Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Lupina Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) është një bimë bishtajore që përdoret për prodhimin e ushqimit dhe përmirësimin e tokës.Zgjerimi global i NLL si një kulturë ka tërhequr shumë kërpudha patogjene, duke përfshirë antraknozën lupine, e cila shkakton sëmundjen shkatërruese të anthraknozës.Dy alele, Lanr1 dhe AnMan, të cilat japin rezistencë të shtuar, janë përdorur në mbarështimin e NLL, por mekanizmat themelorë molekularë mbeten të panjohur.Në këtë studim, shënuesit Lanr1 dhe AnMan u përdorën për të ekzaminuar mostrat evropiane të NLL.Testimi i vaksinës në një mjedis të kontrolluar konfirmoi efikasitetin e të dy donatorëve rezistent.Profilizimi i shprehjes diferenciale të gjenit u krye në linja përfaqësuese rezistente dhe të ndjeshme.Rezistenca ndaj antraknozës u shoqërua me mbishprehjen e termave të ontologjisë gjenetike "GO:0006952 Reagimi i Mbrojtjes", "GO:0055114 Procesi Redox" dhe "GO:0015979 Fotosinteza".Për më tepër, linja Lanr1 (83A: 476) tregoi riprogramim domethënës të transkriptomit me shpejtësi pas inokulimit, ndërsa linjat e tjera treguan një vonesë në këtë përgjigje me rreth 42 orë.Përgjigjet mbrojtëse shoqërohen me gjenet TIR-NBS, CC-NBS-LRR dhe NBS-LRR, 10 proteina të përfshira në patogjenezë, proteinat e transferimit të lipideve, endoglukan-1,3-β-glukozidazën, proteinat e murit qelizor të pasura me glicinë dhe gjenet nga rruga reaktive e oksigjenit.Përgjigjet e hershme ndaj 83A:476, duke përfshirë shtypjen e kujdesshme të gjeneve të lidhura me fotosintezën, përkoi me mbrojtjen e suksesshme gjatë fazës së rritjes vegjetative të biologjisë fungale, duke sugjeruar që një efektor shkakton imunitet.Reagimi Mandeloop ngadalësohet, ashtu si edhe zvarritja e përgjithshme horizontale.
Lupina me gjethe të ngushtë (NLL, Lupinus angustifolius L.) është një drithëra me shumë proteina me origjinë nga rajoni perëndimor i Mesdheut1,2.Aktualisht rritet si një kulturë ushqimore për kafshët dhe njerëzit.Konsiderohet gjithashtu pleh i gjelbër në sistemet e rrotullimit të të korrave për shkak të fiksimit të azotit nga bakteret simbiotike fiksuese të azotit dhe përmirësimit të përgjithshëm të strukturës së tokës.NLL i është nënshtruar një procesi të shpejtë zbutjeje në shekullin e kaluar dhe është ende nën presionin e lartë të mbarështimit3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Me kultivimin e përhapur të NLL, një varg i kërpudhave patogjene krijuan zona të reja bujqësore dhe shkaktuan sëmundje të reja që shkatërronin të korrat. Më e shquara për fermerët dhe mbarështuesit e lupinës ishte shfaqja e antraknozës, e shkaktuar nga kërpudhat patogjene, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Më e shquara për fermerët dhe mbarështuesit e lupinës ishte shfaqja e antraknozës, e shkaktuar nga kërpudhat patogjene, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным за фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Më e dukshme për fermerët dhe mbarështuesit e lupinës ishte shfaqja e antraknozës së shkaktuar nga kërpudhat patogjene Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猎umlletopin , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猲umlletopin Me flokë. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Më e habitshme për fermerët dhe mbarështuesit e lupinave është shfaqja e antraknozës e shkaktuar nga kërpudhat patogjene Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Raportet më të hershme të sëmundjes erdhën nga Brazili dhe Shtetet e Bashkuara, me simptoma tipike që u shfaqën përkatësisht në 1912 dhe 1929.Megjithatë, pas rreth 30 vjetësh, patogjeni u caktua si Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfi i Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld во Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld në Morfologjinë e synuar. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.dhe H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.dhe H. Schlenk,.Fenotipi paraprak i sëmundjes i bërë në mesin e shekullit të 20-të tregoi njëfarë rezistence në ngjitjet e NLL dhe lupinës së verdhë (L. luteus L.), por të gjitha ngjitjet e lupinës së bardhë (L. albus L.) të testuara ishin shumë të ndjeshme15,16.Studimet kanë treguar se zhvillimi i antraknozës shoqërohet me rritje të reshjeve (lagështia e ajrit) dhe temperaturës (në intervalin 12-28°C), duke çuar në një shkelje të rezistencës në temperatura më të larta17, 18. Në fakt, koha e nevojshme për mbirjen e konideve dhe fillimin e sëmundjes, ishte katër herë më e shkurtër në 24°C (1.9 orë në kushte të larta se 1°C (1.2 orë) në kushte lagështie të lartë (4.1°C)Kështu, ngrohja e vazhdueshme globale ka çuar në përhapjen e antraknozës.Megjithatë, sëmundja u vu re në Francë (1982) dhe Ukrainë (1983) si një pararojë e një kërcënimi të afërt, por me sa duket u injorua nga industria e lupinave në atë kohë20,21.Disa vite më vonë, kjo sëmundje shkatërruese u përhap në të gjithë botën dhe preku gjithashtu vendet kryesore prodhuese të lupinës si Australia, Polonia dhe Gjermania22,23,24.Pas një shpërthimi të antraknozës në mesin e viteve 1990, ekzaminimi i gjerë rezultoi në identifikimin e disa donatorëve rezistent në mostrat NLL19.Rezistenca e NLL ndaj antraknozës kontrollohet nga dy alele të veçanta mbizotëruese që gjenden në burime të ndryshme të germplazmës: Lanr1 në kultivarin Tanjil dhe Wonga dhe AnMan në kultivar.Mandalay 25, 26. Këto alele plotësojnë shënuesit molekularë që mbështesin përzgjedhjen e germplazmës rezistente në programet e mbarështimit25,26,27,28,29,30.Linja e rritjes rezistente 83A:476 që mbante alelin Lanr1 u kryqëzua me linjën e egër të ndjeshme P27255 për të marrë një popullsi RIL që ndahet për rezistencën ndaj antraknozës, gjë që bëri të mundur caktimin e vendndodhjes Lanr1 në kromozomin NLL-1131, 32, shënjimi i rezistencës së alternimit nga 32. një kuadër gjenomik, NLL zbuloi vendndodhjen e të tre aleleve në të njëjtin kromozom (NLL-11), por në pozicione të ndryshme29,34,35.Megjithatë, për shkak të numrit të vogël të RIL-ve dhe distancës së madhe gjenetike midis shënuesve dhe aleleve përkatëse, nuk mund të nxirren përfundime të besueshme për gjenet e tyre themelore.Nga ana tjetër, përdorimi i gjenetikës së kundërt në lupin është i vështirë për shkak të potencialit të tyre shumë të ulët rigjenerues, gjë që e bën manipulimin gjenetik të rëndë37.
Zhvillimi i germplazmës së zbutur që mban alelin e dëshiruar në gjendjen homozigote, si 83A:476 (Lanr1) dhe Mandelup (AnMan), ka hapur derën për studimin e rezistencës ndaj antraknozës përballë pranisë së kombinimeve të kundërta të aleleve në popullatat e egra.Mundësitë e mekanizmave molekularë.Krahasoni përgjigjet mbrojtëse të krijuara nga gjenotipe specifike.Ky studim vlerësoi përgjigjen e hershme të transkriptimit të NLL ndaj vaksinimit të C. lupini.Së pari, një panel germplazmi evropian NLL që përmban 215 linja u ekzaminua duke përdorur shënues molekularë që shënojnë alelet Lanr1 dhe AnMan.Më pas u krye fenotipizimi i antraknozës në 50 linja NLL, të përzgjedhura më parë për shënuesit molekularë, në kushte të kontrolluara.Bazuar në këto eksperimente, katër linja të ndryshme në rezistencën ndaj antraknozës dhe përbërjen alelike Lanr1/AnMan u zgjodhën për profilizimin e shprehjes së gjeneve të mbrojtjes diferenciale duke përdorur dy qasje plotësuese: sekuenca e ARN-së me performancë të lartë dhe sasia e PCR në kohë reale.
Ekzaminimi i një grupi të germplazmës NLL (N = 215) me shënuesit Lanr1 (Anseq3 dhe Anseq4) dhe AnMan (Anseq4) dhe AnMan (AnManM1) tregoi se vetëm një rresht (95726, afër Salamanca-b) përforcon "rezistencën" e shenjës së të gjithëve, ndërsa "rezistenca" e "aleleres" të gjetura për të gjithë në 158 (~73.5%) rreshta.Trembëdhjetë linja prodhuan dy alele "rezistente" të shënuesit Lanr1 dhe 8 rreshta prodhuan alele "rezistente" të Lanr1.shënues.Aleli i "rezistencës" së shënuesit AnMan (Tabela Suplementare S1).Dy linja ishin heterozigote për shënuesin Anseq3 dhe një heterozigote për shënuesin AnManM1.42 linja (19.5%) bartnin faza të kundërta të aleleve Anseq3 dhe Anseq4, duke treguar një frekuencë të lartë të rikombinimit midis këtyre dy lokacioneve.Fenotipet e antraknozës në kushte të kontrolluara (Tabela Suplementare S2) zbuluan ndryshueshmëri në rezistencën e gjenotipeve të testuara, gjë që u reflektua në ashpërsinë e anthraknozës.Dallimet në rezultatet mesatare varionin nga 1.8 (mesatarisht rezistent) në 6.9 (të ndjeshme) dhe diferencat në peshën e bimëve varionin nga 0.62 (të ndjeshme) në 4.45 g (rezistente). Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0.51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0.00017 dhe 0.61 për peshën e bimës, P <0.0001) si dhe midis këtyre dy parametrave (− 0.59 dhe − 0.77, P <0.000). Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0.51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0.00017 dhe 0.61 për peshën e bimës, P <0.0001) si dhe midis këtyre dy parametrave (− 0.59 dhe − 0.77, P <1 0.0). Выявлена ​​Достоверная корреляция между значениями, nablyudaemыmi në dy herë përsëritje eksperimenta (0,51 për balllov тяжести болезни, P = 0,00017 dhe 0,61 për çdo masë të madhe, 0,51 për ballov тяжести болезни, P = 0,00017 dhe 0,61 për çdo masë të madhe <1,0,00). умя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). U gjet një korrelacion i rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0,51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0,00017 dhe 0,61 për peshën e bimës, P <0,0001), si dhe midis këtyre dy parametrave (- 0,59 dhe -0,77, P <10,00).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P.10，0分0.物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 䆺刦 5. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（0（0（及和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, naблюдаемыми në dy herë përsëritjah (vlerësimi тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 dhe massa në rritje 0,61, P <0,0001, p <0,0001, pëllëmbë -0001), 001) 0,77, P <0,0001. Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dyfishim (rezultati i ashpërsisë së sëmundjes 0.51, P = 0.00017 dhe pesha e bimës 0.61, P <0.0001) dhe midis këtyre dy parametrave (-0.59 dhe -0.0001) 0.77, P1.0001, P<0.00 ).Simptomat tipike që shihen te bimët e ndjeshme përfshijnë përthyerjen dhe përdredhjen e kërcellit që i ngjan strukturës së "harkut të bariut", e ndjekur nga lezione ovale me sporozoite portokalli/rozë (Fig. 1 plotësuese).Aderimet Australiane që mbartin gjenet Lanr1 (83A:476 dhe Tanjil) dhe AnMan (Mandelup) janë mesatarisht rezistente, 0.0331 dhe 0.0036.Disa linja që mbartin gjithashtu alele "rezistente" Lanr1 dhe/ose AnMan shfaqin simptoma të sëmundjes.
Është interesante se disa linja NLL pa ndonjë alel shënues "rezistent" zbuluan një nivel të lartë të rezistencës ndaj antraknozës (të krahasueshme ose më të lartë se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0.0001 për të dy parametrat), Bojar (vlera P < 0.0001 dhe vlera B01 për pikën e popullatës dhe 01-90 b0). .0001 për pikë dhe jo të rëndësishme për peshën). Është interesante se disa linja NLL pa ndonjë alel shënues "rezistent" zbuluan një nivel të lartë të rezistencës ndaj antraknozës (të krahasueshme ose më të lartë se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0.0001 për të dy parametrat), Bojar (vlera P < 0.0001 dhe vlera B01 për pikën e popullatës dhe 01-90 b0). .0001 për pikë dhe jo të rëndësishme për peshën). Interesno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем для млаго, чем для млазня), P <0,0001 для обоих параметри), Bojar (domethënia P < 0,0001 dля оценки и 0,001 для массы во rritje) dhe popullariteti B-549/79b (domethënia P <0,0001 dля оценки незначително). Është interesante se disa linja NLL pa ndonjë alel shënues 'rezistent' treguan një nivel të lartë rezistence ndaj antraknozës (të krahasueshme ose më të larta se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0,0001 për të dy parametrat ), Bojar (vlera P < 0,0001 pesha < 0,0001 për vlerësimin e bimëve dhe vlera P 0.0001 < 0001 për vlerësimin dhe . 0.0001 për vlerësim dhe jo domethënëse për peshën).有趣的是，一些缺乏任何"抗性"标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭n疽një 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得0分0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值<0.0001，重量不显着）. Është interesant fakti që disa sisteme NLL që nuk kanë asnjë shënues “antigjenik” tregojnë rezistencë të lartë horizontale (ekuivalente me gjenet Lanr1 ose AnMan ose më të lartë), si Boregine (të dy parametrat P < 0.0001), Bojar (vlera P < 0.0001, pesha e bimës 0.001) dhe sforcimi <7, pesha jo e rëndësishme (900p). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показал высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или повеќе, чем во генотипов Lanr1), парања или AnM ров <0,0001), Bojar (vlera P <0,0001, масса në rritje 0,001) dhe popullaritet B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Është interesante se disa linja NLL të cilave u mungonte ndonjë alel shënues 'rezistence' treguan nivele të larta të rezistencës ndaj antraknozës (të krahasueshme ose më të larta se gjenotipet Lanr1 ose AnMan), si p.sh. Boregine (vlera P për të dy parametrat <0,0001), Bojar (vlera P < 0,0001-vlera < 0,0001, pesha e bimës < 0,0001, vlera e bimëve < 0,0001, 0,001, pesha e bimëve, 0,0001, 0,001, pesha e bimëve, 0,0001, 0,001, 0,001, pesha e bimëve) .0001, pesha jo e rëndësishme).Ky fenomen sugjeron mundësinë e një burimi të ri gjenetik të rezistencës, duke shpjeguar mungesën e vërejtur të korrelacionit midis gjenotipeve të markerëve dhe fenotipeve të sëmundjes (vlerat P nga ~ 0,42 në ~ 0,98).Kështu, testi Kolmogorov-Smirnov tregoi se të dhënat për rezistencën ndaj antraknozës u shpërndanë përafërsisht normalisht për rezultatet (vlerat P 0,25 dhe 0,11) dhe masën e bimëve (vlerat P 0,47 dhe 0,55), duke sugjeruar që unë supozoj se përfshihen më shumë alele se Lanr1 dhe AnMan.
Bazuar në rezultatet e shqyrtimit të rezistencës ndaj antraknozës, 4 linja u zgjodhën për analizën e transkriptomit: 83A:476, Boregine, Mandelup dhe Popullsia 22660. Këto linja u ritestuan për rezistencën ndaj antraksit në eksperimentet e inokulimit me sekuencë ARN, me kusht që të ishin të njëjta si në testin e mëparshëm.Vlerat e rezultateve ishin si më poshtë: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) dhe popullsia 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokolli Illumina NovaSeq 6000 arriti një mesatare prej 40,5 çifte Mread për mostër (29,7 deri në 54,4 Mreads) (Tabela Suplementare S3).Rezultatet e shtrirjes në sekuencën e referencës varionin nga 75.5% në 88.6%.Ndërlidhja mesatare e të dhënave të numërimit të leximeve midis varianteve eksperimentale midis përsëritjeve biologjike varionte nga 0,812 në 0,997 (mesatarja 0,959). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk zbuluan asnjë shprehje, dhe 4785 gjenet e tjera u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë < 5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk zbuluan asnjë shprehje, dhe 4785 gjenet e tjera u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë < 5). Nga 35 170 proanalizirovannыh genov 2917 nuk proyavlyali эkspressii, dhe ostalьnые 4785 genov эkspressirovalisь на незначительном уровне (bazë e mesme <5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk treguan asnjë shprehje, dhe 4785 gjenet e mbetura u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以以忽值< 5).35,170 Nga 35 170 proanalizirovannыh genov 2917 nuk ekspresirovalisь, a ональные 4785 genov emeli i pakëtьную эkspressiю (bazavoe среднее значение <5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk u shprehën dhe 4785 gjenet e mbetura kishin shprehje të papërfillshme (mesatarja bazë <5).Kështu, numri i gjeneve të konsideruara të shprehura (mesatarja bazë ≥ 5) gjatë eksperimentit ishte 27,468 (78.1%) (Tabela Suplementare S4).
Që nga momenti i parë kohor, të gjitha linjat NLL iu përgjigjën inokulimit të C. lupini (shtresa Col-08) duke riprogramuar transkriptomën (Tabela 1), megjithatë, dallime domethënëse u vunë re midis linjave.Kështu, linja e rezistencës 83A: 476 (që mbart gjenin Lanr1) tregoi riprogramim domethënës të transkriptomit në pikën e parë kohore (6 hpi) me një rritje 31-69 herë në numrin e gjeneve të izoluara lart dhe poshtë në krahasim me pikat e tjera kohore në këtë pikë kohore.Për më tepër, ky kulm ishte jetëshkurtër, pasi shprehja e vetëm disa gjeneve mbeti e ndryshuar ndjeshëm në pikën e dytë kohore (12 hpi).Është interesante se Boregine, e cila gjithashtu tregoi një nivel të lartë rezistence në testin e shartimit, nuk iu nënshtrua riprogramimit kaq masiv transkriptues gjatë eksperimentit.Megjithatë, numri i gjeneve të shprehura në mënyrë diferenciale (DEG) ishte i njëjtë për Boregine dhe 83A: 476 në 12 HPI.Si Mandelup ashtu edhe popullsia 22660 treguan maja DEG në pikën e fundit kohore (48 l/s), duke treguar një vonesë relative në përgjigjet e mbrojtjes.
Për shkak se 83A:476 iu nënshtrua riprogramimit masiv të transkriptomit në përgjigje të C. lupini në 6 HPI krahasuar me të gjitha linjat e tjera, ~ 91% e DEG-ve të vëzhguara në këtë moment kohor ishin specifike për linjën e gjakut (Fig. 1).Sidoqoftë, kishte disa mbivendosje në përgjigjet e hershme midis linjave të studimit, pasi 68.5%, 50.9% dhe 52.6% DEG në Boregine, Mandelup dhe popullsinë 22660, respektivisht, mbivendosen me ato të gjetura në 83A: 476 në pika të caktuara kohore.Sidoqoftë, këto DEG përbënin vetëm një pjesë të vogël (0,97-1,70%) të të gjitha DEG-ve të zbuluara aktualisht duke përdorur 83A:476.Për më tepër, 11 DEG nga të gjitha linjat ishin koherente në këtë kohë (Tabelat Suplementare S4-S6), duke përfshirë komponentët e zakonshëm të përgjigjeve të mbrojtjes së bimëve: proteina e transferimit të lipideve (TanjilG_32225), enzima endoglukan-1,3-β-glukozide (TanjilG_23384), dy proteina si stresi-3anjilG231AM dhe S1AMjil22. 31531), proteina bazë latex (TanjilG_32352) dhe dy proteina strukturore të murit qelizor të pasura me glicinë (TanjilG_19701 dhe TanjilG_19702).Kishte gjithashtu një mbivendosje relativisht të lartë në përgjigjet e transkriptomeve midis 83A:476 dhe Boregine në 24 HPI (gjithsej 16-38% DEG) dhe midis Mandelup dhe Popullsisë 22660 në 48 HPI (gjithsej 14-20% DEG).
Diagrami i Venit që tregon numrin e gjeneve të shprehura në mënyrë diferenciale (DEG) në linjat e lupinës me gjethe të ngushta (NLL) të inokuluara me Colletotrichum lupini (shtajimi Col-08 i marrë nga fushat e lupinës në Wierzhenice, Poloni, 1999).Linjat NLL të analizuara ishin: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin Lanr1), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mbante alelën AnMan) dhe popullata 22660 (shumë e ndjeshme).Shkurtesa hpi qëndron për orë të tëra pas vaksinimit.Vlerat zero janë hequr për të thjeshtuar grafikun.
Seti i gjeneve të mbishprehura në 6 hpi u analizua për praninë e domeneve kanonike të gjenit R (Tabela Suplementare S7).Ky studim zbuloi induksionin e transkriptomit të gjeneve klasike të rezistencës ndaj sëmundjeve me domenet NBS-LRR vetëm në 83A:476.Ky grup përbëhej nga një gjen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pesë gjene CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 dhe tanjilg_16ur162), dhe tanjilg_16ur16-R LRRE (tanjilg_16162) si dhe Katër NBS-Lrr (tanjilg_16162) dhe Katër NBS-LRR (TANJILG_16162).Të gjitha këto gjene kanë domene kanonike të renditura në sekuenca të ruajtura.Përveç gjeneve të domenit NBS-LRR, disa kinaza RLL u aktivizuan në 6 hpi, përkatësisht një në Boregine (TanjilG_19877), dy në Mandelup (TanjilG_07141 dhe TanjilG_19877) dhe në popullatë 22660 (TanjilG_1913 dhe TanjilG_19) 7:476.
Gjenet me shprehje të ndryshuar dukshëm në përgjigje të inokulimit me C. lupini (shtam Col-08) iu nënshtruan analizës së pasurimit të Ontologjisë Gjenetike (GO) (Tabela Suplementare S8). Termi i procesit biologjik i mbipërfaqësuar më shpesh ishte "GO: 0006952 reagimi i mbrojtjes" i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (kohë × vijë) me rëndësi të lartë (vlera P < 0,001) (Fig. 2). Termi i procesit biologjik i mbipërfaqësuar më shpesh ishte "GO: 0006952 reagimi i mbrojtjes" i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (kohë × vijë) me rëndësi të lartë (vlera P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто черезмерно представленным термином biologicheskogo processa был «GO: 0006952 përщитный ответ», который появлялся во 6 nga 16 (vремя × liniя) kombinimi me высоко, (0006952). Termi i procesit biologjik i mbipërfaqësuar më shpesh ishte 'GO: 0006952 reagimi i mbrojtjes', i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinimet (koha × prejardhja) me rëndësi të lartë (vlera P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在魚个（×旻16 个（×旻个中，具有高显着性（P 值< 0,001）(图2）). Termi më përfaqësues i procesit biologjik është "GO:0006952 reagimi i mbrojtjes", i cili shfaqet në 6 nga 16 kombinimet (时间×线), me rëndësi të lartë (vlera P < 0,001) (图2) . Naibolee часто черезмерно представленным термином biologicheskogo processa был «GO: 0006952 Defense Response», koторый появлялся во 6 од 16 kombinaciy (vremya × liniя) me высокой значимостью (2.00) <0,000 P. Termi i procesit biologjik i mbipërfaqësuar më shpesh ishte 'GO:0006952 Reagimi i Mbrojtjes', i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (kohë × rresht) me rëndësi të lartë (vlera P < 0,001) (Fig. 2).Ky term ishte i mbipërfaqësuar në dy pika kohore në 83A: 476 dhe Boregine (6 dhe 24 hpi) dhe në një moment në Mandelup dhe Popullsia 22660 (12 dhe 6 hpi, respektivisht).Ky është një rezultat i pritshëm, duke nxjerrë në pah përgjigjen antifungale të linjave rezistente.Përveç kësaj, 83A:476 iu përgjigj C. lupini duke nxitur me shpejtësi gjenet që lidhen me shpërthimin oksidativ të përfaqësuar nga termi "GO:0055114 proces redoks", që tregon një përgjigje specifike mbrojtëse, ndërsa Boregine zbuloi përgjigje specifike mbrojtëse, të lidhura me termin 'GO'.:0006950 Përgjigja ndaj stresit”.Popullsia 22660 aktivizoi përgjigjen horizontale të rezistencës që përfshin metabolitët dytësorë, duke theksuar numrin e tepërt të termave "GO:0016104 Procesi i biosintezës së triterpenit" dhe "GO:0006722 Procesi i metabolizmit të triterpenit" (të dy termat i përkasin të njëjtit grup gjenesh, duke marrë parasysh rezultatet e analizës së reaksionit të pasurisë së GO dhe termin GO të pasurimit të GO: 22660. Përveç kësaj, reagimi i hershëm 83A:476 (6 hpi) dhe reagimi i vonuar Mandelup and Population 22660 përfshijnë termin GO:0015979 'fotosintezë' dhe procese të tjera biologjike të lidhura.
Termat e ontologjisë së gjeneve të bioproceseve të zgjedhura në shënimin e gjeneve të shprehura në mënyrë diferenciale gjatë përgjigjeve të transkriptimit të lupinës me gjethe të ngushtë (NLL) të inokuluar me lupin e antraksit (shtajimi Col-08 i marrë nga fushat lupine në Wierzhenice, Poloni, në 1999) janë shumë të ekzagjeruara.Linjat NLL të analizuara ishin: 83A: 476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Boregine (rezistente, sfond gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mbante alelën homozigote AnMan) dhe popullata 22660 (e ndjeshme).
Për shkak se ky studim synonte të identifikonte gjenet që kontribuojnë në rezistencën ndaj antraknozës, gjenet e përcaktuara me termat GO "GO: 0006952 Përgjigjet mbrojtëse" dhe "GO: 0055114 Proceset Redox" u analizuan me ndërprerje pasi mesatarja bazë ≥ 30 me të paktën një rresht.× pikë në kohë duke kombinuar vlera statistikisht të rëndësishme të log2 (ndryshim i fishuar).Numri i gjeneve që përmbushin këto kritere ishte 65 për GO:0006952 dhe 524 për GO:0055114.
83A:476 zbuloi dy maja DEG të shënuara me termin GO:0006952, i pari me 6 gjene për inç (64 gjene, rregullimi lart e poshtë) dhe i dyti me 24 gjene për inç (15 gjene, vetëm rregullim lart).Boregine tregoi gjithashtu se GO:0006952 arriti kulmin në të njëjtën pikë kohore, por me më pak DEG (11 dhe 8) dhe aktivizim preferencial.Mandeloop tregoi dy maja të GO:0006952 në 12 dhe 48 HPI, që të dy mbanin 12 gjene (e para me gjene aktivizuese dhe e dyta me vetëm gjene shtypëse), ndërsa popullata 22660 me 6 HPI (13 gjene) kishte një mbizotërim më të madh të kulmit të rritjes.rregullore.Duhet të theksohet se 96.4% e GO:0006952 DEG në këto maja kishin të njëjtin lloj përgjigjeje (lart ose poshtë), duke treguar një mbivendosje të konsiderueshme në përgjigjet e mbrojtjes pavarësisht ndryshimeve në numrin e gjeneve të përfshira.Grupi më i madh i sekuencave të lidhura me termin GO:0006952 kodifikon Proteinën 22 të Mesazhit të Lidhur me Stresin e Urisë (SAM22-si), e cila i përket klasës 10 të proteinës së lidhur me patogjenezën (PR-10) dhe proteinës bazë latex.proteina e ngjashme (e ngjashme me MLP)) proteina (Fig. 3).Të dy grupet ndryshonin në natyrën e shprehjes dhe drejtimin e përgjigjes.Gjenet që kodojnë proteinat e ngjashme me SAM22 treguan induksion të qëndrueshëm dhe domethënës në pikat e hershme kohore (6 ose 12 hpi) dhe në përgjithësi nuk reaguan në fund të eksperimentit (48 hpi), ndërsa proteinat e ngjashme me MLP treguan koordinim në 6 hpi.hpi.83A:476 dhe Mandelup me 48 kf/in, pothuajse të gjitha pikat e tjera të të dhënave nuk reagonin.Për më tepër, ndryshimet në profilet e shprehjes së gjeneve të proteinave të ngjashme me SAM22 ndoqën ndryshueshmërinë e vërejtur në rezistencën ndaj antraknozës, pasi linjat më rezistente kishin më shumë pika kohore që induktonin ndjeshëm këto gjene sesa gjene më të ndjeshme.Një tjetër gjen PR-10 i ngjashëm me LlR18A/B tregoi një model shprehjeje shumë të ngjashme me gjenin e proteinës së ngjashme me SAM22.
U identifikuan përbërësit kryesorë të termit të procesit biologjik "GO: 0006952 Defense Response" dhe modelet e shprehjes së gjeneve kandidate të aleleve Lanr1 dhe AnMan.Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i palosjes) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtamet Col-08, të marra nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shami) në të njëjtën kohë.Linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta u analizuan: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigotë Lanr1), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mban alelin homozigotë AnMan) dhe Popullsia 22660 (e ndjeshme).
Përveç kësaj, u vlerësuan profilet e shprehjes së gjeneve kandidate ARN-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dhe AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).Gjeni TanjilG_05042 tregoi një përgjigje të rëndësishme (aktivizim) në 83A:476 vetëm në pikën e parë kohore (6 hpi), ndërsa TanjilG_12861 ishte domethënëse në Mandeloop vetëm në dy pika kohore: 6 hpi (rregullimi i poshtëm) dhe 24 hpi (6 hpi).Me.).i rregullueshëm) ).
Gjenet më të mbishprehura në termin GO:0055114 "proces redoks" ishin gjenet që kodonin proteinat e citokromit P450 dhe peroksidazën (Fig. 4).Për mostrat e izoluara nga 83A:476 në 6 HPI, vlerat maksimale ose minimale log2 (për 86,6% të gjeneve) u vunë re përgjithësisht midis bimëve të inokuluara dhe atyre të kontrollit, duke theksuar reagimin e lartë të këtij gjenotipi ndaj seksit inokulues.83A:476 tregoi GO-në më domethënëse: 0055114 DEG në 6 hpi (503 gjene), ndërsa pjesa tjetër e linjave në 48 hpi (Boregine, 31 gjene; ​​Mandelup, 85 gjene; ​​dhe Popullsia 22660, 78 gjene)).Në shumicën e gjeneve të familjes GO:0055114, janë vërejtur dy lloje të përgjigjeve ndaj vaksinimit (aktivizimi dhe frenimi).Është interesante se deri në 97.6% e DEG-ve të identifikuara për termin GO: 0055114 në Mandelupe me 48 kf. Këto vëzhgime sugjerojnë se, pavarësisht shkallës dukshëm më të vogël (d.m.th., numri i gjeneve redoks të mutuara, 85 kundrejt 503), modeli i një përgjigjeje të vonuar të transkriptimit të hershëm ndaj: 76.Në Boregine dhe Popullsia 22660, kjo konvergjencë është më e ulët, përkatësisht 51.6% dhe 75.6%.
U zbuluan modelet e shprehjes së përbërësve kryesorë të termit të procesit biologjik “GO:0055114 Procesi Redox”.Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i palosjes) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtamet Col-08, të marra nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shami) në të njëjtën kohë.Linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta u analizuan: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigotë Lanr1), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mban alelin homozigotë AnMan) dhe Popullsia 22660 (e ndjeshme).
83A:476 Përgjigjet transkriptomike ndaj inokulimit me C. lupini (shtajimi Col-08) përfshinin gjithashtu heshtjen e koordinuar të gjeneve që i atribuohen termit GO:0015979 "fotosintezë" dhe proceseve të tjera biologjike të lidhura (Fig. 5).Ky grup GO:0015979 DEG përmbante 105 gjene që u shtypën ndjeshëm në 6 hpi në 83A:476.Në këtë nëngrup, 37 gjene u rregulluan gjithashtu në Mandelup në 48 HPI dhe 35 në të njëjtën kohë në popullatën 22660, duke përfshirë 19 DEG të përbashkëta për të dy gjenotipet.Asnjë DEG në lidhje me termin GO: 0015979 nuk u aktivizua ndjeshëm në asnjë kombinim (rreshti x kohë).
U zbuluan modelet e shprehjes së përbërësve kryesorë të termit të procesit biologjik "GO:0015979 Fotosinteza".Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i palosjes) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtamet Col-08, të marra nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shami) në të njëjtën kohë.Linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta u analizuan: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigotë Lanr1), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mban alelin homozigotë AnMan) dhe Popullsia 22660 (e ndjeshme).
Bazuar në rezultatet e analizës së shprehjes diferenciale dhe me sa duket i përfshirë në përgjigjet mbrojtëse kundër kërpudhave patogjene, ky grup prej shtatë gjenesh u zgjodh për përcaktimin sasior të profileve të shprehjes me PCR në kohë reale (Tabela Suplementare S9).
Gjeni i supozuar i proteinës TanjilG_10657 u induktua ndjeshëm në të gjitha linjat dhe pikat kohore të studiuara në krahasim me bimët e kontrollit (imitues) (Tabela Suplementare S10, S11).Për më tepër, profili i shprehjes së TanjilG_10657 tregoi një prirje në rritje gjatë rrjedhës së eksperimentit për të gjitha linjat.Popullsia 22660 tregoi ndjeshmërinë më të lartë të TanjilG_10657 ndaj inokulimit me aktivizim 114-fish dhe nivelin më të lartë të shprehjes relative (4,4 ± 0,4) në 24 HPI (Fig. 6a).Gjeni i proteinës PR10 LlR18A TanjilG_27015 tregoi gjithashtu aktivizim në të gjitha linjat dhe pikat kohore, me rëndësi statistikore në shumicën e pikave të të dhënave (Fig. 6b).Ngjashëm me TanjilG_10657, niveli më i lartë i shprehjes relative i TanjilG_27015 u vu re në popullatën 22660 të inokuluar në 24 HPI (19.5 ± 2.4).Gjeni i endokitinazës së acidit TanjilG_04706 u rregullua ndjeshëm në të gjitha linjat dhe në të gjitha pikat kohore, përveç Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Ai u induktua fuqishëm në pikën e parë kohore (6 HPI) në 83A:476 (me 10.5 herë) dhe u rrit mesatarisht në linjat e tjera (me 6.6-7.5 herë).Gjatë eksperimentit, shprehja e TanjilG_04706 mbeti në nivele të ngjashme në 83A:476 dhe Boregine, ndërsa në Mandelup dhe Popullsia 22660 u rrit ndjeshëm, duke arritur vlera relativisht të larta (përkatësisht 5,9 ± 1,5 dhe 6,2 ± 1,5).Gjeni i ngjashëm me endoglukan-1,3-β-glukozidazën TanjilG_23384 tregoi aktivizim të lartë në dy pikat e para kohore (6 dhe 12 hpi) në të gjitha linjat përveç popullatës 22660 (Fig. 6d).Nivelet më të larta të shprehjes relative të TanjilG_23384 u vunë re në pikën e dytë kohore (12 hpi) në Mandelup (2,7 ± 0,3) dhe 83A: 476 (1,5 ± 0,1).Në 24 HPI, shprehja TanjilG_23384 ishte relativisht e ulët në të gjitha linjat e studiuara (nga 0,04 ± 0,009 në 0,44 ± 0,12).
Profilet e shprehjes së gjeneve të zgjedhura (ag) të zbuluara nga PCR sasiore.Numrat 6, 12 dhe 24 përfaqësojnë orë pas vaksinimit.Gjenet LanDExH7 dhe LanTUB6 u përdorën për normalizim dhe LanTUB6 u përdor për kalibrimin ndërmjet serive.Shiritat e gabimit përfaqësojnë devijimin standard bazuar në tre përsëritje biologjike, secila prej të cilave është mesatarja e tre përsëritjeve teknike. Rëndësia statistikore e diferencave në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtami Col-08, marrë në 1999 nga fusha e lupinës në Wierzenica, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shaka) shënohen mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P 0. ≤ 0.05). Rëndësia statistikore e diferencave në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtami Col-08, marrë në 1999 nga fusha e lupinës në Wierzenica, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shaka) shënohen mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P 0. ≤ 0.05). Статистическая значитемость различий во уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchen në 1999 g. со поля люпина во Верженице, Polьша) х (* kuptimi P < 0,05, **kuptimi P ≤ 0,01, ***kuptimi P ≤ 0,001). Ndryshime statistikisht domethënëse në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtami Col-08, i marrë në 1999 nga një fushë lupine në Wierzhenice, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shami) vërehen mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **Vlera P 1.0,00 ≤).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模觋漢田获得）和对照（模觋水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 倂0≤ 1.00接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煰 ）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия во уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей люпина во Верженице, Poli, në 1999, në 1999 г.) нных (* kuptimi P < 0,05, ** P-kuptimi ≤ 0,01, ***P-kuptimi ≤ 0,001). Dallime statistikisht domethënëse në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, shtami Col-08, i marrë nga fushat e lupinës në Verzhenice, Poloni, në 1999) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara me shami) janë shënuar mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0,05 , **P-vlera .0-0,0, ≤).Linjat NLL të analizuara ishin: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mbante alelën homozigote AnMan), Boregine (rezistente, sfond gjenetik i panjohur) dhe popullata 22660 (e ndjeshme).
Gjeni kandidat TanjilG_05042 në vendndodhjen Lanr1 tregoi një model shprehjeje dukshëm të ndryshme nga profilet e marra nga studimet e ARN-seq (Fig. 6e).Aktivizimi i rëndësishëm i këtij gjeni u vu re në popullatën Mandelup dhe 22660 (deri në 39.7 dhe 11.7 herë, përkatësisht), duke rezultuar në nivele relativisht të larta të shprehjes (deri në 1.4 ± 0.14 dhe 7.2 ± 1.3, respektivisht).83A:476 zbuloi gjithashtu një rregullim të caktuar të gjenit TanjilG_05042 (deri në 3,8 herë), megjithatë, nivelet relative të shprehjes së arritur (0,044 ± 0,002) ishin më shumë se 30 herë më të ulëta se ato të vërejtura në Mandelup dhe popullatën 22660.i analizuar nga qPCR tregoi dallime të rëndësishme në nivelet e shprehjes midis gjenotipeve në variantet e vaksinuara (kontroll), duke arritur një ndryshim 58-fish midis popullatave 22660 dhe 83A:476, si dhe midis popullatave 22660 dhe 22660. Një ndryshim i dyfishtë u arrit midis Boregine dhe Mandalup.
Gjeni kandidat në vendndodhjen AnMan, TanjilG_12861, u aktivizua në përgjigje të vaksinimit në 83A:476 dhe Mandelup, ishte neutral në popullatën 22660 dhe u reduktua në Boregine (Fig. 6f).Shprehja relative e gjenit TanjilG_12861 ishte më e larta në 83A të inokuluara: 476 (0.14±0.01).Gjeni i proteinës së goditjes termike të klasës I 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 tregoi nivele më të ulëta të shprehjes relative në të gjitha shtamet dhe pikat kohore të studiuara (Fig. 6g).Vlera më e lartë u vu re në 24 HPI në popullatën 22660 (0,14 ± 0,02, një rritje tetëfish në përgjigje të vaksinimit).
Krahasimi i profileve të shprehjes së gjeneve (Fig. 7) zbuloi një korrelacion të lartë midis TanjilG_10657 dhe katër gjeneve të tjera: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80G_0.80) dheRezultate të tilla mund të tregojnë bashkërregullim të këtyre gjeneve gjatë përgjigjeve mbrojtëse.Gjenet TanjilG_12861 dhe TanjilG_23384 treguan profile të ndryshme shprehjeje me vlera më të ulëta të koeficientit të korrelacionit Pearson (nga 0,08 në 0,43 dhe -0,19 në 0,28, respektivisht) krahasuar me gjenet e tjera.
Korrelacionet midis profileve të shprehjes së gjeneve u zbuluan duke përdorur PCR sasiore.Linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta u analizuan: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigotë Lanr1), Mandelup (mesatarisht rezistent, që mban alelin homozigot AnMan), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur) dhe Popullsia 22660 (e ndjeshme).Janë llogaritur tri pika kohore (6, 12 dhe 24 orë pas inokulimit), duke përfshirë bimët e inokuluara (Colletotrichum lupini, shtamet Col-08, të marra nga fushat e lupinave në Wierzhenice, Poloni, në 1999) dhe bimët e kontrollit (të inokuluara me shami).Shkalla tregon vlerën e koeficientit të korrelacionit Pearson.
Bazuar në të dhënat e marra me 6 kuaj fuqi për inç, WGCNA u krye në 9981 DEG të identifikuar duke krahasuar impiantet e inokuluara dhe ato të kontrollit për t'u fokusuar në përgjigjet e hershme të mbrojtjes (Tabela Suplementare S12).U gjetën njëzet e dy module gjenesh (grupe) me profile të lidhura (pozitive ose negative) të shprehjes midis gjenotipeve dhe varianteve eksperimentale. Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve ishin në rënie në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (në të dy variantet, megjithatë, kjo prirje ishte më e fortë në bimët e kontrollit). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve ishin në rënie në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (në të dy variantet, megjithatë, kjo prirje ishte më e fortë në bimët e kontrollit). Në mesnem уровни экспрессии генови снижались во порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (in обоих варијантах, однако, эта tendencija была сильнее у контрольных во пораст). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve u ulën në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (në të dy variantet, megjithatë, kjo prirje ishte më e fortë në bimët e kontrollit).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 的顺序下降（然而，在两在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popullsia 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 植物 中 更）........................................ Në mesnem уровни экспрессии генови снижались во 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (однако в обоих варијантах эта tendenca была сильнее у контрольных во пораст). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve u ulën në serinë 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (megjithatë, në të dy variantet, kjo prirje ishte më e fortë në bimët e kontrollit).Vaksinimi rezultoi në rregullim të lartë të shprehjes së gjeneve, veçanërisht në modulet 18, 19, 14, 6 dhe 1 (në rend zbritës të efektit), rregullim negativ (p.sh. modulet 9 dhe 20) ose me efekte neutrale (p.sh. modulet 11, 22, 8 dhe 13).Analiza e pasurimit të termit GO (Tabela plotësuese S13) zbuloi "GO: 0006952 Përgjigje mbrojtëse" për modulin e inokuluar (18) me aktivizim maksimal, duke përfshirë gjenet e analizuara nga qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_23culo dhe manys1065 as7culo. modulet e fotosintezës së shtypur (9).Përqendruesi i modulit 18 (Fig. 8) u identifikua si gjeni TanjilG_26536 që kodon proteinën LlR18B të ngjashme me PR-10, dhe përqendruesi i modulit 9 u identifikua si gjeni TanjilG_28955 që kodon proteinën PsbQ të fotosistemit II.Një gjen kandidat i rezistencës ndaj anthraknozës Lanr1, TanjilG_05042, u gjet në modulin 22 (Fig. 9) dhe shoqërohet me termat "GO:0044260 Proceset metabolike makromolekulare qelizore" dhe "GO:0006355 Rregullimi transkriptues, modelimi i ADN-së" që mbartin hu01212G Tanjil.b.b.geni kodon faktorin e transkriptimit të stresit të nxehtësisë A-4a (HSFA4a).
Analiza e ponderuar e rrjetit të bashkë-shprehjes së gjeneve të moduleve me terma të procesit biologjik të mbipërfaqësuar "GO: 0006952 Përgjigjet e Mbrojtjes".Lidhja u thjeshtua për të nxjerrë në pah katër gjenet e analizuara nga qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dhe TanjilG_27015).
Analiza e ponderuar e rrjetit të bashkë-shprehjes së gjeneve të një moduli me një term të procesit biologjik të mbipërfaqësuar "GO: 0006355: Rregullimi i transkriptimit, modelimi i ADN-së" dhe që mbart një gjen kandidat për rezistencë ndaj anthraknozës Lanr1 TanjilG_05042.Lidhja u thjeshtua për të izoluar gjenin TanjilG_05042 dhe gjenin qendror TanjilG_01212.
Ekzaminimi i rezistencës ndaj antraknozës i mbledhur në Australi tregoi se shumica e kultivarëve të lëshuar herët ishin të ndjeshëm;Kalya, Coromup dhe Mandelup janë përshkruar si mesatarisht rezistente, ndërsa Wonga, Tanjil dhe 83A:476 janë përshkruar si shumë rezistente26,27,31.kishin të njëjtën alele rezistence, të caktuar Lanr1, dhe Coromup dhe Mandelup kishin një alel të ndryshëm, të caktuar AnMan10, 26, 39, ndërsa Kalya kaloi në një alele të ndryshme., Lanr2.Ekzaminimi për rezistencën ndaj antraknozës në Gjermani rezultoi në identifikimin e një linje rezistente Bo7212 me një alel kandidat të ndryshëm nga Lanr1, i caktuar LanrBo36.
Studimi ynë zbuloi një frekuencë shumë të ulët (rreth 6%) të alelit Lanr1 në germplazmën e testuar.Ky vëzhgim është në përputhje me rezultatet e ekzaminimit të germplazmës së Evropës Lindore duke përdorur shënuesit Anseq3 dhe Anseq4, të cilat treguan se aleli Lanr1 është i pranishëm vetëm në dy linja bjelloruse.Kjo sugjeron që aleli Lanr1 nuk përdoret ende gjerësisht nga programet lokale të mbarështimit, ndryshe nga Australi, ku është një nga alelet kryesore për mbarështimin me ndihmën e shënuesve.Kjo mund të jetë për shkak të nivelit më të ulët të rezistencës të ofruar nga aleli Lanr1 në kushtet e fushës evropiane në krahasim me raportin australian.Përveç kësaj, studimet e antraknozës në zonat me reshje të larta në Australi kanë treguar se reagimet e rezistencës të ndërmjetësuara nga aleli Lanr1 mund të mos jenë efektive në kushtet e motit që favorizojnë rritjen dhe zhvillimin e shpejtë të patogjenit19,42.Në fakt, në studimin aktual, disa simptoma të antraknozës u vunë re edhe në gjenotipet që mbartin alelin Lanr1, duke sugjeruar që rezistenca mund të zhduket në kushte optimale për zhvillimin e C. lupini.Për më tepër, interpretimet false pozitive të pranisë së shënuesve Anseq3 dhe Anseq4, të cilët janë afërsisht 1 cm nga vendndodhja Lanr1, janë të mundshme 28,30,43.
Studimi ynë tregoi se 83A:476, që mbante alelën Lanr1, iu përgjigj inokulimit të C. lupini me riprogramim të transkriptomit në shkallë të gjerë në pikën e parë kohore të analizuar (6 hpi), ndërsa në Mandelup, që mbante alelën AnMan, përgjigjet transkriptomike u vunë re shumë më vonë.(nga 24 në 48 kf).Këto ndryshime kohore në përgjigjet mbrojtëse shoqërohen me ndryshime në simptomat e sëmundjes, duke theksuar rëndësinë e njohjes së hershme të patogjenit për një përgjigje të suksesshme ndaj rezistencës.Për të infektuar indet bimore, sporet e antraksit duhet të kalojnë nëpër disa faza zhvillimi në sipërfaqen e bujtësit, duke përfshirë mbirjen, ndarjen e qelizave dhe formimin e një appressorium.Një shtojcë është një strukturë infektive që ngjitet në sipërfaqen e bujtësit dhe lehtëson depërtimin në indet strehuese.Kështu, sporet e C. gloeosporioides në ekstraktin e bizeleve treguan ndarjen e parë të bërthamës pas 75-90 minutash inkubacion, formimin e një tubi embrional pas 90-120 minutash dhe shtypjen pas 4 orësh 45 .Mango C. gloeosporioides tregoi më shumë se 40% mbirje konidiale pas 3 orësh inkubimi dhe rreth 20% formim të shtypësve pas 4 orësh.Gjeni CAP20 i lidhur me virulencën i C. gloeosporioides tregoi aktivitet transkriptues në konidet që formojnë epifite pas 3.5 orësh inkubimi në dyllin sipërfaqësor të avokados me përqendrime të larta të proteinës CAP20 pas 4 orë e 46 minutash.Në mënyrë të ngjashme, aktiviteti i gjeneve të biosintezës së melaninës në C. trifolii u nxit gjatë një inkubimi 2-orësh i ndjekur nga formimi i një appressorium pas 1 ore.Studimet e indeve të gjetheve kanë treguar se luleshtrydhet e inokuluara me C. acutatum kanë shtypjen e parë në 8 hpi, ndërsa domatet e inokuluara me C. coccodes kanë shtypjen e parë në 4 hpi48,49.kryesisht në përputhje me shkallën kohore të Colletotrichum spp.proces infektiv.Përgjigjet e shpejta të mbrojtjes ndaj 83A:476 sugjerojnë përfshirjen e gjeneve të rezistencës së bimëve dhe imunitetit të shkaktuar nga efektorët (ETI) në këtë linjë, ndërsa përgjigjet e vonuara të Mandelup mbështesin hipotezën e imunitetit të nxitur nga modeli molekular mikro-shoqërues (MTI) 50. Përgjigjet e hershme ndaj 83A: 476 dhe Mandelup.Mbivendosja e pjesshme midis gjeneve të rregulluara lart ose poshtë në përgjigjen e vonuar gjithashtu mbështet këtë koncept, pasi ETI shpesh konsiderohet të jetë një përgjigje e përshpejtuar dhe e përmirësuar e MTI që kulmon me vdekjen e programuar të qelizave në vendin e infeksionit, i njohur si shoku anafilaktik 51,52.
Shumica e gjeneve që i atribuohen termit të mbipërfaqësuar Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” janë 11 homologët e proteinës 22 të mesazhit të agjërimit të induktuar nga stresi (e ngjashme me SAM22) dhe shtatë ngjashmëritë kryesore të proteinave latex (MLP).Proteinat e ngjashme 31, 34, 43 dhe 423 treguan ngjashmëri të sekuencës.Gjenet e ngjashme me SAM22 treguan aktivizim domethënës që zgjati më gjatë, duke treguar nivele të rritura të rezistencës ndaj antraknozës (83A:476 dhe Boregine).Sidoqoftë, gjenet e ngjashme me MLP-në u rregulluan vetëm në linjat që mbanin alelin e rezistencës kandidate (83A:476/Lanr1 në 6 hpi dhe Mandelup/AnMan në 24 hpi).Duhet të theksohet se të gjithë homologët e identifikuar të ngjashëm me SAM22 e kanë origjinën nga një grup gjenesh që përfshin afërsisht 105 kb, ndërsa gjenet e ngjashme me MLP kanë origjinën nga rajone të veçanta të gjenomit.Aktivizimi i koordinuar i gjeneve të tilla të ngjashme me SAM22 u gjet gjithashtu në studimin tonë të mëparshëm të rezistencës së NLL ndaj vaksinimit Diaporthetoxica, duke sugjeruar që ato janë të përfshira në komponentët horizontalë të përgjigjes së mbrojtjes.Ky përfundim mbështetet gjithashtu nga raportet e një reagimi pozitiv të gjeneve të ngjashme me SAM22 ndaj lëndimit ose trajtimit me acid salicilik, induktues fungale ose peroksid hidrogjeni.
Gjenet e ngjashme me MLP-në janë treguar se u përgjigjen streseve të ndryshme abiotike dhe biotike, duke përfshirë infeksionet bakteriale, virale dhe patogjene fungale në shumë specie bimore55.Drejtimet e reagimit ndaj ndërveprimeve të caktuara midis bimëve dhe patogjenëve varionin nga një rritje e fortë (dmth. gjatë infektimit të pambukut me Verticillium dahliae) në ulje të ndjeshme (dmth. pas infektimit të pemës së mollës me Alternaria spp.)56,57.Një ulje domethënëse e gjenit 423 të ngjashëm me MLP-në është vërejtur gjatë mbrojtjes së avokados ndaj infeksionit F. niger dhe gjatë infeksionit të pemës së mollës Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola dhe Alternaria alternata janë patotipe të mollës58,59.Për më tepër, kalli i mollës që mbishprehte gjenin 423 të ngjashëm me MLP-në kishte shprehje më të ulët të gjeneve të lidhura me rezistencën dhe ishin më të ndjeshëm ndaj infeksionit fungal59.Pas Fusarium oxysporum f, gjeni 423 i ngjashëm me MLP u shtyp gjithashtu në germplazmën e zakonshme të fasules rezistente.cn.Infeksioni i fasules 60.
Anëtarë të tjerë të familjes PR-10 të identifikuar në studimin tonë të ARN-seq ishin gjenet LlR18A dhe LlR18B në përgjigje të rregullimit të lart, si dhe gjeni i rregulluar lart (1 gjen) ose i rregulluar (3 gjene) për proteinën e transferimit të lipideve DIR1..Përveç kësaj, WGCNA thekson gjenin LlR18B si një qendër në këtë modul, i cili është shumë i ndjeshëm ndaj vaksinimit dhe mbart disa gjene të përgjigjes mbrojtëse.Gjenet LlR18A dhe LlR18B u induktuan në gjethet e verdha të lupinit në përgjigje të baktereve patogjene, si dhe në rrjedhin e NLL pas vaksinimit të D. toxica, ndërsa homologu i orizit i këtyre gjeneve, RSOsPR10, u induktua me shpejtësi nga një infeksion fungal që supozohet se ishte i përfshirë në rrugën e sinjalizimit të acidit 21 ,61 jasmon. për proteinat jospecifike të transportit të lipideve që kërkohen për fillimin e rezistencës së fituar sistemike (SAR).Me zhvillimin e reaksioneve mbrojtëse, proteina DIR1 transportohet nga fokusi i infeksionit përmes floemës për të nxitur SAR në organet e largëta.Interesante, gjeni TanjilG_02313 DIR1 u induktua ndjeshëm në pikën e parë kohore në linjat 84A:476 dhe Popullsia 22660, por rezistenca ndaj antraknozës u zhvillua me sukses vetëm në rreshtin 84A:476.Kjo mund të tregojë njëfarë nënfunksionalizimi të gjenit DIR1 në NLL, pasi tre homologët e mbetur iu përgjigjën inokulimit vetëm në linjën 83A:476 në 6 hpi, dhe kjo përgjigje u drejtua poshtë.
Në studimin tonë, përbërësit më të zakonshëm që korrespondojnë me procesin biologjik të quajtur "GO: 0055114 procesi Redox" ishin proteina e citokrom P450, peroksidaza, acidi linoleik 9S-/13S-lipoxygenase dhe 1-aminociklopropan-1-oksidaza e acidit karboksilik.Për më tepër, WGCNA-ja jonë përcakton homologun HSFA4a si një qendër që mbart module të tilla si kandidati i gjenit të rezistencës Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a është një komponent i rregullimit të varur nga redoks i transkriptimit bërthamor në bimë.
Proteinat e citokromit P450 janë oksidoreduktaza që katalizojnë reaksionet e hidroksilimit të varur nga NADPH dhe/ose O2 në metabolizmin primar dhe sekondar, duke përfshirë metabolizmin e ksenobiotikëve, si dhe hormonet, acidet yndyrore, sterolet, përbërësit e murit qelizor, biopolimerët dhe biosintezën e përbërjeve mbrojtëse të bimëve. Funksioni u reduktua nga -10.6 log2 (ndryshim me fish) në 5.7 për shkak të një numri të madh homologësh të ndryshuar (37) dhe ndryshimeve në modelet e përgjigjes midis gjeneve specifike, duke reflektuar një rishikim në rritje..Përdorimi i vetëm të dhënave ARN-seq për të sqaruar funksionin e supozuar biologjik të gjeneve NLL në një superfamilje kaq të madhe proteinash do të ishte shumë spekulative.Megjithatë, vlen të theksohet se disa gjene të citokromit P450 shoqërohen me rritje të rezistencës ndaj kërpudhave ose baktereve patogjene, duke përfshirë një kontribut në reaksionet alergjike69,70,71.
Peroksidazat e klasës III janë enzima bimore multifunksionale të përfshira në një gamë të gjerë procesesh metabolike gjatë rritjes dhe zhvillimit të bimëve, si dhe në përgjigje të streseve mjedisore si kripësia, thatësira, intensiteti i lartë i dritës dhe sulmi patogjen72.Peroksidazat janë të përfshira në ndërveprimin e disa llojeve bimore me Anthracis, duke përfshirë Stylosanthes humilis dhe C. gloeosporioides, Lens culinaris dhe C. truncatum, Phaseolus vulgaris dhe C. lindemuthianum, Cucumis sativus dhe C. lagenarium73,76.75Përgjigja është shumë e shpejtë, ndonjëherë edhe në 4 HPI, përpara se kërpudhat të depërtojnë në indin bimor73.Gjeni i peroksidazës iu përgjigj gjithashtu vaksinimit të D. toxica NLL.Përveç funksioneve të tyre tipike për rregullimin e shpërthimit oksidativ ose eliminimin e stresit oksidativ, peroksidazat mund të ndërhyjnë në rritjen e patogjenit duke krijuar barriera fizike të bazuara në përforcimin e murit qelizor gjatë linjifikimit, nënnjësisë ose ndërlidhjes së komponimeve specifike.Ky funksion mund t'i atribuohet në silikon gjenit TanjilG_03329 që kodon një anion peroksidazë të supozuar që formon linjinë, e cila u rregullua ndjeshëm në studimin tonë në linjën rezistente 83A:476 në 6 HPI, por jo në shtamet e tjera dhe pikat kohore që nuk u përgjigjën.
9S-/13S-lipoksigjenaza e acidit linoleik është hapi i parë në rrugën oksiduese të biosintezës së lipideve78.Produktet e kësaj rruge kanë funksione të shumta në mbrojtjen e bimëve, duke përfshirë forcimin e murit qelizor përmes formimit të depozitave të kalozës dhe pektinës dhe rregullimin e stresit oksidativ përmes prodhimit të specieve reaktive të oksigjenit79,80,81,82,83.Në studimin aktual, shprehja e acidit linoleik 9S-/13S-lipoxygenase u ndryshua në të gjitha shtamet, por në popullatën e ndjeshme 22660, rregullimi mbizotëroi në momente të ndryshme kohore, ndërsa në shtamet që mbartin rezistent Lanr1 dhe alelin AnMan, thekson diversifikimin e këtyre shtresave lipinoksike të diversifikimit.
Homologu i 1-aminociklopropan-1-karboksilate oksidazës (ACO) u rregullua ndjeshëm (9 gjene) ose u rregullua poshtë (2 gjene) kur inokulohej me lupinë.Me dy përjashtime, të gjitha këto përgjigje ndodhën në 6 kf.në 83A:476.Reaksioni enzimatik i ndërmjetësuar nga proteinat ACO është hapi kufizues i shpejtësisë në prodhimin e etilenit dhe për këtë arsye është shumë i rregulluar84.Etileni është një hormon bimor që luan një sërë rolesh në rregullimin e zhvillimit të bimëve dhe përgjigjen ndaj kushteve të stresit abiotik dhe biotik.Induksioni i transkriptimit të ACO dhe aktivizimi i rrugës sinjalizuese të etilenit përfshihen në rritjen e rezistencës së orizit ndaj kërpudhave hemibiotrofike oryzae oryzae duke rregulluar prodhimin e specieve reaktive të oksigjenit dhe fitoaleksinave.Një proces shumë i ngjashëm i infeksionit të gjetheve i gjetur midis M. oryzae dhe C. lupini88,89, në sfondin e një rregullimi të konsiderueshëm të homologëve ACO në linjën 83A:476 të raportuar në këtë studim, zhvendos mundësinë e dhënies së rezistencës ndaj NLL anthracnose Etileni një hap qendror sinjalizues në rrugët molekulare.
Në studimin aktual, shtypja në shkallë të gjerë e shumë gjeneve të lidhura me fotosintezën u vu re në 6 hpi në 83A:476 dhe në 48 hpi në Mandeloop dhe popullsinë 22660.Shtrirja dhe ecuria e këtyre ndryshimeve është proporcionale me nivelin.Në këtë eksperiment u vu re rezistenca ndaj antraknozës.Kohët e fundit, shtypja e fortë dhe e hershme e transkripteve të lidhura me fotosintezën është raportuar në disa modele të ndërveprimeve bimë-patogjen, duke përfshirë bakteret patogjene dhe kërpudhat.Nxitimi (nga 2 HPI në disa ndërveprime) dhe shtypja globale e gjeneve të lidhura me fotosintezën në përgjigje të infeksionit mund të nxisin imunitetin e bimëve bazuar në vendosjen e specieve reaktive të oksigjenit dhe ndërveprimin e tyre me rrugën e acidit salicilik për të ndërmjetësuar reaksionet alergjike 90,94.
Si përfundim, mekanizmat e reagimit mbrojtës të propozuar për linjën më rezistente (83A:476) përfshijnë njohjen e shpejtë të patogjenit nga gjeni R (me sa duket TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dhe sinjalizimin e acidit salicilik dhe etilenit të ndërmjetësuar nga reagimi alergjik, i ndjekur nga vendosja e SAR me rreze të gjatë.veprimi mbështetet nga proteina DIR-1.Duhet theksuar se periudha biotrofike për infeksionin C. lupini është shumë e shkurtër (afërsisht 2 ditë), e ndjekur nga rritja nekrotike95.Kalimi midis këtyre fazave mund të shoqërohet me nekrozë dhe shprehje të proteinave të induktueshme nga etilen, të cilat veprojnë si nxitës për reaksionet e mbindjeshmërisë në bimët pritëse.Prandaj, periudha kohore për kapjen e suksesshme të C. lupini në fazën biotrofike është shumë e ngushtë.Riprogramimi i gjeneve të lidhura me redoksin dhe fotosintezën e vëzhguar në 83A:476 në 6 hpi është në përputhje me përparimin e hifeve kërpudhore dhe paralajmëron zhvillimin e një reagimi të suksesshëm mbrojtës në fazën biotrofike.Përgjigjet transkriptomike të Mandelup dhe popullsisë 22660 mund të vonohen shumë për të kapur kërpudhat përpara se të kalojnë në rritjen nekrotike, megjithatë, Mandelup mund të jetë më efektiv se popullata 22660 sepse rregullimi relativisht i shpejtë i proteinës PR-10 nxit rezistencën horizontale.
ETI, i drejtuar nga gjeni kanonik R, duket të jetë një mekanizëm i zakonshëm për rezistencën e fasules ndaj antraknozës.Kështu, në modelin e bishtajoreve Medicago truncatula, rezistenca ndaj antraknozës jepet nga gjeni RCT1, një anëtar i klasës së gjenit të bimëve TIR-NBS-LRR97.Ky gjen gjithashtu jep rezistencë ndaj antraknozës me spektër të gjerë në jonxhë kur transferohet te bimët e ndjeshme.Në fasulen e zakonshme (P. vulgaris), deri më sot janë identifikuar më shumë se dy duzina gjene të rezistencës ndaj antraknozës.Disa nga këto gjene gjenden në rajone ku mungon ndonjë gjen kanonik R, megjithatë shumë të tjerë ndodhen në skajet e kromozomeve që mbajnë grupin e gjeneve NBS-LRR, duke përfshirë TIR-NBS-LRRs99.Studimi i SSR në të gjithë gjenomin konfirmoi gjithashtu lidhjen e gjenit NBS-LRR me rezistencën ndaj antraknozës në fasulet e zakonshme.Gjeni kanonik R u gjet gjithashtu në rajonin gjenomik që mbante vendndodhjen kryesore të rezistencës ndaj antraknozës në lupin e bardhë 101.
Puna jonë tregon se një reagim i menjëhershëm i rezistencës, i aktivizuar në një fazë të hershme të infeksionit të bimëve (mundësisht jo më vonë se 12 hpi), mbron në mënyrë efektive lupinën me gjethe të ngushta nga antraknoza e shkaktuar nga kërpudhat patogjene Collelotrichum lupini.Duke përdorur sekuencën e xhiros së lartë, ne demonstruam profile të shprehjes diferenciale të gjeneve të rezistencës ndaj antraknozës në bimët NLL të ndërmjetësuara nga gjenet e rezistencës Lanr1 dhe AnMan.Mbrojtja e suksesshme përfshin dizajnimin e kujdesshëm të gjeneve për proteinat e përfshira në redoks, fotosintezë dhe patogjenezë brenda disa orësh nga kontakti i parë i bimës me një patogjen.Reaksione të ngjashme mbrojtëse, por të vonuara në kohë, janë shumë më pak efektive në mbrojtjen e bimëve nga sëmundjet.Rezistenca ndaj antraksit e ndërmjetësuar nga gjeni Lanr1 i ngjan përgjigjes tipike të shpejtë të gjenit R (imuniteti i shkaktuar nga efektor), ndërsa gjeni AnMan ka shumë të ngjarë të sigurojë një përgjigje horizontale (imunitet i shkaktuar nga një model molekular i lidhur me mikrobet), duke siguruar një nivel të moderuar qëndrueshmërie.
215 linjat NLL të përdorura për të ekzaminuar për shënuesit e antraknozës përbëheshin nga 74 kultivarë, 60 linja të marra nga kryqëzimi ose shumimi, 5 mutant dhe 76 germplazma të egra ose origjinale.Linjat erdhën nga 17 vende, kryesisht nga Polonia (58), Spanja (47), Gjermania (27), Australia (26), Rusia (19), Bjellorusia (7), Italia (5) dhe linja të tjera.nga 10 shtete.Kompleti përfshin gjithashtu linja rezistente referencë: 83A:476, Tanjil, Wonga që mban alelin Lanr1 dhe Mandelup që mban alelin AnMan.Linjat u morën nga Baza e të Dhënave të Burimeve Gjenetike të Lupinit Evropian e mbajtur nga Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poloni (Tabela Suplementare S1).
Bimët u rritën në kushte të kontrolluara (fotoperiudha 16 orë, temperatura 25°C gjatë ditës dhe 18°C ​​gjatë natës).Janë analizuar dy kopje biologjike.ADN-ja u izolua nga gjethet tre javore duke përdorur DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Gjermani) sipas protokollit.Cilësia dhe përqendrimi i ADN-së së izoluar u vlerësua me metoda spektrofotometrike (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Markeri AnManM1 që shënon gjenin e rezistencës ndaj anthraknozës AnMan (i rrjedhur nga cv. Mandelup) dhe shënuesit Anseq3 dhe Anseq4 që shoqërojnë gjenin Lanr1 (që rrjedh nga cv. Tanjil) u analizuan 11,26,28.Homozigotët për alelin rezistent u vlerësuan si "1", të ndjeshëm - si "0" dhe heterozigotët - si 0.5.
Bazuar në rezultatet e shqyrtimit për shënuesit AnManM1, AnSeq3 dhe AnSeq4 dhe disponueshmërinë e farave për eksperimentet përfundimtare pasuese, 50 linja NLL u zgjodhën për fenotipizimin e rezistencës ndaj antraknozës.Analiza u krye në dublikatë në një serë të kontrolluar nga kompjuteri me një fotoperiudhë 14 orë me një interval temperaturash 22°C gjatë ditës dhe 19°C gjatë natës.Farërat gërvishten (prerja e shtresës së farës në anën e kundërt të embrionit me një teh të mprehtë) përpara mbjelljes për të parandaluar përgjumjen e farës për shkak se shtresa e farës është shumë e fortë dhe për të siguruar mbirje uniforme.Bimët u rritën në tenxhere (11 × 11 × 21 cm) me tokë sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varshavë, Poloni).Inokulimi u krye me shtamin Colletotrichum lupini Col-08, i rritur në vitin 1999 nga kërcellet e bimëve lupine me gjethe të ngushta të rritura në një fushë në Verzhenitsa, Polonia e Madhe (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Merrni një zonë.Izolimet u kultivuan në mjedis SNA në 20° C. nën dritën e zezë për 21 ditë për të nxitur sporulimin.Katër javë pas mbjelljes, kur bimët kishin arritur në fazën 4-6 gjethe, inokulimi bëhej duke spërkatur me një suspension konidiesh në përqendrim 0,5 x 106 konidia për ml.Pas inokulimit, bimët u mbajtën në errësirë ​​për 24 orë në një lagështi prej rreth 98% dhe një temperaturë prej 25°C për të lehtësuar mbirjen e konideve dhe procesin e infektimit.Bimët u rritën më pas në një fotoperiodë 14-orëshe në 22°C ditë/19°C natën dhe lagështi 70%.Rezultati i sëmundjes u bë 22 ditë pas inokulimit dhe varionte nga 0 (imun) në 9 (shumë i ndjeshëm) në varësi të pranisë ose mungesës së lezioneve nekrotike në kërcell dhe gjethe.Përveç kësaj, pas pikëzimit u mat pesha e bimëve.Marrëdhëniet midis gjenotipeve të markerëve dhe fenotipeve të sëmundjes u llogaritën si korrelacione me dy sekuenca pikash (mungesa e shënuesve heterozigotë në grupin e linjave për analizën e fenotipit të rezistencës ndaj antraknozës).