Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Течна биопсија (ЛБ) је концепт који брзо добија на популарности у области биомедицине.Концепт се углавном заснива на детекцији фрагмената циркулишуће екстрацелуларне ДНК (ццфДНК), који се углавном ослобађају као мали фрагменти након смрти ћелије у различитим ткивима.Мали део ових фрагмената потиче из страних (страних) ткива или организама.У тренутном раду, применили смо овај концепт на дагње, врсту стражара позната по свом високом капацитету филтрације морске воде.Користимо способност дагњи ​​да делују као природни филтери за хватање фрагмената ДНК животне средине из различитих извора да бисмо пружили информације о биодиверзитету морских обалних екосистема.Наши резултати показују да хемолимфа дагње садржи фрагменте ДНК који се веома разликују по величини, од 1 до 5 кб.Секвенцирање сачмарица показало је да је велики број фрагмената ДНК страног микробног порекла.Међу њима смо пронашли фрагменте ДНК из бактерија, археја и вируса, укључујући вирусе за које се зна да инфицирају различите домаћине који се обично налазе у обалним морским екосистемима.У закључку, наша студија показује да концепт ЛБ примењен на дагње представља богат, али још неистражен извор знања о микробној разноликости у морским обалним екосистемима.
Утицај климатских промена (ЦЦ) на биодиверзитет морских екосистема је област истраживања која се брзо развија.Глобално загревање не само да изазива значајне физиолошке стресове, већ и помера еволуционе границе термичке стабилности морских организама, утичући на станиште бројних врста, подстичући их да траже повољније услове [1, 2].Осим што утиче на биодиверзитет метазоана, ЦЦ нарушава деликатну равнотежу интеракција домаћин-микроб.Ова микробна дисбактериоза представља озбиљну претњу за морске екосистеме јер чини морске организме подложнијим инфективним патогенима [3, 4].Верује се да СС игра важну улогу у масовним смртним случајевима, што је озбиљан проблем за управљање глобалним морским екосистемима [5, 6].Ово је важно питање с обзиром на економске, еколошке и нутритивне утицаје многих морских врста.Ово посебно важи за шкољке које живе у поларним регионима, где су ефекти ЦК непосреднији и озбиљнији [6, 7].У ствари, бивали као што су Митилус спп.се широко користе за праћење ефеката ЦЦ на морске екосистеме.Није изненађујуће што је релативно велики број биомаркера развијен за праћење њиховог здравља, често користећи двослојни приступ који укључује функционалне биомаркере засноване на ензимској активности или ћелијским функцијама као што су виталност ћелије и фагоцитна активност [8].Ове методе такође укључују мерење концентрације специфичних индикатора притиска који се акумулирају у меким ткивима након апсорпције великих количина морске воде.Међутим, висок капацитет филтрације и полуотворени циркулаторни систем шкољкаша пружају прилику за развој нових хемолимфних биомаркера користећи концепт течне биопсије (ЛБ), једноставног и минимално инвазивног приступа управљању пацијентима.Иако се у људском ЛБ може наћи неколико типова циркулишућих молекула, овај концепт се првенствено заснива на анализи секвенцирања ДНК фрагмената циркулишуће екстрацелуларне ДНК (ццфДНК) у плазми.У ствари, присуство циркулишуће ДНК у људској плазми је познато још од средине 20. века [11], али је тек последњих година појава високопропусних метода секвенцирања довела до клиничке дијагнозе засноване на ццфДНК.Присуство ових фрагмената ДНК у циркулацији је делимично последица пасивног ослобађања геномске ДНК (нуклеарне и митохондријалне) након смрти ћелије. Код здравих особа, концентрација ццфДНК је нормално ниска (<10 нг/мЛ), али се може повећати за 5-10 пута код пацијената који пате од различитих патологија или су подвргнути стресу, што доводи до оштећења ткива. Код здравих особа, концентрација ццфДНК је нормално ниска (<10 нг/мЛ), али се може повећати за 5-10 пута код пацијената који пате од различитих патологија или су подвргнути стресу, што доводи до оштећења ткива. У здорових лудеј концентрација вккДНК в нормале низкаа (<10 нг/мл), но може повишатьса в 5–10 раз в больних с различној патологији или подложних стрессусов, приводасему к повреждениу тканеј. Код здравих људи, концентрација цццДНК је нормално ниска (<10 нг/мЛ), али се може повећати за 5-10 пута код пацијената са различитим патологијама или под стресом који доводи до оштећења ткива.在 个体 中 中, ЦЦФДНА 的 浓度 通常 通常 通常 通常 通常 通常 较 (<10 НГ / мл), 但 在 患有 各 种 病理 或 压力 的 患者 中 中 中 的 倍 倍, 从而 从而 组织 损伤.在 健康 个体 中, ццфдна 的 浓度 较 低 （ (<10 нг/мл) 但 在 各 种 病理 或 肎可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ццфДНА обично низкие (<10 нг/мл) у здорових лудеј, но могут бить увеличени в 5-10 раз у пациентов с различитим патологиами или стресом, что приводе к повреждениу тканеј. Концентрације ццфДНК су обично ниске (<10 нг/мл) код здравих особа, али могу бити повећане 5-10 пута код пацијената са различитим патологијама или стресом, што доводи до оштећења ткива.Величина фрагмената ццфДНК увелико варира, али се обично креће од 150 до 200 бп.Анализа самопроизведене ццфДНК, односно ццфДНК из нормалних или трансформисаних ћелија домаћина, може се користити за откривање генетских и епигенетских промена присутних у нуклеарном и/или митохондријском геному, чиме се помаже клиничарима да одаберу специфичне молекуларно циљане терапије [13].Међутим, ццфДНК се може добити из страних извора као што је ццфДНК из феталних ћелија током трудноће или из трансплантираних органа [14,15,16,17].ццфДНК је такође важан извор информација за откривање присуства нуклеинских киселина инфективног агенса (страног), што омогућава неинвазивну детекцију широко распрострањених инфекција које нису идентификоване хемокултурама, избегавајући инвазивну биопсију инфицираног ткива [18].Недавне студије су заиста показале да људска крв садржи богат извор информација који се могу користити за идентификацију вирусних и бактеријских патогена и да је око 1% ццфДНК пронађене у људској плазми страног порекла [19].Ове студије показују да се биодиверзитет циркулишућег микробиома организма може проценити коришћењем ццфДНК анализе.Међутим, до недавно, овај концепт се користио искључиво код људи и, у мањој мери, код других кичмењака [20, 21].
У овом раду користимо ЛБ потенцијал за анализу ццфДНК Аулацомиа атра, јужне врсте која се обично налази на субантарктичким острвима Кергуелен, групи острва на врху велике висоравни која се формирала пре 35 милиона година.вулканска ерупција.Користећи ин витро експериментални систем, открили смо да дагње брзо преузимају фрагменте ДНК у морској води и улазе у одељак хемолимфе.Секвенцирање сачмарица показало је да ццфДНК хемолимфе дагњи ​​садржи фрагменте ДНК сопственог и не-сопственог порекла, укључујући симбиотске бактерије и фрагменте ДНК из биома типичне за хладне вулканске морске обалне екосистеме.ццфДНК хемолимфе такође садржи вирусне секвенце изведене из вируса са различитим распонима домаћина.Такође смо пронашли фрагменте ДНК вишећелијских животиња као што су коштане рибе, морске анемоне, алге и инсекти.У закључку, наша студија показује да се ЛБ концепт може успешно применити на морске бескичмењаке како би се створио богат геномски репертоар у морским екосистемима.
Одрасле јединке (55-70 мм дужине) Митилус платенсис (М. платенсис) и Аулацомиа атра (А. атра) сакупљене су са међуплимних стеновитих обала Порт-о-Франса (049°21.235 С, 070°13.490 Е.).Острва Кергуелен у децембру 2018. Остале одрасле плаве дагње (Митилус спп.) су набављене од комерцијалног добављача (ПЕИ Муссел Кинг Инц., Острво Принца Едварда, Канада) и стављене у резервоар са вентилацијом са контролисаном температуром (4°Ц) који садржи 10–20 Л 32‰ вештачког раствора соли.(вештачка морска со Рееф Цристал, Инстант Оцеан, Вирџинија, САД).За сваки експеримент мерене су дужина и тежина појединачних шкољки.
Бесплатни протокол отвореног приступа за овај програм доступан је на мрежи (хттпс://дои.орг/10.17504/протоцолс.ио.81вгб6з9олпк/в1).Укратко, ЛБ хемолимфа је сакупљена из мишића абдуктора као што је описано [22].Хемолимфа је избистрена центрифугирањем на 1200×г током 3 минута, супернатант је замрзнут (-20°Ц) до употребе.За изолацију и пречишћавање цфДНК, узорци (1,5-2,0 мл) су одмрзнути и обрађени помоћу НуцлеоСнап цфДНК комплета (Мацхереи-Нагел, Бетхлехен, ПА) према упутствима произвођача.ццфДНА је чувана на -80°Ц до даље анализе.У неким експериментима, ццфДНК је изолована и пречишћена коришћењем КИАамп ДНК Инвестигатор Кит-а (КИАГЕН, Торонто, Онтарио, Канада).Пречишћена ДНК је квантификована коришћењем стандардног ПицоГреен теста.Дистрибуција фрагмената изоловане ццфДНК је анализирана капиларном електрофорезом коришћењем Агилент 2100 биоанализера (Агилент Тецхнологиес Инц., Санта Цлара, ЦА) коришћењем комплета ДНК високе осетљивости.Тест је изведен коришћењем 1 µл узорка ццфДНК према упутствима произвођача.
За секвенцирање фрагмената ццфДНК хемолимфе, Геноме Куебец (Монтреал, Квебек, Канада) је припремио библиотеке сачмарица користећи Иллумина ДНК Мик комплет из Иллумина МиСек ПЕ75 комплета.Коришћен је стандардни адаптер (БиоО).Датотеке необрађених података доступне су у НЦБИ архиви читања секвенци (СРР8924808 и СРР8924809).Основни квалитет читања је процењен коришћењем ФастКЦ [23].Триммоматиц [24] је коришћен за адаптере за клипинг и читање лошег квалитета.Очитавања пушке са упареним крајевима су ФЛАСХ спојена у дужа појединачна очитавања са минималним преклапањем од 20 бп да би се избегла неслагања [25]. Обједињена читања су означена са БЛАСТН-ом коришћењем базе података таксономије шкољки НЦБИ (е вредност < 1е−3 и 90% хомологије), а маскирање секвенци ниске сложености је изведено коришћењем ДУСТ-а [26]. Обједињена читања су означена са БЛАСТН-ом коришћењем базе података таксономије шкољки НЦБИ (е вредност < 1е−3 и 90% хомологије), а маскирање секвенци ниске сложености је изведено коришћењем ДУСТ-а [26]. Объединенние чтениа били аннотировани с помосьу БЛАСТН с использованием бази данних таксономии двустворчатих моллусков НЦБИ (значение е < 1е-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательних низкој сложености било использовано с использованием ДУСТ [26]. Обједињена очитавања су означена са БЛАСТН-ом коришћењем НЦБИ базе података таксономије шкољки (е вредност < 1е-3 и 90% хомологије), а маскирање секвенце ниске сложености је изведено коришћењем ДУСТ-а [26].使用 双 壳类 нцби 分类 数据库 (е 值 <1е-3 和 90% 同源 性) 用 БЛАССНН 注释 合并 的 读数, 并 使用 дуст [26] 进行 低 复杂度 序列 的 掩蔽.使用 双 壳类 нцби 分类 （（（<1е-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 缻茰 Ｖ 合并 缻茰 Ｖ复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенние чтениа били аннотировани с помосьу БЛАСТН с использованием таксономическој бази данних двустворчатих моллусков НЦБИ (значение е <1е-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательних низкој сложности использовано с использованием ДУСТ [26]. Обједињена очитавања су означена са БЛАСТН коришћењем НЦБИ таксономске базе података о шкољкама (е вредност <1е-3 и 90% хомологије), а маскирање секвенце ниске сложености је изведено коришћењем ДУСТ-а [26].Читања су подељена у две групе: повезана са секвенцама шкољкаша (овде се називају самочитања) и неповезана (не-самочитања).Две групе су одвојено састављене коришћењем МЕГАХИТ-а за генерисање контига [27].У међувремену, таксономска дистрибуција читања ванземаљског микробиома је класификована коришћењем Кракен2 [28] и графички представљена Крона кружним графиконом на Галаксији [29, 30].Оптимални кмери су утврђени као кмерс-59 из наших прелиминарних експеримената. Самоконтиги су затим идентификовани усклађивањем са БЛАСТН-ом (двострука НЦБИ база података, е вредност < 1е-10 и 60% хомологије) за коначну белешку. Самоконтиги су затим идентификовани усклађивањем са БЛАСТН-ом (двострука НЦБИ база података, е вредност < 1е-10 и 60% хомологије) за коначну белешку. Затем собственние контиги били идентификовани путем составлениа с БЛАСТН (база данних двустворчатих моллусков НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%) дла окончательној аннотации. Самоконтиги су затим идентификовани упоређивањем са БЛАСТН (НЦБИ база података о шкољкама, е вредност <1е-10 и 60% хомологије) за коначну белешку.然后通过与БЛАСТН (双壳贝类НЦБИ 数据库, е 值< 1е-10 和60% Затем били идентификовани собственние контиги дла окончательној аннотации путем составлениа с БЛАСТН (база данних НЦБИ дла двустворчатих моллусков, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Самоконтигови су затим идентификовани за коначну белешку упоређивањем са БЛАСТН (НЦБИ база података о шкољкама, е вредност <1е-10 и 60% хомологије). Паралелно, контиги групе који нису самостални су означени са БЛАСТН (нт НЦБИ база података, е вредност < 1е-10 и 60% хомологије). Паралелно, контиги групе који нису самостални су означени са БЛАСТН (нт НЦБИ база података, е вредност < 1е-10 и 60% хомологије). Параллельно чужеродние групповие контиги били аннотировани с помосьу БЛАСТН (база данних нт НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Паралелно, контиги страних група су означени са БЛАСТН (НТ НЦБИ база података, е вредност <1е-10 и 60% хомологије).平行地,用БЛАСТН (нт НЦБИ 数据库,е 值< 1е-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地,用БЛАСТН (нт НЦБИ 数据库,е 值< 1е-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относасиеса к сопственој групи, били аннотировани с помосьу БЛАСТН (база данних нт НЦБИ, значение е <1е-10 и гомологиа 60%). Паралелно, контиги групе који нису самостални су означени са БЛАСТН (нт НЦБИ база података, е вредност <1е-10 и 60% хомологије). БЛАСТКС је такође спроведен на несамосталним контигама коришћењем базе података нр и РефСек протеина НЦБИ (е вредност < 1е-10 и 60% хомологије). БЛАСТКС је такође спроведен на несамосталним контигама коришћењем базе података нр и РефСек протеина НЦБИ (е вредност < 1е-10 и 60% хомологије). БЛАСТКС је такође био спроведен на несамостоательних контигах с использованием базе данних белк нр и РефСек НЦБИ (значење е <1е-10 и гомологиа 60%). БЛАСТКС је такође изведен на несамосталним контигама коришћењем база података нр и РефСек НЦБИ протеина (е вредност < 1е-10 и 60% хомологије).还使用нр 和РефСек 蛋白НЦБИ 数据库对非自身重叠群进行了БЛАСТКС (е 值< 1е-10 咧 60% 咧)还使用нр 和РефСек 蛋白НЦБИ 数据库对非自身重叠群进行了БЛАСТКС (е 值< 1е-10 咧 60% 咧) БЛАСТКС также виполнал на несамостоательних контигах с использованием баз данних белка нр и РефСек НЦБИ (значење е <1е-10 и гомологиа 60%). БЛАСТКС је такође изведен на несамосталним контигама користећи нр и РефСек НЦБИ протеинске базе података (е вредност <1е-10 и 60% хомологије).БЛАСТН и БЛАСТКС скупови не-само-контига представљају коначне контиге (погледајте Додатни фајл).
Прајри који се користе за ПЦР су наведени у табели С1.Так ДНК полимераза (Био Басиц Цанада, Маркхам, ОН) је коришћена за амплификацију циљних гена ццфДНА.Коришћени су следећи реакциони услови: денатурација на 95°Ц 3 минута, 95°Ц 1 минут, подешена температура жарења 1 минут, елонгација на 72°Ц 1 минут, 35 циклуса и коначно 72°Ц у року од 10 минута..ПЦР производи су раздвојени електрофорезом у агарозним геловима (1,5%) који садрже СИБРТМ безбедну ДНК гел боју (Инвитроген, Бурлингтон, ОН, Канада) на 95 В.
Дагње (Митилус спп.) су аклиматизоване у 500 мл оксигенисане морске воде (32 ПСУ) током 24 сата на 4°Ц.Контрола су биле дагње инкубиране у истим условима без додавања ДНК.Трећи контролни резервоар садржао је ДНК без дагњи.Да би се пратио квалитет ДНК у морској води, узорци морске воде (20 μл; три понављања) су узети из сваког резервоара у назначено време.За следљивост плазмидне ДНК, ЛБ дагње су сакупљене у назначено време и анализиране помоћу кПЦР и ддПЦР.Због високог садржаја соли у морској води, аликвоти су разблажени у води квалитета за ПЦР (1:10) пре свих ПЦР тестова.
Дигитал дроплет ПЦР (ддПЦР) је изведен коришћењем БиоРад ККС200 протокола (Мисисага, Онтарио, Канада).Користите температурни профил да одредите оптималну температуру (Табела С1).Капи су генерисане коришћењем генератора капи ККС200 (БиоРад).ддПЦР је изведен на следећи начин: 95 ° Ц током 5 мин, 50 циклуса од 95 ° Ц током 30 с и дата температура жарења током 1 мин и 72 ° Ц током 30 с, 4 ° Ц током 5 мин и 90 ° Ц у току 5 минута.Број капи и позитивних реакција (број копија/µл) мерени су помоћу ККС200 читача капи (БиоРад).Узорци са мање од 10.000 капљица су одбијени.Контрола узорка није вршена сваки пут када је покренут ддПЦР.
кПЦР је изведен коришћењем Ротор-Гене® 3000 (Цорбетт Ресеарцх, Сиднеј, Аустралија) и ЛГАЛС7 специфичних прајмера.Сви квантитативни ПЦР су изведени у 20 µл коришћењем КуантиФаст СИБР Греен ПЦР комплета (КИАГЕН).кПЦР је започет са 15 мин инкубације на 95°Ц, након чега је уследило 40 циклуса на 95°Ц током 10 секунди и на 60°Ц током 60 секунди са једним прикупљањем података.Криве топљења су генерисане коришћењем узастопних мерења на 95°Ц током 5 с, 65°Ц током 60 с и 97°Ц на крају кПЦР.Сваки кПЦР је изведен у три примерка, осим контролних узорака.
Занимало нас је и да ли се ови фрагменти акумулирају у њиховом полуотвореном лимфном систему.Експериментално смо решили овај проблем праћењем судбине растворљивих ДНК фрагмената додатих у резервоаре за плаве дагње.Да бисмо олакшали праћење фрагмената ДНК, користили смо страни (не сопствени) плазмид ДНК који садржи људски ген галектин-7.ддПЦР прати фрагменте плазмидне ДНК у морској води и шкољкама.Фрагменти егзогене ДНК су лако детектовани у року од 15 минута у интравалвуларној течности и хемолимфи (слика 1ц).Ови фрагменти се и даље могу открити до 4 сата након излагања.Ова активност филтрирања у односу на фрагменте ДНК је упоредива са активношћу филтрирања бактерија и алги [31].Ови резултати сугеришу да дагње могу да филтрирају и акумулирају страни ДНК у својим одељцима за течност.
Релативне концентрације плазмидне ДНК у морској води у присуству (А) или одсуству (Б) дагњи, мерене ддПЦР.У А, резултати су изражени у процентима, са ивицама кутија које представљају 75. и 25. перцентиле.Уклопљена логаритамска крива је приказана црвеном бојом, а област осенчена сивом бојом представља интервал поузданости од 95%.У Б, црвена линија представља средњу вредност, а плава линија представља интервал поверења од 95% за концентрацију.Ц Акумулација плазмидне ДНК у хемолимфи и валвуларној течности дагњи ​​у различито време након додавања плазмидне ДНК.Резултати су представљени као апсолутне откривене копије/мЛ (±СЕ).
У ту сврху, цццДНК из хемолимфе дагњи ​​је изолована и пречишћена методама које се обично користе за пречишћавање хумане цццДНК [32, 33].Анализа дистрибуције величине хемолимфне ццфДНК показала је да ови фрагменти веома варирају у величини, у распону од 1000 бп до 1000 бп.до 5000 бп (слика 2).
Репрезентативни ццфДНК електрофореграм хемолимфе дагње.Екстрахован са НуцлеоСнап плазма комплетом (горе) и КИАамп комплетом за ДНК истраживач.Б Виолин дијаграм који приказује дистрибуцију хемолимфне ццфДНК концентрације (±СЕ) у дагњама.Црне и црвене линије представљају медијану и први и трећи квартил, респективно.
Приближно 1% ццфДНК код људи и примата има страни извор [21, 37].
Код људи, и нуклеарна и митохондријска ДНК могу да се пусте у крвоток [38].Међутим, у овој студији није било могуће детаљно описати нуклеарну геномску ДНК дагњи, с обзиром на то да геном А. атра није секвенциониран нити описан.Међутим, успели смо да идентификујемо велики број фрагмената ццфДНК нашег порекла користећи библиотеку шкољки (слика С2, додатне информације).Такође смо потврдили присуство фрагмената ДНК сопственог порекла усмереном ПЦР амплификацијом оних гена А. атра који су секвенцирани (слика 3).Слично томе, с обзиром да је митохондријски геном А. атра доступан у јавним базама података, могу се пронаћи докази о присуству митохондријалних фрагмената ццфДНК у хемолимфи А. атра.Присуство фрагмената митохондријске ДНК потврђено је ПЦР амплификацијом (слика 3).
Различити митохондријални гени били су присутни у хемолимфи А. атра (црвене тачке – каталошки број: СРКС5705969) и М. платенсис (плаве тачке – каталошки број: СРКС5705968) амплифициране ПЦР-ом.Слика прилагођена од Бретон ет ал., 2011. Б Амплификација супернатанта хемолимфе из А. атра Сачувано на ФТА папиру.Користите бушилицу од 3 мм да додате директно у ПЦР епрувету која садржи ПЦР мешавину.
С обзиром на обилно садржај микроба у морској води, у почетку смо се фокусирали на карактеризацију микробних ДНК секвенца у хемолимфу.Да бисмо то учинили, користимо две различите стратегије.Прва стратегија је користила Кракен2, програм за класификацију секвенци заснован на алгоритму који може да идентификује микробне секвенце са тачношћу која је упоредива са БЛАСТ-ом и другим алатима [28].Утврђено је да је више од 6719 очитавања бактеријског порекла, док је 124 и 64 од археја и вируса (слика 4).Најзаступљенији фрагменти бактеријске ДНК били су Фирмицутес (46%), Протеобацтериа (27%) и Бацтероидетес (17%) (слика 4а).Ова дистрибуција је у складу са претходним студијама микробиома морске плаве дагње [39, 40].Гамапротеобактерије су биле главна класа Протеобацтериа (44%), укључујући многе Вибрионалес (слика 4б).Метода ддПЦР потврдила је присуство Вибрио ДНК фрагмената у ццфДНК А. атра хемолимфе (слика 4ц) [41].Да би се добило више информација о бактеријском пореклу ццфДНК, узет је додатни приступ (Слика С2, Додатне информације). У овом случају, читања која се преклапају састављена су као читања са упареним крајевима и класификована су као самостална (шкољке) или несопствена порекла коришћењем БЛАСТН-а и е вредности од 1е−3 и пресека са >90% хомологије. У овом случају, читања која се преклапају састављена су као читања са упареним крајевима и класификована су као самостална (шкољке) или несопствена порекла коришћењем БЛАСТН-а и е вредности од 1е−3 и пресека са >90% хомологије. В етом случае перекриваусааса чтениа били собрание как чтениа с парними концами и били классифицировани как собственние (двустворчатие моллуски) или чужие по происхождениу с использованием БЛАСТН и значениа е 1е-3 и отсечениа с гомологиеј> 90%. У овом случају, преклапајућа очитавања су сакупљена као читања са упареним крајевима и класификована су као нативна (дволушне) или неоригинална коришћењем БЛАСТН-а и е вредности 1е-3 и пресека са >90% хомологије.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用БЛАСТН 和1е-3 的е>倭% 匪值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下, 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数, 使用 使用 彿用 使用 使甌和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 Пошто геном А. атра још није секвенциониран, користили смо де ново стратегију склапања МЕГАХИТ Нект Генератион Секуенцинг (НГС) асемблера.Укупно 147.188 контигла је идентификовано као зависно (бивале) порекла.Ови контиги су затим експлодирани са е-вредностима од 1е-10 користећи БЛАСТН и БЛАСТКС.Ова стратегија нам је омогућила да идентификујемо 482 фрагмента недвосупних шкољки присутних у А. атра ццфДНК.Више од половине (57%) ових фрагмената ДНК добијено је од бактерија, углавном од шкржних симбионта, укључујући сулфотрофне симбионте, и од шкржних симбионта Солемиа велум (слика 5).
Релативно обиље на нивоу типа.Б Микробна разноликост две главне врсте (Фирмицутес и Протеобацтериа).Репрезентативна амплификација ддПЦР Ц Вибрио спп.А. Фрагменти гена 16С рРНА (плави) у три атра хемолимфе.
Анализирано је укупно 482 прикупљених контигла.Општи профил таксономске дистрибуције метагеномских контига напомена (прокариоти и еукариоти).Б Детаљна дистрибуција фрагмената бактеријске ДНК идентификоване помоћу БЛАСТН и БЛАСТКС.
Присуство метаногених микроорганизама у дагњама није изненађујуће, имајући у виду недавне извештаје о екстензивном цурењу метана из дна на висоравни Кергуелен [45] и могућој производњи метана у микробима уоченој код обале острва Кергуелен [46].
Наша пажња се затим пребацила на очитавања ДНК вируса.Колико нам је познато, ово је прва студија о садржају вируса у шкољкама ван циља.Као што се и очекивало, пронашли смо ДНК фрагменте бактериофага (Цаудовиралес) (слика 6б).Међутим, најчешћа вирусна ДНК потиче из типа нуклеоцитовируса, такође познатих као нуклеарни цитоплазматски велики ДНК вирус (НЦЛДВ), који има највећи геном од свих вируса.У оквиру овог типа, већина ДНК секвенци припада породицама Мимимидовиридае (58%) и Поквиридае (21%), чији су природни домаћини кичмењаци и зглавкари, док мали део ових ДНК секвенци припада познатим виролошким алгама.Инфицира марине еукариотске алге.Секвенце су такође добијене од Пандора вируса, џиновског вируса са највећом величином генома од свих познатих вирусних родова.Занимљиво је да је опсег домаћина за који се зна да су заражени вирусом, како је утврђено секвенцирањем ццфДНК хемолимфе, био релативно велик (Слика С3, Додатне информације).Укључује вирусе који инфицирају инсекте као што су Бацуловиридае и Иридовиридае, као и вирусе који инфицирају амебе, алге и кичмењаке.Такође смо пронашли секвенце које одговарају геному Питховирус сиберицум.Питовируси (такође познати као "зомби вируси") су први пут изоловани из 30.000 година старог пермафроста у Сибиру [47].Дакле, наши резултати су у складу са претходним извештајима који показују да нису све модерне врсте ових вируса изумрле [48] и да ови вируси могу бити присутни у удаљеним субарктичким морским екосистемима.
Коначно, тестирали смо да ли можемо да пронађемо фрагменте ДНК од других вишећелијских животиња.БЛАСТН и БЛАСТКС су идентификовали укупно 482 страна контига са нт, нр и РефСек библиотекама (геномске и протеинске).Наши резултати показују да међу страним фрагментима ццфДНК вишећелијских животиња преовлађује ДНК коштаних костију (Сл. 5).Пронађени су и фрагменти ДНК инсеката и других врста.Релативно велики део фрагмената ДНК није идентификован, вероватно због недовољне заступљености великог броја морских врста у геномским базама података у поређењу са копненим врстама [49].
У овом раду примењујемо концепт ЛБ на дагње, тврдећи да секвенцирање хемолимфе ццфДНА снимака може пружити увид у састав морских обалних екосистема.Конкретно, открили смо да 1) хемолимфа дагње садржи релативно високе концентрације (микрограмски нивои) релативно великих (~1-5 кб) циркулишућих ДНК фрагмената;2) ови фрагменти ДНК су независни и независни 3) Међу страним изворима ових ДНК фрагмената нашли смо ДНК бактерија, археја и вируса, као и ДНК других вишећелијских животиња;4) Акумулација ових страних фрагмената ццфДНК у хемолимфи се дешава брзо и доприноси унутрашњој активности филтрирања дагњи.У закључку, наша студија показује да концепт ЛБ, који је до сада примењен углавном у области биомедицине, кодира богат, али неистражен извор знања који се може користити за боље разумевање интеракције између стражарских врста и њиховог окружења.
Поред примата, изолација ццфДНК је пријављена и код сисара, укључујући мишеве, псе, мачке и коње [50, 51, 52].Међутим, према нашим сазнањима, наша студија је прва која је пријавила откривање и секвенцирање ццфДНК у морским врстама са отвореним системом циркулације.Ова анатомска карактеристика и способност филтрирања дагњи ​​могу, барем делимично, да објасне различите карактеристике величине циркулишућих фрагмената ДНК у поређењу са другим врстама.Код људи, већина фрагмената ДНК који циркулишу у крви су мали фрагменти величине од 150 до 200 бп.са максималним пиком од 167 бп [34, 53].Мали, али значајан део фрагмената ДНК је величине између 300 и 500 бп, а око 5% је дужи од 900 бп.[54].Разлог за ову дистрибуцију величине је тај што се главни извор ццфДНК у плазми јавља као резултат ћелијске смрти, било услед смрти ћелије или због некрозе циркулишућих хематопоетских ћелија код здравих особа или због апоптозе туморских ћелија код пацијената са раком (познато као циркулишућа туморска ДНК)., цтДНК).Дистрибуција величине ццфДНК хемолимфе коју смо пронашли у дагњама кретала се од 1000 до 5000 бп, што сугерише да ццфДНК дагњи ​​има другачије порекло.Ово је логична хипотеза, пошто дагње имају полуотворени васкуларни систем и живе у морским воденим срединама које садрже високе концентрације микробне геномске ДНК.У ствари, наши лабораторијски експерименти који користе егзогену ДНК показали су да дагње акумулирају фрагменте ДНК у морској води, барем након неколико сати, они се разграђују након ћелијског уноса и/или ослобађају и/или складиште у различитим организацијама.С обзиром на реткост ћелија (и прокариотских и еукариотских), употреба интравалвуларних одељења ће смањити количину ццфДНК из сопствених извора као и из страних извора.Узимајући у обзир значај урођеног имунитета шкољкаша и велики број циркулирајућих фагоцита, ми смо даље претпоставили да је чак и страна ццфДНК обогаћена циркулирајућим фагоцитима који акумулирају страну ДНК након гутања микроорганизама и/или ћелијских остатака.Узети заједно, наши резултати показују да је ццфДНК хемолимфе шкољки јединствено складиште молекуларних информација и појачава њихов статус као стражарске врсте.
Наши подаци показују да секвенцирање и анализа фрагмената ццфДНК хемолимфе добијених од бактерија могу пружити кључне информације о бактеријској флори домаћина и бактеријама присутним у околном морском екосистему.Технике секвенционирања снимака откриле су секвенце комензалне бактерије А. атра гилл које би биле промашене да су коришћене конвенционалне методе идентификације 16С рРНА, делом због пристрасности референтне библиотеке.У ствари, наша употреба ЛБ података прикупљених од М. платенсис у истом слоју дагњи ​​у Кергуелену показала је да је састав бактеријских симбионта повезаних са шкргама био исти за обе врсте дагњи ​​(Слика С4, Додатне информације).Ова сличност две генетски различите дагње може одражавати састав бактеријских заједница у хладним, сумпорним и вулканским наслагама Кергуелена [55, 56, 57, 58].Виши нивои микроорганизама који смањују сумпор добро су описани приликом сакупљања дагњи ​​из биотурбираних обалних подручја [59], као што је обала Порт-о-Франса.Друга могућност је да флора комензалне шкољке може бити погођена хоризонталним преносом [60, 61].Потребно је више истраживања да би се утврдила корелација између морског окружења, површине морског дна и састава симбиотских бактерија у дагњама.Ове студије тренутно су у току.
Дужина и концентрација ццфДНК хемолимфе, њена лакоћа пречишћавања и висок квалитет који омогућава брзо секвенцирање сачмарица су неке од многих предности коришћења ццфДНК дагњи ​​за процену биодиверзитета у морским обалним екосистемима.Овај приступ је посебно ефикасан за карактеризацију вирусних заједница (вирома) у датом екосистему [62, 63].За разлику од бактерија, археја и еукариота, вирусни геноми не садрже филогенетски конзервиране гене као што су 16С секвенце.Наши резултати показују да се течне биопсије из индикаторских врста као што су дагње могу користити за идентификацију релативно великог броја фрагмената ццфДНА вируса за које је познато да инфицирају домаћине који обично насељавају обалне морске екосистеме.Ово укључује вирусе за које је познато да инфицирају протозое, чланконошце, инсекте, биљке и бактеријске вирусе (нпр. бактериофаге).Слична дистрибуција је пронађена када смо испитали хемолимфни ццфДНК виром плавих дагњи ​​(М. платенсис) сакупљен у истом слоју дагњи ​​у Кергуелену (Табела С2, Додатне информације).Секвенцирање ццфДНК је заиста нови приступ који добија на замаху у проучавању вирома људи или других врста [21, 37, 64].Овај приступ је посебно користан за проучавање дволанчаних ДНК вируса, пошто ниједан ген није сачуван међу свим дволанчаним ДНК вирусима, који представљају најразноврснију и најширу класу вируса у Балтимору [65].Иако већина ових вируса остаје некласификована и могу укључивати вирусе из потпуно непознатог дела вирусног света [66], открили смо да вироми и распони домаћина дагњи ​​А. атра и М. платенсис спадају између ове две врсте.слично (види слику С3, додатне информације).Ова сличност није изненађујућа, јер може одражавати недостатак селективности у преузимању ДНК присутне у животној средини.Тренутно су потребне будуће студије које користе пречишћену РНК за карактеризацију РНК вирома.
У нашој студији користили смо веома ригорозан цевовод прилагођен рад Коварског и његових колега [37], који су користили брисање у два корака обједињених читања и контига пре и после састављања нативне ццфДНК, што је резултирало високим уделом немапираних читања.Стога, не можемо искључити да неки од ових немапираних очитавања још увек могу имати сопствено порекло, пре свега зато што немамо референтни геном за ову врсту дагњи.Такође смо користили овај цевовод јер смо били забринути за химере између сопственог и не-сопственог читања и дужине читања које генерише Иллумина МиСек ПЕ75.Други разлог за већину неуцртаних очитавања је тај што већи део морских микроба, посебно у удаљеним областима као што је Кергуелен, није означен.Користили смо Иллумина Мисек Пе75, претпостављајући да је дужине фрагмената ЦЦФДНА слична људској ЦЦФДНА.За будућа истраживања, с обзиром на наше резултате који показују да хемолимфна ццфДНК има дуже читање од људи и/или сисара, препоручујемо коришћење платформе за секвенцирање која је погоднија за дуже фрагменте ццфДНК.Ова пракса ће учинити много лакшим за идентификацију више индикација за дубље анализу.Добијање тренутно недоступне комплетне секвенце нуклеарног генома А. атра би такође у великој мери олакшало дискриминацију ццфДНК из сопствених и не-личних извора.С обзиром на то да се наше истраживање фокусирало на могућност примене концепта течне биопсије на дагње, надамо се да ће се, како се овај концепт користи у будућим истраживањима, развијати нови алати и цевоводи како би се повећао потенцијал ове методе за проучавање микробне разноврсности дагњи.морски екосистем.
Као неинвазивни клинички биомаркер, повишени нивои ццфДНК у људској плазми су повезани са различитим болестима, оштећењем ткива и стресним стањима [67,68,69].Ово повећање је повезано са ослобађањем фрагмената ДНК сопственог порекла након оштећења ткива.Ово питање смо решили коришћењем акутног топлотног стреса, у коме су дагње кратко биле изложене температури од 30 °Ц.Ова анализа смо наступили на три различите врсте дагње у три независна експеримента.Међутим, нисмо пронашли никакву промену у нивоима ццфДНК након акутног топлотног стреса (види слику С5, додатне информације).Ово откриће може објаснити, барем делимично, чињеницу да дагње имају полуотворени циркулаторни систем и да акумулирају велике количине страног ДНК због своје високе активности филтрирања.С друге стране, дагње, као и многи бескичмењаци, могу бити отпорније на оштећење ткива изазвано стресом, чиме се ограничава ослобађање ццфДНК у њиховој хемолимфи [70, 71].
До данас, ДНК анализа биодиверзитета у воденим екосистемима се углавном фокусирала на метабаркодирање ДНК (еДНК) животне средине.Међутим, овај метод је обично ограничен у анализи биодиверзитета када се користе прајмери.Употреба секвенцирања сачмара окупља ограничења ПЦР-а и пристрасног села сета за прајмер.Дакле, у извесном смислу, наша метода је ближа недавно коришћеној методи секвенцирања еДНК Схотгун са високом пропусношћу, која је у стању да директно секвенцира фрагментирану ДНК и анализира скоро све организме [72, 73].Међутим, постоји низ фундаменталних питања која разликују ЛБ од стандардних еДНК метода.Наравно, главна разлика између еДНК и ЛБ је употреба природних филтера домаћина.Пријављена је употреба морских врста као што су сунђери и шкољке (Дрессеина спп.) као природни филтер за проучавање еДНК [74, 75].Међутим, Драјсенина студија је користила биопсије ткива из којих је извучена ДНК.Анализа ццфДНК из ЛБ не захтева биопсију ткива, специјализовану и понекад скупу опрему и логистику повезану са еДНК или биопсијом ткива.У ствари, недавно смо известили да се ццфДНК из ЛБ може чувати и анализирати уз подршку ФТА без одржавања хладног ланца, што је велики изазов за истраживања у удаљеним областима [76].Екстракција ццфДНК из течних биопсија је такође једноставна и обезбеђује ДНК високог квалитета за секвенционирање сачмарица и ПЦР анализу.Ово је велика предност с обзиром на нека од техничких ограничења повезаних са анализом еДНК [77].Једноставност и ниска цена методе узорковања је такође посебно погодна за дугорочне програме праћења.Поред њихове високе способности филтрирања, још једна добро позната карактеристика шкољкаша је хемијски мукополисахаридни састав њихове слузи, који промовише апсорпцију вируса [78, 79].Ово чини шкољке идеалним природним филтером за карактеризацију биодиверзитета и утицаја климатских промена у датом воденом екосистему.Иако се присуство фрагмената ДНК изведених из домаћина може посматрати као ограничење методе у поређењу са еДНК, трошкови повезани са поседовањем такве природне ццфДНК у поређењу са еДНК су истовремено разумљиви за огромну количину информација доступних за здравствене студије.офсет хост.Ово укључује присуство вирусних секвенци интегрисаних у геном домаћина домаћина.Ово је посебно важно за дагње, с обзиром на присуство хоризонтално преносивих леукемијских ретровируса код шкољкаша [80, 81].Још једна предност ЛБ у односу на еДНК је у томе што користи фагоцитну активност циркулишућих крвних ћелија у хемолимфи, која прогута микроорганизме (и њихове геноме).Фагоцитоза је главна функција крвних зрнаца код шкољкаша [82].Коначно, метода користи предности високог капацитета филтрирања дагњи ​​(просечно 1,5 л/х морске воде) и дводневне циркулације, што повећава мешање различитих слојева морске воде, омогућавајући хватање хетерологне еДНК.[83, 84].Дакле, ццфДНК анализа дагњи ​​је занимљива могућност с обзиром на нутритивне, економске и еколошке утицаје дагњи.Слично анализи ЛБ прикупљених од људи, ова метода такође отвара могућност мерења генетских и епигенетских промена у ДНК домаћина као одговора на егзогене супстанце.На пример, технологије секвенцирања треће генерације могу се предвидети за извођење анализе метилације на нивоу генома у нативној ццфДНК користећи секвенцирање нанопора.Овај процес би требало да буде олакшан чињеницом да је дужина фрагмената ццфДНК дагње идеално компатибилна са платформама за секвенционирање које се дуго читају које омогућавају анализу метилације ДНК у целом геному из једног циклуса секвенцирања без потребе за хемијским трансформацијама.85,86] Ово је занимљива могућност, јер је показано да ДНК одражава одговор на генерисање перметилације на многе обрасце метилације животне средине.Стога, може пружити драгоцен увид у основне механизме који управљају одговором након излагања климатским променама или загађивачима [87].Међутим, употреба ЛБ није без ограничења.Непотребно је рећи да то захтева присуство врста индикатора у екосистему.Као што је горе поменуто, коришћење ЛБ-а за процену биодиверзитета датог екосистема такође захтева ригорозну биоинформатичку линију која узима у обзир присуство фрагмената ДНК из извора.Други главни проблем је доступност референтних генома за морске врсте.Надамо се да ће иницијативе као што су Пројекат генома морских сисара и недавно успостављени пројекат Фисх10к [88] олакшати такву анализу у будућности.Примена ЛБ концепта на организме који се хране морским филтерима је такође компатибилна са најновијим достигнућима у технологији секвенцирања, што га чини веома погодним за развој биомаркера са више ома како би се пружиле важне информације о здрављу морских станишта као одговор на стрес животне средине.

Бриерлеи АС, Кингсфорд МЈ Утицај климатских промена на морски живот и екосистеме.2009;19: П602–П614.
Гисси Е, Манеа Е, Мазарис АД, Фрасцхетти С, Алмпанидоу В, Бевилацкуа С, ет ал.Размотрите комбиноване утицаје климатских промена и других локалних стресора на морско окружење.Опште научно окружење.
Царелла Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П, ет ал.).Наука првог марта.
Серонт Л, Ницастро ЦР, Зарди ГИ, Гобервилле Е. Смањена толеранција на топлоту у условима понављајућег топлотног стреса објашњава високу летњу смртност плавих дагњи.
Феи СБ, Сиепиелски АМ, Нуссле С, Цервантес-Иосхида К, Хван ЈЛ, Хубер ЕР, ет ал.Недавне промене у учесталости, узроцима и обиму угинућа животиња.Проц Натл Ацад Сци УСА.2015;112:1083-8.
Сцарпа Ф, Санна Д, Аззена И, Мугхетти Д, Церрути Ф, Хоссеини С, ет ал.Вишеструки неспецифични патогени су можда изазвали масовну смртност Пинна нобилис.Живот.2020;10:238.
Брадлеи М, Цоуттс СЈ, Јенкинс Е, О'Хара ТМ.Потенцијални утицај климатских промена на арктичке зоонотске болести.Инт ј циркунгуларно здравље.64:468–77.
Беиер Ј., Греене НВ, Броокс С., Аллан ИЈ, Руус А., Гомез Т. ет ал.Плаве дагње (Митилус едулис спп.) као сигнални организми у мониторингу обалног загађења: преглед.Мар Енвирон Рес 2017;
Сиравегна Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Интеграција течне биопсије у лечењу рака.Нат Рев Цлеан Онцол.2017;14:531–48.
Ван ЈЦМ, Массие Ц, Гарциа-Цорбацхо Ј, Моулиере Ф, Брентон ЈД, Цалдас Ц, ет ал.Сазревање течне биопсије: Омогућава циркулацију ДНК тумора.
Мандел П., Метаис П. Нуклеинске киселине у људској плазми.Састанак записнике подружница БИОЛ-а СОЦ-а.1948;142:241-3.
БРОНКХОРСТ АЈ, ИНСХЕРГЕР В, Холденриедер С. Нова улога ДНК без ћелија као молекуларна маркера за лечење рака.Квантификација биомоларне анализе.
Игнатиадис М., санке ГВ, Јеффреи СС Течна биопсија улази у клинику - питања имплементације и будући изазови.Нат Рев Цлин Онцол.2021;18:297–312.
Ло ИМ, Цорбетта Н., Цхамберлаин ПФ, Раи В., Саргент ИЛ, Редман ЦВ и други.Фетал ДНК је присутан у матерном плазми и серуму.Ланцет.1997;350:485-7.
Муфарраи МН, Вонг РЈ, Схав ГМ, Стевенсон ДК, Куаке СР Студија тока трудноће и њених компликација коришћењем циркулишуће екстрацелуларне РНК у крви жена током трудноће.
Оллерицх М, Схервоод К, Кеовн П, Сцхутз Е, Бецк Ј, Стегбауер Ј, ет ал.Течна биопсија: ДНК без ћелија донора се користи за откривање алогених лезија у трансплантату бубрега.Нат Рев Непхрол.2021;17:591–603.
Јуан ФЦ, ЛО ИМ иновације у пренаталној дијагностици: Редослијед генома о материнском плазму.Анна МД.
Гу В, Денг Кс, Лее М, Суцу ИД, Аревало С, Стрике Д, ет ал.Брзо откривање патогена са метагеномским секвенцирањем следеће генерације заражених телесних течности.Нат Медицине.2021;27:115-24.