ЛЦ Основе решавања проблема, део ИИИ: Врхови не изгледају добро

Неке теме за решавање проблема са ЛЦ никада нису застареле, јер постоје проблеми у ЛЦ пракси, чак и када се технологија инструмента временом побољшава. Постоји много начина на које проблеми могу настати у ЛЦ систему и завршити у лошем облику врха. Када се појаве проблеми у вези са обликом врха, кратка листа могућих узрока за ове резултате помаже да се поједностави наше искуство у решавању проблема.
Било је забавно писати ову колумну „ЛЦ Троублесхоотинг“ и размишљати о темама сваког месеца, јер неке теме никада не излазе из моде. Док у области истраживања хроматографије одређене теме или идеје постају застареле јер их замењују новије и боље идеје, у области решавања проблема, од првог отклањања проблема, од првог дана овог часописа за решавање проблема, неки чланак о решавању проблема у ЛЦ-у је још увек релевантан (од када се тема19 појављује у ЛЦ-у) 83(1). Током протеклих неколико година, фокусирао сам неколико одељака за решавање проблема са ЛЦ-ом на савремене трендове који утичу на течну хроматографију (ЛЦ) (на пример, релативно поређење нашег разумевања утицаја притиска на задржавање [2] Нев Адванцес) Наше тумачење резултата ЛЦ и како да решимо проблеме са савременим ЛЦ инструментима који су започели са инсталацијом 1. децембра 2013. године. фокусиран на неке од тема „живота и смрти“ решавања проблема са ЛЦ — елементи који су одлични за било који алат за решавање проблема су од суштинског значаја, без обзира на старост система који користимо. Основна тема ове серије је веома релевантна за ЛЦГЦ-ов чувени „Водич за решавање проблема ЛЦ“ зидне карте (4) која виси у многим лабораторијама у овој серији. , на зидном дијаграму су наведена 44 различита потенцијална узрока лошег облика врха! Не можемо детаљно размотрити сва ова питања у једном чланку, тако да ћу се у овом првом делу о овој теми фокусирати на неке од оних које најчешће виђам. Надам се да ће млади и стари ЛЦ корисници пронаћи неке корисне савете и подсетнике о овој важној теми.
Све чешће одговарам на питања о решавању проблема са „све је могуће“. Овај одговор може изгледати лак када разматрам запажања која је тешко протумачити, али сматрам да је често прикладан. Уз много могућих узрока лошег облика врха, важно је да будете отворени када размишљате о томе шта би проблем могао бити, и да бисте могли да одредите приоритете потенцијалних узрока за почетак нашег заједничког решавања проблема.
Кључни корак у свакој вежби решавања проблема – али онај за који мислим да је потцењен – је препознавање да постоји проблем који треба решити. Препознавање да постоји проблем често значи препознавање да је оно што се дешава са алатом другачије од наших очекивања, која су обликована теоријом, емпиријским знањем и искуством (5). , глатки, мекани, предња ивица, реп, итд.), али и на ширину. Наша очекивања за стварни облик врха су једноставна. Теорија (6) добро подржава очекивања из уџбеника да, у већини случајева, хроматографски врхови треба да буду симетрични и да буду у складу са обликом Гаусове дистрибуције, као што је приказано на слици 1а, као што је приказано на слици 1а. ак облици на слици 1 показују неке од других могућности које би се могле уочити—другим речима, неке од начина на које би ствари могле да крену наопако. У остатку овог дела, посветићемо време дискусији о неким конкретним примерима ситуација које могу довести до ових типова облика.
Понекад се пикови уопште не примећују на хроматограму где се очекује да ће бити елуирани. Горња зидна дијаграма указује на то да је одсуство пика (под претпоставком да узорак заиста садржи циљни аналит у концентрацији која би требало да учини одговор детектора довољним да се види изнад буке) обично повезано са неким проблемом са инструментом или нетачним условима мобилне фазе (ако се уопште примећује).врхови, обично превише „слаби“). Кратка листа потенцијалних проблема и решења у овој категорији може се наћи у табели И.
Као што је горе поменуто, питање колико проширење врха треба толерисати пре него што се обрати пажња и покуша да се то поправи је сложена тема о којој ћу расправљати у будућем чланку. Моје искуство је да је значајно проширење врха често праћено значајном променом облика врха, а заостајање врха је чешће него пре врхунца или раздвајања. Међутим, неколико номиналних ширина може бити узроковано различитим разлозима:
Свако од ових питања је детаљно размотрено у претходним издањима Троублесхоотинг ЛЦ, а читаоци заинтересовани за ове теме могу се обратити овим претходним чланцима за информације о основним узроцима и потенцијалним решењима ових проблема.Детаљније.
Заостајање врха, предња страна врха и цепање могу бити узроковани хемијским или физичким феноменима, а листа потенцијалних решења за ове проблеме увелико варира, у зависности од тога да ли имамо посла са хемијским или физичким проблемом. Често, упоређивањем различитих пикова на хроматограму, можете пронаћи важне назнаке о томе који је највероватније облик узрока који је највероватније сличан узроку. не физички. Ако је погођен само један или неколико врхова, али остали изгледају добро, узрок је највероватније хемијски.
Хемијски узроци задржавања врха су превише сложени да би се овде укратко расправљало. Заинтересовани читалац је упућен у недавно издање „ЛЦ Троублесхоотинг“ за детаљнију дискусију (10). Међутим, лако је покушати смањити масу убризганог аналита и видети да ли се облик врха побољшава. мале масе аналита, или се хроматографски услови морају променити тако да се могу добити добри облици пикова чак и са већим масама које се убризгавају.
Такође постоји много потенцијалних физичких разлога за вршно задржавање. Читаоци заинтересовани за детаљну дискусију о могућностима упућују се на још једно недавно издање „Решавање проблема са ЛЦ“ (11). Један од чешћих физичких узрока вршног задржавања је лоша веза у тачки између ињектора и детектора (12). Екстремни пример који смо изградили у новом лабораторију је приказан на слици од пре неколико недеља. ињекциони вентил који раније нисмо користили, и уградили смо петљу за убризгавање мале запремине са ферулом који је био изливен на капилару од нерђајућег челика. После неких почетних експеримената за решавање проблема, схватили смо да је дубина отвора у статору вентила за убризгавање била много дубља него што смо навикли, што је резултирало великом мртвом запремином на дну отвора. феррула у одговарајући положај да елиминише мртви волумен на дну порта.
Фронтови врхова као што су они приказани на слици 1е такође могу бити узроковани физичким или хемијским проблемима. Уобичајени физички узрок предње ивице је тај што слој честица колоне није добро запакован или што су се честице реорганизовале током времена. Као и код вршног репа узрокованог овим физичким феноменом, најбољи начин да се то поправи је да се колона замени и облик колоне често називамо „без хемијског порекла. линеарни” услови задржавања. Под идеалним (линеарним) условима, количина аналита задржана у стационарној фази (дакле, фактор задржавања) је линеарно повезана са концентрацијом аналита у колони. Хроматографски, то значи да како се маса аналита убризганог у колону повећава, пик постаје виши, али се не поништава само када се та веза не поништава, а не шири се. ллер, али и шири како се убризгава већа маса. Поред тога, нелинеарни облици одређују облик хроматографских пикова, што резултира водећим или задњим ивицама. Као и код преоптерећења масе које изазива вршно задржавање (10), водећи врх узрокован нелинеарним задржавањем такође се може дијагностиковати смањењем масе убризганог аналита. хроматографски услови се морају променити да би се ово понашање свело на минимум.
Понекад посматрамо оно што се чини као „раздвојени“ пик, као што је приказано на слици 1ф. Први корак у решавању овог проблема је да се утврди да ли је облик пика последица делимичне коелуације (тј. присуства два различита, али блиско елуирајућа једињења). Ако заправо постоје два различита аналита који елуирају близу један другом, онда је то ствар поновног бројања „побољшања“ њихове резолуције (нпр. подељени” пикови су повезани са физичким Перформансе немају никакве везе са самом колоном. Често је најважнији траг за ову одлуку да ли сви пикови на хроматограму показују подељене облике, или само један или два. Ако је само један или два, вероватно је проблем коелуације;ако су сви врхови подељени, вероватно је то физички проблем, највероватније повезан са самом колоном.
Раздвојени врхови повезани са физичким својствима саме колоне обично су последица делимично блокираних улазних или излазних фрита, или реорганизације честица у колони, омогућавајући мобилној фази да тече брже од мобилне фазе у одређеним областима формирања канала колоне .у другим регионима (11). Делимично зачепљена фрита се понекад може очистити обрнутим протоком кроз колону;међутим, према мом искуству, ово је обично краткорочно, а не дугорочно решење. Ово је често фатално за модерне колоне ако се честице рекомбинују унутар колоне. У овом тренутку, најбоље је заменити колону и наставити.
Врх на слици 1г, такође из недавног примера у мојој лабораторији, обично указује да је сигнал толико висок да је достигао високу границу опсега одзива. За детекторе оптичке апсорпције (УВ-вис у овом случају), када је концентрација аналита веома висока, аналит апсорбује већину светлости која пролази кроз ћелију протока детектора, остављајући веома мало фото-сигнала да се детектује. извори шума, као што су залутала светлост и „тамна струја“, чинећи сигнал веома „замућеним“ по изгледу и независним од концентрације аналита.Када се то деси, проблем се често може лако решити смањењем убризгане запремине аналита – смањењем запремине убризгавања, разблажењем узорка или обоје.
У школи за хроматографију користимо сигнал детектора (тј. И-осу у хроматограму) као индикатор концентрације аналита у узорку. Тако да изгледа чудно видети хроматограм са сигналом испод нуле, јер је једноставно тумачење да ово указује на негативну концентрацију аналита – што наравно није физички могуће физички.
У овом случају, негативан пик једноставно значи да молекули који елуирају из колоне апсорбују мање светлости од саме мобилне фазе непосредно пре и после пика. Ово се може десити, на пример, када се користе релативно ниске таласне дужине детекције (<230 нм) и адитиви за мобилну фазу који апсорбују већину светлости на овим таласним дужинама. Такви адитиви у негативном формату могу да користе компоненте као што су компоненте за мобилну фазу или ацетолне компоненте као што су компоненте за мобилну фазу или раствараче. пикове да би припремили калибрациону криву и добили тачне квантитативне информације, тако да нема фундаменталног разлога да их избегавамо саме по себи (овај метод се понекад назива „индиректна УВ детекција“) (13). Међутим, ако заиста желимо да избегнемо негативне пикове у целини, у случају детекције апсорбанције, најбоље решење је да користимо другачију детекцију тако да детекција више детекције или таласне фазе промени састав тако да промени таласну фазу. апсорбују мање светлости од аналита.
Негативни врхови се такође могу појавити када се користи детекција индекса преламања (РИ) када се индекс преламања компоненти осим аналита у узорку, као што је матрица растварача, разликује од индекса преламања мобилне фазе. Ово се такође дешава са УВ-вис детекцијом, али овај ефекат има тенденцију да буде ослабљен у односу на детекцију РИ негативног пеак-а. оно мобилне фазе.
У трећем делу о основној теми решавања проблема ЛЦ, расправљао сам о ситуацијама у којима се посматрани облик врха разликује од очекиваног или нормалног облика врха. Ефективно решавање таквих проблема почиње познавањем очекиваних облика врхова (на основу теорије или претходног искуства са постојећим методама), тако да су одступања од ових очекивања очигледна. детаљно наведите неке од разлога које најчешће видим. Познавање ових детаља представља добро место за почетак решавања проблема, али не обухвата све могућности. Читаоци заинтересовани за детаљнију листу узрока и решења могу да погледају зидну шему ЛЦГЦ „Водич за решавање проблема ЛЦ“.
(4) Зидна дијаграм ЛЦГЦ „ЛЦ Троублесхоотинг Гуиде”.хттпс://ввв.цхроматограпхионлине.цом/виев/троублесхоотинг-валлцхарт (2021).
(6) А. Фелингер, Анализа података и обрада сигнала у хроматографији (Елсевиер, Нев Иорк, НИ, 1998), стр. 43-96.
(8) Вахаб МФ, Дасгупта ПК, Кадјо АФ и Армстронг ДВ, Анал.Цхим.Јоурнал.Рев.907, 31–44 (2016). хттпс://дои.орг/10.1016/ј.аца.2015.11.043.


Време поста: Јул-04-2022