Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Приказује вртешку од три слајда одједном.Користите дугмад Претходно и Следеће да бисте се кретали кроз три слајда одједном или користите дугмад клизача на крају да бисте се кретали кроз три слајда одједном.
Крвно-мождана баријера и крвно-мождана баријера спречавају биотерапеутске агенсе да дођу до својих циљева у централном нервном систему, ометајући на тај начин ефикасно лечење неуролошких болести.Да бисмо открили нове транспортере мозга ин виво, увели смо библиотеку пептида Т7 фага и серијски сакупљали крв и цереброспиналну течност (ЦСФ) користећи канулиран свесни модел великог базена пацова.Специфични клонови фага су високо обогаћени ЦСФ након четири круга селекције.Тестирање појединачних кандидата за пептиде открило је више од 1000 пута обогаћивање ЦСФ.Биоактивност пептидом посредоване испоруке у мозак је потврђена смањењем од 40% нивоа амилоида-β у цереброспиналној течности коришћењем БАЦЕ1 пептидног инхибитора повезаног са идентификованим новим транзитним пептидом.Ови резултати сугеришу да пептиди идентификовани ин виво методама селекције фага могу бити корисна средства за системску испоруку макромолекула у мозак са терапеутским ефектом.
Истраживање циљане терапије за централни нервни систем (ЦНС) је у великој мери фокусирано на идентификацију оптимизованих лекова и агенаса који показују својства циљања на ЦНС, уз мање напора на откривању механизама који покрећу активну испоруку лекова у мозак.Ово сада почиње да се мења јер је испорука лекова, посебно великих молекула, саставни део развоја модерних неуронаучних лекова.Окружење централног нервног система је добро заштићено системом цереброваскуларне баријере, који се састоји од крвно-мождане баријере (БББ) и крвно-мождане баријере (БЦББ)1, што отежава испоруку лекова у мозак1,2.Процењује се да се скоро сви лекови са великим молекулима и више од 98% лекова са малим молекулима елиминишу из мозга3.Због тога је веома важно идентификовати нове транспортне системе мозга који обезбеђују ефикасну и специфичну испоруку терапијских лекова у ЦНС 4,5.Међутим, БББ и БЦСФБ такође представљају одличну прилику за испоруку лекова јер продиру и улазе у све структуре мозга кроз његову екстензивну васкулатуру.Дакле, тренутни напори да се користе неинвазивне методе испоруке у мозак су у великој мери засновани на механизму транспорта посредованог рецептором (ПМТ) коришћењем ендогеног БББ6 рецептора.Упркос недавним кључним напретцима у коришћењу пута трансферина рецептора7,8, потребан је даљи развој нових система испоруке са побољшаним својствима.У том циљу, наш циљ је био да идентификујемо пептиде који су способни да посредују у транспорту ЦСФ, јер би у принципу могли да се користе за испоруку макромолекула у ЦНС или за отварање нових путева рецептора.Конкретно, специфични рецептори и транспортери цереброваскуларног система (БББ и БСЦФБ) могу послужити као потенцијалне мете за активну и специфичну испоруку биотерапеутских лекова.Цереброспинална течност (ЦСФ) је секреторни производ хороидног плексуса (ЦС) и у директном је контакту са интерстицијском течношћу мозга кроз субарахноидални и вентрикуларни простор4.Недавно је показано да субарахноидна цереброспинална течност прекомерно дифундује у интерстицијум мозга9.Надамо се да ћемо приступити паренхимском простору помоћу овог субарахноидног улазног тракта или директно кроз БББ.Да бисмо то постигли, применили смо робусну ин виво стратегију селекције фага која идеално идентификује пептиде који се транспортују било којим од ова два различита пута.
Сада описујемо секвенцијални ин виво метод скрининга фага са узорковањем ЦСФ у комбинацији са секвенцирањем високе пропусности (ХТС) да бисмо пратили почетне кругове селекције са највећом разноврсношћу библиотеке.Скрининг је обављен на пацовима при свести са трајно имплантираном великом цистерном (ЦМ) канилом да би се избегла контаминација крви.Важно је да овај приступ бира и циљање на мозак и пептиде са транспортном активношћу кроз цереброваскуларну баријеру.Користили смо Т7 фаге због њихове мале величине (~ 60 нм)10 и сугерисали да су погодни за транспорт везикула који омогућавају трансцелуларно укрштање ендотелне и/или епително-медулне баријере.После четири круга панинга, изоловане су популације фага које показују снажно ин виво обогаћивање ЦСФ-а и повезаност церебралних микросудова.Важно је да смо били у могућности да потврдимо наше налазе показујући да су пожељни и хемијски синтетисани најбољи кандидати пептиди способни да транспортују протеински терет у цереброспиналну течност.Прво, фармакодинамички ефекти ЦНС-а су успостављени комбиновањем водећег транзитног пептида са инхибитором БАЦЕ1 пептида.Поред демонстрације да стратегије функционалног скрининга ин виво могу идентификовати нове пептиде за транспорт мозга као ефикасне носаче протеинског терета, очекујемо да ће слични приступи функционалне селекције такође постати важни у идентификацији нових путева транспорта мозга.
На основу јединица које формирају плак (ПФУ), након корака паковања фага, дизајнирана је и креирана библиотека насумичних 12-мерних линеарних Т7 фагних пептида са разноврсношћу од приближно 109 (видети Материјали и методе).Важно је напоменути да смо пажљиво анализирали ову библиотеку пре ин виво померања.ПЦР амплификација узорака библиотеке фага коришћењем модификованих прајмера генерисала је ампликоне који су били директно применљиви на ХТС (додатна слика 1а).Због а) грешака секвенционирања ХТС11, б) утицаја на квалитет прајмера (ННК)1-12, и ц) присуства дивљег типа (вт) фага (скелетних уметака) у резервној библиотеци, спроведена је процедура филтрирања секвенце да би се издвојиле само верификоване информације о секвенци (допунска слика 1б).Ови кораци филтера се примењују на све библиотеке ХТС секвенцирања.За стандардну библиотеку добијено је укупно 233.868 читања, од којих је 39% прошло критеријуме филтера и коришћено је за анализу библиотеке и одабир за наредне рунде (додатна слика 1ц–е).Очитавања су била претежно вишеструка од 3 пара база у дужини са врхом од 36 нуклеотида (допунска слика 1ц), потврђујући дизајн библиотеке (ННК) 1-12.Приметно је да је приближно 11% чланова библиотеке садржало 12-димензионални дивљи тип (тежина) кичме ПАГИСРЕЛВДКЛ инсерт, а скоро половина секвенци (49%) је садржала инсерције или делеције.ХТС библиотеке библиотеке потврдио је високу разноликост пептида у библиотеци: више од 81% пептидних секвенци пронађено је само једном, а само 1,5% се догодило у ≥4 копије (додатна слика 2а).Учесталости аминокиселина (аа) на свих 12 позиција у репертоару добро су корелирале са очекиваним фреквенцијама за број кодона које генерише дегенерисани НКК репертоар (додатна слика 2б).Уочена фреквенција аа остатака кодираних овим уметцима добро је корелирала са израчунатом фреквенцијом (р = 0,893) (додатна слика 2ц).Припрема фагних библиотека за ињекције укључује кораке амплификације и уклањања ендотоксина.Раније се показало да ово потенцијално смањује разноликост библиотека фага12,13.Због тога смо секвенцирали библиотеку фага амплификовану на плочи која је била подвргнута уклањању ендотоксина и упоредили је са оригиналном библиотеком да бисмо проценили учесталост АА.Уочена је јака корелација (р = 0,995) између оригиналног базена и амплифицираног и пречишћеног базена (додатна слика 2д), што указује да конкуренција између клонова амплифицираних на плочама помоћу Т7 фага није изазвала велику пристрасност.Ово поређење је засновано на учесталости трипептидних мотива у свакој библиотеци, пошто се разноликост библиотека (~ 109) не може у потпуности ухватити чак ни са ХТС.Анализа фреквенције аа на свакој позицији открила је малу пристрасност зависну од позиције у последње три позиције унетог репертоара (допунска слика 2е).У закључку смо закључили да су квалитет и разноврсност библиотеке прихватљиви и да су уочене само мање промене у диверзитету услед амплификације и припреме фагних библиотека између неколико кругова селекције.
Серијско узимање узорака цереброспиналне течности може се извршити хируршким имплантацијом каниле у ЦМ пацова при свести да би се олакшала идентификација Т7 фага убризганог интравенозно (ив) преко БББ и/или БЦСФБ (слика 1а-б).Користили смо две независне селекције (руке А и Б) у прва три круга ин виво селекције (слика 1ц).Постепено смо повећавали строгост селекције смањујући укупну количину фага уведеног у прва три круга селекције.За четврти круг пановања комбиновали смо узорке из грана А и Б и извршили три додатне независне селекције.Да би се проучавала ин виво својства честица фага Т7 у овом моделу, фаг дивљег типа (ПАГИСРЕЛВДКЛ мастер инсерт) је убризган пацовима преко репне вене.Опоравак фага из цереброспиналне течности и крви у различитим временским тачкама показао је да су релативно мали Т7 икосаедарски фаги имали брзу почетну фазу чишћења из одељка за крв (додатна слика 3).На основу примењених титара и запремине крви пацова, израчунали смо да је само приближно 1% теж.фаг из примењене дозе је откривен у крви 10 минута након интравенске ињекције.После овог почетног брзог опадања, мерен је спорији примарни клиренс са полуживотом од 27,7 минута.Важно је да је само неколико фага извучено из одељка ЦСФ, што указује на ниску позадину за миграцију фага дивљег типа у одељак ЦСФ (додатна слика 3).У просеку, само око 1 к 10-3% титара Т7 фага у крви и 4 к 10-8% иницијално инфундираних фага откривено је у цереброспиналној течности током целог периода узорковања (0-250 мин).Приметно је да је време полураспада (25,7 мин) дивљег типа фага у цереброспиналној течности било слично оном уоченом у крви.Ови подаци показују да је баријера која одваја ЦСФ одељак од крви нетакнута код пацова са ЦМ-канулираним пацовима, омогућавајући ин виво селекцију фагних библиотека за идентификацију клонова који се лако транспортују из крви у ЦСФ одељак.
(а) Постављање методе за поновно узимање узорака цереброспиналне течности (ЦСФ) из великог базена.(б) Дијаграм који приказује ћелијску локацију баријере централног нервног система (ЦНС) и стратегију селекције која се користи за идентификацију пептида који прелазе крвно-мождану баријеру (БББ) и крвно-мождану баријеру.(ц) Дијаграм тока скрининга приказа фага ин виво.У сваком кругу селекције, фаги (идентификатори животиња унутар стрелица) су убризгани интравенозно.Два независна алтернативна огранка (А, Б) се држе одвојено до 4. круга селекције.За кругове селекције 3 и 4, сваки клон фага екстрахован из ЦСФ-а је ручно секвенциониран.(д) Кинетика фага изолованог из крви (црвени кругови) и цереброспиналне течности (зелени троуглови) током првог круга селекције код два канулована пацова након интравенске ињекције Т7 пептидне библиотеке (2 к 1012 фага/животиња).Плави квадрати означавају просечну почетну концентрацију фага у крви, израчунату из количине убризганог фага, узимајући у обзир укупан волумен крви.Црни квадрати означавају тачку пресека и линије екстраполиране из концентрација фага у крви.(е,ф) Представите релативну фреквенцију и дистрибуцију свих могућих преклапајућих трипептидних мотива који се налазе у пептиду.Приказан је број мотива пронађених у 1000 читања.Значајно (п < 0,001) обогаћени мотиви су означени црвеним тачкама.(е) Корелациони дијаграм расејања који упоређује релативну учесталост мотива трипептида ињектиране библиотеке са фагом добијеним из крви животиња #1.1 и #1.2.(ф) Корелациона дијаграма расејања која упоређује релативне фреквенције трипептидних мотива животињских фага #1.1 и #1.2 изолованих у крви и цереброспиналној течности.(г, х) Репрезентација ИД секвенце фага обогаћеног крвљу (г) у односу на убризгане библиотеке и фага обогаћеног ЦСФ (х) у односу на крв након рунде ин виво селекције код обе животиње.Величина кода од једног слова показује колико се често та аминокиселина појављује на тој позицији.Зелена = поларна, љубичаста = неутрална, плава = базична, црвена = кисела и црна = хидрофобне аминокиселине.Слику 1а, б дизајнирао је и произвео Едуард Урицх.
Убризгали смо библиотеку пептида фага у два ЦМ инструмент пацова (класе А и Б) и изоловали фаг из цереброспиналне течности и крви (слика 1д).Почетни брзи клиренс из библиотеке био је мање изражен у поређењу са фагом дивљег типа.Средњи полуживот убризгане библиотеке код обе животиње био је 24,8 минута у крви, слично као код дивљег типа фага, и 38,5 минута у ЦСФ.Узорци фага крви и цереброспиналне течности сваке животиње су подвргнути ХТС и сви идентификовани пептиди су анализирани на присуство кратког трипептидног мотива.Трипептидни мотиви су одабрани јер обезбеђују минималну основу за формирање структуре и интеракције пептид-протеин14,15.Пронашли смо добру корелацију у дистрибуцији мотива између убризгане библиотеке фага и клонова екстрахованих из крви обе животиње (слика 1е).Подаци указују да је састав библиотеке само маргинално обогаћен у претинцу крви.Учесталости аминокиселина и консензус секвенце су даље анализиране на свакој позицији коришћењем адаптације софтвера Веблого16.Занимљиво је да смо открили снажно обогаћивање у остацима глицина у крви (слика 1г).Када је крв упоређена са клоновима одабраним из ЦСФ-а, уочена је јака селекција и одређена деселекција мотива (слика 1ф), а одређене аминокиселине су биле првенствено присутне на унапред одређеним позицијама у 12-чланом (слика 1х).Значајно је да су се појединачне животиње значајно разликовале у цереброспиналној течности, док је обогаћивање крви глицином примећено код обе животиње (додатна слика 4а-ј).Након строгог филтрирања података о секвенци у цереброспиналној течности животиња # 1.1 и # 1.2, добијено је укупно 964 и 420 јединствених 12-мер пептида (додатна слика 1д-е).Изоловани клонови фага су амплификовани и подвргнути другом кругу ин виво селекције.Фаг екстрахован из другог круга селекције је подвргнут ХТС-у у свакој животињи и сви идентификовани пептиди су коришћени као улаз у програм за препознавање мотива за анализу појаве трипептидних мотива (Слика 2а, б, еф).У поређењу са првим циклусом фага опорављеног из ЦСФ, приметили смо даљу селекцију и поништавање селекције многих мотива у ЦСФ у гранама А и Б (слика 2).Алгоритам идентификације мреже је примењен да би се утврдило да ли представљају различите обрасце доследног низа.Уочена је јасна сличност између 12-димензионалних секвенци добијених ЦСФ-ом у алтернативној клади А (слика 2ц, д) и клади Б (слика 2г, х).Обједињена анализа у свакој грани открила је различите профиле селекције за 12-мер пептиде (додатна слика 5ц, д) и повећање односа ЦСФ/титра крви током времена за обједињене клонове након другог круга селекције у поређењу са првим кругом селекције (додатна слика 5е).).
Обогаћивање мотива и пептида у цереброспиналној течности помоћу два узастопна круга ин виво функционалне селекције фага.
Сви фаги цереброспиналне течности добијени из првог круга сваке животиње (животиње #1.1 и #1.2) су спојени, амплификовани, ХТ-секвенционисани и поново убризгани заједно (2 к 1010 фага/животиња) 2 СМ канулирани пацови (#1.1 → #).2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4).(а,б,е,ф) Корелациони дијаграми расипања који упоређују релативну учесталост трипептидних мотива свих фага добијених из ЦСФ-а у првом и другом кругу селекције.Релативна учесталост и дистрибуција мотива који представљају све могуће преклапајуће трипептиде који се налазе у пептидима у обе оријентације.Приказан је број мотива пронађених у 1000 читања.Црвеним тачкама су истакнути мотиви који су значајно (п < 0,001) одабрани или искључени у некој од упоређених библиотека.(ц, д, г, х) Репрезентација логотипа секвенце свих секвенци дугих 12 аминокиселина богатих ЦСФ на основу 2. и 1. круга ин виво селекције.Величина кода од једног слова показује колико се често та аминокиселина појављује на тој позицији.Да би се представио логотип, упоређује се учесталост секвенци ЦСФ екстрахованих из појединачних животиња између два круга селекције и приказане су обогаћене секвенце у другом кругу: (ц) #1.1–#2.1 (д) #1.1–#2.2 (г) #1.2–#2.3 и (х) #1.2–#2.4.Највише обогаћене аминокиселине на датој позицији код (ц,д) животиња бр.2.1 и бр.2.2 или (г, х) код животиња бр.2.3 и бр.2.4 су приказане у боји.Зелена = поларна, љубичаста = неутрална, плава = базична, црвена = кисела и црна = хидрофобне аминокиселине.
Након трећег круга селекције, идентификовали смо 124 јединствене пептидне секвенце (#3.1 и #3.2) из ​​332 ЦСФ-реконституисана клона фага изолованих од две животиње (допунска слика 6а).Секвенца ЛГСВС (18,7%) имала је највећи релативни удео, а затим следи уметци дивљег типа ПАГИСРЕЛВДКЛ (8,2%), МРВФФСХАСКГР (3%), ДВАКВС (3%), ТВЛФСЛГ (2,2%) и САРГСВРЕИВСЛС (2,2%).У последњем четвртом кругу, спојили смо две независно одабране гране од три одвојене животиње (слика 1ц).Од 925 секвенцираних клонова фага добијених из ЦСФ-а, у четвртом кругу смо пронашли 64 јединствене пептидне секвенце (допунска слика 6б), међу којима је релативни удео дивљег типа фага пао на 0,8%.Најчешћи клонови ЦСФ у четвртом кругу били су ЛИВЛХСРГЛВГФКЛАААЛЕ (18%), ЛГСВС (17%), ГФВРФРЛСНТР (14%), КВАВРВФСЛФВК (7%), СВХГВ (5%), ГРПККИНГАРВЦ (3,6%) и РЛССВДСДЛСГЦ.%)).Опсег дужине одабраних пептида је последица уметања/делеције нуклеотида или превремених стоп кодона у прајмерима библиотеке када се користе дегенерисани кодони за дизајн ННК библиотеке.Превремени стоп кодони генеришу краће пептиде и одабрани су зато што садрже повољан аа мотив.Дужи пептиди могу бити резултат инсерција/делеција у прајмерима синтетичких библиотека.Ово позиционира дизајнирани стоп кодон ван оквира и чита га док се нови стоп кодон не појави низводно.Генерално, израчунали смо факторе обогаћивања за сва четири круга селекције упоређујући улазне податке са излазним подацима узорка.За први круг скрининга, користили смо титре фага дивљег типа као неспецифичну позадину.Занимљиво је да је негативна селекција фага била веома јака у првом циклусу ЦСФ, али не и у крви (Слика 3а), што може бити последица мале вероватноће пасивне дифузије већине чланова пептидне библиотеке у ЦСФ одељак или релативни фаги имају тенденцију да се ефикасније задржавају или уклањају из крвотока него бактериофаги.Међутим, у другом кругу панинга, уочена је јака селекција фага у ЦСФ у обе кладе, што сугерише да је претходни круг био обогаћен фагима који показују пептиде који промовишу унос ЦСФ (слика 3а).Опет, без значајног обогаћивања крви.Такође у трећем и четвртом кругу, клонови фага су значајно обогаћени ЦСФ.Упоређујући релативну фреквенцију сваке јединствене пептидне секвенце између последња два круга селекције, открили смо да су секвенце још више обогаћене у четвртом кругу селекције (слика 3б).Укупно 931 трипептидни мотив је екстрахован из свих 64 јединствене пептидне секвенце користећи обе оријентације пептида.Најбогатији мотиви у четвртом кругу су пажљивије испитани због њихових профила обогаћивања у свим круговима у поређењу са убризганом библиотеком (гранична вредност: 10% обогаћивања) (допунска слика 6ц).Општи обрасци селекције су показали да је већина проучаваних мотива обогаћена у свим претходним круговима обе селекције.Међутим, неки мотиви (нпр. СГЛ, ВСГ, ЛГС ГСВ) су били претежно из алтернативне кладе А, док су други (нпр. ФГВ, РТН, ВГФ, НТР) обогаћени алтернативним кладом Б.
Валидација транспорта ЦСФ пептида обогаћених фагом и биотинилованих водећих пептида коњугованих са стрептавидином.
(а) Односи обогаћивања израчунати у сва четири круга (Р1-Р4) на основу убризганих (улаз = И) титара фага (ПФУ) и утврђених титара фага ЦСФ (излаз = О).Фактори обогаћивања за последње три рунде (Р2-Р4) су израчунати поређењем са претходном рундом и првом рундом (Р1) са подацима о тежини.Отворене траке су цереброспинална течност, осенчене траке су плазма.(***п<0,001, на основу Студентовог т-теста).(б) Листа најзаступљенијих фагних пептида, рангираних према њиховој релативној пропорцији у односу на све фаге сакупљене у ЦСФ након 4. круга селекције.Шест најчешћих клонова фага је истакнуто бојом, нумерисаним и њиховим факторима обогаћивања између 3. и 4. круга селекције (инсетови).(ц,д) Шест најбогатијих фагних клонова, празних фага и пептидних библиотека родитељских фага из круга 4 анализирано је појединачно у моделу узорковања ЦСФ.ЦСФ и узорци крви су прикупљени у назначеним временским тачкама.(ц) Једнаке количине од 6 кандидата клонова фага (2 к 1010 фага/животиње), празних фага (#1779) (2 к 1010 фага/животиње) и библиотеке пептида сточних фага (2 к 1012 фага/животиње) Ињектирајте најмање 3 животињска репа у одвојене канте у ЦМ.Приказана је фармакокинетика ЦСФ сваког убризганог клона фага и библиотеке фагних пептида током времена.(д) показује просечан однос ЦСФ/крв за све пронађене фаге/мЛ током времена узорковања.(е) Четири синтетичка водећа пептида и једна шифрована контрола су повезани са биотином и стрептавидином преко њиховог Н-краја (тетрамерни приказ) након чега је уследила ињекција (репна вена ив, 10 мг стрептавидина/кг).Најмање три интубирана пацова (Н = 3).).Узорци ЦСФ су сакупљени у назначеним временским тачкама, а концентрације стрептавидина су мерене помоћу ЦСФ анти-стрептавидин ЕЛИСА (нд = није откривено).(*п<0,05, **п<0,01, ***п<0,001, на основу АНОВА теста).(ф) Поређење аминокиселинске секвенце најбогатијег фагног пептидног клона #2002 (љубичаста) са другим одабраним клоновима фагних пептида из 4. круга селекције.Идентични и слични фрагменти амино киселина су означени бојама.
Од свих обогаћених фага у четвртом кругу (слика 3б), одабрано је шест клонова кандидата за даљу индивидуалну анализу у моделу узорковања ЦСФ.Једнаке количине од шест библиотека фага кандидата, празних фага (без уметака) и профагних пептидних библиотека су убризгане у три канулиране ЦМ животиње, а фармакокинетика је одређена у тестовима ЦСФ (слика 3ц) и крви (додатна слика 7).Сви тестирани клонови фага циљали су на ЦСФ одељак на нивоу 10-1000 пута већем од нивоа празног контролног фага (#1779).На пример, клонови #2020 и #2077 су имали око 1000 пута већи титар ЦСФ-а од контролног фага.Фармакокинетички профил сваког одабраног пептида је другачији, али сви они имају високу способност навођења ЦСФ-а.Приметили смо константно смањење током времена за клонове #1903 и #2011, док за клонове #2077, #2002 и #2009 повећање током првих 10 минута може указивати на активан транспорт, али треба да буде верификовано.Клонови #2020, #2002 и #2077 су се стабилизовали на високим нивоима, док се концентрација ЦСФ-а клона #2009 полако смањивала након почетног повећања.Затим смо упоредили релативну учесталост сваког кандидата за ЦСФ са његовом концентрацијом у крви (слика 3д).Корелација средњег титра сваког кандидата за ЦСФ са његовим титром крви у свим временима узорковања показала је да су три од шест кандидата значајно обогаћена крвном ЦСФ.Занимљиво је да је клон #2077 показао већу стабилност крви (додатна слика 7).Да бисмо потврдили да су сами пептиди способни да активно транспортују терет осим честица фага у одељак ЦСФ, синтетизовали смо четири водећа пептида дериватизована биотином на Н-терминусу где се пептиди везују за честицу фага.Биотиниловани пептиди (бр. 2002, 2009, 2020 и 2077) су коњуговани са стрептавидином (СА) да би се добили мултимерни облици који донекле опонашају геометрију фага.Овај формат нам је такође омогућио да измеримо изложеност СА у крви и цереброспиналној течности као протеинским пептидима који транспортују терет.Важно је да се подаци о фагима често могу репродуковати када се синтетички пептиди дају у овом формату коњугованом са СА (слика 3е).Кодирани пептиди су имали мању почетну изложеност и бржи клиренс из ЦСФ-а са неоткривеним нивоима у року од 48 сати.Да бисмо стекли увид у путеве испоруке ових клонова пептидних фага у ЦСФ простор, анализирали смо локализацију појединачних погодака пептида фага користећи имунохистохемију (ИХЦ) да бисмо директно открили честице фага 1 сат након интравенске ињекције ин виво.Посебно, клонови # 2002, # 2077 и # 2009 могу бити откривени јаким бојењем у можданим капиларама, док контролни фаг (# 1779) и клон # 2020 нису откривени (додатна слика 8).Ово сугерише да ови пептиди доприносе ефекту на мозак управо укрштањем БББ.Потребна је даља детаљна анализа да би се тестирала ова хипотеза, јер БСЦФБ рута такође може бити укључена.Приликом поређења аминокиселинске секвенце најбогатијег клона (#2002) са другим одабраним пептидима, примећено је да неки од њих имају сличне аминокиселинске екстензије, што може указивати на сличан транспортни механизам (слика 3ф).
Због свог јединственог профила у плазми и значајног повећања ЦСФ током времена, клон фага дисплеја #2077 је даље истражен током дужег периода од 48 сати и био је у стању да репродукује брзи пораст ЦСФ примећен у вези са сталним нивоима СА (Слика 4а).Што се тиче других идентификованих клонова фага, #2077 је снажно обојен на мождане капиларе и показао је значајну колокализацију лектином капиларног маркера када се посматра у вишој резолуцији и вероватно мало бојења у паренхимском простору (Слика 4б).Да бисмо истражили да ли се фармаколошки ефекти посредовани пептидима могу постићи у ЦНС-у, извели смо експеримент у којем су биотиниловане верзије и) #2077 транзитног пептида и ии) пептида инхибитора БАЦЕ1 помешане са СА у два различита односа.За једну комбинацију користили смо само инхибитор БАЦЕ1 пептида, а за другу смо користили однос 1:3 пептидног инхибитора БАЦЕ1 према #2077 пептиду.Оба узорка су давана интравенозно и током времена су мерени нивои бета-амилоидног пептида 40 (Абета40) у крви и цереброспиналној течности.Абета40 је измерен у ЦСФ јер одражава инхибицију БАЦЕ1 у можданом паренхиму.Као што се очекивало, оба комплекса су значајно смањила нивое Абета40 у крви (слика 4ц, д).Међутим, само узорци који садрже мешавину пептида бр.2077 и инхибитор БАЦЕ1 пептида коњугованог са СА изазвали су значајно смањење Абета40 у цереброспиналној течности (слика 4ц).Подаци показују да је пептид бр.2077 је у стању да транспортује 60 кДа СА протеин у ЦНС и такође изазива фармаколошке ефекте са СА-коњугованим инхибиторима БАЦЕ1 пептида.
(а) Клонска ињекција (2 × 10 фага/животиња) Т7 фага која показује дугорочне фармакокинетичке профиле ЦСФ пептида # 2077 (РЛССВДСДЛСГЦ) и неињектираног контролног фага (# 1779) код најмање три ЦМ интубирана пацова.(б) Конфокална микроскопска слика репрезентативних кортикалних микросудова код пацова убризганих фагом (2 × 10 10 фага/животиња) која показује супротно бојење пептида #2077 и судова (лектин).Ови клонови фага су давани на 3 пацова и остављени да циркулишу 1 сат пре перфузије.Мозгови су исечени и обојени поликлонским антителима обележеним ФИТЦ против капсида Т7 фага.Десет минута пре перфузије и накнадне фиксације, лектин обележен ДиЛигхт594 је примењен интравенозно.Флуоресцентне слике које показују бојење лектина (црвено) на луминалној страни микросудова и фага (зелено) у лумену капилара и периваскуларног можданог ткива.Линија скале одговара 10 µм.(ц, д) Биотиниловани БАЦЕ1 инхибиторни пептид сам или у комбинацији са биотинилованим транзитним пептидом #2077 је спојен са стрептавидином, након чега је уследила интравенска ињекција најмање три ЦМ пацова са канулом (10 мг стрептавидина/кг).Смањење Аβ40 посредовано инхибитором БАЦЕ1 пептида је мерено помоћу Аβ1-40 ЕЛИСА у крви (црвено) и цереброспиналној течности (наранџасто) у назначеним временским тачкама.Ради боље јасноће, испрекидана линија је нацртана на графикону у скали од 100%.(ц) Процентуално смањење Аβ40 у крви (црвени троуглови) и цереброспиналној течности (наранџасти троуглови) код пацова третираних стрептавидином коњугованим са транзитним пептидом #2077 и БАЦЕ1 инхибиторним пептидом у односу 3:1.(д) Процентуално смањење Аβ40 у крви (црвени кругови) и цереброспиналне течности (наранџасти кругови) пацова лечених стрептавидином спојеним само са БАЦЕ1 инхибиторним пептидом.Концентрација Аβ у контроли била је 420 пг/мл (стандардна девијација = 101 пг/мл).
Фаги дисплеј је успешно примењен у неколико области биомедицинских истраживања17.Ова метода је коришћена за ин виво студије васкуларне разноврсности18,19, као и студије које циљају на церебралне судове20,21,22,23,24,25,26.У овој студији смо проширили примену ове методе селекције не само на директну идентификацију пептида који циљају на церебралне судове, већ и на откривање кандидата са активним транспортним својствима да пређу крвно-мождану баријеру.Сада описујемо развој ин виво процедуре селекције код ЦМ интубираних пацова и демонстрирамо његов потенцијал да идентификује пептиде са својствима ЦСФ-а.Користећи Т7 фаг који приказује библиотеку 12-мерних насумичних пептида, успели смо да покажемо да је Т7 фаг довољно мали (отприлике 60 нм у пречнику)10 да се прилагоди крвно-можданој баријери, чиме директно прелази крвно-мождану баријеру или хороидни плексус.Приметили смо да је сакупљање ЦСФ-а од канулираних ЦМ пацова била добро контролисана метода функционалног скрининга ин виво, и да се екстраховани фаг не само везује за васкулаттуру, већ је такође функционисао као транспортер кроз крвно-мождану баријеру.Штавише, истовременим прикупљањем крви и применом ХТС-а на ЦСФ и фаге добијене из крви, потврдили смо да на наш избор ЦСФ-а није утицало обогаћивање крви или способност за проширење између рунди селекције.Међутим, одељак крви је део процедуре селекције, пошто фаги који могу да дођу до ЦСФ одељења морају да преживе и циркулишу у крвотоку довољно дуго да се обогате у мозгу.Да бисмо издвојили поуздане информације о секвенци из необрађених ХТС података, имплементирали смо филтере прилагођене грешкама секвенционирања специфичних за платформу у току рада анализе.Укључујући кинетичке параметре у метод скрининга, потврдили смо брзу фармакокинетику Т7 фага дивљег типа (т½ ~ 28 мин) у крви24, 27, 28 и такође одредили њихов полуживот у цереброспиналној течности (т½ ~ 26 мин) у минути).Упркос сличним фармакокинетичким профилима у крви и ликвору, само 0,001% концентрације фага у крви може се детектовати у ЦСФ, што указује на ниску позадину покретљивости дивљег типа Т7 фага преко крвно-мождане баријере.Овај рад наглашава важност првог круга селекције када се користе стратегије ин виво паннинг, посебно за системе фага који се брзо уклањају из циркулације, пошто је неколико клонова у стању да допре до ЦНС одељка.Тако је у првом кругу смањење разноликости библиотека било веома велико, пошто је само ограничен број клонова на крају сакупљен у овом веома строгом ЦСФ моделу.Ова стратегија ин виво паннинг је укључивала неколико корака селекције као што су активна акумулација у одељку ЦСФ, преживљавање клонова у одељку крви и брзо уклањање клонова Т7 фага из крви у првих 10 минута (слика 1д и додатна слика 4М).).Дакле, након првог круга, различити клонови фага су идентификовани у ЦСФ, иако је исти почетни скуп коришћен за појединачне животиње.Ово сугерише да вишеструки строги изборни кораци за изворне библиотеке са великим бројем чланова библиотеке резултирају значајним смањењем разноликости.Стога ће случајни догађаји постати саставни део процеса иницијалне селекције, који ће у великој мери утицати на резултат.Вероватно је да су многи клонови у оригиналној библиотеци имали врло сличну склоност обогаћивању ЦСФ.Међутим, чак и под истим експерименталним условима, резултати селекције се могу разликовати због малог броја сваког одређеног клона у почетном скупу.
Мотиви обогаћени ликвором разликују се од оних у крви.Занимљиво је да смо приметили први помак ка пептидима богатим глицином у крви појединих животиња.(Слика 1г, Додатне слике 4е, 4ф).Пептиди глицина који садрже фаг могу бити стабилнији и мање је вероватно да ће бити извучени из циркулације.Међутим, ови пептиди богати глицином нису откривени у узорцима цереброспиналне течности, што сугерише да су куриране библиотеке прошле кроз два различита корака селекције: један у крви, а други је дозвољен да се акумулира у цереброспиналној течности.Клонови обогаћени ЦСФ-ом који су резултат четвртог круга селекције су опсежно тестирани.Потврђено је да су скоро сви појединачно тестирани клонови обогаћени ЦСФ у поређењу са слепим контролним фагом.Један пептидни погодак (#2077) је детаљније испитан.Показао је дужи полуживот у плазми у поређењу са другим погоцима (слика 3д и допунска слика 7), а занимљиво је да је овај пептид садржао цистеински остатак на Ц-терминусу.Недавно је показано да додавање цистеина пептидима може побољшати њихова фармакокинетичка својства везивањем за албумин 29 .Ово је тренутно непознато за пептид #2077 и захтева даље проучавање.Неки пептиди су показали валентну зависност у обогаћивању ЦСФ (подаци нису приказани), што може бити повезано са приказаном геометријом површине Т7 капсиде.Т7 систем који смо користили показао је 5-15 копија сваког пептида по честици фага.ИХЦ је изведен на кандидатским клоновима оловних фага убризганих интравенозно у церебрални кортекс пацова (додатна слика 8).Подаци су показали да су најмање три клона (бр. 2002, бр. 2009 и бр. 2077) у интеракцији са БББ.Остаје да се утврди да ли ова интеракција БББ резултира акумулацијом ЦСФ или премештањем ових клонова директно у БЦСФБ.Важно је да показујемо да одабрани пептиди задржавају свој транспортни капацитет ЦСФ када се синтетишу и везују за протеински терет.Везивање Н-терминалних биотинилованих пептида за СА у суштини понавља резултате добијене са њиховим одговарајућим клоновима фага у крви и цереброспиналној течности (слика 3е).Коначно, показали смо да је оловни пептид #2077 у стању да промовише мождано дејство биотинилованог пептидног инхибитора БАЦЕ1 коњугованог са СА, изазивајући изражене фармакодинамичке ефекте у ЦНС-у значајним смањењем нивоа Абета40 у ЦСФ (слика 4).Нисмо били у могућности да идентификујемо хомологе у бази података тако што смо извршили претрагу хомологије пептидне секвенце свих погодака.Важно је напоменути да је величина Т7 библиотеке приближно 109, док је теоретска величина библиотеке за 12-мере 4 к 1015. Због тога смо одабрали само мали део простора разноликости библиотеке 12-мерних пептида, што може значити да се оптимизованији пептиди могу идентификовати проценом суседног простора секвенце поготка ових идентификованих секвенци.Хипотетички, један од разлога зашто нисмо пронашли природне хомологе ових пептида може бити поништавање селекције током еволуције како би се спречио неконтролисани улазак одређених пептидних мотива у мозак.
Узети заједно, наши резултати пружају основу за будући рад на идентификацији и детаљнијем карактеризацији транспортних система цереброваскуларне баријере ин виво.Основна поставка ове методе заснива се на стратегији функционалне селекције која не само да идентификује клонове са својствима везивања церебралних васкуларних система, већ укључује и критични корак у којем успешни клонови имају интринзичну активност да пређу биолошке баријере ин виво у одељак ЦНС-а.је да се разјасни механизам транспорта ових пептида и њихова преференција за везивање за микроваскулатуру специфичну за регион мозга.Ово може довести до открића нових путева за транспорт БББ и рецептора.Очекујемо да се идентификовани пептиди могу директно везати за цереброваскуларне рецепторе или за циркулишуће лиганде који се транспортују кроз БББ или БЦСФБ.Пептидни вектори са транспортном активношћу ЦСФ откривени у овом раду биће даље истражени.Тренутно истражујемо мождану специфичност ових пептида због њихове способности да пређу БББ и/или БЦСФБ.Ови нови пептиди биће изузетно драгоцени алати за потенцијално откривање нових рецептора или путева и за развој нових високо ефикасних платформи за испоруку макромолекула, као што су биолошки лекови, у мозак.
Канулирајте велику цистерну (ЦМ) користећи модификацију претходно описане методе.Анестезирани Вистар пацови (200-350 г) су постављени на стереотаксички апарат и направљен је средњи рез преко обријаног и асептички припремљеног власишта да би се открила лобања.Избушите две рупе у пределу горњег крила и причврстите вијке за причвршћивање у рупе.Додатна рупа је избушена у бочном окципиталном гребену за стереотактично вођење каниле од нерђајућег челика у ЦМ.Нанесите зубни цемент око каниле и причврстите завртњима.Након фото-стврдњавања и стврдњавања цемента, кожна рана је затворена супрамидним шавом 4/0.Правилно постављање каниле потврђује спонтано цурење цереброспиналне течности (ЦСФ).Уклоните пацова из стереотаксијског апарата, примите одговарајућу постоперативну негу и збрињавање бола и оставите му да се опорави најмање недељу дана док се не примете знаци крви у цереброспиналној течности.Вистар пацови (Црл:ВИ/Хан) су добијени из Цхарлес Ривер (Француска).Сви пацови су држани у специфичним условима без патогена.Сви експерименти на животињама одобрени су од стране Канцеларије за ветеринарство града Базела, Швајцарска, и изведени су у складу са лиценцом за животиње број 2474 (Процена активног транспорта мозга мерењем нивоа терапеутских кандидата у цереброспиналној течности и мозгу пацова).
Нежно држите пацова при свести са ЦМ канилом у руци.Уклоните Датура из каниле и сакупите 10 µл спонтано тече цереброспиналне течности.Пошто је проходност каниле на крају била угрожена, у ову студију су укључени само бистри узорци цереброспиналне течности без доказа о контаминацији крви или промени боје.Паралелно, приближно 10–20 μл крви је узето из малог реза на врху репа у епрувете са хепарином (Сигма-Алдрицх).ЦСФ и крв су прикупљени у различитим временским тачкама након интравенске ињекције Т7 фага.Отприлике 5–10 μл течности је одбачено пре него што је сакупљен сваки узорак ЦСФ, што одговара мртвој запремини катетера.
Библиотеке су генерисане коришћењем Т7Селецт 10-3б вектора како је описано у Т7Селецт системском приручнику (Новаген, Росенберг ет ал., ИнНоватионс 6, 1-6, 1996).Укратко, насумични 12-мер ДНК уметак је синтетизован у следећем формату:
ННК кодон је коришћен да би се избегли двоструки стоп кодони и прекомерна експресија аминокиселина у инсерту.Н је ручно мешани еквимоларни однос сваког нуклеотида, а К је ручно мешани еквимоларни однос нуклеотида аденина и цитозина.Једноланчани региони су конвертовани у дволанчану ДНК даљом инкубацијом са дНТП (Новаген) и Кленов ензимом (Нев Енгланд Биолабс) у Кленов пуферу (Нев Енгланд Биолабс) током 3 сата на 37°Ц.После реакције, дволанчана ДНК је добијена преципитацијом ЕтОХ.Добијена ДНК је дигестирана са рестрикцијским ензимима ЕцоРИ и ХиндИИИ (оба из Роцхе).Одцепљени и пречишћени (КИАкуицк, Киаген) уметак (Т4 лигаза, Нев Енгланд Биолабс) је затим лигиран у оквиру у претходно цепани Т7 вектор после амино киселине 348 10Б капсидног гена.Реакције везивања су инкубиране на 16°Ц током 18 сати пре ин витро паковања.Паковање фага ин витро је изведено у складу са упутствима приложеним уз комплет за клонирање Т7Селецт 10-3б (Новаген) и раствор за паковање је једном амплификован до лизе коришћењем Есцхерицхиа цоли (БЛТ5615, Новаген).Лизати су центрифугирани, титрирани и замрзнути на -80°Ц као основни раствор глицерола.
Директна ПЦР амплификација варијабилних региона фага амплификованих у бујону или плочи коришћењем заштићених 454/Роцхе-ампликон фузионих прајмера.Прајмер за предњу фузију садржи секвенце које окружују варијабилни регион (ННК) 12 (специфичан за шаблон), ГС ФЛКС титанијумски адаптер А и секвенцу кључева библиотеке са четири базе (ТЦАГ) (додатна слика 1а):
Прајмер за реверзну фузију такође садржи биотин везан за перле за хватање и ГС ФЛКС титанијумски адаптер Б потребан за клонску амплфикацију током емулзионе ПЦР:
Ампликони су затим подвргнути 454/Роцхе пиросеквенцији у складу са 454 ГС-ФЛКС Титаниум протоколом.За ручно Сангер секвенцирање (Апплиед Биосистемс Хитацхи 3730 кл ДНК Анализер), Т7 фагна ДНК је амплификована ПЦР-ом и секвенцирана са следећим паровима прајмера:
Инсерти са појединачних плакова су подвргнути ПЦР амплификацији коришћењем Роцхе Фаст Старт ДНК полимеразе комплета (према упутствима произвођача).Извршите врући старт (10 мин на 95 °Ц) и 35 циклуса појачавања (50 с на 95 °Ц, 1 мин на 50 °Ц и 1 мин на 72 °Ц).
Фаг из библиотека, фаг дивљег типа, фаг спашен из ЦСФ и крви или појединачни клонови су амплификовани у Есцхерицхиа цоли БЛ5615 у ТБ бујону (Сигма Алдрицх) или у посудама од 500 цм2 (Тхермо Сциентифиц) током 4 сата на 37 ° Ц.Фаг је екстрахован са плоча испирањем плоча са Трис-ЕДТА пуфером (Флука Аналитицал) или сакупљањем плакова стерилним врховима пипете.Фаг је изолован из супернатанта културе или пуфера за екстракцију са једном рундом преципитације полиетилен гликола (ПЕГ 8000) (Промега) и ресуспендован у Трис-ЕДТА пуферу.
Амплификовани фаг је подвргнут 2-3 круга уклањања ендотоксина коришћењем куглица за уклањање ендотоксина (Милтении Биотец) пре интравенске (ИВ) ињекције (500 μл/животињи).У првом кругу уведено је 2×1012 фага;у другом, 2×1010 фага;у трећем и четвртом кругу селекције, 2×109 фага по животињи.Садржај фага у ЦСФ и узорцима крви прикупљеним у назначеним временским тачкама одређен је бројањем плака према упутствима произвођача (Т7Селецт системски приручник).Селекција фага је изведена интравенском ињекцијом пречишћених библиотека у репну вену или поновним убризгавањем фага екстрахованог из ЦСФ-а из претходног круга селекције, а накнадне бербе су обављене на 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин, односно 240 мин узорака крви.Спроведена су укупно четири круга ин виво панинга у којима су две одабране гране одвојено похрањене и анализиране током прва три круга селекције.Сви уметци фага екстраховани из ЦСФ из прва два круга селекције подвргнути су 454/Роцхе пиросеквенцији, док су сви клонови екстраховани из ЦСФ из последња два круга селекције ручно секвенционирани.Сви крвни фаги из првог круга селекције су такође подвргнути 454/Роцхе пиросеквенцији.За ињекцију клонова фага, одабрани фаги су амплификовани у Е. цоли (БЛ5615) на плочама од 500 цм2 на 37°Ц током 4 сата.Индивидуално одабрани и ручно секвенцирани клонови су размножени у ТБ медијуму.После екстракције фага, пречишћавања и уклањања ендотоксина (као што је горе описано), 2 × 1010 фага/животињи у 300 μл је убризгано интравенозно у једну репну вену.
Претходна обрада и квалитативно филтрирање података секвенце.Необрађени 454/Роцхе подаци су конвертовани из бинарног стандардног формата мапе тока (сфф) у Пеарсон-ов формат читљив за људе (фаста) коришћењем софтвера произвођача.Даља обрада нуклеотидне секвенце је обављена коришћењем власничких Ц програма и скрипти (необјављени софтверски пакет) као што је описано у наставку.Анализа примарних података укључује строге вишестепене процедуре филтрирања.Да би се филтрирала очитавања која нису садржала важећу секвенцу ДНК уметања од 12 мера, читања су секвенцијално поређана са почетном ознаком (ГТГАТГТЦГГГГАТЦЦГААТТЦТ), стоп етикетом (ТААГЦТТГЦГГЦЦГЦАЦТЦГАГТА) и позадинским уметком (ЦЦЦТГЦАГГГАТАТЦЦЦГГГАГЦТЦГТЦГАЦлеман) коришћењем теста глобалног Нет-ВВ.поравнање које дозвољава до 2 недоследности по поравнању31.Стога су из библиотеке уклоњена читања без ознака за почетак и заустављање и читања која садрже уметке у позадини, тј. поравнања која прелазе дозвољени број неподударања.Што се тиче преосталих очитавања, Н-мер ДНК секвенца која се протеже од почетне ознаке и завршава пре ознаке заустављања је изрезана из оригиналне секвенце очитавања и даље обрађена (у даљем тексту „уметнути“).Након транслације уметка, део после првог стоп кодона на 5′ крају прајмера се уклања из инсерта.Поред тога, уклоњени су и нуклеотиди који су довели до некомплетних кодона на 3′ крају прајмера.Да би се искључили уметци који садрже само позадинске секвенце, уклоњени су и преведени уметци који почињу са шаблоном аминокиселина „ПАГ“.Пептиди са посттранслационом дужином мањом од 3 аминокиселине су уклоњени из библиотеке.На крају, уклоните сувишност у групи уметања и одредите учесталост сваког јединственог уметања.Резултати ове анализе укључивали су листу нуклеотидних секвенци (уметака) и њихових (читања) фреквенција (додатне слике 1ц и 2).
Групирајте Н-мер ДНК уметке према сличности секвенце: Да би се елиминисале грешке секвенционирања специфичне за 454/Роцхе (као што су проблеми са секвенционирањем екстензија хомополимера) и уклонили мање важне редунданције, претходно филтрирани уметци Н-мер ДНК секвенце (инсерти) се сортирају по сличности.уметања (дозвољене су до 2 неподударне базе) коришћењем итеративног алгоритма дефинисаног на следећи начин: уметања се прво сортирају по учесталости (од највеће до најниже), а ако су иста, по њиховом секундарном сортирању по дужини (од најдуже до најкраће) ).Дакле, најчешћа и најдужа уметања дефинишу прву „групу“.Групна фреквенција је подешена на кључну фреквенцију.Затим, свако уметање преостало на сортираној листи је покушано да се дода групи по пару Неедлеман-Вунсцх поравнања.Ако број неподударања, уметања или брисања у поравнању не прелази праг од 2, уметање се додаје групи, а укупна учесталост групе се повећава за колико често је уметање додато.Уметци додати групи су означени као коришћени и искључени из даље обраде.Ако се секвенца уметања не може додати у већ постојећу групу, секвенца уметања се користи за креирање нове групе са одговарајућом фреквенцијом уметања и означена као коришћена.Итерација се завршава када се свака секвенца уметања или користи за формирање нове групе или може бити укључена у већ постојећу групу.На крају крајева, груписани уметци који се састоје од нуклеотида се на крају преводе у пептидне секвенце (пептидне библиотеке).Резултат ове анализе је скуп уметања и њихових одговарајућих фреквенција који чине број узастопних читања (додатна слика 2).
Генерисање мотива: На основу листе јединствених пептида, креирана је библиотека која садржи све могуће обрасце аминокиселина (аа) као што је приказано у наставку.Сваки могући образац дужине 3 је екстрахован из пептида и његов инверзни образац је додат заједно са заједничком библиотеком мотива која садржи све обрасце (трипептиде).Библиотеке мотива који се јако понављају су секвенциониране и уклоњена сувишност.Затим смо за сваки трипептид у библиотеци мотива проверили његово присуство у библиотеци помоћу рачунарских алата.У овом случају, фреквенција пептида који садржи пронађени мотивни трипептид се додаје и додељује мотиву у библиотеци мотива („број мотива“).Резултат генерисања мотива је дводимензионални низ који садржи сва појављивања трипептида (мотива) и њихове одговарајуће вредности, а то су број секвенционих читања која резултирају одговарајућим мотивом када се читања филтрирају, групишу и преводе.метрика као што је детаљно описано горе.
Нормализација броја мотива и одговарајућих дијаграма расејања: Број мотива за сваки узорак је нормализован коришћењем
где је ни број читања која садрже тему и.Дакле, ви представља процентуалну учесталост читања (или пептида) који садрже мотив и у узорку.П-вредности за ненормализовани број мотива су израчунате коришћењем Фишеровог егзактног теста.Што се тиче корелограма броја мотива, Спирманове корелације су израчунате коришћењем нормализованог броја мотива са Р.
Да би се визуелизовао садржај аминокиселина на свакој позицији у библиотеци пептида, креирани су веб логограми 32, 33 (хттп://веблого.тхрееплусоне.цом).Прво, садржај аминокиселина на свакој позицији 12-мерног пептида се чува у матрици од 20×12.Затим, скуп од 1000 пептида који садрже исти релативни садржај аминокиселина на свакој позицији се генерише у формату брзе секвенце и даје се као улаз за веб-лого 3, који генерише графички приказ релативног садржаја амино киселина на свакој позицији.за дату библиотеку пептида.Да би се визуелизовали вишедимензионални скупови података, топлотне мапе су креиране коришћењем интерно развијеног алата у Р (биосХеатмап, Р пакет који тек треба да буде објављен).Дендрограми представљени у топлотним картама су израчунати коришћењем Вордове хијерархијске методе груписања са метриком Еуклидске удаљености.За статистичку анализу података о бодовању мотива, П вредности за ненормализовано бодовање су израчунате коришћењем Фишеровог егзактног теста.П-вредности за друге скупове података су израчунате у Р користећи Студентов т-тест или АНОВА.
Одабрани клонови фага и фаги без уметака су убризгани интравенозно преко репне вене (2 × 1010 фага/животињи у 300 μл ПБС).Десет минута пре перфузије и накнадне фиксације, исте животиње су интравенозно убризгане са 100 μл лектина обележеног ДиЛигхт594 (Вецтор Лабораториес Инц., ДЛ-1177).60 минута након ињекције фага, пацовима је перфузирано срце са 50 мл ПБС, а затим са 50 мл 4% ПФА/ПБС.Узорци мозга су додатно фиксирани преко ноћи у 4% ПФА/ПБС и натопљени у 30% сахарозе преко ноћи на 4°Ц.Узорци се брзо замрзавају у ОЦТ смеши.Имунохистохемијска анализа смрзнутих узорака изведена је на собној температури на криосекцијама од 30 µм блокираним са 1% БСА и инкубираних са поликлонским ФИТЦ-обележеним антителима против Т7 фага (Новус НБ 600-376А) на 4 °Ц.Инкубирајте преко ноћи.Коначно, пресеци су испрани 3 пута са ПБС и испитани конфокалним ласерским микроскопом (Леица ТЦС СП5).
Сви пептиди са минималном чистоћом од 98% су синтетизовани помоћу ГенСцрипт УСА, биотиниловани и лиофилизовани.Биотин је везан преко додатног троструког глицинског одстојника на Н-крају.Проверите све пептиде помоћу масене спектрометрије.
Стрептавидин (Сигма С0677) је помешан са 5-струким еквимоларним вишком биотинилованог пептида, биотинилованог БАЦЕ1 инхибиторног пептида или комбинацијом (3:1 однос) биотинилованог БАЦЕ1 инхибиторног пептида и БАЦЕ1 инхибиторног пептида у 5-10% ДМСО/инцуба.1 сат на собној температури пре ињекције.Стрептавидин-коњуговани пептиди су убризгани интравенозно у дози од 10 мг/кг у једну од репних вена пацова са церебралном шупљином.
Концентрација стрептавидин-пептидних комплекса је процењена помоћу ЕЛИСА.Нунц Макисорп микротитарске плоче (Сигма) су обложене преко ноћи на 4°Ц са 1,5 μг/мл мишјим анти-стрептавидин антителом (Тхермо, МА1-20011).Након блокирања (пуфер за блокирање: 140 нМ НаЦЛ, 5 мМ ЕДТА, 0,05% НП40, 0,25% желатин, 1% БСА) на собној температури у трајању од 2 сата, испрати плочу са 0,05% Твеен-20/ПБС (пуфер за испирање) и 3 секунде у плазма се додавати узорци са блоком ЦСФ-а. :10 000, ЦСФ 1:115).Плоча је затим инкубирана преко ноћи на 4°Ц са детекционим антителом (1 μг/мл, анти-стрептавидин-ХРП, Новус НБ120-7239).После три корака испирања, стрептавидин је детектован инкубацијом у раствору ТМБ супстрата (Роцхе) до 20 мин.Након заустављања развоја боје са 1М Х2СО4, измерите апсорбанцију на 450 нм.
Функција комплекса стрептавидин-пептид-БАЦЕ1 инхибитор је процењена помоћу Аβ(1-40) ЕЛИСА у складу са протоколом произвођача (Вако, 294-64701).Укратко, узорци ЦСФ су разблажени у стандардном разблаживачу (1:23) и инкубирани преко ноћи на 4°Ц у плочама са 96 јажица обложеним антителом за хватање БНТ77.После пет корака испирања, ХРП-коњуговано БА27 антитело је додато и инкубирано 2 сата на 4°Ц, након чега је уследило пет корака испирања.Аβ(1–40) је детектован инкубацијом у раствору ТМБ током 30 минута на собној температури.Након што је развој боје заустављен са стоп раствором, измерите апсорбанцију на 450 нм.Узорци плазме су подвргнути екстракцији чврсте фазе пре Аβ(1–40) ЕЛИСА.Плазма је додата у 0,2% ДЕА (Сигма) у плоче са 96 јажица и инкубирана на собној температури 30 минута.Након сукцесивног прања СПЕ плоча (Оасис, 186000679) водом и 100% метанолом, на СПЕ плоче су додати узорци плазме и сва течност је уклоњена.Узорци су испрани (прво са 5% метанола, а затим са 30% метанола) и елуирани са 2% НХ4ОХ/90% метанола.Након сушења елуата на 55°Ц током 99 минута уз константну струју Н2, узорци су редуковани у стандардним разблаживачима и Аβ(1–40) је мерен као што је горе описано.
Како цитирати овај чланак: Урицх, Е. ет ал.Достава терета у мозак помоћу транзитних пептида идентификованих ин виво.Наука.5, 14104;дои: 10.1038/среп14104 (2015).
Ликхота Ј., Скјорринге Т., Тхомсен ЛБ и Моос Т. Испорука макромолекуларних лекова у мозак коришћењем циљане терапије.Јоурнал оф Неуроцхемистри 113, 1–13, 10.1111/ј.1471-4159.2009.06544.к (2010).
Брашњевиц, И., Стеинбусцх, ХВ, Сцхмитз, Ц., анд Мартинез-Мартинез, П. Испорука пептидних и протеинских лекова кроз крвно-мождану баријеру.Прог Неуробиол 87, 212–251, 10.1016/ј.пнеуробио.2008.12.002 (2009).
Пардридге, ВМ Крвно-мождана баријера: уско грло у развоју лекова за мозак.НеуроРк 2, 3–14, 10.1602/неурорк.2.1.3 (2005).
Јохансон, КЕ, Дунцан, ЈА, Стопа, ЕГ, и Бирд, А. Изгледи за побољшану испоруку лекова и циљање у мозак путем хороидног плексуса-ЦСФ пута.Пхармацеутицал Ресеарцх 22, 1011–1037, 10.1007/с11095-005-6039-0 (2005).
Пардридге, ВМ Модернизација биофармацеутика са молекуларним тројанским коњима за испоруку мозга.Биоцоњуг Цхем 19, 1327–1338, 10.1021/бц800148т (2008).
Пардридге, транспорт пептида посредован ВМ рецептором кроз крвно-мождану баријеру.Ендоцр Рев. 7, 314–330 (1986).
Ниевоехнер, Ј. ет ал.Повећајте пенетрацију у мозак и ефикасност терапијских антитела користећи моновалентне молекуларне шатлове.Неурон 81, 49–60, 10.1016/ј.неурон.2013.10.061 (2014).
Биен-Лее, Н. ет ал.Транспорт рецептора трансферина (ТфР) одређује узимање у мозгу афинитетних варијанти ТфР антитела.Ј Екп Мед 211, 233–244, 10.1084/јем.20131660 (2014).