Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta paraqesim faqen pa stile dhe JavaScript.
Ekziston nevoja për një sistem të besueshëm in vitro që mund të riprodhojë me saktësi mjedisin fiziologjik të zemrës për testimin e barnave. Disponueshmëria e kufizuar e sistemeve të kulturës së indeve të zemrës njerëzore ka çuar në interpretime të pasakta të efekteve kardiake të barnave. Këtu, ne kemi zhvilluar një model të kulturës së indeve të zemrës (CTCM) që stimulon elektromekanikisht fetat e zemrës dhe i nënshtrohet shtrirjes fiziologjike gjatë fazave sistolike dhe diastolike të ciklit kardiak. Pas 12 ditësh kulturë, kjo qasje përmirësoi pjesërisht qëndrueshmërinë e seksioneve të zemrës, por nuk e ruajti plotësisht integritetin e tyre strukturor. Prandaj, pas shqyrtimit të molekulave të vogla, zbuluam se shtimi i 100 nM triiodotironinë (T3) dhe 1 μM deksametazon (Dex) në mjedisin tonë ruajti mikrostrukturën e seksioneve për 12 ditë. Në kombinim me trajtimin T3/Dex, sistemi CTCM ruajti profilet transkriptuese, qëndrueshmërinë, aktivitetin metabolik dhe integritetin strukturor në të njëjtin nivel si indet e freskëta të zemrës për 12 ditë. Përveç kësaj, shtrirja e tepërt e indit kardiak në kulturë shkakton sinjalizim hipertrofik kardiak, duke ofruar prova për aftësinë e CTCM për të imituar kushtet hipertrofike të shkaktuara nga shtrirja kardiake. Si përfundim, CTCM mund të modelojë fiziologjinë dhe patofiziologjinë e zemrës në kulturë gjatë periudhave të gjata kohore, duke mundësuar shqyrtim të besueshëm të barnave.
Përpara kërkimeve klinike, nevojiten sisteme të besueshme in vitro që mund të riprodhojnë me saktësi mjedisin fiziologjik të zemrës njerëzore. Sisteme të tilla duhet të imitojnë shtrirjen mekanike të ndryshuar, rrahjet e zemrës dhe vetitë elektrofiziologjike. Modelet shtazore përdoren zakonisht si një platformë shqyrtimi për fiziologjinë kardiake me besueshmëri të kufizuar në pasqyrimin e efekteve të barnave në zemrën e njeriut1,2. Në fund të fundit, Modeli Ideal Eksperimental i Kulturës së Indeve Kardiake (CTCM) është një model që është shumë i ndjeshëm dhe specifik për ndërhyrje të ndryshme terapeutike dhe farmakologjike, duke riprodhuar me saktësi fiziologjinë dhe patofiziologjinë e zemrës së njeriut3. Mungesa e një sistemi të tillë kufizon zbulimin e trajtimeve të reja për dështimin e zemrës4,5 dhe ka çuar në kardiotoksicitetin e barnave si një arsye kryesore për daljen nga tregu6.
Gjatë dekadës së fundit, tetë ilaçe jo-kardiovaskulare janë tërhequr nga përdorimi klinik sepse shkaktojnë zgjatje të intervalit QT që çon në aritmi ventrikulare dhe vdekje të papritur7. Kështu, ekziston një nevojë në rritje për strategji të besueshme të shqyrtimit paraklinik për të vlerësuar efikasitetin dhe toksicitetin kardiovaskular. Përdorimi i kohëve të fundit i kardiomiociteve të nxjerra nga qelizat staminale pluripotente të induktuara nga njeriu (hiPS-CM) në shqyrtimin e barnave dhe testimin e toksicitetit ofron një zgjidhje të pjesshme për këtë problem. Megjithatë, natyra e papjekur e hiPS-CM dhe mungesa e kompleksitetit shumëqelizor të indit kardiak janë kufizime kryesore të kësaj metode. Studimet e fundit kanë treguar se ky kufizim mund të kapërcehet pjesërisht duke përdorur hiPS-CM të hershëm për të formuar hidrogele të indeve kardiake menjëherë pas fillimit të tkurrjeve spontane dhe duke rritur gradualisht stimulimin elektrik me kalimin e kohës. Megjithatë, këtyre mikroindeve hiPS-CM u mungojnë vetitë e pjekura elektrofiziologjike dhe kontraktile të miokardit të rritur. Përveç kësaj, indi kardiak njerëzor ka një strukturë më komplekse, e përbërë nga një përzierje heterogjene e llojeve të ndryshme të qelizave, duke përfshirë qelizat endoteliale, neuronet dhe fibroblastet stromale, të ndërlidhura nga grupe specifike të proteinave të matricës jashtëqelizore. Kjo heterogjenitet i popullatave jo-kardiomiocite11,12,13 në zemrën e gjitarëve të rritur është një pengesë e madhe për modelimin e indeve kardiake duke përdorur lloje individuale qelizash. Këto kufizime të mëdha theksojnë rëndësinë e zhvillimit të metodave për kultivimin e indit të paprekur miokardial në kushte fiziologjike dhe patologjike.
Seksionet e holla të kultivuara (300 µm) të zemrës njerëzore kanë provuar të jenë një model premtues i miokardit të paprekur njerëzor. Kjo metodë ofron qasje në një sistem të plotë shumëqelizor 3D të ngjashëm me indin e zemrës njerëzore. Megjithatë, deri në vitin 2019, përdorimi i seksioneve të kultivuara të zemrës ishte i kufizuar nga mbijetesa e shkurtër (24 orë) e kulturës. Kjo për shkak të një numri faktorësh, duke përfshirë mungesën e shtrirjes fiziko-mekanike, ndërfaqen ajër-lëng dhe përdorimin e mediave të thjeshta që nuk mbështesin nevojat e indit kardiak. Në vitin 2019, disa grupe kërkimore demonstruan se përfshirja e faktorëve mekanikë në sistemet e kulturës së indeve kardiake mund të zgjasë jetëgjatësinë e kulturës, të përmirësojë shprehjen kardiake dhe të imitojë patologjinë kardiake. Dy studime elegante 17 dhe 18 tregojnë se ngarkesa mekanike uniaxiale ka një efekt pozitiv në fenotipin kardiak gjatë kulturës. Megjithatë, këto studime nuk përdorën ngarkesën dinamike tre-dimensionale fiziko-mekanike të ciklit kardiak, pasi seksionet e zemrës u ngarkuan ose me forca izometrike tërheqëse 17 ose me ngarkesë lineare auxotonike 18. Këto metoda të shtrirjes së indeve rezultuan në shtypjen e shumë gjeneve kardiake ose në mbishprehjen e gjeneve të shoqëruara me përgjigje anormale të shtrirjes. Veçanërisht, Pitoulis et al. 19 zhvilluan një banjë dinamike kulture të fetave të zemrës për rindërtimin e ciklit kardiak duke përdorur reagime nga transduktori i forcës dhe nxitës tensioni. Edhe pse ky sistem lejon modelim më të saktë të ciklit kardiak in vitro, kompleksiteti dhe rendimenti i ulët i metodës kufizon zbatimin e këtij sistemi. Laboratori ynë kohët e fundit ka zhvilluar një sistem kulture të thjeshtuar duke përdorur stimulim elektrik dhe një medium të optimizuar për të ruajtur qëndrueshmërinë e seksioneve të indeve të zemrës së derrit dhe njeriut për deri në 6 ditë 20,21.
Në dorëshkrimin aktual, ne përshkruajmë një model të kulturës së indeve kardiake (CTCM) duke përdorur seksione të zemrës së derrit që përfshin sinjale humorale për të përmbledhur fiziologjinë tre-dimensionale kardiake dhe distensionin patofiziologjik gjatë ciklit kardiak. Ky CTCM mund të rrisë saktësinë e parashikimit paraklinik të barnave në një nivel të paarritur më parë duke ofruar një sistem kardiak me kosto efektive dhe rendiment të mesëm që imiton fiziologjinë/patofiziologjinë e zemrës së gjitarëve për testimin paraklinik të barnave.
Sinjalet mekanike hemodinamike luajnë një rol kritik në ruajtjen e funksionit të kardiomiociteve in vitro 22,23,24. Në dorëshkrimin aktual, ne kemi zhvilluar një CTCM (Figura 1a) që mund të imitojë mjedisin kardiak të të rriturve duke nxitur stimulim elektrik dhe mekanik në frekuenca fiziologjike (1.2 Hz, 72 rrahje në minutë). Për të shmangur shtrirjen e tepërt të indeve gjatë diastolës, u përdor një pajisje printimi 3D për të rritur madhësinë e indeve me 25% (Fig. 1b). Stimulimi elektrik i induktuar nga sistemi C-PACE u caktua në kohën e duhur për të filluar 100 ms para sistolës duke përdorur një sistem mbledhjeje të të dhënave për të riprodhuar plotësisht ciklin kardiak. Sistemi i kulturës së indeve përdor një aktivizues pneumatik të programueshëm (LB Engineering, Gjermani) për të zgjeruar ciklikisht një membranë silikoni fleksibël për të shkaktuar zgjerimin e fetave të zemrës në dhomën e sipërme. Sistemi u lidh me një linjë ajri të jashtme përmes një transduktori presioni, i cili bëri të mundur rregullimin e saktë të presionit (± 1 mmHg) dhe kohës (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Bashkangjitni seksionin e indeve në unazën mbështetëse 7 mm, të treguar me blu, brenda dhomës së kulturës së pajisjes. Dhoma e kulturës është e ndarë nga dhoma e ajrit nga një membranë e hollë fleksibile silikoni. Vendosni një guarnicion midis secilës dhomë për të parandaluar rrjedhjet. Kapaku i pajisjes përmban elektroda grafiti që ofrojnë stimulim elektrik. b Paraqitje skematike e pajisjes së indeve të mëdha, unazës udhëzuese dhe unazës mbështetëse. Seksionet e indeve (kafe) vendosen në pajisjen e madhe me unazën udhëzuese të vendosur në brazdën në skajin e jashtëm të pajisjes. Duke përdorur udhëzuesin, vendosni me kujdes unazën mbështetëse të veshur me ngjitës akrilik indesh mbi seksionin e indit kardiak. c Grafik që tregon kohën e stimulimit elektrik si një funksion i presionit të dhomës së ajrit të kontrolluar nga një aktivizues pneumatik i programueshëm (PPD). Një pajisje për mbledhjen e të dhënave u përdor për të sinkronizuar stimulimin elektrik duke përdorur sensorë presioni. Kur presioni në dhomën e kulturës arrin pragun e caktuar, një sinjal pulsi dërgohet në C-PACE-EM për të shkaktuar stimulimin elektrik. d Imazh i katër CTCM-ve të vendosura në një raft inkubatori. Katër pajisje janë të lidhura me një PPD nëpërmjet një qarku pneumatik, dhe sensorë presioni futen në valvulën hemostatike për të monitoruar presionin në qarkun pneumatik. Çdo pajisje përmban gjashtë seksione indesh.
Duke përdorur një aktivizues të vetëm pneumatik, ne ishim në gjendje të kontrollonim 4 pajisje CTCM, secila prej të cilave mund të mbante 6 seksione indesh (Fig. 1d). Në CTCM, presioni i ajrit në dhomën e ajrit shndërrohet në presion sinkron në dhomën e lëngjeve dhe shkakton zgjerim fiziologjik të prerjes së zemrës (Figura 2a dhe Filmi Plotësues 1). Vlerësimi i shtrirjes së indeve në 80 mm Hg. Artikull tregon shtrirjen e seksioneve të indeve me 25% (Fig. 2b). Kjo përqindje shtrirjeje është treguar se korrespondon me një gjatësi fiziologjike të sarkomerit prej 2.2–2.3 µm për kontraktueshmëri normale të seksionit kardiak17,19,25. Lëvizja e indeve u vlerësua duke përdorur cilësime të personalizuara të kamerës (Figura Plotësuese 1). Amplituda dhe shpejtësia e lëvizjes së indeve (Fig. 2c, d) korrespondonin me shtrirjen gjatë ciklit kardiak dhe kohën gjatë sistolës dhe diastolës (Fig. 2b). Shtrirja dhe shpejtësia e indit kardiak gjatë tkurrjes dhe relaksimit mbetën konstante për 12 ditë në kulturë (Fig. 2f). Për të vlerësuar efektin e stimulimit elektrik në kontraktilitet gjatë kulturës, ne zhvilluam një metodë për përcaktimin e deformitetit aktiv duke përdorur një algoritëm hijezimi (Fig. 2a, b plotësuese) dhe ishim në gjendje të dallonim deformimet me dhe pa stimulim elektrik. E njëjta pjesë e zemrës (Fig. 2f). Në rajonin e lëvizshëm të prerjes (R6-9), tensioni gjatë stimulimit elektrik ishte 20% më i lartë se në mungesë të stimulimit elektrik, gjë që tregon kontributin e stimulimit elektrik në funksionin kontraktil.
Gjurmët përfaqësuese të presionit të dhomës së ajrit, presionit të dhomës së lëngut dhe matjeve të lëvizjes së indeve konfirmojnë se presioni i dhomës ndryshon presionin e dhomës së lëngut, duke shkaktuar një lëvizje përkatëse të prerjes së indeve. b Gjurmët përfaqësuese të përqindjes së shtrirjes (blu) të seksioneve të indeve që korrespondojnë me përqindjen e shtrirjes (portokalli). c Lëvizja e matur e prerjes kardiake është në përputhje me shpejtësinë e matur të lëvizjes. (d) Trajektoret përfaqësuese të lëvizjes ciklike (vija blu) dhe shpejtësisë (vija me pika portokalli) në një prerje të zemrës. e Kuantifikimi i kohës së ciklit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), koha e tkurrjes (n = 19 feta për grup), koha e relaksimit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), lëvizja e indeve (n = 25 feta)/grup nga derra të ndryshëm), shpejtësia maksimale sistolike (n = 24(D0), 25(D12) feta/grup nga derra të ndryshëm) dhe shkalla maksimale e relaksimit (n=24(D0), 25(D12) feta/grup nga derra të ndryshëm). Testi t i Studentit me dy bishta nuk tregoi ndonjë ndryshim të rëndësishëm në asnjë parametër. Gjurmë të analizës përfaqësuese të tendosjes së seksioneve të indeve me (të kuqe) dhe pa (blu) stimulim elektrik, dhjetë zona rajonale të seksioneve të indeve nga e njëjta seksion. Panelet e poshtme tregojnë përcaktimin sasior të ndryshimit në përqindje në tendosje në seksionet e indeve me dhe pa stimulim elektrik në dhjetë zona nga seksione të ndryshme. (n = 8 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi t i Studentit me dy bishta; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi t i Studentit me dy bishta; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seksione/grup nga derra të ndryshëm, testi t i Studentit me dy bishta; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksione/grup, nga derra të ndryshëm, testi t i Studentit me dy bishta; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Në sistemin tonë të mëparshëm të kulturës statike biomimetike të fetave të zemrës [20, 21], ne ruajtëm qëndrueshmërinë, funksionin dhe integritetin strukturor të fetave të zemrës për 6 ditë duke aplikuar stimulim elektrik dhe duke optimizuar përbërjen e mediumit. Megjithatë, pas 10 ditësh, këto shifra ranë ndjeshëm. Ne do t'i referohemi seksioneve të kultivuara në sistemin tonë të mëparshëm të kulturës statike biomimetike 20, 21 në kushtet e kontrollit (Ctrl) dhe do të përdorim mediumin tonë të optimizuar më parë si kushte MC dhe kulturë nën stimulim të njëkohshëm mekanik dhe elektrik (CTCM). të quajtur . Së pari, ne përcaktuam se stimulimi mekanik pa stimulim elektrik ishte i pamjaftueshëm për të ruajtur qëndrueshmërinë e indeve për 6 ditë (Fig. Plotësuese 3a,b). Është interesante se me futjen e stimulimit fiziko-mekanik dhe elektrik duke përdorur STCM, qëndrueshmëria e seksioneve të zemrës 12-ditore mbeti e njëjtë si në seksionet e freskëta të zemrës në kushte MS, por jo në kushte Ctrl, siç tregohet nga analiza MTT (Fig. 1). 3a). Kjo sugjeron që stimulimi mekanik dhe simulimi i ciklit kardiak mund t'i mbajnë seksionet e indeve të qëndrueshme për dy herë më shumë kohë sesa është raportuar në sistemin tonë të mëparshëm të kulturës statike. Megjithatë, vlerësimi i integritetit strukturor të seksioneve të indeve me anë të imunoetiketimit të troponinës kardiake T dhe koneksinës 43 tregoi se shprehja e koneksinës 43 ishte dukshëm më e lartë në indet MC në ditën 12 sesa në kontrollet në të njëjtën ditë. Megjithatë, shprehja uniforme e koneksinës 43 dhe formimi i diskut Z nuk u ruajtën plotësisht (Fig. 3b). Ne përdorim një kornizë inteligjence artificiale (AI) për të përcaktuar sasinë e integritetit strukturor të indeve26, një tubacion të të mësuarit të thellë të bazuar në imazhe bazuar në ngjyrosjen troponinë-T dhe koneksinës43 për të përcaktuar automatikisht sasinë e integritetit strukturor dhe fluoreshencës së prerjeve të zemrës në aspektin e forcës së lokalizimit. Kjo metodë përdor një Rrjet Neural Konvolucional (CNN) dhe një kornizë të të mësuarit të thellë për të përcaktuar në mënyrë të besueshme sasinë e integritetit strukturor të indit kardiak në një mënyrë të automatizuar dhe të paanshme, siç përshkruhet në referencë. 26. Indi MC tregoi ngjashmëri strukturore të përmirësuar në ditën 0 krahasuar me seksionet statike të kontrollit. Përveç kësaj, ngjyrosja trikrome e Masson zbuloi një përqindje dukshëm më të ulët të fibrozës në kushtet e MS krahasuar me kushtet e kontrollit në ditën 12 të kulturës (Fig. 3c). Ndërsa CTCM rriti qëndrueshmërinë e seksioneve të indeve të zemrës në ditën e 12-të në një nivel të ngjashëm me atë të indeve të freskëta të zemrës, ajo nuk e përmirësoi ndjeshëm integritetin strukturor të seksioneve të zemrës.
Një grafik me shtylla tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë MTT të fetave të freskëta të zemrës (D0) ose kulturës së fetave të zemrës për 12 ditë ose në kulturë statike (D12 Ctrl) ose në CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl). Një grafik me shtylla tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë MTT të fetave të freskëta të zemrës (D0) ose të kulturës së fetave të zemrës për 12 ditë ose në kulturë statike (D12 Ctrl) ose në CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl).Histograma tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë së seksioneve të zemrës së freskët MTT (D0) ose kulturës së seksioneve të zemrës për 12 ditë në kulturë statike (kontroll D12) ose CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12). ) , 12 (D12 MC) seksione/grup nga derra të ndryshëm, kryhet një test ANOVA me një drejtim;####p < 0,0001 në сравнению со D0 dhe **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl). një 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组茡VA化测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01). një 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p <1D， 与相比,**p.)histograma që tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë së MTT-së në prerje të freskëta të zemrës (D0) ose prerje të zemrës të kultivuara për 12 ditë në kulturë statike (kontroll D12) ose CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontroll D12)), 12 prerje/grup (D12 MC) nga derra të ndryshëm, testi ANOVA me një drejtim;####p < 0,0001 në сравнению со D0, **p < 0,01 në сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0.0001 krahasuar me D0, **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl).b Troponina-T (jeshile), koneksina 43 (e kuqe) dhe DAPI (blu) në seksione të zemrës të sapoizoluara (D0) ose seksione të zemrës të kultivuara në kushte statike (Ctrl) ose kushte CTCM (MC) për 12 ditë) të imazheve përfaqësuese të imunofluoreshencës (shkalla bosh = 100 µm). Kuantifikimi me inteligjencë artificiale i integritetit strukturor të indeve të zemrës (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). Kuantifikimi me inteligjencë artificiale i integritetit strukturor të indeve të zemrës (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп от разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный сравнению со D0 dhe ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Përcaktimi sasior i integritetit strukturor të indit kardiak me anë të inteligjencës artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksione/grupe nga derra të ndryshëm, u krye testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 kundrejt D0 dhe ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila derra të ndryshme, testi i njëanshëm #0#00p ANOVA;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secilin prej derrave të ndryshëm, testi i njëanshëm ANOVA ##0#0 <1;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/группу каждой из разных свиней, raporti D000 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Inteligjencë artificiale për të përcaktuar në mënyrë sasiore integritetin strukturor të indit kardiak (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksione/grup secili prej derrave të ndryshëm, testi ANOVA me një drejtim; ####p<0.0001 kundrejt .D0 Për krahasim ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktim sasior (djathtas) për fetat e zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikromike të Massonit (Shkalla e bardhë = 500 µm) (n = 10 feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktim sasior (djathtas) për fetat e zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikromike të Massonit (Shkalla e bardhë = 500 µm) (n = 10 feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). c. raportornniй тест ANOVA; Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktim sasior (djathtas) të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikrome të Massonit (shkalla e paveshur = 500 µm) (n = 10 seksione/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA me një drejtim i kryer; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). c.个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相010 与D0 相010 与D0 相01.相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单# 单向 单# 向0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) сорезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 сорезов/grupypa, protestë помощью однофакторного dispersionnogo analizë ;### #p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktim sasior (djathtas) të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikrome të Massonit (bosh = 500 µm) (n = 10 seksione/grup, secila nga një derr i ndryshëm, testuar me anë të analizës njëkahëshe të variancës;### # p < 0.0001 krahasuar me D0, ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Ne hipotetizuam se duke shtuar molekula të vogla në mjedisin e kulturës, integriteti i kardiomiociteve mund të përmirësohej dhe zhvillimi i fibrozës të zvogëlohej gjatë kulturës CTCM. Prandaj, ne shqyrtuam për molekula të vogla duke përdorur kulturat tona statike të kontrollit20,21 për shkak të numrit të vogël të faktorëve ngatërrues. Deksametazona (Dex), triiodotironina (T3) dhe SB431542 (SB) u zgjodhën për këtë shqyrtim. Këto molekula të vogla janë përdorur më parë në kulturat hiPSC-CM për të nxitur maturimin e kardiomiociteve duke rritur gjatësinë e sarkomerit, tubulat T dhe shpejtësinë e përçueshmërisë. Përveç kësaj, si Dex (një glukokortikoid) ashtu edhe SB janë të njohura për shtypjen e inflamacionit29,30. Prandaj, ne testuam nëse përfshirja e njërës ose e një kombinimi të këtyre molekulave të vogla do të përmirësonte integritetin strukturor të seksioneve të zemrës. Për shqyrtimin fillestar, doza e secilit përbërës u zgjodh bazuar në përqendrimet që përdoren zakonisht në modelet e kulturës qelizore (1 μM Dex27, 100 nM T327 dhe 2.5 μM SB31). Pas 12 ditësh kultivimi, kombinimi i T3 dhe Dex rezultoi në integritet optimal strukturor të kardiomiociteve dhe rimodelim minimal fibroze (Figurat plotësuese 4 dhe 5). Përveç kësaj, përdorimi i këtyre përqendrimeve të dyfishta ose të dyfishta të T3 dhe Dex prodhoi efekte të dëmshme krahasuar me përqendrimet normale (Fig. plotësuese 6a,b).
Pas shqyrtimit fillestar, ne kryem një krahasim kokë më kokë të 4 kushteve të kulturës (Figura 4a): Ctrl: seksione të zemrës të kultivuara në kulturën statike të përshkruar më parë duke përdorur mjedisin tonë të optimizuar; 20.21 TD: T3 dhe Ctrl u shtuan Dex të mërkurën; MC: seksione të zemrës të kultivuara në CTCM duke përdorur mjedisin tonë të optimizuar më parë; dhe MT: CTCM me T3 dhe Dex të shtuara në mjedis. Pas 12 ditësh kultivimi, qëndrueshmëria e indeve MS dhe MT mbeti e njëjtë si në indet e freskëta të vlerësuara me anë të analizës MTT (Fig. 4b). Është interesante se shtimi i T3 dhe Dex në kulturat transwell (TD) nuk rezultoi në një përmirësim të ndjeshëm të qëndrueshmërisë krahasuar me kushtet Ctrl, duke treguar një rol të rëndësishëm të stimulimit mekanik në ruajtjen e qëndrueshmërisë së seksioneve të zemrës.
Një diagram i projektimit eksperimental që përshkruan katër kushtet e kulturës të përdorura për të vlerësuar efektet e stimulimit mekanik dhe plotësimit me T3/Dex në medium për 12 ditë. Grafiku me shtylla tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me fetat e freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 krahasuar me D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl). Grafiku me shtylla tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me fetat e freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 krahasuar me D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 ditë pas kulturimit në të gjitha 4 kushtet e kulturave (kontroll, TD, MC dhe MT) me sravneniyu me dhjetëra vjet (D101 (D101) (D101 serd) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу од разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ###p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с. 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). Grafiku me shtylla tregon përcaktimin sasior të qëndrueshmërisë 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (kontroll, TD, MC dhe MT) krahasuar me prerjet e zemrës së freskët (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC) prerje/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kundrejt D0 dhe **p < 0.01 krahasuar me D12 Ctrl). b. TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.000001相比,**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (kontroll, TD, MC dhe MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe 12 MT2) MC) срезы/gruppa, raportornniй тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). b Histograma që tregon të 4 kushtet e kulturës (kontroll, TD, MC dhe MT) krahasuar me prerjet e zemrës së freskët (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), nga derra të ndryshëm 12 prerje/grup (D12 MC), testi ANOVA me një drejtim; ####p<0.0001, ###p<0.001 kundrejt D0, **p<0.01 kundrejt kontrollit D12). Grafiku me shufra tregon përcaktimin sasior të fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me fetat e zemrës së freskët (D0) (n = 6 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ###p < 0.001, krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). Grafiku me shufra tregon përcaktimin sasior të fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me fetat e zemrës së freskët (D0) (n = 6 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ###p < 0.001, krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dite pas kultivirovanija në të gjitha 4 kushtet e grupeve (kontroll, TD, MC dhe MT) me sravneniyu me stërvitje (60) разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; Histograma tregon përcaktimin sasior të fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (kontroll, TD, MC dhe MT) krahasuar me prerjet e zemrës së freskët (D0) (n = 6 prerje/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA me një drejtim i kryer; ###p < 0.001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001 krahasuar me D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相湯弌弌天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#0p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , , ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 ditë pas kulturave për të gjitha 4 kushtetй культивирования (kontroll, TD, MC dhe MT) për disa herë (60 ditë me çdo ditë) срезов/группа, от разных свиней, односотронний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (kontroll); c Histograma që tregon përcaktimin sasior të fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës për të 4 kushtet e kulturës (kontroll, TD, MC dhe MT) krahasuar me prerjet e zemrës së freskët (D0) (n = 6 prerje/grup, nga derra të ndryshëm, unilaterale. U kryen testet ANOVA, ###p < 0.001 krahasuar me D0, ***p < 0.001 krahasuar me D12 (kontroll).d Grafikët e analizës së tendosjes së indeve të freskëta (blu), MC të ditës 12 (jeshile) dhe MT të ditës 12 (e kuqe) në dhjetë pika rajonale të prerjes së indeve (n = 4 feta/grup, test ANOVA me një drejtim; nuk kishte ndryshim të rëndësishëm midis grupeve). e Grafiku i Vullkanit që tregon gjenet e shprehura në mënyrë të ndryshme në prerjet e zemrës së freskët (D0) krahasuar me prerjet e zemrës të kultivuara në kushte statike (Ctrl) ose në kushte MT (MT) për 10-12 ditë. f Harta e nxehtësisë e gjeneve të sarkomerit për prerjet e zemrës të kultivuara në secilën prej kushteve të kulturës. Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Varësia metabolike nga kalimi nga oksidimi i acideve yndyrore në glikolizë është një shenjë dalluese e dediferencimit të kardiomiociteve. Kardiomiocitet e papjekura përdorin kryesisht glukozën për prodhimin e ATP-së dhe kanë mitokondri hipoplazike me pak krista5,32. Analizat e shfrytëzimit të glukozës treguan se në kushtet e MC dhe MT, shfrytëzimi i glukozës ishte i ngjashëm me atë në indet e ditës 0 (Figura 4c). Megjithatë, mostrat Ctrl treguan një rritje të konsiderueshme në shfrytëzimin e glukozës krahasuar me indet e freskëta. Kjo tregon se kombinimi i CTCM dhe T3/Dex rrit qëndrueshmërinë e indeve dhe ruan fenotipin metabolik të seksioneve të zemrës të kultivuara 12-ditore. Përveç kësaj, analiza e tendosjes tregoi se nivelet e tendosjes mbetën të njëjta si në indet e freskëta të zemrës për 12 ditë në kushtet e MT dhe MS (Fig. 4d).
Për të analizuar ndikimin e përgjithshëm të CTCM dhe T3/Dex në peizazhin global transkriptues të indeve të prerjeve kardiake, ne kryem RNAseq në prerjet kardiake nga të katër kushtet e ndryshme të kulturës (Të dhëna plotësuese 1). Është interesante se prerjet MT treguan ngjashmëri të lartë transkriptuese me indin e freskët të zemrës, me vetëm 16 gjene të shprehura në mënyrë të ndryshme nga 13,642 gjene. Megjithatë, siç treguam më parë, prerjet Ctrl shfaqën 1229 gjene të shprehura në mënyrë të ndryshme pas 10-12 ditësh në kulturë (Fig. 4e). Këto të dhëna u konfirmuan nga qRT-PCR e gjeneve të zemrës dhe të fibroblasteve (Fig. plotësuese 7a-c). Është interesante se prerjet Ctrl treguan ulje të gjeneve të ciklit kardiak dhe qelizor dhe aktivizim të programeve të gjeneve inflamatore. Këto të dhëna sugjerojnë që dediferencimi, i cili normalisht ndodh pas kultivimit afatgjatë, është dobësuar plotësisht në kushtet MT (Fig. plotësuese 8a,b). Një studim i kujdesshëm i gjeneve të sarkomerit tregoi se vetëm në kushte MT ruhen gjenet që kodojnë sarkomerin (Fig. 4f) dhe kanalin jonik (Fig. Plotësuese 9), duke i mbrojtur ato nga shtypja në kushte Ctrl, TD dhe MC. Këto të dhëna tregojnë se me një kombinim të stimulimit mekanik dhe humoral (T3/Dex), transkriptomi i prerjes së zemrës mund të mbetet i ngjashëm me prerjet e freskëta të zemrës pas 12 ditësh në kulturë.
Këto gjetje transkriptuese mbështeten nga fakti se integriteti strukturor i kardiomiociteve në seksionet e zemrës ruhet më së miri në kushte MT për 12 ditë, siç tregohet nga koneksina 43 e paprekur dhe e lokalizuar (Fig. 5a). Përveç kësaj, fibroza në seksionet e zemrës në kushte MT u zvogëlua ndjeshëm krahasuar me Ctrl dhe ngjashëm me seksionet e freskëta të zemrës (Fig. 5b). Këto të dhëna tregojnë se kombinimi i stimulimit mekanik dhe trajtimit T3/Dex ruan në mënyrë efektive strukturën kardiake në seksionet e zemrës në kulturë.
Imazhe përfaqësuese të imunofluoreshencës së troponinës-T (jeshile), koneksinës 43 (e kuqe) dhe DAPI (blu) në seksione të zemrës të izoluara fllad (D0) ose të kultivuara për 12 ditë në të katër kushtet e kulturës së seksionit të zemrës (shiriti i shkallës = 100 µm). Kuantifikimi me inteligjencë artificiale i integritetit strukturor të indeve të zemrës (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe *p < 0.05, ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). Kuantifikimi me inteligjencë artificiale i integritetit strukturor të indeve të zemrës (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe *p < 0.05, ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целости ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) тестрезов/группу од разных свиней, ##VA; 0,0001 me sravneniyu me D0 dhe *p < 0,05 ose ****p < 0,0001 me sravneniyu me D12 Ctrl). Përcaktimi sasior i integritetit strukturor të indeve të zemrës duke përdorur inteligjencën artificiale (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) seksione/grup nga derra të ndryshëm, u krye testi ANOVA me një drejtim; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe *p < 0.05 ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和0*p < 0,0001 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 m）2 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p <0.00. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Përcaktimi sasior i integritetit strukturor të indit kardiak duke përdorur inteligjencën artificiale në derra të ndryshëm (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) seksione/grup) me një test ANOVA me një drejtim;#### p < 0,0001 по сравнению со D0 dhe *p < 0,05 ose ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe *p < 0.05 ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktim sasior për fetat e zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikromike të Massonit (Shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 feta (D12 MT)/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001, ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktim sasior për fetat e zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikromike të Massonit (Shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 feta (D12 MT)/grup nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe ***p < 0.001, ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D121 TD9), dhe D121 TD9) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA. b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktimi sasior i seksioneve të zemrës të ngjyrosura me ngjyrosjen trikromike të Massonit (shkalla shirit = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 (D12 MT) seksione/grup nga derra të ndryshëm, të kryera ANOVA me një drejtim; ####p < 0.0001 kundrejt D0 dhe ***p < 0.001 ose ****p < 0.0001 kundrejt D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单曠素方差弌#00与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； 00##0D； 00.相比，***p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC) / группы, один- способ ANOVA; b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktimi sasior i seksioneve të zemrës të ngjyrosura me trikromin e Massonit (shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 seksione (D12 MT) nga derra/grupe të ndryshme, një metodë ANOVA; ####p < 0.0001 krahasuar me D0, ***p < 0.001 ose ****p < 0.0001 krahasuar me D12 Ctrl).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Së fundmi, aftësia e CTCM për të imituar hipertrofinë kardiake u vlerësua duke rritur shtrirjen e indit kardiak. Në CTCM, presioni maksimal i dhomës së ajrit u rrit nga 80 mmHg në 80 mmHg. Art. (shtrirje normale) deri në 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Kjo korrespondon me një rritje prej 32% në shtrirje (Fig. 6b), e cila më parë ishte treguar si përqindja përkatëse e shtrirjes së kërkuar për seksionet e zemrës për të arritur një gjatësi sarkomere të ngjashme me atë të parë në hipertrofi. Shtrirja dhe shpejtësia e indit kardiak gjatë tkurrjes dhe relaksimit mbetën konstante gjatë gjashtë ditëve të kulturës (Fig. 6c). Indi kardiak nga kushtet e MT iu nënshtrua shtrirjes normale (MT (Normale)) ose kushteve të mbishtrirjes (MT (OS)) për gjashtë ditë. Tashmë pas katër ditësh në kulturë, biomarkeri hipertrofik NT-ProBNP u rrit ndjeshëm në mjedis në kushte MT (OS) krahasuar me kushtet MT (normale) (Fig. 7a). Përveç kësaj, pas gjashtë ditësh kultivimi, madhësia e qelizave në MT (OS) (Fig. 7b) u rrit ndjeshëm krahasuar me seksionet e zemrës MT (normale). Përveç kësaj, zhvendosja bërthamore e NFATC4 u rrit ndjeshëm në indet e mbi-shtrënguara (Fig. 7c). Këto rezultate tregojnë zhvillimin progresiv të rimodelimit patologjik pas hiperdistenzionit dhe mbështesin konceptin se pajisja CTCM mund të përdoret si një platformë për të studiuar sinjalizimin e hipertrofisë kardiake të shkaktuar nga shtrirja.
Gjurmët përfaqësuese të presionit të dhomës së ajrit, presionit të dhomës së lëngut dhe matjeve të lëvizjes së indeve konfirmojnë se presioni i dhomës ndryshon presionin e dhomës së lëngut, duke shkaktuar një lëvizje përkatëse të prerjes së indeve. b Kurbat përfaqësuese të përqindjes së shtrirjes dhe shkallës së shtrirjes për seksionet e indeve të shtrira normalisht (portokalli) dhe të mbishtrira (blu). c Grafiku me shufra që tregon kohën e ciklit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), kohën e tkurrjes (n = 18-19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), kohën e relaksimit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm)), amplituda e lëvizjes së indeve (n = 14 feta/grup, nga derra të ndryshëm), shpejtësinë maksimale sistolike (n = 14 feta/grup, nga derra të ndryshëm) dhe shkallën maksimale të relaksimit (n = 14 (D0), 15 (D6) (seksione/grupe) nga derra të ndryshëm), testi t i Studentit me dy bishta nuk tregoi ndonjë ndryshim të rëndësishëm në asnjë parametër, duke treguar se këta parametra mbetën konstant gjatë 6 ditëve të kulturës me mbitension. Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Një përcaktim sasior i përqendrimit të NT-ProBNP në median e kulturës nga fetat e zemrës të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (Norm) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm dhe D4 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, u krye ANOVA me dy drejtime; **p < 0.01 krahasuar me shtrirjen normale). Një përcaktim sasior i përqendrimit të NT-ProBNP në median e kulturës nga fetat e zemrës të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (Norm) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 feta/grup (D2 MTOS, D4 MTNorm dhe D4 MTOS) nga derra të ndryshëm, u krye ANOVA me dy drejtime; **p < 0.01 krahasuar me shtrirjen normale).Histograma sasiore e përqendrimit të NT-ProBNP në mjedisin e kulturës nga fetat e zemrës të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (normë) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm dhe D4).MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet analiza dyfaktorëshe e variancës;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0.01 krahasuar me shtrirjen normale). një 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01). një përcaktim sasior i përqendrimit të NT-ProBNP në feta zemre të kultivuara nën kushte të shtrirjes normale MT (Norm) ose mbishtrirjeje (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) nga të ndryshme猪的切片/组，可以双向方方发发动 **krahasuar me shtrirjen normale, p <0,01).histograma Kuantifikimi i përqendrimeve të NT-ProBNP në feta të zemrës të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (normë) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dhe D4 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, analiza dypalëshe e variancës;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0.01 krahasuar me shtrirjen normale). b Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës të ngjyrosura me troponinë-T dhe WGA (majtas) dhe përcaktimi i madhësisë së qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 feta të ndryshme nga derra të ndryshëm, është kryer testi t i Studentit me dy bishta; ****p < 0.0001 krahasuar me shtrirjen normale). b Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës të ngjyrosura me troponinë-T dhe WGA (majtas) dhe përcaktimi i madhësisë së qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 feta të ndryshme nga derra të ndryshëm, është kryer testi t i Studentit me dy bishta; ****p < 0.0001 krahasuar me shtrirjen normale). b Representativnыe izobrazheniya rezov serdca, okrashennыh troponinom-T dhe AZP (sleva) dhe koliчестvennogo përcaktimija e përcaktimit të kletokut (sdrejta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетката свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imazhe përfaqësuese të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me troponinë-T dhe AZP (majtas) dhe përcaktimi i madhësisë së qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 seksione të ndryshme nga derra të ndryshëm, u krye testi t i Studentit me dy bishta; ****p < 0.0001 krahasuar me llojin normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表漈3 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001). b Imazhe përfaqësuese të fetave të zemrës të ngjyrosura me kalkareinë-T dhe WGA (majtas) dhe madhësia e qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 nga 10 feta të ndryshme (D6 MTNorm)) Cells/molecular, testi i magnezit me magnezyûm të urinës; krahasuar me shtrirjen normale, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения сорезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm znыh) из 10 Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b Imazhe përfaqësuese të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me troponinë-T dhe AZP (majtas) dhe përcaktimi sasior i madhësisë së qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga 10 seksione të ndryshme nga derra të ndryshëm) Qeliza/grup, kriteri dypalësh Student's t; ****p < 0.0001 krahasuar me sojin normal). Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës MTOS të ditës 0 dhe 6 të imunoetiketuara për troponin-T dhe NFATC4 dhe përcaktimi sasior i translokacionit të NFATC4 në bërthamat e CM-ve (n = 4 (D0), 3 feta (D6 MTOS)/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testi t i Studentit me dy bishta; *p < 0.05). Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës MTOS të ditës 0 dhe 6 të imunoetiketuara për troponin-T dhe NFATC4 dhe përcaktimi sasior i translokacionit të NFATC4 në bërthamat e CM-ve (n = 4 (D0), 3 feta (D6 MTOS)/grup nga derra të ndryshëm, u krye testi t i Studentit me dy bishta; *p < 0.05). c. срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). Imazhe përfaqësuese për prerjet e zemrës në ditët 0 dhe 6 të MTOS, të imunoetiketuara për troponin-T dhe NFATC4, dhe përcaktimi sasior i translokacionit të NFATC4 në bërthamën e qelizave kavernoze (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) prerje/grup nga derra të ndryshëm) kryen testin t të Studentit me dy bishta; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (30D) (MT40n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)". c Imazhe përfaqësuese të etiketimit të imunitetit calcanin-T dhe NFATC4 第0天和第6天MTOS, dhe NFATC4 nga bërthama e ndryshme e qelizave NFATC4 易位至CM的sasia化 (n = 4 (D6/MTOS 礻礻),时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c. хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). Imazhe përfaqësuese të fetave të zemrës MTOS në ditën 0 dhe 6 për imunoetiketimin e troponinës-T dhe NFATC4 dhe përcaktimin sasior të translokacionit NFATC4 në bërthamën e CM nga derra të ndryshëm (n = 4 (D0), 3 (D6) feta MTOS/grup, kriteri t me dy bishta Student's; *p < 0.05).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Hulumtimi kardiovaskular translacional kërkon modele qelizore që riprodhojnë me saktësi mjedisin kardiak. Në këtë studim, u zhvillua dhe u karakterizua një pajisje CTCM që mund të stimulojë seksione ultra të holla të zemrës. Sistemi CTCM përfshin stimulim elektromekanik të sinkronizuar fiziologjikisht dhe pasurim me lëngje T3 dhe Dex. Kur seksionet e zemrës së derrit u ekspozuan ndaj këtyre faktorëve, qëndrueshmëria e tyre, integriteti strukturor, aktiviteti metabolik dhe shprehja transkriptuese mbetën të njëjta si në indet e freskëta të zemrës pas 12 ditësh kulture. Përveç kësaj, shtrirja e tepërt e indit kardiak mund të shkaktojë hipertrofi të zemrës të shkaktuar nga hiperekstensioni. Në përgjithësi, këto rezultate mbështesin rolin kritik të kushteve fiziologjike të kulturës në ruajtjen e një fenotipi normal kardiak dhe ofrojnë një platformë për shqyrtimin e barnave.
Shumë faktorë kontribuojnë në krijimin e një mjedisi optimal për funksionimin dhe mbijetesën e kardiomiociteve. Më të dukshëmit nga këta faktorë lidhen me (1) bashkëveprimet ndërqelizore, (2) stimulimin elektromekanik, (3) faktorët humoralë dhe (4) substratet metabolike. Ndërveprimet fiziologjike qelizë-me-qelizë kërkojnë rrjete komplekse tre-dimensionale të llojeve të shumëfishta të qelizave të mbështetura nga një matricë jashtëqelizore. Ndërveprime të tilla komplekse qelizore janë të vështira për t'u rindërtuar in vitro me anë të bashkëkulturës së llojeve individuale të qelizave, por mund të arrihen lehtësisht duke përdorur natyrën organotipike të seksioneve të zemrës.
Shtrirja mekanike dhe stimulimi elektrik i kardiomiociteve janë kritike për ruajtjen e fenotipit kardiak33,34,35. Ndërsa stimulimi mekanik është përdorur gjerësisht për kushtëzimin dhe maturimin e hiPSC-CM, disa studime elegante kanë tentuar së fundmi stimulimin mekanik të fetave të zemrës në kulturë duke përdorur ngarkesë uniaksiale. Këto studime tregojnë se ngarkesa mekanike uniaksiale 2D ka një efekt pozitiv në fenotipin e zemrës gjatë kulturës. Në këto studime, seksionet e zemrës u ngarkuan ose me forca izometrike tërheqëse17, ngarkesë lineare auxotonike18, ose cikli kardiak u rikrijua duke përdorur reagime të transduktorit të forcës dhe nxitës tensioni. Megjithatë, këto metoda përdorin shtrirjen uniaksiale të indeve pa optimizim mjedisor, duke rezultuar në shtypjen e shumë gjeneve kardiake ose mbishprehjen e gjeneve të shoqëruara me përgjigje anormale të shtrirjes. CTCM e përshkruar këtu ofron një stimul elektromekanik 3D që imiton ciklin natyror kardiak për sa i përket kohës së ciklit dhe shtrirjes fiziologjike (25% shtrirje, 40% sistolë, 60% diastolë dhe 72 rrahje në minutë). Edhe pse ky stimulim mekanik tre-dimensional vetëm nuk është i mjaftueshëm për të ruajtur integritetin e indeve, një kombinim i stimulimit humoral dhe mekanik duke përdorur T3/Dex është i nevojshëm për të ruajtur në mënyrë adekuate qëndrueshmërinë, funksionin dhe integritetin e indeve.
Faktorët humoralë luajnë një rol të rëndësishëm në modulimin e fenotipit të zemrës së të rriturve. Kjo u theksua në studimet HiPS-CM në të cilat T3 dhe Dex u shtuan në median e kulturës për të përshpejtuar maturimin e qelizave. T3 mund të ndikojë në transportin e aminoacideve, sheqernave dhe kalciumit nëpër membranat qelizore36. Përveç kësaj, T3 nxit shprehjen e MHC-α dhe uljen e MHC-β, duke nxitur formimin e miofibrileve me tkurrje të shpejtë në kardiomiocitet e pjekura krahasuar me miofibrilet me tkurrje të ngadaltë në CM fetale. Mungesa e T3 në pacientët me hipotiroidizëm rezulton në humbjen e brezave miofibrilarë dhe një shkallë të reduktuar të zhvillimit të tonit37. Dex vepron në receptorët glukokortikoide dhe është treguar se rrit kontraktueshmërinë miokardiale në zemrat e izoluara të perfuzuara; 38 ky përmirësim mendohet të jetë i lidhur me efektin në hyrjen e shtyrë nga depozitat e kalciumit (SOCE) 39,40. Përveç kësaj, Dex lidhet me receptorët e tij, duke shkaktuar një përgjigje të gjerë intraqelizore që shtyp funksionin imunitar dhe inflamacionin30.
Rezultatet tona tregojnë se stimulimi fizik-mekanik (MS) përmirësoi performancën e përgjithshme të kulturës krahasuar me Ctrl, por dështoi të ruante qëndrueshmërinë, integritetin strukturor dhe shprehjen kardiake gjatë 12 ditëve në kulturë. Krahasuar me Ctrl, shtimi i T3 dhe Dex në kulturat CTCM (MT) përmirësoi qëndrueshmërinë dhe ruajti profile të ngjashme transkriptimi, integritet strukturor dhe aktivitet metabolik me indin e freskët të zemrës për 12 ditë. Përveç kësaj, duke kontrolluar shkallën e shtrirjes së indeve, u krijua një model i hipertrofisë kardiake të shkaktuar nga hiperekstensioni duke përdorur STCM, duke ilustruar shkathtësinë e sistemit STCM. Duhet të theksohet se megjithëse rimodelimi kardiak dhe fibroza zakonisht përfshijnë organe të paprekura, qelizat qarkulluese të të cilave mund të sigurojnë citokinat e duhura, si dhe fagocitozën dhe faktorë të tjerë të rimodelimit, seksionet e zemrës ende mund të imitojnë procesin fibrotik në përgjigje të stresit dhe traumës. Kjo është vlerësuar më parë në këtë model të prerjes kardiake. Duhet të theksohet se parametrat CTCM mund të modulohen duke ndryshuar amplitudën dhe frekuencën e presionit/elektrike për të simuluar shumë kushte të tilla si takikardia, bradikardia dhe mbështetja mekanike e qarkullimit të gjakut (zemër e shkarkuar mekanikisht). Kjo e bën sistemin një rendiment mesatar për testimin e barnave. Aftësia e CTCM për të modeluar hipertrofinë kardiake të shkaktuar nga mbingarkesa hap rrugën për testimin e këtij sistemi për terapi të personalizuar. Si përfundim, studimi aktual tregon se shtrirja mekanike dhe stimulimi humoral janë kritikë për ruajtjen e kulturës së seksioneve të indeve kardiake.
Edhe pse të dhënat e paraqitura këtu sugjerojnë që CTCM është një platformë shumë premtuese për modelimin e miokardit të paprekur, kjo metodë kulture ka disa kufizime. Kufizimi kryesor i kulturës CTCM është se ajo imponon strese të vazhdueshme mekanike dinamike në feta, gjë që përjashton mundësinë për të monitoruar në mënyrë aktive tkurrjet e fetave kardiake gjatë çdo cikli. Përveç kësaj, për shkak të madhësisë së vogël të seksioneve kardiake (7 mm), aftësia për të vlerësuar funksionin sistolik jashtë sistemeve të kulturës duke përdorur sensorë tradicionalë të forcës është e kufizuar. Në dorëshkrimin aktual, ne e kapërcejmë pjesërisht këtë kufizim duke vlerësuar tensionin optik si një tregues të funksionit kontraktil. Megjithatë, ky kufizim do të kërkojë punë të mëtejshme dhe mund të adresohet në të ardhmen duke futur metoda për monitorimin optik të funksionit të fetave të zemrës në kulturë, siç është hartëzimi optik duke përdorur kalcium dhe ngjyra të ndjeshme ndaj tensionit. Një kufizim tjetër i CTCM është se modeli i punës nuk manipulon stresin fiziologjik (parangarkesën dhe pasngarkesën). Në CTCM, presioni u induktua në drejtime të kundërta për të riprodhuar 25% shtrirje fiziologjike në diastole (shtrirje e plotë) dhe sistolë (gjatësia e tkurrjes gjatë stimulimit elektrik) në inde shumë të mëdha. Ky kufizim duhet të hiqet në modelet e ardhshme të CTCM-së duke ushtruar presion të mjaftueshëm mbi indin kardiak nga të dyja anët dhe duke aplikuar marrëdhëniet e sakta presion-vëllim që ndodhin në dhomat e zemrës.
Rimodelimi i shkaktuar nga mbishtrirja i raportuar në këtë dorëshkrim është i kufizuar në imitimin e sinjaleve të hipershtrirjes hipertrofike. Kështu, ky model mund të ndihmojë në studimin e sinjalizimit hipertrofik të shkaktuar nga shtrirja pa nevojën për faktorë humoralë ose nervorë (të cilët nuk ekzistojnë në këtë sistem). Nevojiten studime të mëtejshme për të rritur shumëfishin e CTCM-së, për shembull, bashkëkulturimi me qelizat imune, faktorët humoralë në plazmën qarkulluese dhe inervimi kur bashkëkulturimi me qelizat neuronale do të përmirësojë mundësitë e modelimit të sëmundjes me CTCM.
Në këtë studim u përdorën trembëdhjetë derra. Të gjitha procedurat me kafshët u kryen në përputhje me udhëzimet institucionale dhe u miratuan nga Komiteti i Kujdesit dhe Përdorimit të Kafshëve Institucionale të Universitetit të Louisville. Harku i aortës u mbyll me kapëse dhe zemra u perfuzua me 1 L kardioplegji sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparinë, pH deri në 7.4); Zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë me akull deri sa u transportuan në laborator në akull, që zakonisht është <10 minuta. Zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë me akull deri sa u transportuan në laborator në akull, që zakonisht është <10 minuta. Serdca хранили në ледяном кардиоплегическом shpërndahet deri në transportirov në laboratorët e lumit, që nuk kërkon <10 min. Zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë me akull deri në transportimin në laborator në akull, gjë që zakonisht zgjat <10 minuta.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до transportirovki në laboratorët e lьdu, обычно <10 мин. Mbajini zemrat në kardioplegji në akull deri në transportimin në laborator në akull, zakonisht <10 minuta.
Pajisja CTCM u zhvillua në programin SolidWorks të dizajnit të ndihmuar nga kompjuteri (CAD). Dhomat e kulturës, ndarësit dhe dhomat e ajrit janë bërë nga plastikë akrilike transparente CNC. Unaza rezervë me diametër 7 mm është bërë nga polietileni me dendësi të lartë (HDPE) në qendër dhe ka një kanal unaze-o për të akomoduar unazën-o prej silikoni të përdorur për të vulosur median poshtë saj. Një membranë e hollë silici ndan dhomën e kulturës nga pllaka e ndarjes. Membrana prej silikoni është prerë me lazer nga një fletë silikoni me trashësi 0.02″ dhe ka një fortësi prej 35A. Guarnicionet e poshtme dhe të sipërme prej silikoni janë prerë me lazer nga një fletë silikoni me trashësi 1/16″ dhe kanë një fortësi prej 50A. Vida dhe arra krahësh çeliku inox 316L përdoren për fiksimin e bllokut dhe krijimin e një vule hermetike.
Një pllakë qarku e printuar (PCB) e dedikuar është projektuar për t'u integruar me sistemin C-PACE-EM. Prizat e lidhësve të makinës zvicerane në PCB janë të lidhura me elektroda grafiti me anë të telave të bakrit të veshur me argjend dhe vida bronzi 0-60 të vidhosura në elektroda. Pllaka e qarkut të printuar vendoset në mbulesën e printerit 3D.
Pajisja CTCM kontrollohet nga një aktivizues pneumatik i programueshëm (PPD) që krijon një presion të kontrolluar qarkullimi të ngjashëm me një cikël kardiak. Ndërsa presioni brenda dhomës së ajrit rritet, membrana fleksibile e silikonit zgjerohet lart, duke e detyruar mjedisin nën vendin e indeve. Zona e indeve do të shtrihet më pas nga kjo nxjerrje e lëngut, duke imituar zgjerimin fiziologjik të zemrës gjatë diastolës. Në kulmin e relaksimit, stimulimi elektrik u aplikua përmes elektrodave grafiti, të cilat ulën presionin në dhomën e ajrit dhe shkaktuan tkurrje të seksioneve të indeve. Brenda tubit është një valvul hemostatik me një sensor presioni për të zbuluar presionin në sistemin e ajrit. Presioni i ndjerë nga sensori i presionit aplikohet në një mbledhës të dhënash të lidhur me laptopin. Kjo lejon monitorimin e vazhdueshëm të presionit brenda dhomës së gazit. Kur u arrit presioni maksimal i dhomës (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), pajisja e mbledhjes së të dhënave u urdhërua të dërgonte një sinjal në sistemin C-PACE-EM për të gjeneruar një sinjal tensioni bifazik për 2 ms, të vendosur në 4 V.
U morën prerje të zemrës dhe kushtet e kultivimit në 6 puse u kryen si më poshtë: Zemrat e mbledhura u transferuan nga ena e transferimit në një tabaka që përmbante kardioplegji të ftohtë (4° C.). Ventrikula e majtë u izolua me një teh steril dhe u pre në copa prej 1-2 cm3. Këto blloqe indesh u ngjitën në mbështetëse indesh me ngjitës indesh dhe u vendosën në një banjë indesh me mikrotom vibruese që përmbante tretësirë ​​Tyrode dhe u oksigjenua vazhdimisht (3 g/L 2,3-butanedion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glukozë (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml tretësirë ​​1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml tretësirë ​​1 M), deri në 1 L ddH2O). Mikrotomi vibrues u vendos për të prerë feta me trashësi 300 µm në një frekuencë prej 80 Hz, një amplitudë dridhjeje horizontale prej 2 mm dhe një shpejtësi avancimi prej 0.03 mm/s. Banja e indeve u rrethua nga akulli për ta mbajtur tretësirën të freskët dhe temperatura u mbajt në 4°C. Transferoni seksionet e indeve nga banja e mikrotomit në një banjë inkubimi që përmban tretësirë ​​Tyrode të oksigjenuar vazhdimisht në akull derisa të merren seksione të mjaftueshme për një pllakë kulture. Për kulturat transwell, seksionet e indeve u ngjitën në mbështetëse sterile poliuretani me gjerësi 6 mm dhe u vendosën në 6 ml medium të optimizuar (medium 199, 1x shtesë ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline dhe 2X antibiotik-antifungal). Stimulimi elektrik (10 V, frekuenca 1.2 Hz) u aplikua në seksionet e indeve përmes C-Pace. Për kushtet TD, T3 dhe Dex të freskëta u shtuan në 100 nM dhe 1 μM në çdo ndryshim të mediumit. Mjedisi ngopet me oksigjen para zëvendësimit 3 herë në ditë. Seksionet e indeve u kultivuan në një inkubator në 37°C dhe 5% CO2.
Për kulturat CTCM, prerjet e indeve u vendosën në një printer 3D të bërë me porosi në një enë Petri që përmbante tretësirë ​​të modifikuar të Tyrode. Pajisja është projektuar për të rritur madhësinë e prerjes së zemrës me 25% të sipërfaqes së unazës mbështetëse. Kjo bëhet në mënyrë që prerjet e zemrës të mos shtrihen pasi të transferohen nga tretësira e Tyrode në mjedis dhe gjatë diastolës. Duke përdorur ngjitës histoakrilik, prerjet me trashësi 300 µm u fiksuan në një unazë mbështetëse me diametër 7 mm. Pasi të keni bashkangjitur prerjet e indeve në unazën mbështetëse, pritini prerjet e tepërta të indeve dhe vendosni prerjet e bashkangjitura të indeve përsëri në banjën e tretësirës Tyrode në akull (4°C) derisa të jenë përgatitur prerje të mjaftueshme për një pajisje. Koha totale e përpunimit për të gjitha pajisjet nuk duhet të kalojë 2 orë. Pasi 6 prerje indesh u bashkangjitën në unazat e tyre mbështetëse, pajisja CTCM u montua. Dhoma e kulturës CTCM është e mbushur paraprakisht me 21 ml mjedis të para-oksigjenuar. Transferoni prerjet e indeve në dhomën e kulturës dhe hiqni me kujdes çdo flluskë ajri me një pipetë. Seksioni i indeve më pas drejtohet në vrimë dhe shtypet butësisht në vend. Së fundmi, vendosni kapakun e elektrodës në pajisje dhe transferoni pajisjen në inkubator. Pastaj lidhni CTCM me tubin e ajrit dhe sistemin C-PACE-EM. Aktuatori pneumatik hapet dhe valvula e ajrit hap CTCM-në. Sistemi C-PACE-EM u konfigurua për të dhënë 4 V në 1.2 Hz gjatë stimulimit bifazik për 2 ms. Mjedisi u ndërrua dy herë në ditë dhe elektrodat u ndërruan një herë në ditë për të shmangur akumulimin e grafitit në elektroda. Nëse është e nevojshme, seksionet e indeve mund të hiqen nga puset e tyre të kulturës për të nxjerrë çdo flluskë ajri që mund të ketë rënë nën to. Për kushtet e trajtimit MT, T3/Dex u shtua i freskët me çdo ndërrim të mjedisit me 100 nM T3 dhe 1 μM Dex. Pajisjet CTCM u kultivuan në një inkubator në 37°C dhe 5% CO2.
Për të marrë trajektore të shtrira të fetave të zemrës, u zhvillua një sistem i veçantë kamerash. Një aparat fotografik SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japoni) u përdor me një lente makro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Vizualizimi u krye në temperaturën e dhomës pasi u zëvendësua mediumi me medium të freskët. Kamera është pozicionuar në një kënd 51° dhe videoja regjistrohet me 30 korniza për sekondë. Së pari, softueri me burim të hapur (MUSCLEMOTION43) u përdor me Image-J për të përcaktuar lëvizjen e fetave të zemrës. Maska u krijua duke përdorur MATLAB (MathWorks, Natick, MA, SHBA) për të përcaktuar rajonet me interes për feta të zemrës që rrahin për të shmangur zhurmën. Maska të segmentuara manualisht aplikohen në të gjitha imazhet në një sekuencë kornizash dhe më pas kalohen në shtojcën MUSCLEMOTION. Muscle Motion përdor intensitetin mesatar të pikselëve në secilin kuadër për të përcaktuar lëvizjen e tij në lidhje me kornizën referuese. Të dhënat u regjistruan, u filtruan dhe u përdorën për të përcaktuar kohën e ciklit dhe për të vlerësuar shtrirjen e indeve gjatë ciklit kardiak. Videoja e regjistruar u përpunua më pas duke përdorur një filtër dixhital zero-fazor të rendit të parë. Për të përcaktuar shtrirjen e indeve (nga maja në majë), u krye analiza nga maja në majë për të dalluar majat dhe uljet në sinjalin e regjistruar. Përveç kësaj, heqja e trendit kryhet duke përdorur një polinom të rendit të 6-të për të eliminuar zhvendosjen e sinjalit. Kodi i programit u zhvillua në MATLAB për të përcaktuar lëvizjen globale të indeve, kohën e ciklit, kohën e relaksimit dhe kohën e tkurrjes (Kodi Plotësues i Programit 44).
Për analizën e tendosjes, duke përdorur të njëjtat video të krijuara për vlerësimin e shtrirjes mekanike, së pari gjurmuam dy imazhe që përfaqësonin majat e lëvizjes (pikat më të larta (të sipërme) dhe më të ulëta (të poshtme) të lëvizjes) sipas softuerit MUSCLEMOTION. Pastaj segmentuam rajonet e indeve dhe aplikuam një formë algoritmi hijezimi në indin e segmentuar (Fig. plotësuese 2a). Indi i segmentuar u nda më pas në dhjetë nënsipërfaqe, dhe stresi në secilën sipërfaqe u llogarit duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm: Tendosje = (Sup-Sdown)/Sdown, ku Sup dhe Sdown janë distancat e formës nga hijet e sipërme dhe të poshtme të pëlhurës, përkatësisht (Fig. plotësuese .2b).
Seksionet e zemrës u fiksuan në 4% paraformaldehidë për 48 orë. Indet e fiksuara u dehidratuan në 10% dhe 20% sukrozë për 1 orë, pastaj në 30% sukrozë gjatë natës. Seksionet më pas u futën në përbërjen me temperaturë optimale prerjeje (përbërësin OCT) dhe u ngrinë gradualisht në një banjë izopentan/akull të thatë. Blloqet e ngulitjes OCT u ruajtën në -80 °C deri në ndarje. Laminat u përgatitën si seksione me një trashësi prej 8 μm.
Për të hequr OCT nga prerjet e zemrës, ngrohni laminat në një bllok ngrohjeje në 95 °C për 5 minuta. Shtoni 1 ml PBS në secilën laminat dhe inkubojeni për 30 minuta në temperaturën e dhomës, pastaj përshkoni prerjet duke vendosur 0.1% Triton-X në PBS për 15 minuta në temperaturën e dhomës. Për të parandaluar lidhjen e antitrupave jospecifikë me mostrën, shtoni 1 ml tretësirë ​​BSA 3% në laminat dhe inkubojeni për 1 orë në temperaturën e dhomës. BSA u hoq më pas dhe laminat u lanë me PBS. Shënoni secilën mostër me laps. Antitrupat primarë (të holluar 1:200 në 1% BSA) (koneksina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dhe troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) u shtuan gjatë 90 minutave, pastaj antitrupat sekondarë (të holluar 1:200 në 1% BSA) kundër Alexa Fluor 488 të miut (Thermo Scientific; #A16079), kundër Alexa Fluor 594 të lepurit (Thermo Scientific; #T6391) për 90 minuta të tjera. U larë 3 herë me PBS. Për të dalluar ngjyrosjen e shënjestrës nga sfondi, përdorëm vetëm antitrupin sekondar si kontroll. Së fundmi, u shtua ngjyrosja bërthamore DAPI dhe lamellat u vendosën në një vectashield (Vector Laboratories) dhe u vulosën me manikyr. (zmadhim -x) dhe mikroskopi Keyence me zmadhim 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) në 5 μg/ml në PBS u përdor për ngjyrosjen WGA dhe u aplikua në seksione të fiksuara për 30 minuta në temperaturë ambienti. Laminat më pas u lanë me PBS dhe në secilën laminat iu shtua e zeza e Sudanit dhe u inkubuan për 30 minuta. Laminat më pas u lanë me PBS dhe iu shtua mediumi i ngulitjes vectashield. Laminat u vizualizuan në një mikroskop Keyence me zmadhim 40x.
OCT u hoq nga mostrat siç përshkruhet më sipër. Pas heqjes së OCT-së, lamëzat zhyten në tretësirën e Bouin-it gjatë natës. Lamëzat u shpëlanë me ujë të distiluar për 1 orë dhe më pas u vendosën në një tretësirë ​​Bibrich të acidit aloe fuksinë për 10 minuta. Pastaj, lamëzat u lanë me ujë të distiluar dhe u vendosën në një tretësirë ​​prej 5% fosfomolibden/5% acid fosfotungstik për 10 minuta. Pa shpëlarje, transferojini lamëzat direkt në tretësirën blu të anilinës për 15 minuta. Pastaj, lamëzat u lanë me ujë të distiluar dhe u vendosën në një tretësirë ​​1% acidi acetik për 2 minuta. Lamëzat u thanë në etanol 200 N dhe u transferuan në ksilen. Lamëzat e ngjyrosura u vizualizuan duke përdorur një mikroskop Keyence me një objektiv 10x. Përqindja e sipërfaqes së fibrozës u përcaktua duke përdorur programin Keyence Analyzer.
Analiza e Qëndrueshmërisë Qelizore CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), numri i katalogut V13154, sipas protokollit të prodhuesit me disa modifikime. Në veçanti, një shpues kirurgjikal me diametër 6 mm u përdor për të siguruar madhësinë uniforme të indeve gjatë analizës MTT. Indet u vendosën individualisht në pusetat e një pllake me 12 puseta që përmbante substratin MTT sipas protokollit të prodhuesit. Seksionet inkubohen në 37°C për 3 orë dhe indi i gjallë metabolizon substratin MTT për të formuar një përbërje formazan të purpurt. Zëvendësoni tretësirën MTT me 1 ml DMSO dhe inkubojeni në 37°C për 15 minuta për të nxjerrë formazan të purpurt nga seksionet e zemrës. Mostrat u holluan 1:10 në DMSO në pllaka me fund të tejdukshëm me 96 puseta dhe intensiteti i ngjyrës vjollcë u mat në 570 nm duke përdorur një lexues pllake Citation (BioTek). Leximet u normalizuan në peshën e secilës prerje të zemrës.
Media e prerjes së zemrës u zëvendësua me media që përmbante 1 μCi/ml [5-3H]-glukozë (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SHBA) për analizën e shfrytëzimit të glukozës siç është përshkruar më parë. Pas 4 orësh inkubimi, shtoni 100 µl media në një tub mikrocentrifuge të hapur që përmbante 100 µl 0.2 N HCl. Pastaj tubi u vendos në një tub shintillimi që përmbante 500 μl dH2O për të avulluar [3H]2O për 72 orë në 37°C. Pastaj hiqeni tubin e mikrocentrifugës nga tubi i shintillimit dhe shtoni 10 ml lëng shintillimi. Numërimi i shintillimit u krye duke përdorur një analizues të shintillimit të lëngshëm Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SHBA). Shfrytëzimi i glukozës u llogarit më pas duke marrë parasysh aktivitetin specifik të [5-3H]-glukozës, ekuilibrin dhe sfondin jo të plotë, hollimin e [5-3H]-së në glukozë të paetiketuar dhe efikasitetin e numëruesit të shkënditjes. Të dhënat normalizohen në masën e seksioneve të zemrës.
Pas homogjenizimit të indeve në Trizol, ARN-ja u izolua nga prerjet e zemrës duke përdorur Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sipas protokollit të prodhuesit. Përgatitja e bibliotekës RNAsec, sekuencimi dhe analiza e të dhënave u kryen si më poshtë:
1 μg ARN për mostër u përdor si material fillestar për përgatitjen e bibliotekës së ARN-së. Bibliotekat e sekuencimit u gjeneruan duke përdorur Kit-in e Përgatitjes së Bibliotekës së ARN-së NEBNext UltraTM për Illumina (NEB, SHBA) duke ndjekur rekomandimet e prodhuesit, dhe kodet e indeksit u shtuan në sekuencat e atributeve për secilën mostër. Shkurtimisht, ARNi u pastrua nga ARN-ja totale duke përdorur sfera magnetike të bashkangjitura me oligonukleotide poli-T. Fragmentimi kryhet duke përdorur katione dyvalente në temperaturë të lartë në NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). ADNc-ja e vargut të parë u sintetizua duke përdorur prajmerë heksamer të rastësishëm dhe transkriptazë të kundërt M-MuLV (RNase H-). ADNc-ja e vargut të dytë më pas sintetizohet duke përdorur ADN polimerazën I dhe RNase H. Mbivarjet e mbetura shndërrohen në skaje të topitura nga aktiviteti i eksonukleazës/polimerazës. Pas adenilimit të skajit 3' të fragmentit të ADN-së, një Përshtatës NEBNext me një strukturë laku në formë gjilpëre i bashkangjitet atij për ta përgatitur atë për hibridizim. Për përzgjedhjen e fragmenteve të ADNc-së me gjatësi të preferuar 150-200 bp, fragmentet e bibliotekës u pastruan duke përdorur sistemin AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SHBA). Pastaj, 3 μl USER Enzyme (NEB, SHBA) me ADNc të zgjedhur sipas madhësisë të lidhur me një përshtatës u përdorën për 15 minuta në 37°C dhe pastaj për 5 minuta në 95°C para PCR. PCR u krye më pas duke përdorur polimerazën e ADN-së Phusion High-Fidelity, prajmerët universalë të PCR dhe prajmerët Index (X). Së fundmi, produktet e PCR u pastruan (sistemi AMPure XP) dhe cilësia e bibliotekës u vlerësua në një sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Biblioteka e ADNc-së u sekuencua më pas duke përdorur një sekuencues Novaseq. Skedarët e imazheve të papërpunuara nga Illumina u konvertuan në lexime të papërpunuara duke përdorur CASAVA Base Calling. Të dhënat e papërpunuara ruhen në skedarë të formatit FASTQ(fq) që përmbajnë sekuenca leximi dhe cilësitë përkatëse të bazave. Zgjidhni HISAT2 për të përputhur leximet e sekuencimit të filtruar me gjenomin referues Sscrofa11.1. Në përgjithësi, HISAT2 mbështet gjenomet e çdo madhësie, duke përfshirë gjenomet më të mëdha se 4 miliardë baza, dhe vlerat e parazgjedhura janë vendosur për shumicën e parametrave. Leximet e bashkimit nga të dhënat e Seq të ARN-së mund të harmonizohen në mënyrë efikase duke përdorur HISAT2, sistemin më të shpejtë të disponueshëm aktualisht, me të njëjtën saktësi ose më të mirë se çdo metodë tjetër.
Bollëku i transkripteve pasqyron drejtpërdrejt nivelin e shprehjes së gjenit. Nivelet e shprehjes së gjenit vlerësohen nga bollëku i transkripteve (numri i sekuencimit) i shoqëruar me gjenomin ose eksonet. Numri i leximeve është proporcional me nivelet e shprehjes së gjenit, gjatësinë e gjenit dhe thellësinë e sekuencimit. FPKM (fragmente për mijë çifte bazash të transkripteve të sekuencuara për milion çifte bazash) u llogaritën dhe vlerat P të shprehjes diferenciale u përcaktuan duke përdorur paketën DESeq2. Pastaj llogaritëm shkallën e zbulimit të rremë (FDR) për secilën vlerë P duke përdorur metodën Benjamini-Hochberg9 bazuar në funksionin R të integruar "p.adjust".
ARN-ja e izoluar nga seksionet e zemrës u shndërrua në ADNc në një përqendrim prej 200 ng/μl duke përdorur përzierjen SuperScript IV Vilo Master nga Thermo (Thermo, nr. kat. 11756050). RT-PCR sasiore u krye duke përdorur një pllakë reagimi transparente me 384 puseta Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, nr. kat. 4483319) dhe ngjitës optik mikroamp (Thermo, nr. kat. 4311971). Përzierja e reagimit përbëhej nga 5 µl përzierje Taqman Fast Advanced Master (Thermo, nr. kat. 4444557), 0.5 µl Taqman Primer dhe 3.5 µl H2O të përzier për pus. Ciklet standarde qPCR u kryen dhe vlerat CT u matën duke përdorur një instrument PCR në kohë reale Quantstudio 5 të Applied Biosystems (moduli me 384 puseta; produkti # A28135). Prajmerët Taqman u blenë nga Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Vlerat CT të të gjitha mostrave u normalizuan në gjenin e mirëmbajtjes GAPDH.
Lëshimi i NT-ProBNP në media u vlerësua duke përdorur kitin NT-ProBNP (derr) (Nr. Kat. MBS2086979, MyBioSource) sipas protokollit të prodhuesit. Shkurtimisht, 250 µl të secilës mostër dhe standard u shtuan në dy kopje në secilën pus. Menjëherë pas shtimit të mostrës, shtoni 50 µl të Reagjentit të Analizës A në secilën pus. Tundeni butësisht pllakën dhe vuloseni me sealant. Pastaj tabletat u inkubuan në 37°C për 1 orë. Pastaj aspironi tretësirën dhe lani pusetat 4 herë me 350 µl të tretësirës larëse 1X, duke inkubuar tretësirën larëse për 1-2 minuta çdo herë. Pastaj shtoni 100 µl të Reagjentit të Analizës B për çdo pus dhe vuloseni me sealant pllake. Tableta u tund lehtë dhe u inkubua në 37°C për 30 minuta. Aspironi tretësirën dhe lani pusetat 5 herë me 350 µl të tretësirës larëse 1X. Shtoni 90 µl tretësirë ​​substrati në secilën puset dhe vuloseni pllakën. Inkuboni pllakën në 37°C për 10-20 minuta. Shtoni 50 µl Tretësirë ​​Stop në secilën puset. Pllaka u mat menjëherë duke përdorur një lexues pllake Cytation (BioTek) të vendosur në 450 nm.
Analizat e fuqisë u kryen për të zgjedhur madhësitë e grupeve të cilat do të ofrojnë fuqi >80% për të zbuluar një ndryshim absolut prej 10% në parametër me një shkallë gabimi të Tipit I prej 5%. Analizat e fuqisë u kryen për të zgjedhur madhësitë e grupeve të cilat do të ofrojnë fuqi >80% për të zbuluar një ndryshim absolut prej 10% në parametër me një shkallë gabimi të Tipit I prej 5%. Analiza e mundësisë был vыplot для выбора размеров групп, которые обеспечаток >80% domosdoshmëri për zbardhjen 10% absolutisht absolutisht edimeneniya parametra me 5% частотой ошибок lloji I. Analiza e fuqisë u krye për të zgjedhur madhësitë e grupeve që do të siguronin >80% fuqi për të zbuluar 10% ndryshim absolut të parametrit me një shkallë gabimi të Tipit I prej 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Bыl proveden analiz moщnosty dlя vыбора размера gruppы, kotorыy opespechil bы > 80% domosdoshmëri për shfrytezimin 10% absolutisht të ndryshueshme të parametrave dhe 5% orë të tipit I. U krye një analizë e fuqisë për të zgjedhur një madhësi grupi që do të ofronte >80% fuqi për të zbuluar 10% ndryshim absolut të parametrit dhe 5% shkallë gabimi të tipit I.Seksionet e indeve u përzgjodhën rastësisht para eksperimentit. Të gjitha analizat ishin të verbra në varësi të kushteve dhe mostrat u dekoduan vetëm pasi të gjitha të dhënat ishin analizuar. Për të kryer të gjitha analizat statistikore u përdor softueri GraphPad Prism (San Diego, CA). Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0.05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0.05.Testi t i Studentit me dy kahe u krye në të dhënat me vetëm 2 krahasime. ANOVA me një ose dy kahe u përdor për të përcaktuar rëndësinë midis grupeve të shumëfishta. Gjatë kryerjes së testeve post hoc, korrigjimi i Tukey-t u aplikua për të marrë parasysh krahasimet e shumëfishta. Të dhënat e RNAsec kanë konsiderata të veçanta statistikore kur llogariten FDR dhe p.adjust siç përshkruhet në seksionin Metodat.
Për më shumë informacion mbi hartimin e studimit, shihni abstraktin e Raportit të Kërkimeve të Natyrës të lidhur me këtë artikull.