Faleminderit që vizituat Nature.com. Po përdorni një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Shfaq një karusel me tre diapozitiva njëherësh. Përdorni butonat "Më parë" dhe "Më pas" për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh, ose përdorni butonat e rrëshqitësit në fund për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh.
Grimcat poroze të silicës u përgatitën me metodën sol-xhel me disa modifikime për të përftuar grimca me pore të gjera. Këto grimca u derivatizuan me N-fenilmaleimid-metilvinil izocianat (PMI) dhe stiren nëpërmjet polimerizimit të transferimit të zinxhirit të kundërt-fragmentimit (RAFT) për të prodhuar poliamide të interkaluara me N-fenilmaleimid. Faza stacionare e stirenit (PMP). Kolonat prej çeliku inox me diametër të ngushtë (100 × 1.8 mm me diametër të brendshëm) u paketuan me një mbushje slurri. Performanca kromatografike e kolonës PMP u vlerësua për të ndarë një përzierje peptidesh sintetike të përbërë nga pesë peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, enkefalina e aminoacidit Leu) dhe hidrolizat triptik të albuminës së serumit njerëzor (HAS). Në kushte optimale të elucionit, numri teorik i pllakave me një përzierje peptidesh arriti në 280,000 pllaka/m². Duke krahasuar performancën e ndarjes së kolonës së zhvilluar me kolonën komerciale Ascentis Express RP-Amid, u vu re se efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP ishte më i lartë se kolona komerciale për sa i përket efikasitetit dhe rezolucionit të ndarjes.
Industria biofarmaceutike është bërë një treg global në zgjerim me një rritje të ndjeshme të pjesës së tregut në vitet e fundit. Me rritjen shpërthyese të industrisë biofarmaceutike1,2,3 ekziston një nevojë e madhe për analizën e peptideve dhe proteinave. Përveç peptidit të synuar, gjatë sintezës së peptideve formohen papastërti të ndryshme, kështu që kërkohet pastrimi kromatografik për të marrë pastërtinë e dëshiruar të peptidit. Analiza dhe karakterizimi i proteinave në lëngjet e trupit, indet dhe qelizat është një detyrë jashtëzakonisht sfiduese për shkak të numrit të madh të specieve potencialisht të zbulueshme të pranishme në një mostër të vetme. Megjithëse spektrometria masive është një mjet efektiv për sekuencimin e peptideve dhe proteinave, nëse mostra të tilla futen direkt në spektrometrin e masës, ndarja do të jetë e pakënaqshme. Ky problem mund të zgjidhet duke kryer kromatografi të lëngshme (LC) para analizës MS, e cila do të zvogëlojë sasinë e analitëve që hyjnë në spektrometrin e masës në një kohë të caktuar4,5,6. Përveç kësaj, analitët mund të përqendrohen në një rajon të ngushtë gjatë ndarjes së fazës së lëngshme, duke i përqendruar kështu këta analit dhe duke rritur ndjeshmërinë e zbulimit MS. Kromatografia e lëngshme (LC) ka përparuar ndjeshëm gjatë dekadës së fundit dhe është bërë një metodë e përdorur gjerësisht për analizën proteomike7,8,9,10.
Kromatografia e lëngshme me fazë të kundërt (RP-LC) përdoret gjerësisht për të pastruar dhe ndarë përzierjet e peptideve duke përdorur silicë të modifikuar me oktadecil (ODS) si fazë stacionare11,12,13. Megjithatë, për shkak të strukturës së tyre komplekse dhe natyrës amfoterike,14,15 fazat stacionare RP nuk mund të ofrojnë një ndarje të kënaqshme të peptideve dhe proteinave. Prandaj, analiza e peptideve dhe proteinave me fragmente polare dhe jopolare kërkon faza stacionare të projektuara posaçërisht për të bashkëvepruar dhe për të ruajtur këto analite16. Kromatografia e përzier, e cila ofron ndërveprime multimodale, mund të jetë një alternativë ndaj RP-LC për ndarjen e peptideve, proteinave dhe përzierjeve të tjera komplekse. U përgatitën disa faza stacionare të tipit të përzier dhe kolona të mbushura me këto faza stacionare u përdorën për të ndarë peptidet dhe proteinat17,18,19,20,21. Për shkak të pranisë së grupeve polare dhe jopolare, fazat stacionare të modës së përzier (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ndërthurja polare/RPLC) janë të përshtatshme për ndarjen e peptideve dhe proteinave22,23,24,25,26,27,28. , Fazat stacionare polare të ndërthurura me grupe polare të lidhura kovalente tregojnë aftësi të mira ndarjeje dhe selektivitet unik për analitët polare dhe jopolarë sepse ndarja varet nga bashkëveprimi midis analitit dhe fazës stacionare. Ndërveprimet multimodale 29,30,31,32. Kohët e fundit, Zhang et al. 30 morën faza stacionare të poliaminave të terminuara me behenil dhe ndanë me sukses hidrokarbure, antidepresivë, flavonoide, nukleozide, estrogjene dhe disa analit të tjerë. Materiali stacionar i ngulitur polar ka grupe si polare ashtu edhe jopolare, kështu që mund të përdoret për të ndarë peptidet dhe proteinat në pjesë hidrofobe dhe hidrofile. Kolonat polare në linjë (p.sh., kolonat C18 me amide në linjë) janë të disponueshme nën emrin tregtar kolonat Ascentis Express RP-Amid, por këto kolona janë përdorur vetëm për analizën e aminës 33.
Në studimin aktual, një fazë stacionare me ngulitje polare (N-fenilmaleimid, polistiren me ngulitje) u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e peptideve dhe copëtimin triptik të HSA-së. Strategjia e mëposhtme u përdor për të përgatitur fazën stacionare. Grimcat poroze të silicës u përgatitën sipas procedurave të përshkruara në botimet tona të mëparshme, me disa ndryshime në skemat e përgatitjes 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Raportet e uresë, polietilen glikolit (PEG), TMOS dhe acidit ujor acetik u rregulluan për të marrë grimca silice me madhësi të mëdha poresh. Së dyti, u sintetizua një ligand i ri fenilmaleimid-metilvinil izocianat dhe grimcat e tij të derivatizuara të silicës u përdorën për të përgatitur fazat stacionare polare të ngulitura. Faza stacionare e përftuar u paketua në një kolonë çeliku inox (diametri i brendshëm 100 × 1.8 mm) sipas një skeme paketimi të optimizuar. Paketimi i kolonës ndihmohet nga dridhjet mekanike për të siguruar një shtresë uniforme brenda kolonës. Kolona e paketuar u vlerësua për ndarjen e një përzierjeje peptidesh që përbëhet nga pesë peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptid leucinë-enkefalinë). dhe hidrolizat triptike të albuminës së serumit njerëzor (HSA). U vu re se përzierja e peptideve dhe tretja triptike e HSA u ndanë me rezolucion dhe efikasitet të mirë. Efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP u krahasua me atë të kolonës Ascentis Express RP-Amid. U vu re se peptidet dhe proteinat kanë rezolucion të mirë dhe efikasitet të lartë ndarjeje në kolonën PMP, dhe efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP është më i lartë se ai i kolonës Ascentis Express RP-Amid.
PEG (polietilen glikol), ure, acid acetik, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsinë, albuminë serumi njerëzor (HSA), klorur amoniumi, ure, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), klorur metakriloil (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, peroksid benzoili (BPO), acetonitril (ACN) për HPLC, metanol, 2-propanol dhe aceton. Kompania Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, SHBA).
Një përzierje ureje (8 g), polietilen glikol (8 g) dhe 8 ml acid acetik 0.01 N u trazua për 10 minuta dhe iu shtuan 24 ml TMOS nën ftohje me akull. Përzierja e reagimit u ngroh në 40°C për 6 orë dhe më pas në 120°C për 8 orë në një autoklavë çeliku inox. Uji u dekantua dhe mbetja u tha në 70°C për 12 orë. Blloqet e buta të thara u bluan butësisht dhe u kalcinuan në një furrë në 550°C për 12 orë. U përgatitën dhe u karakterizuan tre grupe për të testuar riprodhueshmërinë e madhësive të grimcave, madhësisë së poreve dhe sipërfaqes.
Grupi polar dhe faza stacionare për zinxhirët e polistirenit. Procedura e përgatitjes përshkruhet më poshtë.
N-fenilmaleimidi (200 mg) dhe metil vinil izocianati (100 mg) u tretën në toluen anhidrik, dhe më pas 0.1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) u shtua në balonën e reagimit për të përftuar një kopolimer të fenilmaleimidit dhe metil vinil izocianatit (PMCP). ) Përzierja u ngroh në 60°C për 3 orë, u filtrua dhe u tha në furrë në 40°C për 3 orë.
Grimcat e silicës së tharë (2 g) u shpërndanë në toluen të thatë (100 ml), u përzien dhe u nënshtruan ultratingujve për 10 minuta në një balonë me fund të rrumbullakët prej 500 ml. PMCP (10 mg) u tret në toluen dhe u shtua me pika në balonën e reagimit nëpërmjet një hinke shtese. Përzierja u ngroh në refluks në 100°C për 8 orë, u filtrua, u la me aceton dhe u tha në 60°C për 3 orë. Pastaj, grimcat e silicës të shoqëruara me PMCP (100 g) u tretën në toluen (200 ml), dhe 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) u shtua në prani të 100 μl dibutiltin dilaurat si katalizator. Përzierja u përzie në 50°C për 8 orë, u filtrua dhe u tha në 50°C për 3 orë.
Stireni (1 ml), peroksidi i benzoilit BPO (0.5 ml) dhe grimcat e silicës të bashkangjitura në TEMPO-PMCP (1.5 g) u shpërndanë në toluen dhe u pastruan me azot. Polimerizimi i stirenit u krye në 100°C për 12 orë. Produkti që rezultoi u la me metanol dhe u tha gjatë natës në 60°C. Skema e përgjithshme e reaksionit është treguar në fig. 1.
Mostrat u degazuan në 393 K për 1 orë derisa u arrit një presion i mbetur më i vogël se 10–3 Torr. Sasia e N2 e adsorbuar në presionin relativ P/P0 = 0.99 u përdor për të përcaktuar vëllimin total të poreve. Morfologjia e grimcave të silicës së pastër dhe të lidhur me ligand u ekzaminua duke përdorur një mikroskop elektronik skanues (Hitachi High Technologies, Tokio, Japoni). Mostrat e thata (silicë e pastër dhe grimca të silicës së lidhur me ligand) u vendosën në shufra alumini duke përdorur shirit karboni. Ari u depozitua në mostër duke përdorur një pajisje spërkatjeje Q150T, dhe një shtresë Au me trashësi 5 nm u depozitua në mostër. Kjo përmirëson efikasitetin e procesit të tensionit të ulët dhe siguron spërkatje të imët të ftohtë. Analiza elementare u krye duke përdorur një analizues të përbërjes elementare Thermo Electron (Waltham, MA, SHBA) Flash EA1112. Një analizues i madhësisë së grimcave Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 u përdor për të marrë shpërndarjen e madhësisë së grimcave. Grimcat e paveshura të silicës dhe grimcat e silicës të lidhura me ligand (5 mg secila) u shpërndanë në 5 ml izopropanol, u nënshtruan ultratingujve për 10 minuta, u trazuan për 5 minuta dhe u vendosën në një bankë optike Mastersizer. Analiza termogravimetrike kryhet me një shpejtësi prej 5 °C për minutë në diapazonin e temperaturës nga 30 deri në 800 °C.
Kolonat prej çeliku inox me diametër të ngushtë të veshura me fibra qelqi me dimensione (ID 100 × 1.8 mm) u paketuan me metodën e mbushjes me llaç duke ndjekur të njëjtën procedurë si në referencën 31. Kolona prej çeliku inox (e veshur me xham, ID 100 × 1.8 mm) dhe një dalje që përmbante një fritë 1 µm u lidh me një makinë paketimi llaçi (Alltech Deerfield, IL, SHBA). Përgatitni një pezullim të fazës stacionare duke pezulluar 150 mg të fazës stacionare në 1.2 ml metanol dhe duke e ushqyer atë në një kolonë rezervuari. Metanoli u përdor si tretës llaçi dhe tretës kontrolli. Paketoni kolonën duke aplikuar një sekuencë presioni prej 100 MP për 10 minuta, 80 MP për 15 minuta dhe 60 MP për 30 minuta. Procesi i paketimit përdori dy vibratorë kolonash të kromatografisë me gaz (Alltech, Deerfield, IL, SHBA) për dridhje mekanike për të siguruar paketim uniform të kolonës. Mbylleni paketuesin e llaçit dhe lironi presionin ngadalë për të parandaluar dëmtimin e vargut. Kolona u shkëput nga gryka e slurit dhe një pajisje tjetër u lidh në hyrje dhe u lidh me sistemin LC për të testuar funksionimin e saj.
Një MLC i personalizuar u ndërtua duke përdorur një pompë LC (10AD Shimadzu, Japoni), një marrës mostrash me një lak injeksioni prej 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), një degazues membrane (Shimadzu DGU-14A) dhe një dritare kapilare UV-VIS. Pajisje detektorësh (UV-2075) dhe mikrokolonë e emaluar. Përdorni tuba lidhës shumë të ngushtë dhe të shkurtër për të minimizuar efektin e zgjerimit shtesë të kolonës. Pas mbushjes së kolonës, instaloni një kapilar (50 µm id 365) në daljen e kryqëzimit reduktues 1/16″ dhe instaloni një kapilar (50 µm) të kryqëzimit reduktues. Mbledhja e të dhënave dhe përpunimi i kromatogramit kryhen duke përdorur programin Multichro 2000. Në 254 nm, thithja UV e analitëve të subjekteve u monitorua në 0. Të dhënat kromatografike u analizuan duke përdorur OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina e serumit njerëzor, pluhur i liofilizuar, ≥ 96% (elektroforezë në xhel agaroze) 3 mg e përzier me tripsinë (1.5 mg), 4.0 M ure (1 ml) dhe 0.2 M bikarbonat amoni (1 ml). Tretësira u përzie për 10 minuta dhe u mbajt në një banjë uji në 37°C për 6 orë, pastaj u shua me 1 ml TFA 0.1%. Filtrohet tretësira dhe ruhet nën 4°C.
Ndarja e një përzierjeje peptidesh dhe HSA të tretur triptik në një kolonë PMP u vlerësua veçmas. Kontrolloni hidrolizën triptike të një përzierjeje peptidesh dhe HSA të ndarë nga një kolonë PMP dhe krahasoni rezultatet me një kolonë Ascentis Express RP-Amid. Numri i pllakave teorike llogaritet duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm:
Imazhet SEM të grimcave të silicës së pastër dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand tregohen në Figurën 2. Imazhet SEM të grimcave të silicës së pastër (A, B) tregojnë një formë sferike në të cilën grimcat janë të zgjatura ose kanë simetri të parregullt krahasuar me studimet tona të mëparshme. Sipërfaqja e grimcave të silicës të lidhura nga ligandi (C, D) është më e lëmuar se ajo e grimcave të silicës së pastër, gjë që mund të jetë për shkak të zinxhirëve të polistirenit që mbulojnë sipërfaqen e grimcave të silicës.
Mikrografi elektronike skanuese të grimcave të silicës së pastër (A, B) dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand (C, D).
Shpërndarja e madhësisë së grimcave të grimcave të silicës së pastër dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand është treguar në Fig. 2. 3(A). Kurbat e shpërndarjes volumetrike të madhësisë së grimcave treguan se madhësia e grimcave të silicës u rrit pas modifikimit kimik (Fig. 3A). Të dhënat e shpërndarjes së madhësisë së grimcave të silicës nga studimi aktual dhe studimi i mëparshëm krahasohen në Tabelën 1(A). Madhësia volumetrike e grimcave d(0.5) e PMP ishte 3.36 µm, krahasuar me vlerën ad(0.5) prej 3.05 µm në studimin tonë të mëparshëm (grimca silice të lidhura me polistiren)34. Për shkak të ndryshimit në raportin e PEG, uresë, TMOS dhe acidit acetik në përzierjen e reagimit, shpërndarja e madhësisë së grimcave të kësaj serie ishte më e ngushtë krahasuar me studimin tonë të mëparshëm. Madhësia e grimcave të fazës PMP është pak më e madhe se ajo e fazës së grimcave të silicës së lidhur me polistiren që studiuam më parë. Kjo do të thotë që funksionalizimi sipërfaqësor i grimcave të silicës me stiren depozitoi vetëm një shtresë polistireni (0.97 µm) në sipërfaqen e silicës, ndërsa në fazën PMP trashësia e shtresës ishte 1.38 µm.
Shpërndarja e madhësisë së grimcave (A) dhe shpërndarja e madhësisë së poreve (B) e grimcave të silicës së pastër dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand.
Madhësia e poreve, vëllimi i poreve dhe sipërfaqja e grimcave të silicës të përdorura në këtë studim tregohen në Tabelën 1 (B). Profilet PSD të grimcave të silicës së pastër dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand tregohen në Fig. 3(B). Rezultatet ishin të krahasueshme me studimin tonë të mëparshëm34. Madhësitë e poreve të grimcave të silicës së pastër dhe të lidhur me ligand ishin përkatësisht 310 Å dhe 241 Å, duke treguar se pas modifikimit kimik, madhësia e poreve u zvogëlua me 69 Å, siç tregohet në Tabelën 1 (B), dhe kurba e zhvendosjes tregohet në Fig. Sipërfaqja specifike e grimcave të silicës në studimin aktual është 116 m2/g, e cila është e krahasueshme me studimin tonë të mëparshëm (124 m2/g). Siç tregohet në Tabelën 1(B), sipërfaqja (m2/g) e grimcave të silicës pas modifikimit kimik gjithashtu u ul nga 116 m2/g në 105 m2/g.
Rezultatet e analizës elementare të fazës stacionare paraqiten në Tabelën 2. Përmbajtja e karbonit në fazën stacionare aktuale është 6.35%, që është më e ulët se në studimin tonë të mëparshëm (grimca silici të shoqëruara me polistiren, përkatësisht 7.93%35 dhe 10.21%). 42. Përmbajtja e karbonit në fazën stacionare aktuale më poshtë, pasi disa ligandë polarë si fenilmaleimidi metil vinil izocianat (PCMP) dhe 4-hidroksi-TEMPO janë përdorur përveç stirenit në përgatitjen e SP. Përqindja në peshë e azotit në fazën stacionare aktuale është 2.21% krahasuar me 0.1735 dhe 0.85% në studimet e mëparshme. 42. Kjo do të thotë që faza stacionare aktuale ka një përqindje të lartë në peshë të azotit për shkak të fenilmaleimidit. Në mënyrë të ngjashme, produktet (4) dhe (5) kanë një përmbajtje karboni prej 2.7% dhe 2.9%, përkatësisht, ndërsa produkti përfundimtar (6) ka një përmbajtje karboni prej 6.35%, siç tregohet në Tabelën 2. Analiza termogravimetrike (TGA) u përdor në fazën stacionare të PMP për të testuar humbjen e peshës, dhe kurba TGA është treguar në Figurën 4. Kurba TGA tregon një humbje peshe prej 8.6%, e cila është në përputhje të mirë me përmbajtjen e karbonit (6.35%), pasi ligandët përmbajnë jo vetëm C, por edhe N, O dhe H.
Ligandi fenilmaleimid-metilvinil izocianat u zgjodh për të modifikuar sipërfaqen e grimcave të silicës për shkak të grupeve të tij polare fenilmaleimid dhe vinilizocianat. Grupet vinil izocianat mund të reagojnë më tej me stirenin duke polimerizuar radikalin e gjallë. Arsyeja e dytë është të futet një grup që ka ndërveprime të moderuara me analitin dhe pa ndërveprime të forta elektrostatike midis analitit dhe fazës stacionare, pasi pjesa e fenilmaleimidit nuk ka ngarkesë virtuale në pH normal. Polariteti i fazës stacionare mund të kontrollohet nga sasia optimale e stirenit dhe koha e reagimit të polimerizimit të radikaleve të lira. Hapi i fundit i reagimit (polimerizimi i radikaleve të lira) është kritik pasi ndryshon polaritetin e fazës stacionare. Analiza elementare u krye për të kontrolluar përmbajtjen e karbonit në këto faza stacionare. Është vërejtur se rritja e sasisë së stirenit dhe kohës së reagimit rrit përmbajtjen e karbonit të fazës stacionare dhe anasjelltas. SP-të e përgatitura me përqendrime të ndryshme të stirenit kanë ngarkesa të ndryshme karboni. Në mënyrë të ngjashme, këto faza stacionare u vendosën në kolona çeliku inox dhe u kontrolluan karakteristikat e tyre kromatografike (selektiviteti, rezolucioni, vlera e N, etj.). Bazuar në këto eksperimente, u zgjodh një përbërje e optimizuar për përgatitjen e fazës stacionare PMP për të siguruar polaritet të kontrolluar dhe mbajtje të mirë të analitit.
Kolona PMP u vlerësua gjithashtu për analizën e pesë përzierjeve të peptideve (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinë-enkefalinë) duke përdorur kapacitetin e fazës mobile. 60/40 (v/v) ACN/ujë (0.1% TFA) me një shpejtësi rrjedhjeje prej 80 µl/min. Nën kushte optimale të elucionit (200,000 pllaka/m2), numri i pllakave teorike (N) për kolonë (100 × 1.8 mm) është 20,000 ± 100. Vlerat N për tre kolonat PMP tregohen në Tabelën 3 dhe kromatogramet tregohen në Figurën 5A. Analizë e shpejtë me shpejtësi të lartë rrjedhjeje (700 µl/min) në një kolonë PMP, pesë peptide të eluuara brenda një minute, vlerë e shkëlqyer e N prej 13,500 ± 330 për kolonë (diametër 100 x 1.8 mm), ekuivalente me 135,000 pllaka/m2 (Fig. 5B). Tre kolona me të njëjtën madhësi (diametri i brendshëm 100 x 1.8 mm) u mbushën me tre grupe të ndryshme të fazës stacionare PMP për të testuar riprodhueshmërinë. Analitët u regjistruan për secilën kolonë duke ndarë të njëjtën përzierje testimi në secilën kolonë duke përdorur kushte optimale të elucionit, numrin e pllakave teorike N dhe kohën e mbajtjes. Të dhënat e riprodhueshmërisë për kolonat PMP tregohen në Tabelën 4. Riprodhueshmëria e kolonës PMP korreloi mirë me vlera shumë të ulëta %RSD siç tregohet në Tabelën 3.
Ndarja e përzierjeve të peptideve në një kolonë PMP (B) dhe një kolonë Ascentis Express RP-Amid (A), faza mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensionet e kolonës PMP (100 x 1.8 mm id), analiza. Rendi i elucionit të komponimeve: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dhe 5 (enkefalina e acidit leukik).
Një kolonë PMP (diametri i brendshëm 100 x 1.8 mm) u vlerësua për ndarjen e hidrolizatit triptik të albuminës së serumit njerëzor me anë të HPLC. Kromatograma në Figurën 6 tregon se mostrat janë të ndara mirë me rezolucion shumë të mirë. Tretësirat HSA u analizuan duke përdorur një shpejtësi rrjedhjeje prej 100 μl/min, një fazë mobile prej 70/30 acetonitril/ujë dhe 0.1% TFA. Copëtimi i HSA u nda në 17 maja, siç tregohet në kromatogram (Fig. 6), që korrespondojnë me 17 peptide. Efikasiteti i ndarjes së majave individuale nga hidrolizat HSA u llogaritën dhe vlerat tregohen në Tabelën 5.
Hidrolizat triptike të HSA u ndanë në një kolonë PMP (diametri i brendshëm 100 x 1.8 mm), shpejtësia e rrjedhjes (100 μl/min), faza mobile 60/40 acetonitril/ujë dhe 0.1% TFA.
ku L është gjatësia e kolonës, η është viskoziteti i fazës mobile, ΔP është presioni i kundërt i kolonës dhe u është shpejtësia lineare e fazës mobile. Përshkueshmëria e kolonës PMP ishte 2.5 × 10–14 m2, shkalla e rrjedhjes ishte 25 µl/min, u përdor 60/40 v/v. ACN/ujë. Përshkueshmëria e kolonës PMP (ID 100 × 1.8 mm) ishte e ngjashme me atë të studimit tonë të mëparshëm Ref.34. Përshkueshmëria e një kolone të mbushur me grimca sipërfaqësisht poroze është 1.7×10 0.6 µm, 2.5×10-14 m2 për grimca 5 µm43. Prandaj, përshkueshmëria e fazës PMP është e ngjashme me përshkueshmërinë e grimcave bërthamë-guaskë me një madhësi prej 5 μm.
ku Wx është masa e kolonës së mbushur me kloroform, Wy është masa e kolonës së mbushur me metanol, dhe ρ është dendësia e tretësit. Dendësia e metanolit (ρ = 0.7866) dhe kloroformit (ρ = 1.484). Poroziteti total i kolonës së grimcave silicë-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 dhe kolonës sonë të studiuar më parë C18-ure31 ishte përkatësisht 0.63 dhe 0.55. Kjo do të thotë që prania e ligandëve të uresë zvogëlon përshkueshmërinë e fazës stacionare. Nga ana tjetër, poroziteti total i kolonës PMP (diametri i brendshëm 100 × 1.8 mm) është 0.60. Kolonat PMP janë më pak të përshkueshme se kolonat e mbushura me grimca silicë të lidhura me C18 sepse në fazat stacionare të tipit C18 ligandët C18 janë të bashkangjitur në grimcat e silicës në zinxhirë linearë, ndërsa në fazat stacionare të tipit polistiren një polimer relativisht i trashë formohet rreth grimcave. shtresa A. Në një eksperiment tipik, poroziteti i kolonës llogaritet si më poshtë:
Në fig. 7A, B tregojnë grafikët Van Deemter për një kolonë PMP (id 100 x 1.8 mm) dhe një kolonë Ascentis Express RP-Amid (id 100 x 1.8 mm) në të njëjtat kushte elucioni, 60/40 ACN/H2O dhe 0.1% TFA 20 µl/min deri në 800 µl/min në të dyja kolonat. Vlerat minimale të HETP në shpejtësinë optimale të rrjedhjes (80 µl/min) ishin përkatësisht 2.6 µm dhe 3.9 µm për kolonën PMP dhe kolonën Ascentis Express RP-Amid. Vlerat e HETP tregojnë se efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP (id 100 x 1.8 mm) është shumë më i lartë se ai i kolonës Ascentis Express RP-Amid të disponueshme në treg (id 100 x 1.8 mm). Grafiku van Deemter në Fig. 7(A) tregon se ulja e vlerës së N nuk është dukshëm më e lartë me rritjen e rrjedhës krahasuar me studimin tonë të mëparshëm. Efikasiteti më i lartë i ndarjes së kolonës PMP (id 100 × 1.8 mm) krahasuar me kolonën Ascentis Express RP-Amid bazohet në formën dhe madhësinë e përmirësuar të grimcave dhe procedurën e sofistikuar të paketimit të kolonës të përdorur në punën aktuale34.
(A) Grafiku Van Deemter (shpejtësia lineare HETP kundrejt fazës mobile) i marrë në një kolonë PMP (id 100 x 1.8 mm) në 60/40 ACN/H2O me 0.1% TFA. (B) Grafiku Van Deemter (HETP kundrejt shpejtësisë lineare të fazës mobile) i marrë në një kolonë Ascentis Express RP-Amid (id 100 x 1.8 mm) në 60/40 ACN/H2O me 0.1% TFA.
Një fazë stacionare polare e polistirenit të interkaluar u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e një përzierjeje të peptideve sintetike dhe hidrolizatit triptik të albuminës së serumit njerëzor (HSA) në kromatografinë e lëngshme me performancë të lartë. Performanca kromatografike e kolonave PMP për përzierjet e peptideve është e shkëlqyer për sa i përket efikasitetit dhe rezolucionit të ndarjes. Efikasiteti i përmirësuar i ndarjes së kolonave PMP është për shkak të disa arsyeve, të tilla si madhësia e grimcave të silicës dhe madhësia e poreve, sinteza e kontrolluar e fazave stacionare dhe materialet komplekse të paketimit të kolonës. Përveç efikasitetit të lartë të ndarjes, një tjetër avantazh i kësaj faze stacionare është presioni i ulët i kundërt i kolonës në shpejtësi të larta rrjedhjeje. Kolonat PMP janë shumë të riprodhueshme dhe mund të përdoren për të analizuar përzierjet e peptideve dhe tretjen triptike të proteinave të ndryshme. Ne synojmë ta përdorim këtë kolonë për ndarjen e komponimeve bioaktive nga produktet natyrore, ekstraktet e bimëve medicinale dhe kërpudhat në kromatografinë e lëngshme. Në të ardhmen, kolonat PMP do të vlerësohen gjithashtu për ndarjen e proteinave dhe antitrupave monoklonalë.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Hetimi mbi sistemet e ndarjes së peptideve me kromatografi të fazës së kundërt, pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakterizimin e kolonës. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Hetimi mbi sistemet e ndarjes së peptideve me kromatografi të fazës së kundërt, pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakterizimin e kolonës.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dhe Petersson, P. Hetimi i sistemeve të ndarjes së peptideve me anë të kromatografisë me fazë të kundërt, Pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakterizimin e kolonës. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Hetimi mbi sistemet e ndarjes së peptideve me kromatografi të fazës së kundërt, pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakteristikat e kolonës. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Hetimi mbi sistemet e ndarjes së peptideve me kromatografi të fazës së kundërt, pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakteristikat e kolonës.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dhe Petersson, P. Hetimi i sistemeve të ndarjes së peptideve me anë të kromatografisë me fazë të kundërt, Pjesa I: Zhvillimi i një protokolli për karakterizimin e kolonës.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)".
Gomez, B. et al. Metoda për krijimin e peptideve aktive të përmirësuara për trajtimin e sëmundjeve infektive. Bioteknologjia. Arritjet 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide terapeutike sintetike: Shkenca dhe tregu. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide terapeutike sintetike: Shkenca dhe tregu.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dhe Chreschatyski M. Peptide terapeutike sintetike: shkenca dhe tregu.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dhe Khreschatsky M. Peptidet terapeutike sintetike: shkenca dhe tregu. zbulimi i barnave. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi e lëngshme proteomike e avancuar. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi e lëngshme proteomike e avancuar.Shih F., Smith RD dhe Shen Yu. Kromatografia e lëngshme proteomike e avancuar. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Përbërja e avancuar e proteinave 液相色谱.Shih F., Smith RD dhe Shen Yu. Kromatografia e lëngshme proteomike e avancuar.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografia e lëngshme e avancuar - spektrometria masive është në gjendje të kombinojë metabolomikën dhe proteomikën me bazë të gjerë. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin farmaceutik. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin farmaceutik.Chesnut, SM dhe Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin farmaceutik.Chesnut, SM dhe Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin e barnave. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspektet themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion ultra të lartë për ndarje të shpejta. Wu, N. & Clausen, AM Aspektet themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion ultra të lartë për ndarje të shpejta.Wu, N. dhe Clausen, AM Aspektet themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion të lartë për ndarje të shpejtë. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspekte bazë dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion ultra të lartë për ndarje të shpejtë.Wu, N. dhe Clausen, AM Aspektet themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion të lartë për ndarje të shpejtë.J. Sep. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Përdorimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin farmaceutik. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Përdorimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin farmaceutik.Ren, SA dhe Chelischeff, P. Përdorimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin farmaceutik. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA dhe Tchelitcheff, P.Ren, SA dhe Chelischeff, P. Zbatimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin e barnave.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Një hidrogel monolit makroporoz i nxjerrë nga një emulsion vaj-në-ujë me një fazë të brendshme të lartë për pastrim efikas të enterovirusit 71. Projekt Kimik. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dhe Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dhe Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Trendet e reja në ndarjet kromatografike të lëngshme me fazë të kundërt të peptideve dhe proteinave terapeutike: Teoria dhe zbatimet. & Guillarme, D. Trendet e reja në ndarjet kromatografike të lëngshme me fazë të kundërt të peptideve dhe proteinave terapeutike: Teoria dhe zbatimet. & Guillarme, D. Tendencat e reja në disa veçori terapeutike terapeutike dhe belkov me ndihmën e hidkostnoy hromatographies me обращенной фазой: теория и примена. & Guillarme, D. Trendet e reja në ndarjen e peptideve dhe proteinave terapeutike me anë të kromatografisë së lëngshme me fazë të kundërt: teoria dhe zbatimet. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.dhe Guillarmé, D. Trendet e reja në ndarjen e peptideve dhe proteinave terapeutike me anë të kromatografisë së lëngshme me fazë të kundërt: teoria dhe zbatimet.J. Pharm. Shkenca Biomjekësore. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ndarja dy-dimensionale e peptideve duke përdorur sistemin RP-RP-HPLC me pH të ndryshëm në dimensionin e parë dhe të dytë të ndarjes. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ndarja dy-dimensionale e peptideve duke përdorur sistemin RP-RP-HPLC me pH të ndryshëm në dimensionin e parë dhe të dytë të ndarjes.Gilar M., Olivova P., Dali AE dhe Gebler JK Ndarja dy-dimensionale e peptideve duke përdorur sistemin RP-RP-HPLC me pH të ndryshëm në dimensionin e parë dhe të dytë të ndarjes.Gilar M., Olivova P., Dali AE dhe Gebler JK Ndarja dy-dimensionale e peptideve duke përdorur vlera të ndryshme të pH-it në dimensionin e parë dhe të dytë të ndarjes duke përdorur sistemin RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Hetimi i transferimit të masës dhe karakteristikave kinetike të kolonave të kromatografisë me performancë të lartë të mbushura me grimca C18 plotësisht poroze dhe sipërfaqësisht poroze më të vogla se 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Trendet e fundit dhe sfidat analitike në izolimin, identifikimin dhe validimin e peptideve bioaktive të bimëve. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Peizazhi proteomik i mbretërisë së jetës. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Pas-trajtimi i peptideve terapeutike me anë të kromatografisë së lëngshme përgatitore. Molecules (Bazel, Zvicër) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimet e saj në biopolimerë. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimet e saj në biopolimerë.Yang, Yu. dhe Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimi i saj në biopolimerë. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimi i saj në biopolimerë.Yang, Yu. dhe Gene, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimi i saj në biopolimerë.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).