Прикупљање и дистрибуција хранљивих материја интегрише храњење инсеката и карактеристике животног циклуса. Да би надокнадили недостатке одређених хранљивих материја у различитим животним фазама, инсекти могу да добију ове хранљиве материје путем додатне исхране, на пример, храњењем секретима кичмењака у процесу познатом као „барице“. Чини се да је комарац Anopheles arabiani неухрањен и стога му требају хранљиве материје и за метаболизам и за репродукцију. Циљ ове студије био је да се процени да ли агитација An. arabiensis на крављем урину ради прикупљања хранљивих материја побољшава карактеристике животног циклуса.
Уверите се да је безбедно. arabiensis је привлачио мирис свежег, 24-часовног, 72-часовног и 168-часовног крављег урина, а женке које траже домаћина и хране се крвљу (48 сати након оброка крви) мерене су у Y-цевном олфактометру, а трудне женке су процењене за тест мрешћења. Затим је коришћена комбинована хемијска и електрофизиолошка анализа за идентификацију биоактивних једињења у крављем урину у све четири старосне групе. Синтетичке мешавине биоактивних једињења процењене су у Y-цевним и теренским испитивањима. Да би се истражио крављи урин и његово главно једињење које садржи азот, уреа, као потенцијални додатни састојци исхране за векторе маларије, мерени су параметри исхране и карактеристике животног циклуса. Процењен је удео женки комараца и количина апсорбованог крављег урина и урее. Након храњења, женке су процењене на преживљавање, лет у вези са везом и репродукцију.
Траже крв и храну домаћина. У лабораторијским и теренским студијама, Арапе је привукао природни и синтетички мирис свежег и старог крављег урина. Трудне женке су биле равнодушне према реакцијама крављег урина на местима мреста. Женке које траже домаћина и сисају крв активно апсорбују крављи урин и уреу и распоређују ове ресурсе у складу са компромисима током животног века као функцијом физиолошког стања за лет, преживљавање или репродукцију.
Anopheles arabinis прикупља и дистрибуција крављег урина ради побољшања карактеристика животног циклуса. Додатно храњење крављим урином директно утиче на капацитет вектора повећањем дневног преживљавања и густине вектора, а индиректно променом активности лета и стога би требало да се узме у обзир у будућим моделима.
Прикупљање и дистрибуција хранљивих материја интегрише карактеристике исхране инсеката и њиховог животног циклуса [1,2,3]. Инсекти су у стању да бирају и набављају храну и врше компензаторно храњење на основу доступности хране и потреба за хранљивим материјама [1, 3]. Дистрибуција хранљивих материја зависи од животног циклуса и може довести до различитих захтева за квалитетом и количином исхране у различитим животним фазама инсеката [1, 2]. Да би надокнадили недостатке у одређеним хранљивим материјама, инсекти могу да добију ове хранљиве материје путем додатне исхране, као што је блато, разни измет и секрети кичмењака и лешине, процес познат као локве [2]. Иако је првенствено описано много врста лептира и мољаца, рупе за појило се јављају и код других редова инсеката, а привлачење и храњење овим врстама ресурса може имати значајан утицај на здравље и друге особине животног циклуса [2, 4, 5, 6],7]. Маларијски комарац Anopheles gambiae sensu lato (sl) се појављује као „неухрањена“ одрасла јединка [8], тако да заливање може играти важну улогу у његовим карактеристикама животног циклуса, али ово понашање је до сада било занемарено. Употреба агитације као средства за повећање уноса хранљивих материја у овом важном возилу заслужује пажњу јер може имати важне епидемиолошке последице.
Унос азота код одраслих женки комараца Anopheles је ограничен због ниских калоријских резерви које носе из ларвалне фазе и неефикасног коришћења крвног брашна [9]. Женка Ann.gambiae sl обично компензује ово допуњавањем додатним крвним оброцима [10, 11], чиме се више људи излаже ризику од оболевања од болести и комарци су у већем ризику од предатора. Алтернативно, комарци могу користити додатно храњење излучевинама кичмењака како би стекли азотна једињења која побољшавају адаптацију и маневарску способност лета, као што су показали други инсекти [2]. У том смислу, занимљива је снажна и изразита привлачност једне од сродних врста унутар гамбијског комплекса врста An. Гамбијски sl, Anopheles arabinis, свежег и старог крављег урина [12,13,14]. Anopheles arabinis је опортунистички у својим преференцијама домаћина и познато је да се повезује са стоком и храни се њоме. Крављи урин је ресурс богат азотним једињењима, при чему уреа чини 50-95% укупног азота у свежем урину [15, 16]. Како крављи урин стари, Микроорганизми користе ове ресурсе да би смањили сложеност азотних једињења у року од 24 сата [15]. Са брзим повећањем амонијака, повезаним са смањењем органског азота, алкалофилни микроорганизми (од којих многи производе једињења токсична за комарце) напредују [15], што може бити женка Ann.arabiensis коју преференцијално привлачи урин стар 24 сата или мање [13, 14].
У овој студији, тражене су животиње домаћина и животиње храњене крвљу. Током свог првог циклуса гонадотропина, arabiensis је процењен на усвајање азотних једињења, укључујући уреу, мешањем урина. Затим је спроведен низ експеримената како би се проценило како женке комараца распоређују овај потенцијални хранљиви ресурс за побољшано преживљавање, размножавање и даље тражење хране. Коначно, процењен је мирис свежег и старог крављег урина како би се утврдило да ли они пружају поуздане трагове за животиње домаћина и животиње храњене крвљу. У својој потрази за овим потенцијалним хранљивим ресурсом, arabiensis је открио хемијске корелације иза уочене различите атрактивности. Синтетичке мешавине мириса испарљивих органских једињења (ВОЦ) идентификоване у урину старом 24 сата даље су процењене у теренским условима, проширујући резултате добијене у лабораторијским условима и демонстрирајући ефекат мириса говеђег урина на различита физиолошка стања. Привлачност комараца. Добијени резултати потврђују да An. arabiensis стиче и дистрибуира азотна једињења која се налазе у урину кичмењака како би утицала на карактеристике животног циклуса. Ови резултати се разматрају у контексту потенцијалних епидемиолошких последица и како се могу користити за надзор и контролу вектора.
Њенке Anopheles arabicans (сој Dongola) су одржаване на температури од 25 ± 2 °C, 65 ± 5% релативне влажности и циклусу светлост:там од 12:12 сати. Ларве су узгајане у пластичним посудама (20 цм × 18 цм × 7 цм) напуњеним дестилованом водом и храњене рибљом храном Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Лутке су сакупљене у шоље од 30 мл (Nolato Hertila, Åstorp, SE), а затим пребачене у Bugdorm кавезе (30 цм × 30 цм × 30 цм; MegaView Science, Taichung, Taiwan) како би се омогућило излазак одраслих јединки. Одрасле јединке су добијале 10% раствор сахарозе ad libitum до 4 дана након избијања (dpe), када је женкама које траже домаћина понуђена храна непосредно пре експеримента или су гладовале преко ноћи са дестилованом водом пре експеримента, као што је описано у наставку. Женке коришћене за експерименте са летним цевима су гладовале само 4-6 сати са водом ad libitum. Да би се припремили комарци који сишу крв за наредне биолошке тестове, 4 женке dpe су добиле дефибротичну овчију крв (Håtunalab, Bro, SE) коришћењем система за мембранско храњење (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Потпуно загушене женке су затим пребачене у појединачне кавезе и директно су добијале храну, као што је описано у наставку, или 10% сахарозу ad libitum током 3 дана пре експеримената описаних у наставку. Последње женке су коришћене за биолошке тестове у епруветама за летење и пребачене у лабораторију, а затим су добијале дестиловану воду ad libitum током 4-6 сати пре експеримента.
Тестови храњења коришћени су за квантификацију потрошње урина и урее код одраслих женки арапске расе. Женке које траже домаћина и храњене крвљу добијале су исхрану која је садржала 1% разблаженог свежег и старог крављег урина, различите концентрације урее и две контролне групе (10% сахарозе и воде) током 48 сати. Поред тога, у исхрану је додата прехрамбена боја (1 мг мл-1 ксилен цијанид FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стокхолм, СЕ) и испоручена у матрици 4 × 4 у микроцентрифужним епруветама од 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Слика 1A) Напуните до ивице (~300 µl). Да бисте избегли конкуренцију између комараца и потенцијалне ефекте боје, ставите 10 комараца у велику Петријеву шољу (пречника 12 цм и висине 6 цм; Semadeni, Ostermundigen, CH; Слика 1A) у потпуном мраку на 25 ± 2 цм °C и релативној влажности 65 ± 5%. Ови експерименти поновљени су 5 до 10 пута. Након излагања исхрани, комарци су смештени на -20 °C до даље анализе.
Потражите говеђи урин и уреу које апсорбују домаћин и женка Anopheles arabianus која сиса крв. У пробном исхрани (А), женкама комараца је дата исхрана која се састојала од свежег и зрелог крављег урина, различитих концентрација урее, сахарозе (10%) и дестиловане воде (H2O). Женке које траже домаћина (B) и женке које се хране крвљу (C) апсорбовале су више сахарозе него било која друга тестирана исхрана. Треба напоменути да су женке које траже домаћина апсорбовале 72-часовни крављи урин мање од 168-часовног крављег урина (B). Просечан укупни садржај азота (± стандардна девијација) урина је представљен на уметку. Женке које траже домаћина (D, F) и женке које сисају крв (E, G) апсорбују уреу на начин зависан од дозе. Просечне удисане запремине (D, E) са различитим словима значајно су се разликовале једна од друге (једносмерна ANOVA коришћењем Тукијеве пост хок анализе; p < 0,05). Грешке представљају стандардну грешку средње вредности (BE). Испрекидана линија представља логаритамско-линеарну регресијску линију (F, G).
Да би се ослободила апсорбована храна, комарци су појединачно стављани у микроцентрифужне епрувете од 1,5 мл које су садржале 230 µл дестиловане воде, а ткиво је разбијено помоћу тучка за једнократну употребу и бежичног мотора (VWR International, Лунд, СЕ), након чега је уследило центрифугирање на 10 крпм током 10 минута. Супернатант (200 µл) је пребачен на микроплочу са 96 бунарића (Sigma-Aldrich) и апсорбанција (λ620) је одређена помоћу читача микроплоча на бази спектрофотометра (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ортенберг, ДЕ) нм. Алтернативно, комарци су млевени у 1 мл дестиловане воде, од чега је 900 µл пребачено у кивету за спектрофотометријску анализу (λ620 нм; UV 1800, Shimadzu, Киста, СЕ). Да би се квантификовао унос хране, стандардна крива је припремљена серијским разблаживањем да би се добило од 0,2 µл до 2,4 µл ксилена од 1 мг мл-1. цијанид. Затим је оптичка густина познатих концентрација боје коришћена за одређивање количине хране коју је сваки комарац прогутао.
Подаци о запремини анализирани су једнофакторском анализом варијансе (ANOVA), након чега су уследила Тукијева пост хок парна поређења (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Линеарне регресионе анализе описале су унос урее зависан од концентрације и упоредиле одговоре између комараца који траже домаћина и комараца који сишу крв (GraphPad Prism v8.0.0 за Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Приближно 20 µl узорака урина из сваке старосне групе везано је за Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) и капсулирано у лимене капсуле (8 mm × 5 mm). Капсуле су уметнуте у комору за сагоревање CHNS/O анализатора (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САД) да би се одредио садржај азота у свежем и старом урину према протоколу произвођача. Укупни азот (g N l-1) је квантификован на основу познатих концентрација урее које се користе као стандард.
Да би се проценио утицај исхране на преживљавање женки које траже домаћина и сишу крв, комарци су појединачно смештени у велике Петријеве шоље (пречника 12 цм и висине 6 цм; Семадени) са отвором прекривеним мрежицом на поклопцу (пречника 3 цм) ради вентилације и снабдевања храном. Дијета је дата директно након 4 дана након отклањања инфекције и укључивала је 1% разблаженог свежег и старог крављег урина, четири концентрације урее и две контроле, 10% сахарозе и воде. Свака дијета је пипетирана на стоматолошки тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) уметнут у шприц од 5 мл (Thermo Fisher Scientific, Гетеборг, SE), клип је уклоњен и постављен на врх Петријеве шоље (слика 1).1А). Мењајте исхрану сваког дана. Одржавајте лабораторију као што је горе описано. Преживели комарци су бројани два пута дневно, док су мртви комарци одбачени док последњи комарац није угинуо (n = 40 по третману). Преживљавање комараца храњених различитим дијетама је статистички анализирано коришћењем Каплан-Мајерових кривих преживљавања и лог-ранк тестова. да се упореде расподела преживљавања између дијета (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Прилагођени летећи млин за комарце заснован на Атисану и др. [17], направљен од провидних акрилних панела дебљине 5 мм (ширине 10 цм x дужине 10 цм x висине 10 цм) без предњег и задњег панела (Сл. 3: горе). Окретни склоп са вертикалном цеви направљеном од колоне за гасну хроматографију (унутрашњи пречник 0,25 мм; дужине 7,5 цм) са крајевима залепљеним за иглу за инсекте окачену између пара неодимијумских магнета удаљених 9 цм. Хоризонтална цев направљена од истог материјала (дужине 6,5 цм) пресецала је вертикалну цев како би формирала повезану руку и руку која је носила мали комад алуминијумске фолије као сигнал за прекидање светлости.
Женке које су гладовале 24 сата добијале су горе наведену исхрану 30 минута пре ограничавања. Потпуно храњене женке комараца су затим појединачно анестезиране на леду 2-3 минута и причвршћене за игле за инсекте пчелињим воском (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а затим везане за кракове хоризонталних цеви. Летећи млин. Обртаји по лету су забележени помоћу посебно направљеног уређаја за бележење података, а затим сачувани и приказани помоћу софтвера PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Летећи млин је смештен у просторију са регулисаном климом (12 h:12 h, светло:там, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% релативне влажности).
Да би се визуализовао образац активности лета, укупна пређена удаљеност (м) и укупан број узастопних активности лета израчунати су по сату током периода од 24 сата. Поред тога, просечне пређене удаљености појединачних женки упоређене су између третмана и анализиране коришћењем једносмерне ANOVA и Тукијеве пост хок анализе (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), где је просечна удаљеност сматрана зависном променљивом, док је третман независни фактор. Поред тога, просечан број рунди израчунава се у корацима од 10 минута.
Да би се проценио утицај исхране на репродуктивне перформансе An.arabiensis, шест женки (4 дпе) је директно пребачено у Bugdorm кавезе (30 цм × 30 цм × 30 цм) након узимања крви, а затим им је обезбеђена експериментална исхрана током 48 сати као што је горе описано. Исхрана је затим уклоњена, а посуде за мрест (30 мл; Nolato Hertila) напуњене са 20 мл дестиловане воде су обезбеђене трећег дана током 48 сати, мењајући их свака 24 сата. Сваки режим исхране поновити 20-50 пута. Јаја су пребројана и забележена за сваки експериментални кавез. Подузорци јаја су коришћени за процену средње величине и варијације дужине појединачних јаја (n ≥ 200 по исхрани) коришћењем Dialux-20 микроскопа (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) опремљеног Leica камером (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Немачка). Преостала јаја су држана у климатски контролисаној просторији под стандардним условима узгоја током 24 сата, а подузорак недавно излеглих ларви првог инстара (n ≥ 200 по исхрани) је мерен, као што је горе описано. Број јаја и величина јаја и ларви су упоређени између третмана коришћењем једносмерне ANOVA и Тукијеве пост хок анализе (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Испарљиве материје из свежег (1 сат након узорковања), урина старог 24 сата, 72 сата и 168 сати прикупљене су из узорака прикупљених од говеда раса Зебу и Арси. Ради лакшег сналажења, узорци урина су прикупљени рано ујутру док су краве још биле у штали. Узорци урина су прикупљени од 10 јединки и 100-200 мл сваког узорка је пребачено у појединачне полиамидне кесе за печење (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Минден, Немачка) у полиамидним бурадима од 3 литра са поклопцем у винилхлоридним пластичним бурадима. Испарљиве материје из сваког узорка говеђег урина су прикупљене или директно (свеже) или након сазревања на собној температури током 24 сата, 72 сата и 168 сати, тј. сваки узорак урина је био репрезентативан за сваку старосну групу.
За сакупљање испарљивих материја у простору над атмосфером (headspace), коришћен је систем затворене петље за циркулацију гаса филтрираног активним угљем (100 ml min-1) кроз полиамидну кесу до адсорпционе колоне током 2,5 сата коришћењем дијафрагмалне вакуум пумпе (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Као контрола, сакупљање у простору над атмосфером је извршено из празне полиамидне кесе. Адсорпциона колона је направљена од тефлонске цеви (5,5 cm x 3 mm унутрашњи пречник) која садржи 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) између чепова од стаклене вуне. Пре употребе, колона је испрана са 1 ml редестилованог n-хексана (Merck, Darmstadt, DE) и 1 ml пентана (99,0% чистог растварача, GC квалитета, Sigma Aldrich). Адсорбоване испарљиве материје су елуиране са 400 μl пентана. Колекције у простору над атмосфером су сакупљене, а затим чуване на -20°C до употребе за даљу анализу.
Бихејвиоралне реакције An-а који траже домаћина и једу крв. Испарљиви екстракти из хеадспацеа сакупљени из свежег, 24-часовног, 72-часовног и 168-часовног урина анализирани су на испарљиве екстракте комараца Arabidopsis коришћењем олфактометра са равном стакленом цеви [18]. Експерименти су спроведени током ЗТ 13-15, периода врхунца активности An-а у потрази за домаћином. Arab [19]. Олфактометр са стакленом цеви (80 цм × 9,5 цм унутрашњег пречника) осветљен је са 3 ± 1 lx црвене светлости одозго. Проток ваздуха филтриран угљем и влажен (25 ± 2 °C, 65 ± 2% релативне влажности) прошао је биолошки тест брзином од 30 цм с-1. Ваздух се пропушта кроз низ мрежастих сита од нерђајућег челика, стварајући ламинарни ток и једноличну структуру перја. Диспензер за стоматолошке тампоне (4 цм × 1 цм; Л:Д; DAB Dental AB), окачен на калем од 5 цм на крају окренутом ка ветру... олфактометром, са променом стимулатора сваких 5 минута. За анализу, 10 μл сваког екстракта из простора у хедспејсу, разблаженог 1:10, коришћено је као стимулус. Једнака количина пентана коришћена је као контрола. Појединачни комарци који траже домаћина или сишу крв смештени су у појединачне кавезе за ослобађање 2-3 сата пре почетка експеримента. Кавез за ослобађање је постављен на страну олфактометра низ ветар, а комарцима је остављено да се аклиматизују 1 минут, а затим је отворен лептир вентил кавеза ради ослобађања. Привлачност према третману или контроли анализирана је као удео комараца који су дошли у контакт са извором у року од 5 минута од ослобађања. Сваки испарљиви екстракт из простора у хедспејсу и контрола су реплицирани најмање 30 пута, а да би се избегли ефекти било ког једног дана, исти број третмана и контрола је тестиран сваког експерименталног дана. Одговори на тражење од домаћина и Ans храњених крвљу. Арапски у односу на скупове из простора у хедспејсу анализирани су коришћењем номиналне логистичке регресије, након чега су уследила парна поређења за односе непарности (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Ан-ова реакција на мрест. Екстракти из простора над точковима из свежег и старог крављег урина анализирани су у Bugdorm кавезима (30 цм × 30 цм × 30 цм; MegaView Science). Пластичне чаше (30 мл; Nolato Hertila) напуњене са 20 мл дестиловане воде служиле су као супстрат за мрест и постављене су у супротне углове кавеза, на растојању од 24 цм. Чаше за третман су подешене са 10 μл сваког екстракта из простора над точковима у разблажењу 1:10. Једнака количина пентана је коришћена за подешавање контролне чаше. Чаше за третман и контролне чаше су замењене између сваког експеримента како би се контролисали ефекти положаја. Десет женки храњених крвљу пуштено је у експерименталне кавезе у ZT 9-11, а јаја у чашама су пребројана 24 сата касније. Формула за израчунавање индекса мреста је: (број јаја положених у чаши за третман – број јаја положених у контролној чаши) / (укупан број положених јаја). Сваки третман је поновљен 8 пута.
Анализа гасном хроматографијом и детекцијом електронског антенског дијаграма (GC-EAD) женки An.arabiensis је извршена као што је претходно описано [20]. Укратко, свежи испарљиви екстракти из хемијског простора су одвојени коришћењем Agilent Technologies 6890 GC (Санта Клара, Калифорнија, САД) опремљеног HP-5 колоном (30 m × 0,25 mm унутрашњи пречник, дебљина филма 0,25 μm, Agilent Technologies). и старење урина. Водоник је коришћен као мобилна фаза са просечном линеарном брзином протока од 45 цм с-1. Сваки узорак (2 μl) је убризган 30 секунди у режиму без раздвајања са улазном температуром од 225 °C. Температура GC пећи је програмирана од 35 °C (задржавање 3 минута) до 300 °C (задржавање 10 минута) на 10 °C min-1. У разделитељу отпадне воде GC, додато је 4 psi азота и раздвојено 1:1 у Gerstel 3D/2 укрштању са малом мртвом запремином (Gerstel, Mülheim, DE) између детектора пламене јонизације и електроакумулаторног детектора (EAD). Капиларна течност за отпадну воду GC за EAD је пропуштена кроз Gerstel ODP-2 преносну линију, која прати температуру GC пећи плус 5 °C, у стаклену цев (10 cm × 8 mm), где је помешана са ваздухом филтрираним угљеником, влажним (1,5 l min-1). Антена је постављена 0,5 cm од излаз цеви. Сваки појединачни комарац представљао је једну репликацију, а за комарце који траже домаћина, најмање три репликације су извршене на узорцима урина сваке старости.
Идентификација биоактивних једињења у колекцијама свежег и старог говеђег урина у хеадспацеу коришћењем комбинованог ГЦ и масеног спектрометра (ГЦ-МС; 6890 ГЦ и 5975 МС; Агилент Тецхнологиес) за изазивање антенских одговора у ГЦ-ЕАД анализи, радећи у режиму јонизације електронским ударом на 70 eV. ГЦ је био опремљен капиларном колоном од фузионог силицијум диоксида обложеном HP-5MS UI (унутрашњи пречник 60 м × 0,25 мм, дебљина филма 0,25 μм) користећи хелијум као мобилну фазу са просечном линеарном брзином протока од 35 цм с-1. Узорак од 2 μл је убризган коришћењем истих подешавања ињектора и температуре пећи као за ГЦ-ЕАД анализу. Једињења су идентификована на основу њиховог времена задржавања (Коватов индекс) и масених спектара у поређењу са прилагођеном библиотеком и NIST14 библиотеком (Агилент). Идентификована једињења су потврђена убризгавањем аутентичних стандарда (Додатна датотека 1: Табела С2). За квантификацију, хептил ацетат (10 нг, 99,8% хемијске чистоће, Aldrich) је убризган као спољни стандард.
Процена ефикасности синтетичке мешавине мириса која се састоји од биоактивних једињења идентификованих у свежем и старом урину, како би се привукле врсте Ans.arabiensis које траже домаћина и које сишу крв, користећи исти олфактометар и протокол као горе. Синтетичке смеше су опонашале састав и пропорције једињења у мешаним испарљивим екстрактима из простора над земљом свежег, 24-часовног, 48-часовног, 72-часовног и 168-часовног урина (Слика 5D-G; Додатна датотека 1: Табела S2). За анализу, користите 10 μl разблажења 1:100 потпуно синтетичке смеше, са укупном брзином ослобађања у распону од приближно 140-2400 ng h-1, за процену атрактивности за домаћина и комарце који сишу крв. Након тога, тест се изводи на комплетним смешама, у којима се уклањају субтрактивне смеше појединачних једињења комплетне смеше. Одговори на тражење од домаћина и Ans. који су се хранили крвљу. Арабске у односу на синтетичке и субтрактивне смеше анализиране су коришћењем номиналне логистичке регресије, након чега су уследила парна поређења за односе непарности (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Да би се проценило да ли крављи урин може послужити као знак станишта домаћина за маларијске комарце, свеж и стар крављи урин, сакупљен као што је горе описано, и вода су стављени у мрежасте канте од 3 л (100 мл) и постављени у замке за мамац домаћина. (BG-HDT верзија; BioGents, Регензбург, Немачка). Десет замки постављено је на удаљености од 50 м на пашњаку, 400 м од сеоске заједнице (Силај, Етиопија, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) и без стоке, на сталним местима за размножавање и селима. Пет замки је загрејано да би се симулирало присуство домаћина, док је пет замки остављено негрејано. Свака локација третмана се ротира сваке ноћи укупно пет ноћи. Број комараца ухваћених у замкама са мамацима од урина различите старости упоређен је коришћењем логистичке регресије са бета биномном расподелом (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
У селу у близини града Маки, регион Оромија, Етиопија, ендемском за маларију (8° 11′ 08″ с.ш., 38° 81′ 70″ и.д.). Студија је спроведена између средине августа и средине септембра пре годишњег прскања резидуалним инсектицидима у затвореном простору, уз дугу кишну сезону. За студију је одабрано пет пари кућа (удаљених 20–50 м) које се налазе на ободу села (слика 6А). Критеријуми који су коришћени за избор кућа били су: животиње нису дозвољене у кући, кување у затвореном простору (вучење огревног дрвета или ћумура) није било дозвољено (барем током пробног периода) и куће са највише два становника, које спавају у неинсектицидним просторијама. испод третиране мреже против комараца. Етичко одобрење је дао Одбор за институционалну ревизију етике истраживања (IRB/022/2016) Природно-математичког факултета (CNS-IRB), Универзитета у Адис Абеби, у складу са смерницама које је утврдила Хелсиншка декларација Светског медицинског удружења. Сагласност сваког старешине домаћинства добијена је уз помоћ особља за здравствене савете. Читав процес је подржан од стране локалних администрација на нивоу округа и одељења („кебеле“). Експериментални дизајн је пратио латински квадратни дизајн 2 × 2, у коме су синтетичке смеше и контроле додељене упареним кућама прве ноћи и замењене између кућа следеће експерименталне ноћи. Овај процес је поновљен десет пута. Поред тога, да би се проценила активност комараца у одабраним кућама, CDC замке су подешене да раде пет узастопних ноћи на почетку, средини и крају теренског испитивања у исто доба дана.
Синтетичка смеша која садржи шест биоактивних једињења растворена је у хептану (97,0% растварач GC квалитета, Sigma Aldrich) и ослобађана брзином од 140 нг х-1 помоћу дозатора са памучним фитиљем [20]. Дозатор са фитиљем је омогућио да се сва једињења ослобађају у константним пропорцијама током 12-часовног експеримента. Хептан је коришћен као контрола. Бочица је окачена поред улазне тачке светлосне замке Центра за контролу и превенцију болести (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; Слика 6А). Замке су окачене 0,8 – 1 м изнад земље, близу подножја кревета, а добровољац је спавао испод нетретиране мреже против комараца и радио је између 18:00 и 06:30. Комарци ухваћени по полу и физиолошком статусу (нехрањени, храњени, полутрудноће и трудне [21]) су потом прегледани помоћу анализе ланчане реакције полимеразе (PCR) како би се идентификовале врсте морфолошки идентификоване као A. gambiae sl. Чланови комплекса [23]. На терену У овој студији, хватање упарених кућа помоћу замки анализирано је коришћењем номиналног логистичког модела уклапања, где је привлачење била зависна променљива, а третман (синтетичка смеша наспрам контроле) био је фиксни ефекат (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Овде извештавамо о χ2 и p-вредностима ​​из теста односа вероватноће.
Процените да ли је безбедно. arabiensis је био у стању да добије урин, свој главни извор азота, уреу, директним храњењем, у року од 48 сати од примене током 4 дана након (dpe) испитивања храњења женки које траже домаћина и женки које су се храниле крвљу (Сл. 1А). И женке које траже домаћина и женке које сисају крв апсорбовале су значајно више сахарозе него било која друга дијета или вода (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 и F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, респективно; Сл. 1Б,Ц). Штавише, женке које траже домаћина јеле су мање урина након 72 сата у поређењу са урином након 168 сати (Сл. 1Б). Када им је понуђена дијета која садржи уреу, женке које траже домаћина апсорбовале су значајно већу количину урее при 2,69 mM у поређењу са свим другим концентрацијама и водом, док су биле нераздвојиве од 10% сахарозе (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Слика 1Д). Ово је било у супротности са одговором женки храњених крвљу, које су обично апсорбовале значајно више хране која садржи уреу него воде, иако значајно мање од 10% сахарозе (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Слика 1).1Е). Штавише, када се упореде два физиолошка стања, флеботомизоване женке су апсорбовале више урее од женки које траже домаћина при најнижим концентрацијама, а ове женке су апсорбовале сличне количине урее при вишим концентрацијама (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Слика 1Ф, Г). Иако је унос из хране која садржи уреу изгледа имао оптималне вредности (Слика 1Д, Е), женке у оба физиолошка стања су биле у стању да модулирају количину апсорбоване урее у целом опсегу концентрација урее на лог-линеаран начин (Слика 1Ф, Г). Слично томе, комарци изгледа контролишу унос азота регулисањем количине апсорбованог урина, јер се количина азота у урину одражава на апсорбовану количину (уметци на слици 1Б, Ц и Б).
Да би се проценили ефекти урина и урее на преживљавање комараца који траже домаћина и који сишу крв, женке су храњене урином свих четири узраста (свежим, 24 сата, 72 сата и 168 сати након депозиције), а распон концентрација урее, као и дестилована вода и 10% сахароза служили су као контрола (Слика 2А). Ова анализа преживљавања показала је да исхрана има значајан утицај на укупно преживљавање код женки које траже домаћина (урин: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; уреа: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Слика 2Б, Ц) и женки које су се храниле крвљу (урин: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; уреа: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Слика 2Д,Е). У свим експериментима, женке храњене исхраном од урина, урее и воде имале су значајно ниже стопе преживљавања у поређењу са женкама храњеним исхраном сахарозе (Слика 2Б-Е). Женке које траже домаћина, храњене свежим и устајалим урином, показале су различите стопе преживљавања, при чему су оне храњене 72-часовним устајалим урином (p = 0,016) имале најмању вероватноћу преживљавања (Слика 2Б). Штавише, женке које траже домаћина, храњене 135 mM уреом, преживеле су дуже од контролне групе која је примала воду (p < 0,04) (Слика 2Ц). У поређењу са водом, жене храњене свежим урином и 24-часовним урином преживеле су дуже (p = 0,001 и p = 0,012, респективно; Слика 2Д), док су жене храњене 72-часовним урином преживеле дуже од оних које су храњене кратким свежим урином и 24-часовним урином (p < 0,0001 и p = 0,013, респективно; Слика 2Д). Када су храњене 135 mM уреом, Женке храњене крвљу преживеле су дуже од свих осталих концентрација урее и воде (p < 0,013; Слика 2Е).
Преживљавање домаћина и женки Anopheles arabinis које сишу крв, хранећи се крављим урином и уреом. У биолошком тесту (А), женкама комараца је дата исхрана која се састојала од свежег и зрелог крављег урина, различитих концентрација урее, сахарозе (10%) и дестиловане воде (H2O). Преживљавање комараца који траже домаћина (B, C) и комараца који сишу крв (D, E) бележено је сваких 12 сати док све женке које су се храниле урином (B, D) и уреом (C, E), и контролне, сахароза и вода, нису угинуле.
Укупна удаљеност и број кругова одређених у тесту лета током периода од 24 сата разликовали су се између комараца који траже домаћина и комараца који сишу крв, који су показали мању укупну активност лета (Сл. 3). Комарци који траже домаћина и који су давали свеж и стар урин или сахарозу и воду показали су различите обрасце лета (Сл. 3), при чему су женке које су се храниле свежим урином биле активније у зору, док су оне које су се храниле 24 и 168 сати старим урином. Комарци који су се хранили урином показали су различите обрасце лета и били су првенствено дневни. Женке комараца које су давале сахарозу или 72-часовни урин показале су активност током целог 24-часовног периода, док су женке које су давале воду биле активније током средине периода. Комарци који су се хранили сахарозом показали су највиши ниво активности касно ноћу и рано ујутру, док су они који су уносили 72-часовни урин доживели сталан пад активности током 24 сата (Слика 3).
Летачке перформансе женки Anopheles arabinis које сишу крв и траже ловце, хранећи се крављим урином и уреом. У тесту лета, женке комараца које су се храниле свежим и старим крављим урином, различитим концентрацијама урее, сахарозе (10%) и дестиловане воде (H2O) биле су везане за хоризонталне, слободно ротирајуће кракове (горе). За женке које траже домаћина (лево) и женке које сишу крв (десно), забележена је укупна удаљеност и број летова на сат за сваку исхрану током периода од 24 сата (тамно: сиво; светло: бело). Просечна удаљеност и просечан број налета приказани су десно од графикона циркадијалне активности. Грешке представљају стандардну грешку средње вредности. Статистичка анализа, видети текст.
Генерално, укупна активност лета женки које траже домаћина пратила је образац сличан оном пређене удаљености током периода од 24 сата. На просечну удаљеност лета значајно је утицала унета исхрана (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), а женке које траже домаћина, а које су унеле 72 сата урина, прелетеле су знатно веће удаљености у поређењу са свим осталим исхранама (p < 0,0001), а комарци храњени сахарозом летели су дуже од комараца храњених свежим (p = 0,022) и 24 сата старим урином (p = 0,022). За разлику од обрасца активности лета описаног исхраном урином, женке које траже домаћина храњене уреом показале су перзистентну активност лета током периода од 24 сата, достижући врхунац током друге половине мрачне фазе (Слика 3). Иако су обрасци активности били слични, женке које траже домаћина храњене уреом значајно су повећале просечну удаљеност лета у зависности од апсорбоване концентрације (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Женке које траже домаћина храњене било којом концентрацијом урее летеле су дуже од женки храњених водом или сахарозом (p < 0,03).
Укупна активност лета крвосисајућих комараца била је стабилна и одржана током 24 сата у свим дијетама, са повећаном активношћу урина током друге половине мрачног периода код женки храњених водом, као и код женки храњених свежом водом и женки старих 24 сата (слика 3). Док је исхрана урином значајно утицала на просечну удаљеност лета код женки храњених крвљу (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), исхрана уреом није (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) са другим урином и контролном исхраном (свежа, p = 0,0091; 72 сата, p = 0,0022; 168 сати, p = 0,001; сахароза, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Ефекти храњења урином и уреом на репродуктивне параметре процењени су биолошким тестовима полагања јаја (слика 4А) и испитивани су према броју јаја које је положила свака женка, величини јаја и новоизлеглим ларвама првог инстара. Број положених јаја. Женке арапског порекла храњене урином варирале су у зависности од исхране (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; слика 4Б). Женке храњене 24-часовним урином и крвним оброком положиле су значајно више јаја од женки храњених другим дијетама са урином и биле су сличне онима храњеним сахарозом (слика 4Б). Слично томе, величина јаја која су положиле женке храњене урином варирала је у зависности од исхране (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), при чему су женке храњене 24-часовним урином и сахарозом полагале значајно већа јаја од женки храњених водом, док су јаја женки храњене са 168 сати урина била значајно мања (слика 4Ц). Поред тога, исхрана урином значајно је утицала на величину ларви (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), са значајно већим ларвама које излазе из јаја које су положиле женке старе 24 и 72 сата храњене урином него из јаја која су положиле ларве јаја. Женке храњене водом и 168 сати храњене урином (Слика 4Д).
Репродуктивне перформансе женки Anopheles arabinis које се хране крављим урином и уреом. Женке комараца храњене крвљу храњене су дијетама које се састоје од свежег и старог крављег урина, различитих концентрација урее, сахарозе (10%) и дестиловане воде (H2O) током 48 сати пре стављања у биолошке тестове и добијања супстрата за полагање јаја 48 сати (A). Број јаја (B, E), величина јаја (C, F) и величина ларви (D, G) били су значајно погођени обезбеђеном дијетом (крављи урин: BD; уреа: EG). Средње вредности за сваки параметар мерене коришћењем различитих словних назива биле су значајно различите једна од друге (једносмерна ANOVA коришћењем Tukey-јеве post hoc анализе; p < 0,05). Грешке представљају стандардну грешку средње вредности.
Као главна азотна компонента урина, уреа, када је дата као дијета женкама храњеним крвљу, значајно је утицала на репродуктивне параметре у свим студијама. Број јаја које су положиле женке храњене уреом, након оброка крвљу, у зависности од концентрације урее (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), женке храњене концентрацијама урее између 134 µM и 1,34 mM положиле су више јаја (слика 4Е). Женке храњене концентрацијама урее од 134 µM или више положиле су већа јаја од женки храњених водом (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; слика 4F), а величина ларви, иако је била под утицајем сличних концентрација урее код мајки (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), била је варијабилнија (слика 4G).
Укупна привлачност за испарљиве екстракте из простора над говеђим урином који траже домаћина. На врсту *arabiensis* процењену у олфактометру са стакленом цеви (слика 5А) значајно је утицала старост урина (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; слика 5Б). Пост хок анализа је показала да је мирис устајалог урина након 24 сата изазвао значајно већи ниво привлачности у поређењу са свим другим третманима (72 сата: p = 0,0060, 168 сати: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), осим мириса свежег урина (p = 0,13; слика 5Б). Иако се укупна привлачност комараца који сишу крв према мирису урина није значајно разликовала (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; слика 5Ц), утврђено је да су ове женке значајно привлачније за испарљиве екстракте из простора над говеђим урином у поређењу са урином старим 72 сата у поређењу са контролном групом (p = 0,0066; Слика 5C).
Бихејвиорални одговори на природне и синтетичке мирисе крављег урина у потрази за домаћином и Anopheles arabianus који се хране крвљу. Шема олфактометра са стакленом цеви (А). Привлачење испарљивих екстраката из простора над зрачењем из свежег и остарелог крављег урина на домаћина (Б) и комарце који сишу крв (Ц). Пронађите реакцију пипака Лорда Ан. Приказани су екстракти из простора над зрачењем изоловани из свежег (Д), 24-часовног (Е), 72-часовног (Ф) и 168-часовног (Г) крављег урина. Трагови детекције електронске антене (ЕАД) показују промене напона као одговор на биоактивна једињења у простору над зрачењем елуирана из гасног хроматографа и детектована детектором јонизације пламена (ФИД). Скала представља амплитуду одговора (мВ) у односу на време задржавања (с). Приказане су особине и брзине ослобађања (µг х-1) биолошки активних једињења. Једна звездица (*) означава конзистентан одговор мале амплитуде. Двоструке звездице (**) означавају нерепродуцибилне одговоре. Пронађите домаћина (Х) и комарце који сишу крв. (I) An.arabiensis има различите привлачности за синтетичке мешавине мириса свежег и старог крављег урина. Просечни удели комараца које привлаче различита имена слова значајно су се разликовали једни од других (једносмерна ANOVA коришћењем Тукијеве пост хок анализе; p < 0,05). Грешке представљају стандардну грешку скале.
Женка Ann.arabiensis, 72 сата и 120 сати након оброка са крвљу, током мрешћења, није показана склоност ка испарљивим екстрактима из простора над водом из свежег и старог крављег урина у поређењу са контролама са пентаном (χ2 = 3,07, p > 0,05; Додатна датотека 1: Сл. S1).
За женке Ann.arabiensis, GC-EAD и GC-MS анализе су идентификовале осам, шест, три и три биоактивна једињења (слика 5D-G). Иако су примећене разлике у броју једињења која су изазвала електрофизиолошке одговоре, већина ових једињења је била присутна у сваком испарљивом екстракту из простора над урином сакупљеном из свежег и старог урина. Стога су за сваки екстракт у даље анализе укључена само једињења која су изазвала физиолошки одговор женских антена изнад прага.
Укупна брзина ослобађања испарљивих биоактивних једињења у хедспејс колекцији повећала се са 29 µг h-1 у свежем урину на 242 µг h-1 у урину старом 168 сати, углавном због п-крезола и м-формалдехида. Фенол се повећава, као и фенол. Насупрот томе, брзине ослобађања других једињења, као што су 2-циклохексен-1-он и деканал, смањивале су се са повећањем старости урина, што је било у корелацији са примећеним смањењем интензитета сигнала (обилности) у хроматограму (Сл. 5Д)-Г леви панел) и физиолошким одговорима на ова једињења (Сл. 5Д-Г десни панел).
Генерално, синтетичка смеша је имала сличан природни однос биоактивних једињења идентификованих у испарљивим екстрактима свежег и остарелог урина (Сл. 5Д–Г) и није изгледало да изазива значајну привлачност у потрази за домаћином (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Сл. 5Х) или комарцима који сишу крв (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Сл. 5И). Међутим, пост хок поређења парова између третмана показала су да су комарци који траже домаћина били значајно привлачнији синтетичкој смеши урина старог 24 сата у поређењу са контролама са пентаном (p = 0,0086; Сл. 5Х).
Да би се проценила улога појединачних компоненти у синтетичким смешама урина старог 24 сата, шест субтрактивних смеша је процењено у односу на комплетне смеше у Y-цеви, у којој су појединачна једињења уклоњена. Код комараца који траже домаћина, одузимање појединачних једињења из комплетне смеше имало је значајан утицај на бихевиоралне реакције (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Додатна датотека 1: Слика S2A), све субтрактивне смеше су биле мање атрактивне од потпуно помешаних. Насупрот томе, уклањање појединачних једињења из потпуно синтетичке смеше није утицало на бихевиоралне реакције комараца који сишу крв (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), са изузетком деканала, што је резултирало нижим нивоима привлачности у поређењу са комплетном смешом (p = 0,022; Додатна датотека 1: Слика S2B).
У селу у Етиопији, ендемском за маларију, ефикасност синтетичке мешавине 24-часовног крављег урина у привлачењу комараца у пољским условима процењивана је током десет ноћи (Сл. 6А). Укупно је ухваћено и идентификовано 4.861 комараца, од којих је 45,7% било Anthropus.gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis и 35,4% Culex spp. (Додатна датотека 1: Табела S1). Anopheles arabinis је једини члан комплекса врста An.Gambian идентификован PCR анализом. У просеку је ухваћено 320 комараца по ноћи, током којих су замке са синтетичким мешавинама мамаца ухватиле више комараца него упарене замке без мешавине (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Замке без мамаца постављене су сваке од пет контролних ноћи на почетку, средини и крају испитивања. Сличан број комараца је ухваћен у сваком пару замки, што указује... Без пристрасности између кућа (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) и без смањења популације током периода истраживања. У поређењу са контролним замкама, број комараца ухваћених у замкама које садрже синтетичку смешу је значајно повећан: тражење домаћина (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), недавно храњење крвљу (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) и трудноћа (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Додатна датотека 1: Табела S1). Ово се такође одражава на укупни број ухваћених комараца: тражење домаћина > крвосисавање > трудне > полутрудне > мужјак.
Теренска евалуација ефикасности 24-часовне синтетичке мешавине мириса крављег урина. Теренска испитивања су спроведена у јужно-централној Етиопији (мапа), близу града Маки (уметнути део), користећи светлосну замку Центра за контролу и превенцију болести (CDC) (десно) у парним кућицама, са дизајном латинског квадрата (снимак из ваздуха) (А). Синтетичке CDC фото-замке са мирисним мамацима привлаче и хватају женке Anopheles arabesques (Б), али не и Anopheles farroes (Ц), на другачији начин, ефекат зависан од физиолошког стања. Поред тога, ове замке су ухватиле значајно повећан број комараца домаћина Culex. (Д) У поређењу са контролом. Траке са леве стране представљају просечан индекс селекције комараца ухваћених у парове замки са мирисним мамацем (зелено) и контролним (отвореним) замкама (N = 10), док траке са десне стране представљају просечан индекс селекције у паровима контролних замки (отворене; N = 5). Звездице означавају нивое статистичке значајности (*p = 0,01 и ***p < 0,0001).
Три врсте су различито хваћене у замкама које су садржале синтетичке смеше. Тражећи домаћина (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), исхрањујући крвљу (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) и трудноћи (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), .arabiensis је био заробљен у замци ослобађајући синтетичку смешу (Сл. 6Б), док се количина An није разликовала. Пронађени су Pharoensis у различитим физиолошким стањима (Сл. 6Ц). Код Culex-а, примећено је само значајно повећање броја комараца који траже домаћина у замкама са мамацима од синтетичке смеше (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Сл. 6Д), у поређењу са контролним замкама.
Замке за мамац домаћина, смештене ван потенцијалних домаћина између места размножавања и руралних заједница у Етиопији, коришћене су да би се проценило да ли маларијски комарци користе мирис крављег урина као знак станишта домаћина. У одсуству знакова домаћина, топлоте и са или без присуства мириса крављег урина, нису ухваћени комарци (Додатна датотека 1: Слика S3). Међутим, у присуству високе температуре и мириса крављег урина, женке маларијских комараца су привучене и ухваћене, иако у малом броју, независно од старости урина (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Додатна датотека 1: Слика S3). Насупрот томе, контроле воде нису ухватиле маларијске комарце на високим температурама (Додатна датотека 1: Слика S3).
Комарци против маларије стичу и дистрибуирају једињења која садрже азот путем компензаторног храњења крављим урином (тј. барама) како би побољшали особине животног циклуса, слично као и други инсект [2, 4, 24, 25, 26]. Крављи урин је лако доступан обновљиви ресурс који је уско повезан са местима за одмор вектора маларије, као што су штале и висока вегетација близу сеоских кућа и места за мрест. Женке комараца лоцирају овај ресурс мирисом и способне су да регулишу унос азотних једињења у урину, укључујући уреу, главну азотну компоненту у урину [15, 16]. У зависности од физиолошког стања женке комарца, хранљиве материје у урину се додељују како би се побољшала активност лета и преживљавање женки комараца које траже домаћина, као и преживљавање и репродуктивне карактеристике јединки које се хране крвљу током првог гонадотропног циклуса. Стога, мешање урина игра важну нутритивну улогу за векторе маларије који су затворени попут неухрањених одраслих [8], јер пружа женкама комараца могућност да стекну важна азотна једињења учествујући у исхрани са ниским ризиком. Ово откриће има значајне епидемиолошке последице, јер женке повећавају свој животни век, активност и репродуктивни резултат, што све утиче на капацитет вектора. Штавише, ово понашање може бити мета будућих програма управљања векторима.