Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Еволуција микробних паразита подразумева контрадејство између природне селекције, која доводи до побољшања паразита, и генетског дрифта, који доводи до губитка гена код паразита и акумулирања штетних мутација. Овде, како бисмо разумели како се ово контрадејство дешава на нивоу једног макромолекула, описујемо крио-ЕМ структуру рибозома Encephalitozoon cuniculi, еукариотског организма са једним од најмањих генома у природи. Екстремно смањење рРНК у рибозомима E. cuniculi праћено је невиђеним структурним променама, као што је еволуција раније непознатих фузионираних рРНК линкера и рРНК без избочина. Поред тога, рибозом E. cuniculi преживео је губитак рРНК фрагмената и протеина развијајући способност да користи мале молекуле као структурне имитације деградираних рРНК фрагмената и протеина. Генерално, показујемо да молекуларне структуре за које се дуго сматрало да су редуковане, дегенерисане и подложне исцрпљујућим мутацијама имају низ компензационих механизама који их одржавају активним упркос екстремним молекуларним контракцијама.
Пошто већина група микробних паразита има јединствене молекуларне алате за искоришћавање својих домаћина, често морамо да развијемо различите терапије за различите групе паразита1,2. Међутим, нови докази указују на то да су неки аспекти еволуције паразита конвергентни и углавном предвидљиви, што указује на потенцијалну основу за широке терапијске интервенције код микробних паразита3,4,5,6,7,8,9.
Претходни рад је идентификовао заједнички еволутивни тренд код микробних паразита назван редукција генома или пропадање генома10,11,12,13. Тренутна истраживања показују да када микроорганизми одустану од свог слободног начина живота и постану интрацелуларни паразити (или ендосимбионти), њихови геноми пролазе кроз споре, али невероватне метаморфозе током милиона година9,11. У процесу познатом као пропадање генома, микробни паразити акумулирају штетне мутације које многе раније важне гене претварају у псеудогене, што доводи до постепеног губитка гена и мутационог колапса14,15. Овај колапс може уништити до 95% гена код најстаријих интрацелуларних организама у поређењу са блиско сродним слободноживућим врстама. Дакле, еволуција интрацелуларних паразита је борба између две супротстављене силе: дарвинистичке природне селекције, која доводи до побољшања паразита, и колапса генома, који баца паразите у заборав. Како је паразит успео да изађе из ове борбе и задржи активност своје молекуларне структуре, остаје нејасно.
Иако механизам распада генома није у потпуности схваћен, чини се да се јавља углавном због честог генетског дрифта. Пошто паразити живе у малим, асексуалним и генетски ограниченим популацијама, они не могу ефикасно елиминисати штетне мутације које се понекад јављају током репликације ДНК. То доводи до неповратног нагомилавања штетних мутација и смањења генома паразита. Као резултат тога, паразит не само да губи гене који више нису неопходни за његов опстанак у интрацелуларном окружењу. Управо је немогућност популација паразита да ефикасно елиминишу спорадичне штетне мутације оно што узрокује да се ове мутације нагомилавају у целом геному, укључујући и њихове најважније гене.
Велики део нашег тренутног разумевања редукције генома заснива се искључиво на поређењима секвенци генома, са мање пажње посвећене променама у стварним молекулима који обављају кућне функције и служе као потенцијалне мете лекова. Упоредне студије су показале да терет штетних интрацелуларних микробних мутација изгледа предиспонира протеине и нуклеинске киселине да се погрешно савијају и агрегирају, чинећи их зависнијим од шаперона и преосетљивијим на топлоту19,20,21,22,23. Поред тога, разни паразити – независна еволуција понекад раздвојена чак 2,5 милијарде година – доживели су сличан губитак центара за контролу квалитета у својој синтези протеина5,6 и механизмима поправке ДНК24. Међутим, мало се зна о утицају интрацелуларног начина живота на сва друга својства ћелијских макромолекула, укључујући молекуларну адаптацију на растући терет штетних мутација.
У овом раду, како бисмо боље разумели еволуцију протеина и нуклеинских киселина интрацелуларних микроорганизама, одредили смо структуру рибозома интрацелуларног паразита Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi је организам сличан гљивици који припада групи паразитских микроспоридија које имају необично мале еукариотске геноме и стога се користе као моделни организми за проучавање распадања генома25,26,27,28,29,30. Недавно је крио-ЕМ структура рибозома одређена за умерено редуковане геноме Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (геном величине ~3,2 Mb). Ове структуре сугеришу да се извесни губитак амплификације рРНК компензује развојем нових контаката између суседних рибозомалних протеина или стицањем нових рибозомалних протеина msL131,32. Врсте Encephalitozoon (геном ~2,5 милиона пар база), заједно са својим најближим рођаком Ordospora, показују ултимативни степен редукције генома код еукариота – имају мање од 2000 гена који кодирају протеине, и очекује се да њихови рибозоми нису само лишени фрагмената експанзије рРНК (фрагменти рРНК који разликују еукариотске рибозоме од бактеријских рибозома), већ имају и четири рибозомска протеина због недостатка хомолога у геному E. cuniculi26,27,28. Стога смо закључили да рибозом E. cuniculi може открити раније непознате стратегије за молекуларну адаптацију на распадање генома.
Наша крио-ЕМ структура представља најмањи еукариотски цитоплазматски рибозом који је окарактерисан и пружа увид у то како крајњи степен редукције генома утиче на структуру, склапање и еволуцију молекуларног механизма који је саставни део ћелије. Открили смо да рибозом E. cuniculi крши многе од широко очуваних принципа савијања РНК и склапања рибозома и открили нови, раније непознати рибозомски протеин. Сасвим неочекивано, показујемо да су рибозоми микроспоридија развили способност везивања малих молекула и претпостављамо да скраћивања у рРНК и протеинима покрећу еволутивне иновације које на крају могу дати корисне особине рибозому.
Да бисмо боље разумели еволуцију протеина и нуклеинских киселина у интрацелуларним организмима, одлучили смо да изолујемо споре E. cuniculi из култура инфицираних ћелија сисара како бисмо пречистили њихове рибозоме и одредили структуру ових рибозома. Тешко је добити велики број паразитских микроспоридија јер се микроспоридије не могу култивисати у хранљивој подлози. Уместо тога, оне расту и размножавају се само унутар ћелије домаћина. Стога, да бисмо добили биомасу E. cuniculi за пречишћавање рибозома, инфицирали смо ћелијску линију бубрега сисара RK13 спорама E. cuniculi и култивисали ове инфициране ћелије неколико недеља како бисмо омогућили E. cuniculi да расте и размножава се. Користећи монослој инфицираних ћелија површине око пола квадратног метра, успели смо да пречистимо око 300 мг спора микроспоридија и да их користимо за изолацију рибозома. Затим смо разбили пречишћене споре стакленим перлама и изоловали сирове рибозоме користећи постепено фракционисање лизата полиетилен гликолом. Ово нам је омогућило да добијемо приближно 300 µг сирових рибозома E. cuniculi за структурну анализу.
Затим смо прикупили крио-ЕМ слике користећи добијене узорке рибозома и обрадили ове слике користећи маске које одговарају великој рибозомској подјединици, глави мале подјединице и малој подјединици. Током овог процеса, прикупили смо слике око 108.000 рибозомских честица и израчунали крио-ЕМ слике са резолуцијом од 2,7 Å (додатне слике 1-3). Затим смо користили крио-ЕМ слике за моделирање рРНК, рибозомског протеина и фактора хибернације Mdf1 повезаног са рибозомима E. cuniculi (слике 1а, б).
а Структура рибозома E. cuniculi у комплексу са фактором хибернације Mdf1 (pdb id 7QEP). б Мапа фактора хибернације Mdf1 повезаног са рибозомом E. cuniculi. ц Мапа секундарне структуре која упоређује опорављену рРНК код микроспоридијанских врста са познатим рибозомским структурама. Панели приказују локацију амплификованих фрагмената рРНК (ES) и активних места рибозома, укључујући место за декодирање (DC), саркиницинску петљу (SRL) и центар за пептидил трансферазу (PTC). д Густина електрона која одговара центру за пептидил трансферазу рибозома E. cuniculi сугерише да ово каталитичко место има исту структуру код паразита E. cuniculi и његових домаћина, укључујући H. sapiens. е, ф Одговарајућа густина електрона центра за декодирање (e) и шематска структура центра за декодирање (f) указују да E. cuniculi има остатке U1491 уместо A1491 (нумерација E. coli) код многих других еукариота. Ова промена сугерише да би E. cuniculi могла бити осетљива на антибиотике који циљају ово активно место.
За разлику од претходно утврђених структура рибозома V. necatrix и P. locustae (обе структуре представљају исту породицу микроспоридија Nosematidae и веома су сличне једна другој), 31,32 рибозоми E. cuniculi пролазе кроз бројне процесе фрагментације рРНК и протеина. Даља денатурација (Допунске слике 4-6). Код рРНК, најупечатљивије промене укључивале су потпуни губитак амплификованог 25S рРНК фрагмента ES12L и делимичну дегенерацију хеликса h39, h41 и H18 (Слика 1ц, Допунска слика 4). Међу рибозомалним протеинима, најупечатљивије промене укључивале су потпуни губитак протеина eS30 и скраћивање протеина eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (Допунске слике 4, 5).
Дакле, екстремно смањење генома врста Encephalotozoon/Ordospora огледа се у њиховој структури рибозома: рибозоми E. cuniculi доживљавају најдраматичнији губитак садржаја протеина у еукариотским цитоплазматским рибозомима који су подложни структурној карактеризацији, а они чак немају ни оне рРНК и протеинске фрагменте који су широко конзервирани не само код еукариота, већ и у три домена живота. Структура рибозома E. cuniculi пружа први молекуларни модел за ове промене и открива еволутивне догађаје који су превиђени и упоредном геномиком и у студијама интрацелуларне биомолекуларне структуре (Допунска слика 7). У наставку описујемо сваки од ових догађаја заједно са њиховим вероватним еволутивним пореклом и њиховим потенцијалним утицајем на функцију рибозома.
Затим смо открили да, поред великих скраћења рРНК, рибозоми E. cuniculi имају варијације рРНК на једном од својих активних места. Иако пептидил трансфераза центар рибозома E. cuniculi има исту структуру као и други еукариотски рибозоми (Сл. 1д), центар за декодирање се разликује због варијације секвенце на нуклеотиду 1491 (нумерација E. coli, Сл. 1е, ф). Ово запажање је важно јер место за декодирање еукариотских рибозома обично садржи остатке G1408 и A1491 у поређењу са остацима бактеријског типа A1408 и G1491. Ова варијација је основа различите осетљивости бактеријских и еукариотских рибозома на породицу аминогликозида рибозомских антибиотика и других малих молекула који циљају место за декодирање. На месту за декодирање рибозома E. cuniculi, остатак A1491 је замењен са U1491, потенцијално стварајући јединствени интерфејс за везивање за мале молекуле који циљају ово активно место. Иста варијанта A14901 присутна је и код других микроспоридија као што су P. locustae и V. necatrix, што указује на то да је широко распрострањена међу врстама микроспоридија (Сл. 1ф).
Пошто су наши узорци рибозома E. cuniculi изоловани из метаболички неактивних спора, тестирали смо крио-ЕМ мапу E. cuniculi за претходно описано везивање рибозома под стресом или гладовањем. Фактори хибернације 31, 32, 36, 37, 38. Упарили смо претходно утврђену структуру хибернирајућег рибозома са крио-ЕМ мапом рибозома E. cuniculi. За доковање су коришћени рибозоми S. cerevisiae у комплексу са фактором хибернације Stm138, рибозоми скакаваца у комплексу са фактором Lso232 и рибозоми V. necatrix у комплексу са факторима Mdf1 и Mdf231. Истовремено, пронашли смо крио-ЕМ густину која одговара фактору одмора Mdf1. Слично везивању Mdf1 за рибозом V. necatrix, Mdf1 се такође везује за рибозом E. cuniculi, где блокира Е место рибозома, што вероватно помаже да рибозоми постану доступни када споре паразита постану метаболички неактивне након инактивације тела (Слика 2).
Mdf1 блокира Е место рибозома, што изгледа помаже у инактивацији рибозома када споре паразита постану метаболички неактивне. У структури рибозома E. cuniculi, открили смо да Mdf1 формира раније непознати контакт са стаблом рибозома L1, делом рибозома који олакшава ослобађање деацилисане тРНК из рибозома током синтезе протеина. Ови контакти сугеришу да се Mdf1 дисоцира са рибозома користећи исти механизам као и деацетилована тРНК, што пружа могуће објашњење за то како рибозом уклања Mdf1 да би реактивирао синтезу протеина.
Међутим, наша структура је открила непознати контакт између Mdf1 и L1 рибозомског крака (део рибозома који помаже у ослобађању деацилисане тРНК из рибозома током синтезе протеина). Конкретно, Mdf1 користи исте контакте као и лакатни сегмент деацилисаног молекула тРНК (Сл. 2). Ово раније непознато молекуларно моделирање показало је да се Mdf1 дисоцира са рибозома користећи исти механизам као и деацетилована тРНК, што објашњава како рибозом уклања овај фактор хибернације да би реактивирао синтезу протеина.
Приликом конструисања рРНК модела, открили смо да рибозом E. cuniculi има абнормално савијене рРНК фрагменте, које смо назвали фузиона рРНК (Сл. 3). У рибозомима који обухватају три домена живота, рРНК се савија у структуре у којима се већина рРНК база или упарује и савија једна са другом или интерагује са рибозомским протеинима38,39,40. Међутим, у рибозомима E. cuniculi, чини се да рРНК крше овај принцип савијања претварајући неке од својих хеликса у нераспаковане рРНК регионе.
Структура H18 25S рРНК хеликса код S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi. Типично, у рибозомима који обухватају три животна домена, овај линкер се увија у РНК хеликс који садржи 24 до 34 остатка. Код микроспоридија, насупрот томе, овај рРНК линкер се постепено редукује на два једноланчана линкера богата уридином који садрже само 12 остатака. Већина ових остатака је изложена растварачима. Слика показује да паразитске микроспоридије изгледа крше опште принципе савијања рРНК, где су базе рРНК обично спрегнуте са другим базама или укључене у интеракције рРНК-протеин. Код микроспоридија, неки фрагменти рРНК попримају неповољан прегиб, у којем бивши хеликс рРНК постаје једноланчани фрагмент издужен скоро у правој линији. Присуство ових необичних региона омогућава рРНК микроспоридија да се веже за удаљене фрагменте рРНК користећи минималан број РНК база.
Најупечатљивији пример ове еволутивне транзиције може се посматрати у H18 25S рРНК хеликсу (Сл. 3). Код врста од E. coli до људи, базе овог рРНК хеликса садрже 24-32 нуклеотида, формирајући благо неправилан хеликс. У претходно идентификованим рибозомским структурама из V. necatrix и P. locustae,31,32 базе H18 хеликса су делимично одмотане, али је упаривање нуклеотидних база очувано. Међутим, код E. cuniculi овај рРНК фрагмент постаје најкраћи линкери 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUUU307. За разлику од типичних рРНК фрагмената, ови линкери богати уридином се не увијају нити остварују опсежан контакт са рибозомским протеинима. Уместо тога, они усвајају структуре отворене за растварач и потпуно развијене у којима су ланци рРНК испружени скоро праволинијски. Ова растегнута конформација објашњава како E. cuniculi користи само 12 РНК база да попуни празнину од 33 Å између H16 и H18 рРНК хеликса, док другим врстама треба најмање двоструко више рРНК база да попуне празнину.
Дакле, можемо показати да су, путем енергетски неповољног савијања, паразитске микроспоридије развиле стратегију контракције чак и оних сегмената рРНК који остају широко конзервирани код врста у три домена живота. Изгледа да акумулирањем мутација које трансформишу хеликсе рРНК у кратке поли-U линкере, E. cuniculi може да формира необичне фрагменте рРНК који садрже што је могуће мање нуклеотида за лигацију дисталних фрагмената рРНК. Ово помаже да се објасни како су микроспоридије постигле драматично смањење своје основне молекуларне структуре без губитка структурног и функционалног интегритета.
Још једна необична карактеристика рРНК E. cuniculi је појава рРНК без задебљања (Сл. 4). Избочине су нуклеотиди без базних парова који се увијају изван РНК хеликса уместо да се крију у њему. Већина избочина рРНК делује као молекуларни лепкови, помажући у везивању суседних рибозомских протеина или других фрагмената рРНК. Неке од избочина делују као шарке, омогућавајући рРНК хеликсу да се оптимално савија и савија за продуктивну синтезу протеина 41.
а) Избочина рРНК (нумерација S. cerevisiae) је одсутна из структуре рибозома E. cuniculi, али је присутна код већине других еукариота б) Унутрашњи рибозоми E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и E. cuniculi. Паразити немају многа древна, високо конзервисана избочења рРНК. Ова задебљања стабилизују структуру рибозома; стога, њихово одсуство код микроспоридија указује на смањену стабилност савијања рРНК код паразита микроспоридија. Поређење са P стабљикама (L7/L12 стабљике код бактерија) показује да се губитак избочења рРНК понекад поклапа са појавом нових избочења поред изгубљених избочења. H42 спирала у 23S/28S рРНК има древно избочење (U1206 код Saccharomyces cerevisiae) за које се процењује да је старо најмање 3,5 милијарди година због своје заштите у три домена живота. Код микроспоридија, ово избочење је елиминисано. Међутим, поред изгубљене избочине (А1306 код Е. цуницули) појавила се нова избочина.
Запањујуће је да смо открили да рибозомима E. cuniculi недостаје већина рРНК испупчења која се налазе код других врста, укључујући више од 30 испупчења конзервисаних код других еукариота (Сл. 4а). Овај губитак елиминише многе контакте између рибозомских подјединица и суседних рРНК хеликса, понекад стварајући велике шупље празнине унутар рибозома, чинећи рибозом E. cuniculi порознијим у поређењу са традиционалнијим рибозомима (Сл. 4б). Приметно је да смо открили да је већина ових испупчења такође изгубљена у претходно идентификованим структурама рибозома V. necatrix и P. locustae, што је превиђено претходним структурним анализама31,32.
Понекад је губитак рРНК избочина праћен развојем нових избочина поред изгубљене избочине. На пример, рибозомално П-стабло садржи избочину U1208 (код Saccharomyces cerevisiae) која је преживела од E. coli до људи и стога се процењује да је стара 3,5 милијарди година. Током синтезе протеина, ова избочина помаже П-стаблу да се креће између отворених и затворених конформација тако да рибозом може да регрутује факторе транслације и испоручи их на активно место. Код рибозома E. cuniculi, ово задебљање је одсутно; међутим, ново задебљање (G883) које се налази само у три базна пара може допринети обнављању оптималне флексибилности П-стабла (Сл. 4ц).
Наши подаци о рРНК без испупчења указују на то да минимизирање рРНК није ограничено само на губитак рРНК елемената на површини рибозома, већ може укључивати и једро рибозома, стварајући молекуларни дефект специфичан за паразита који није описан у слободно живим ћелијама. Примећене су живе врсте.
Након моделирања канонских рибозомских протеина и рРНК, открили смо да конвенционалне рибозомске компоненте не могу да објасне три дела крио-ЕМ слике. Два од ових фрагмената су мале молекуле (Сл. 5, Допунска слика 8). Први сегмент је смештен између рибозомских протеина uL15 и eL18 на позицији коју обично заузима C-терминус eL18, који је скраћен код E. cuniculi. Иако не можемо да утврдимо идентитет овог молекула, величина и облик овог острва густине се добро објашњавају присуством молекула спермидина. Његово везивање за рибозом стабилизовано је мутацијама специфичним за микроспоридије у протеинима uL15 (Asp51 и Arg56), које изгледа повећавају афинитет рибозома за овај мали молекул, јер омогућавају uL15 да умота мали молекул у рибозомску структуру. Допунска слика 2). 8, додатни подаци 1, 2).
Крио-ЕМ снимање које приказује присуство нуклеотида изван рибозе везане за рибозом E. cuniculi. У рибозому E. cuniculi, овај нуклеотид заузима исто место као и 25S рРНК А3186 нуклеотид (нумерација Saccharomyces cerevisiae) у већини других еукариотских рибозома. б У рибозомалној структури E. cuniculi, овај нуклеотид се налази између рибозомалних протеина uL9 и eL20, чиме се стабилизује контакт између два протеина. цд Анализа конзервације секвенце eL20 међу врстама микроспоридија. Филогенетско стабло врста микроспоридија (ц) и вишеструко поравнање секвенци протеина eL20 (д) показују да су остаци F170 и K172 који везују нуклеотиде конзервирани у већини типичних микроспоридија, са изузетком S. lophii, са изузетком микроспоридија раног гранања, које су задржале екстензију ES39L рРНК. е Ова слика показује да су остаци F170 и K172 који везују нуклеотиде присутни само у eL20 високо редукованог генома микроспоридија, али не и код других еукариота. Генерално, ови подаци сугеришу да су микроспоридијски рибозоми развили место везивања нуклеотида које изгледа везује молекуле АМП и користи их за стабилизацију протеин-протеин интеракција у рибозомалној структури. Висока конзервација овог места везивања код микроспоридија и његово одсуство код других еукариота сугерише да ово место може пружити селективну предност у преживљавању за микроспоридије. Дакле, џеп за везивање нуклеотида у рибозому микроспоридија не изгледа као дегенерисана карактеристика или крајњи облик деградације рРНК као што је претходно описано, већ корисна еволутивна иновација која омогућава рибозому микроспоридија да директно веже мале молекуле, користећи их као молекуларне градивне блокове за рибозоме. Ово откриће чини рибозом микроспоридија јединим рибозомом за који се зна да користи један нуклеотид као свој структурни градивни блок. ф Хипотетички еволутивни пут изведен из везивања нуклеотида.
Друга густина мале молекулске тежине налази се на интерфејсу између рибозомских протеина uL9 и eL30 (Сл. 5а). Овај интерфејс је претходно описан у структури рибозома Saccharomyces cerevisiae као место везивања за 25S нуклеотид рРНК A3186 (део екстензије ES39L рРНК)38. Показано је да се у дегенерисаним рибозомима P. locustae ES39L, овај интерфејс везује за непознати један нуклеотид 31, и претпоставља се да је овај нуклеотид редуковани коначни облик рРНК, у коме је дужина рРНК ~130-230 база. ES39L је редукован на један нуклеотид 32,43. Наше крио-ЕМ слике подржавају идеју да се густина може објаснити нуклеотидима. Међутим, већа резолуција наше структуре показала је да је овај нуклеотид екстрарибозомски молекул, могуће AMP (Сл. 5а, б).
Затим смо питали да ли се место везивања нуклеотида појављује на рибозому E. cuniculi или је постојало раније. Пошто је везивање нуклеотида углавном посредовано остацима Phe170 и Lys172 у рибозомалном протеину eL30, проценили смо конзервацију ових остатака код 4396 репрезентативних еукариота. Као и у случају uL15 изнад, открили смо да су остаци Phe170 и Lys172 високо конзервирани само код типичних микроспоридија, али одсутни код других еукариота, укључујући атипичне микроспоридије Mitosporidium и Amphiamblys, код којих фрагмент ES39L рРНК није редукован 44, 45, 46 (Сл. 5ц). -е).
Узети заједно, ови подаци подржавају идеју да су E. cuniculi и могуће друге канонске микроспоридије еволуирале способност ефикасног хватања великог броја малих метаболита у структури рибозома како би компензовале пад нивоа рРНК и протеина. Тиме су развиле јединствену способност везивања нуклеотида изван рибозома, показујући да паразитске молекуларне структуре компензују хватањем обилних малих метаболита и њиховим коришћењем као структурних имитатора деградираних фрагмената РНК и протеина.
Трећи несимулирани део наше крио-ЕМ мапе, пронађен у великој рибозомалној подјединици. Релативно висока резолуција (2,6 Å) наше мапе сугерише да ова густина припада протеинима са јединственим комбинацијама остатака великих бочних ланаца, што нам је омогућило да идентификујемо ову густину као раније непознати рибозомални протеин који смо идентификовали као... Назван је msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (методе, слика 6). Наша претрага хомологије показала је да је msL2 конзервиран у клади Microsporidia рода Encephaliter и Orosporidium, али је одсутан код других врста, укључујући друге Microsporidia. У рибозомалној структури, msL2 заузима празнину насталу губитком продужене ES31L рРНК. У овој празнини, msL2 помаже у стабилизацији савијања рРНК и може надокнадити губитак ES31L (Слика 6).
а Густина електрона и модел рибозомског протеина msL2 специфичног за микроспоридије који се налази у рибозомима E. cuniculi. б Већина еукариотских рибозома, укључујући 80S рибозом Saccharomyces cerevisiae, има изгубљену амплификацију ES19L рРНК код већине врста микроспоридија. Претходно утврђена структура рибозома микроспоридија V. necatrix сугерише да је губитак ES19L код ових паразита компензован еволуцијом новог рибозомског протеина msL1. У овој студији, открили смо да је рибозом E. cuniculi такође развио додатни протеин који мимитира рибозомску РНК као очигледну компензацију за губитак ES19L. Међутим, msL2 (тренутно означен као хипотетички протеин ECU06_1135) и msL1 имају различито структурно и еволутивно порекло. Ово откриће генерисања еволутивно неповезаних рибозомских протеина msL1 и msL2 сугерише да ако рибозоми акумулирају штетне мутације у својој рРНК, могу постићи невиђене нивое саставне разноликости чак и код малог подскупа блиско сродних врста. Ово откриће би могло помоћи у разјашњавању порекла и еволуције митохондријалног рибозома, који је познат по својој знатно редукованој рРНК и абнормалној варијабилности у саставу протеина међу врстама.
Затим смо упоредили протеин msL2 са претходно описаним протеином msL1, јединим познатим рибозомалним протеином специфичним за микроспоридије који се налази у рибозому V. necatrix. Желели смо да тестирамо да ли су msL1 и msL2 еволутивно повезани. Наша анализа је показала да msL1 и msL2 заузимају исту шупљину у рибозомалној структури, али имају различите примарне и терцијарне структуре, што указује на њихово независно еволутивно порекло (Сл. 6). Дакле, наше откриће msL2 пружа доказе да групе компактних еукариотских врста могу независно да еволуирају структурно различите рибозомалне протеине како би надокнадили губитак фрагмената рРНК. Ово откриће је значајно по томе што већина цитоплазматских еукариотских рибозома садржи инваријантни протеин, укључујући исту породицу од 81 рибозомалног протеина. Појава msL1 и msL2 у различитим кладама микроспоридија као одговор на губитак проширених сегмената рРНК сугерише да деградација молекуларне архитектуре паразита узрокује да паразити траже компензаторне мутације, што на крају може довести до њиховог стицања у различитим популацијама паразита.
Коначно, када је наш модел завршен, упоредили смо састав рибозома E. cuniculi са оним предвиђеним на основу секвенце генома. Раније се сматрало да неколико рибозомских протеина, укључујући eL14, eL38, eL41 и eS30, недостаје у геному E. cuniculi због очигледног одсуства њихових хомолога из генома E. cuniculi. Губитак многих рибозомских протеина се такође предвиђа код већине других високо редукованих интрацелуларних паразита и ендосимбионта. На пример, иако већина слободноживућих бактерија садржи исту фамилију од 54 рибозомска протеина, само 11 од ових протеинских фамилија има детектабилне хомологе у сваком анализираном геному бактерија ограничених на домаћина. У прилог овој идеји, експериментално је примећен губитак рибозомских протеина код микроспоридија V. necatrix и P. locustae, којима недостају протеини eL38 и eL4131,32.
Међутим, наше структуре показују да су само eL38, eL41 и eS30 заправо изгубљени у рибозому E. cuniculi. Протеин eL14 је био очуван и наша структура је показала зашто се овај протеин није могао пронаћи у претрази хомологије (Сл. 7). У рибозомима E. cuniculi, већи део места везивања eL14 је изгубљен због деградације ES39L амплификованог рРНК. У одсуству ES39L, eL14 је изгубио већи део своје секундарне структуре, а само 18% секвенце eL14 је било идентично код E. cuniculi и S. cerevisiae. Ова лоша очуваност секвенце је изванредна јер чак и Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens - организми који су еволуирали са разликом од 1,5 милијарди година - деле више од 51% истих остатака у eL14. Овај аномални губитак очуваности објашњава зашто је E. cuniculi eL14 тренутно означен као претпостављени протеин M970_061160, а не као рибозомски протеин eL1427.
и Рибозом микроспоридија је изгубио екстензију ES39L рРНК, што је делимично елиминисало место везивања рибозомског протеина eL14. У одсуству ES39L, протеин микроспора eL14 губи секундарну структуру, у којој се бивши α-хеликс који везује рРНК дегенерише у петљу минималне дужине. б Вишеструко поравнање секвенци показује да је протеин eL14 високо конзервиран код еукариотских врста (57% идентитета секвенце између квасца и људских хомолога), али слабо конзервиран и дивергентан код микроспоридија (у којима је не више од 24% остатака идентично хомологу eL14). од S. cerevisiae или H. sapiens). Ова лоша конзервација секвенце и варијабилност секундарне структуре објашњавају зашто хомолог eL14 никада није пронађен код E. cuniculi и зашто се сматра да је овај протеин изгубљен код E. cuniculi. Насупрот томе, eL14 код E. cuniculi је претходно означен као претпостављени протеин M970_061160. Ово запажање сугерише да је разноликост генома микроспоридија тренутно прецењена: неки гени за које се тренутно сматра да су изгубљени у микроспоридијама су заправо очувани, иако у високо диференцираним облицима; уместо тога, сматра се да неки кодирају гене микроспоридија за протеине специфичне за црве (нпр. хипотетички протеин M970_061160) заправо кодира веома разноврсне протеине који се налазе код других еукариота.
Ово откриће сугерише да денатурација рРНК може довести до драматичног губитка конзервације секвенце у суседним рибозомским протеинима, чинећи ове протеине неоткривеним за претрагу хомологије. Стога, можемо преценити стварни степен молекуларне деградације код организама са малим геномом, јер неки протеини за које се сматра да су изгубљени заправо опстају, иако у веома измењеним облицима.
Како паразити могу задржати функцију својих молекуларних машина у условима екстремне редукције генома? Наша студија одговара на ово питање описујући сложену молекуларну структуру (рибозома) E. cuniculi, организма са једним од најмањих еукариотских генома.
Већ скоро две деценије је познато да се молекули протеина и РНК код микробних паразита често разликују од својих хомологних молекула код слободноживућих врста јер им недостају центри за контролу квалитета, смањени су на 50% своје величине код слободноживућих микроба итд. имају многе исцрпљујуће мутације које нарушавају савијање и функцију. На пример, очекује се да рибозомима организама са малим геномом, укључујући многе интрацелуларне паразите и ендосимбионте, недостаје неколико рибозомских протеина и до једне трећине рРНК нуклеотида у поређењу са слободноживућим врстама 27, 29, 30, 49. Међутим, начин на који ови молекули функционишу код паразита остаје углавном мистерија, проучавана углавном кроз упоредну геномику.
Наша студија показује да структура макромолекула може открити многе аспекте еволуције које је тешко извући из традиционалних упоредних геномских студија интрацелуларних паразита и других организама ограничених на домаћина (Допунска слика 7). На пример, пример протеина eL14 показује да можемо преценити стварни степен деградације молекуларног апарата код паразитских врста. Верује се да енцефалитични паразити сада имају стотине гена специфичних за микроспоридије. Међутим, наши резултати показују да су неки од ових наизглед специфичних гена заправо само веома различите варијанте гена који су уобичајени код других еукариота. Штавише, пример протеина msL2 показује како превиђамо нове рибозомске протеине и потцењујемо садржај паразитских молекуларних машина. Пример малих молекула показује како можемо превидети најгенијалније иновације у паразитским молекуларним структурама које им могу дати нову биолошку активност.
Узети заједно, ови резултати побољшавају наше разумевање разлика између молекуларних структура организама ограничених домаћином и њихових пандана у слободноживућим организмима. Показујемо да молекуларне машине, за које се дуго сматрало да су редуковане, дегенерисане и подложне разним исцрпљујућим мутацијама, уместо тога имају скуп систематски занемарених необичних структурних карактеристика.
С друге стране, фрагменти рРНК који нису гломазни и фузионисани фрагменти које смо пронашли у рибозомима E. cuniculi сугеришу да редукција генома може променити чак и оне делове основне молекуларне машинерије који су очувани у три домена живота – након скоро 3,5 милијарди година независне еволуције врста.
Фрагменти рРНК без избочина и фузионисани фрагменти у рибозомима E. cuniculi су од посебног интереса у светлу претходних студија молекула РНК код ендосимбиотских бактерија. На пример, код ендосимбионта биљне уши Buchnera aphidicola, показано је да молекули рРНК и тРНК имају температурно осетљиве структуре због пристрасности у саставу А+Т и високог удела неканонских базних парова20,50. Сматра се да су ове промене у РНК, као и промене у молекулима протеина, сада одговорне за прекомерну зависност ендосимбионата од партнера и немогућност ендосимбионата да преносе топлоту21,23. Иако рРНК паразитских микроспоридија има структурно различите промене, природа ових промена сугерише да смањена термичка стабилност и већа зависност од протеина шаперона могу бити заједничке карактеристике молекула РНК код организама са редукованим геномима.
С друге стране, наше структуре показују да су паразитске микроспоридије развиле јединствену способност да се одупру широко конзервираним рРНК и протеинским фрагментима, развијајући способност да користе обилне и лако доступне мале метаболите као структурне имитације дегенерисаних рРНК и протеинских фрагмената. Деградација молекуларне структуре. . Ово мишљење је поткрепљено чињеницом да се мали молекули који компензују губитак протеинских фрагмената у рРНК и рибозомима E. cuniculi везују за остатке специфичне за микроспоридије у протеинима uL15 и eL30. Ово сугерише да везивање малих молекула за рибозоме може бити производ позитивне селекције, у којој су мутације специфичне за микроспоридије у рибозомским протеинима одабране због њихове способности да повећају афинитет рибозома за мале молекуле, што може довести до ефикаснијих рибозомских организама. Откриће открива паметну иновацију у молекуларној структури микробних паразита и даје нам боље разумевање како молекуларне структуре паразита одржавају своју функцију упркос редуктивној еволуцији.
Тренутно, идентификација ових малих молекула остаје нејасна. Није јасно зашто се изглед ових малих молекула у рибозомалној структури разликује између врста микроспоридија. Посебно, није јасно зашто се везивање нуклеотида примећује у рибозомима E. cuniculi и P. locustae, а не у рибозомима V. necatrix, упркос присуству остатка F170 у протеинима eL20 и K172 V. necatrix. Ова делеција може бити узрокована остатком 43 uL6 (који се налази поред џепа за везивање нуклеотида), који је тирозин код V. necatrix, а не треонин код E. cuniculi и P. locustae. Гломазни ароматични бочни ланац Tyr43 може ометати везивање нуклеотида због стерног преклапања. Алтернативно, очигледна делеција нуклеотида може бити последица ниске резолуције крио-ЕМ снимања, што омета моделирање рибозомалних фрагмената V. necatrix.
С друге стране, наш рад сугерише да процес распадања генома може бити инвентивна сила. Конкретно, структура рибозома E. cuniculi сугерише да губитак рРНК и протеинских фрагмената у рибозому микроспоридија ствара еволутивни притисак који подстиче промене у структури рибозома. Ове варијанте се јављају далеко од активног места рибозома и изгледа да помажу у одржавању (или обнављању) оптималног склопа рибозома који би иначе био поремећен редукованом рРНК. Ово сугерише да је главна иновација рибозома микроспоридија изгледа еволуирала у потребу за пуферовањем генског дрифта.
Можда је ово најбоље илустровано везивањем нуклеотида, које до сада никада није примећено код других организама. Чињеница да су остаци за везивање нуклеотида присутни код типичних микроспоридија, али не и код других еукариота, сугерише да места за везивање нуклеотида нису само реликти који чекају да нестану, или коначно место за рРНК да се врати у облик појединачних нуклеотида. Уместо тога, ово место делује као корисна карактеристика која је могла еволуирати током неколико рунди позитивне селекције. Места за везивање нуклеотида могу бити нуспроизвод природне селекције: када се ES39L разгради, микроспоридије су приморане да траже компензацију како би обновиле оптималну биогенезу рибозома у одсуству ES39L. Пошто овај нуклеотид може да имитира молекуларне контакте нуклеотида A3186 у ES39L, молекул нуклеотида постаје градивни блок рибозома, чије се везивање додатно побољшава мутацијом секвенце eL30.
Што се тиче молекуларне еволуције интрацелуларних паразита, наша студија показује да силе дарвинистичке природне селекције и генетског дрифта распадања генома не делују паралелно, већ осцилирају. Прво, генетски дрифт елиминише важне карактеристике биомолекула, чинећи компензацију преко потребном. Само када паразити задовоље ову потребу кроз дарвинистичку природну селекцију, њихови макромолекули ће имати прилику да развију своје најимпресивније и најиновативније особине. Важно је напоменути да еволуција места везивања нуклеотида у рибозому E. cuniculi сугерише да овај образац молекуларне еволуције „губитак-до-добитак“ не само да амортизује штетне мутације, већ понекад даје потпуно нове функције паразитским макромолекулима.
Ова идеја је у складу са теоријом покретне равнотеже Сјуела Рајта, која наводи да строги систем природне селекције ограничава способност организама да иновирају51,52,53. Међутим, ако генетски дрифт поремети природну селекцију, ови дрифтови могу произвести промене које саме по себи нису адаптивне (или чак штетне), али доводе до даљих промена које пружају већу кондицију или нову биолошку активност. Наш оквир подржава ову идеју илуструјући да иста врста мутације која смањује набор и функцију биомолекула изгледа да је главни окидач за његово побољшање. У складу са еволуционим моделом у којем сви добијају, наша студија показује да је пропадање генома, традиционално посматрано као дегенеративни процес, такође главни покретач иновација, понекад, а можда чак и често, омогућавајући макромолекулима да стекну нове паразитске активности. Могу их користити.