Хвала вам што сте посетили Nature.com. Користите верзију прегледача са ограниченом CSS подршком. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Поред тога, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Приказује вртешку од три слајда одједном. Користите дугмад Претходно и Следеће да бисте се кретали кроз три слајда истовремено или користите клизаче на крају да бисте се кретали кроз три слајда одједном.
Крвно-мождана баријера и крвно-мождана баријера спречавају биотерапеутске агенсе да достигну своје циљеве у централном нервном систему, чиме ометају ефикасно лечење неуролошких болести. Да бисмо открили нове транспортере мозга in vivo, увели смо библиотеку Т7 фагних пептида и серијски сакупљали крв и цереброспиналну течност (ЦСТ) користећи канулирани модел великог базена пацова са свешћу. Специфични фагни клонови су били високо обогаћени ЦСТ-ом након четири круга селекције. Тестирање појединачних кандидатских пептида открило је више од 1000 пута обогаћење ЦСТ-а. Биоактивност пептидом посредоване испоруке у мозак потврђена је смањењем нивоа амилоида-β у цереброспиналној течности за 40% коришћењем инхибитора пептида BACE1 повезаног са идентификованим новим транзитним пептидом. Ови резултати сугеришу да пептиди идентификовани in vivo методама селекције фага могу бити корисна средства за системску испоруку макромолекула у мозак са терапеутским ефектом.
Истраживање терапије усмерене на централни нервни систем (ЦНС) углавном је усмерено на идентификацију оптимизованих лекова и агенаса који показују својства усмерена на ЦНС, са мање напора на откривању механизама који покрећу активну испоруку лекова у мозак. Ово сада почиње да се мења, јер је испорука лекова, посебно великих молекула, саставни део модерног развоја лекова у неуронауци. Окружење централног нервног система је добро заштићено системом цереброваскуларне баријере, који се састоји од крвно-мождане баријере (КМБ) и крвно-мождане баријере (КМБ)1, што отежава испоруку лекова у мозак1,2. Процењује се да се скоро сви лекови великих молекула и више од 98% лекова малих молекула елиминишу из мозга3. Зато је веома важно идентификовати нове системе транспорта у мозгу који обезбеђују ефикасну и специфичну испоруку терапијских лекова у ЦНС4,5. Међутим, КМБ и КМБ такође представљају одличну прилику за испоруку лекова јер продиру и улазе у све структуре мозга кроз његову опсежну васкулатуру. Стога, тренутни напори да се користе неинвазивне методе испоруке у мозак у великој мери се заснивају на механизму транспорта посредованог рецепторима (ПМТ) коришћењем ендогеног КББ6 рецептора. Упркос недавном кључном напретку у коришћењу пута рецептора трансферина7,8, потребан је даљи развој нових система испоруке са побољшаним својствима. У том циљу, наш циљ је био да идентификујемо пептиде способне да посредују у транспорту ЦСФ, јер би се они у принципу могли користити за испоруку макромолекула у ЦНС или за отварање нових рецепторских путева. Конкретно, специфични рецептори и транспортери цереброваскуларног система (КББ и БСКФБ) могу послужити као потенцијалне мете за активну и специфичну испоруку биотерапеутских лекова. Цереброспинална течност (ЦСФ) је секреторни производ хороидног плексуса (ХП) и налази се у директном контакту са интерстицијалном течношћу мозга кроз субарахноидални простор и вентрикуларни простор4. Недавно је показано да субарахноидна цереброспинална течност прекомерно дифундује у интерстицијум мозга9. Надамо се да ћемо приступити паренхималном простору користећи овај субарахноидални улазни тракт или директно кроз КМБ. Да бисмо то постигли, имплементирали смо робусну in vivo стратегију селекције фага која идеално идентификује пептиде транспортоване било којим од ова два различита пута.
Сада описујемо секвенцијалну методу скрининга фага in vivo са узорковањем цереброспиналне течности (CSF) заједно са секвенцирањем високог протока (HTS) ради праћења почетних рунди селекције са највећом разноликошћу библиотека. Скрининг је спроведен на свесним пацовима са трајно имплантираном канилом велике цистерне (CM) како би се избегла контаминација крви. Важно је да овај приступ селектује и пептиде усмерене на мозак и пептиде са транспортном активношћу преко цереброваскуларне баријере. Користили смо T7 фаге због њихове мале величине (~60 nm)10 и сугерисали да су погодни за транспорт везикула које омогућавају трансцелуларни прелазак ендотелне и/или епително-медуларне баријере. Након четири рунде паннинга, изоловане су популације фага које показују снажно in vivo обогаћивање CSF и повезаност церебралних микросудова. Важно је да смо успели да потврдимо наше налазе показујући да су преферирани и хемијски синтетизовани најбољи кандидати за пептиде способни да транспортују протеински терет у цереброспиналну течност. Прво, фармакодинамички ефекти CNS-а су утврђени комбиновањем водећег транзитног пептида са инхибитором BACE1 пептида. Поред тога што показује да стратегије функционалног скрининга in vivo могу идентификовати нове пептиде за транспорт мозга као ефикасне носаче протеинског терета, очекујемо да ће слични приступи функционалној селекцији постати важни и у идентификовању нових путева транспорта мозга.
На основу јединица које формирају плакове (PFU), након корака паковања фага, дизајнирана је и креирана библиотека случајних 12-мерних линеарних T7 фагних пептида са разноликошћу од приближно 109 (видети Материјали и методе). Важно је напоменути да смо пажљиво анализирали ову библиотеку пре in vivo паннинга. PCR амплификација узорака фагних библиотека коришћењем модификованих прајмера генерисала је ампликоне који су били директно применљиви на HTS (Допунска слика 1а). Због а) грешака у секвенцирању HTS11, б) утицаја на квалитет прајмера (NNK)1-12 и ц) присуства фага дивљег типа (wt) (скелетни уметци) у резервној библиотеци, имплементирана је процедура филтрирања секвенци да би се извукле само верификоване информације о секвенци (Допунска слика 1б). Ови кораци филтрирања примењују се на све HTS библиотеке секвенцирања. За стандардну библиотеку, добијено је укупно 233.868 очитавања, од којих је 39% прошло критеријуме филтера и коришћено је за анализу библиотеке и селекцију за наредне рунде (Допунска слика 1ц–е). Очитавања су претежно била вишекратници 3 базна пара дужине са врхунцем на 36 нуклеотида (Допунска слика 1ц), што потврђује дизајн библиотеке (NNK) 1-12. Приметно је да је приближно 11% чланова библиотеке садржало 12-димензионални инсерт PAGISRELVDKL основне линије дивљег типа (wt), а скоро половина секвенци (49%) садржала је инсерције или делеције. HTS библиотечке библиотеке потврдио је велику разноликост пептида у библиотеци: више од 81% пептидних секвенци пронађено је само једном, а само 1,5% се појавило у ≥4 копије (Допунска слика 2а). Фреквенције аминокиселина (аа) на свих 12 позиција у репертоару добро су се корелирале са фреквенцијама очекиваним за број кодона генерисаних дегенерисаним NKK репертоаром (Допунска слика 2б). Уочена фреквенција аа остатака кодираних овим инсертима добро је корелирала са израчунатом фреквенцијом (r = 0,893) (Допунска слика 2ц). Припрема фагних библиотека за ињекцију укључује кораке амплификације и уклањања ендотоксина. Претходно је показано да ово потенцијално смањује разноликост фагних библиотека12,13. Стога смо секвенционирали фагну библиотеку амплификовану на плочи која је прошла кроз уклањање ендотоксина и упоредили је са оригиналном библиотеком како бисмо проценили учесталост аминокиселина (АА). Примећена је јака корелација (r = 0,995) између оригиналног пула и амплификованог и пречишћеног пула (Допунска слика 2д), што указује да конкуренција између клонова амплификованих на плочама коришћењем Т7 фага није изазвала значајну пристрасност. Ово поређење се заснива на учесталости трипептидних мотива у свакој библиотеци, пошто се разноликост библиотека (~109) не може у потпуности обухватити чак ни помоћу ХТС-а. Анализа фреквенције аминокиселина на свакој позицији открила је малу пристрасност зависну од позиције у последње три позиције унетог репертоара (Допунска слика 2е). Закључно, закључили смо да су квалитет и разноликост библиотеке били прихватљиви и да су примећене само мање промене у разноликости због амплификације и припреме фагних библиотека између неколико рунди селекције.
Серијско узорковање цереброспиналне течности може се извршити хируршким имплантирањем каниле у цревни мозак свесних пацова како би се олакшала идентификација Т7 фага убризганог интравенозно (ив) преко КМБ и/или БЦСФБ (Сл. 1а-б). Користили смо два независна селекциона крака (кракови А и Б) у прва три круга ин виво селекције (Сл. 1ц). Постепено смо повећавали строгост селекције смањењем укупне количине фага унетог у прва три круга селекције. За четврти круг панинга, комбиновали смо узорке из грана А и Б и извршили три додатне независне селекције. Да бисмо проучили ин виво својства честица Т7 фага у овом моделу, фаг дивљег типа (PAGISRELVDKL главни уметак) је убризган пацовима преко репне вене. Опоравак фага из цереброспиналне течности и крви у различитим временским тачкама показао је да релативно мали Т7 икосаедарски фаги имају брзу почетну фазу клиренса из крвног одељка (Допунска слика 3). На основу примењених титара и запремине крви пацова, израчунали смо да је само приближно 1% тежинског удела фага из примењене дозе детектовано у крви 10 минута након интравенске ињекције. Након овог почетног брзог пада, измерен је спорији примарни клиренс са временом полураспада од 27,7 минута. Важно је напоменути да је само врло мало фага добијено из цереброспиналне течности, што указује на ниску позадину за миграцију фага дивљег типа у цереброспиналну течност (Допунска слика 3). У просеку, само око 1 x 10⁻⁶% титара Т7 фага у крви и 4 x 10⁻⁶% почетно инфузираних фага детектовано је у цереброспиналној течности током целог периода узорковања (0-250 мин). Приметно је да је време полураспада (25,7 мин) фага дивљег типа у цереброспиналној течности било слично оном примећеном у крви. Ови подаци показују да је баријера која одваја одељак ЦСФ од крви нетакнута код пацова којима је канулирана ЦМ, што омогућава in vivo селекцију фагних библиотека за идентификацију клонова који се лако транспортују из крви у одељак ЦСФ.
(а) Постављање методе за поновно узорковање цереброспиналне течности (ЦСТ) из великог базена. (б) Дијаграм који приказује ћелијску локацију баријере централног нервног система (ЦНС) и стратегију селекције која се користи за идентификацију пептида који прелазе крвно-мождану баријеру (КМБ) ​​и крвно-мождану баријеру. (ц) Дијаграм тока скрининга фага in vivo. У свакој рунди селекције, фаги (идентификатори животиња унутар стрелица) су убризгани интравенозно. Две независне алтернативне гране (А, Б) се држе одвојено до 4. рунде селекције. За рунде селекције 3 и 4, сваки клон фага екстрахован из ЦСТ је ручно секвенциониран. (д) Кинетика фага изолованог из крви (црвени кругови) и цереброспиналне течности (зелени троуглови) током прве рунде селекције код два канулирана пацова након интравенске ињекције библиотеке Т7 пептида (2 x 1012 фага/животињи). Плави квадрати означавају просечну почетну концентрацију фага у крви, израчунату из количине убризганог фага, узимајући у обзир укупну запремину крви. Црни квадрати означавају тачку пресека y линије екстраполиране из концентрација фага у крви. (е, ф) Прикажите релативну учесталост и дистрибуцију свих могућих преклапајућих трипептидних мотива пронађених у пептиду. Приказан је број мотива пронађених у 1000 очитавања. Значајно (p < 0,001) обогаћени мотиви су означени црвеним тачкама. (е) Диаграм расејања корелације који упоређује релативну учесталост трипептидног мотива убризгане библиотеке са фагом изведеним из крви животиња #1.1 и #1.2. (ф) Диаграм расејања корелације који упоређује релативне учесталости трипептидних мотива животињских фага #1.1 и #1.2 изолованих у крви и цереброспиналној течности. (г, х) Репрезентација ИД секвенце фага обогаћеног крвљу (г) у односу на убризгане библиотеке и фага обогаћеног ЦСФ (х) у односу на крв након рунде селекције in vivo код обе животиње. Величина једнословног кода показује колико често се та аминокиселина јавља на тој позицији. Зелена = поларна, љубичаста = неутрална, плава = базна, црвена = кисела и црна = хидрофобне аминокиселине. Слике 1а, б је дизајнирао и произвео Едуард Урих.
Убризгали смо библиотеку фагних пептида у два пацова са ЦМ инструментом (кладе А и Б) и изоловали фаг из цереброспиналне течности и крви (Слика 1д). Почетно брзо уклањање библиотеке било је мање изражено у поређењу са фагом дивљег типа. Средње време полураспада убризгане библиотеке код обе животиње било је 24,8 минута у крви, слично фагу дивљег типа, и 38,5 минута у ЦСФ-у. Узорци фага крви и цереброспиналне течности од сваке животиње подвргнути су ХТС-у и сви идентификовани пептиди су анализирани на присуство кратког трипептидног мотива. Трипептидни мотиви су изабрани зато што пружају минималну основу за формирање структуре и интеракције пептид-протеин14,15. Пронашли смо добру корелацију у дистрибуцији мотива између убризгане библиотеке фага и клонова екстрахованих из крви обе животиње (Слика 1е). Подаци указују да је састав библиотеке само маргинално обогаћен у крвном одељку. Фреквенције аминокиселина и консензусне секвенце су даље анализиране на свакој позицији коришћењем адаптације софтвера Weblogo16. Занимљиво је да смо пронашли снажно обогаћивање остацима глицина у крви (Сл. 1г). Када је крв упоређена са клоновима одабраним из ЦСФ-а, примећена је снажна селекција и извесна деселекција мотива (Сл. 1ф), а одређене аминокиселине су биле преференцијално присутне на унапред одређеним позицијама у 12-чланом систему (Сл. 1х). Приметно је да су се појединачне животиње значајно разликовале у цереброспиналној течности, док је обогаћивање глицином у крви примећено код обе животиње (Допунска слика 4а–ј). Након строгог филтрирања података о секвенци у цереброспиналној течности животиња #1.1 и #1.2, добијено је укупно 964 и 420 јединствених 12-мерних пептида (Допунска слика 1д–е). Изоловани фагни клонови су амплификовани и подвргнути другом кругу селекције in vivo. Фаги екстраховани из другог круга селекције подвргнути су ХТС-у код сваке животиње и сви идентификовани пептиди су коришћени као улаз у програм за препознавање мотива ради анализе појаве трипептидних мотива (Сл. 2а, б, еф). У поређењу са првим циклусом фага опорављеног из ЦСФ-а, приметили смо даљу селекцију и деселекцију многих мотива у ЦСФ-у у гранама А и Б (Сл. 2). Примењен је алгоритам за идентификацију мреже да би се утврдило да ли представљају различите обрасце конзистентне секвенце. Јасна сличност је примећена између 12-димензионалних секвенци опорављених помоћу ЦСФ-а у алтернативној клади А (Сл. 2ц, д) и клади Б (Сл. 2г, х). Збирна анализа у свакој грани открила је различите профиле селекције за 12-мерне пептиде (Допунска слика 5ц, д) и повећање односа титра ЦСФ/крви током времена за збирне клонове након друге рунде селекције у поређењу са првом рундом селекције (Допунска слика 5е).
Обогаћивање мотива и пептида у цереброспиналној течности помоћу два узастопна круга селекције функционалног фагног приказа in vivo.
Сви фаги цереброспиналне течности добијени из прве рунде сваке животиње (животиње бр. 1.1 и бр. 1.2) су обједињени, амплификовани, ХТ-секвенционирани и поново убризгани заједно (2 x 1010 фага/животињи) 2 SM канулирана пацова (бр. 1.1 → бр.). 2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4). (а, б, е, ф) Диаграми расејања корелације који пореде релативну учесталост трипептидних мотива свих фага изведених из цереброспиналне течности у првој и другој рунди селекције. Релативна учесталост и дистрибуција мотива који представљају све могуће преклапајуће трипептиде пронађене у пептидима у обе оријентације. Приказан је број мотива пронађених у 1000 очитавања. Мотиви који су значајно (p < 0,001) одабрани или искључени у једној од упоређених библиотека су означени црвеним тачкама. (ц, д, г, х) Лого секвенце који приказује све секвенце богате ЦСФ-ом, дужине 12 аминокиселина, на основу 2. и 1. рунде селекције in vivo. Величина једнословног кода означава колико често се та аминокиселина јавља на тој позицији. Да би се представио лого, упоређује се учесталост ЦСФ секвенци екстрахованих из појединачних животиња између две рунде селекције и приказане су обогаћене секвенце у другој рунди: (ц) #1.1–#2.1 (д) #1.1–#2.2 (г) #1.2–#2.3 и (х) #1.2–#2.4. Најобогаћеније аминокиселине на датој позицији код (ц, д) животиња бр. 2.1 и бр. 2.2 или (г, х) код животиња бр. 2.3 и бр. 2.4 су приказане у боји. Зелена = поларна, љубичаста = неутрална, плава = базна, црвена = кисела и црна = хидрофобне аминокиселине.
Након треће рунде селекције, идентификовали смо 124 јединствене пептидне секвенце (#3.1 и #3.2) из ​​332 клона фага реконституисаних из ЦСФ-а, изолованих из две животиње (Допунска слика 6а). Секвенца LGSVS (18,7%) имала је највећи релативни удео, а затим су следили инсерти дивљег типа PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%). У последњој четвртој рунди, објединили смо две независно одабране гране из три одвојене животиње (Слика 1ц). Од 925 секвенцираних клонова фага опорављених из ЦСФ-а, у четвртој рунди смо пронашли 64 јединствене пептидне секвенце (Допунска слика 6б), међу којима је релативни удео фага дивљег типа пао на 0,8%. Најчешћи CSF клонови у четвртој рунди били су LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3,2%). Распон дужине одабраних пептида је последица нуклеотидних инсерција/делеција или превремених стоп кодона у прајмерима библиотеке када се користе дегенерисани кодони за дизајн NNK библиотеке. Превремени стоп кодони генеришу краће пептиде и одабрани су зато што садрже повољан αa мотив. Дужи пептиди могу настати услед инсерција/делеција у прајмерима синтетичких библиотека. Ово позиционира дизајнирани стоп кодон ван оквира и чита га док се не појави нови стоп кодон низводно. Генерално, израчунали смо факторе обогаћивања за све четири рунде селекције упоређујући улазне податке са излазним подацима узорка. За прву рунду скрининга, користили смо титре фага дивљег типа као неспецифичну позадинску референцу. Занимљиво је да је негативна селекција фага била веома јака у првом циклусу ЦСФ-а, али не и у крви (Сл. 3а), што може бити последица мале вероватноће пасивне дифузије већине чланова пептидне библиотеке у одељак ЦСФ-а или да се релативни фаги ефикасније задржавају или уклањају из крвотока него бактериофаги. Међутим, у другом кругу паннинга, примећена је јака селекција фага у ЦСФ-у у обе кладе, што сугерише да је претходни круг био обогаћен фагима који приказују пептиде који промовишу апсорпцију ЦСФ-а (Сл. 3а). Поново, без значајног обогаћивања крви. Такође, у трећем и четвртом кругу, клонови фага су били значајно обогаћени ЦСФ-ом. Упоређујући релативну фреквенцију сваке јединствене пептидне секвенце између последња два круга селекције, открили смо да су секвенце биле још обогаћеније у четвртом кругу селекције (Сл. 3б). Укупно 931 трипептидни мотив је екстрахован из свих 64 јединствене пептидне секвенце коришћењем обе пептидне оријентације. Најобогаћенији мотиви у четвртој рунди су пажљивије испитани због њихових профила обогаћивања у свим рундама у поређењу са убризганом библиотеком (гранична вредност: 10% обогаћивања) (Допунска слика 6ц). Општи обрасци селекције показали су да је већина проучаваних мотива обогаћена у свим претходним рундама обе гране селекције. Међутим, неки мотиви (нпр. SGL, VSG, LGS GSV) су претежно били из алтернативне кладе А, док су други (нпр. FGW, RTN, WGF, NTR) били обогаћени алтернативном кладом Б.
Валидација транспорта фагом приказаних пептида обогаћених ЦСФ-ом и биотинилисаних лидерских пептида конјугованих са стрептавидинским теретом у ЦСФ-у.
(а) Односи обогаћивања израчунати у сва четири круга (R1-R4) на основу убризганих (улаз = I) титара фага (PFU) и одређених титара фага у цереброспиналној течности (излаз = O). Фактори обогаћивања за последња три круга (R2-R4) израчунати су поређењем са претходним кругом и првим кругом (R1) са подацима о тежини. Отворени столбци представљају цереброспиналну течност, осенчени столбци представљају плазму. (***p<0,001, на основу Студентовог t-теста). (б) Листа најзаступљенијих фагних пептида, рангираних према њиховом релативном уделу у свим фагима сакупљеним у цереброспиналној течности након 4. круга селекције. Шест најчешћих фагних клонова је истакнуто бојом, нумерисано, а њихови фактори обогаћивања између 3. и 4. круга селекције (уметци). (ц,д) Шест најобогаћенијих фагних клонова, празних фага и родитељских библиотека фагних пептида из 4. круга анализирани су појединачно у моделу узорковања цереброспиналне течности. Узорци цереброспиналне течности и крви су сакупљени у назначеним временским тачкама. (ц) Једнаке количине од 6 кандидатских фаг клонова (2 x 1010 фага/животиња), празних фага (#1779) (2 x 1010 фага/животиња) и основних фаг пептидних библиотека (2 x 1012 фага/животиња). Убризгати најмање 3 ЦМ се даје канулираној животињи одвојено преко репне вене. Приказана је фармакокинетика ЦСФ сваког убризганог фаг клона и фаг пептидне библиотеке током времена. (д) приказује просечан однос ЦСФ/крв за све опорављене фаге/мл током времена узорковања. (е) Четири синтетичка лидерска пептида и један помешани контролни пептид су повезани биотином са стрептавидином преко њиховог Н-терминуса (тетрамерски дисплеј) након чега је уследила ињекција (ив репна вена, 10 мг стрептавидина/кг). Најмање три интубирана пацова (Н = 3). Узорци цереброспиналне течности (ЦСТ) су сакупљени у назначеним временским тачкама, а концентрације стрептавидина су мерене помоћу ЦСТ анти-стрептавидин ELISA теста (нд = није детектовано). (*п<0,05, **п<0,01, ***п<0,001, на основу ANOVA теста). (ф) Поређење аминокиселинске секвенце најобогаћенијег клона фагног пептида #2002 (љубичаста) са другим одабраним клоновима фагног пептида из 4. рунде селекције. Идентични и слични фрагменти аминокиселина су означени бојама.
Од свих обогаћених фага у четвртој рунди (Сл. 3б), шест кандидат клонова је одабрано за даљу појединачну анализу у моделу узорковања ЦСФ. Једнаке количине библиотека од шест кандидат фага, празних фага (без уметка) и профагних пептида убризгане су у три канулиране ЦСФ животиње, а фармакокинетика је одређена у тестовима ЦСФ (Сл. 3ц) и крви (Допунска слика 7). Сви тестирани фаг клонови циљали су одељак ЦСФ на нивоу 10-1000 пута већем од нивоа празног контролног фага (#1779). На пример, клонови #2020 и #2077 имали су око 1000 пута веће титре ЦСФ од контролног фага. Фармакокинетички профил сваког одабраног пептида је различит, али сви они имају високу способност усмеравања у ЦСФ. Уочили смо константно смањење током времена за клонове #1903 и #2011, док је за клонове #2077, #2002 и #2009 повећање током првих 10 минута могло указивати на активни транспорт, али је потребно да се провери. Клонови #2020, #2002 и #2077 су се стабилизовали на високим нивоима, док је концентрација у ЦСФ клона #2009 полако опадала након почетног повећања. Затим смо упоредили релативну учесталост сваког кандидата у ЦСФ са његовом концентрацијом у крви (Сл. 3д). Корелација средњег титра сваког кандидата у ЦСФ са његовим титром у крви у свим временима узорковања показала је да су три од шест кандидата значајно обогаћена ЦСФ-ом у крви. Занимљиво је да је клон #2077 показао већу стабилност у крви (Додатна слика 7). Да бисмо потврдили да су сами пептиди способни да активно транспортују терет који није фагне честице у одељак ЦСФ, синтетизовали смо четири лидерска пептида дериватизована биотином на Н-терминусу где се пептиди везују за фагну честицу. Биотиниловани пептиди (бр. 2002, 2009, 2020 и 2077) су конјуговани са стрептавидином (SA) да би се добили мултимерни облици који донекле опонашају геометрију фага. Овај формат нам је такође омогућио да измеримо изложеност SA у крви и цереброспиналној течности као протеинским пептидима који транспортују терет. Важно је напоменути да су се подаци о фагима често могли репродуковати када су синтетички пептиди примењени у овом SA-коњугованом формату (Сл. 3е). Помешани пептиди су имали мању почетну изложеност и бржи клиренс из цереброспиналне течности са недетектабилним нивоима у року од 48 сати. Да бисмо стекли увид у путеве испоруке ових клонова пептидних фага у цереброспинални простор, анализирали смо локализацију појединачних погодака фагних пептида користећи имунохистохемију (IHC) да бисмо директно детектовали честице фага 1 сат након интравенске ињекције in vivo. Приметно је да су клонови #2002, #2077 и #2009 могли бити детектовани јаким бојењем у можданим капиларима, док контролни фаг (#1779) и клон #2020 нису детектовани (Додатна слика 8). Ово сугерише да ови пептиди доприносе ефекту на мозак управо преласком кроз КМБ. Потребна је даља детаљна анализа да би се тестирала ова хипотеза, јер би и БСКФБ рута могла бити укључена. Приликом упоређивања аминокиселинске секвенце најобогаћенијег клона (#2002) са другим одабраним пептидима, примећено је да неки од њих имају сличне аминокиселинске екстензије, што може указивати на сличан механизам транспорта (Сл. 3ф).
Због свог јединственог плазма профила и значајног повећања ЦСФ током времена, клон фагног дисплеја #2077 је даље истраживан током дужег периода од 48 сати и био је у стању да репродукује брзо повећање ЦСФ примећено у вези са одрживим нивоима SA (Слика 4а). Што се тиче других идентификованих фагних клонова, #2077 се снажно обојио за мождане капиларе и показао значајну колокализацију са капиларним маркером лектином када се посматра у већој резолуцији и могуће извесно бојење у паренхималном простору (Слика 4б). Да бисмо истражили да ли се пептидом посредовани фармаколошки ефекти могу добити у ЦНС-у, извели смо експеримент у којем су биотинилисане верзије i) транзитног пептида #2077 и ii) пептида инхибитора BACE1 помешане са SA у два различита односа. За једну комбинацију користили смо само инхибитор пептида BACE1, а за другу смо користили однос 1:3 инхибитора пептида BACE1 и пептида #2077. Оба узорка су примењена интравенозно, а нивои бета-амилоидног пептида 40 (Abeta40) у крви и цереброспиналној течности су мерени током времена. Абета40 је мерен у цереброспиналној течности (ЦСТ) јер одражава инхибицију BACE1 у паренхиму мозга. Као што се и очекивало, оба комплекса су значајно смањила нивое Абета40 у крви (Сл. 4ц, д). Међутим, само узорци који садрже смешу пептида бр. 2077 и инхибитора пептида BACE1 конјугованог са SA изазвали су значајно смањење Абета40 у цереброспиналној течности (Сл. 4ц). Подаци показују да је пептид бр. 2077 у стању да транспортује протеин SA од 60 kDa у ЦНС, а такође индукује фармаколошке ефекте са инхибиторима пептида BACE1 конјугованим са SA.
(а) Клонална ињекција (2 × 10 фага/животињи) Т7 фага која приказује дугорочне фармакокинетичке профиле ЦСФ пептида #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неињектираног контролног фага (#1779) код најмање три пацова са ЦМ интубираном матерничком масом. (б) Конфокална микроскопска слика репрезентативних кортикалних микроваскула код пацова којима су ињектирани фаги (2 × 10 10 фага/животињи) која приказује контрабојење пептида #2077 и крвних судова (лектин). Ови фагни клонови су дати 3 пацова и остављени су да циркулишу 1 сат пре перфузије. Мозгови су пресечени и обојени поликлоналним ФИТЦ-обележеним антителима против капсида Т7 фага. Десет минута пре перфузије и накнадне фиксације, лектин обележен DyLight594 је дат интравенозно. Флуоресцентне слике које приказују бојење лектином (црвено) луминалне стране микроваскула и фага (зелено) у лумену капилара и периваскуларном можданом ткиву. Скала одговара 10 µм. (ц, д) Биотиниловани BACE1 инхибиторни пептид, сам или у комбинацији са биотинилираним транзитним пептидом #2077, је повезан са стрептавидином, након чега је уследила интравенска ињекција најмање три канулирана CM пацова (10 мг стрептавидина/кг). Смањење Aβ40 посредовано BACE1 пептидним инхибитором је мерено Aβ1-40 ELISA тестом у крви (црвена) и цереброспиналној течности (наранџаста) у назначеним временским тачкама. Ради боље јасноће, испрекидана линија је нацртана на графикону у скали од 100%. (ц) Процентуално смањење Aβ40 у крви (црвени троуглови) и цереброспиналној течности (наранџасти троуглови) код пацова третираних стрептавидином конјугованим са транзитним пептидом #2077 и BACE1 инхибиторним пептидом у односу 3:1. (д) Процентуално смањење Aβ40 у крви (црвени кругови) и цереброспиналној течности (наранџасти кругови) код пацова третираних стрептавидином повезаним само са BACE1 инхибиторним пептидом. Концентрација Aβ у контролној групи била је 420 pg/ml (стандардна девијација = 101 pg/ml).
Фагни дисплеј је успешно примењен у неколико области биомедицинских истраживања17. Ова метода је коришћена за in vivo студије васкуларне разноликости18,19, као и за студије усмерене на церебралне судове20,21,22,23,24,25,26. У овој студији, проширили смо примену ове методе селекције не само на директну идентификацију пептида усмерених на церебралне судове, већ и на откривање кандидата са својствима активног транспорта за прелазак крвно-мождане баријере. Сада описујемо развој in vivo поступка селекције код интубираних пацова са ЦМ и демонстрирамо његов потенцијал за идентификацију пептида са својствима усмеравања у ЦСФ. Користећи Т7 фаг који приказује библиотеку 12-мерних случајних пептида, успели смо да покажемо да је Т7 фаг довољно мали (приближно 60 nm у пречнику)10 да се прилагоди крвно-можданој баријери, чиме директно прелази крвно-мождану баријеру или хороидни плексус. Приметили смо да је сакупљање ЦСФ-а од канулираних ЦМ пацова добро контролисана метода функционалног скрининга in vivo, и да се екстраховани фаг не само везује за васкулатуру већ функционише и као транспортер преко крвно-мождане баријере. Штавише, истовременим сакупљањем крви и применом ХТС-а на ЦСФ и фаге изведене из крви, потврдили смо да на наш избор ЦСФ-а није утицало обогаћивање крви или подобност за експанзију између рунди селекције. Међутим, одељак крви је део поступка селекције, јер фаги способни да дођу до одељка ЦСФ-а морају да преживе и циркулишу у крвотоку довољно дуго да се обогате у мозгу. Да бисмо извукли поуздане информације о секвенци из сирових ХТС података, имплементирали смо филтере прилагођене грешкама секвенцирања специфичним за платформу у ток рада анализе. Укључивањем кинетичких параметара у метод скрининга, потврдили смо брзу фармакокинетику фага дивљег типа Т7 (t½ ~ 28 мин) у крви24, 27, 28, а такође смо одредили њихов полуживот у цереброспиналној течности (t½ ~ 26 мин) у минути). Упркос сличним фармакокинетичким профилима у крви и цереброспиналној течности (ЦСТ), само 0,001% концентрације фага у крви могло је бити детектовано у ЦСТ, што указује на ниску позадинску мобилност фага дивљег типа Т7 преко крвно-мождане баријере. Овај рад истиче важност прве рунде селекције када се користе in vivo стратегије испитивања, посебно за фагне системе који се брзо уклањају из циркулације, јер мало клонова може да доспе до одељка ЦНС-а. Стога је у првој рунди смањење разноликости библиотека било веома велико, јер је само ограничен број клонова на крају сакупљен у овом веома строгом ЦСТ моделу. Ова in vivo стратегија испитивања укључивала је неколико корака селекције као што су активна акумулација у одељку ЦСТ, преживљавање клонова у одељку крви и брзо уклањање клонова Т7 фага из крви у првих 10 минута (Сл. 1д и Допунска слика 4М). Дакле, након прве рунде, различити клонови фага су идентификовани у ЦСТ, иако је исти почетни пул коришћен за појединачне животиње. Ово сугерише да вишеструки строги кораци селекције за изворне библиотеке са великим бројем чланова библиотеке резултирају значајним смањењем разноликости. Стога ће случајни догађаји постати саставни део почетног процеса селекције, значајно утичући на резултат. Вероватно је да су многи клонови у оригиналној библиотеци имали веома сличну склоност ка обогаћивању CSF-а. Међутим, чак и под истим експерименталним условима, резултати селекције могу се разликовати због малог броја сваког појединачног клона у почетном фонду.
Мотиви обогаћени у цереброспиналној течности (ЦСТ) разликују се од оних у крви. Занимљиво је да смо приметили прво померање ка пептидима богатим глицином у крви појединачних животиња (Сл. 1г, Допунске слике 4е, 4ф). Фаги који садрже глицинске пептиде могу бити стабилнији и мања је вероватноћа да ће бити избачени из циркулације. Међутим, ови пептиди богати глицином нису детектовани у узорцима цереброспиналне течности, што сугерише да су куриране библиотеке прошле кроз два различита корака селекције: један у крви, а други му је дозвољено да се акумулира у цереброспиналној течности. Клонови обогаћени ЦСТ-ом, који су резултат четврте рунде селекције, опширно су тестирани. Потврђено је да су скоро сви појединачно тестирани клонови обогаћени ЦСТ-ом у поређењу са фагом за контролу без икаквих узорака. Један погодак пептида (#2077) је детаљније испитан. Показао је дуже време полураспада у плазми у поређењу са другим погодцима (Слика 3д и Допунска слика 7), и занимљиво је да је овај пептид садржао остатак цистеина на Ц-терминусу. Недавно је показано да додавање цистеина пептидима може побољшати њихова фармакокинетичка својства везивањем за албумин 29. Ово је тренутно непознато за пептид #2077 и захтева даља истраживања. Неки пептиди су показали зависност од валенције у обогаћивању ЦСФ (подаци нису приказани), што може бити повезано са приказаном површинском геометријом Т7 капсида. Т7 систем који смо користили показао је 5-15 копија сваког пептида по фагној честици. ИХЦ је извршена на кандидатским водећим фагним клоновима убризганим интравенозно у мождану кору пацова (Допунска слика 8). Подаци су показали да су најмање три клона (бр. 2002, бр. 2009 и бр. 2077) интераговала са КМБ. Остаје да се утврди да ли ова интеракција КМБ резултира акумулацијом ЦСФ или кретањем ових клонова директно у БКФБ. Важно је напоменути да показујемо да одабрани пептиди задржавају свој капацитет транспорта у ЦСФ када се синтетишу и везују за протеински терет. Везивање N-терминалних биотинилисаних пептида за SA у суштини понавља резултате добијене са њиховим одговарајућим фагним клоновима у крви и цереброспиналној течности (Сл. 3е). Коначно, показујемо да је водећи пептид #2077 у стању да промовише деловање биотинилисаног пептидног инхибитора BACE1 коњугованог са SA на мозак, узрокујући изражене фармакодинамске ефекте у ЦНС-у значајним смањењем нивоа Abeta40 у ЦСФ-у (Сл. 4). Нисмо били у могућности да идентификујемо ниједан хомолог у бази података извођењем претраге хомологије пептидне секвенце свих погодака. Важно је напоменути да је величина Т7 библиотеке приближно 109, док је теоретска величина библиотеке за 12-мерне пептиде 4 x 1015. Стога смо одабрали само мали део простора разноликости 12-мерне пептидне библиотеке, што може значити да се оптимизованији пептиди могу идентификовати проценом суседног простора секвенци ових идентификованих погодака. Хипотетички, један од разлога зашто нисмо пронашли никакве природне хомологе ових пептида може бити деселекција током еволуције како би се спречио неконтролисан улазак одређених пептидних мотива у мозак.
Узети заједно, наши резултати пружају основу за будући рад на детаљнијој идентификацији и карактеризацији транспортних система цереброваскуларне баријере in vivo. Основна поставка ове методе заснива се на стратегији функционалне селекције која не само да идентификује клонове са својствима везивања за церебралне крвне судове, већ укључује и критични корак у којем успешни клонови имају интринзичну активност да пређу биолошке баријере in vivo у одељак ЦНС-а, јесте да се разјасни механизам транспорта ових пептида и њихова склоност ка везивању за микроваскулатуру специфичну за регион мозга. Ово може довести до открића нових путева за транспорт КМБ и рецептора. Очекујемо да се идентификовани пептиди могу директно везати за цереброваскуларне рецепторе или за циркулишуће лиганде који се транспортују кроз КМБ или БЦСФБ. Пептидни вектори са активношћу транспорта цереброваскуларне баријере откривени у овом раду биће даље истражени. Тренутно истражујемо специфичност ових пептида за мождани мозак због њихове способности да пређу КМБ и/или БЦСФБ. Ови нови пептиди биће изузетно вредни алати за потенцијално откривање нових рецептора или путева и за развој нових високо ефикасних платформи за испоруку макромолекула, као што су биолошки лекови, у мозак.
Канулирати велику цистерну (ВЦ) користећи модификацију претходно описане методе. Анестезирани Вистар пацови (200-350 г) су постављени на стереотаксични апарат и направљен је средњи рез преко обријаног и асептично припремљеног скалпа како би се открила лобања. Избушити две рупе у пределу горњег дела коже и причврстити завртње за фиксирање у рупе. Додатна рупа је избушена у латералном окципиталном гребену за стереотаксичко вођење каниле од нерђајућег челика у ВЦ. Нанети зубни цемент око каниле и осигурати завртњима. Након фото-полимеризације и стврдњавања цемента, кожна рана је затворена супрамидним шавом 4/0. Правилно постављање каниле потврђује се спонтаним цурењем цереброспиналне течности (ЦСТ). Уклонити пацова из стереотаксичног апарата, примити одговарајућу постоперативну негу и лечење бола и оставити му да се опорави најмање једну недељу док се не примете знаци крви у цереброспиналној течности. Вистар пацови (Crl:WI/Han) су набављени од Чарлс Ривера (Француска). Сви пацови су држани у специфичним условима без патогена. Све експерименте на животињама одобрила је Ветеринарска канцеларија града Базела, Швајцарска, и спроведени су у складу са Лиценцом за животиње бр. 2474 (Процена активног транспорта мозга мерењем нивоа терапијских кандидата у цереброспиналној течности и мозгу пацова).
Пажљиво држите пацова при свести са ЦМ канилом у руци. Извадите датуру из каниле и сакупите 10 µl спонтано текуће цереброспиналне течности. Пошто је проходност каниле на крају била угрожена, у ову студију су укључени само бистри узорци цереброспиналне течности без доказа о контаминацији крвљу или промени боје. Паралелно, приближно 10–20 μl крви је узето из малог реза на врху репа у епрувете са хепарином (Sigma-Aldrich). ЦСФ и крв су сакупљани у различитим временским тачкама након интравенске ињекције Т7 фага. Приближно 5–10 μl течности је одбачено пре него што је сакупљен сваки узорак ЦСФ-а, што одговара мртвој запремини катетера.
Библиотеке су генерисане коришћењем T7Select 10-3b вектора као што је описано у приручнику за T7Select систем (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Укратко, синтетисан је случајни 12-мерни ДНК уметак у следећем формату:
NNK кодон је коришћен да би се избегли двоструки стоп кодони и прекомерна експресија аминокиселина у инсерту. N је ручно помешан еквимоларни однос сваког нуклеотида, а K је ручно помешан еквимоларни однос аденинских и цитозинских нуклеотида. Једноланчани региони су конвертовани у дволанчану ДНК даљом инкубацијом са dNTP (Novagen) и Klenow ензимом (New England Biolabs) у Klenow пуферу (New England Biolabs) током 3 сата на 37°C. Након реакције, дволанчана ДНК је регенерисана преципитацијом EtOH. Добијена ДНК је дигестирана рестрикционим ензимима EcoRI и HindIII (оба од Roche-а). Расцепљени и пречишћени (QIAquick, Qiagen) инсерт (T4 лигаза, New England Biolabs) је затим лигиран ин-фрејм у претходно расцепљени T7 вектор после аминокиселине 348 гена капсида 10B. Реакције лигације су инкубиране на 16°C током 18 сати пре in vitro паковања. Паковање фага in vitro је извршено према упутствима која су приложена уз комплет за клонирање T7Select 10-3b (Novagen), а раствор за паковање је једном амплификован до лизе коришћењем Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лизати су центрифугирани, титрирани и замрзнути на -80°C као основни раствор глицерола.
Директна ПЦР амплификација варијабилних региона фага амплификованих у бујону или плочи коришћењем патентираних 454/Roche-ампликон фузионих прајмера. Прајмер за директну фузију садржи секвенце које окружују варијабилни регион (NNK) 12 (специфичан за шаблон), GS FLX Titanium Adapter A и кључну секвенцу библиотеке са четири базе (TCAG) (Допунска слика 1а):
Прајмер за реверзну фузију такође садржи биотин везан за куглице за хватање и GS FLX Titanium Adapter B потребан за клоналну амплификацију током емулзионе PCR:
Ампликони су затим подвргнути пиросеквенцирању 454/Roche према протоколу 454 GS-FLX Titanium. За ручно Сангерово секвенцирање (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК фага Т7 је амплификована PCR-ом и секвенцирана са следећим паровима прајмера:
Уметци из појединачних плакова су подвргнути PCR амплификацији коришћењем Roche Fast Start DNA Polymerase Kit-а (према упутствима произвођача). Извршен је врући старт (10 мин на 95 °C) и 35 циклуса појачавања (50 с на 95 °C, 1 мин на 50 °C и 1 мин на 72 °C).
Фаги из библиотека, фаги дивљег типа, фаги извађени из цереброспиналне течности и крви, или појединачни клонови су амплификовани у Escherichia coli BL5615 у ТБ бујону (Sigma Aldrich) или у посудама од 500 цм2 (Thermo Scientific) током 4 сата на 37°C. Фаги су екстраховани са плоча испирањем плоча Tris-EDTA пуфером (Fluka Analytical) или сакупљањем плакова стерилним врховима пипета. Фаги су изоловани из супернатанта културе или екстракционог пуфера једним кругом преципитације полиетилен гликолом (PEG 8000) (Promega) и ресуспендовани у Tris-EDTA пуферу.
Амплификовани фаг је подвргнут 2-3 рунде уклањања ендотоксина коришћењем перли за уклањање ендотоксина (Miltenyi Biotec) пре интравенске (IV) ињекције (500 μl/животињи). У првој рунди, унето је 2×1012 фага; у другој, 2×1010 фага; у трећој и четвртој рунди селекције, 2×109 фага по животињи. Садржај фага у узорцима цереброспиналне течности и крви прикупљеним у назначеним временским тачкама одређен је бројањем плака према упутствима произвођача (упутство за систем T7Select). Селекција фага је извршена интравенском ињекцијом пречишћених библиотека у репну вену или поновном ињекцијом фага екстрахованог из цереброспиналне течности из претходне рунде селекције, а накнадна сакупљања су извршена на 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин, респективно, у узорцима цереброспиналне течности и крви. Укупно су спроведене четири рунде in vivo паннинга у којима су две одабране гране одвојено складиштене и анализиране током прве три рунде селекције. Сви фагни уметци екстраховани из ЦСФ-а из прве две рунде селекције подвргнути су 454/Roche пиросеквенцирању, док су сви клонови екстраховани из ЦСФ-а из последње две рунде селекције ручно секвенцирани. Сви крвни фаги из прве рунде селекције такође су подвргнути 454/Roche пиросеквенцирању. За ињекцију фагних клонова, одабрани фаги су амплификовани у E. coli (BL5615) на плочама од 500 cm2 на 37°C током 4 сата. Појединачно одабрани и ручно секвенцирани клонови су размножени у TB медијуму. Након екстракције фага, пречишћавања и уклањања ендотоксина (као што је горе описано), 2×1010 фага/животињи у 300 μl је интравенозно убризгано у једну репну вену.
Претходна обрада и квалитативно филтрирање података о секвенци. Сирови 454/Roche подаци су конвертовани из бинарног стандардног формата мапе тока (sff) у Пирсонов људски читљив формат (fasta) коришћењем софтвера произвођача. Даља обрада нуклеотидне секвенце је извршена коришћењем власничких C програма и скрипти (необјављени софтверски пакет) као што је описано у наставку. Анализа примарних података укључује строге процедуре вишестепеног филтрирања. Да би се филтрирала очитавања која нису садржала валидну 12-мерну уметнуту ДНК секвенцу, очитавања су секвенцијално поравната са почетном ознаком (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп ознаком (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и позадинским уметком (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) коришћењем глобалног Нидлман-Вунш теста. поравнање које дозвољава до 2 недоследности по поравнању31. Стога су очитавања без почетних и стоп ознака и очитавања која садрже позадинске уметке, тј. поравнања која прелазе дозвољени број неусклађености, уклоњена из библиотеке. Што се тиче преосталих очитавања, N-мер ДНК секвенца која се протеже од почетне ознаке и завршава пре стоп ознаке је исечена из оригиналне секвенце за очитавање и даље обрађена (у даљем тексту „инсерт“). Након транслације инсерта, део после првог стоп кодона на 5′ крају прајмера је уклоњен из инсерта. Поред тога, нуклеотиди који воде до непотпуних кодона на 3′ крају прајмера су такође уклоњени. Да би се искључили инсерти који садрже само позадинске секвенце, уклоњени су и транслирани инсерти који почињу аминокиселинским обрасцем „PAG“. Пептиди са посттранслационом дужином мањом од 3 аминокиселине су уклоњени из библиотеке. Коначно, уклонити редундантност у скупу инсерта и одредити фреквенцију сваког јединственог инсерта. Резултати ове анализе укључивали су листу нуклеотидних секвенци (инсерта) и њихове (очитане) фреквенције (додатне слике 1ц и 2).
Груписање N-мер ДНК уметака по сличности секвенци: Да би се елиминисале грешке у секвенцирању специфичне за 454/Рош (као што су проблеми са секвенцирањем хомополимерних екстензија) и уклониле мање важне редундантности, претходно филтрирани N-мер ДНК уметци (уметци) секвенце сортирају по сличности. (дозвољене су до 2 базе које се не подударају) коришћењем итеративног алгоритма дефинисаног на следећи начин: уметци се прво сортирају по њиховој учесталости (од највише до најмање), а ако су исте, по њиховом секундарном сортирању по дужини (од најдуже до најкраће). Дакле, најчешћи и најдужи уметци дефинишу прву „групу“. Учесталост групе је подешена на кључну фреквенцију. Затим, свака преостала уметка на сортираној листи покушана је да се дода групи помоћу парног Нидлман-Вуншовог поравнања. Ако број неусклађености, уметка или брисања у поравнању не прелази праг од 2, уметци се додају групи, а укупна учесталост групе се повећава за то колико често је уметци додат. Уметци додати групи су означени као коришћени и искључени из даље обраде. Ако се уметнута секвенца не може додати већ постојећој групи, уметнута секвенца се користи за креирање нове групе са одговарајућом фреквенцијом уметања и означена је као коришћена. Итерација се завршава када је свака уметнута секвенца или коришћена за формирање нове групе или се може укључити у већ постојећу групу. На крају крајева, груписани уметци који се састоје од нуклеотида се на крају преводе у пептидне секвенце (пептидне библиотеке). Резултат ове анализе је скуп уметака и њихових одговарајућих фреквенција које чине број узастопних очитавања (Допунска слика 2).
Генерисање мотива: На основу листе јединствених пептида, креирана је библиотека која садржи све могуће обрасце аминокиселина (аа) као што је приказано испод. Сваки могући образац дужине 3 је издвојен из пептида и његов инверзни образац је додат заједно са заједничком библиотеком мотива која садржи све обрасце (трипептиде). ​​Библиотеке мотива са високим репетитивним садржајем су секвенциониране и уклоњена је редундантност. Затим, за сваки трипептид у библиотеци мотива, проверили смо његово присуство у библиотеци користећи рачунарске алате. У овом случају, фреквенција пептида који садржи пронађени мотив трипептида се додаје и додељује мотиву у библиотеци мотива („број мотива“). Резултат генерисања мотива је дводимензионални низ који садржи сва појављивања трипептида (мотива) и њихове одговарајуће вредности, које представљају број секвенционираних очитавања која резултирају одговарајућим мотивом када се очитавања филтрирају, групишу и транслирају. Метрике као што је детаљно описано горе.
Нормализација броја мотива и одговарајућих дијаграма расејања: Број мотива за сваки узорак је нормализован коришћењем
где је ni број очитавања која садрже тему i. Дакле, vi представља процентуалну учесталост очитавања (или пептида) који садрже мотив i у узорку. P-вредности за ненормализовани број мотива израчунате су коришћењем Фишеровог тачног теста. Што се тиче корелограма броја мотива, Спирманове корелације су израчунате коришћењем нормализованог броја мотива са R.
Да би се визуализовао садржај аминокиселина на свакој позицији у библиотеци пептида, креирани су веб логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Прво, садржај аминокиселина на свакој позицији 12-мерног пептида се чува у матрици 20×12. Затим се генерише скуп од 1000 пептида који садрже исти релативни садржај аминокиселина на свакој позицији у fasta-sequence формату и доставља као улаз за web-logo 3, који генерише графички приказ релативног садржаја аминокиселина на свакој позицији за дату библиотеку пептида. Да би се визуализовали вишедимензионални скупови података, креиране су топлотне мапе коришћењем интерно развијеног алата у R-у (biosHeatmap, R пакет који тек треба да буде објављен). Дендрограми представљени на топлотним мапама израчунати су коришћењем Вордове хијерархијске методе кластеровања са Еуклидовом метриком удаљености. За статистичку анализу података о бодовању мотива, P вредности за ненормализовано бодовање израчунате су коришћењем Фишеровог тачног теста. P-вредности за остале скупове података израчунате су у R коришћењем Студентовог t-теста или ANOVA.
Одабрани фагни клонови и фаги без уметака су интравенозно убризгани преко репне вене (2×1010 фага/животињи у 300 μl PBS-а). Десет минута пре перфузије и накнадне фиксације, истим животињама је интравенозно убризгано 100 μl лектина обележеног са DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 минута након убризгавања фага, пацови су перфузовани кроз срце са 50 ml PBS-а, а затим са 50 ml 4% PFA/PBS-а. Узорци мозга су додатно фиксирани преко ноћи у 4% PFA/PBS-у и натопљени у 30% сахарози преко ноћи на 4°C. Узорци су брзо замрзнути у OCT смеши. Имунохистохемијска анализа замрзнутих узорака је спроведена на собној температури на криопресецима од 30 µm блокираним са 1% BSA и инкубираним са поликлоналним FITC-обележеним антителима против T7 фага (Novus NB 600-376A) на 4°C. Инкубирати преко ноћи. Коначно, пресеци су испрани 3 пута са PBS и испитани конфокалним ласерским микроскопом (Leica TCS SP5).
Све пептиде са минималном чистоћом од 98% синтетисала је компанија GenScript USA, биотинилисала и лиофилизовала. Биотин је везан преко додатног троструког глицинског размакника на N-терминусу. Проверите све пептиде помоћу масене спектрометрије.
Стрептавидин (Sigma S0677) је помешан са 5-струким еквимоларним вишком биотинилираног пептида, биотинилираног BACE1 инхибиторног пептида или комбинацијом (однос 3:1) биотинилираног BACE1 инхибиторног пептида и BACE1 инхибиторног пептида у 5–10% DMSO/инкубирано у PBS. 1 сат на собној температури пре ињекције. Стрептавидин-коњуговани пептиди су интравенозно убризгани у дози од 10 мг/кг у једну од репних вена пацова са можданом шупљином.
Концентрација стрептавидин-пептидних комплекса процењена је ELISA тестом. Nunc Maxisorp микротитарске плоче (Sigma) су преко ноћи на 4°C обложене са 1,5 μg/ml мишјег анти-стрептавидин антитела (Thermo, MA1-20011). Након блокирања (пуфер за блокирање: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатина, 1% BSA) на собној температури током 2 сата, плоча је испрана са 0,05% Tween-20/PBS (пуфер за прање) током 3 секунде, узорци CSF и плазме су додати у бунариће разблажене пуфером за блокирање (плазма 1:10.000, CSF 1:115). Плоча је затим инкубирана преко ноћи на 4°C са детекционим антителом (1 μg/ml, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239). Након три корака прања, стрептавидин је детектован инкубацијом у раствору TMB супстрата (Roche) до 20 минута. Након заустављања развоја боје са 1M H2SO4, измерити апсорбанцију на 450 nm.
Функција комплекса стрептавидин-пептид-BACE1 инхибитор је процењена помоћу Aβ(1-40) ELISA теста према протоколу произвођача (Wako, 294-64701). Укратко, узорци CSF су разблажени у стандардном разблаживачу (1:23) и инкубирани преко ноћи на 4°C у плочама са 96 бунарића обложеним BNT77 антителом за хватање. Након пет корака прања, додато је HRP-коњуговано BA27 антитело и инкубирано 2 сата на 4°C, након чега је уследило пет корака прања. Aβ(1–40) је детектован инкубацијом у TMB раствору током 30 минута на собној температури. Након што је развој боје заустављен стоп раствором, измерити апсорбанцију на 450 nm. Узорци плазме су подвргнути екстракцији чврсте фазе пре Aβ(1–40) ELISA теста. Плазма је додата у 0,2% DEA (Sigma) у плочама са 96 бунарића и инкубирана на собној температури током 30 минута. Након сукцесивног прања SPE плоча (Oasis, 186000679) водом и 100% метанолом, узорци плазме су додати на SPE плоче и сва течност је уклоњена. Узорци су испрани (прво са 5% метанола, затим са 30% метанола) и елуирани са 2% NH4OH/90% метанола. Након сушења елуата на 55°C током 99 минута при константној струји N2, узорци су редуковани у стандардним разблаживачима и Aβ(1–40) је измерен као што је горе описано.
Како цитирати овај чланак: Урих, Е. и др. Достава терета у мозак коришћењем транзитних пептида идентификованих in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Ј., Скјоринге Т., Томсен ЛБ и Мус Т. Испорука макромолекуларних лекова у мозак коришћењем циљане терапије. Часопис за неурохемију 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брашњевић, И., Штајнбуш, ХВ, Шмиц, К. и Мартинез-Мартинез, П. Испорука пептидних и протеинских лекова преко крвно-мождане баријере. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардриџ, ВМ Крвно-мождана баријера: уско грло у развоју лекова за мозак. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Јохансон, КЕ, Данкан, ЈА, Стопа, ЕГ и Берд, А. Перспективе за побољшану испоруку лекова и њихово циљање у мозак путем хороидног плексуса-ЦСФ пута. Фармацеутска истраживања 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардриџ, ВМ Модернизација биофармацеутских производа са молекуларним тројанским коњима за испоруку у мозгу. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардриџ, ВМ рецептор-посредован транспорт пептида преко крвно-мождане баријере. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивонер, Ј. и др. Повећање пенетрације у мозак и ефикасности терапијских антитела коришћењем моновалентних молекуларних шатлова. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Бјен-Ли, Н. и др. Транспорт рецептора трансферина (TfR) одређује усвајање афинитетних варијанти TfR антитела у мозгу. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).