Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta paraqesim faqen pa stile dhe JavaScript.
Pjelloria e zogjve varet nga aftësia e tyre për të ruajtur mjaftueshëm spermë të qëndrueshme për një periudhë të zgjatur kohore në tubulat e ruajtjes së spermës (SST). Mekanizmi i saktë me të cilin spermatozoidët hyjnë, qëndrojnë në dhe dalin nga SST mbetet i diskutueshëm. Spermatozoidet e pulave sharkasi treguan një tendencë të lartë për aglutinim, duke formuar tufa filamentoze të lëvizshme që përmbajnë shumë qeliza. Për shkak të vështirësisë së vëzhgimit të lëvizshmërisë dhe sjelljes së spermatozoideve në një tub fallopian të errët, ne përdorëm një pajisje mikrofluidike me një prerje tërthore mikrokanali të ngjashme me atë të spermatozoideve për të studiuar aglutinimin dhe lëvizshmërinë e spermatozoideve. Ky studim diskuton se si formohen tufat e spermës, si lëvizin ato dhe rolin e tyre të mundshëm në zgjatjen e qëndrimit të spermës në SST. Ne hetuam shpejtësinë e spermës dhe sjelljen reologjike kur rrjedha e lëngjeve gjenerohej brenda një kanali mikrofluidik nga presioni hidrostatik (shkalla e rrjedhjes = 33 µm/s). Spermatozoidët kanë tendencë të notojnë kundër rrymës (reologji pozitive) dhe shpejtësia e tufës së spermatozoideve është dukshëm e reduktuar në krahasim me spermatozoidet e vetme. Tufat e spermës janë vërejtur të lëvizin në spirale dhe të rriten në gjatësi dhe trashësi ndërsa rekrutohen më shumë spermë të vetme. Tufat e spermës u vunë re duke u afruar dhe duke u ngjitur në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur përfshirjen me shpejtësi rrjedhjeje të lëngut > 33 µm/s. Tufat e spermës u vunë re duke u afruar dhe duke u ngjitur në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur përfshirjen me shpejtësi rrjedhjeje të lëngut > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Është vërejtur se tufat e spermës afrohen dhe ngjiten në muret anësore të kanaleve mikrofluidike për të shmangur rrëmbimin me shpejtësi rrjedhjeje lëngu >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 μm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Është vërejtur se tufat e spermës afrohen dhe ngjiten në muret anësore të kanalit mikrofluidik për të shmangur rrëmbimin nga rrjedha e lëngjeve me shpejtësi >33 µm/s.Mikroskopia elektronike skanuese dhe transmetuese zbuloi se tufat e spermës mbështeteshin nga material i bollshëm dhe i dendur. Të dhënat e marra demonstrojnë lëvizshmërinë unike të spermatozoideve të pulës Sharkazi, si dhe aftësinë e spermatozoideve për t'u aglutinuar dhe për të formuar tufa të lëvizshme, gjë që kontribuon në një kuptim më të mirë të ruajtjes afatgjatë të spermatozoideve në SMT.
Për të arritur fekondimin tek njerëzit dhe shumica e kafshëve, spermatozoidet dhe vezët duhet të mbërrijnë në vendin e fekondimit në kohën e duhur. Prandaj, çiftëzimi duhet të ndodhë para ose në kohën e ovulimit. Nga ana tjetër, disa gjitarë, siç janë qentë, si dhe speciet jo-gjitarë, siç janë insektet, peshqit, zvarranikët dhe zogjtë, e ruajnë spermën në organet e tyre riprodhuese për një periudhë të zgjatur kohore derisa vezët e tyre të jenë gati për fekondim (fekondim asinkron 1 ). Zogjtë janë në gjendje të ruajnë qëndrueshmërinë e spermatozoideve të afta për të fekonduar vezë për 2-10 javë 2.
Ky është një tipar unik që i dallon zogjtë nga kafshët e tjera, pasi siguron një probabilitet të lartë fekondimi pas një inseminimi të vetëm për disa javë pa çiftëzim dhe ovulim të njëkohshëm. Organi kryesor i ruajtjes së spermës, i quajtur tubuli i ruajtjes së spermës (SST), ndodhet në palosjet e brendshme mukozale në kryqëzimin uterovaginal. Deri më sot, mekanizmat me të cilët spermatozoidet hyjnë, qëndrojnë dhe dalin nga banka e spermës nuk janë kuptuar plotësisht. Bazuar në studimet e mëparshme, janë paraqitur shumë hipoteza, por asnjëra prej tyre nuk është konfirmuar.
Forman4 hipotezoi se spermatozoidët ruajnë vendbanimin e tyre në zgavrën SST përmes lëvizjes së vazhdueshme osciluese kundër drejtimit të rrjedhës së lëngjeve përmes kanaleve të proteinave të vendosura në qelizat epiteliale të SST (reologjia). ATP pakësohet për shkak të aktivitetit të vazhdueshëm flagjelar të nevojshëm për të mbajtur spermatozoidet në lumenin e SST dhe lëvizshmëria përfundimisht bie derisa spermatozoidet të nxirren nga banka e spermës nga rrjedha e lëngjeve dhe të fillojnë një udhëtim të ri poshtë tubit fallopian ngjitës për të fekonduar spermatozoidet. Vezë (Forman4). Ky model i ruajtjes së spermës mbështetet nga zbulimi me anë të imunocitokimisë i akuaporinave 2, 3 dhe 9 të pranishme në qelizat epiteliale të SST. Deri më sot, mungojnë studime mbi reologjinë e spermës së pulave dhe rolin e saj në ruajtjen e SST, përzgjedhjen e spermës vaginale dhe konkurrencën e spermës. Tek pulat, spermatozoidet hyjnë në vaginë pas çiftëzimit natyror, por më shumë se 80% e spermatozoideve nxirren nga vagina menjëherë pas çiftëzimit. Kjo sugjeron që vagina është vendi kryesor për përzgjedhjen e spermës tek zogjtë. Përveç kësaj, është raportuar se më pak se 1% e spermatozoideve të fekonduara në vaginë përfundojnë në SST2. Në inseminimin artificial të pulave në vaginë, numri i spermatozoideve që arrijnë SST tenton të rritet 24 orë pas inseminimit. Deri më tani, mekanizmi i përzgjedhjes së spermës gjatë këtij procesi është i paqartë, dhe lëvizshmëria e spermës mund të luajë një rol të rëndësishëm në thithjen e spermës nga SST. Për shkak të mureve të trasha dhe të errëta të tubave fallopiane, është e vështirë të monitorohet drejtpërdrejt lëvizshmëria e spermës në tubat fallopiane të zogjve. Prandaj, na mungojnë njohuritë bazë se si spermatozoidet kalojnë në SST pas fekondimit.
Reologjia është njohur kohët e fundit si një faktor i rëndësishëm që kontrollon transportin e spermës në organet gjenitale të gjitarëve. Bazuar në aftësinë e spermatozoideve lëvizëse për të migruar në drejtim të kundërt me rrymën, Zaferani et al.8 përdorën një sistem mikrofluidik corra për të izoluar në mënyrë pasive spermatozoidet lëvizëse nga mostrat e spermës së shtypur. Ky lloj klasifikimi i spermës është thelbësor për trajtimin mjekësor të infertilitetit dhe kërkimin klinik, dhe preferohet ndaj metodave tradicionale që kërkojnë kohë dhe punë intensive dhe mund të kompromentojnë morfologjinë dhe integritetin strukturor të spermës. Megjithatë, deri më sot, nuk janë kryer studime mbi efektin e sekrecioneve nga organet gjenitale të pulave në lëvizshmërinë e spermës.
Pavarësisht mekanizmit që mban spermatozoidet të ruajtura në SST, shumë studiues kanë vërejtur se spermatozoidet rezidente aglutinohen kokë më kokë në SST të pulave 9, 10, shkurtave 2 dhe gjelave 11 për të formuar tufa të aglutinuara të spermës. Autorët sugjerojnë se ekziston një lidhje midis këtij aglutinimi dhe ruajtjes afatgjatë të spermatozoideve në SST.
Tingari dhe Lake12 raportuan një lidhje të fortë midis spermatozoideve në gjëndrën marrëse të spermës së pulës dhe vunë në dyshim nëse spermatozoidet e shpendëve aglutinohen në të njëjtën mënyrë si spermatozoidet e gjitarëve. Ata besojnë se lidhjet e thella midis spermatozoideve në vas deferens mund të jenë për shkak të stresit të shkaktuar nga prania e një numri të madh spermatozoidesh në një hapësirë ​​të vogël.
Gjatë vlerësimit të sjelljes së spermatozoideve në laminat e qelqit të varur të freskët, mund të shihen shenja kalimtare të aglutinimit, veçanërisht në skajet e pikave të spermës. Megjithatë, aglutinimi shpesh shqetësohej nga veprimi rrotullues i shoqëruar me lëvizjen e vazhdueshme, gjë që shpjegon natyrën kalimtare të këtij fenomeni. Studiuesit vunë re gjithashtu se kur holluesi i shtohej spermës, shfaqeshin agregate qelizash të zgjatura "si fije".
Përpjekjet e hershme për të imituar një spermatozoid u bënë duke hequr një tel të hollë nga një pikë varëse, gjë që rezultoi në një fshikëz të zgjatur të ngjashme me spermatozoidin që dilte nga pika e spermës. Spermatozoidët u rreshtuan menjëherë në një mënyrë paralele brenda fshikëzës, por e gjithë njësia u zhduk shpejt për shkak të kufizimit 3D. Prandaj, për të studiuar aglutinimin e spermatozoideve, është e nevojshme të vëzhgohet lëvizshmëria dhe sjellja e spermatozoideve direkt në tuba të izoluara të magazinimit të spermës, gjë që është e vështirë të arrihet. Prandaj, është e nevojshme të zhvillohet një instrument që imiton spermatozoidet për të mbështetur studimet e lëvizshmërisë së spermës dhe sjelljes së aglutinimit. Brillard et al13 raportuan se gjatësia mesatare e tubave të magazinimit të spermës tek zogjtë e rritur është 400-600 µm, por disa SST mund të jenë deri në 2000 µm. Mero dhe Ogasawara14 i ndanë gjëndrat seminifere në tubula të zgjeruara dhe jo të zgjeruara për ruajtjen e spermës, të dyja të njëjta në gjatësi (~500 µm) dhe gjerësi qafe (~38 µm), por diametri mesatar i lumenit të tubujve ishte 56.6 dhe 56.6 µm. . , përkatësisht 11.2 μm. Në studimin aktual, ne përdorëm një pajisje mikrofluidike me një madhësi kanali prej 200 µm × 20 µm (Gjerësi × Lartësi), prerja tërthore e së cilës është disi e afërt me atë të SST-së së amplifikuar. Përveç kësaj, ne shqyrtuam lëvizshmërinë e spermës dhe sjelljen e aglutinimit në lëngun që rrjedh, gjë që është në përputhje me hipotezën e Foreman se lëngu i prodhuar nga qelizat epiteliale SST i mban spermatozoidet në lumen në një drejtim kundërrrjedhës (reologjik).
Qëllimi i këtij studimi ishte kapërcimi i problemeve të vëzhgimit të lëvizshmërisë së spermatozoideve në tubën fallopiane dhe shmangia e vështirësive të studimit të reologjisë dhe sjelljes së spermatozoideve në një mjedis dinamik. U përdor një pajisje mikrofluidike që krijon presion hidrostatik për të simuluar lëvizshmërinë e spermës në organet gjenitale të një pule.
Kur një pikë e një mostre të holluar sperme (1:40) u ngarkua në pajisjen e mikrokanalit, mund të identifikoheshin dy lloje lëvizshmërie të spermës (spermë e izoluar dhe spermë e lidhur). Përveç kësaj, spermatozoidët kishin tendencë të notonin kundër rrymës (reologji pozitive; video 1, 2). Edhe pse tufat e spermës kishin shpejtësi më të ulët se ajo e spermës së vetmuar (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermës që shfaqte reotaksë pozitive (p < 0,001; Tabela 2). Edhe pse tufat e spermës kishin shpejtësi më të ulët se ajo e spermës së vetmuar (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermës që shfaqte reotaksë pozitive (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки spermatozoidov emërtohen më shumë se shpejt, чем у gonochnыh spermatozoidov (p < 0,001), они uvelichivali procent spermatozoidov, demonstriruющих poложительный reotaxis (p < 0,001; Edhe pse tufat e spermatozoideve kishin një shpejtësi më të ulët se ajo e spermatozoideve të vetme (p < 0,001), ato rritën përqindjen e spermatozoideve që tregonin reotaksë pozitive (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p <0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显独 阾 度百分比 (p <0,001 ； 2……………………………………..) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент на сперматозоидов положительной реологией (p < 0,001; tab 2). Edhe pse shpejtësia e tufave të spermës ishte më e ulët se ajo e spermatozoideve të vetme (p < 0.001), ato rritën përqindjen e spermatozoideve me reologji pozitive (p < 0.001; Tabela 2).Reologjia pozitive për spermatozoidet e vetme dhe tufat vlerësohet në afërsisht 53% dhe 85%, përkatësisht.
Është vërejtur se spermatozoidet e pulave sharkasi menjëherë pas ejakulimit formojnë tufa lineare, të përbëra nga dhjetëra individë. Këto tufa rriten në gjatësi dhe trashësi me kalimin e kohës dhe mund të qëndrojnë in vitro për disa orë para se të shpërndahen (video 3). Këto tufa filamentoze kanë formën e spermatozoideve të echidnës që formohen në fund të epididimit. Sperma e pulës sharkashi është gjetur të ketë një tendencë të lartë për t'u aglutinuar dhe për të formuar një tufë rrjetëzore në më pak se një minutë pas mbledhjes. Këto tufa janë dinamike dhe të afta të ngjiten në çdo mur ose objekt statik aty pranë. Megjithëse tufat e spermës zvogëlojnë shpejtësinë e qelizave të spermës, është e qartë se makroskopikisht ato rrisin linearitetin e tyre. Gjatësia e tufave ndryshon në varësi të numrit të spermatozoideve të mbledhura në tufa. Dy pjesë të tufës u izoluan: pjesa fillestare, duke përfshirë kokën e lirë të spermës së aglutinuar, dhe pjesa terminale, duke përfshirë bishtin dhe të gjithë skajin distal të spermës. Duke përdorur një kamerë me shpejtësi të lartë (950 fps), në pjesën fillestare të tufës u vunë re koka të lira të spermatozoideve të aglutinuar, përgjegjëse për lëvizjen e tufës për shkak të lëvizjes së tyre osciluese, duke i tërhequr ato të mbetura në tufë me një lëvizje helikoidale (Video 4). Megjithatë, në tufat e gjata, është vërejtur se disa koka të lira të spermatozoideve janë ngjitur në trup dhe pjesa terminale e tufës veprojnë si fletë për të ndihmuar në shtytjen e tufës.
Ndërsa ndodhen në një rrjedhë të ngadaltë lëngu, tufat e spermatozoideve lëvizin paralel me njëra-tjetrën, megjithatë, ato fillojnë të mbivendosen dhe të ngjiten në çdo gjë që është e palëvizshme, në mënyrë që të mos lahen nga rrjedha e rrymës ndërsa shpejtësia e rrjedhës rritet. Tufat formohen kur një grusht qelizash spermatozoidesh i afrohen njëra-tjetrës, ato fillojnë të lëvizin në sinkron dhe mbështillen rreth njëra-tjetrës, dhe pastaj ngjiten në një substancë ngjitëse. Figurat 1 dhe 2 tregojnë se si spermatozoidet i afrohen njëri-tjetrit, duke formuar një kryqëzim ndërsa bishtat mbështillen rreth njëri-tjetrit.
Studiuesit aplikuan presion hidrostatik për të krijuar rrjedhje lëngu në një mikrokanal për të studiuar reologjinë e spermës. U përdor një mikrokanal me madhësi 200 µm × 20 µm (Gjerësi × Lartësi) dhe gjatësi 3.6 µm. Përdorni mikrokanale midis enëve me shiringa të vendosura në skajet. U përdor ngjyrues ushqimor për t'i bërë kanalet më të dukshme.
Lidhni kabllot dhe aksesorët e ndërlidhjes në mur. Videoja është xhiruar me një mikroskop me kontrast faze. Me çdo imazh, paraqiten mikroskopia me kontrast faze dhe imazhet e hartëzimit. (A) Lidhja midis dy rrjedhave i reziston rrjedhës për shkak të lëvizjes helikoidale (shigjeta e kuqe). (B) Lidhja midis tufës së tubit dhe murit të kanalit (shigjetat e kuqe), në të njëjtën kohë ato janë të lidhura me dy tufa të tjera (shigjetat e verdha). (C) Tufat e spermës në kanalin mikrofluidik fillojnë të lidhen me njëra-tjetrën (shigjetat e kuqe), duke formuar një rrjetë tufash sperme. (D) Formimi i një rrjeti tufash sperme.
Kur një pikë sperme e holluar u ngarkua në pajisjen mikrofluidike dhe u krijua një rrjedhë, u vu re se rrezja e spermës lëvizte kundër drejtimit të rrjedhës. Tufat përshtaten mirë me muret e mikrokanaleve, dhe kokat e lira në pjesën fillestare të tufave përshtaten mirë me to (video 5). Ato gjithashtu ngjiten në çdo grimcë të palëvizshme në rrugën e tyre, siç janë mbeturinat, për t'i rezistuar rrëmbimit nga rryma. Me kalimin e kohës, këto tufa bëhen filamente të gjata që bllokojnë spermatozoidë të tjerë të vetëm dhe tufa më të shkurtra (Video 6). Ndërsa rrjedha fillon të ngadalësohet, linjat e gjata të spermës fillojnë të formojnë një rrjet linjash sperme (Video 7; Figura 2).
Në shpejtësi të lartë të rrjedhjes (V > 33 µm/s), lëvizjet spirale të fijeve rriten si një përpjekje për të kapur shumë tufa individuale spermatozoidesh që formojnë, të cilat i rezistojnë më mirë forcës lëvizëse të rrjedhës. Në shpejtësi të lartë të rrjedhjes (V > 33 µm/s), lëvizjet spirale të fijeve rriten si një përpjekje për të kapur shumë tufa individuale spermatozoidesh që formojnë, të cilat i rezistojnë më mirë forcës lëvizëse të rrjedhës. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных spermatozoidov, образующишейдреусечки, силе потока. Në shpejtësi të larta rrjedhjeje (V > 33 µm/s), lëvizjet helikoidale të fijeve rriten ndërsa ato përpiqen të kapin shumë spermatozoidë individualë duke formuar tufa që janë më të afta t'i rezistojnë forcës lëvizëse të rrjedhës.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 μm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。... При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих путочки, чтобьщих путочки, чтобьщий лучь. Në shpejtësi të larta rrjedhjeje (V > 33 µm/s), lëvizja helikoidale e filamenteve rritet në një përpjekje për të kapur shumë spermatozoidë individualë që formojnë tufa për t'i rezistuar më mirë forcave të zhvendosjes së rrjedhës.Ata gjithashtu u përpoqën të bashkëngjitnin mikrokanale në muret anësore.
Tufat e spermës u identifikuan si grumbuj kokash sperme dhe bishtash të përdredhur duke përdorur mikroskopinë me dritë (LM). Tufat e spermës me agregate të ndryshme janë identifikuar gjithashtu si koka të përdredhura dhe agregate flagjelare, bishta të shumëfishta sperme të shkrirë, koka sperme të bashkangjitura në një bisht dhe koka sperme me bërthama të përkulura si bërthama të shumëfishta të shkrirë. Mikroskopi elektronike transmetuese (TEM). Mikroskopia elektronike skanuese (SEM) tregoi se tufat e spermës ishin agregate të mbështjella të kokave të spermës dhe agregatet e spermës treguan një rrjet të bashkangjitur bishtash të mbështjellë.
Morfologjia dhe ultrastruktura e spermatozoideve, formimi i tufave të spermatozoideve u studiuan duke përdorur mikroskopinë me dritë (gjysmë prerje), mikroskopinë elektronike skanuese (SEM) dhe mikroskopinë elektronike transmetuese (TEM), njollat ​​e spermës u ngjyrosën me portokalli akridine dhe u ekzaminuan duke përdorur mikroskopinë epifluoreshente.
Ngjyrosja e njollave të spermës me portokalli akridine (Fig. 3B) tregoi se kokat e spermatozoideve ishin të ngjitura së bashku dhe të mbuluara me material sekretues, gjë që çoi në formimin e tufave të mëdha (Fig. 3D). Tufat e spermës përbëheshin nga agregate spermatozoidesh me një rrjet bishtash të bashkangjitur (Fig. 4A-C). Tufat e spermës përbëhen nga bishtat e shumë spermatozoideve të ngjitura së bashku (Fig. 4D). Sekretet (Fig. 4E,F) mbulonin kokat e tufave të spermatozoideve.
Formimi i tufës së spermatozoideve. Duke përdorur mikroskopinë me kontrast fazor dhe njollat ​​e spermës me ngjyrë portokalli akridine, u tregua se kokat e spermatozoideve ngjiten së bashku. (A) Formimi i hershëm i tufës së spermës fillon me një spermë (rreth të bardhë) dhe tre spermë (rreth të verdhë), me spiralen që fillon nga bishti dhe mbaron në kokë. (B) Fotomikrografi e një njolle sperme të ngjyrosur me ngjyrë portokalli akridine që tregon kokat e spermës ngjitëse (shigjeta). Shkarkimi mbulon kokën/kokat. Zmadhimi × 1000. (C) Zhvillimi i një rrezeje të madhe të transportuar nga rrjedha në një kanal mikrofluidik (duke përdorur një kamerë me shpejtësi të lartë në 950 fps). (D) Mikrografi e një njolle sperme të ngjyrosur me ngjyrë portokalli akridine që tregon tufa të mëdha (shigjeta). Zmadhimi: ×200.
Mikrografi elektronike skanuese e një tufe sperme dhe një shpëlarjeje sperme të ngjyrosur me portokalli akridine. (A, B, D, E) janë mikrografi elektronike skanuese dixhitale me ngjyra të spermatozoideve, dhe C dhe F janë mikrografi të shpëlarjeve të spermës të ngjyrosura me portokalli akridine që tregojnë ngjitjen e spermatozoideve të shumëfishta që mbështjellin rrjetën kaudale. (AC) Agregimet e spermës tregohen si një rrjet bishtash të bashkangjitur (shigjeta). (D) Ngjitja e disa spermatozoideve (me substancë ngjitëse, skicë rozë, shigjetë) që mbështjellin bishtin. (E dhe F) Agregime të kokës së spermës (treguesa) të mbuluara me material ngjitës (treguesa). Spermatozoidet formuan tufa me disa struktura të ngjashme me vorbullën (F). (C) zmadhime ×400 dhe (F) zmadhime ×200.
Duke përdorur mikroskopinë elektronike transmetuese, zbuluam se tufat e spermatozoideve kishin bishta të bashkangjitur (Fig. 6A, C), koka të bashkangjitura në bishta (Fig. 6B) ose koka të bashkangjitura në bishta (Fig. 6D). Kokat e spermatozoideve në tufë janë të lakuara, duke paraqitur në prerje dy rajone bërthamore (Fig. 6D). Në tufën e prerjes, spermatozoidet kishin një kokë të përdredhur me dy rajone bërthamore dhe rajone të shumëfishta flagjelare (Fig. 5A).
Mikrografi elektronike dixhitale me ngjyra që tregon bishtat lidhës në tufën e spermës dhe materialin aglutinues që lidh kokat e spermës. (A) Bishti i bashkangjitur i një numri të madh spermatozoidesh. Vini re se si duket bishti si në projeksionet portret (shigjetë) ashtu edhe në ato peizazhore (shigjetë). (B) Koka (shigjeta) e spermës është e lidhur me bishtin (shigjetë). (C) Disa bishta të spermës (shigjeta) janë të bashkangjitura. (D) Materiali i aglutinimit (AS, blu) lidh katër koka të spermës (vjollcë).
Mikroskopia elektronike skanuese u përdor për të zbuluar kokat e spermës në tufat e spermës të mbuluara me sekrecione ose membrana (Figura 6B), duke treguar se tufat e spermës ishin të ankoruara nga materiali jashtëqelizor. Materiali i aglutinuar u përqendrua në kokën e spermës (montim i ngjashëm me kokën e kandilës; Fig. 5B) dhe u zgjerua distalisht, duke dhënë një pamje të verdhë të shkëlqyer nën mikroskopinë fluoreshente kur u ngjyros me portokalli akridine (Fig. 6C). Kjo substancë është qartë e dukshme nën një mikroskop skanues dhe konsiderohet si një lidhës. Seksionet gjysmë të holla (Fig. 5C) dhe njollat ​​e spermës të ngjyrosura me portokalli akridine treguan tufa sperme që përmbanin koka të dendura dhe bishta të përdredhura (Fig. 5D).
Fotomikrografi të ndryshme që tregojnë grumbullimin e kokave të spermatozoideve dhe bishtave të palosur duke përdorur metoda të ndryshme. (A) Mikrografi elektronike dixhitale me transmetim me ngjyra në prerje tërthore e një tufe spermatozoidesh që tregon një kokë spermatozoidesh të mbështjellë me një bërthamë dypjesëshe (blu) dhe disa pjesë flagjelare (jeshile). (B) Mikrografi elektronike dixhitale me skanim me ngjyra që tregon një grumbull kokash spermatozoidesh të ngjashme me kandil deti (shigjeta) që duket se janë të mbuluara. (C) Seksion gjysmë i hollë që tregon koka spermatozoidesh të grumbulluara (shigjeta) dhe bishta të përdredhur (shigjeta). (D) Mikrografi e një njolle sperme të ngjyrosur me portokalli akridine që tregon grumbullime të kokave të spermatozoideve (shigjeta) dhe bishta të përdredhur ngjitës (shigjeta). Vini re se një substancë ngjitëse (S) mbulon kokën e spermatozoideve. (D) Zmadhim × 1000.
Duke përdorur mikroskopinë elektronike transmetuese (Fig. 7A), u vu re gjithashtu se kokat e spermatozoideve ishin të përdredhura dhe bërthamat kishin një formë spirale, siç u konfirmua nga njollat ​​e spermës të ngjyrosura me portokalli akridine dhe të ekzaminuara duke përdorur mikroskopinë fluoreshente (Fig. 7B).
(A) Mikrografi dixhitale elektronike me transmetim me ngjyra dhe (B) Njollë sperme e ngjyrosur me portokalli akridine që tregon kokat e mbështjella dhe ngjitjen e kokave dhe bishtave të spermës (shigjeta). (B) Zmadhim × 1000.
Një zbulim interesant është se spermatozoidet e Sharkazit grumbullohen për të formuar tufa filamentoze të lëvizshme. Vetitë e këtyre tufave na lejojnë të kuptojmë rolin e tyre të mundshëm në thithjen dhe ruajtjen e spermatozoideve në SST.
Pas çiftëzimit, spermatozoidet hyjnë në vaginë dhe i nënshtrohen një procesi intensiv përzgjedhjeje, duke rezultuar në vetëm një numër të kufizuar spermatozoidesh që hyjnë në SST15,16. Deri më sot, mekanizmat me të cilët spermatozoidet hyjnë dhe dalin nga SST janë të paqarta. Tek shpendët, spermatozoidet ruhen në SST për një periudhë të zgjatur prej 2 deri në 10 javë, varësisht nga speciet6. Mbeten polemika në lidhje me gjendjen e spermës gjatë ruajtjes në SST. A janë ato në lëvizje apo në qetësi? Me fjalë të tjera, si e ruajnë spermatozoidet pozicionin e tyre në SST për kaq gjatë?
Forman4 sugjeroi që qëndrimi dhe nxjerrja e SST mund të shpjegohet në terma të lëvizshmërisë së spermës. Autorët hipotetizojnë se spermatozoidet e ruajnë pozicionin e tyre duke notuar kundër rrjedhës së lëngjeve të krijuar nga epiteli SST dhe se spermatozoidet nxirren nga SST kur shpejtësia e tyre bie nën pikën në të cilën ato fillojnë të lëvizin prapa për shkak të mungesës së energjisë. Zaniboni5 konfirmoi praninë e akuaporinave 2, 3 dhe 9 në pjesën apikale të qelizave epiteliale SST, të cilat mund të mbështesin indirekt modelin e ruajtjes së spermës së Foreman. Në studimin aktual, zbuluam se pothuajse gjysma e spermatozoideve të Sharkashi tregojnë reologji pozitive në lëngun që rrjedh, dhe se tufat e spermës së aglutinuar rrisin numrin e spermatozoideve që tregojnë reologji pozitive, megjithëse aglutinimi i ngadalëson ato. Mënyra se si spermatozoidet udhëtojnë lart në tubin fallopian të shpendëve deri në vendin e fekondimit nuk është kuptuar plotësisht. Tek gjitarët, lëngu folikular kemoatraktues i tërheq spermatozoidet. Megjithatë, besohet se kemoatraktuesit i drejtojnë spermatozoidet drejt distancave të gjata7. Prandaj, mekanizma të tjerë janë përgjegjës për transportin e spermës. Aftësia e spermës për t'u orientuar dhe për të rrjedhur kundër lëngut të tubave fallopiane të lëshuar pas çiftëzimit është raportuar të jetë një faktor kryesor në synimin e spermës tek minjtë. Parker 17 sugjeroi që spermatozoidët kalojnë oviduktet duke notuar kundër rrymës ciliare tek zogjtë dhe zvarranikët. Edhe pse nuk është demonstruar eksperimentalisht tek zogjtë, Adolphi18 ishte i pari që zbuloi se sperma e shpendëve jep rezultate pozitive kur një shtresë e hollë lëngu midis një mbulese dhe rrëshqitëses krijohet me një shirit letre filtri. Reologjia. Hino dhe Yanagimachi [19] vendosën një kompleks vezor-tubal-uterinë të miut në një unazë perfuzioni dhe injektuan 1 µl bojë në istmus për të vizualizuar rrjedhën e lëngjeve në tubat fallopiane. Ata vunë re një lëvizje shumë aktive të tkurrjes dhe relaksimit në tubën fallopiane, në të cilën të gjitha topat e bojës lëviznin vazhdimisht drejt ampulës së tubave fallopiane. Autorët theksojnë rëndësinë e rrjedhës së lëngjeve tubale nga tubat fallopiane të poshtme në ato të sipërme për ngritjen dhe fekondimin e spermës. Brillard20 raportoi se te pulat dhe gjelat, spermatozoidet migrojnë me lëvizje aktive nga hyrja vaginale, ku ruhen, në kryqëzimin utero-vaginal, ku ruhen. Megjithatë, kjo lëvizje nuk kërkohet midis kryqëzimit utero-vaginal dhe infundibulumit sepse spermatozoidet transportohen me zhvendosje pasive. Duke ditur këto rekomandime të mëparshme dhe rezultatet e marra në studimin aktual, mund të supozohet se aftësia e spermatozoideve për të lëvizur lart (reologjia) është një nga vetitë në të cilat bazohet procesi i përzgjedhjes. Kjo përcakton kalimin e spermatozoideve nëpër vaginë dhe hyrjen e tyre në CCT për ruajtje. Siç sugjeroi Forman4, kjo gjithashtu mund të lehtësojë procesin e hyrjes së spermatozoideve në SST dhe habitatin e saj për një periudhë kohore dhe më pas daljen kur shpejtësia e tyre fillon të ngadalësohet.
Nga ana tjetër, Matsuzaki dhe Sasanami 21 sugjeruan që spermatozoidet e shpendëve pësojnë ndryshime në lëvizshmëri nga gjendja e qetësisë në lëvizshmëri në traktet riprodhuese mashkullore dhe femërore. Frenimi i lëvizshmërisë së spermës rezidente në SST është propozuar për të shpjeguar kohën e gjatë të ruajtjes së spermës dhe më pas rigjenerimin pas largimit nga SST. Në kushte hipoksike, Matsuzaki et al. 1 raportuan prodhim dhe çlirim të lartë të laktatit në SST, gjë që mund të çojë në frenimin e lëvizshmërisë së spermës rezidente. Në këtë rast, rëndësia e reologjisë së spermës reflektohet në përzgjedhjen dhe thithjen e spermatozoideve, dhe jo në ruajtjen e tyre.
Modeli i aglutinimit të spermës konsiderohet një shpjegim i besueshëm për periudhën e gjatë të ruajtjes së spermës në SST, pasi ky është një model i zakonshëm i mbajtjes së spermës te shpendët2,22,23. Bakst et al. 2 vëzhguan se shumica e spermatozoideve ngjiteshin me njëri-tjetrin, duke formuar agregate fashikulare, dhe spermatozoidë të vetëm rrallë gjendeshin në CCM të thëllëzave. Nga ana tjetër, Wen et al. 24 vëzhguan më shumë spermatozoidë të shpërndarë dhe më pak tufa spermatozoidësh në lumenin e SST te pulat. Bazuar në këto vëzhgime, mund të supozohet se prirja për aglutinimin e spermës ndryshon midis zogjve dhe midis spermatozoideve në të njëjtin ejakulat. Përveç kësaj, Van Krey et al. 9 sugjeruan që shkëputja e rastësishme e spermatozoideve të aglutinuara është përgjegjëse për depërtimin gradual të spermatozoideve në lumenin e tubës fallopiane. Sipas kësaj hipoteze, spermatozoidët me kapacitet më të ulët aglutinimi duhet të nxirren nga SST të parët. Në këtë kontekst, aftësia e spermatozoideve për t'u aglutinuar mund të jetë një faktor që ndikon në rezultatin e konkurrencës së spermës te zogjtë e ndotur. Përveç kësaj, sa më gjatë të shkëputet sperma e aglutinuar, aq më gjatë ruhet pjelloria.
Edhe pse grumbullimi dhe grumbullimi i spermatozoideve në tufa është vërejtur në disa studime2,22,24, ato nuk janë përshkruar në detaje për shkak të kompleksitetit të vëzhgimit të tyre kinematik brenda SST-së. Janë bërë disa përpjekje për të studiuar aglutinimin e spermës in vitro. Grumbullim i gjerë por i përkohshëm u vu re kur teli i hollë u hoq nga pika e varur e farës. Kjo çon në faktin se një flluskë e zgjatur del nga pika, duke imituar gjëndrën seminale. Për shkak të kufizimeve 3D dhe kohëve të shkurtra të tharjes me pika, i gjithë blloku u shkatërrua shpejt9. Në studimin aktual, duke përdorur pula Sharkashi dhe çipa mikrofluidike, ne ishim në gjendje të përshkruanim se si formohen këto tufa dhe si lëvizin ato. Tufat e spermës u formuan menjëherë pas mbledhjes së spermës dhe u gjetën të lëviznin në spirale, duke treguar reologji pozitive kur ishin të pranishme në rrjedhë. Për më tepër, kur shihen makroskopikisht, tufat e spermës janë vërejtur të rrisin linearitetin e lëvizshmërisë krahasuar me spermatozoidet e izoluara. Kjo sugjeron që aglutinimi i spermës mund të ndodhë para depërtimit të SST-së dhe se prodhimi i spermës nuk kufizohet në një zonë të vogël për shkak të stresit siç është sugjeruar më parë (Tingari dhe Lake12). Gjatë formimit të tufës, spermatozoidët notojnë në sinkron derisa të formojnë një kryqëzim, pastaj bishtat e tyre mbështillen rreth njëri-tjetrit dhe koka e spermatozoidit mbetet e lirë, por bishti dhe pjesa distale e spermatozoidit ngjiten së bashku me një substancë ngjitëse. Prandaj, koka e lirë e ligamentit është përgjegjëse për lëvizjen, duke zvarritur pjesën tjetër të ligamentit. Mikroskopia elektronike skanuese e tufave të spermës tregoi koka të spermës të bashkangjitura të mbuluara me shumë material ngjitës, duke sugjeruar që kokat e spermës ishin të bashkangjitura në tufa pushimi, gjë që mund të ketë ndodhur pasi të kenë arritur në vendin e ruajtjes (SST).
Kur një njollosje sperme ngjyroset me portokall akridine, materiali ngjitës jashtëqelizor rreth qelizave të spermës mund të shihet nën një mikroskop fluoreshent. Kjo substancë lejon që tufat e spermës të ngjiten dhe të kapen pas çdo sipërfaqeje ose grimce përreth në mënyrë që ato të mos lëvizin me rrjedhën përreth. Kështu, vëzhgimet tona tregojnë rolin e ngjitjes së spermatozoideve në formën e tufave të lëvizshme. Aftësia e tyre për të notuar kundër rrymës dhe për t'u ngjitur në sipërfaqet aty pranë lejon që spermatozoidet të qëndrojnë më gjatë në SST.
Rothschild25 përdori një kamerë hemocitometrie për të studiuar shpërndarjen lundruese të spermës së gjedhit në një pikë pezullimi, duke marrë fotomikrografi përmes një kamere me bosht optik vertikal dhe horizontal të mikroskopit. Rezultatet treguan se spermatozoidët tërhiqeshin nga sipërfaqja e dhomës. Autorët sugjerojnë se mund të ketë ndërveprime hidrodinamike midis spermës dhe sipërfaqes. Duke marrë parasysh këtë, së bashku me aftësinë e spermës së pulës Sharkashi për të formuar tufa ngjitëse, mund të rritet gjasat që sperma të ngjitet në murin SST dhe të ruhet për periudha të gjata kohore.
Bccetti dhe Afzeliu26 raportuan se glikokaliksi i spermës është i nevojshëm për njohjen dhe aglutinimin e gameteve. Forman10 vëzhgoi se hidroliza e lidhjeve α-glikozidike në veshjet glikoproteinë-glikolipid duke trajtuar spermën e shpendëve me neuraminidazë rezultoi në ulje të pjellorisë pa ndikuar në lëvizshmërinë e spermës. Autorët sugjerojnë se efekti i neuraminidazës në glikokaliks dëmton sekuestrimin e spermës në kryqëzimin uterovaginal, duke zvogëluar kështu pjellorinë. Vëzhgimet e tyre nuk mund të injorojnë mundësinë që trajtimi me neuraminidazë mund të zvogëlojë njohjen e spermës dhe oociteve. Forman dhe Engel10 zbuluan se pjelloria u zvogëlua kur pulat u inseminuan në mënyrë intravaginale me spermë të trajtuar me neuraminidazë. Megjithatë, IVF me spermë të trajtuar me neuraminidazë nuk ndikoi në pjellorinë krahasuar me pulat e kontrollit. Autorët arritën në përfundimin se ndryshimet në shtresën glikoproteinë-glikolipid rreth membranës së spermës zvogëluan aftësinë e spermës për t'u fekonduar duke dëmtuar sekuestrimin e spermës në kryqëzimin uterovaginal, gjë që nga ana tjetër rriti humbjen e spermës për shkak të shpejtësisë së kryqëzimit uterovaginal, por nuk ndikon në njohjen e spermës dhe vezës.
Tek gjelat e detit, Bakst dhe Bauchan 11 gjetën fshikëza të vogla dhe fragmente membrane në lumenin e SST-së dhe vunë re se disa nga këto granula ishin bashkuar me membranën e spermës. Autorët sugjerojnë se këto marrëdhënie mund të kontribuojnë në ruajtjen afatgjatë të spermatozoideve në SST. Megjithatë, studiuesit nuk specifikuan burimin e këtyre grimcave, nëse ato sekretohen nga qelizat epiteliale CCT, prodhohen dhe sekretohen nga sistemi riprodhues mashkullor, apo prodhohen nga vetë spermatozoidet. Gjithashtu, këto grimca janë përgjegjëse për aglutinimin. Grützner et al.27 raportuan se qelizat epiteliale epididimale prodhojnë dhe sekretojnë një proteinë specifike që është e nevojshme për formimin e trakteve seminale me një por të vetëm. Autorët raportojnë gjithashtu se shpërndarja e këtyre tufave varet nga bashkëveprimi i proteinave epididimale. Nixon et al.28 zbuluan se adneksat sekretojnë një proteinë, osteonektinën acidike të pasur me cisteinë; SPARC është i përfshirë në formimin e tufave të spermës në ekidnat dhe platipët me sqep të shkurtër. Shpërndarja e këtyre rrezeve shoqërohet me humbjen e kësaj proteine.
Në studimin aktual, analiza ultrastrukturore duke përdorur mikroskopinë elektronike tregoi se spermatozoidët ngjiteshin në një sasi të madhe materiali të dendur. Këto substanca mendohet të jenë përgjegjëse për aglutinimin që kondensohet midis dhe rreth kokave ngjitëse, por në përqendrime më të ulëta në rajonin e bishtit. Ne supozojmë se kjo substancë aglutinuese ekskretohet nga sistemi riprodhues mashkullor (epididimi ose vas deferens) së bashku me spermën, pasi shpesh vërejmë ndarjen e spermës nga limfa dhe plazma seminale gjatë ejakulimit. Është raportuar se, ndërsa spermatozoidët e shpendëve kalojnë nëpër epididimin dhe vas deferens, ato i nënshtrohen ndryshimeve të lidhura me maturimin që mbështesin aftësinë e tyre për të lidhur proteinat dhe për të fituar glikoproteina të shoqëruara me lemën plazmatike. Qëndrueshmëria e këtyre proteinave në membranat rezidente të spermës në SST sugjeron që këto proteina mund të ndikojnë në fitimin e stabilitetit të membranës së spermës 30 dhe të përcaktojnë pjellorinë e tyre 31. Ahammad et al32 raportuan se spermatozoidet e marra nga pjesë të ndryshme të sistemit riprodhues mashkullor (nga testikujt deri te kanali distal i enëve të gjakut) treguan një rritje progresive të qëndrueshmërisë në kushte të lëngshme ruajtjeje, pavarësisht nga temperatura e ruajtjes, dhe qëndrueshmëria te pulat rritet gjithashtu në tubat fallopiane pas inseminimit artificial.
Tufat e spermës së pulës Sharkashi kanë karakteristika dhe funksione të ndryshme nga speciet e tjera si ekidnat, platipët, minjtë e pyllit, minjtë e drerit dhe derrat e Guinesë. Tek pulat sharkasi, formimi i tufave të spermatozoideve uli shpejtësinë e tyre të notit krahasuar me spermatozoidet e vetme. Megjithatë, këto tufa rritën përqindjen e spermatozoideve reologjikisht pozitive dhe rritën aftësinë e spermatozoideve për t'u stabilizuar në një mjedis dinamik. Kështu, rezultatet tona konfirmojnë sugjerimin e mëparshëm se aglutinimi i spermës në SST është i lidhur me ruajtjen afatgjatë të spermës. Ne gjithashtu hipotetizojmë se prirja e spermës për të formuar tufa mund të kontrollojë shkallën e humbjes së spermës në SST, gjë që mund të ndryshojë rezultatin e konkurrencës së spermës. Sipas këtij supozimi, spermatozoidet me kapacitet të ulët aglutinimi lëshojnë SST të parët, ndërsa spermatozoidet me kapacitet të lartë aglutinimi prodhojnë pjesën më të madhe të pasardhësve. Formimi i tufave të spermës me një por të vetëm është i dobishëm dhe ndikon në raportin prind-fëmijë, por përdor një mekanizëm të ndryshëm. Tek ekidnat dhe platipët, spermatozoidët janë të vendosur paralel me njëri-tjetrin për të rritur shpejtësinë përpara të rrezes. Tufat e ekidnave lëvizin rreth tre herë më shpejt se spermatozoidet e vetme. Besohet se formimi i tufave të tilla të spermës tek ekidnat është një përshtatje evolucionare për të ruajtur dominimin, pasi femrat janë të përziera dhe zakonisht çiftëzohen me disa meshkuj. Prandaj, spermatozoidet nga ejakulate të ndryshme konkurrojnë ashpër për fekondimin e vezës.
Spermatozoidet e aglutinuara të pulave sharkasi janë të lehta për t'u vizualizuar duke përdorur mikroskopinë me kontrast fazor, e cila konsiderohet e dobishme sepse lejon studimin e lehtë të sjelljes së spermatozoideve in vitro. Mekanizmi me të cilin formimi i tufave të spermës nxit riprodhimin te pulat sharkasi është gjithashtu i ndryshëm nga ai i parë te disa gjitarë placentalë që përfaqësojnë sjellje bashkëpunuese të spermës, siç janë minjtë e pyllit, ku disa spermatozoide arrijnë vezët, duke ndihmuar individë të tjerë të lidhur të arrijnë dhe të dëmtojnë vezët e tyre. për të provuar veten. sjellje altruiste. Vetë-fekondimi 34. Një shembull tjetër i sjelljes bashkëpunuese te spermatozoide u gjet te minjtë e drerit, ku spermatozoidet ishin në gjendje të identifikonin dhe kombinoheshin me spermatozoidet më të lidhura gjenetikisht dhe të formonin grupe bashkëpunuese për të rritur shpejtësinë e tyre krahasuar me spermatozoidet e palidhura 35.
Rezultatet e marra në këtë studim nuk bien ndesh me teorinë e Foman për ruajtjen afatgjatë të spermatozoideve në SWS. Studiuesit raportojnë se qelizat e spermës vazhdojnë të lëvizin në rrjedhën e qelizave epiteliale që veshin SST për një periudhë të zgjatur kohore, dhe pas një periudhe të caktuar kohore, rezervat e energjisë së qelizave të spermës shterohen, duke rezultuar në një ulje të shpejtësisë, e cila lejon dëbimin e substancave me peshë të vogël molekulare. Energjia e spermatozoideve me rrjedhën e lëngut nga lumeni i SST Zgavra e tubës fallopiane. Në studimin aktual, ne vumë re se gjysma e spermatozoideve të vetme treguan aftësinë për të notuar kundër lëngjeve që rrjedhin, dhe ngjitja e tyre në tufë rriti aftësinë e tyre për të treguar reologji pozitive. Për më tepër, të dhënat tona janë në përputhje me ato të Matsuzaki et al. 1 të cilët raportuan se rritja e sekretimit të laktatit në SST mund të pengojë lëvizshmërinë e spermës rezidente. Megjithatë, rezultatet tona përshkruajnë formimin e ligamenteve lëvizëse të spermës dhe sjelljen e tyre reologjike në prani të një mjedisi dinamik brenda një mikrokanali në një përpjekje për të sqaruar sjelljen e tyre në SST. Hulumtimet e ardhshme mund të përqendrohen në përcaktimin e përbërjes kimike dhe origjinës së agjentit aglutinues, gjë që padyshim do t'i ndihmojë studiuesit të zhvillojnë mënyra të reja për të ruajtur spermën e lëngshme dhe për të rritur kohëzgjatjen e pjellorisë.
Pesëmbëdhjetë sharkasi meshkuj 30-javësh me qafë të zhveshur (homozigotë dominantë; Na Na) u përzgjodhën si dhurues sperme në studim. Shpendët u rritën në Fermën Kërkimore të Shpendëve të Fakultetit të Bujqësisë, Universiteti Ashit, Guvernatori i Ashit, Egjipt. Shpendët u strehuan në kafaze individuale (30 x 40 x 40 cm), iu nënshtruan një programi drite (16 orë dritë dhe 8 orë errësirë) dhe u ushqyen me një dietë që përmbante 160 g proteina të papërpunuara, 2800 kcal energji të metabolizueshme, 35 g kalcium secili. 5 gramë fosfor të disponueshëm për kilogram dietë.
Sipas të dhënave 36, 37, sperma u mblodh nga meshkujt me anë të masazhit të barkut. Një total prej 45 mostrash sperme u mblodhën nga 15 burra gjatë 3 ditëve. Sperma (n = 15/ditë) u hollua menjëherë 1:1 (v:v) me holluesin e spermës Belsville Poultry, i cili përmban difosfat kaliumi (1.27 g), monohidrat glutamat monosodiumi (0.867 g), fruktozë (0.5 d), acetat natriumi anhidrik (0.43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0.195 g), monohidrat citrat kaliumi (0.064 g), monofosfat kaliumi (0.065 g), klorur magnezi (0.034 g) dhe H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 333 mOsm/kg38. Mostrat e holluara të spermës u ekzaminuan fillimisht nën një mikroskop me dritë për të siguruar cilësi të mirë të spermës (lagështi) dhe më pas u ruajtën në një banjë uji në 37°C deri në përdorim brenda gjysmë ore pas mbledhjes.
Kinematika dhe reologjia e spermatozoideve përshkruhen duke përdorur një sistem pajisjesh mikrofluidike. Mostrat e spermës u holluan më tej në 1:40 në holluesin e spermës së shpendëve Beltsville, u ngarkuan në një pajisje mikrofluidike (shih më poshtë), dhe parametrat kinetikë u përcaktuan duke përdorur një sistem të Analizës së Kompjuterizuar të Spermës (CASA) të zhvilluar më parë për karakterizimin e mikrofluidikës. mbi lëvizshmërinë e spermatozoideve në mjedise të lëngshme (Departamenti i Inxhinierisë Mekanike, Fakulteti i Inxhinierisë, Universiteti Assiut, Egjipt). Shtojca mund të shkarkohet në: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Shpejtësia e kurbës (VCL, μm/s), shpejtësia lineare (VSL, μm/s) dhe shpejtësia mesatare e trajektores (VAP, μm/s) u matën. Videot e spermatozoideve u morën duke përdorur një mikroskop kontrasti fazor Optika XDS-3 të përmbysur (me objektiv 40x) të lidhur me një kamerë Tucson ISH1000 me 30 fps për 3 s. Përdorni programin CASA për të studiuar të paktën tre zona dhe 500 trajektore të spermës për mostër. Videoja e regjistruar u përpunua duke përdorur një CASA të ndërtuar në shtëpi. Përkufizimi i lëvizshmërisë në shtojcën CASA bazohet në shpejtësinë e notit të spermës krahasuar me shkallën e rrjedhjes dhe nuk përfshin parametra të tjerë si lëvizja nga njëra anë në tjetrën, pasi kjo është gjetur të jetë më e besueshme në rrjedhën e lëngjeve. Lëvizja reologjike përshkruhet si lëvizja e qelizave të spermës kundër drejtimit të rrjedhjes së lëngjeve. Spermatozoidet me veti reologjike u ndanë me numrin e spermatozoideve lëvizëse; spermatozoidet që ishin në qetësi dhe spermatozoidet që lëviznin në mënyrë konvektive u përjashtuan nga numërimi.
Të gjitha kimikatet e përdorura u morën nga Elgomhoria Pharmaceuticals (Kajro, Egjipt) përveç nëse përcaktohet ndryshe. Pajisja u prodhua siç përshkruhet nga El-sherry et al. 40 me disa modifikime. Materialet e përdorura për të prodhuar mikrokanalet përfshinin pllaka qelqi (Howard Glass, Worcester, MA), rezistencë negative SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkool diacetoni (Sigma Aldrich, Steinheim, Gjermani) dhe poliaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalet prodhohen duke përdorur litografi të butë. Së pari, një maskë mbrojtëse transparente për fytyrën me dizajnin e dëshiruar të mikrokanalit u shtyp në një printer me rezolucion të lartë (Prismatic, Kajro, Egjipt dhe Pacific Arts and Design, Markham, ON). Master-et u bënë duke përdorur pllaka qelqi si substrate. Pllakat u pastruan në aceton, izopropanol dhe ujë të deionizuar dhe më pas u veshën me një shtresë 20 µm SU8-25 me anë të veshjes me spin (3000 rpm, 1 min). Shtresat SU-8 u thanë butësisht (65°C, 2 minuta dhe 95°C, 10 minuta) dhe u ekspozuan ndaj rrezatimit UV për 50 s. Piqja pas ekspozimit në 65°C dhe 95°C për 1 minutë dhe 4 minuta për të lidhur shtresat e ekspozuara SU-8, e ndjekur nga zhvillimi në alkool diacetoni për 6.5 minuta. Piqni fort vaflat (200°C për 15 minuta) për ta ngurtësuar më tej shtresën SU-8.
PDMS u përgatit duke përzier monomerin dhe ngurtësuesin në një raport peshe prej 10:1, pastaj u degazua në një tharës vakumi dhe u derdh në kornizën kryesore të SU-8. PDMS u tha në një furrë (120°C, 30 minuta), pastaj kanalet u prenë, u ndanë nga masteri dhe u shpuan për të lejuar që tubat të bashkangjiteshin në hyrje dhe dalje të mikrokanalit. Së fundmi, mikrokanalet PDMS u bashkangjitën përgjithmonë në lamejtë e mikroskopit duke përdorur një procesor portativ korona (Electro-Technic Products, Chicago, IL) siç përshkruhet diku tjetër. Mikrokanali i përdorur në këtë studim mat 200 µm × 20 µm (Gj × L) dhe është 3.6 cm i gjatë.
Rrjedha e lëngut e induktuar nga presioni hidrostatik brenda mikrokanalit arrihet duke ruajtur nivelin e lëngut në rezervuarin hyrës mbi ndryshimin e lartësisë Δh39 në rezervuarin dalës (Fig. 1).
ku f është koeficienti i fërkimit, i përcaktuar si f = C/Re për rrjedhën laminare në një kanal drejtkëndor, ku C është një konstante që varet nga raporti i aspektit të kanalit, L është gjatësia e mikrokanalit, Vav është shpejtësia mesatare brenda mikrokanalit, Dh është diametri hidraulik i kanalit, g – nxitimi i gravitetit. Duke përdorur këtë ekuacion, shpejtësia mesatare e kanalit mund të llogaritet duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm: