Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Еволуција микробних паразита укључује контраакцију између природне селекције, која узрокује побољшање паразита, и генетског дрифта, који узрокује да паразити губе гене и акумулирају штетне мутације.Овде, да бисмо разумели како се ова контраакција дешава на скали једног макромолекула, описујемо крио-ЕМ структуру рибозома Енцепхалитозоон цуницули, еукариотског организма са једним од најмањих генома у природи.Екстремно смањење рРНК у рибозомима Е. цуницули праћено је структурним променама без преседана, као што је еволуција претходно непознатих спојених рРНК линкера и рРНК без избочина.Поред тога, рибозом Е. цуницули је преживео губитак фрагмената и протеина рРНК тако што је развио способност да користи мале молекуле као структурне имитације деградираних фрагмената и протеина рРНК.Све у свему, показујемо да молекуларне структуре за које се дуго сматрало да су редуковане, дегенерисане и подложне ослабљујућим мутацијама имају низ компензационих механизама који их одржавају активним упркос екстремним молекуларним контракцијама.
Пошто већина група микробних паразита има јединствене молекуларне алате за експлоатацију својих домаћина, често морамо да развијемо различите терапије за различите групе паразита1,2.Међутим, нови докази сугеришу да су неки аспекти еволуције паразита конвергентни и у великој мери предвидљиви, што указује на потенцијалну основу за широке терапеутске интервенције код микробних паразита3,4,5,6,7,8,9.
Претходни рад је идентификовао уобичајени еволуциони тренд код микробних паразита који се назива смањење генома или пропадање генома10,11,12,13.Садашња истраживања показују да када микроорганизми одустану од свог слободног начина живота и постану интрацелуларни паразити (или ендосимбионти), њихови геноми пролазе кроз споре, али невероватне метаморфозе током милиона година9,11.У процесу познатом као пропадање генома, микробни паразити акумулирају штетне мутације које претварају многе раније важне гене у псеудогене, што доводи до постепеног губитка гена и мутационог колапса14,15.Овај колапс може уништити до 95% гена у најстаријим интрацелуларним организмима у поређењу са блиско сродним слободноживућим врстама.Дакле, еволуција интрацелуларних паразита је натезање између две супротстављене силе: дарвинистичке природне селекције, која води ка побољшању паразита, и колапса генома, бацајући паразите у заборав.Остаје нејасно како је паразит успео да изађе из овог потезања конопа и задржи активност своје молекуларне структуре.
Иако механизам пропадања генома није у потпуности схваћен, чини се да се јавља углавном због честог генетског дрифта.Пошто паразити живе у малим, асексуалним и генетски ограниченим популацијама, они не могу ефикасно елиминисати штетне мутације које се понекад јављају током репликације ДНК.То доводи до неповратног нагомилавања штетних мутација и смањења генома паразита.Као резултат тога, паразит не само да губи гене који више нису неопходни за његов опстанак у интрацелуларном окружењу.Неспособност популација паразита да ефикасно елиминишу спорадичне штетне мутације узрокује да се ове мутације акумулирају у читавом геному, укључујући њихове најважније гене.
Велики део нашег тренутног разумевања редукције генома заснива се искључиво на упоређивању секвенци генома, са мање пажње на промене у стварним молекулима који обављају кућне функције и служе као потенцијалне мете за лекове.Компаративна истраживања су показала да терет штетних интрацелуларних микробних мутација предиспонира протеине и нуклеинске киселине да се погрешно савијају и агрегирају, чинећи их више зависним од пратиоца и преосетљивим на топлоту19,20,21,22,23.Поред тога, различити паразити - независна еволуција понекад раздвојена за чак 2,5 милијарди година - доживели су сличан губитак центара за контролу квалитета у њиховој синтези протеина5,6 и механизмима поправке ДНК24.Међутим, мало се зна о утицају интрацелуларног начина живота на сва друга својства ћелијских макромолекула, укључујући молекуларну адаптацију на све већи терет штетних мутација.
У овом раду, у циљу бољег разумевања еволуције протеина и нуклеинских киселина интрацелуларних микроорганизама, утврдили смо структуру рибозома интрацелуларног паразита Енцепхалитозоон цуницули.Е. цуницули је организам сличан гљивици који припада групи паразитских микроспоридија које имају необично мале еукариотске геноме и стога се користе као узорни организми за проучавање пропадања генома25,26,27,28,29,30.Недавно је одређена структура крио-ЕМ рибозома за умерено редуковане геноме Мицроспоридиа, Параносема лоцустае и Ваириморпха нецатрик31,32 (~3,2 Мб генома).Ове структуре сугеришу да је неки губитак амплификације рРНК надокнађен развојем нових контаката између суседних рибозомалних протеина или стицањем нових мсЛ131,32 рибосомских протеина.Врсте Енцепхалитозоон (геном ~2,5 милиона бп), заједно са својим најближим сродником Ордоспора, показују крајњи степен редукције генома код еукариота – имају мање од 2000 гена који кодирају протеине, а очекује се да њихови рибозоми нису само лишени рРНА експанзијских фрагмената ребра) који такође разликују фрагменте рибозома четири рибозома (рРНАук рибосома). омалних протеина због недостатка хомолога у геному Е. цуницули26,27,28.Стога смо закључили да рибозом Е. цуницули може открити раније непознате стратегије за молекуларну адаптацију на пропадање генома.
Наша крио-ЕМ структура представља најмањи еукариотски цитоплазматски рибозом који треба окарактерисати и пружа увид у то како крајњи степен редукције генома утиче на структуру, склапање и еволуцију молекуларне машинерије која је саставни део ћелије.Открили смо да рибозом Е. цуницули крши многе од широко очуваних принципа савијања РНК и састављања рибозома, и открили нови, раније непознати рибозомски протеин.Сасвим неочекивано, показујемо да су рибозоми микроспоридија развили способност везивања малих молекула и претпостављамо да скраћивање рРНК и протеина покрећу еволуционе иновације које на крају могу дати корисне квалитете рибозому.
Да бисмо побољшали наше разумевање еволуције протеина и нуклеинских киселина у интрацелуларним организмима, одлучили смо да изолујемо споре Е. цуницули из култура инфицираних ћелија сисара како бисмо пречистили њихове рибозоме и одредили структуру ових рибозома.Тешко је добити велики број паразитских микроспоридија јер се микроспоридија не може узгајати у хранљивој средини.Уместо тога, они расту и репродукују се само унутар ћелије домаћина.Стога, да бисмо добили биомасу Е. цуницули за пречишћавање рибозома, инфицирали смо ћелијску линију бубрега сисара РК13 спорама Е. цуницули и култивисали ове инфициране ћелије неколико недеља да бисмо омогућили Е. цуницули да расте и умножава се.Користећи инфицирани ћелијски монослој од око пола квадратног метра, успели смо да пречистимо око 300 мг спора Мицроспоридиа и употребимо их за изоловање рибозома.Затим смо разбили пречишћене споре стакленим перлама и изоловали сирове рибозоме користећи постепену полиетилен гликол фракционисање лизата.Ово нам је омогућило да добијемо приближно 300 µг сирових рибозома Е. цуницули за структурну анализу.
Затим смо сакупили крио-ЕМ слике користећи резултујуће узорке рибозома и обрадили ове слике користећи маске које одговарају великој рибозомалној подјединици, малој глави подјединице и малој подјединици.Током овог процеса, прикупили смо слике од око 108.000 рибосомских честица и израчунали крио-ЕМ слике са резолуцијом од 2,7 А (додатне слике 1-3).Затим смо користили цриоЕМ слике за моделирање рРНА, рибозомалног протеина и фактора хибернације Мдф1 повезаног са рибозомима Е. цуницули (слика 1а, б).
а Структура рибозома Е. цуницули у комплексу са фактором хибернације Мдф1 (пдб ид 7КЕП).б Мапа фактора хибернације Мдф1 повезаног са рибозомом Е. цуницули.ц Мапа секундарне структуре која упоређује обновљену рРНК у микроспоридијским врстама са познатим рибозомским структурама.Панели показују локацију амплификованих фрагмената рРНК (ЕС) и активних места рибозома, укључујући место за декодирање (ДЦ), петљу сарцицина (СРЛ) и центар пептидил трансферазе (ПТЦ).д Електронска густина која одговара центру пептидил трансферазе рибозома Е. цуницули сугерише да ово каталитичко место има исту структуру код паразита Е. цуницули и његових домаћина, укључујући Х. сапиенс.е, ф Одговарајућа електронска густина центра за декодирање (е) и шематска структура центра за декодирање (ф) указују на то да Е. цуницули има остатке У1491 уместо А1491 (Е. цоли нумерисање) код многих других еукариота.Ова промена сугерише да Е. цуницули може бити осетљива на антибиотике који циљају ово активно место.
За разлику од раније утврђених структура рибозома В. нецатрик и П. лоцустае (обе структуре представљају исту породицу микроспоридија Носематидае и веома су сличне једна другој), 31,32 рибозоми Е. цуницули пролазе кроз бројне процесе фрагментације рРНК и протеина.Даља денатурација (додатне слике 4-6).У рРНА, најупечатљивије промене су укључивале потпуни губитак амплификованог 25С рРНА фрагмента ЕС12Л и делимичну дегенерацију спирала х39, х41 и Х18 (слика 1ц, додатна слика 4).Међу рибозомским протеинима, најупечатљивије промене су укључивале потпуни губитак протеина еС30 и скраћивање протеина еЛ8, еЛ13, еЛ18, еЛ22, еЛ29, еЛ40, уС3, уС9, уС14, уС17 и еС7 (Слика 4, додатни протеини).
Дакле, екстремна редукција генома врста Енцепхалотозоон/Ордоспора се огледа у њиховој структури рибозома: рибозоми Е. цуницули доживљавају најдраматичнији губитак садржаја протеина у еукариотским цитоплазматским рибозомима који су подложни структурној карактеризацији, а немају чак ни оне рРНК и протеинске домене који чувају животни фрагменти не само у три домена који се налазе у широком опсегу.Структура рибозома Е. цуницули пружа први молекуларни модел за ове промене и открива еволуционе догађаје који су занемарени и упоредном геномиком и проучавањем унутарћелијске биомолекуларне структуре (додатна слика 7).У наставку описујемо сваки од ових догађаја заједно са њиховим вероватним еволуционим пореклом и њиховим потенцијалним утицајем на функцију рибозома.
Затим смо открили да, поред великих скраћења рРНК, рибозоми Е. цуницули имају варијације рРНК на једном од својих активних места.Иако центар пептидил трансферазе рибозома Е. цуницули има исту структуру као и други еукариотски рибозоми (слика 1д), центар за декодирање се разликује због варијације секвенце на нуклеотиду 1491 (број Е. цоли, слика 1е, ф).Ово запажање је важно јер место декодирања еукариотских рибозома обично садржи остатке Г1408 и А1491 у поређењу са остацима бактеријског типа А1408 и Г1491.Ова варијација лежи у основи различите осетљивости бактеријских и еукариотских рибозома на аминогликозидну породицу рибозомалних антибиотика и других малих молекула који циљају на место декодирања.На месту декодирања рибозома Е. цуницули, остатак А1491 је замењен са У1491, потенцијално стварајући јединствени интерфејс везивања за мале молекуле који циљају ово активно место.Иста варијанта А14901 је такође присутна у другим микроспоридијама као што су П. лоцустае и В. нецатрик, што сугерише да је широко распрострањена међу врстама микроспоридија (слика 1ф).
Пошто су наши узорци рибозома Е. цуницули изоловани из метаболички неактивних спора, тестирали смо крио-ЕМ мапу Е. цуницули за претходно описано везивање рибозома у условима стреса или гладовања.Фактори хибернације 31, 32, 36, 37, 38. Успоредили смо претходно утврђену структуру рибозома у хибернацији са крио-ЕМ мапом рибозома Е. цуницули.За пристајање су коришћени рибозоми С. церевисиае у комплексу са фактором хибернације Стм138, рибозоми скакавца у комплексу са фактором Лсо232 и рибозоми В. нецатрик у комплексу са факторима Мдф1 и Мдф231.Истовремено, пронашли смо густину крио-ЕМ која одговара фактору одмора Мдф1.Слично Мдф1 везивању за рибозом В. нецатрик, Мдф1 се такође везује за рибозом Е. цуницули, где блокира Е место рибозома, вероватно помажући да рибозоми буду доступни када споре паразита постану метаболички неактивне након инактивације тела (Слика 2).).
Мдф1 блокира Е место рибозома, што изгледа помаже у инактивацији рибозома када споре паразита постану метаболички неактивне.У структури рибозома Е. цуницули, открили смо да Мдф1 формира претходно непознат контакт са стаблом рибозома Л1, делом рибозома који олакшава ослобађање деацилиране тРНК из рибозома током синтезе протеина.Ови контакти сугеришу да се Мдф1 одваја од рибозома користећи исти механизам као деацетилирана тРНА, пружајући могуће објашњење како рибозом уклања Мдф1 да би поново активирао синтезу протеина.
Међутим, наша структура је открила непознати контакт између Мдф1 и Л1 ноге рибозома (део рибозома који помаже у ослобађању деацилиране тРНК из рибозома током синтезе протеина).Посебно, Мдф1 користи исте контакте као и лакат сегмент деацилираног тРНА молекула (слика 2).Ово раније непознато молекуларно моделирање показало је да се Мдф1 одваја од рибозома користећи исти механизам као деацетилирана тРНА, што објашњава како рибозом уклања овај фактор хибернације да би поново активирао синтезу протеина.
Приликом конструисања модела рРНК, открили смо да рибозом Е. цуницули има абнормално пресавијене рРНК фрагменте, које смо назвали фузионисана рРНК (слика 3).У рибозомима који обухватају три домена живота, рРНА се савија у структуре у којима се већина база рРНК или упарује и савија једна са другом или у интеракцији са рибозомским протеинима38,39,40.Међутим, у рибозомима Е. цуницули, чини се да рРНК крше овај принцип савијања претварајући неке од својих спирала у несавијене регионе рРНК.
Структура хеликса Х18 25С рРНА у С. церевисиае, В. нецатрик и Е. цуницули.Типично, у рибозомима који обухватају три животна домена, овај линкер се увија у РНК спиралу која садржи 24 до 34 остатка.У микроспоридији, насупрот томе, овај рРНА линкер се постепено редукује на два једноланчана линкера богата уридином који садрже само 12 остатака.Већина ових остатака је изложена растварачима.Слика показује да се чини да паразитска микроспоридија крши опште принципе савијања рРНК, где су базе рРНК обично повезане са другим базама или укључене у интеракције рРНК-протеина.У микроспоридији, неки рРНК фрагменти попримају неповољан набор, при чему бивша спирала рРНК постаје једноланчани фрагмент издужен скоро у правој линији.Присуство ових необичних региона омогућава рРНК микроспоридије да веже удаљене рРНК фрагменте користећи минималан број РНК база.
Најупечатљивији пример ове еволуционе транзиције може се приметити у спирали Х18 25С рРНА (слика 3).Код врста од Е. цоли до људи, базе ове рРНК хеликса садрже 24-32 нуклеотида, формирајући благо неправилну спиралу.У претходно идентификованим рибозомским структурама из В. нецатрик и П. лоцустае,31,32 базе Х18 хеликса су делимично размотане, али је упаривање нуклеотидних база очувано.Међутим, код Е. цуницули овај рРНА фрагмент постаје најкраћи линкери 228УУУГУ232 и 301УУУУУУУУУ307.За разлику од типичних фрагмената рРНК, ови линкери богати уридином се не намотају нити остварују опсежан контакт са рибозомским протеинима.Уместо тога, они усвајају отворене и потпуно несавијене структуре у којима се рРНА ланци протежу скоро равно.Ова растегнута конформација објашњава како Е. цуницули користи само 12 РНК база да попуни празнину од 33 А између Х16 и Х18 рРНА спирала, док је другим врстама потребно најмање двоструко више рРНК база да попуне празнину.
Дакле, можемо показати да су, енергетски неповољним савијањем, паразитске микроспоридија развиле стратегију за склапање чак и оних рРНА сегмената који остају широко очувани међу врстама у три домена живота.Очигледно, акумулацијом мутација које трансформишу рРНА спирале у кратке поли-У линкере, Е. цуницули може да формира необичне рРНК фрагменте који садрже што је могуће мање нуклеотида за лигацију дисталних рРНК фрагмената.Ово помаже да се објасни како је микроспоридија постигла драматично смањење своје основне молекуларне структуре без губитка структурног и функционалног интегритета.
Још једна необична карактеристика рРНК Е. цуницули је појава рРНК без задебљања (слика 4).Избочине су нуклеотиди без базних парова који се извијају из РНК спирале уместо да се крију у њој.Већина рРНА избочина делује као молекуларни адхезив, помажући да се вежу суседни рибозомални протеини или други фрагменти рРНК.Неке од избочина делују као шарке, омогућавајући спирали рРНК да се савија и савија оптимално за продуктивну синтезу протеина 41 .
а Избочина рРНК (нумерација С. церевисиае) је одсутна у структури рибозома Е. цуницули, али је присутна у већини других еукариота б Е. цоли, С. церевисиае, Х. сапиенс и Е. цуницули унутрашњи рибозоми.паразитима недостају многе древне, високо очуване рРНА избочине.Ова задебљања стабилизују структуру рибозома;стога, њихово одсуство у микроспоридији указује на смањену стабилност савијања рРНК код микроспоридијских паразита.Поређење са П стаблима (Л7/Л12 стабљике код бактерија) показује да се губитак рРНА квржица понекад поклапа са појавом нових избочина поред изгубљених кврга.Хеликс Х42 у 23С/28С рРНА има древну избочину (У1206 у Саццхаромицес церевисиае) за коју се процењује да је стара најмање 3,5 милијарди година због своје заштите у три домена живота.Код микроспорије, ова избочина се елиминише.Међутим, поред изгубљеног испупчења појавило се ново испупчење (А1306 код Е. цуницули).
Запањујуће, открили смо да рибозомима Е. цуницули недостаје већина рРНК избочина пронађених код других врста, укључујући више од 30 избочина сачуваних код других еукариота (слика 4а).Овај губитак елиминише многе контакте између рибозомских подјединица и суседних рРНА спирала, понекад стварајући велике шупље шупљине унутар рибозома, чинећи рибозом Е. цуницули порознијим у поређењу са традиционалнијим рибозомима (слика 4б).Значајно, открили смо да је већина ових избочина такође изгубљена у претходно идентификованим структурама рибозома В. нецатрик и П. лоцустае, које су превиђене претходним структурним анализама31,32.
Понекад је губитак рРНА испупчења праћен развојем нових избочина поред изгубљене избочине.На пример, рибосомско П-стабло садржи избочину У1208 (у Саццхаромицес церевисиае) која је преживела од Е. цоли до људи и стога се процењује да је стара 3,5 милијарди година.Током синтезе протеина, ово избочење помаже П стаблу да се креће између отворених и затворених конформација тако да рибозом може да регрутује факторе транслације и достави их на активно место.У рибозомима Е. цуницули ово задебљање је одсутно;међутим, ново задебљање (Г883) које се налази само у три пара база може допринети обнављању оптималне флексибилности П стабла (слика 4ц).
Наши подаци о рРНК без избочина сугеришу да минимизација рРНК није ограничена на губитак рРНК елемената на површини рибозома, већ може укључити и језгро рибозома, стварајући молекуларни дефект специфичан за паразите који није описан у слободним ћелијама.посматрају се живе врсте.
Након моделирања канонских рибосомалних протеина и рРНА, открили смо да конвенционалне рибосомске компоненте не могу да објасне три дела крио-ЕМ слике.Два од ових фрагмената су малих молекула (слика 5, додатна слика 8).Први сегмент је у сендвичу између рибозомалних протеина уЛ15 и еЛ18 на позицији коју обично заузима Ц-терминус еЛ18, који је скраћен код Е. цуницули.Иако не можемо утврдити идентитет овог молекула, величина и облик овог острва густине се добро објашњава присуством молекула спермидина.Његово везивање за рибозом је стабилизовано мутацијама специфичним за микроспоридију у уЛ15 протеинима (Асп51 и Арг56), за које се чини да повећавају афинитет рибозома за овај мали молекул, јер омогућавају уЛ15 да омота мали молекул у рибозомалну структуру.Додатна слика 2).8, додатни подаци 1, 2).
Крио-ЕМ снимак који показује присуство нуклеотида ван рибозе везаних за рибозом Е. цуницули.У рибозому Е. цуницули, овај нуклеотид заузима исто место као нуклеотид 25С рРНА А3186 (нумерација Саццхаромицес церевисиае) у већини других еукариотских рибозома.б У рибозомалној структури Е. цуницули, овај нуклеотид се налази између рибозомалних протеина уЛ9 и еЛ20, чиме се стабилизује контакт између два протеина.анализа очувања секвенце цд еЛ20 међу врстама микроспоридија.Филогенетско стабло врста Мицроспоридиа (ц) и вишеструко поравнање секвенци еЛ20 протеина (д) показују да су остаци који се везују за нуклеотиде Ф170 и К172 очувани у већини типичних микроспоридија, са изузетком С. лопхии, са изузетком раног гранања Мицроспоридиа, који је задржао РНК39Л.е Ова слика показује да су остаци који се везују за нуклеотиде Ф170 и К172 присутни само у еЛ20 високо редукованог генома микроспоридије, али не и код других еукариота.Све у свему, ови подаци сугеришу да су рибозоми Мицроспоридиан развили место везивања нуклеотида које изгледа да везује молекуле АМП и користи их за стабилизацију интеракција протеин-протеин у рибозомалној структури.Висока очуваност овог места везивања код Мицроспоридиа и његово одсуство код других еукариота сугерише да ово место може да обезбеди селективну предност преживљавања за Мицроспоридиа.Дакле, џеп који се везује за нуклеотиде у рибозому микроспоридије не изгледа као дегенерисана карактеристика или крајњи облик деградације рРНК као што је претходно описано, већ је то корисна еволуциона иновација која омогућава рибозому микроспоридије да директно веже мале молекуле, користећи их као молекуларне грађевне блокове.грађевни блокови за рибозоме.Ово откриће чини рибозом микроспоридије јединим рибозомом за који се зна да користи један нуклеотид као свој структурни градивни блок.ф Хипотетички еволуциони пут изведен из везивања нуклеотида.
Друга ниска молекулска густина се налази на интерфејсу између рибозомалних протеина уЛ9 и еЛ30 (слика 5а).Овај интерфејс је претходно описан у структури рибозома Саццхаромицес церевисиае као место везивања за 25С нуклеотид рРНА А3186 (део ЕС39Л рРНА екстензије)38.Показано је да у дегенерисаним рибозомима П. лоцустае ЕС39Л овај интерфејс везује непознати појединачни нуклеотид 31, а претпоставља се да је овај нуклеотид редуковани коначни облик рРНК, у којој је дужина рРНК ~130-230 база.ЕС39Л се редукује на један нуклеотид 32.43.Наше црио-ЕМ слике подржавају идеју да се густина може објаснити нуклеотидима.Међутим, већа резолуција наше структуре показала је да је овај нуклеотид екстрарибозомални молекул, вероватно АМП (слика 5а, б).
Затим смо питали да ли се место везивања нуклеотида појавило у рибозому Е. цуницули или је постојало раније.Пошто је везивање нуклеотида углавном посредовано остацима Пхе170 и Лис172 у рибозомском протеину еЛ30, проценили смо очување ових остатака код 4396 репрезентативних еукариота.Као иу случају уЛ15 изнад, открили смо да су остаци Пхе170 и Лис172 високо конзервирани само у типичној микроспоридији, али одсутни код других еукариота, укључујући атипичне Мицроспоридиа Митоспоридиум и Ампхиамблис, у којима ЕС39Л рРНА фрагмент није редукован (Слика 45, 44ц, Сл. 44ц).-е).
Узети заједно, ови подаци подржавају идеју да су Е. цуницули и могуће друге канонске микроспоридија развиле способност да ефикасно хватају велики број малих метаболита у структури рибозома да би компензовали пад нивоа рРНК и протеина.Чинећи то, развили су јединствену способност везивања нуклеотида изван рибозома, показујући да паразитске молекуларне структуре компензују тако што хватају обиље малих метаболита и користе их као структурне имитације деградиране РНК и фрагмената протеина..
Трећи несимулирани део наше крио-ЕМ мапе, пронађен у великој рибозомалној подјединици.Релативно висока резолуција (2,6 А) наше мапе сугерише да ова густина припада протеинима са јединственим комбинацијама великих остатака бочног ланца, што нам је омогућило да идентификујемо ову густину као раније непознати рибозомални протеин који смо идентификовали као мсЛ2 (протеин Л2 специфичан за микроспоридија) (методе, слика 6).Наша претрага хомологије показала је да је мсЛ2 очуван у клади Мицроспоридиа из рода Енцепхалитер и Ороспоридиум, али одсутан у другим врстама, укључујући друге Мицроспоридиа.У рибозомској структури, мсЛ2 заузима празнину насталу губитком продужене ЕС31Л рРНА.У овој празнини, мсЛ2 помаже у стабилизацији савијања рРНА и може надокнадити губитак ЕС31Л (слика 6).
а Електронска густина и модел рибозомалног протеина мсЛ2 специфичног за Мицроспоридиа који се налази у рибозомима Е. цуницули.б Већина еукариотских рибозома, укључујући 80С рибозом Саццхаромицес церевисиае, има ЕС19Л рРНА амплификацију изгубљену у већини микроспоридијских врста.Претходно утврђена структура рибозома микроспоридија В. нецатрик сугерише да је губитак ЕС19Л код ових паразита надокнађен еволуцијом новог рибозомалног протеина мсЛ1.У овој студији смо открили да је рибозом Е. цуницули такође развио додатни протеин који опонаша рибозомску РНК као очигледну компензацију за губитак ЕС19Л.Међутим, мсЛ2 (тренутно означен као хипотетички протеин ЕЦУ06_1135) и мсЛ1 имају различита структурна и еволуциона порекла.ц Ово откриће генерисања еволуцијски неповезаних мсЛ1 и мсЛ2 рибосомских протеина сугерише да ако рибозоми акумулирају штетне мутације у својој рРНК, могу постићи нивое композиционе разноврсности без преседана чак и у малој подскупини блиско повезаних врста.Ово откриће би могло помоћи да се разјасни порекло и еволуција митохондријалног рибозома, који је познат по својој високо смањеној рРНК и абнормалној варијабилности у саставу протеина међу врстама.
Затим смо упоредили протеин мсЛ2 са претходно описаним протеином мсЛ1, јединим познатим рибозомалним протеином специфичним за микроспоридију који се налази у рибозому В. нецатрик.Желели смо да тестирамо да ли су мсЛ1 и мсЛ2 еволутивно повезани.Наша анализа је показала да мсЛ1 и мсЛ2 заузимају исту шупљину у рибозомској структури, али имају различите примарне и терцијарне структуре, што указује на њихово независно еволуционо порекло (слика 6).Дакле, наше откриће мсЛ2 пружа доказ да групе компактних еукариотских врста могу независно да еволуирају структурно различите рибозомске протеине како би надокнадиле губитак фрагмената рРНА.Овај налаз је значајан по томе што већина цитоплазматских еукариотских рибозома садржи непроменљиви протеин, укључујући исту породицу од 81 рибозомског протеина.Појава мсЛ1 и мсЛ2 у различитим кладама микроспоридије као одговор на губитак проширених сегмената рРНА сугерише да деградација молекуларне архитектуре паразита узрокује да паразити траже компензационе мутације, што на крају може довести до њиховог стицања у различитим популацијама паразита.структуре.
Коначно, када је наш модел завршен, упоредили смо састав рибозома Е. цуницули са оним предвиђеним из секвенце генома.За неколико рибозомалних протеина, укључујући еЛ14, еЛ38, еЛ41 и еС30, раније се сматрало да недостаје у геному Е. цуницули због очигледног одсуства њихових хомолога из генома Е. цуницули.Губитак многих рибосомских протеина такође се предвиђа код већине других високо редукованих интрацелуларних паразита и ендосимбионта.На пример, иако већина слободноживућих бактерија садржи исту фамилију од 54 рибосомска протеина, само 11 од ових породица протеина има детектабилне хомологе у сваком анализираном геному бактерија ограничених на домаћина.У прилог овој идеји, експериментално је примећен губитак рибозомалних протеина код микроспоридије В. нецатрик и П. лоцустае, којима недостају протеини еЛ38 и еЛ4131,32.
Међутим, наше структуре показују да су само еЛ38, еЛ41 и еС30 заправо изгубљени у рибозому Е. цуницули.Протеин еЛ14 је конзервиран и наша структура је показала зашто овај протеин није могао бити пронађен у хомолошкој потрази (слика 7).У рибозомима Е. цуницули, већина места везивања еЛ14 је изгубљена услед деградације ЕС39Л амплифицираног рРНА.У одсуству ЕС39Л, еЛ14 је изгубио већину своје секундарне структуре, а само 18% секвенце еЛ14 је било идентично код Е. цуницули и С. церевисиае.Ово лоше очување секвенце је изванредно јер чак и Саццхаромицес церевисиае и Хомо сапиенс - организми који су еволуирали у размаку од 1,5 милијарди година - деле више од 51% истих остатака у еЛ14.Овај аномални губитак очувања објашњава зашто је Е. цуницули еЛ14 тренутно означен као наводни протеин М970_061160, а не као рибозомални протеин еЛ1427.
и Рибозом Мицроспоридиа је изгубио екстензију ЕС39Л рРНА, што је делимично елиминисало везујуће место за рибозомални протеин еЛ14.У одсуству ЕС39Л, протеин микроспоре еЛ14 подлеже губитку секундарне структуре, у којој се бивши α-хеликс који се везује за рРНА дегенерише у петљу минималне дужине.б Вишеструко поравнање секвенци показује да је протеин еЛ14 високо конзервиран у еукариотским врстама (57% идентичности секвенце између хомолога квасца и човека), али је лоше очуван и дивергентан у микроспоридији (у којој је не више од 24% остатака идентично хомологу еЛ14).од С. церевисиае или Х. сапиенс).Ова лоша очуваност секвенце и варијабилност секундарне структуре објашњава зашто хомолог еЛ14 никада није пронађен у Е. цуницули и зашто се сматра да је овај протеин изгубљен у Е. цуницули.Насупрот томе, Е. цуницули еЛ14 је претходно означен као наводни протеин М970_061160.Ово запажање сугерише да је разноликост генома микроспоридије тренутно прецењена: неки гени за које се тренутно сматра да су изгубљени у микроспоридији су у ствари очувани, иако у високо диференцираним облицима;уместо тога, сматра се да неки кодирају гене микроспоридија за протеине специфичне за црве (нпр. хипотетички протеин М970_061160) заправо кодира веома различите протеине који се налазе у другим еукариотима.
Овај налаз сугерише да денатурација рРНК може довести до драматичног губитка очувања секвенце у суседним рибозомским протеинима, чинећи ове протеине неоткривеним за претрагу хомологије.Дакле, можемо преценити стварни степен молекуларне деградације у малим геномским организмима, пошто неки протеини за које се сматра да су изгубљени заправо опстају, иако у веома измењеним облицима.
Како паразити могу задржати функцију својих молекуларних машина у условима екстремне редукције генома?Наша студија одговара на ово питање описом сложене молекуларне структуре (рибозома) Е. цуницули, организма са једним од најмањих еукариотских генома.
Скоро две деценије је познато да се молекули протеина и РНК у микробним паразитима често разликују од својих хомологних молекула у слободноживућим врстама јер им недостају центри за контролу квалитета, смањени су на 50% своје величине код слободноживућих микроба итд.многе исцрпљујуће мутације које нарушавају савијање и функцију.На пример, очекује се да рибозоми малих геномских организама, укључујући многе интрацелуларне паразите и ендосимбионте, немају неколико рибозомалних протеина и до једне трећине рРНК нуклеотида у поређењу са слободноживућим врстама 27, 29, 30, 49. Међутим, начин на који ови молекули проучавају главни молекули функционишу у главном паразиту који функционишу у генима.
Наша студија показује да структура макромолекула може открити многе аспекте еволуције које је тешко издвојити из традиционалних упоредних геномских студија интрацелуларних паразита и других организама ограничених домаћинима (додатна слика 7).На пример, пример протеина еЛ14 показује да можемо преценити стварни степен деградације молекуларног апарата код паразитских врста.Верује се да енцефалитични паразити имају стотине гена специфичних за микроспоридија.Међутим, наши резултати показују да су неки од ових наизглед специфичних гена заправо само веома различите варијанте гена које су уобичајене код других еукариота.Штавише, пример протеина мсЛ2 показује како превиђамо нове рибозомске протеине и потцењујемо садржај паразитских молекуларних машина.Пример малих молекула показује како можемо превидети најгенијалније иновације у паразитским молекуларним структурама које им могу дати нову биолошку активност.
Узети заједно, ови резултати побољшавају наше разумевање разлика између молекуларних структура организама ограничених домаћинима и њихових колега у организмима слободног живота.Показујемо да молекуларне машине, за које се дуго сматрало да су редуковане, дегенерисане и подложне разним ослабљујућим мутацијама, уместо тога имају скуп систематски занемарених необичних структурних карактеристика.
С друге стране, негломазни рРНА фрагменти и спојени фрагменти које смо пронашли у рибозомима Е. цуницули сугеришу да редукција генома може да промени чак и оне делове основне молекуларне машинерије који су сачувани у три домена живота – после скоро 3,5 милијарди година.независна еволуција врста.
Фрагменти рРНА без испупчења и спојени у рибозомима Е. цуницули су од посебног интереса у светлу претходних студија молекула РНК у ендосимбиотским бактеријама.На пример, у ендосимбионту лисне уши Буцхнера апхидицола, показало се да молекули рРНА и тРНА имају структуре осетљиве на температуру због пристрасности А+Т састава и високог удела неканонских парова база20,50.Сматра се да су ове промене у РНК, као и промене у молекулима протеина, одговорне за прекомерну зависност ендосимбионта од партнера и неспособност ендосимбиона да пренесу топлоту 21, 23 .Иако рРНА паразитске микроспоридије има структурно различите промене, природа ових промена сугерише да смањена термичка стабилност и већа зависност од протеина шаперона могу бити уобичајене карактеристике молекула РНК у организмима са смањеним геномима.
С друге стране, наше структуре показују да су паразитске микроспорије развиле јединствену способност да се одупру широко очуваним рРНК и фрагментима протеина, развијајући способност коришћења обиља и лако доступних малих метаболита као структурних имитација дегенерисаних рРНК и фрагмената протеина.Деградација молекуларне структуре..Ово мишљење поткрепљује чињеница да се мали молекули који надокнађују губитак протеинских фрагмената у рРНК и рибозомима Е. цуницули везују за остатке специфичне за микроспоридију у протеинима уЛ15 и еЛ30.Ово сугерише да везивање малих молекула за рибозоме може бити производ позитивне селекције, у којој су мутације специфичне за микроспоридију у рибозомским протеинима одабране због њихове способности да повећају афинитет рибозома за мале молекуле, што може довести до ефикаснијих рибозомалних организама.Ово откриће открива паметну иновацију у молекуларној структури микробних паразита и даје нам боље разумевање како молекуларне структуре паразита одржавају своју функцију упркос редуктивној еволуцији.
Тренутно, идентификација ових малих молекула остаје нејасна.Није јасно зашто се изглед ових малих молекула у рибозомској структури разликује међу врстама микроспоридија.Посебно, није јасно зашто се везивање нуклеотида примећује у рибозомима Е. цуницули и П. лоцустае, а не у рибозомима В. нецатрик, упркос присуству остатка Ф170 у еЛ20 и К172 протеинима В. нецатрик.Ово брисање може бити узроковано остатком 43 уЛ6 (који се налази поред џепа за везивање нуклеотида), који је тирозин у В. нецатрик, а не треонин у Е. цуницули и П. лоцустае.Крупни ароматични бочни ланац Тир43 може ометати везивање нуклеотида због стеричког преклапања.Алтернативно, привидна делеција нуклеотида може бити последица ниске резолуције крио-ЕМ имиџинга, што отежава моделирање фрагмената рибозома В. нецатрик.
С друге стране, наш рад сугерише да процес пропадања генома може бити инвентивна сила.Посебно, структура рибозома Е. цуницули сугерише да губитак рРНК и фрагмената протеина у рибозому микроспоридија ствара еволуциони притисак који промовише промене у структури рибозома.Ове варијанте се јављају далеко од активног места рибозома и изгледа да помажу у одржавању (или обнављању) оптималног склопа рибозома који би иначе био поремећен смањеном рРНК.Ово сугерише да се чини да је главна иновација рибозома микроспоридије еволуирала у потребу да се ублажи дрифт гена.
Можда ово најбоље илуструје везивање нуклеотида, што до сада никада није примећено код других организама.Чињеница да су остаци који се везују за нуклеотиде присутни у типичним микроспоридијама, али не и у другим еукариотима, сугерише да места за везивање нуклеотида нису само реликвије које чекају да нестану, или коначно место за рРНА да се врати у облик појединачних нуклеотида.Уместо тога, ова страница изгледа као корисна функција која је могла да се развије током неколико кругова позитивне селекције.Места везивања нуклеотида могу бити нуспроизвод природне селекције: када се ЕС39Л разгради, микроспоридије су принуђене да траже компензацију за обнављање оптималне биогенезе рибозома у одсуству ЕС39Л.Пошто овај нуклеотид може да опонаша молекуларне контакте нуклеотида А3186 у ЕС39Л, молекул нуклеотида постаје грађевински блок рибозома, чије се везивање додатно побољшава мутацијом секвенце еЛ30.
Што се тиче молекуларне еволуције интрацелуларних паразита, наша студија показује да силе дарвинистичке природне селекције и генетски дрифт пропадања генома не делују паралелно, већ осцилирају.Прво, генетски дрифт елиминише важне карактеристике биомолекула, чинећи компензацију преко потребном.Тек када паразити задовоље ову потребу Дарвиновском природном селекцијом, њихови макромолекули ће имати прилику да развију своје најимпресивније и најиновативније особине.Важно је да еволуција места везивања нуклеотида у рибозому Е. цуницули сугерише да овај образац молекуларне еволуције између губитка и добијања не само да амортизује штетне мутације, већ понекад даје потпуно нове функције паразитским макромолекулима.
Ова идеја је у складу са теоријом покретне равнотеже Сјуела Рајта, која каже да строг систем природне селекције ограничава способност организама да иновирају51,52,53.Међутим, ако генетски дрифт поремети природну селекцију, ови помаци могу произвести промене које саме по себи нису адаптивне (или чак штетне), али доводе до даљих промена које обезбеђују већу кондицију или нову биолошку активност.Наш оквир подржава ову идеју илуструјући да исти тип мутације која смањује набор и функцију биомолекула изгледа као главни покретач за његово побољшање.У складу са еволуционим моделом на који сви добијају, наша студија показује да је пропадање генома, које се традиционално посматра као дегенеративни процес, такође главни покретач иновација, понекад, а можда чак и често дозвољавајући макромолекулима да стекну нове паразитске активности.могу их користити.