Хвала вам што сте посетили Натуре.цом. Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС. За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или искључите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у). У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Морфогенеза људског црева успоставља карактеристике крипто-вилуса 3Д микроархитектуре епитела и просторне организације. Ова јединствена структура је неопходна за одржавање хомеостазе црева тако што штити нишу матичних ћелија у базалној крипти од егзогених микробних антигена и њихових метаболита. Поред тога, цревне ресице и цревне ресице и различите ћелије које луче слуз присутну функционалну слуз штите Према томе, рекреација 3Д епителних структура је кључна за изградњу ин витро модела црева. Посебно, органско миметичко црево на чипу може да изазове спонтану 3Д морфогенезу цревног епитела са побољшаним физиолошким функцијама и биомехаником. црева на микрофлуидном чипу као и у Трансвелл уграђеном хибридном чипу. Описујемо детаљне методе за производњу уређаја, култивисање Цацо-2 или цревних органоидних епителних ћелија у конвенционалним окружењима, као и на микрофлуидној платформи, индукцију 3Д морфогенезе уз помоћ вишеструке морфогенезе и постизање вишеструке карактеризације. генерисање функционалне микроархитектуре црева контролисањем базолатералног протока течности током 5 дана. Наша метода ин витро морфогенезе користи физиолошки релевантан напон смицања и механичко кретање и не захтева сложени ћелијски инжењеринг или манипулацију, што може надмашити друге постојеће технике. Предвиђамо да би наш предложени протокол могао да има утицаја на биомедицинску истраживачку заједницу, пружајући регенерацију епимедицинске истраживачке заједнице у3. ин витро за биомедицинску, клиничку и фармацеутску примену.
Експерименти показују да Цацо-2 ћелије цревног епитела култивисане у цревима на чипу1,2,3,4,5 или двослојним микрофлуидним уређајима6,7 могу да се подвргну спонтаној 3Д морфогенези ин витро без јасног разумевања основног механизма. У нашој недавној студији, открили смо да је уклањање морфогенезе са базолатералне културе у довољној мери неопходно за уклањање морфогенезе са базолатералне културе у довољној мери код експеримената. морфогенеза ин витро, што је демонстрирано са Цацо-2 и цревним органоидима добијеним од пацијената.Епителне ћелије су валидиране. У овој студији смо се посебно фокусирали на производњу ћелија и дистрибуцију концентрације снажног Внт антагониста, Дицккопф-1 (ДКК-1), у гут-он-а-цхип и модификованим микрофлуидним уређајима који садрже Трансвелл уметке, назване "Хибридни чип". Д-повезан протеин 1, или Согги-1) у цревима на чипу инхибира морфогенезу или ремети преструктурирани 3Д епителни слој, што сугерише да је антагонистички стрес током културе одговоран за цревну морфогенезу ин витро. Стога је практичан приступ за постизање чврстог епителиогенезе минималног нивоа морфогенезе В да би се одржао минимални ниво морфогенезе епителиоза на нивоу В на минималном нивоу уклањања морфогенезе В на нивоу. одељак активним испирањем (нпр. у платформама гут-он-а-цхип или хибрид-на-цхип) или дифузијом .Базолатерални медијум (нпр. из Трансвелл умета у велике базолатералне резервоаре у бунарима).
У овом протоколу пружамо детаљну методу за производњу микроуређаја „гут-он-а-цхип“ и хибридних чипова који се могу уметнути у Трансвелл (кораци 1-5) за култивацију цревних епителних ћелија на порозним мембранама на бази полидиметилсилоксана (ПДМС) (кораци 6А, 7Б уметак мембране од мембране 6А, 7Б6А). , 7Б, 8, 9) и индукована 3Д морфогенеза ин витро (корак 10). Такође смо идентификовали ћелијске и молекуларне карактеристике које указују на хистогенезу специфичну за ткиво и ћелијску диференцијацију зависну од линије применом вишеструких модалитета снимања (кораци 11-24). , у два формата културе са техничким детаљима укључујући модификацију површине порозних мембрана, стварање 2Д монослојева, и цревне биохемијске и Репродукција биомеханичког микроокружења.ин витро.Да бисмо индуковали 3Д морфогенезу из 2Д епителних монослојева, уклонили смо антагонисте морфогена помоћу антагониста морфогена у оба слоја културе, у основи које смо гајили у компосту, представљали смо подлоге за култивисане форме. ција корисности регенерабилног 3Д епителног слоја који се може користити за моделирање раста епитела зависног од морфогена, уздужних кокултура домаћина и микробиома, инфекције патогеном, инфламаторне повреде, дисфункције епителне баријере и терапија заснованих на пробиотицима Пример.утицаји.
Наш протокол може бити користан широком спектру научника у основном (нпр. биологија цревне слузокоже, биологија матичних ћелија и развојна биологија) и примењеним истраживањима (нпр. претклиничко тестирање лекова, моделирање болести, ткивни инжењеринг и гастроентерологија) широког утицаја. предвиђају да се наша техничка стратегија може дистрибуирати публици која проучава динамику ћелијске сигнализације током развоја црева, регенерације или хомеостазе. Поред тога, наш протокол је користан за испитивање инфекције под различитим инфективним агенсима као што су Норовирус 8, Тешки акутни респираторни синдром Цоронавирус 2 (САРС-лостпхилидиум-димонстерио92) лерае.Публика патологије и патогенезе болести је такође корисна. Употреба микрофизиолошког система црева на чипу може омогућити лонгитудиналну ко-културу 10 и накнадну процену одбране домаћина, имунолошких одговора и поправке повреда повезаних са патогеном у гастроинтестиналном (ГИ) тракту 11 .Други ГИ поремећаји повезани са гастроинтестиналним (ГИ) поремећајима, синдромом пропуштања црева, синдромом цурења црева и синдромом цурења црева или синдром иритабилног црева се може симулирати када се 3Д слојеви цревног епитела припремају коришћењем пацијентових 3Д цревних епителних слојева, ове болести укључују атрофију ресица, скраћивање крипте, оштећење слузокоже или оштећену епителну баријеру. читаоци могу размотрити додавање типова ћелија релевантних за болест, као што су мононуклеарне ћелије периферне крви пацијената (ПБМЦ), моделима који садрже 3Д микроархитектуре цревних ресица-крипта.ткивно специфичне имуне ћелије, 5.
Пошто се 3Д микроструктура епитела може фиксирати и визуелизовати без процеса сечења, гледаоци који раде на просторној транскриптомији и сликама високе резолуције или супер резолуције могу бити заинтересовани за наше мапирање просторно-временске динамике гена и протеина на епителним нишама.Заинтересован за технологију. Одговор на микробне или имуне стимулусе. Даље, уздужно преслушавање домаћин-микробиом 10, 14 које координира хомеостазу црева може се успоставити у 3Д слоју цревне слузокоже ко-културом различитих микробних врста, микробних заједница, посебно у фекалној микробиоти.на платформи.Овај приступ је посебно атрактиван за публику која проучава имунологију слузокоже, гастроентерологију, људски микробиом, културомику и клиничку микробиологију која настоји да култивише претходно некултивисану микробиоту црева у лабораторији. Ако се наш ин витро протокол морфогенезе може прилагодити скалабилним форматима за уметање културе са више јажица, као што су 462, континуални формати плоча за уметање културе 462 или базолатералним одељцима, протокол се такође може дистрибуирати онима који развијају фармацеутске, биомедицинске или платформе за скрининг или валидацију високе пропусности за прехрамбену индустрију. Као доказ принципа, недавно смо демонстрирали изводљивост мултиплексног система за морфогенезу високе пропусности који је скалабилан на комерцијалну плочу са вишеструким органским форматом. 18. Према томе, валидација наше ин витро методе морфогенезе може бити убрзана и потенцијално усвојена од стране многих истраживачких лабораторија, индустрије или владиних и регулаторних агенција да би се разумело ћелијско репрограмирање ин витро морфогенезе црева на транскриптомском нивоу за тестирање лекова или биотерапеутике. да процени репродуктивност процеса морфогенезе црева.
Ограничен број експерименталних модела релевантних за људе коришћен је за проучавање морфогенезе цревног епитела, углавном због недостатка имплементираних протокола за индукцију 3Д морфогенезе ин витро. У ствари, велики део садашњег знања о морфогенези црева заснива се на студијама на животињама (нпр. зебрафисх или20, мишеви могу коштати трудноћу 2-, Х цхицкевер 2-). бити етички упитни, и што је најважније, не одређују прецизно развојне процесе човека. Ови модели су такође веома ограничени у својој способности да се тестирају на вишесмерни скалабилан начин. Због тога је наш протокол за регенерацију 3Д структура ткива ин витро надмашио ин виво животињске моделе, као и друге традиционалне статичке 2Д ћелијске моделе описане у претходном узорку, дозволио нам је претходно описане статичке 2Д ћелијске структуре3Д. просторна локализација диференцираних ћелија у оси крипта-вилус као одговор на различите мукозне или имуне стимулусе. 3Д епителни слојеви могу да обезбеде простор за проучавање како се микробне ћелије такмиче да формирају просторне нише и еколошку еволуцију као одговор на факторе домаћина (нпр. унутрашњи наспрам спољашњих слојева слузи, секреција морробних молекула ИгА, морробних 3Д-пептида, омогућавају више антимикробног ИгД-пептида). разумеју како микробиота црева структурише своје заједнице и синергистички производи микробне метаболите (нпр. кратколанчане масне киселине) који обликују ћелијску организацију и нише матичних ћелија у базалним криптама. Ове карактеристике се могу показати само када се ин витро успоставе 3Д епителни слојеви.
Поред нашег метода креирања 3Д интестиналних епителних структура, постоји неколико ин витро метода. Интестинална органоидна култура је најсавременија техника инжењеринга ткива заснована на култивацији цревних матичних ћелија у специфичним условима морфогена23,24,25. Међутим, употреба 3Д органоидних модела за анализу транспорта лубометина домаћина је често је затворен унутар органоида и стога је увођење луминалних компоненти као што су микробне ћелије или егзогени антигени ограничено.Приступ органоидним луменима може се побољшати коришћењем микроињектора,26,27, али ова метода је инвазивна и радно интензивна и захтева специјализовано знање за извођење. Штавише, традиционалне органоидне културе које се одржавају у хидрогелним скелама у статичким условима не одражавају тачно активну ин виво биомеханику.
Други приступи које користи неколико истраживачких група користе унапред структурисане 3Д хидрогелске скеле да опонашају епителну структуру црева култивисањем изолованих људских цревних ћелија на површини гела. Израдите хидрогелске скеле користећи 3Д штампане, микро млевене или литографски произведене калупе. Овај метод показује да се самоорганизовани, физички изоловани епителни аранжмани ћелије формирају. епителну структуру високог аспекта и преслушавање строма-епитела укључивањем стромалних ћелија у скелу. Међутим, природа преструктурираних скела може спречити приказ самог спонтаног морфогенетског процеса. Ови модели такође не обезбеђују динамички луминални или интерстицијални ток, недостаје им то да би се у текућој физиолошкој функцији и недавним смицањем појачала функција течности и смицања. Студија је користила хидрогелне скеле у микрофлуидној платформи и узорковане интестиналне епителне структуре коришћењем техника ласерског нагризања. Органоиди црева миша прате урезане узорке да би формирали цревне цевасте структуре, а проток интралуминалне течности се може рекапитулирати коришћењем микрофлуидног модула. Д технике штампања из исте групе су биле у стању да створе минијатурне цревне цеви са спонтаним морфогенетским процесима. Упркос сложеној производњи различитих сегмената црева унутар цеви, овом моделу такође недостаје проток луминалне течности и механичка деформација. Поред тога, операбилност модела може бити ограничена, посебно након што је процес биоштампања завршен, што доводи до узнемиравања. фогенеза, физиолошки релевантан смичући стрес, биомеханика која опонаша покретљивост црева, доступност независних апикалних и базолатералних одељења и поновно креирање комплексног биолошког микроокружења модуларности. Стога, наш ин витро 3Д протокол морфогенезе може да пружи комплементаран приступ постојећим методама за превазилажење изазова.
Наш протокол је у потпуности фокусиран на 3Д епителну морфогенезу, са само епителним ћелијама у култури и без других типова околних ћелија као што су мезенхималне ћелије, ендотелне ћелије и имуне ћелије. Као што је претходно описано, срж нашег протокола је индукција епителне морфогенезе, увођењем инхибитора морфогенезе морфогенезе са стране морфогенеза који се излучује на страни модула Вхибас, који уводи робусну страну морфогенезе. Једност нашег црева-на-чипу и хибрида-на-чипу нам омогућава да поново створимо таласасти 3Д епителни слој, додатне биолошке сложености као што су епително-мезенхимске интеракције33,34, депозиција екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) 35 и, у нашем моделу, ћелије крипто-вилуса које се сматрају даљим карактеристикама крипто-вилуса остају криптовалуалне ћелије. нпр. фибробласти) у мезенхиму играју кључну улогу у производњи ЕЦМ протеина и регулацији цревне морфогенезе ин виво35,37,38.Додавање мезенхималних ћелија нашем моделу побољшало је морфогенетски процес и ефикасност везивања ћелија. Ендотелни слој (тј. капиларе) или важну улогу у регулацији ћелијске имуне3 и лимфне регулације 40 у микроокружењу црева. Штавише, компоненте васкулатуре које се могу повезати између модела ткива су предуслов када су модели ткива дизајнирани да демонстрирају интеракције више органа. Због тога, ендотелне ћелије ће можда морати да буду укључене да би се моделовале прецизније физиолошке карактеристике са резолуцијом на нивоу органа. и ткивно-специфични имунитет у контексту опонашања цревне болести.
Употреба хибридних чипова је једноставнија од гут-он-а-цхип јер је подешавање уређаја једноставније и употреба Трансвелл уметака омогућава скалабилну културу цревног епитела. Међутим, комерцијално доступни Трансвелл уметци са полиестерским мембранама нису еластични и не могу да симулирају перисталтичке покрете. нема напрезања на смицање на апикалној страни. Јасно је да статичка својства у апикалном одељку ретко омогућавају дугорочну кокултуру бактерија у хибридним чиповима. Док можемо снажно индуковати 3Д морфогенезу у Трансвелл уметцима када користимо хибридне чипове, недостатак физиолошки релевантних биомеханика течности може ограничити апликативни потенцијал биомеханике течности платформе за апикалне примене.
Реконструкције пуног обима осе људске крипто-ресице у културама црева на чипу и хибрида на чипу нису у потпуности успостављене. Пошто морфогенеза почиње од епителног монослоја, 3Д микроархитектуре не обезбеђују нужно морфолошка сличност са криптоћелијском популацијом која је у близини криптоћелије у популацији коју карактеришемо у близини криптоћелије ин в. микропроизведени 3Д епител, крипта и вилозни региони нису били јасно разграничени. Иако виши горњи канали на чипу доводе до повећане висине микропроизведеног епитела, максимална висина је и даље ограничена на ~300–400 µм. Стварна дубина цревних и великих крипти човека је 0 м3 и 0 µм, а око 0 µм5 ~ 0 ивели, а висина ресица танког црева је ~600 µм41.
Са становишта имиџинга, ин ситу снимање супер-резолуције 3Д микроархитектура може бити ограничено на црево на чипу, пошто је потребно радно растојање од сочива објектива до епителног слоја реда величине неколико милиметара. Да би се превазишао овај проблем, може бити потребан удаљени објектив. Штавише, прављење танких пресека за израду слике високе специчности је потребно за више еластичности. , пошто микрофабрикација црева слој по слој на чипу укључује трајну адхезију између сваког слоја, изузетно је изазовно отворити или уклонити горњи слој да би се испитала површинска структура епителног слоја. На пример, коришћењем скенирајућег електронског микроскопа (СЕМ).
Хидрофобност ПДМС-а је била ограничавајући фактор у студијама заснованим на микрофлуидима које се баве хидрофобним малим молекулима, будући да ПДМС може неспецифично да адсорбује такве хидрофобне молекуле. Алтернативе ПДМС-у се могу размотрити са другим полимерним материјалима. из адсорпције хидрофобних молекула.
Коначно, наш метод није добро окарактерисан у смислу обезбеђивања скрининга високог протока или експерименталне платформе „једне величине за све“. Тренутни протокол захтева пумпу за шприц по микроуређају, која заузима простор у ЦО2 инкубатору и спречава експерименте великих размера. Ово ограничење може бити значајно побољшано нпр. Порозни уметци са 4 бунара који омогућавају континуирано допуњавање и уклањање базолатералних медија).
Да бисмо изазвали 3Д морфогенезу хуманог цревног епитела ин витро, користили смо цревни уређај са микрофлуидним чипом који садржи два паралелна микроканала и еластичну порозну мембрану између њих да бисмо створили интерфејс лумен-капилар. Такође демонстрирамо употребу једноканалног микрофлуидног уређаја (безконтинуални басно-хибридни слој) који обезбеђује континуални епичипиолатерални слој узгајане на Трансвелл уметцима. На обе платформе, морфогенеза различитих хуманих интестиналних епителних ћелија може се демонстрирати применом усмерене манипулације протока да би се уклонили антагонисти морфогена из базолатералног одељка. Целокупна експериментална процедура (Слика 1) састоји се од пет делова: (и) микрофабрикација или микрофабрикација црева 1бр цхип (Бокс 1бр уметнуто црево 5). ии) припрема интестиналних епителних ћелија (Цацо-2 ћелије) или хуманих цревних органоида;кутије 2-5), (иии) култура интестиналних епителних ћелија на цревним чиповима или хибридним чиповима (кораци 6-9), (ив) индукција 3Д морфогенезе ин витро (корак 10) и (в) ) да би се карактерисала 3Д микроструктура епитела је дизајнирана за карактеризацију 3Д микроструктуре епитела (кораци Ф1 даље су дизајнирани за одговарајућу контролну групу1) (кораци Ф1 у наставку). ефикасност ин витро морфогенезе упоређивањем епителне морфогенезе са просторним, временским, условним или процедуралним контролама.
Користили смо две различите платформе за културу: гут-он-а-цхип са правим каналима или нелинеарним савијеним каналима, или хибридне чипове који садрже Трансвелл (ТВ) уметке у микрофлуидном уређају, произведеном као што је описано у Оквиру 1, а корак 1-5. „Израда уређаја“ показује главне кораке у прављењу једног чипа или извора ХипхелЦстинултуре од Хумансцхипхел хибрид. (Цацо-2 или људски цревни органоиди) и поступак културе који се користи у овом протоколу. „Ин витро морфогенеза“ показује свеукупне кораке у којима се Цацо-2 или епителне ћелије изведене из органоида култивишу на интестиналном чипу или на Трансвелл уметцима хибридног чипа, након чега следи индукција броја морфогенезе или 3Д формације морфогене структуре. ед испод сваке стрелице. Апликација пружа примере како се успостављени слојеви цревног епитела могу користити, на пример, у карактеризацији диференцијације ћелија, студијама физиологије црева, успостављању екосистема домаћин-микробиома и моделирању болести. Имунофлуоресцентне слике у „Целл Дифферентиатион“ које приказују језгра и Ф-МУд експресију епитела Ца2 на слоју Цалицо2 чип. МУЦ2 сигнализација је присутна у пехарастим ћелијама и слузи која се излучује са површина слузокоже. Флуоресцентне слике у физиологији црева показују слуз произведену бојењем за остатке сијаличне киселине и Н-ацетилглукозамина коришћењем флуоресцентног аглутинина пшеничних клица. Две слике које се преклапају у "Хост-Ц-Мицробе цо-био-цо-цултуре" приказују репрезентативне слике домаћина "Хост-Ц-Мицроме" т на чипу. Лева табла приказује кокултуру Е. цоли која експресује зелени флуоресцентни протеин (ГФП) са микроинжењерингом 3Д Цацо-2 епителним ћелијама. Десни панел приказује локализацију ГФП Е. цоли заједно култивисане са 3Д Цацо-2 епителним ћелијама, праћено имуносним флуоресцентним флуоресцентним моделом (моделом имунофлуоресценције и флуоресценције Цацо-2). прави стратегију здравих у односу на црева која пропуштају у чиповима за запаљење црева под физиолошким изазовом са бактеријским антигенима (нпр. липополисахарид, ЛПС) и имуним ћелијама (нпр. ПБМЦ);зелено). Цацо-2 ћелије су култивисане да би се успоставио 3Д епителни слој. Скала трака, 50 µм. Слике у доњем реду: “Диференцијација ћелија” прилагођена уз дозволу референце.2.Окфорд Университи Пресс;Репродуковано уз дозволу из Реф.5.НАС;„Кокултура домаћина и микроба“ прилагођена уз дозволу из реф.3.НАС;„Моделирање болести” прилагођено уз дозволу референце.5.НАС.
И гут-он-цхип и хибридни чипови су произведени коришћењем ПДМС реплика које су извађене из силицијумских калупа меком литографијом1,44 и узорковане помоћу СУ-8. Дизајн микроканала у сваком чипу је одређен узимањем у обзир хидродинамике као што су напон смицања и хидродинамички притисак), који се састоји од оригиналног дизајна гуцхит-он (Слика 1,4,12). од два супротстављена паралелна равна микроканала, еволуирао је у сложено црево на чипу (проширени подаци, слика 1б) који укључује пар закривљених микроканала да изазове продужено време задржавања течности, нелинеарне обрасце тока и вишеосну деформацију култивисаних ћелија (слика 2а, 2а, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2а, 2а, 2а, 2а, 2а) -он-а-цхипс се може изабрати. Показали смо да увијени Гут-Цхип такође снажно индукује 3Д морфогенезу у сличном временском оквиру са сличним степеном раста епитела у поређењу са оригиналним Гут-Цхип-ом, без обзира на тип култивисане ћелије. Према томе, да би се индуковала 3Д морфогенеза морфогенезе на МС-цхип-у, линеарни и МС гуликонски комплекси се могу репродуцирати на МС-Цхипге-у. дс са узорцима СУ-8 дали су негативне карактеристике након уклањања из калупа (Сл.2а). Да би се произвела црева на чипу, припремљени горњи ПДМС слој је секвенцијално везан за порозни ПДМС филм, а затим поравнат са доњим ПДМС слојем иреверзибилним везивањем помоћу уређаја за обраду короне (Слика 2б–ф). Да би се произвели хибридни чипови, очвршћени су ПДМС уређаји који су могли да се очврсну на микрофлуксу који је могао да створи једноструке ПДМС реплике на стакло. датум Трансвелл инсерти (слика 2х и проширени подаци сл. 2). Процес везивања се изводи третирањем површина ПДМС реплике и стакла третманом кисеоником плазмом или короном. Након стерилизације микрофабрикованог уређаја причвршћеног на силиконску цев, уређај је био спреман за извођење 3Д морфогенезе морфогенезе2 у слици 2).
а, Шематска илустрација припреме ПДМС делова из СУ-8 узоркованих силицијумских калупа. Неочврсли ПДМС раствор је изливен у силицијумски калуп (лево), осушен на 60 °Ц (у средини) и извађен (десно). Извађени ПДМС је исечен на комаде и очишћен за даљу употребу.б, Фотографија силиконског силиконовог слоја коришћена је за припрему силиконовог слоја. користи се за производњу ПДМС порозне мембране.д, Серија фотографија горње и доње ПДМС компоненте и састављеног цревног уређаја на чипу.е, Шема поравнања горњих, мембранских и доњих ПДМС компоненти. Сваки слој је неповратно везан плазмом или корона микроконцентрисаним уређајем са микро-волуменом од тканине.ф, с и вакуум коморе.г, Постављање гут-он-а-цхип за микрофлуидну ћелијску културу. Произведено црево на чипу састављено од силиконске цеви и шприца је стављено на покровно стакло. Уређај за чип је постављен на поклопац петријеве посуде од 150 мм за обраду. Везиво се користи за затварање силиконске цеви од силиконске цеви. и 3Д морфогенеза коришћењем хибридних чипова. Трансвелл уметци припремљени независно за културу 2Д монослојеви интестиналних епителних ћелија су убачени у хибридни чип да би се индуковала цревна 3Д морфогенеза. Медијум се перфузира кроз микроканале испод ћелијског слоја. 1 ца успостављен на референтном слоју Трансмиссион бар цм.Елсевиер.
У овом протоколу, Цацо-2 ћелијска линија и цревни органоиди су коришћени као епителни извори (слика 3а). Обе врсте ћелија су култивисане независно (кутија 2 и кутија 5) и коришћене за засејавање микроканала обложених ЕЦМ-ом црева на чипу или трансвелл уметака. старости 10 и 50 година) у Т-боцама се сакупљају да би се припремиле дисоциране ћелијске суспензије помоћу течности за трипсинизацију (кутија 2). Људски цревни органоиди из цревних биопсија или хируршких ресекција култивисани су у куполама Матригел скеле у плочама са 24 бунарчића да би се подржали структурни микрогени В као што су есенцијални морфијум Р. и Ноггин) и фактори раста припремљени како је описано у Оквиру 3 допуњавани су сваки други дан све док органоиди не нарасту до ~500 µм у пречнику. Потпуно израсли органоиди се сакупљају и раздвајају у појединачне ћелије за засејавање у цревима или Трансвелл уметцима на чип (Оквир 5). болести, колоректалног карцинома или нормалног донора), места лезије (нпр. лезија наспрам области без лезије) и гастроинтестиналне локације у тракту (нпр. дванаестопалачно црево, јејунум, илеум, цекум, дебело црево или ректум). Ми обезбеђујемо оптимизовани протокол у оквиру 5 за култивисање органоидних органа дебелог црева који обично захтевају већу концентрацију органоида у дебелом цреву (колостиноид).
а, Ток рада за индукцију морфогенезе црева у цревном чипу. Цацо-2 хумани цревни епител и цревни органоиди се користе у овом протоколу да би се демонстрирала 3Д морфогенеза. Изоловане епителне ћелије су засејане у припремљеном уређају за црево на чипу (ћелије су спојене на ПД и спојене на МС препарат). порозна мембрана на дан 0 (Д0), апикални (АП) ток се покреће и одржава прва 2 дана (ток, АП, Д0-Д2). Базолатерални (БЛ) ток се такође покреће заједно са цикличним покретима истезања (истезање, проток, АП и БЛ) када се потпуни 2Д ток, АП и БЛ формира након спонтаног формирања 2Д монослојне микрослојне културе. фогенеза, Д5).Фазне контрастне слике показују репрезентативну морфологију Цацо-2 ћелија у сваком експерименталном кораку или временској тачки (бар граф, 100 µм). Четири шематска дијаграма који илуструју одговарајуће каскаде морфогенезе црева (горе десно). Испрекидане стрелице на шеми представљају правац епи-2 површине течности на горњој слици (СЕМ 3 приказује смер протока течности на врху). фт). Уметак који истиче увећано подручје (бела испрекидана кутија) приказује регенерисане микроресе на 3Д Цацо-2 слоју (десно).ц, Хоризонтални фронтални поглед на успостављени Цацо-2 3Д, клаудин (ЗО-1, црвена) и континуиране мембране четкице означене Ф-актин (зелено) и нуклеусне имунофлуоросцентне ћелије на конзумно-флуоросценичним ћелијама (зелена) чипови. Стрелице које показују на средњу шему указују на локацију фокалне равни за сваки конфокални приказ.д, Временски ток морфолошких промена у органоидима култивисаним на чипу добијеном фазноконтрастном микроскопијом 3, 7, 9, 11 и 13 дана. Уметак (горе десно) показује велико увећање, снимљено на датој фотографији епиграфског органа с Д. дана 7.ф, прекривене имунофлуоресцентне слике које показују маркере за матичне ћелије (ЛГР5;магента), пехарасте ћелије (МУЦ2; зелено), Ф-актин (сиво) и језгра (цијан) узгајане на чиповима црева током 3 дана, респективно (лево) и 13-дневне (средње) органоиде на епителном слоју. Такође погледајте проширене податке на слици 3, која наглашава ЛГР5 сигнализацију микросцене десно. 3Д органоидни епител успостављен у цревима на чипу бојењем плазма мембране бојом ЦеллМаск (десно) 13. дана културе. Скала траке је 50 μм осим ако није другачије наведено.б Поново штампано уз дозволу референце.2.Окфорд Университи Пресс;ц Прилагођено уз дозволу Референца.2.Окфорд Университи Пресс;е и ф прилагођено уз дозволу путем референце.12 Под Цреативе Цоммонс лиценцом ЦЦ БИ 4.0.
У цревима на чипу, неопходно је модификовати хидрофобну површину ПДМС порозне мембране за успешан ЕЦМ премаз. У овом протоколу примењујемо две различите методе за модификацију хидрофобности ПДМС мембрана. За култивисање Цацо-2 ћелија, површинска активација УВ/озонским третманом, и само обрада површине Цацо-МС МС-а и причвршћивање површине Цацо-МС МС-а били су довољни мембрана.Међутим, микрофлуидна култура органоидног епитела захтева функционализацију површине засновану на хемијским састојцима да би се постигло ефикасно таложење ЕЦМ протеина узастопним наношењем полиетиленимина (ПЕИ) и глутаралдехида на ПДМС микроканале. Након модификације површине, ЕЦМ протеини су депоновани да покрију изоловану површину органа, а затим се функционализоване ћелије изолованог органа унесу у ПДМС. идиц ћелијска култура почиње перфузијом само медијума у ​​горњи микроканал све док ћелије не формирају потпуни монослој, док доњи микроканал одржава статичке услове. Ова оптимизована метода за површинску активацију и ЕЦМ премаз омогућава везивање органоидног епитела да изазове 3Д морфогенезу на површини ПДМС.
Трансвелл културе такође захтевају ЕЦМ премаз пре сејања ћелија;међутим, Трансвелл културе не захтевају сложене кораке претходног третмана да би се активирала површина порозних уметака. За узгој Цацо-2 ћелија на Трансвелл уметцима, ЕЦМ премаз на порозним уметцима убрзава везивање дисоцираних Цацо-2 ћелија (<1 сат) и формирање баријере уске спојнице (<1-2 дана). површине (<3 х) и одржавана док органоиди не формирају потпуни монослој са интегритетом баријере. Трансвелл културе се изводе у плочама са 24 бунарчића без употребе хибридних чипова.
Ин витро 3Д морфогенеза се може покренути применом протока течности на базолатерални аспект успостављеног епителног слоја. У цревима на чипу, епителна морфогенеза је почела када је медијум перфузионисан у горњи и доњи микроканале (слика 3а). Као што је претходно описано, кључно је да се уведе континуални ток течности или морфогенезе у смеру континуалног уклањања течности (слика 3а). с. Да бисмо обезбедили довољно хранљивих материја и серума ћелијама везаним за порозне мембране и генерисали луминални смичући стрес, ми обично примењујемо двоструки ток у цревима на чипу. Код хибридних чипова, Трансвелл уметци који садрже епителне монослојеве су уметнути у хибридне чипове. Затим је подлога примењена испод микробочне стране медијума басолатералног уметка. црвено 3-5 дана након иницирања базолатералног тока у обе платформе културе.
Морфолошке карактеристике микроинжењерских 3Д епителних слојева могу се анализирати применом различитих модалитета снимања, укључујући фазно-контрастну микроскопију, микроскопију диференцијалног интерферентног контраста (ДИЦ), СЕМ или имунофлуоресцентну конфокалну микроскопију (Слике 3 и 4). Фазни контраст или ДИЦ сликање могу се лако извести у било ком тренутку за праћење облика епитела3 у било ком тренутку. оптичка транспарентност ПДМС и полиестерских филмова, и платформа црева на чипу и платформа хибридног чипа могу да обезбеде ин ситу снимање у реалном времену без потребе за сечењем или растављањем уређаја. Приликом извођења имунофлуоресцентног снимања (Слике 1, 3ц, ф и 4б) су типично фиксиране ћелије са 4б, паравол. затим Тритон Кс-100 и 2% (вт/вол)) говеђег серумског албумина (БСА), по реду. У зависности од типа ћелије, могу се користити различити фиксативи, пермеабилизатори и блокирајући агенси. цлеус (нпр. 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, ДАПИ) или Ф-актин (нпр. флуоресцентно обележени фалоидин). Живо снимање засновано на флуоресценцији се такође може извести ин ситу да би се открила производња слузи (Сл.1, „Диференцијација ћелија“ и „Физиологија црева“), насумична колонизација микробних ћелија (Слика 1, „Кокултура домаћин-микроб“), регрутовање имуних ћелија (Слика 1, „Моделирање болести“) или контуре 3Д епителне морфологије, Сл. одвојите горњи слој од доњег слоја микроканала, као што је описано у реф. Као што је приказано на слици 2, 3Д епителна морфологија као и микровили на ивици апикалне четкице могу се визуелизовати помоћу СЕМ (Слика 3б). Експресија маркера диференцијације може се проценити извођењем квантитативног ПЦР5 или епителне ћелије у једном ћелијском случају расту у слоју ДРНК. чипс или хибридни чипс се сакупљају трипсинизацијом и затим користе за молекуларну или генетску анализу.
а, Ток рада за индукцију цревне морфогенезе у хибридном чипу. Цацо-2 и цревни органоиди се користе у овом протоколу да би се демонстрирала 3Д морфогенеза на платформи хибридног чипа. Дисоциране епителне ћелије су засејане у припремљене Трансвелл уметке и приложене су слике у наставку (ТВ се прикачи на претходно). мембране у Трансвелл уметцима, све ћелије су култивисане у статичким условима (ТВ култура). После 7 дана, један Трансвелл уметак који је садржао 2Д монослој епителних ћелија је интегрисан у хибридни чип да би се увео базолатерални ток (Флов, БЛ), што је на крају довело до стварања 3Д 3Д морфолошког епителног епителног слоја органа (П). извучени из узлазног дебелог црева нормалног донора (линија Ц103) у сваком експерименталном кораку или временској тачки. Шеме у горњим слојевима илуструју експерименталну конфигурацију за сваки корак.б, Хибридни чипови (лева шема) могу довести до 3Д морфогенезе органоидних епителних ћелија са одозго надоле у ​​конфокалном З микроскопију;види десну шему и одговарајуће испрекидане линије).показао очигледне морфолошке карактеристике. Ф-актин (цијан), језгро (сиво).ц, флуоресцентне конфокалне микрографије (3Д поглед под углом) епителних ћелија добијених из органоида култивисаних у статичком Трансвелл-у (ТВ; уметак унутар беле испрекидане кутије) наспрам хибридног чипа (највећи пун снимак) у односу на укрштање у односу на 3-Д, у поређењу са 3-2. изрезани прикази (уметнути у горњем десном углу; „КСЗ“) такође показују 2Д и 3Д карактеристике. Скала трака, 100 µм.ц Поново штампано уз дозволу референце.4.Елсевиер.
Контроле се могу припремити култивисањем истих ћелија (Цацо-2 или епителних ћелија цревног органоида) у дводимензионалне монослојеве под конвенционалним условима статичке културе. Приметно, исцрпљивање хранљивих материја може да доведе до смањења запреминског капацитета микроканала (тј. ~4 µЛ у горњем каналу на оригиналном дизајну гут-орепх, епителног тока такође и после дизајна епилатералног тока црева). упоредити.
Процес меке литографије треба да се изводи у чистој просторији. За сваки слој на чипу (горњи и доњи слојеви и мембране) и хибридне чипове, коришћене су различите фотомаске које су произведене на засебним силицијумским плочицама јер су висине микроканала биле различите. Циљне висине горњих и доњих микроканала црева су 50 мм0 и 0µ0 мм. Висина циља канала хибридног чипа је 200 µм.
Ставите силиконску плочицу од 3 инча у посуду са ацетоном. Лагано вртите плочу 30 секунди, а затим је осушите на ваздуху. Пренесите облатну на плочу са ИПА, а затим окрените плочу 30 с да бисте је очистили.
Раствор пиране (мешавина водоник-пероксида и концентроване сумпорне киселине, 1:3 (вол/вол)) може се опционо користити да би се максимизирало уклањање органских остатака са површине силицијумске плочице.
Пиранха раствор је изузетно корозиван и ствара топлоту. Неопходне су додатне мере предострожности. За одлагање отпада, оставите раствор да се охлади и пребаците у чист, сув контејнер за отпад. Користите секундарне контејнере и правилно означите контејнере за отпад. Молимо вас да пратите безбедносне смернице установе за детаљније процедуре.
Облатне дехидрирајте тако што ћете их ставити на ринглу на 200 °Ц 10 мин. Након дехидрације, обланда је протресена пет пута на ваздуху да се охлади.
Сипајте ~10 г фоторезиста СУ-8 2100 на средину очишћене силицијумске вафле. Користите пинцету да равномерно распоредите фоторезист по обланди. Повремено ставите облатну на ринглу на 65°Ц како би фоторезист био мање лепљив и лакши за ширење. Не стављајте облатну директно на грејну плочу.
СУ-8 је био равномерно распоређен на плочицу помоћу премаза са центрифугирањем. Програмирајте улазну ротацију СУ-8 за 5–10 с да се шири на 500 о/мин при убрзању од 100 рпм/с. Подесите главно окретање за 200 µм дебљине узорка на 1,500 рпм 5 µм висине (или постићи а500 рпм 5 µм висине горњи слој црева на чипу; погледајте „Критични кораци“ испод) подешен на убрзање од 300 о/мин 30 секунди на 1200 о/мин.
Главна брзина центрифуге се може подесити према жељеној дебљини узорка СУ-8 на силиконској плочици.
Да би се произвели СУ-8 узорци висине 500 µм за горњи слој црева на чипу, кораци центрифугирања и меког печења ове кутије (корак 7 и 8) су узастопно поновљени (погледајте корак 9) да би се произвела два слоја од 250 µм. Дебео слој СУ-8, који се може спојити у слој од УВ0, слој 5, прављење слоја од 5 експо 1. µм високо.
Меко пеците облатне обложене СУ-8 тако што ћете их пажљиво ставити на ринглу на 65 °Ц у трајању од 5 минута, а затим променити поставку на 95 °Ц и инкубирати додатних 40 мин.
Да бисте постигли висину СУ-8 узорка од 500 μм у горњем микроканалу, поновите кораке 7 и 8 да бисте генерисали два слоја СУ-8 дебљине 250 μм.
Користећи УВ маску за поравнавање, извршите тест лампе у складу са упутствима произвођача да бисте израчунали време излагања плочице. (време експозиције, мс) = (доза излагања, мЈ/цм2)/(снага лампе, мВ/цм2).
Након одређивања времена експозиције, поставите фотомаску на држач маске УВ маске за поравнавање и поставите фотомаску на плочицу обложену СУ-8.
Поставите штампану површину фотомаске директно на СУ-8 обложену страну силиконске плочице да бисте минимизирали УВ дисперзију.
Изложите СУ-8 обложену плочицу и фотомаску вертикално на 260 мЈ/цм2 УВ светлости током унапред одређеног времена експозиције (погледајте корак 10 овог оквира).
После излагања УВ зрачењу, силиконске плочице обложене СУ-8 су печене на 65°Ц 5 мин и 95°Ц 15 мин на свакој грејној плочи да би се произвеле шаре висине 200 μм. Продужите време после печења на 95 °Ц на 30 мин да бисте направили шаре висине 500 µм.
Развијач се сипа у стаклену посуду, а печена обланда се ставља у посуду. Запремина развијача СУ-8 може да варира у зависности од величине стаклене плоче. Уверите се да користите довољно развијача СУ-8 да потпуно уклоните неосветљени СУ-8. На пример, када користите стаклену посуду пречника 150 мм са капацитетом од 1 Л, користите развитак од ~300 мола за развитак од ~300 минута. ција.
Исперите развијени калуп са ~10 мЛ свежег развијача, а затим ИПА прскањем раствора помоћу пипете.
Ставите плочицу у чистач за плазму и изложите плазми кисеоника (атмосферски гас, циљни притисак 1 × 10-5 Торр, снага 125 В) током 1,5 мин.
Ставите обланду у вакуум ексикатор са стакленим тобоганом унутра. Облатне и плочице се могу поставити један поред другог. Ако је вакуум ексикатор плочом подељен на неколико слојева, ставите плочице у доњу комору, а облатне у горњу комору. Убаците 100 μЛ трихлоро(1Х2) раствора трихлоро(1Х2оил) флуоро(1Х2ил) стаклена плочица и применити вакуум за силанизацију.
Одмрзните бочицу смрзнутих Цацо-2 ћелија у воденом купатилу на 37°Ц, а затим пребаците одмрзнуте ћелије у Т75 боцу која садржи 15 мЛ претходно загрејаног Цацо-2 медијума на 37 °Ц.
За пропуштање Цацо-2 ћелија при ~90% конфлуентности, прво загрејте Цацо-2 медијум, ПБС и 0,25% трипсина/1 мМ ЕДТА у воденом купатилу на 37°Ц.
Аспирирајте медијум вакуумском аспирацијом. Ћелије испрати два пута са 5 мЛ топлог ПБС-а понављањем вакуум аспирације и додавањем свежег ПБС-а.