Неке теме решавања проблема са течним кристалима (LC) никада нису застареле, јер постоје проблеми у LC пракси, чак и када се технологија инструмената побољшава током времена. Постоји много начина на које се проблеми могу појавити у LC систему и завршити лошим обликом врха. Када се појаве проблеми везани за облик врха, кратка листа могућих узрока за ове резултате помаже у поједностављивању нашег искуства решавања проблема.
Било је забавно писати ову колумну „Решавање проблема са течном хроматографијом“ и размишљати о темама сваког месеца, јер неке теме никада не излазе из моде. Док у области истраживања хроматографије одређене теме или идеје застаревају јер их замењују новије и боље идеје, у области решавања проблема, од појављивања првог чланка о решавању проблема у овом часопису (тадашњи часопис о течној хроматографији), пошто су неке теме и даље релевантне, 1983. године (1). Током протеклих неколико година, фокусирао сам се на неколико одељака о решавању проблема са течном хроматографијом на савремене трендове који утичу на течну хроматографију (ЛЦ) (на пример, релативно поређење нашег разумевања утицаја притиска на задржавање [2] Нови напредак), наше тумачење резултата ЛЦ и како решавати проблеме са модерним ЛЦ инструментима. У овомесечном издању настављам своју серију (3), која је започета у децембру 2021. године, а која се фокусирала на неке од „животних“ тема решавања проблема са ЛЦ – елементи који су одлични за сваког решавача проблема су неопходни, без обзира на старост система који користимо. Главна тема ове серије је веома релевантна за чувени зидни графикон „Водич за решавање проблема са ЛЦ“ (4) који виси у... многе лабораторије. За трећи део ове серије, одлучио сам да се фокусирам на питања везана за облик или карактеристике врхова. Невероватно, зидна табела наводи 44 различита потенцијална узрока лошег облика врхова! Не можемо детаљно размотрити сва ова питања у једном чланку, па ћу се у овом првом делу на ову тему фокусирати на неке од оних које најчешће виђам. Надам се да ће млади и стари корисници LC пронаћи неке корисне савете и подсетнике о овој важној теми.
Све чешће одговарам на питања о решавању проблема са „све је могуће“. Овај одговор може деловати лако када се разматрају запажања која је тешко интерпретирати, али сматрам да је често прикладан. Са многим могућим узроцима лошег облика врха, важно је бити отвореног ума када се разматра шта би могао бити проблем и бити у стању да одредимо приоритет потенцијалних узрока како бисмо започели наше напоре за решавање проблема, фокусирајући се на оне најчешће могућности, ова тачка је веома важна.
Кључни корак у свакој вежби решавања проблема — али онај који сматрам потцењеним — јесте препознавање да постоји проблем који треба решити. Препознавање да постоји проблем често значи препознавање да се оно што се дешава са алатом разликује од наших очекивања, која су обликована теоријом, емпиријским знањем и искуством (5). „Облик врха“ на који се овде позивамо заправо се не односи само на облик врха (симетричан, асиметричан, глатки, пахуљасти, водећа ивица, реп итд.), већ и на ширину. Наша очекивања за стварни облик врха су једноставна. Теорија (6) добро подржава очекивање из уџбеника да би, у већини случајева, хроматографски врхови требало да буду симетрични и да одговарају облику Гаусове расподеле, као што је приказано на слици 1а. Оно што очекујемо од ширине врхова је сложеније питање и о овој теми ћемо разговарати у будућем чланку. Остали облици врхова на слици 1 показују неке од других могућности које би се могле посматрати — другим речима, неке од начина на које ствари могу кренути по злу. У остатку овог дела, посветићемо време разматрању неких специфичних примера ситуација које могу довести до ових типова облика.
Понекад се врхови уопште не примећују на хроматограму тамо где се очекује да буду елуирани. Горе приказана зидна табела показује да је одсуство врха (под претпоставком да узорак заправо садржи циљни аналит у концентрацији која би требало да учини одзив детектора довољним да га види изнад шума) обично повезано са неким проблемом са инструментом или нетачним условима мобилне фазе (ако се уопште примећују). врхови, обично превише „слаби“). Кратак списак потенцијалних проблема и решења у овој категорији може се наћи у Табели I.
Као што је горе поменуто, питање колико проширења врхова треба толерисати пре него што се обрати пажња и покуша да се то поправи је сложена тема о којој ћу разговарати у будућем чланку. Моје искуство је да значајно проширење врхова често прати значајна промена облика врха, а „реп“ врхова је чешћи него пре врха или раздвајање. Међутим, номинално симетрични врхови су такође проширени, што може бити узроковано неколико различитих разлога:
Свако од ових питања је детаљно разматрано у претходним издањима часописа „Решавање проблема са ЛЦ“, а читаоци заинтересовани за ове теме могу се позвати на ове претходне чланке за информације о узроцима и потенцијалним решењима ових проблема. Више детаља.
Репови пикова, фронтални врхови и цепање пикова могу бити узроковани хемијским или физичким феноменима, а листа потенцијалних решења за ове проблеме значајно варира, у зависности од тога да ли се ради о хемијском или физичком проблему. Често, упоређивањем различитих пикова у хроматограму, можете пронаћи важне назнаке о томе који је кривац. Ако сви пикови у хроматограму показују сличне облике, узрок највероватније није физички. Ако је погођен само један или неколико пикова, али остали изгледају добро, узрок је највероватније хемијски.
Хемијски узроци „репова“ пика су превише сложени да би се овде укратко разматрали. Заинтересовани читалац се упућује на недавно издање „LC Troubleshooting“ за детаљнију дискусију (10). Међутим, једноставна ствар коју може да се покуша јесте да се смањи маса убризганог аналита и види да ли се облик пика побољшава. Ако јесте, онда је то добар показатељ да је проблем „преоптерећење масом“. У овом случају, метод мора бити ограничен на убризгавање малих маса аналита или се хроматографски услови морају променити тако да се могу добити добри облици пикова чак и са убризганим већим масама.
Такође постоји много потенцијалних физичких разлога за појаву „вршних репова“. Читаоци заинтересовани за детаљну дискусију о могућностима упућују се на још једно недавно издање „LC Troubleshooting“ (11). Један од најчешћих физичких узрока појаве „вршних репова“ је лоша веза у тачки између инјектора и детектора (12). Екстремни пример је приказан на слици 1д, добијеној у мојој лабораторији пре неколико недеља. У овом случају, направили смо систем са новим инјекционим вентилом који раније нисмо користили и инсталирали смо инјекциону петљу мале запремине са ферулом која је била обликована на капилар од нерђајућег челика. Након неких почетних експеримената за решавање проблема, схватили смо да је дубина отвора у статору инјекционог вентила много већа него што смо навикли, што је резултирало великом мртвом запремином на дну отвора. Овај проблем се лако решава заменом инјекционе петље другом цеви, можемо подесити ферулу у правилан положај да бисмо елиминисали мртву запремину на дну отвора.
Фронтови пикова попут оних приказаних на слици 1е такође могу бити узроковани физичким или хемијским проблемима. Уобичајени физички узрок водеће ивице је да слој честица у колони није добро упакован или да су се честице временом реорганизовале. Као и код репа пика изазваног овим физичким феноменом, најбољи начин да се ово реши јесте да се замени колона и настави са радом. У основи, облици пикова водеће ивице хемијског порекла често настају из онога што називамо „нелинеарним“ условима задржавања. Под идеалним (линеарним) условима, количина аналита коју задржава стационарна фаза (дакле, фактор задржавања) је линеарно повезана са концентрацијом аналита у колони. Хроматографски, то значи да како се маса аналита убризганог у колону повећава, пик постаје виши, али не и шири. Ова веза се прекида када је понашање задржавања нелинеарно, а пикови не само да постају виши већ и шири како се убризгава више масе. Поред тога, нелинеарни облици одређују облик хроматографских пикова, што резултира водећим или задњим ивицама. Као и код преоптерећења масом које узрокује репа пика (10), водећи пик узрокован... Нелинеарна ретенција се такође може дијагностиковати смањењем масе убризганог аналита. Ако се облик пика побољша, метода мора бити модификована тако да не прелази квалитет убризгавања који узрокује водећу ивицу, или се хроматографски услови морају променити како би се ово понашање минимизирало.
Понекад посматрамо оно што изгледа као „раздвојени“ врх, као што је приказано на слици 1ф. Први корак у решавању овог проблема јесте утврђивање да ли је облик врха последица делимичне коелуције (тј. присуства два различита, али блиско елуирајућа једињења). Ако заправо постоје два различита аналита која елуирају близу једно другом, онда је у питању побољшање њихове резолуције (на пример, повећањем селективности, задржавања или броја плоча), а очигледни „раздвојени“ врхови су повезани са физичким перформансама. Перформансе немају никакве везе са самом колоном. Често је најважнији траг за ову одлуку да ли сви врхови у хроматограму показују раздвојене облике или само један или два. Ако је само један или два, вероватно је у питању проблем коелуције; ако су сви врхови раздвојени, вероватно је у питању физички проблем, највероватније повезан са самом колоном.
Раздвојени врхови повезани са физичким својствима саме колоне обично су последица делимично блокираних улазних или излазних фрита, или реорганизације честица у колони, што омогућава мобилној фази да тече брже од мобилне фазе у одређеним областима формирања канала колоне, а у другим регионима (11). Делимично зачепљена фрита се понекад може очистити обртањем протока кроз колону; међутим, по мом искуству, ово је обично краткорочно, а не дугорочно решење. Ово је често фатално код модерних колона ако се честице рекомбинују унутар колоне. У овом тренутку је најбоље заменити колону и наставити.
Врхунац на слици 1г, такође из недавног примера у мојој лабораторији, обично указује да је сигнал толико висок да је достигао горњу границу опсега одзива. Код оптичких детектора апсорбанције (у овом случају UV-VIS), када је концентрација аналита веома висока, аналит апсорбује већину светлости која пролази кроз проточну ћелију детектора, остављајући врло мало светлости за детекцију. Под овим условима, на електрични сигнал са фотодетектора у великој мери утичу различити извори шума, као што су расејана светлост и „тамна струја“, што сигнал чини веома „мутним“ по изгледу и независним од концентрације аналита. Када се то деси, проблем се често може лако решити смањењем запремине убризгавања аналита – смањењем запремине убризгавања, разблаживањем узорка или обоје.
У школи хроматографије, користимо сигнал детектора (тј. y-оса у хроматограму) као индикатор концентрације аналита у узорку. Зато делује чудно видети хроматограм са сигналом испод нуле, јер је једноставно тумачење да то указује на негативну концентрацију аналита – што наравно није физички могуће. По мом искуству, негативни врхови се најчешће примећују када се користе оптички детектори апсорбанције (нпр. UV-vis).
У овом случају, негативни пик једноставно значи да молекули који елуирају из колоне апсорбују мање светлости него сама мобилна фаза непосредно пре и после пика. Ово се може десити, на пример, када се користе релативно ниске таласне дужине детекције (<230 nm) и адитиви мобилне фазе који апсорбују већину светлости на овим таласним дужинама. Такви адитиви могу бити компоненте растварача мобилне фазе као што је метанол или компоненте пуфера као што су ацетат или формиат. Негативни пикови се заправо могу користити за припрему калибрационе криве и добијање тачних квантитативних информација, тако да не постоји фундаментални разлог да се они избегавају сами по себи (ова метода се понекад назива „индиректна УВ детекција“) (13). Међутим, ако заиста желимо да у потпуности избегнемо негативне пикове, у случају детекције апсорбанције, најбоље решење је да се користи другачија таласна дужина детекције тако да аналит апсорбује више од мобилне фазе или да се промени састав мобилне фазе тако да апсорбују мање светлости од аналита.
Негативни пикови се такође могу појавити када се користи детекција индекса преламања (РИ) када се индекс преламања компоненти осим аналита у узорку, као што је матрица растварача, разликује од индекса преламања мобилне фазе. Ово се такође дешава код УВ-вид детекције, али овај ефекат има тенденцију да буде ослабљен у односу на РИ детекцију. У оба случаја, негативни пикови се могу минимизирати ближим подударањем састава матрице узорка са саставом мобилне фазе.
У трећем делу о основној теми решавања проблема са LC-ом, разматрао сам ситуације у којима се облик посматраног врха разликује од очекиваног или нормалног облика врха. Ефикасно решавање проблема таквих проблема почиње познавањем очекиваних облика врхова (на основу теорије или претходног искуства са постојећим методама), тако да су одступања од ових очекивања очигледна. Проблеми са обликом врха имају много различитих потенцијалних узрока (преширок, реп, водећа ивица итд.). У овом делу детаљно разматрам неке од разлога које најчешће виђам. Познавање ових детаља пружа добро место за почетак решавања проблема, али не обухвата све могућности. Читаоци заинтересовани за детаљнији списак узрока и решења могу се позвати на зидну табелу LCGC „LC Troubleshooting Guide“.
(4) LCGC „Водич за решавање проблема са LC“ зидни графикон. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Анализа података и обрада сигнала у хроматографији (Elsevier, Њујорк, NY, 1998), стр. 43–96.
(8) Вахаб МФ, Дасгупта П.К., Каџо АФ и Армстронг ДВ, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.