Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Grimcat poroze të silicës u përgatitën me një metodë sol-xhel me disa modifikime për të marrë grimca makroporoze. Këto grimca u derivatizuan nga polimerizimi i kthyeshëm i transferimit të zinxhirit të fragmentimit shtesë (RAFT) me N-fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PMI) dhe stiren për të përgatitur N-phenilmarrëborë-stacionar më pak kolona çeliku (100 × 1,8 mm id) u paketuan me paketim me slurry. Vlerësoi ndarjen e kolonës PMP të një përzierjeje peptide të përbërë nga pesë peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Serucine, Tyr-Ile-Gly-Serphalin) dhe performanca njerëzore. albumin (HAS). Në kushte optimale elucioni, numri teorik i pllakave të përzierjes së peptideve është deri në 280,000 pllaka/m². Duke krahasuar performancën e ndarjes së kolonës së zhvilluar me kolonën komerciale Ascentis Express RP-Amide, u vu re se performanca e ndarjes së kolonës PMP ishte superiore ndaj rezolucionit të kolonës komerciale për sa i përket rezolucionit të veçantë.
Vitet e fundit, industria biofarmaceutike është bërë një treg global në zgjerim me një rritje të konsiderueshme të pjesës së tregut. Me rritjen shpërthyese të industrisë biofarmaceutike1,2,3, analiza e peptideve dhe proteinave është shumë e dëshiruar. Përveç peptidit të synuar, disa papastërti krijohen gjatë sintezës së peptideve, duke kërkuar kështu pastrimin dhe pastrimin e purptideve të dëshiruar të karakterit të purifikimit të peptideve. proteinat në lëngjet e trupit, indet dhe qelizat janë një detyrë jashtëzakonisht sfiduese për shkak të numrit të madh të specieve potencialisht të zbulueshme në një kampion të vetëm.Megjithëse spektrometria e masës është një mjet efektiv për sekuencën e peptideve dhe proteinave, nëse mostra të tilla injektohen në spektrometrin e masës me një kalim, ndarja nuk do të jetë ideale. Ky problem mund të zvogëlohet në analizën e mëparshme të analizës LC. analitet që hyjnë në spektrometrin e masës në një kohë të caktuar4,5,6. Përveç kësaj, gjatë ndarjes së fazës së lëngshme, analitet mund të fokusohen në rajone të ngushta, duke i përqendruar në këtë mënyrë këto analite dhe duke përmirësuar ndjeshmërinë e zbulimit të MS. Kromatografia e lëngshme (LC) ka avancuar ndjeshëm gjatë dekadës së fundit dhe është bërë një teknikë e njohur e analizës në prote708,9.
Kromatografia e lëngshme e fazës së kundërt (RP-LC) përdoret gjerësisht për pastrimin dhe ndarjen e përzierjeve peptide duke përdorur silicë të modifikuar me oktadecil (ODS) si fazë stacionare11,12,13. Megjithatë, fazat stacionare RP nuk sigurojnë ndarje të kënaqshme të peptideve, strukturës së tyre komplekse5 dhe proteinave, në mënyrë të veçantë1, për shkak të natyrës komplekse dhe amphide1. Fazat stacionare të projektuara kërkohen për të analizuar peptidet dhe proteinat me pjesë polare dhe jo polare për të ndërvepruar dhe mbajtur këto analiza. dhe ndarjet e proteinave17,18,19,20,21. Fazat stacionare të modalitetit të përzier (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ndërthurja polare/RPLC) janë të përshtatshme për ndarjet e peptideve dhe proteinave për shkak të pranisë së grupeve polare dhe jopolare22,23,24,25,28, polare dhe stacionare polarë-imike. Grupet lar tregojnë fuqi të mirë ndarëse dhe selektivitet unik për analitet polare dhe jopolare, pasi ndarja varet nga ndërveprimi ndërmjet analitit dhe fazës stacionare.Ndërveprimet multimodale 29, 30, 31, 32. Kohët e fundit, Zhang et al.30 përgatiti një fazë stacionare poliamine të përfunduar me dodecil dhe ndau me sukses hidrokarburet, antidepresantët, flavonoidet, nukleozidet, estrogjenet dhe disa analite të tjera. Ndërkaluesi polar ka grupe polare dhe jopolare, kështu që mund të përdoret për të ndarë peptidet dhe proteinat që kanë kolonë hidrofobike dhe hidrofobe. ed C18 kolonat) janë të disponueshme në treg nën emrin tregtar Ascentis Express RP-Amide kolona, ​​por këto kolona përdoren vetëm për analizën e aminës 33.
Në studimin aktual, një fazë stacionare e ngulitur në polare (N-fenilmaleimid-polistireni i ngulitur) u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e peptideve dhe tretjeve të tripsinës të HSA. Faza stacionare u përgatit duke përdorur strategjinë e mëposhtme. Grimcat poroze të silicës u përgatitën sipas procedurës së dhënë në botimin tonë të mëparshëm të polietilureolit. G), TMOS, acidi acetik i ujit u rregullua për të përgatitur grimcat silicë me madhësi të madhe pore. Së dyti, një ligand i ri, fenilmaleimid-metil vinil izocianat, u sintetizua dhe u përdor për të derivatuar grimcat e silicës për të përgatitur një fazë stacionare të ngulitur polare. Rezultati rezultoi në një fazë stacionare 1 mm (1 mm të optimizuar) në një fazë të palëvizshme 0 × 000. Skema e paketimit. Paketimi i kolonës ndihmohet me dridhje mekanike për të siguruar formimin e një shtrati homogjen brenda kolonës. Vlerësoni ndarjen e kolonave të paketuara të përzierjeve peptide që përbëhen nga pesë peptide;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) dhe tretja e Tripsinës e albuminës së serumit të njeriut (HAS). Përzierja e peptideve dhe tretja e tripsinës së HSA u vu re se ndaheshin me rezolucion të mirë dhe efikasitet të mirë të kolonës, krahasuar me performancën e shprehur të PRPA. Të dy peptidet dhe proteinat u vunë re se ishin të zgjidhura mirë dhe efikase në kolonën PMP, e cila ishte më efikase se kolona Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilen Glikoli), Ure, Acid acetik, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilani (TMCS), Tripsina, Albumina e Serumit Njerëzor (HSA), Klorur Amoniumi, Ure, Heksan Metildisilazane (HMDS), Metakriloil Stiokside-PO, MCS, Klorid metakriloil (TEZOYREX), 4. BPO), Acetonitril i klasës HPLC (ACN), metanol, 2-propanol dhe aceton të blerë nga Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SHBA).
Një përzierje ure (8 g), polietilen glikol (8 g) dhe 8 ml acid acetik 0,01 N u trazua për 10 minuta dhe më pas 24 ml TMOS iu shtua në kushte të ftohta akulli. Përzierja e reaksionit u ngroh në 40°C për 6 orë dhe më pas në 120°C, materiali u izolua automatikisht në 8 orë në ujë. u tha në 70°C për 12 orë. Masa e butë e tharë u blua e lëmuar në furrë dhe u kalcinua në 550°C për 12 orë. U përgatitën tre tufa dhe u karakterizuan për të ekzaminuar riprodhueshmërinë në madhësinë e grimcave, madhësinë e poreve dhe sipërfaqen.
Me modifikimin sipërfaqësor të grimcave të silicës me ligand të para-sintetizuar fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PCMP) i ndjekur nga polimerizimi radial me stiren, u përgatit një përbërës që përmban grup polar.Faza stacionare për agregatet dhe zinxhirët e polistirenit. Procesi i përgatitjes është përshkruar më poshtë.
N-fenilmaleimidi (200 mg) dhe metil vinil izocianat (100 mg) u tretën në toluen të thatë dhe 0.1 mL 2,2'-azoisobutironitrile (AIBN) u shtuan në balonën e reaksionit për të përgatitur përzierjen fenilmaleimid-metil vinil, izocianti i filtruar në 6°C, izocianati u filtua në 60 orë. thahen në furrë në 40°C për 3 orë.
Grimcat e thata të silicës (2 g) u shpërndanë në toluen të thatë (100 mL), u trazuan dhe u sonikuan në një balonë me fund të rrumbullakët 500 ml për 10 minuta. PMCP (10 mg) u tret në toluen dhe u shtua pika-pika në balonën e reaksionit nëpërmjet një gypi me pika. Përzierja u filtua në 10°C dhe u tha me refluks për 10°C. 60°C për 3 orë. Më pas, grimcat silicë të lidhura me PMCP (100 g) u tretën në toluen (200 ml) dhe u shtua 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) në prani të 100 μL dilaurat dibutiltin si një katalizator. Përzierja u filtua në 50°C në 50°C dhe u trazua për 50°C për 3 orë. .
Stireni (1 mL), peroksidi benzoil BPO (0,5 mL) dhe grimcat e silicës të lidhura me TEMPO-PMCP (1,5 g) u shpërndanë në toluen dhe u pastruan me azot. Polimerizimi i stirenit u krye në 100°C për 12 orë. Reaksioni i rezultuar u la në 60°C me scheanol të gjithë. me është paraqitur në figurën 1.
Mostrat u degazuan në 393 K për 1 orë për të marrë një presion të mbetur prej më pak se 10-3 Torr. Sasia e N2 e absorbuar në një presion relativ prej P/P0 = 0.99 u përdor për të përcaktuar vëllimin total të poreve. Morfologjia e grimcave silicë të zhveshur dhe të lidhura me ligand (ligand-lidhja e grimcave silicë të zhveshur, u ekzaminuan me mikrothomëza të larta të silicës, duke u ekzaminuar me elektroskopikë të lartë). Mostrat e thara (silicë të zhveshur dhe grimca silice të lidhura me ligand) u vendosën në një kolonë alumini duke përdorur shirit ngjitës karboni. Ari u vendos në kampione duke përdorur një shtresë spërkatëse Q150T dhe një shtresë Au 5 nm u depozitua mbi mostrat. Kjo përmirëson efikasitetin e procesit, siguron një voltazh të imët të procesit duke përdorur një voltazh të ulët të ftohtë. ham, MA, USA) Për analizën elementare është përdorur analizuesi elementar flash EA1112. Një analizues i madhësisë së grimcave Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 është përdorur për të marrë shpërndarjen e madhësisë së grimcave. min, dhe vendoset në stolin optik të Mastersizer. Analiza termogravimetrike u krye me një shpejtësi prej 5 °C në minutë në një interval temperaturash nga 30 deri në 800 °C.
Kolonat me vrima të ngushta prej çeliku të pandryshkshëm të veshura me xham (100 × 1,8 mm id) u paketuan duke përdorur metodën e paketimit me slurry, duke aplikuar të njëjtën procedurë të përdorur në Ref.31.Një kolonë prej çeliku inoks (të veshur me xham, id 100 × 1,8 mm) me një pajisje daljeje që përmban një frit 1 µm u lidh me një paketues sluri (Alltech Deerfield, IL, USA). përdoret si tretës i llumit si dhe si tretës shtytës. Mbushni kolonën në mënyrë sekuenciale duke ushtruar presione prej 100 MP për 10 minuta, 80 MP për 15 minuta dhe 60 MP për 30 minuta. Gjatë paketimit, dridhjet mekanike u aplikuan me dy shkundësa GC (Alltech, mbështjellëse) të kolonës uniforme (Alltech, Details) paketoni dhe lironi presionin ngadalë për të parandaluar ndonjë dëmtim brenda kolonës. Shkëputni kolonën nga njësia e paketimit të llumit dhe lidhni një pajisje tjetër në hyrje dhe në sistemin LC për të kontrolluar performancën e saj.
Një pompë LC (10AD Shimadzu, Japoni), injektor (Valco (SHBA) C14 W.05) me lak injeksioni 50 nL, degazues membranor (Shimadzu DGU-14A), dritare kapilar UV-VIS U ndërtua Detektor i veçantë i pajisjes μLC (UV-2075) me efektin shumë të shkurtër të tubit të narkozës së qelqit. Pas paketimit, kapilarët (50 μm id 365 dhe kapilarët e bashkimit reduktues (50 μm) u instaluan në daljen 1/16″ të bashkimit reduktues. Mbledhja e të dhënave dhe përpunimi kromatografik u krye duke përdorur softuerin Multichro 2000. Monitorimi u analizua në 254V të dhënat e përthithjesm. inPro8 (Northampton, MA).
Albuminë nga serumi i njeriut, pluhur i liofilizuar, ≥ 96% (elektroforezë me xhel agarozë) 3 mg e përzier me tripsinë (1.5 mg), 4.0 M ure (1 mL) dhe 0.2 M bikarbonat amoniumi (1 mL). Tretësira u trazua për 10 minuta dhe u mbajt për 10°C, më pas në 3 orë me ujë. 0.1% TFA. Filtroni tretësirën dhe ruani nën 4 °C.
Ndarja e përzierjeve të peptideve dhe tretjeve të tripsinës HSA u vlerësuan veçmas në kolonat PMP. Kontrolloni ndarjen e përzierjes së peptideve dhe tretjes së tripsinës së HSA nga kolona PMP dhe krahasoni rezultatet me kolonën Ascentis Express RP-Amide. Numri teorik i pllakës llogaritet si më poshtë:
Imazhet SEM të grimcave të zhveshura të silicës dhe grimcave silicë të lidhura me ligand janë paraqitur në Fig.2 .Imazhet SEM të grimcave të zhveshura të silicës (A, B) tregojnë se, ndryshe nga studimet tona të mëparshme, këto grimca janë sferike në të cilat grimcat janë të zgjatura ose kanë simetri të parregullt. grimcat.
Imazhet e mikroskopit elektronik të skanimit të grimcave të zhveshura të silicës (A, B) dhe grimcave silicë të lidhura me ligand (C, D).
Shpërndarjet e madhësisë së grimcave të grimcave të zhveshura të silicës dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand janë paraqitur në Figurën 3(A). Lakoret e shpërndarjes së madhësisë së grimcave të bazuara në vëllim treguan se madhësia e grimcave të silicës u rrit pas modifikimit kimik (Fig. 3A). (0.5), i PMP është 3.36 μm, krahasuar me studimin tonë të mëparshëm me vlerë ad(0.5) prej 3.05 μm (grimca silicë të lidhura me polistiren)34. Kjo grumbull kishte një shpërndarje më të ngushtë të madhësisë së grimcave në krahasim me studimin tonë të mëparshëm për shkak të raporteve të ndryshme të PEG, ure, grimca e acidit MP që është paksa më e madhe se grimca në fazën e reagimit dhe acari është më i madh se grimca e acidit TMOS dhe ac. Faza e grimcave silicë të lidhur ne kemi studiuar më parë. Kjo do të thotë se funksionalizimi sipërfaqësor i grimcave silicë me stiren depozitoi vetëm një shtresë polistireni (0.97 µm) në sipërfaqen e silicës, ndërsa në fazën PMP trashësia e shtresës ishte 1.38 µm.
Shpërndarja e madhësisë së grimcave (A) dhe shpërndarja e madhësisë së poreve (B) të grimcave të zhveshura të silicës dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand.
Madhësia e poreve, vëllimi i poreve dhe sipërfaqja e grimcave silicë të studimit aktual janë dhënë në tabelën 1(B). Profilet e PSD të grimcave të zhveshura të silicës dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand janë paraqitur në Figurën 3(B). Rezultatet janë të krahasueshme me studimin tonë të mëparshëm. Madhësitë e poreve të grimcave të zhveshura dhe ligane janë respektivisht 2,31 dhe ligane. tregon se madhësia e poreve zvogëlohet me 69 pas modifikimit kimik, siç tregohet në tabelën 1(B), dhe ndryshimi i lakores tregohet në figurën 3(B). Në mënyrë të ngjashme, vëllimi i poreve të grimcave të silicës u ul nga 0.67 në 0.58 cm3/g pas modifikimit kimik. Sipërfaqja specifike e studiuar aktualisht është si 1 m2 e sipërfaqes së mëparshme, e cila aktualisht është si një grimcë e mëparshme. studimi (124 m2/g). Siç tregohet në tabelën 1(B), sipërfaqja (m2/g) e grimcave të silicës gjithashtu u ul nga 116 m2/g në 105 m2/g pas modifikimit kimik.
Rezultatet e analizës elementare të fazës stacionare janë paraqitur në tabelën 2. Ngarkimi i karbonit i fazës aktuale të palëvizshme është 6,35%, që është më e ulët se ngarkesa e karbonit e studimit tonë të mëparshëm (grimcat silicë të lidhura me polistiren, përkatësisht 7,93%35 dhe 10,21%, përkatësisht) nuk janë përdorur disa ligande polare si phenilmaleimid-metilvinilizocyanat (PCMP) dhe 4-hidroksi-TEMPO. Përqindja e peshës së azotit të fazës aktuale stacionare është 2.21%, krahasuar me 0.1735 dhe 0.85% ndaj peshës së azotit në studimet e mëparshme, përkatësisht. Në mënyrë të ngjashme, ngarkesat e karbonit të produkteve (4) dhe (5) ishin përkatësisht 2.7% dhe 2.9%, ndërsa ngarkimi i karbonit i produktit përfundimtar (6) ishte 6.35%, siç tregohet në tabelën 2. Humbja e peshës u kontrollua me fazën stacionare PMP, dhe kurba TGA tregohet në Figurën 4. Kurba e TGA tregon një marrëveshje të mirë me humbjen e peshës. 35%) sepse ligandët përmbajnë jo vetëm C, por edhe N, O dhe H.
Ligandi fenilmaleimid-metilvinilizocianat u zgjodh për modifikimin sipërfaqësor të grimcave të silicës sepse ka grupe polare të fenilmaleimidit dhe grupe vinilizocianat. , meqenëse pjesa e fenilmaleimidit nuk ka ngarkesë virtuale në pH normal. Polariteti i fazës stacionare mund të kontrollohet nga sasia optimale e stirenit dhe koha e reagimit të polimerizimit të radikaleve të lira. Hapi i fundit i reaksionit (polimerizimi me radikal të lirë) është kritik dhe mund të ndryshojë polaritetin e fazës stacionare. Është vëzhguar analiza elementare e ngarkesës stacionare në fazën stacionare në rritje. ne dhe koha e reagimit rriti ngarkesën e karbonit të fazës stacionare dhe anasjelltas. SP-të e përgatitura me përqendrime të ndryshme të stirenit kanë ngarkesa të ndryshme karboni. Përsëri, ngarkoni këto faza të palëvizshme në kolona çelik inox dhe kontrolloni performancën e tyre kromatografike (selektiviteti, rezolucioni, vlera N, etj.). Bazuar në këto eksperimente, u përzgjodh një formulim i optimizuar për ripërgatitjen e fazës PMP me një formulim të ripërgatitur për ripërgatitjen e PMP.
Pesë përzierje peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) u vlerësuan gjithashtu duke përdorur një kolonë PMP duke përdorur një fazë të lëvizshme;60/40 (v/v) acetonitril/ujë (0,1% TFA) me një shpejtësi rrjedhjeje prej 80 μL/min. Në kushtet optimale të elucionit, numri teorik i pllakës (N) për kolonë (100 × 1,8 mm id) është 20,000 ± 100 (200,000 Pllakat e mundshme për kolonat 200,000 T). kromatogramet tregohen në figurën 5A. Analiza e shpejtë në një kolonë PMP me shpejtësi të lartë rrjedhjeje (700 μL/min), pesë peptide u eluan brenda një minute, vlerat N ishin shumë të mira, 13,500 ± 330 për kolonë (100 × 1,8 mm id), Korrespondon me 0h 0h 5 madhësinë e kolonës identike. (100 × 1,8 mm id) u paketuan me tre lote të ndryshme të fazës stacionare PMP për të kontrolluar riprodhueshmërinë. Përqendrimi i analitit për secilën kolonë u regjistrua duke përdorur kushtet optimale të elucionit dhe numrin e pllakave teorike N dhe kohën e mbajtjes për të ndarë të njëjtën përzierje provë në secilën kolonë. Të dhënat e riprodhueshmërisë për kolonat PMP, tregohen në tabelën me vlerën e reproduktimit të ulët të kolonës %R të reproduktimit të kolonave %R shumë të ulët. në tabelën 3.
Ndarja e përzierjes peptide në kolonën PMP (B) dhe kolonën Ascentis Express RP-Amide (A);faza e lëvizshme 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensionet e kolonës PMP (100 × 1,8 mm id);analitike Rendi i elucionit të përbërjeve: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dhe 5 (leucinë) enkefalinë acid)).
Një kolonë PMP (100 × 1.8 mm id) u vlerësua për ndarjen e tretjeve triptike të albuminës së serumit njerëzor në kromatografinë e lëngshme të performancës së lartë. Kromatogrami në figurën 6 tregon se kampioni është i ndarë mirë dhe rezolucioni është shumë i mirë. Tretjet e HSA u analizuan duke përdorur një shpejtësi rrjedhjeje prej 100 µ1 faze të lëvizshme dhe 70 mL fazë të lëvizshme. .Siç tregohet në kromatogramën (Figura 6), tretja e HSA është ndarë në 17 maja që korrespondojnë me 17 peptide. Është llogaritur efikasiteti i ndarjes së çdo piku në tretjen e HSA dhe vlerat janë dhënë në tabelën 5.
Një tretje triptike e HSA (100 × 1.8 mm id) u nda në një kolonë PMP;shpejtësia e rrjedhjes (100 µL/min), faza e lëvizshme 60/40 acetonitril/ujë me 0,1% TFA.
ku L është gjatësia e kolonës, η është viskoziteti i fazës së lëvizshme, ΔP është presioni i kundërt i kolonës dhe u është shpejtësia lineare e fazës lëvizëse. Përshkueshmëria e kolonës PMP ishte 2,5 × 10-14 m2, shpejtësia e rrjedhës ishte 25 μL/min dhe 60/40 v/v. ishte e ngjashme me atë të studimit tonë të mëparshëm Ref.34. Përshkueshmëria e kolonës së mbushur me grimca poroze sipërfaqësore është: 1.7 × 10-15 për grimcat 1.3 μm, 3.1 × 10-15 për grimcat 1.7 μm, 5.2 × 10-5 × 15 μm, 5.2 × 10-5 × 15 μm dhe 2 grimcat m 43. Prandaj, përshkueshmëria e fazës PMP është e ngjashme me atë të grimcave bërthamë-predha 5 μm.
ku Wx është pesha e kolonës së mbushur me kloroform, Wy është pesha e kolonës së mbushur me metanol dhe ρ është dendësia e tretësit. Dendësia e metanolit (ρ = 0,7866) dhe kloroformit (ρ = 1,484). Poroziteti i përgjithshëm i SILICA × 1 08 kolona Kolonat C18-ure 31 që ne studiuam më parë ishin përkatësisht 0.63 dhe 0.55. Kjo do të thotë se prania e ligandëve të uresë zvogëlon përshkueshmërinë e fazës stacionare. Nga ana tjetër, poroziteti total i kolonës PMP (100 × 1.8 mm id) është 0.60 më i ulët se ajo e paketimit të MP8 me kolonën 8. a grimca sepse në fazat stacionare të tipit C18 ligandët C18 janë ngjitur me grimcat e silicës si zinxhirë linearë, ndërsa në fazat stacionare të tipit polistiren, rreth saj formohet shtresa polimer relativisht e trashë A. Në një eksperiment tipik, poroziteti i kolonës llogaritet si:
Figura 7A,B tregon kolonën PMP (100 × 1,8 mm id) dhe kolonën Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) duke përdorur të njëjtat kushte elucioni (dmth. 60/40 ACN/H2O dhe 0,1% TFA).) të parcelës van Deemter.Përzierjet e zgjedhura të peptideve (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) u përgatitën në 20 µL/ Shpejtësia minimale e rrjedhës për të dyja kolonat është 800 µL/min. Minimumi i HETPum është shkalla e rrjedhës optimum/min. Kolona RP-Amide ishte respektivisht 2,6 µm dhe 3,9 µm. Vlerat HETP tregojnë se efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP (100 × 1,8 mm id) është shumë më i mirë se kolona Ascentis Express RP-Amide e disponueshme në treg (100 × 1,8 Dem Emri i kolonës RP-Amide) (Figura 100 × 1,8 Dememter është një rënie në grafikun e rrjedhës në 7). jo domethënëse në krahasim me studimin tonë të mëparshëm. Efikasiteti më i lartë i ndarjes së kolonës PMP (100 × 1,8 mm id) në krahasim me kolonën Ascentis Express RP-Amide bazohet në përmirësimet në formën, madhësinë e grimcave dhe procedurat komplekse të paketimit të kolonës të përdorura në punën aktuale34.
(A) grafiku i van Deemter (HETP kundrejt shpejtësisë lineare të fazës së lëvizshme) i marrë duke përdorur një kolonë PMP (100 × 1,8 mm id) në 60/40 ACN/H2O me 0,1% TFA. (B) grafiku van Deemter (HETP kundrejt shpejtësisë lineare të fazës së lëvizshme) marrë duke përdorur një kolonë Ascentis 8 mm 0 × 1 RP-0. ACN/H2O me 0,1% TFA.
Një fazë stacionare e polistirenit të ngulitur me polare u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e përzierjeve sintetike të peptideve dhe tretjen e porsinës së albuminës së serumit njerëzor (HAS) në kromatografinë e lëngshme të performancës së lartë. Performanca kromatografike e kolonave PMP për përzierjet e peptideve është e shkëlqyeshme në efikasitetin e ndarjes dhe rezolucionin për shkak të madhësisë së përmirësuar të grimcave PMP për arsye të ndryshme të madhësisë së PMP. i grimcave të silicës, sinteza e kontrolluar e fazës stacionare dhe paketimi kompleks i kolonës. Përveç efikasitetit të lartë të ndarjes, presioni i ulët i prapambetur i kolonës me ritme të larta rrjedhje është një tjetër avantazh i kësaj faze stacionare. Kolonat PMP shfaqin riprodhueshmëri të mirë dhe mund të përdoren për analizën e përzierjeve peptide dhe tretjen e tripsinës nga përbërësit natyral të dyfishtë në fund të proteinave, ne përdorim këtë përbërës natyral në fund të kësaj kolone. bimët dhe ekstraktet e kërpudhave në kromatografinë e lëngshme. Në të ardhmen, kolonat PMP do të vlerësohen edhe për ndarjen e proteinave dhe antitrupave monoklonale.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Kërkim mbi Sistemet e Ndarjes së Peptideve nga Kromatografia me Fazë të Reversed Pjesa I: Zhvillimi i një Protokolli të Karakterizimit të Kolonave.J.Kromatografia.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptide aktive të përmirësuara të dizajnuara për trajtimin e sëmundjeve infektive.Bioteknologjia.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic Peptides: Science and the market.zbulimi i barnave.15 (1-2) sot, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.2091.
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia e lëngshme Proteomike e Avancuar.J.Kromatografia.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografia e lëngshme e avancuar-spektrometria e masës mundëson përfshirjen e metabolomikës dhe proteomics.anus.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) me synim të gjerë.
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin e barnave.J.Shtator Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspekte themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion ultra të lartë për ndarje të shpejta.J.Shtator Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin e barnave.J.Kromatografia.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hidrogele makroporoze monolitike te pergatitura nga emulsione me faze te larte te brendshme vaj ne uje per pastrim efikas te enteroviruseve.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë.J.Kromatografia.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Tendencat në zhvillim në ndarjet me kromatografi të lëngshme me fazë të kundërt të peptideve dhe proteinave terapeutike: teori dhe aplikime.J.Farmaci.Shkenca Biomjekësore.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ndarja dydimensionale e peptideve duke përdorur një sistem RP-RP-HPLC duke përdorur vlera të ndryshme pH në dimensionet e ndarjes së parë dhe të dytë.J.Shtator Sci.28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.U hetuan karakteristikat e transferimit të masës dhe performanca kinetike e kolonave kromatografike me efikasitet të lartë të mbushura me grimca poroze plotësisht dhe sipërfaqësisht C18 nën-2 μm.J.Shtator Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tendencat e fundit dhe sfidat analitike në izolimin, identifikimin dhe vlefshmërinë e peptideve bioaktive të bimëve.anus.anus biologjik.Chemical.410(15), 3425-3444.https://doi.org/10.1007/s018-2016).
Mueller, JB et al. Peizazhi proteomik i mbretërisë së jetës.
DeLuca, C. et al. Përpunimi në rrjedhën e poshtme të peptideve terapeutike me anë të kromatografisë së lëngshme përgatitore. Molecule (Basel, Switzerland) 26 (15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe aplikimi i saj në biopolimerët.J.Kromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands për kromatografinë e proteinave me modalitet të përzier: parimi, karakterizimi dhe dizajni.J.Bioteknologjia.144(1), 3-11 (2009).