reologjinë e spermës.Është përdorur një mikrokanal me madhësi 200 µm × 20 µm (W × H) dhe një gjatësi prej 3,6 µm.Përdorni mikrokanale midis kontejnerëve me shiringa të vendosura në skajet.Ngjyrosja e ushqimit u përdor për t'i bërë kanalet më të dukshme.
Lidhni kabllot e ndërlidhjes dhe aksesorët në mur.Videoja është marrë me një mikroskop me kontrast fazor.Me çdo imazh, paraqitet mikroskopi i kontrastit fazor dhe imazhet e hartës.(A) Lidhja midis dy përrenjve i reziston rrjedhës për shkak të lëvizjes spirale (shigjeta e kuqe).(B) Lidhja midis tubit të tubit dhe murit të kanalit (shigjeta të kuqe), në të njëjtën kohë ato lidhen me dy tufa të tjera (shigjeta të verdha).(C) Tufat e spermës në kanalin mikrofluidik fillojnë të lidhen me njëra-tjetrën (shigjetat e kuqe), duke formuar një rrjetë tufash sperme.(D) Formimi i një rrjeti të tufave të spermës.
Kur një pikë sperme e holluar u ngarkua në pajisjen mikrofluidike dhe u krijua një rrjedhë, u vu re se tufa e spermës lëvizte kundër drejtimit të rrjedhës.Tufat përshtaten fort me muret e mikrokanaleve dhe kokat e lira në pjesën fillestare të tufave përshtaten fort me to (video 5).Ata gjithashtu ngjiten në çdo grimcë të palëvizshme në rrugën e tyre, të tilla si mbeturinat, për t'i rezistuar marrjes së rrymës.Me kalimin e kohës, këto tufa bëhen fije të gjata duke bllokuar spermatozoidet e tjera të vetme dhe tufat më të shkurtra (Video 6).Ndërsa rrjedha fillon të ngadalësohet, linjat e gjata të spermës fillojnë të formojnë një rrjet vijash spermatozoide (Video 7; Figura 2).
Me shpejtësi të lartë të rrjedhës (V > 33 µm/s), lëvizjet spirale të fijeve rriten si një përpjekje për të kapur shumë tufa individuale që formojnë spermatozoidet që i rezistojnë më mirë forcës lëvizëse të rrjedhës. Me shpejtësi të lartë të rrjedhës (V > 33 µm/s), lëvizjet spirale të fijeve rriten si një përpjekje për të kapur shumë tufa individuale që formojnë spermatozoidet që i rezistojnë më mirë forcës lëvizëse të rrjedhës. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных spermatozoidov, образующише помылятся . Me shpejtësi të lartë rrjedhjeje (V > 33 µm/s), lëvizjet spirale të fijeve rriten ndërsa përpiqen të kapin shumë spermatozoa individualë që formojnë tufa që janë më të afta t'i rezistojnë forcës lëvizëse të rrjedhës.在高流速(V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s)地 抵抗 的 漂移力…..… При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих путочки, чтобьщих путочки, чтобьщий лучь. Me shpejtësi të lartë rrjedhjeje (V > 33 µm/s), lëvizja spirale e filamenteve rritet në një përpjekje për të kapur shumë spermatozoide individuale që formojnë tufa për t'i rezistuar më mirë forcave lëvizëse të rrjedhës.Ata gjithashtu u përpoqën të lidhnin mikrokanale në muret anësore.
Tufat e spermës u identifikuan si grupe të kokave të spermës dhe bishtave të përdredhur duke përdorur mikroskopin e dritës (LM).Tufat e spermës me agregate të ndryshëm janë identifikuar gjithashtu si koka të përdredhura dhe agregate flagjelarësh, bishta të shumtë të shkrirë të spermës, koka sperme të ngjitura në një bisht dhe koka sperme me bërthama të përkulura si bërthama të shumta të shkrira.mikroskopi elektronik transmetues (TEM).Mikroskopi elektronik skanues (SEM) tregoi se tufat e spermës ishin agregate të mbështjella të kokave të spermës dhe agregatet e spermës treguan një rrjet të bashkangjitur bishtash të mbështjellë.
Morfologjia dhe ultrastruktura e spermatozoideve, formimi i tufave të spermatozoideve u studiuan duke përdorur mikroskopi me dritë (gjysmë seksioni), mikroskopi elektronik skanues (SEM) dhe mikroskopi elektronik transmetues (TEM), spermatozoidet u ngjyrosën me akridine portokalli dhe u ekzaminuan duke përdorur mikroskopi epifluorec.
Ngjyrosja e njollosjes së spermës me akridine portokalli (Fig. 3B) tregoi se kokat e spermës ishin ngjitur së bashku dhe të mbuluara me material sekretues, gjë që çoi në formimin e tufave të mëdha (Fig. 3D).Tufat e spermës përbëheshin nga agregate sperme me një rrjet bishtash të bashkangjitur (Fig. 4A-C).Tufat e spermës përbëhen nga bishtat e shumë spermatozoideve të mbërthyer së bashku (Fig. 4D).Sekretet (Fig. 4E,F) mbulonin kokat e tufave të spermatozoideve.
Formimi i grupit të spermatozoideve Përdorimi i mikroskopisë së kontrastit të fazës dhe lyerjeve të spermës të lyer me portokall akridine, tregoi se kokat e spermatozoideve ngjiten së bashku.(A) Formimi i hershëm i tufës së spermës fillon me një spermë (rreth i bardhë) dhe tre spermatozoide (rreth i verdhë), me spirale që fillon nga bishti dhe përfundon në kokë.(B) Fotomikrografi e një smeari sperme të lyer me portokall akridine që tregon kokat ngjitëse të spermës (shigjetat).Shkarkimi mbulon kokën(t).Zmadhimi × 1000. (C) Zhvillimi i një rrezeje të madhe të transportuar nga rrjedha në një kanal mikrofluidik (duke përdorur një kamerë me shpejtësi të lartë në 950 fps).(D) Mikrografia e njollosjes së spermës së njollosur me portokalli akridine që tregon tufa (shigjeta) të mëdha.Zmadhimi: × 200.
Mikrografi elektronik skanues i një rreze sperme dhe një njollë sperme të lyer me akridine portokalli.(A, B, D, E) janë mikrografë dixhitale elektronike me skanim me ngjyra të spermatozoideve dhe C dhe F janë mikrografë të spermatozoideve të ngjyrosura me ngjyrë portokalli akridine që tregojnë lidhjen e spermatozoideve të shumta që mbështjellin rrjetën bishtore.(AC) Agregatet e spermës tregohen si një rrjet bishtash të bashkangjitur (shigjeta).(D) Ngjitja e disa spermatozoideve (me substancë ngjitëse, kontur rozë, shigjetë) që mbështillen rreth bishtit.(E dhe F) Agregatet e kokës së spermës (pointers) të mbuluara me material ngjitës (pointers).Spermatozoidet formuan tufa me disa struktura të ngjashme me vorbullën (F).(C) ×400 dhe (F) ×200 zmadhimet.
Duke përdorur mikroskopin elektronik të transmisionit, ne zbuluam se tufat e spermës kishin bishta të bashkangjitur (Fig. 6A, C), koka të lidhura me bishtat (Fig. 6B) ose koka të lidhura me bishtat (Fig. 6D).Kokat e spermatozoideve në tufë janë të lakuar, duke paraqitur në seksionin dy rajone bërthamore (Fig. 6D).Në paketën e prerjes, spermatozoa kishte një kokë të përdredhur me dy rajone bërthamore dhe rajone të shumta flagelare (Fig. 5A).
Mikrografi elektronik me ngjyra dixhitale që tregon bishtat lidhës në paketën e spermës dhe materialin aglutinues që lidh kokat e spermës.(A) Bishti i ngjitur i një numri të madh spermatozoidësh.Vini re se si duket bishti si në projeksionet e portretit (shigjeta) ashtu edhe në peizazhin (shigjeta).(B) Koka (shigjeta) e spermës është e lidhur me bishtin (shigjetën).(C) Disa bishta (shigjeta) të spermës janë ngjitur.(D) Materiali aglutinues (AS, blu) lidh katër koka sperme (vjollcë).
Mikroskopi elektronik skanues u përdor për të zbuluar kokat e spermës në tufat e spermës të mbuluara me sekrecione ose membrana (Figura 6B), duke treguar se tufat e spermës ishin të ankoruara nga materiali jashtëqelizor.Materiali i aglutinuar u përqendrua në kokën e spermës (montim i ngjashëm me kokën e kandil deti; Fig. 5B) dhe u zgjerua distalisht, duke dhënë një pamje të verdhë të shkëlqyeshme nën mikroskopin fluoreshent kur ngjyroset me akridine portokalli (Fig. 6C).Kjo substancë është qartë e dukshme nën një mikroskop skanues dhe konsiderohet një lidhës.Seksionet gjysmë të holla (Fig. 5C) dhe spermatozoidet e ngjyrosura me portokall akridine treguan tufa sperme që përmbanin koka të mbushura dendur dhe bishta të përdredhur (Fig. 5D).
Fotomikrografë të ndryshëm që tregojnë grumbullimin e kokave të spermës dhe bishtit të palosur duke përdorur metoda të ndryshme.(A) Mikrografi elektronik i transmetimit dixhital të ngjyrave me seksion tërthor të një tufe sperme që tregon një kokë sperme të mbështjellë me një bërthamë dypjesëshe (blu) dhe disa pjesë flagelare (jeshile).(B) Mikrografi elektronik i skanimit me ngjyra dixhitale që tregon një grup kokash sperme të ngjashme me kandil deti (shigjeta) që duket se janë të mbuluara.(C) Seksion gjysmë i hollë që tregon kokat e grumbulluara të spermës (shigjetat) dhe bishtat e përdredhur (shigjetat).(D) Mikrografia e një njollosjeje sperme të lyer me portokall akridine që tregon agregatet e kokave të spermës (shigjetat) dhe bishtat ngjitës të dredhur (shigjetat).Vini re se një substancë ngjitëse (S) mbulon kokën e spermatozoidit.(D) × 1000 zmadhim.
Duke përdorur mikroskopin elektronik transmetues (Fig. 7A), u vu re gjithashtu se kokat e spermës ishin të përdredhura dhe bërthamat kishin një formë spirale, siç konfirmohet nga spermatozoidet e lyera me akridine portokalli dhe të ekzaminuara duke përdorur mikroskopin fluoreshent (Fig. 7B).
(A) Mikrografi elektronik i transmetimit të ngjyrave dixhitale dhe (B) njollosja e spermës me ngjyrë portokalli Acridine që tregon kokat e mbështjellura dhe lidhjen e kokave dhe bishtave të spermës (shigjeta).(B) × 1000 zmadhim.
Një zbulim interesant është se sperma e Sharkazit grumbullohet për të formuar tufa filamentoze të lëvizshme.Vetitë e këtyre tufave na lejojnë të kuptojmë rolin e tyre të mundshëm në përthithjen dhe ruajtjen e spermatozoideve në SST.
Pas çiftëzimit, spermatozoidet hyjnë në vaginë dhe i nënshtrohen një procesi intensiv përzgjedhjeje, duke rezultuar në një numër të kufizuar të spermatozoideve që hyjnë në SST15,16.Deri më sot, mekanizmat me të cilët spermatozoidet hyjnë dhe dalin nga SST janë të paqarta.Në shpendët, spermatozoidet ruhen në SST për një periudhë të zgjatur prej 2 deri në 10 javë, në varësi të specieve6.Mbeten polemika rreth gjendjes së spermës gjatë ruajtjes në SST.A janë në lëvizje apo në pushim?Me fjalë të tjera, si e mbajnë qelizat spermatozoide pozicionin e tyre në SST për kaq gjatë?
Forman4 sugjeroi që qëndrimi dhe nxjerrja e SST-së mund të shpjegohej në termat e lëvizshmërisë së spermës.Autorët supozojnë se spermatozoidet ruajnë pozicionin e tyre duke notuar kundër rrjedhës së lëngjeve të krijuar nga epiteli SST dhe se spermatozoidet nxirren nga SST kur shpejtësia e tyre bie nën pikën në të cilën ata fillojnë të lëvizin prapa për shkak të mungesës së energjisë.Zaniboni5 konfirmoi praninë e akuaporinave 2, 3 dhe 9 në pjesën apikale të qelizave epiteliale SST, të cilat mund të mbështesin indirekt modelin e ruajtjes së spermës së Foreman.Në studimin aktual, ne zbuluam se pothuajse gjysma e spermatozoideve të Sharkashit shfaqin reologji pozitive në lëngun që rrjedh dhe se tufat e aglutinuara të spermës rrisin numrin e spermatozoideve që tregojnë reologji pozitive, megjithëse aglutinimi i ngadalëson ato.Se si qelizat e spermës udhëtojnë në tubin fallopian të zogut në vendin e fekondimit nuk është kuptuar plotësisht.Tek gjitarët, lëngu folikular kimiotërheq spermatozoidet.Megjithatë, besohet se kimiatraktantët i drejtojnë spermatozoidet të afrohen në distanca të gjata7.Prandaj, mekanizma të tjerë janë përgjegjës për transportin e spermës.Aftësia e spermës për të orientuar dhe rrjedhur kundër lëngut të tubit fallopian të lëshuar pas çiftëzimit është raportuar të jetë një faktor kryesor në shënjestrimin e spermës tek minjtë.Parker 17 sugjeroi që spermatozoa të kalojë oviduktet duke notuar kundër rrymës ciliare te zogjtë dhe zvarranikët.Megjithëse nuk është demonstruar eksperimentalisht te zogjtë, Adolphi18 ishte i pari që zbuloi se sperma e shpendëve jep rezultate pozitive kur një shtresë e hollë lëngu midis një mbulese dhe rrëshqitëse krijohet me një rrip letre filtri.Reologjia.Hino dhe Yanagimachi [19] vendosën një kompleks miu vezore-tubale-uterine në një unazë perfuzioni dhe injektuan 1 µl boje në istmus për të vizualizuar rrjedhjen e lëngjeve në tubat fallopiane.Ata vunë re një lëvizje shumë aktive të tkurrjes dhe relaksimit në tubin fallopian, në të cilin të gjitha topat e bojës lëviznin në mënyrë të qëndrueshme drejt ampulës së tubit fallopian.Autorët theksojnë rëndësinë e rrjedhjes së lëngjeve tubale nga tubat fallopiane të poshtme në ato të sipërme për ngritjen dhe fekondimin e spermës.Brillard20 raportoi se te pulat dhe gjelat, spermatozoidet migrojnë me lëvizje aktive nga hyrja vaginale, ku ruhen, në kryqëzimin utero-vaginal, ku ruhen.Megjithatë, kjo lëvizje nuk kërkohet ndërmjet kryqëzimit uterovaginal dhe infundibulumit, sepse spermatozoidet transportohen me zhvendosje pasive.Duke ditur këto rekomandime të mëparshme dhe rezultatet e marra në studimin aktual, mund të supozohet se aftësia e spermatozoideve për të lëvizur në rrjedhën e sipërme (reologjia) është një nga vetitë mbi të cilat bazohet procesi i përzgjedhjes.Kjo përcakton kalimin e spermatozoideve përmes vaginës dhe hyrjen e tyre në CCT për ruajtje.Siç sugjeroi Forman4, kjo mund të lehtësojë gjithashtu procesin e hyrjes së spermës në SST dhe habitatin e tij për një periudhë kohore dhe më pas daljen kur shpejtësia e tyre fillon të ngadalësohet.
Nga ana tjetër, Matsuzaki dhe Sasanami 21 sugjeruan që spermatozoidet e shpendëve t'i nënshtrohen ndryshimeve të lëvizshmërisë nga gjumi në lëvizshmëri në traktet riprodhuese të meshkujve dhe femrave.Frenimi i lëvizshmërisë së spermës rezidente në SST është propozuar për të shpjeguar kohën e gjatë të ruajtjes së spermës dhe më pas përtëritjen pas largimit nga SST.Në kushte hipoksi, Matsuzaki et al.1 raportoi prodhim dhe çlirim të lartë të laktatit në SST, gjë që mund të çojë në frenimin e lëvizshmërisë së spermës rezidente.Në këtë rast, rëndësia e reologjisë së spermës reflektohet në përzgjedhjen dhe përthithjen e spermatozoideve, dhe jo në ruajtjen e tyre.
Modeli i aglutinimit të spermës konsiderohet një shpjegim i besueshëm për periudhën e gjatë të ruajtjes së spermës në SST, pasi ky është një model i zakonshëm i mbajtjes së spermës në shpendë2,22,23.Bakst etj.2 vuri re se shumica e spermatozoideve ngjiteshin me njëri-tjetrin, duke formuar agregate fascikulare dhe spermatozoidet e vetme u gjetën rrallë në CCM të thëllëzave.Nga ana tjetër, Wen et al.24 vëzhguan më shumë spermatozoa të shpërndara dhe më pak tufa spermatozoidësh në lumenin SST te pulat.Bazuar në këto vëzhgime, mund të supozohet se prirja për aglutinim të spermës ndryshon midis zogjve dhe midis spermatozoideve në të njëjtin ejakulat.Përveç kësaj, Van Krey et al.9 sugjeroi që disociimi i rastësishëm i spermatozoideve të aglutinuar është përgjegjës për depërtimin gradual të spermatozoideve në lumenin e tubit fallopian.Sipas kësaj hipoteze, spermatozoidet me kapacitet më të ulët aglutinimi duhet të përjashtohen fillimisht nga SST.Në këtë kontekst, aftësia e spermatozoideve për t'u aglutinuar mund të jetë një faktor që ndikon në rezultatin e konkurrencës së spermës në zogjtë e pistë.Përveç kësaj, sa më gjatë të shkëputet sperma e aglutinuar, aq më gjatë ruhet fertiliteti.
Megjithëse grumbullimi dhe grumbullimi i spermatozoideve në tufa janë vërejtur në disa studime2,22,24, ato nuk janë përshkruar në detaje për shkak të kompleksitetit të vëzhgimit të tyre kinematik brenda SST.Janë bërë disa përpjekje për të studiuar aglutinimin e spermës in vitro.Një grumbullim i gjerë, por kalimtar u vu re kur teli i hollë u hoq nga pika e varur e farës.Kjo çon në faktin se një flluskë e zgjatur del nga rënia, duke imituar gjëndrën seminale.Për shkak të kufizimeve 3D dhe kohërave të shkurtra të tharjes me pika, i gjithë blloku ra shpejt në gjendje të keqe9.Në studimin aktual, duke përdorur pula Sharkashi dhe patate të skuqura mikrofluidike, ne ishim në gjendje të përshkruanim se si formohen këto tufa dhe si lëvizin ato.Tufat e spermës u formuan menjëherë pas mbledhjes së spermës dhe u zbuluan se lëviznin në një spirale, duke treguar reologji pozitive kur ishin të pranishme në rrjedhë.Për më tepër, kur shihen në mënyrë makroskopike, tufat e spermës janë vërejtur për të rritur linearitetin e lëvizshmërisë në krahasim me spermatozoidet e izoluara.Kjo sugjeron që aglutinimi i spermës mund të ndodhë përpara depërtimit të SST dhe se prodhimi i spermës nuk kufizohet në një zonë të vogël për shkak të stresit siç sugjerohet më parë (Tingari dhe Lake12).Gjatë formimit të tufës, spermatozoidet notojnë në sinkron derisa të formojnë një bashkim, pastaj bishti i tyre mbështillet rreth njëri-tjetrit dhe koka e spermatozoidit mbetet e lirë, por bishti dhe pjesa distale e spermatozoidit ngjiten së bashku me një substancë ngjitëse.Prandaj, koka e lirë e ligamentit është përgjegjëse për lëvizjen, duke tërhequr pjesën tjetër të ligamentit.Mikroskopi elektronik i skanimit të tufave të spermës tregoi kokat e spermës së bashkangjitur të mbuluara me shumë material ngjitës, duke sugjeruar se kokat e spermës ishin ngjitur në tufa pushimi, gjë që mund të ketë ndodhur pas arritjes së vendit të ruajtjes (SST).
Kur njollosja e spermës ngjyroset me akridine portokalli, materiali ngjitës jashtëqelizor rreth qelizave të spermës mund të shihet nën një mikroskop fluoreshent.Kjo substancë lejon që tufat e spermës të ngjiten dhe të ngjiten në çdo sipërfaqe ose grimcë përreth, në mënyrë që ato të mos lëvizin me rrjedhën përreth.Kështu, vëzhgimet tona tregojnë rolin e ngjitjes së spermatozoideve në formën e tufave të lëvizshme.Aftësia e tyre për të notuar kundër rrymës dhe për t'u ngjitur në sipërfaqet e afërta lejon që spermatozoidet të qëndrojnë më gjatë në SST.
Rothschild25 përdori një kamerë hemocitometrie për të studiuar shpërndarjen lundruese të spermës së gjedhit në një pikë pezullimi, duke marrë fotomikrografë përmes një kamere me bosht optik vertikal dhe horizontal të mikroskopit.Rezultatet treguan se spermatozoidet tërhiqeshin nga sipërfaqja e dhomës.Autorët sugjerojnë se mund të ketë ndërveprime hidrodinamike midis spermës dhe sipërfaqes.Duke marrë parasysh këtë, së bashku me aftësinë e spermës së pulës Sharkashi për të formuar tufa ngjitëse, mund të rrisë gjasat që sperma të ngjitet në murin SST dhe të ruhet për periudha të gjata kohore.
Bccetti dhe Afzeliu26 raportuan se glikokaliksi i spermës është i nevojshëm për njohjen dhe aglutinimin e gameteve.Forman10 vuri re se hidroliza e lidhjeve α-glikozidike në veshjet glikoproteinë-glikolipide duke trajtuar spermën e shpendëve me neuraminidazë rezultoi në ulje të pjellorisë pa ndikuar në lëvizshmërinë e spermës.Autorët sugjerojnë se efekti i neuraminidazës në glikokaliks dëmton sekuestrimin e spermës në kryqëzimin mitër-vaginal, duke reduktuar kështu fertilitetin.Vëzhgimet e tyre nuk mund të injorojnë mundësinë që trajtimi me neuraminidazë mund të zvogëlojë njohjen e spermës dhe ovociteve.Forman dhe Engel10 zbuluan se fertiliteti u zvogëlua kur pulat inseminoheshin në mënyrë intravaginale me spermë të trajtuar me neuraminidazë.Megjithatë, IVF me spermë të trajtuar me neuraminidazë nuk ndikoi në fertilitetin në krahasim me pulat e kontrollit.Autorët arritën në përfundimin se ndryshimet në shtresën glikoproteinë-glikolipide rreth membranës së spermës reduktuan aftësinë e spermës për t'u fekonduar duke dëmtuar sekuestrimin e spermës në kryqëzimin utero-vaginal, gjë që rriti humbjen e spermës për shkak të shpejtësisë së mitrës, pors-vaginale dhe nuk ndikon në lidhjen e saj.
Tek gjelat Bakst dhe Bauchan 11 gjetën fshikëza të vogla dhe fragmente membranash në lumenin e SST dhe vunë re se disa nga këto granula ishin shkrirë me membranën e spermës.Autorët sugjerojnë se këto marrëdhënie mund të kontribuojnë në ruajtjen afatgjatë të spermatozoideve në SST.Megjithatë, studiuesit nuk specifikuan burimin e këtyre grimcave, nëse ato sekretohen nga qelizat epiteliale CCT, prodhohen dhe sekretohen nga sistemi riprodhues mashkullor, apo prodhohen nga vetë sperma.Gjithashtu, këto grimca janë përgjegjëse për aglutinimin.Grützner et al27 raportuan se qelizat epiteliale epididymale prodhojnë dhe sekretojnë një proteinë specifike që kërkohet për formimin e trakteve seminale me një pore.Autorët raportojnë gjithashtu se shpërndarja e këtyre tufave varet nga ndërveprimi i proteinave epididymale.Nixon et al28 zbuluan se adnexa sekretojnë një proteinë, osteonektinën acidike të pasur me cisteinë;SPARC është i përfshirë në formimin e tufave të spermës në ekidnat me sqep të shkurtër dhe platipuset.Shpërndarja e këtyre rrezeve shoqërohet me humbjen e kësaj proteine.
Në studimin aktual, analiza ultrastrukturore duke përdorur mikroskopin elektronik tregoi se spermatozoidet ngjiteshin në një sasi të madhe materiali të dendur.Këto substanca mendohet se janë përgjegjëse për aglutinimin që kondensohet midis dhe rreth kokave ngjitëse, por në përqendrime më të ulëta në rajonin e bishtit.Supozojmë se kjo substancë aglutinuese ekskretohet nga sistemi riprodhues i mashkullit (epididymis ose vas deferens) së bashku me spermën, pasi shpesh vërejmë se sperma ndahet nga limfat dhe plazma seminale gjatë ejakulimit.Është raportuar se ndërsa spermatozoidet e shpendëve kalojnë nëpër epididymis dhe vas deferens, ato pësojnë ndryshime të lidhura me maturimin që mbështesin aftësinë e tyre për të lidhur proteinat dhe për të përvetësuar glikoproteinat e lidhura me lemat plazmatike.Persistenca e këtyre proteinave në membranat e spermës rezidente në SST sugjeron që këto proteina mund të ndikojnë në marrjen e stabilitetit të membranës së spermës 30 dhe të përcaktojnë pjellorinë e tyre 31 .Ahammad et al32 raportoi se spermatozoidet e marra nga pjesë të ndryshme të sistemit riprodhues mashkullor (nga testikujt deri te vas deferens distal) treguan një rritje progresive të qëndrueshmërisë në kushtet e ruajtjes së lëngjeve, pavarësisht nga temperatura e ruajtjes, dhe qëndrueshmëria te pulat rritet gjithashtu në tubat fallopiane pas mbarësimit artificial.
Tufat e spermës së pulës Sharkashi kanë karakteristika dhe funksione të ndryshme nga speciet e tjera si echidnas, platypuses, minjtë e drurit, minjtë e drerit dhe derrat gini.Tek pulat sharkasi, formimi i tufave të spermatozoideve uli shpejtësinë e tyre të notit në krahasim me spermatozoidet e vetme.Megjithatë, këto tufa rritën përqindjen e spermatozoideve reologjikisht pozitive dhe rritën aftësinë e spermatozoideve për të stabilizuar veten në një mjedis dinamik.Kështu, rezultatet tona konfirmojnë sugjerimin e mëparshëm se aglutinimi i spermës në SST shoqërohet me ruajtjen afatgjatë të spermës.Ne gjithashtu hipotezojmë se prirja e spermës për të formuar tufa mund të kontrollojë shkallën e humbjes së spermës në SST, e cila mund të ndryshojë rezultatin e konkurrencës së spermës.Sipas këtij supozimi, spermatozoidet me kapacitet të ulët aglutinimi lëshojnë fillimisht SST, ndërsa spermatozoidet me kapacitet të lartë aglutinimi prodhojnë pjesën më të madhe të pasardhësve.Formimi i tufave të spermës me një pore është i dobishëm dhe ndikon në raportin prind-fëmijë, por përdor një mekanizëm tjetër.Në echidnas dhe platypuses, spermatozoidet janë rregulluar paralelisht me njëri-tjetrin për të rritur shpejtësinë përpara të rrezes.Tufat e echidnas lëvizin rreth tre herë më shpejt se spermatozoidet e vetme.Besohet se formimi i tufave të tilla të spermës në echidnas është një përshtatje evolucionare për të ruajtur dominimin, pasi femrat janë të shthurura dhe zakonisht çiftëzohen me disa meshkuj.Prandaj, spermatozoidet nga ejakulatet e ndryshme konkurrojnë ashpër për fekondimin e vezës.
Spermatozoidet e aglutinuara të pulave sharkasi janë të lehta për t'u vizualizuar duke përdorur mikroskopin e kontrastit fazor, i cili konsiderohet i favorshëm sepse lejon studimin e lehtë të sjelljes së spermatozoideve in vitro.Mekanizmi me të cilin formimi i tufave të spermës nxit riprodhimin në pulat sharkasi është gjithashtu i ndryshëm nga ai që shihet në disa gjitarë placentarë që përfaqësojnë sjelljen bashkëpunuese të spermës, si minjtë e drurit, ku disa spermatozoa arrijnë te vezët, duke ndihmuar individët e tjerë të lidhur të arrijnë dhe dëmtojnë vezët e tyre.për të provuar veten.sjellje altruiste.Vetëfertilizimi 34. Një shembull tjetër i sjelljes bashkëpunuese në spermatozoidet u gjet te minjtë e drerit, ku spermatozoidet ishin në gjendje të identifikonin dhe kombinoheshin me spermatozoidet më të lidhura gjenetikisht dhe të formonin grupe bashkëpunuese për të rritur shpejtësinë e tyre në krahasim me spermatozoidet e palidhur35.
Rezultatet e marra në këtë studim nuk kundërshtojnë teorinë e Foman-it për ruajtjen afatgjatë të spermatozoideve në SWS.Studiuesit raportojnë se qelizat e spermës vazhdojnë të lëvizin në rrjedhën e qelizave epiteliale që rreshtojnë SST për një periudhë të gjatë kohore dhe pas një periudhe të caktuar kohore, rezervat e energjisë së qelizave të spermës janë varfëruar, duke rezultuar në një ulje të shpejtësisë, e cila lejon dëbimin e substancave me peshë të vogël molekulare.energjia e spermatozoideve me rrjedhjen e lëngut nga lumeni i SST Kaviteti i tubit fallopian.Në studimin aktual, ne vumë re se gjysma e spermatozoideve të vetme treguan aftësinë për të notuar kundër lëngjeve që rrjedhin dhe ngjitja e tyre në pako rriti aftësinë e tyre për të treguar reologji pozitive.Për më tepër, të dhënat tona janë në përputhje me ato të Matsuzaki et al.1 i cili raportoi se rritja e sekretimit të laktatit në SST mund të pengojë lëvizshmërinë e spermës rezidente.Sidoqoftë, rezultatet tona përshkruajnë formimin e ligamenteve lëvizëse të spermës dhe sjelljen e tyre reologjike në prani të një mjedisi dinamik brenda një mikrokanali në një përpjekje për të sqaruar sjelljen e tyre në SST.Hulumtimet e ardhshme mund të fokusohen në përcaktimin e përbërjes kimike dhe origjinës së agjentit aglutinues, gjë që padyshim do t'i ndihmojë studiuesit të zhvillojnë mënyra të reja për ruajtjen e spermës së lëngshme dhe rritjen e kohëzgjatjes së fertilitetit.
Pesëmbëdhjetë sharkasit meshkuj me qafë të zhveshur 30 javësh (dominant homozigot; Na Na) u zgjodhën si donatorë të spermës në studim.Zogjtë u rritën në Fermën Kërkimore të Shpendëve të Fakultetit të Bujqësisë, Universiteti Ashit, Guvernatori Ashit, Egjipt.Zogjtë u vendosën në kafaze individuale (30 x 40 x 40 cm), iu nënshtruan një programi drite (16 orë dritë dhe 8 orë errësirë) dhe ushqeheshin me një dietë që përmbante 160 g proteina të papërpunuara, 2800 kcal energji të metabolizueshme, 35 g kalcium secili.5 gram fosfor në dispozicion për kilogram dietë.
Sipas të dhënave 36, 37, sperma është mbledhur nga meshkujt me masazh abdominal.Gjithsej 45 mostra të spermës u mblodhën nga 15 meshkuj gjatë 3 ditëve.Sperma (n = 15/ditë) u hollua menjëherë 1:1 (v:v) me holluesin e spermës së shpendëve Belsville, i cili përmban difosfat kaliumi (1,27 g), monosodium glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozë (0,5 d) natrium anhidrik.acetat (0,43 g), tris (hidroksimetil) aminometan (0,195 g), monohidrat citrat kaliumi (0,064 g), monofosfat kaliumi (0,065 g), klorur magnezi (0,034 g) dhe H2O (100 ml, 30gmog, pH, 5,3m3, pH =Mostrat e holluara të spermës u ekzaminuan fillimisht nën një mikroskop të lehtë për të siguruar cilësi të mirë të spermës (lagështi) dhe më pas u ruajtën në një banjë uji në 37°C deri në përdorim brenda gjysmë ore pas grumbullimit.
Kinematika dhe reologjia e spermatozoideve përshkruhen duke përdorur një sistem pajisjesh mikrofluidike.Mostrat e spermës u holluan më tej në 1:40 në holluesin e spermës së shpendëve Beltsville, të ngarkuara në një pajisje mikrofluidike (shih më poshtë) dhe parametrat kinetikë u përcaktuan duke përdorur një sistem të kompjuterizuar të analizës së spermës (CASA) të zhvilluar më parë për karakterizimin e mikrofluidëve.mbi lëvizshmërinë e spermatozoideve në media të lëngshme (Departamenti i Inxhinierisë Mekanike, Fakulteti i Inxhinierisë, Universiteti Assiut, Egjipt).Shtojca mund të shkarkohet në: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.U matën shpejtësia e kurbës (VCL, μm/s), shpejtësia lineare (VSL, μm/s) dhe shpejtësia mesatare e trajektores (VAP, μm/s).Videot e spermatozoideve u morën duke përdorur një mikroskop kontrasti të përmbysur Optika XDS-3 (me objektiv 40x) të lidhur me një kamerë Tucson ISH1000 me 30 fps për 3 s.Përdorni softuerin CASA për të studiuar të paktën tre zona dhe 500 trajektore të spermës për mostër.Videoja e regjistruar u përpunua duke përdorur një CASA të bërë në shtëpi.Përkufizimi i lëvizshmërisë në shtojcën CASA bazohet në shpejtësinë e notit të spermatozoidit në krahasim me shpejtësinë e rrjedhjes dhe nuk përfshin parametra të tjerë si lëvizja anash, pasi kjo është gjetur të jetë më e besueshme në rrjedhën e lëngjeve.Lëvizja reologjike përshkruhet si lëvizja e qelizave të spermës kundër drejtimit të rrjedhës së lëngut.Spermatozoidet me veti reologjike ndaheshin me numrin e spermatozoideve te levizshme;spermatozoidet që ishin në qetësi dhe spermatozoidet që lëviznin në mënyrë konvektive u përjashtuan nga numërimi.
Të gjitha kimikatet e përdorura janë marrë nga Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egjipt) përveç nëse shënohet ndryshe.Pajisja u prodhua siç përshkruhet nga El-sherry et al.40 me disa modifikime.Materialet e përdorura për fabrikimin e mikrokanaleve përfshinin pllaka qelqi (Howard Glass, Worcester, MA), rezistent negativ SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkool diaceton (Sigma Aldrich, Steinheim, Gjermani) dhe poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanalet prodhohen duke përdorur litografi të butë.Së pari, një maskë e pastër mbrojtëse e fytyrës me dizajnin e dëshiruar të mikrokanalit u printua në një printer me rezolucion të lartë (Prismatic, Kairo, Egjipt dhe Pacific Arts and Design, Markham, ON).Mjeshtrat u bënë duke përdorur pllaka qelqi si nënshtresa.Pllakat u pastruan në aceton, izopropanol dhe ujë të dejonizuar dhe më pas u mbuluan me një shtresë 20 µm SU8-25 me mbështjellje rrotullimi (3000 rpm, 1 min).Shtresat SU-8 më pas u thanë butësisht (65°C, 2 min dhe 95°C, 10 min) dhe u ekspozuan ndaj rrezatimit UV për 50 s.Piqni pas ekspozimit në 65°C dhe 95°C për 1 min e 4 min për të lidhur shtresat e ekspozuara SU-8, e ndjekur nga zhvillimi në alkool diacetoni për 6,5 min.Piqni fort vaflet (200°C për 15 min) për të ngurtësuar më tej shtresën SU-8.
PDMS u përgatit duke përzier monomerin dhe ngurtësuesin në një raport peshe 10:1, më pas u degazua në një tharëse vakum dhe u derdh në kornizën kryesore SU-8.PDMS u tha në një furrë (120°C, 30 min), më pas kanalet u prenë, u ndanë nga masteri dhe u shpuan për të lejuar që tubat të ngjiteshin në hyrjen dhe daljen e mikrokanalit.Më në fund, mikrokanalet PDMS u ngjitën përgjithmonë në rrëshqitjet e mikroskopit duke përdorur një procesor portativ të koronës (Electro-Technic Products, Chicago, IL) siç përshkruhet diku tjetër.Mikrokanali i përdorur në këtë studim ka përmasa 200 µm × 20 µm (W × H) dhe është i gjatë 3,6 cm.
Rrjedha e lëngut e shkaktuar nga presioni hidrostatik brenda mikrokanalit arrihet duke ruajtur nivelin e lëngut në rezervuarin e hyrjes mbi diferencën e lartësisë Δh39 në rezervuarin e daljes (Fig. 1).
ku f është koeficienti i fërkimit, i përcaktuar si f = C/Re për rrjedhën laminare në një kanal drejtkëndor, ku C është një konstante në varësi të raportit të pamjes së kanalit, L është gjatësia e mikrokanalit, Vav është shpejtësia mesatare brenda mikrokanalit, Dh është diametri hidraulik i kanalit, g – nxitimi i gravit.Duke përdorur këtë ekuacion, shpejtësia mesatare e kanalit mund të llogaritet duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm: