Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Плодност птица зависи од њихове способности да складиште довољно одрживе сперме током дужег временског периода у тубулама за складиштење сперме (SST). Тачан механизам којим сперматозоиди улазе, бораве у и напуштају SST остаје контроверзан. Сперма шаркасија кокошака показала је високу склоност ка аглутинацији, формирајући мобилне филаментозне снопове који садрже много ћелија. Због тешкоће посматрања покретљивости и понашања сперматозоида у непрозирном јајоводу, користили смо микрофлуидни уређај са попречним пресеком микроканала сличним оном код сперматозоида да бисмо проучили аглутинацију и покретљивост сперматозоида. Ова студија разматра како се снопови сперме формирају, како се крећу и њихову могућу улогу у продужавању боравка сперматозоида у SST. Истраживали смо брзину сперматозоида и реолошко понашање када је проток течности генерисан унутар микрофлуидног канала хидростатичким притиском (брзина протока = 33 µm/s). Сперматозоиди имају тенденцију да пливају против струје (позитивна реологија) и брзина снопа сперматозоида је значајно смањена у поређењу са појединачним сперматозоидима. Примећено је да се снопови сперматозоида крећу спирално и повећавају дужину и дебљину како се регрутује све више појединачних сперматозоида. Примећено је да се снопови сперматозоида приближавају и прилепљују бочним зидовима микрофлуидних канала како би се избегло да буду захваћени брзином протока течности > 33 µm/s. Примећено је да се снопови сперматозоида приближавају и прилепљују бочним зидовима микрофлуидних канала како би се избегло да буду захваћени брзином протока течности > 33 µm/s. Било замечено, что пучки сперматозоидов приближаутса и прилипаут к боковим стенкам микрофлуидних каналов, чтоби избегнути сметаниа со скоростьу потока жидкости> 33 мкм / с. Примећено је да се снопови сперматозоида приближавају и прилепљују за бочне зидове микрофлуидних канала како би избегли да буду однесени при брзинама протока течности >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体浇速> 33 м/с33 µм/с 扫过. Било замечено, что пучки сперматозоиди приближавају и прилипаут к боковим стенкам микрожидкостнога канала, чтоби избећи сметаниа потока жидкости со скоростьу > 33 мкм/с. Примећено је да се снопови сперматозоида приближавају и прилепљују за бочне зидове микрофлуидног канала како би избегли да их однесе проток течности брзином >33 µm/s.Скенирајућа и трансмисиона електронска микроскопија показале су да су снопови сперматозоида били поткрепљени обилним густим материјалом. Добијени подаци показују јединствену мобилност сперматозоида шаркази пилића, као и способност сперматозоида да се аглутинирају и формирају мобилне снопове, што доприноси бољем разумевању дугорочног складиштења сперматозоида у СМТ.
Да би се постигла оплодња код људи и већине животиња, сперматозоиди и јајне ћелије морају стићи на место оплодње у право време. Стога, парење мора да се догоди пре или у време овулације. С друге стране, неки сисари, попут паса, као и врсте које нису сисари, попут инсеката, риба, гмизаваца и птица, чувају сперму у својим репродуктивним органима током дужег временског периода док њихова јајна ћелија не буду спремна за оплодњу (асинхрона оплодња 1 ). Птице су у стању да одрже одрживост сперматозоида способних за оплодњу јајних ћелија 2-10 недеља2.
Ово је јединствена карактеристика која разликује птице од других животиња, јер пружа велику вероватноћу оплодње након једне инсеминације током неколико недеља без истовременог парења и овулације. Главни орган за складиштење сперме, назван тубул за складиштење сперме (SST), налази се у унутрашњим наборима слузокоже на утеровагиналном споју. До данас, механизми којима сперматозоиди улазе, бораве и излазе из банке сперме нису у потпуности схваћени. На основу претходних студија, изнете су многе хипотезе, али ниједна од њих није потврђена.
Форман4 је поставио хипотезу да сперматозоиди одржавају своје боравиште у SST шупљини кроз континуирано осцилаторно кретање супротно од правца протока течности кроз протеинске канале који се налазе на SST епителним ћелијама (реологија). АТП се исцрпљује због сталне флагеларне активности потребне да се сперматозоиди одрже у SST лумену, а покретљивост на крају опада док се сперматозоиди не изнесу из банке сперме протоком течности и не започну ново путовање низ узлазни јајовод како би оплођивали сперматозоиде. Јајна ћелија (Форман4). Овај модел складиштења сперме поткрепљен је детекцијом аквапорина 2, 3 и 9 присутних у SST епителним ћелијама имуноцитохемијом. До данас недостају студије о реологији пилеће сперме и њеној улози у складиштењу SST, селекцији вагиналне сперме и конкуренцији сперматозоида. Код пилића, сперма улази у вагину након природног парења, али више од 80% сперматозоида се избацује из вагине убрзо након парења. Ово сугерише да је вагина примарно место за селекцију сперме код птица. Поред тога, објављено је да мање од 1% сперматозоида оплођених у вагини завршава у SST-овима2. Код вештачке оплодње пилића у вагини, број сперматозоида који достижу SST има тенденцију да се повећа 24 сата након оплодње. До сада, механизам селекције сперматозоида током овог процеса није јасан, а покретљивост сперматозоида може играти важну улогу у апсорпцији сперматозоида у SST-у. Због дебелих и непрозирних зидова јајовода, тешко је директно пратити покретљивост сперматозоида у јајоводима птица. Стога нам недостаје основно знање о томе како сперматозоиди прелазе у SST након оплодње.
Реологија је недавно препозната као важан фактор који контролише транспорт сперматозоида у гениталијама сисара. На основу способности покретних сперматозоида да мигрирају у супротном смеру, Заферани и др.8 користили су микрофлуидни систем кора да пасивно изолују покретне сперматозоиде из узорака сперме. Ова врста сортирања сперме је неопходна за медицинско лечење неплодности и клиничка истраживања и пожељнија је у односу на традиционалне методе које захтевају много времена и рада и могу угрозити морфологију и структурни интегритет сперматозоида. Међутим, до данас нису спроведене студије о утицају секрета из гениталних органа пилића на покретљивост сперматозоида.
Без обзира на механизам који одржава сперму ускладиштену у SST-у, многи истраживачи су приметили да се резидентни сперматозоиди аглутинирају главама у SST-у пилића 9, 10, препелица 2 и ћурака 11 како би формирали аглутинисане снопове сперматозоида. Аутори сугеришу да постоји веза између ове аглутинације и дугорочног складиштења сперматозоида у SST-у.
Тингари и Лејк12 су известили о јакој повезаности између сперматозоида у жлезди која прима сперму код пилића и поставили су питање да ли се сперматозоиди птица аглутинирају на исти начин као сперматозоиди сисара. Они верују да дубоке везе између сперматозоида у семеноводу могу бити последица стреса изазваног присуством великог броја сперматозоида у малом простору.
Приликом процене понашања сперматозоида на свеже висећим стакленим плочицама, могу се видети пролазни знаци аглутинације, посебно на ивицама капљица сперме. Међутим, аглутинацију је често пореметило ротационо дејство повезано са континуираним кретањем, што објашњава пролазну природу овог феномена. Истраживачи су такође приметили да када се разблаживач дода сперми, појављују се издужени ћелијски агрегати „налик нитима“.
Рани покушаји имитирања сперматозоида направљени су уклањањем танке жице из висеће капи, што је резултирало издуженом везикулом сличном сперматозоиду која је вирила из капи сперме. Сперматозоиди су се одмах постројили паралелно унутар везикуле, али је цела јединица брзо нестала због 3Д ограничења. Стога, да би се проучила аглутинација сперматозоида, неопходно је директно посматрати покретљивост и понашање сперматозоида у изолованим тубулама за складиштење сперме, што је тешко постићи. Стога је неопходно развити инструмент који имитира сперматозоиде како би се подржале студије покретљивости и понашања аглутинације сперматозоида. Бријар и др.13 су известили да је просечна дужина тубула за складиштење сперме код одраслих пилића 400–600 µm, али неки SST-ови могу бити дугачки и до 2000 µm. Меро и Огасавара14 су поделили семиниферне жлезде на увећане и неувећане тубуле за складиштење сперматозоида, које су обе биле исте дужине (~500 µm) и ширине врата (~38 µm), али је средњи пречник лумена тубула био 56,6 и 56,6 µm, респективно 11,2 μm. У овој студији, користили смо микрофлуидни уређај са величином канала 200 µm × 20 µm (Ш × В), чији је попречни пресек донекле близак оном код амплификованог SST-а. Поред тога, испитали смо покретљивост сперматозоида и понашање аглутинације у текућој течности, што је у складу са Формановом хипотезом да течност коју производе епителне ћелије SST-а држи сперматозоиде у лумену у контраструјном (реолошком) смеру.
Циљ ове студије био је да се превазиђу проблеми посматрања покретљивости сперматозоида у јајоводу и да се избегну тешкоће проучавања реологије и понашања сперматозоида у динамичном окружењу. Коришћен је микрофлуидни уређај који ствара хидростатички притисак како би се симулирала покретљивост сперматозоида у гениталијама пилета.
Када је кап разблаженог узорка сперме (1:40) убачена у микроканални уређај, могла су се идентификовати два типа покретљивости сперматозоида (изолована сперма и везана сперма). Поред тога, сперматозоиди су тежили да пливају против струје (позитивна реологија; видео 1, 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину од брзине усамљених сперматозоида (p < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксију (p < 0,001; Табела 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину од брзине усамљених сперматозоида (p < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксију (p < 0,001; Табела 2). Иако пучки сперматозоиди имају више ниску брзину, него у одиночних сперматозоида (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида, демонстрирајући позитиван реотаксис (п < 0,001; табела 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину од брзине појединачних сперматозоида (p < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксију (p < 0,001; Табела 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（п < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比 (п < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （п <0,001) ， 但 增加 了 显借 阁 显倧 阁百分比 (п <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хота скорость пучков сперматозоидов била ниже, него у одиночних сперматозоида (п < 0,001), они су повећали процент сперматозоида с позитивној реологијом (п < 0,001; таблица 2). Иако је брзина снопића сперматозоида била нижа него код појединачних сперматозоида (p < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида са позитивном реологијом (p < 0,001; Табела 2).Позитивна реологија за појединачне сперматозоиде и снопчиће процењује се на приближно 53% и 85%, респективно.
Примећено је да сперматозоиди шаркаши пилића одмах након ејакулације формирају линеарне снопове, који се састоје од десетина јединки. Ови чуперци се временом повећавају у дужини и дебљини и могу остати ин витро неколико сати пре него што се распрше (видео 3). Ови филаментозни снопови су обликовани као сперматозоиди ехидне који се формирају на крају епидидимиса. Утврђено је да сперма шаркаши кокошке има велику склоност ка аглутинацији и формирању мрежастог снопа за мање од једног минута након сакупљања. Ови зраци су динамични и способни да се залепе за било које оближње зидове или статичне предмете. Иако снопови сперме смањују брзину сперматозоида, јасно је да макроскопски повећавају њихову линеарност. Дужина снопова варира у зависности од броја сперматозоида сакупљених у сноповима. Изолована су два дела снопа: почетни део, укључујући слободну главу аглутинисаног сперматозоида, и терминални део, укључујући реп и цео дистални крај сперматозоида. Користећи камеру велике брзине (950 fps), у почетном делу снопа су примећене слободне главе аглутинираних сперматозоида, одговорне за кретање снопа због свог осцилаторног кретања, вукући преостале у сноп спиралним кретањем (Видео 4). Међутим, код дугих праменова, примећено је да су се неке слободне главе сперматозоида прилепиле за тело, а завршни део праменова делује као лопатице које помажу у покретању праменова.
Док су у спором току течности, снопови сперматозоида се крећу паралелно један другом, међутим, почињу да се преклапају и лепе за све што мирује, како их не би однела струја како се брзина протока повећава. Снопови се формирају када се шачица сперматозоида приближи једна другој, почињу да се крећу синхроно и обавијају једна око друге, а затим се лепе за лепљиву супстанцу. Слике 1 и 2 приказују како се сперматозоиди приближавају једна другој, формирајући спој док се репови обавијају један око другог.
Истраживачи су применили хидростатички притисак да би створили проток течности у микроканалу како би проучили реологију сперматозоида. Коришћен је микроканал величине 200 µm × 20 µm (Ш × В) и дужине 3,6 µm. Коришћени су микроканали између посуда са шприцевима постављеним на крајевима. Прехрамбене боје су коришћене да би канали били видљивији.
Причврстите каблове за међусобно повезивање и додатну опрему за зид. Видео је снимљен фазно контрастним микроскопом. Уз сваку слику приказане су слике фазно контрастне микроскопије и мапирања. (А) Веза између два тока опире се протоку због хеликоидног кретања (црвена стрелица). (Б) Веза између снопа цеви и зида канала (црвене стрелице), истовремено су повезани са два друга снопа (жуте стрелице). (Ц) Снопови сперматозоида у микрофлуидном каналу почињу да се повезују једни са другима (црвене стрелице), формирајући мрежу снопова сперматозоида. (Д) Формирање мреже снопова сперматозоида.
Када је кап разблажене сперме убачена у микрофлуидни уређај и створен је проток, примећено је да се сноп сперме креће супротно од смера протока. Снопови се чврсто приањају уз зидове микроканала, а слободне главе у почетном делу снопова чврсто се приањају уз њих (видео 5). Такође се лепе за све непокретне честице на свом путу, као што су остаци, како би се одупрли одношењу струјом. Временом, ови чуперци постају дугачки филаменти који хватају друге појединачне сперматозоиде и краће чуперке (видео 6). Како проток почиње да се успорава, дугачке линије сперме почињу да формирају мрежу линија сперме (видео 7; слика 2).
При великој брзини протока (V > 33 µm/s), спирални покрети нити се повећавају као покушај да се ухвати што више појединачних снопова сперматозоида који формирају боље како би се боље одупрли сили дрифта протока. При великој брзини протока (V > 33 µm/s), спирални покрети нити се повећавају као покушај да се ухвати што више појединачних снопова сперматозоида који формирају боље како би се боље одупрли сили дрифта протока. При високој скорости потока (В > 33 мкм/с) спиралевидние движениа нитеј усиливаутса, пошто они питаутса појмать множество отдельних сперматозоидов, образуусих пучки, которие лучше противстоат дрејфуусеј силе потока. При високим брзинама протока (V > 33 µm/s), спирални покрети нити се повећавају док покушавају да ухвате много појединачних сперматозоида, формирајући снопове који су боље способни да се одупру сили дрифта протока.在高流速(В > 33 µм/с)时，螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (в> 33 µм/с) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形成 束 形成 束 在 高 流速从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При високих скоростах потока (В > 33 мкм/с) спирално движение нитеј увеличаваетса в попитке захватить множество отдельних сперматозоидов, образуусих пучки, чтоби боље сопротивлатьса силам дрејфа потока. При високим брзинама протока (V > 33 µm/s), спирално кретање филамената се повећава у покушају да се ухвати много појединачних сперматозоида који формирају снопове како би се боље одупрли силама дрифта протока.Такође су покушали да причврсте микроканале на бочне зидове.
Снопови сперматозоида су идентификовани као кластери глава сперматозоида и увијених репова коришћењем светлосне микроскопије (ЛМ). Снопови сперматозоида са различитим агрегатима су такође идентификовани као увијене главе и флагеларни агрегати, вишеструко стопљени репови сперматозоида, главе сперматозоида причвршћене за реп и главе сперматозоида са савијеним једрима као вишеструко стопљена једра. трансмисиона електронска микроскопија (ТЕМ). Скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ) је показала да су снопови сперматозоида били обложени агрегати глава сперматозоида, а агрегати сперматозоида су показивали причвршћену мрежу обмотаних репова.
Морфологија и ултраструктура сперматозоида, формирање снопова сперматозоида проучавани су светлосном микроскопијом (половина пресека), скенирајућом електронском микроскопијом (СЕМ) и трансмисионом електронском микроскопијом (ТЕМ), размази сперме су обојени акридин оранж бојом и испитани епифлуоресцентном микроскопијом.
Бојење размаза сперме акридин оранџом (Сл. 3Б) показало је да су главе сперматозоида биле слепљене и прекривене секреторним материјалом, што је довело до формирања великих чуперки (Сл. 3Д). Снопови сперматозоида састојали су се од агрегата сперматозоида са мрежом причвршћених репова (Сл. 4А-Ц). Снопови сперматозоида су састављени од репова многих сперматозоида слепљених заједно (Сл. 4Д). Секрети (Сл. 4Е,Ф) прекривали су главе снопова сперматозоида.
Формирање снопа сперматозоида Коришћењем фазно контрастне микроскопије и размаза сперме обојених акридин поморанџом, показано је да се главе сперматозоида држе заједно. (А) Рано формирање чуперка сперматозоида почиње са сперматозоидом (бели круг) и три сперматозоида (жути круг), при чему спирала почиње на репу, а завршава се на глави. (Б) Фотомикрографија размаза сперме обојеног акридин поморанџом која приказује прилепљене главе сперматозоида (стрелице). Пражњење покрива главу(е). Увећање × 1000. (Ц) Развој великог снопа транспортованог протоком у микрофлуидном каналу (коришћењем камере велике брзине при 950 fps). (Д) Микрографија размаза сперме обојеног акридин поморанџом која приказује велике чуперке (стрелице). Увећање: ×200.
Скенирајућа електронска микрографија снопа сперматозоида и размаза сперматозоида обојеног акридин поморанџастом бојом. (А, Б, Д, Е) су дигиталне скенирајуће електронске микрографије сперматозоида у боји, а Ц и Ф су микрографије размаза сперматозоида обојених акридин поморанџастом бојом које приказују причвршћивање више сперматозоида који обавијају каудални слој. (АЦ) Агрегати сперматозоида су приказани као мрежа причвршћених репова (стрелице). (Д) Адхезија неколико сперматозоида (са лепљивом супстанцом, ружичастим обрисом, стрелицом) који се обавијају око репа. (Е и Ф) Агрегати главе сперматозоида (показивачи) прекривени лепљивим материјалом (показивачима). Сперматозоиди су формирали снопове са неколико структура сличних вртлогу (Ф). (Ц) Увећања ×400 и (Ф) ×200.
Користећи трансмисиону електронску микроскопију, открили смо да снопови сперматозоида имају причвршћене репове (Сл. 6А, Ц), главе причвршћене за репове (Сл. 6Б) или главе причвршћене за репове (Сл. 6Д). Главе сперматозоида у снопу су закривљене, представљајући у пресеку два нуклеарна региона (Сл. 6Д). У снопу инцизије, сперматозоиди су имали увијену главу са два нуклеарна региона и више флагеларних региона (Сл. 5А).
Дигитална електронска микрографија у боји која приказује спојне репове у снопу сперматозоида и аглутинирајући материјал који повезује главе сперматозоида. (А) Причвршћени реп великог броја сперматозоида. Обратите пажњу како реп изгледа и у усправној (стрелица) и у хоризонталној (стрелица) пројекцији. (Б) Глава (стрелица) сперматозоида је повезана са репом (стрелица). (Ц) Неколико репова сперматозоида (стрелице) је причвршћено. (Д) Аглутинирајући материјал (АС, плаво) повезује четири главе сперматозоида (љубичасто).
Скенирајућа електронска микроскопија је коришћена за детекцију глава сперматозоида у сноповима сперматозоида прекривеним секретима или мембранама (слика 6Б), што указује да су снопови сперматозоида били усидрени екстрацелуларним материјалом. Аглутинисани материјал је био концентрисан у глави сперматозоида (склоп сличан глави медузе; сл. 5Б) и проширен дистално, дајући бриљантно жути изглед под флуоресцентном микроскопијом када је обојена акридин поморанџом (слика 6Ц). Ова супстанца је јасно видљива под скенирајућим микроскопом и сматра се везивним средством. Полутанки пресеци (слика 5Ц) и размази сперме обојени акридин поморанџом показали су снопове сперматозоида који садрже густо збијене главе и увијене репове (слика 5Д).
Различите фотомикрографије које приказују агрегацију глава сперматозоида и пресавијених репова коришћењем различитих метода. (А) Попречни пресек дигиталне трансмисионе електронске микрографије у боји снопа сперматозоида која приказује спиралну главу сперматозоида са дводелним једром (плаво) и неколико флагеларних делова (зелено). (Б) Дигитална скенирајућа електронска микрографија у боји која приказује групу глава сперматозоида сличних медузама (стрелице) које изгледају као да су прекривене. (Ц) Полутанки пресек који приказује агрегиране главе сперматозоида (стрелице) и увијене репове (стрелице). (Д) Микрографија размаза сперме обојеног акридин поморанџом која приказује агрегате глава сперматозоида (стрелице) и увијене прилепљене репове (стрелице). Треба напоменути да лепљива супстанца (С) прекрива главу сперматозоида. (Д) Увећање × 1000.
Коришћењем трансмисионе електронске микроскопије (Сл. 7А), такође је примећено да су главе сперматозоида биле увијене, а језгра су имала спирални облик, што је потврђено размазима сперме обојеним акридин оранж бојом и испитаним флуоресцентном микроскопијом (Сл. 7Б).
(А) Дигитална трансмисиона електронска микрографија у боји и (Б) Размаз сперме обојен акридин наранџастом бојом који приказује спиралне главе и причвршћивање глава и репова сперматозоида (стрелице). (Б) Увећање × 1000.
Занимљиво откриће је да се Шарказијева сперма агрегира и формира мобилне филаментозне снопове. Особине ових снопова нам омогућавају да разумемо њихову могућу улогу у апсорпцији и складиштењу сперматозоида у SST-у.
Након парења, сперматозоиди улазе у вагину и пролазе кроз интензиван процес селекције, што резултира само ограниченим бројем сперматозоида који улазе у ССТ15,16. До данас, механизми којима сперматозоиди улазе и излазе из ССТ нису јасни. Код живине, сперматозоиди се чувају у ССТ-у током дужег периода од 2 до 10 недеља, у зависности од врсте6. Контроверза остаје око стања сперме током складиштења у ССТ-у. Да ли су у покрету или у мировању? Другим речима, како сперматозоиди одржавају свој положај у ССТ-у тако дуго?
Форман4 је сугерисао да се боравак и избацивање SST-а могу објаснити покретљивошћу сперматозоида. Аутори претпостављају да сперматозоиди одржавају свој положај пливајући против тока течности који ствара SST епител и да се сперматозоиди избацују из SST-а када њихова брзина падне испод тачке у којој почињу да се крећу уназад због недостатка енергије. Занибони5 је потврдио присуство аквапорина 2, 3 и 9 у апикалном делу SST епителних ћелија, што може индиректно подржати Форманов модел складиштења сперме. У тренутној студији, открили смо да скоро половина Шаркашијевих сперматозоида показује позитивну реологију у течности која тече и да аглутинисани снопови сперматозоида повећавају број сперматозоида који показују позитивну реологију, иако их аглутинација успорава. Како сперматозоиди путују уз јајовод птице до места оплодње није у потпуности схваћено. Код сисара, фоликуларна течност хемоатрактантно привлачи сперматозоиде. Међутим, верује се да хемоатрактанти усмеравају сперматозоиде да се приближавају великим удаљеностима7. Стога су други механизми одговорни за транспорт сперматозоида. Способност сперматозоида да се оријентише и тече супротно течности из јајовода која се ослобађа након парења пријављена је као главни фактор у циљању сперматозоида код мишева. Паркер 17 је сугерисао да сперматозоиди прелазе јајоводе пливајући супротно цилијарној струји код птица и гмизаваца. Иако то није експериментално показано код птица, Адолфи 18 је био први који је открио да птичја сперма даје позитивне резултате када се танки слој течности између покровног стакла и предметног стакла створи помоћу траке филтер папира. Реологија. Хино и Јанагимачи [19] су поставили мишји комплекс јајника-јавовода-матернице у перфузиони прстен и убризгали 1 µl мастила у истмус како би визуализовали проток течности у јајоводима. Приметили су веома активно кретање контракције и релаксације у јајоводу, у коме су се све куглице мастила стално кретале ка ампули јајовода. Аутори истичу важност протока течности из доњег у горњи део јајовода за подизање и оплодњу сперматозоида. Брилард20 је известио да код пилића и ћурака сперматозоиди мигрирају активним кретањем од вагиналног улаза, где се складиште, до утеровагиналног споја, где се складиште. Међутим, ово кретање није потребно између утеровагиналног споја и инфундибулума, јер се сперматозоиди транспортују пасивним померањем. Познавајући ове претходне препоруке и резултате добијене у тренутној студији, може се претпоставити да је способност сперматозоида да се крећу узводно (реологија) једно од својстава на којима се заснива процес селекције. Ово одређује пролазак сперматозоида кроз вагину и њихов улазак у ЦЦТ ради складиштења. Као што је Форман4 сугерисао, ово такође може олакшати процес уласка сперматозоида у ССТ и његово станиште на одређени временски период, а затим изласка када њихова брзина почне да се успорава.
С друге стране, Мацузаки и Сасанами21 сугерисали су да птичји сперматозоиди пролазе кроз промене покретљивости од мировања до покретљивости у мушким и женским репродуктивним трактовима. Инхибиција покретљивости резидентних сперматозоида у ССТ-у је предложена као објашњење дугог времена складиштења сперме, а затим подмлађивања након напуштања ССТ-а. У хипоксичним условима, Мацузаки и др.1 су известили о високој производњи и ослобађању лактата у ССТ-у, што може довести до инхибиције покретљивости резидентних сперматозоида. У овом случају, важност реологије сперматозоида огледа се у селекцији и апсорпцији сперматозоида, а не у њиховом складиштењу.
Образац аглутинације сперматозоида сматра се вероватним објашњењем за дуг период складиштења сперматозоида у ССТ-у, јер је то уобичајени образац задржавања сперматозоида код живине2,22,23. Бакст и др.2 су приметили да се већина сперматозоида прилепила једна за другу, формирајући фасцикуларне агрегате, а појединачни сперматозоиди су ретко пронађени у ЦЦМ препелица. С друге стране, Вен и др.24 су приметили више расутих сперматозоида и мање снопова сперматозоида у лумену ССТ-а код пилића. На основу ових запажања, може се претпоставити да се склоност ка аглутинацији сперматозоида разликује између птица и између сперматозоида у истом ејакулату. Поред тога, Ван Креј и др.9 сугерисали су да је насумична дисоцијација аглутинираних сперматозоида одговорна за постепено продирање сперматозоида у лумен јајовода. Према овој хипотези, сперматозоиди са нижим капацитетом аглутинације требало би прво да буду избачени из ССТ-а. У овом контексту, способност сперматозоида да аглутинирају може бити фактор који утиче на исход конкуренције сперматозоида код прљавих птица. Поред тога, што се дуже аглутинисана сперма дисоцира, дуже се одржава плодност.
Иако је агрегација сперматозоида и агрегација у снопове примећена у неколико студија2,22,24, она нису детаљно описана због сложености њиховог кинематичког посматрања у оквиру SST-а. Урађено је неколико покушаја проучавања аглутинације сперматозоида in vitro. Примећена је екстензивна, али пролазна агрегација када је танка жица уклоњена из висеће капи семена. То доводи до чињенице да издужени мехур вири из капи, имитирајући семену жлезду. Због 3D ограничења и кратког времена сушења капањем, цео блок је брзо пропао9. У тренутној студији, користећи Шаркаши пилиће и микрофлуидне чипове, успели смо да опишемо како се ови снопови формирају и како се крећу. Снопови сперматозоида су се формирали одмах након сакупљања сперме и утврђено је да се крећу спирално, показујући позитивну реологију када су присутни у току. Штавише, када се макроскопски посматрају, примећено је да снопови сперматозоида повећавају линеарност покретљивости у поређењу са изолованим сперматозоидима. Ово указује на то да се аглутинација сперматозоида може догодити пре пенетрације SST-а и да производња сперматозоида није ограничена на малу површину због стреса као што је раније сугерисано (Тингари и Лејк12). Током формирања чуперка, сперматозоиди пливају синхроно док не формирају спој, затим се њихови репови обавијају један око другог и глава сперматозоида остаје слободна, али реп и дистални део сперматозоида се лепе лепљивом супстанцом. Стога је слободна глава лигамента одговорна за кретање, вукући остатак лигамента. Скенирајућа електронска микроскопија снопова сперматозоида показала је причвршћене главе сперматозоида прекривене пуно лепљивог материјала, што указује на то да су главе сперматозоида биле причвршћене у сноповима у мировању, што се могло догодити након достизања места складиштења (SST).
Када се размаз сперме обоји акридин поморанџом, екстрацелуларни адхезивни материјал око сперматозоида може се видети под флуоресцентним микроскопом. Ова супстанца омогућава сноповима сперматозоида да се прилепе и држе за било које околне површине или честице тако да не лебде са околним током. Стога, наша запажања показују улогу адхезије сперматозоида у облику мобилних снопова. Њихова способност да пливају против струје и држе се оближњих површина омогућава сперматозоидима да дуже остану у SST-у.
Ротшилд25 је користио хемоцитометријску камеру за проучавање плутајуће дистрибуције говеђе сперме у капи суспензије, правећи фотомикрографије помоћу камере са вертикалном и хоризонталном оптичком осом микроскопа. Резултати су показали да су сперматозоиди привучени површином коморе. Аутори сугеришу да могу постојати хидродинамичке интеракције између сперматозоида и површине. Узимајући ово у обзир, заједно са способношћу сперме пилића Шаркаши да формира лепљиве чуперке, може се повећати вероватноћа да ће се сперма прилепити за зид SST-а и да ће се чувати дуже време.
Бечети и Афзелиу26 су известили да је гликокаликс сперматозоида неопходан за препознавање и аглутинацију гамета. Форман10 је приметио да хидролиза α-гликозидних веза у гликопротеин-гликолипидним премазима третирањем птичје сперме неураминидазом доводи до смањене плодности без утицаја на покретљивост сперматозоида. Аутори сугеришу да ефекат неураминидазе на гликокаликс нарушава секвестрацију сперматозоида на утеровагиналном споју, чиме се смањује плодност. Њихова запажања не могу игнорисати могућност да третман неураминидазом може смањити препознавање сперматозоида и ооцита. Форман и Енгел10 су открили да је плодност смањена када су кокошке инсеминиране интравагинално спермом третираном неураминидазом. Међутим, вантелесна оплодња са спермом третираном неураминидазом није утицала на плодност у поређењу са контролним пилићима. Аутори су закључили да промене у гликопротеин-гликолипидном премазу око мембране сперматозоида смањују способност сперматозоида да се оплоди оштећујући секвестрацију сперматозоида на утеровагиналном споју, што заузврат повећава губитак сперматозоида због брзине утеровагиналног споја, али не утиче на препознавање сперматозоида и јајних ћелија.
Код ћурки, Бакст и Баучан 11 су пронашли мале везикуле и фрагменте мембране у лумену ССТ-а и приметили да су се неке од ових гранула спојиле са мембраном сперматозоида. Аутори сугеришу да ови односи могу допринети дугорочном складиштењу сперматозоида у ССТ-у. Међутим, истраживачи нису прецизирали извор ових честица, да ли их луче епителне ћелије ЦЦТ-а, да ли их производи и лучи мушки репродуктивни систем или их производи сама сперма. Такође, ове честице су одговорне за аглутинацију. Груцнер и др.27 су известили да епителне ћелије епидидимиса производе и луче специфичан протеин који је потребан за формирање семенских трактова са једном пором. Аутори такође извештавају да дисперзија ових снопова зависи од интеракције епидидималних протеина. Никсон и др.28 су открили да аднексе луче протеин, кисели остеонектин богат цистеином; SPARC је укључен у формирање чуперки сперматозоида код краткокљуних ехидна и платипуса. Расејање ових зрака повезано је са губитком овог протеина.
У тренутној студији, ултраструктурна анализа електронском микроскопијом показала је да су сперматозоиди пријањали за велику количину густог материјала. Сматра се да су ове супстанце одговорне за аглутинацију која се кондензује између и око пријањајућих глава, али у нижим концентрацијама у пределу репа. Претпостављамо да се ова аглутинирајућа супстанца излучује из мушког репродуктивног система (епидидимиса или вас деференса) заједно са спермом, јер често посматрамо одвајање сперме од лимфе и семене плазме током ејакулације. Пријављено је да, док птичји сперматозоиди пролазе кроз епидидимис и вас деференс, пролазе кроз промене повезане са сазревањем које подржавају њихову способност везивања протеина и стицања гликопротеина повезаних са плазма лемом. Перзистентност ових протеина на резидентним мембранама сперматозоида у SST сугерише да ови протеини могу утицати на стицање стабилности мембране сперматозоида 30 и одредити њихову плодност 31. Ахамад и др.32 су известили да сперматозоиди добијени из различитих делова мушког репродуктивног система (од тестиса до дисталног васемвода) показују прогресивно повећање виталности у условима складиштења у течности, без обзира на температуру складиштења, а виталност код пилића се такође повећава у јајоводима након вештачке оплодње.
Чуперци сперме код шаркаши пилића имају другачије карактеристике и функције од других врста као што су ехидне, платипуси, шумски мишеви, јеленски пацови и заморци. Код шаркаши пилића, формирање снопова сперматозоида смањило је брзину пливања у поређењу са појединачним сперматозоидима. Међутим, ови снопови су повећали проценат реолошки позитивних сперматозоида и повећали способност сперматозоида да се стабилизују у динамичном окружењу. Дакле, наши резултати потврђују претходну сугестију да је аглутинација сперматозоида у ССТ повезана са дугорочним складиштењем сперме. Такође претпостављамо да склоност сперматозоида ка формирању чуперака може контролисати брзину губитка сперматозоида у ССТ, што може променити исход конкуренције сперматозоида. Према овој претпоставци, сперматозоиди са ниским капацитетом аглутинације први ослобађају ССТ, док сперматозоиди са високим капацитетом аглутинације производе већину потомства. Формирање снопова сперматозоида са једном пором је корисно и утиче на однос родитељ-дете, али користи другачији механизам. Код ехидна и платипуса, сперматозоиди су распоређени паралелно један другом како би се повећала брзина кретања снопа. Снопови ехидна крећу се око три пута брже од појединачних сперматозоида. Верује се да је формирање таквих снопова сперматозоида код ехидна еволутивна адаптација за одржавање доминације, пошто су женке промискуитетне и обично се паре са неколико мужјака. Стога се сперматозоиди из различитих ејакулата жестоко такмиче за оплодњу јајне ћелије.
Аглутинисани сперматозоиди шаркаси пилића се лако визуализују помоћу фазно-контрастне микроскопије, што се сматра предношћу јер омогућава лако проучавање понашања сперматозоида in vitro. Механизам којим формирање чуперки сперматозоида подстиче репродукцију код шаркаси пилића такође се разликује од оног који се види код неких плацентних сисара, што представља кооперативно понашање сперматозоида, као што су шумски мишеви, где неки сперматозоиди доспевају до јаја, помажући другим сродним јединкама да досегну и оштете њихова јаја. да се докажете. алтруистичко понашање. Самооплодња 34. Још један пример кооперативног понашања код сперматозоида пронађен је код јеленских мишева, где су сперматозоиди били у стању да идентификују и комбинују се са генетски најсроднијим сперматозоидима и формирају кооперативне групе како би повећали своју брзину у поређењу са неповезаним сперматозоидима35.
Резултати добијени у овој студији не противрече Фомановој теорији о дугорочном складиштењу сперматозоида у SST. Истраживачи извештавају да се сперматозоиди настављају кретати у току епителних ћелија које облажу SST током дужег временског периода, и након одређеног временског периода, залихе енергије сперматозоида се исцрпљују, што резултира смањењем брзине, што омогућава избацивање супстанци мале молекулске тежине. енергија сперматозоида протоком течности из лумена SST - шупљине јајовода. У овој студији, приметили смо да је половина појединачних сперматозоида показала способност пливања против текућих течности, а њихова адхезија у снопу повећала је њихову способност да покажу позитивну реологију. Штавише, наши подаци су у складу са подацима Мацузакија и др. 1 који су известили да повећана секреција лактата у SST може инхибирати покретљивост резидентних сперматозоида. Међутим, наши резултати описују формирање покретних лигамената сперматозоида и њихово реолошко понашање у присуству динамичног окружења унутар микроканала у покушају да разјасне њихово понашање у SST. Будућа истраживања могу се фокусирати на одређивање хемијског састава и порекла аглутинирајућег средства, што ће несумњиво помоћи истраживачима да развију нове начине за складиштење течне сперме и повећање трајања плодности.
Петнаест мужјака шаркасија без врата (хомозиготно доминантно; Na Na) старих 30 недеља одабрано је као донори сперме у студији. Птице су узгајане на Истраживачкој фарми живине Пољопривредног факултета Универзитета Ашит, гувернерство Ашит, Египат. Птице су смештене у појединачне кавезе (30 x 40 x 40 цм), подвргнуте светлосном програму (16 сати светлости и 8 сати таме) и храњене храном која садржи 160 г сировог протеина, 2800 kcal метаболичке енергије, 35 г калцијума по особи и 5 грама расположивог фосфора по килограму исхране.
Према подацима 36, ​​37, сперма је прикупљена од мушкараца абдоминалном масажом. Укупно 45 узорака сперме је прикупљено од 15 мушкараца током 3 дана. Сперма (н = 15/дан) је одмах разблажена 1:1 (в:в) са разблаживачем сперме Belsville Poultry, који садржи калијум-дифосфат (1,27 г), мононатријум-глутамат монохидрат (0,867 г), фруктозу (0,5 г), безводни натријум-ацетат (0,43 г), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 г), калијум-цитрат монохидрат (0,064 г), калијум-монофосфат (0,065 г), магнезијум-хлорид (0,034 г) и H2O (100 мл), pH = 7,5, осмоларност 333 mOsm/kg38. Разблажени узорци сперме су прво испитани под светлосним микроскопом како би се осигурао добар квалитет сперме (влага), а затим су чувани у воденом купатилу на 37°C до употребе у року од пола сата након сакупљања.
Кинематика и реологија сперматозоида су описане коришћењем система микрофлуидних уређаја. Узорци сперме су додатно разблажени на 1:40 у разблаживачу птичје сперме Beltsville Avian, убачени у микрофлуидни уређај (видети доле), а кинетички параметри су одређени коришћењем система за компјутеризовану анализу сперме (CASA) који је претходно развијен за микрофлуидну карактеризацију. о мобилности сперматозоида у течним медијумима (Катедра за машинство, Факултет инжењерства, Универзитет Асијут, Египат). Додатак се може преузети на: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Мерене су брзина криве (VCL, μm/s), линеарна брзина (VSL, μm/s) и просечна брзина путање (VAP, μm/s). Видео снимци сперматозоида су снимљени коришћењем инвертованог Optika XDS-3 фазно-контрастног микроскопа (са објективом од 40x) повезаног са Tucson ISH1000 камером при 30 fps током 3 s. Користите CASA софтвер за проучавање најмање три области и 500 путања сперматозоида по узорку. Снимљени видео је обрађен помоћу домаћег CASA програма. Дефиниција покретљивости у CASA додатку заснива се на брзини пливања сперматозоида у поређењу са брзином протока и не укључује друге параметре као што је кретање са стране на страну, јер се показало да је то поузданије код протока течности. Реолошко кретање се описује као кретање сперматозоида супротно од смера протока течности. Сперматозоиди са реолошким својствима су подељени бројем покретних сперматозоида; сперматозоиди који су били у мировању и сперматозоиди који се конвективно крећу су искључени из бројања.
Све коришћене хемикалије су набављене од компаније Elgomhoria Pharmaceuticals (Каиро, Египат), осим ако није другачије назначено. Уређај је произведен како је описано од стране Ел-шери и др. 40, уз неке модификације. Материјали коришћени за израду микроканала укључивали су стаклене плоче (Howard Glass, Worcester, MA), негативни резист SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), диацетон алкохол (Sigma Aldrich, Steinheim, Немачка) и полиацетон.-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Микроканали су направљени коришћењем меке литографије. Прво, провидна заштитна маска за лице са жељеним дизајном микроканала је одштампана на штампачу високе резолуције (Prismatic, Каиро, Египат и Pacific Arts and Design, Markham, ON). Мастер модели су направљени коришћењем стаклених плоча као подлога. Плоче су очишћене у ацетону, изопропанолу и дејонизованој води, а затим су пресвучене слојем SU8-25 дебљине 20 µm центрифугирањем (3000 о/мин, 1 мин). Слојеви SU-8 су затим нежно осушени (65°C, 2 мин и 95°C, 10 мин) и изложени УВ зрачењу током 50 секунди. Након излагања, печење је спроведено на 65°C и 95°C током 1 мин и 4 мин да би се умрежили изложени слојеви SU-8, а затим је уследило развијање у диацетон алкохолу током 6,5 мин. Вафле су тврдо печене (200°C током 15 мин) да би се слој SU-8 додатно учврстио.
ПДМС је припремљен мешањем мономера и учвршћивача у тежинском односу 10:1, затим је дегазиран у вакуумском ексикатору и изливен на главни оквир SU-8. ПДМС је очврснут у пећи (120°C, 30 мин), затим су канали исечени, одвојени од мастер модела и перфорирани како би се омогућило причвршћивање цеви на улазу и излазу микроканала. Коначно, ПДМС микроканали су трајно причвршћени за микроскопска стакла помоћу преносивог корона процесора (Electro-Technic Products, Чикаго, Илиноис) као што је описано другде. Микроканал коришћен у овој студији мери 200 µm × 20 µm (Ш × В) и дугачак је 3,6 cm.
Проток флуида индукован хидростатичким притиском унутар микроканала постиже се одржавањем нивоа флуида у улазном резервоару изнад висинске разлике Δh39 у излазном резервоару (Сл. 1).
где је f коефицијент трења, дефинисан као f = C/Re за ламинарни ток у правоугаоном каналу, где је C константа која зависи од односа ширине и висине канала, L је дужина микроканала, Vav је просечна брзина унутар микроканала, Dh је хидраулички пречник канала, g – убрзање гравитације. Користећи ову једначину, просечна брзина канала може се израчунати помоћу следеће једначине: