Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Плодност птица зависи од њихове способности да складиште довољно одрживе сперме током дужег временског периода у тубулима за складиштење сперме (ССТ).Тачан механизам којим сперматозоиди улазе, бораве и напуштају ССТ остаје контроверзан.Сперма кокоши шаркаси показала је високу склоност ка аглутинацији, формирајући покретне филаментне снопове који садрже много ћелија.Због потешкоћа у посматрању покретљивости и понашања сперматозоида у непрозирној јајоводној цеви, за проучавање аглутинације и покретљивости сперматозоида користили смо микрофлуидни уређај са микроканалним попречним пресеком сличним оном код сперматозоида.Ова студија говори о томе како се формирају снопови сперме, како се крећу и њиховој могућој улози у продужењу боравка сперме у ССТ.Испитивали смо брзину сперме и реолошко понашање када је проток течности генерисан унутар микрофлуидног канала хидростатичким притиском (брзина протока = 33 µм/с).Сперматозоиди имају тенденцију да пливају против струје (позитивна реологија) и брзина снопа сперматозоида је значајно смањена у поређењу са појединачним сперматозоидима.Примећено је да се снопови сперме крећу у спиралу и повећавају дужину и дебљину како се регрутује више појединачних сперматозоида. Примећено је да се снопови сперме приближавају и пријањају за бочне зидове микрофлуидних канала како би се избегло да буду пометени брзином протока течности > 33 µм/с. Примећено је да се снопови сперме приближавају и пријањају за бочне зидове микрофлуидних канала како би се избегло да буду пометени брзином протока течности > 33 µм/с. Било замечено, что пучки сперматозоидов приближаутса и прилипаут к боковим стенкам микрофлуидних каналов, чтоби избегнути сметаниа со скоростьу потока жидкости> 33 мкм / с. Примећено је да се снопови сперме приближавају и пријањају за бочне зидове микрофлуидних канала како би избегли да буду одбачени при брзинама протока течности >33 µм/с.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体浇速> 33 м/с33 µм/с 扫过. Било замечено, что пучки сперматозоиди приближавају и прилипаут к боковим стенкам микрожидкостнога канала, чтоби избећи сметаниа потока жидкости со скоростьу > 33 мкм/с. Примећено је да се снопови сперме приближавају и пријањају за бочне зидове микрофлуидног канала како би избегли да буду однесени протоком течности при >33 µм/с.Скенирање и трансмисиона електронска микроскопија открила је да су снопови сперме били подржани обиљем густог материјала.Добијени подаци показују јединствену покретљивост сперматозоида Шаркази пилића, као и способност сперматозоида да се аглутинирају и формирају покретне снопове, што доприноси бољем разумевању дуготрајног складиштења сперматозоида у СМТ.
Да би се постигла оплодња код људи и већине животиња, сперматозоиди и јајне ћелије морају да стигну на место оплодње у право време.Стога, парење мора да се деси пре или у време овулације.С друге стране, неки сисари, као што су пси, као и врсте несисара, као што су инсекти, рибе, гмизавци и птице, чувају сперму у својим репродуктивним органима током дужег временског периода док њихова јаја нису спремна за оплодњу (асинхрона оплодња 1).Птице су у стању да одрже одрживост сперматозоида способне да оплоде јаја 2-10 недеља2.
Ово је јединствена карактеристика која разликује птице од других животиња, јер пружа велику вероватноћу оплодње након једне оплодње током неколико недеља без истовременог парења и овулације.Главни орган за складиштење сперме, назван тубул за складиштење сперме (ССТ), налази се у унутрашњим наборима слузокоже на утеровагиналном споју.До данас, механизми помоћу којих сперма улази, борави и излази из банке сперме нису у потпуности схваћени.На основу претходних студија, постављене су многе хипотезе, али ниједна од њих није потврђена.
Форман4 је претпоставио да сперматозоиди одржавају свој боравак у ССТ шупљини кроз континуирано осцилаторно кретање против смера протока течности кроз протеинске канале који се налазе на епителним ћелијама ССТ (реологија).АТП је исцрпљен због сталне флагеларне активности потребне да се сперматозоиди одрже у лумену ССТ и покретљивост на крају опада све док се сперматозоиди не изнесу из банке сперме протоком течности и започну ново путовање низ узлазну јајоводу да би оплодили сперму.Јаје (Форман4).Овај модел складиштења сперме је подржан детекцијом имуноцитохемијом аквапорина 2, 3 и 9 присутних у епителним ћелијама ССТ.До данас недостају студије о реологији пилећег семена и његовој улози у складиштењу ССТ, селекцији вагиналне сперме и конкуренцији сперматозоида.Код пилића, сперма улази у вагину након природног парења, али више од 80% сперматозоида се избацује из вагине убрзо након парења.Ово сугерише да је вагина примарно место за селекцију сперме код птица.Поред тога, пријављено је да мање од 1% сперматозоида оплођених у вагини заврши у ССТ2.Код вештачке оплодње пилића у вагини, број сперматозоида који достижу ССТ има тенденцију повећања 24 сата након оплодње.До сада је механизам селекције сперматозоида током овог процеса нејасан, а покретљивост сперматозоида може играти важну улогу у преузимању ССТ сперматозоида.Због дебелих и непрозирних зидова јајовода, тешко је директно пратити покретљивост сперматозоида у јајоводима птица.Због тога нам недостаје основно знање о томе како сперматозоиди прелазе у ССТ након оплодње.
Реологија је недавно препозната као важан фактор који контролише транспорт сперме у гениталијама сисара.На основу способности покретних сперматозоида да мигрирају противструјно, Заферани и сарадници су користили микрофлуидни систем цорра да пасивно изолују покретне сперматозоиде из узорака сперме.Ова врста сортирања сперме је неопходна за медицинско лечење неплодности и клиничка истраживања, и преферира се у односу на традиционалне методе које захтевају време и рад и могу да угрозе морфологију сперме и структурни интегритет.Међутим, до данас нису спроведене студије о утицају секрета из гениталних органа пилића на покретљивост сперматозоида.
Без обзира на механизам који одржава сперму ускладиштену у ССТ, многи истраживачи су приметили да резидентни сперматозоиди аглутинирају главу уз главу у ССТ пилића 9, 10, препелица 2 и ћурки 11 да би формирали аглутиниране снопове сперме.Аутори сугеришу да постоји веза између ове аглутинације и дуготрајног складиштења сперматозоида у ССТ.
Тингари и Лаке12 су пријавили снажну повезаност између сперматозоида у жлезди која прима сперму пилетине и поставила питање да ли се сперматозоиди птица аглутинирају на исти начин као сперматозоиди сисара.Они верују да дубоке везе између сперматозоида у семеноводу могу бити последица стреса изазваног присуством великог броја сперматозоида у малом простору.
Приликом процене понашања сперматозоида на свежим висећим стакленим предметима, могу се уочити пролазни знаци аглутинације, посебно на ивицама капљица семена.Међутим, аглутинација је често била поремећена ротационим дејством повезаним са континуираним кретањем, што објашњава пролазну природу овог феномена.Истраживачи су такође приметили да када се разблаживач дода у сперму, појављују се издужени агрегати ћелија у облику нити.
Рани покушаји да се опонаша сперматозоид направљени су уклањањем танке жице са висеће капи, што је резултирало издуженим везикулом налик сперми који вири из капи сперме.Сперматозоиди су се одмах поредали на паралелан начин унутар везикуле, али је цела јединица брзо нестала због 3Д ограничења.Због тога је за проучавање аглутинације сперматозоида неопходно посматрати покретљивост и понашање сперматозоида директно у изолованим тубулима за складиштење сперме, што је тешко постићи.Стога је неопходно развити инструмент који опонаша сперматозоиде да би се подржале студије покретљивости сперматозоида и понашања аглутинације.Бриллард и сарадници13 су известили да је просечна дужина тубула за складиштење сперме код одраслих пилића 400–600 µм, али неки ССТ могу бити дуги и до 2000 µм.Меро и Огасавара14 поделили су семенске жлезде у увећане и неувећане тубуле за складиштење сперме, од којих су обе биле исте дужине (~ 500 µм) и ширине врата (~ 38 µм), али је средњи пречник лумена тубула био 56,6 и 56,6 µм.., односно 11,2 μм, респективно.У тренутној студији користили смо микрофлуидни уређај са величином канала од 200 µм × 20 µм (Ш × Х), чији је попречни пресек нешто близак оном код појачаног ССТ-а.Поред тога, испитали смо покретљивост сперматозоида и понашање аглутинације у текућој течности, што је у складу са Форемановом хипотезом да течност коју производе ССТ епителне ћелије држи сперму у лумену у супротном (реолошком) смеру.
Циљ овог рада био је да се превазиђу проблеми посматрања покретљивости сперматозоида у јајоводу и да се избегну тешкоће проучавања реологије и понашања сперматозоида у динамичном окружењу.Коришћен је микрофлуидни уређај који ствара хидростатички притисак за симулацију покретљивости сперматозоида у гениталијама пилића.
Када се кап разблаженог узорка сперме (1:40) стави у микроканални уређај, могу се идентификовати две врсте покретљивости сперматозоида (изолована сперма и везана сперма).Поред тога, сперматозоиди су имали тенденцију да пливају против струје (позитивна реологија; видео 1, 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину од оне усамљене сперме (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксу (п < 0,001; Табела 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину од оне усамљене сперме (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксу (п < 0,001; Табела 2). Иако пучки сперматозоиди имају више ниску брзину, него у одиночних сперматозоида (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида, демонстрирајући позитиван реотаксис (п < 0,001; табела 2). Иако су снопови сперматозоида имали мању брзину него појединачни сперматозоиди (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида који показују позитивну реотаксу (п < 0,001; Табела 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度 (п < 0,001)分比 (п < 0,001；表2).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 (п <0,001) ， 但 增加 了 显借 阁 显倧 阁分比 (п <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хота скорость пучков сперматозоидов била ниже, него у одиночних сперматозоида (п < 0,001), они су повећали процент сперматозоида с позитивној реологијом (п < 0,001; таблица 2). Иако је брзина снопова сперматозоида била мања од брзине појединачних сперматозоида (п < 0,001), они су повећали проценат сперматозоида са позитивном реологијом (п < 0,001; Табела 2).Позитивна реологија за појединачне сперматозоиде и чуперке се процењује на приближно 53% и 85%, респективно.
Примећено је да сперматозоиди шаркаси пилића одмах након ејакулације формирају линеарне снопове, који се састоје од десетина јединки.Ови праменови се временом повећавају у дужини и дебљини и могу остати ин витро неколико сати пре него што се распрше (видео 3).Ови филаментозни снопови су у облику сперматозоида ехидне који се формирају на крају епидидимиса.Утврђено је да сперма кокоши шаркаши има високу тенденцију аглутинације и формира мрежасти сноп за мање од једног минута након сакупљања.Ове греде су динамичне и могу се залепити за било које оближње зидове или статичне објекте.Иако снопови сперме смањују брзину сперматозоида, јасно је да макроскопски повећавају њихову линеарност.Дужина снопова варира у зависности од броја сперматозоида прикупљених у сноповима.Изолована су два дела снопа: почетни део, укључујући слободну главу аглутиниране сперме, и завршни део, укључујући реп и цео дистални крај сперме.Коришћењем камере велике брзине (950 фпс) у почетном делу снопа уочене су слободне главе аглутинираних сперматозоида, одговорне за померање снопа услед њиховог осцилаторног кретања, увлачећи преостале у сноп спиралним кретањем (Видео 4).Међутим, у дугим чуперцима, примећено је да су неке слободне главе сперме залепљене за тело и крајњи део чуперка делују као лопатице које помажу у покретању чуперка.
Док су у спором току течности, снопови сперме се крећу паралелно један са другим, међутим, почињу да се преклапају и лепе за све што мирује, како их не би испрао струјни ток како се брзина протока повећава.Снопови се формирају када се шачица сперматозоида приближи једна другој, почињу да се крећу синхронизовано и омотавају један око другог, а затим се залепе за лепљиву супстанцу.Слике 1 и 2 показују како се сперматозоиди приближавају једни другима, формирајући спој док се репови омотају један око другог.
Истраживачи су применили хидростатички притисак да би створили проток течности у микроканалу за проучавање реологије сперме.Коришћен је микроканал величине 200 µм × 20 µм (Ш × В) и дужине 3,6 µм.Користите микроканале између контејнера са шприцевима постављеним на крајевима.Да би канали били видљивији, коришћене су боје за храну.
Вежите интерконективне каблове и прибор за зид.Видео је снимљен фазним контрастним микроскопом.Уз сваку слику, представљени су фазни контраст микроскопије и слике мапирања.(А) Веза између два тока опире се току због спиралног кретања (црвена стрелица).(Б) Веза између снопа цеви и зида канала (црвене стрелице), у исто време су повезани са два друга снопа (жуте стрелице).(Ц) Снопови сперме у микрофлуидном каналу почињу да се повезују једни са другима (црвене стрелице), формирајући мрежу снопова сперме.(Д) Формирање мреже снопова сперме.
Када се кап разблажене сперме убаци у микрофлуидни уређај и створи проток, примећено је да се сноп сперме креће у супротном смеру од тока.Снопови се добро приањају уз зидове микроканала, а слободне главе у почетном делу снопова добро пристају уз њих (видео 5).Такође се лепе за све стационарне честице на свом путу, као што су крхотине, да би се одупрле да их струја однесе.Временом, ови чуперци постају дуги филаменти који заробљавају друге појединачне сперматозоиде и краће чуперке (Видео 6).Како проток почиње да успорава, дугачке линије сперме почињу да формирају мрежу линија сперме (Видео 7; Слика 2).
При великој брзини протока (В > 33 µм/с), спирална кретања нити су повећана као покушај да се ухвати велики број појединачних снопова сперматозоида који формирају снопове да се боље одупру сили протока. При великој брзини протока (В > 33 µм/с), спирална кретања нити су повећана као покушај да се ухвати велики број појединачних снопова сперматозоида који формирају снопове да се боље одупру сили протока. При високој скорости потока (В > 33 мкм/с) спиралевидние движениа нитеј усиливаутса, пошто они питаутса појмать множество отдельних сперматозоидов, образуусих пучки, которие лучше противстоат дрејфуусеј силе потока. При високим брзинама протока (В > 33 µм/с), спирални покрети ланаца се повећавају док покушавају да ухвате многе појединачне сперматозоиде формирајући снопове који су у стању да се боље одупру сили протока.在高流速(В > 33 µм/с) 时，螺纹的螺旋运动增加, 以试图捕捉许多形成束的好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (в> 33 µм/с) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形戎 束 ，更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При високих скоростах потока (В > 33 мкм/с) спирално движение нитеј увеличаваетса в попитке захватить множество отдельних сперматозоидов, образуусих пучки, чтоби боље сопротивлатьса силам дрејфа потока. При високим брзинама протока (В > 33 µм/с), спирално кретање филамената се повећава у покушају да се ухвати много појединачних сперматозоида који формирају снопове како би се боље одупрли силама струјања.Такође су покушали да причврсте микроканале на бочне зидове.
Снопови сперме су идентификовани као кластери глава сперме и репа који се увијају помоћу светлосне микроскопије (ЛМ).Снопови сперме са различитим агрегатима такође су идентификовани као уврнуте главе и бичасти агрегати, вишеструки спојени репови сперматозоида, главе сперматозоида причвршћене за реп и главе сперматозоида са савијеним језгром као више спојених језгара.трансмисиона електронска микроскопија (ТЕМ).Скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ) показала је да су снопови сперме били обложени агрегати глава сперме, а агрегати сперме су показали причвршћену мрежу умотаних репова.
Морфологија и ултраструктура сперматозоида, формирање снопова сперматозоида проучавани су светлосном микроскопијом (полупресек), скенирајућом електронском микроскопом (СЕМ) и трансмисијском електронском микроскопом (ТЕМ), размази сперме су обојени акридин наранџастом и прегледани епифлуоресцентном микроскопом.
Бојење размаза сперме акридин наранџастом (слика 3Б) показало је да су главе сперматозоида заглављене и прекривене секреторним материјалом, што је довело до формирања великих чуперака (слика 3Д).Снопићи сперме су се састојали од агрегата сперме са мрежом причвршћених репова (слика 4А-Ц).Снопићи сперме се састоје од репова многих сперматозоида који су заглављени (слика 4Д).Тајне (сл. 4Е, Ф) покривале су главе снопова сперматозоида.
Формирање снопа сперматозоида Коришћење фазноконтрастне микроскопије и размаза сперматозоида обојених акридин наранџастом бојом, показало је да се главе сперматозоида држе заједно.(А) Рано формирање сперматозоида почиње са спермом (бели круг) и три сперме (жути круг), са спиралом која почиње на репу и завршава се на глави.(Б) Микрофотографија размаза сперме обојеног акридин наранџастом бојом на којој се виде приањајуће главе сперме (стрелице).Исцједак покрива главу(е).Увећање × 1000. (Ц) Развој великог снопа који се преноси протоком у микрофлуидном каналу (користећи камеру велике брзине при 950 фпс).(Д) Микрограф размаза сперме обојеног акридин наранџастом бојом који показује велике чуперке (стрелице).Увећање: ×200.
Скенирајући електронски микрограф снопа сперме и размаза сперме обојеног акридин наранџастом бојом.(А, Б, Д, Е) су дигиталне електронске микрофотографије сперматозоида за скенирање у боји, а Ц и Ф су микрофотографије размаза сперматозоида обојених акридин наранџастом бојом који показују причвршћивање више сперматозоида који омотавају каудалну мрежу.(АЦ) Агрегати сперме су приказани као мрежа причвршћених репова (стрелица).(Д) Адхезија неколико сперматозоида (са адхезивном супстанцом, ружичасти обрис, стрелица) који се омотавају око репа.(Е и Ф) Агрегати глава сперме (показивачи) прекривени лепљивим материјалом (показивачи).Сперматозоиди су формирали снопове са неколико структура налик на вртлог (Ф).(Ц) ×400 и (Ф) ×200 увећања.
Користећи трансмисиону електронску микроскопију, открили смо да снопови сперме имају причвршћене репове (слика 6А, Ц), главе причвршћене за репове (слика 6Б) или главе причвршћене за репове (слика 6Д).Главе сперматозоида у снопу су закривљене и представљају у делу два нуклеарна региона (слика 6Д).У снопу инцизије, сперматозоиди су имали уврнуту главу са два нуклеарна региона и више флагеларних региона (слика 5А).
Дигитални електронски микрограф у боји који приказује спојне репове у снопу сперме и аглутинирајући материјал који повезује главе сперме.(А) Прикачени реп великог броја сперматозоида.Обратите пажњу на то како реп изгледа у портретној (стрелица) и пејзажној (стрелица) пројекцији.(Б) Глава (стрелица) сперме је повезана са репом (стрелица).(Ц) Неколико репова сперме (стрелице) је причвршћено.(Д) Материјал за аглутинацију (АС, плава) повезује четири главе сперме (љубичасте).
Скенирајућа електронска микроскопија је коришћена за откривање глава сперме у сноповима сперме прекривеним секретима или мембранама (слика 6Б), што указује да су снопови сперме усидрени екстрацелуларним материјалом.Аглутинирани материјал је концентрисан у глави сперме (склоп налик на главу медузе; слика 5Б) и проширен дистално, дајући бриљантно жути изглед под флуоресцентном микроскопијом када је обојен акридин наранџастом (слика 6Ц).Ова супстанца је јасно видљива под скенирајућим микроскопом и сматра се везивом.Полутанки пресеци (слика 5Ц) и размази сперме обојени акридин наранџастом бојом показали су снопове сперме који садрже густо збијене главе и увијене репове (слика 5Д).
Различите микрофотографије које приказују агрегацију глава и савијених репова сперматозоида користећи различите методе.(А) Електронски микрограф са трансмисијом дигиталног пресека у боји снопа сперме који приказује намотану главу сперме са дводелним језгром (плаво) и неколико делова бича (зелено).(Б) Дигитални скенирајући електронски микрограф у боји који приказује скуп глава сперме налик медузи (стрелице) које изгледају као да су прекривене.(Ц) Полутанки пресек који приказује агрегиране главе сперме (стрелице) и увијене репове (стрелице).(Д) Микрограф размаза сперматозоида обојеног акридин наранџастом бојом који приказује агрегате глава сперме (стрелице) и увијених прилепљених репова (стрелице).Имајте на уму да лепљива супстанца (С) покрива главу сперматозоида.(Д) × 1000 увећање.
Коришћењем трансмисионе електронске микроскопије (слика 7А), такође је примећено да су главе сперматозоида биле уврнуте и да језгра имају спирални облик, што је потврђено размазима сперме обојеним акридин наранџастом бојом и прегледаним помоћу флуоресцентне микроскопије (слика 7Б).
(А) Електронски микрограф са дигиталним преносом у боји и (Б) размаз сперматозоида обојен акридин наранџастом бојом који показује намотане главе и причвршћење глава и репа сперме (стрелице).(Б) × 1000 увећање.
Занимљиво откриће је да се Шарказијева сперма агрегира и формира покретне филаментне снопове.Особине ових снопова нам омогућавају да разумемо њихову могућу улогу у апсорпцији и складиштењу сперматозоида у ССТ.
Након парења, сперматозоиди улазе у вагину и пролазе кроз интензиван процес селекције, што доводи до тога да само ограничен број сперматозоида улази у ССТ15,16.До данас су нејасни механизми помоћу којих сперматозоиди улазе и излазе из ССТ.Код живине, сперматозоиди се чувају у ССТ на дужи период од 2 до 10 недеља, у зависности од врсте6.Остају контроверзе о стању сперме током складиштења у ССТ.Да ли су у покрету или мирују?Другим речима, како сперматозоиди одржавају своју позицију у ССТ тако дуго?
Форман4 је сугерисао да се боравак и избацивање ССТ могу објаснити у смислу покретљивости сперматозоида.Аутори претпостављају да сперматозоиди одржавају своју позицију пливајући против протока течности који ствара ССТ епител и да се сперматозоиди избацују из ССТ-а када њихова брзина падне испод тачке у којој почињу да се крећу уназад због недостатка енергије.Занибони5 је потврдио присуство аквапорина 2, 3 и 9 у апикалном делу епителних ћелија ССТ, што може индиректно подржати Фореманов модел складиштења сперме.У тренутној студији смо открили да скоро половина Шаркашијевих сперматозоида показује позитивну реологију у текућој течности и да аглутинирани снопови сперме повећавају број сперматозоида који показују позитивну реологију, иако их аглутинација успорава.Како сперматозоиди путују уз јајовод птице до места оплодње није у потпуности схваћено.Код сисара, фоликуларна течност хемопривлачи сперматозоиде.Међутим, верује се да хемоатрактанти усмеравају сперматозоиде на велике удаљености7.Дакле, други механизми су одговорни за транспорт сперме.Способност сперме да се оријентише и тече према течности јајовода која се ослобађа након парења је главни фактор у циљању сперме код мишева.Паркер 17 је сугерисао да сперматозоиди прелазе јајоводе пливајући против цилијарне струје код птица и гмизаваца.Иако то није експериментално демонстрирано на птицама, Адолпхи18 је био први који је открио да птичја сперма даје позитивне резултате када се танак слој течности између покровног стакла и стакалца створи траком филтер папира.Реологија.Хино и Ианагимацхи [19] су поставили мишји комплекс јајник-тубал-утерина у перфузиони прстен и убризгали 1 µл мастила у истхмус да би се визуелизовао проток течности у јајоводима.Приметили су веома активно кретање контракције и опуштања у јајоводу, у коме су се све куглице мастила стабилно кретале ка ампули јајовода.Аутори истичу значај протока течности у јајоводима од доњих ка горњим јајоводима за подизање и оплодњу сперматозоида.Бриллард20 је известио да код пилића и ћурки сперматозоиди мигрирају активним кретањем од вагиналног улаза, где се чувају, до утеро-вагиналног споја, где се чувају.Међутим, ово кретање није потребно између утеровагиналног споја и инфундибулума јер се сперматозоиди транспортују пасивним померањем.Познавајући ове претходне препоруке и резултате добијене у тренутној студији, може се претпоставити да је способност сперматозоида да се крећу узводно (реологија) једно од својстава на којима се заснива процес селекције.Ово одређује пролаз сперматозоида кроз вагину и њихов улазак у ЦЦТ ради складиштења.Као што је Форман4 сугерисао, ово такође може олакшати процес уласка сперме у ССТ и његово станиште током одређеног временског периода, а затим изласка када њихова брзина почне да се успорава.
С друге стране, Матсузаки и Сасанами 21 сугерисали су да сперматозоиди птица пролазе кроз промене покретљивости од мировања до покретљивости у мушком и женском репродуктивном тракту.Инхибиција резидентне покретљивости сперматозоида у ССТ-у је предложена да би се објаснило дуго време складиштења сперме, а затим и подмлађивање након напуштања ССТ-а.У хипоксичним условима, Матсузаки ет ал.1 је пријавио високу производњу и ослобађање лактата у ССТ, што може довести до инхибиције покретљивости резидентних сперматозоида.У овом случају, значај реологије сперме огледа се у одабиру и апсорпцији сперматозоида, а не у њиховом складиштењу.
Образац аглутинације сперме сматра се уверљивим објашњењем за дуг период складиштења сперме у ССТ, пошто је ово уобичајен образац задржавања сперме код живине2,22,23.Бакст и др.2 приметио је да се већина сперматозоида пријања једна за другу, формирајући фасцикуларне агрегате, а појединачни сперматозоиди су ретко пронађени у ЦЦМ препелица.С друге стране, Вен ет ал.24 приметили су више расутих сперматозоида и мање чуперака сперматозоида у ССТ лумену код пилића.На основу ових запажања, може се претпоставити да се склоност аглутинацији сперматозоида разликује између птица и између сперматозоида у истом ејакулату.Поред тога, Ван Креи ет ал.9 сугерише да је насумична дисоцијација аглутинираних сперматозоида одговорна за постепено продирање сперматозоида у лумен јајовода.Према овој хипотези, сперматозоиди са нижим капацитетом аглутинације прво треба да буду избачени из ССТ.У овом контексту, способност сперматозоида да аглутинирају може бити фактор који утиче на исход такмичења сперматозоида код прљавих птица.Поред тога, што се дуже аглутинирани сперматозоиди дисоцира, то се дуже одржава плодност.
Иако је агрегација сперматозоида и агрегација у снопове уочена у неколико студија2,22,24, они нису детаљно описани због сложености њиховог кинематичког посматрања у оквиру ССТ.Учињено је неколико покушаја да се проучава аглутинација сперматозоида ин витро.Опсежна, али пролазна агрегација је примећена када је танка жица уклоњена са висеће капи семена.То доводи до чињенице да издужени мехур вири из капи, имитирајући семенску жлезду.Због 3Д ограничења и кратког времена сушења, цео блок је брзо пропао9.У тренутној студији, користећи шаркаши пилиће и микрофлуидни чипс, успели смо да опишемо како се ови праменови формирају и како се крећу.Снопићи сперме су се формирали одмах након сакупљања сперме и утврђено је да се крећу спирално, показујући позитивну реологију када су присутни у току.Штавише, када се посматра макроскопски, примећено је да снопови сперме повећавају линеарност покретљивости у поређењу са изолованим сперматозоидима.Ово сугерише да се аглутинација сперматозоида може десити пре пенетрације ССТ-а и да производња сперме није ограничена на малу површину због стреса као што је претходно предложено (Тингари и Лаке12).Током формирања чуперка, сперматозоиди пливају синхронизовано док не формирају спој, затим им се репови омотају један око другог и глава сперматозоида остаје слободна, али се реп и дистални део сперматозоида лепе лепљивом супстанцом.Због тога је слободна глава лигамента одговорна за кретање, повлачећи остатак лигамента.Скенирајућа електронска микроскопија снопова сперматозоида показала је причвршћене главе сперме прекривене пуно лепљивог материјала, што сугерише да су главе сперме биле причвршћене у сноповима који се одмарају, што се могло догодити након што су стигле до места складиштења (ССТ).
Када је размаз сперме обојен акридин наранџастом, екстрацелуларни лепљиви материјал око сперматозоида може се видети под флуоресцентним микроскопом.Ова супстанца омогућава сноповима сперме да се приањају и приањају за све околне површине или честице тако да не лебде са околним током.Дакле, наша запажања показују улогу адхезије сперматозоида у облику мобилних снопова.Њихова способност да пливају против струје и држе се за оближње површине омогућава сперми да дуже остане у ССТ.
Ротхсцхилд25 је користио камеру за хемоцитометрију за проучавање плутајуће дистрибуције говеђе сперме у капи суспензије, узимајући фотомикрографије кроз камеру са вертикалном и хоризонталном оптичком осом микроскопа.Резултати су показали да су сперматозоиди привучени површином коморе.Аутори сугеришу да могу постојати хидродинамичке интеракције између сперме и површине.Узимајући ово у обзир, заједно са способношћу сперме пилића Шаркаши да формира лепљиве чуперке, може повећати вероватноћу да ће се сперма причврстити на зид од ССТ-а и да ће се чувати током дужег временског периода.
Бццетти и Афзелиу26 су известили да је гликокаликс сперме потребан за препознавање и аглутинацију гамета.Форман10 је приметио да хидролиза α-гликозидних веза у гликопротеин-гликолипидним облогама третирањем семена птица неураминидазом доводи до смањене плодности без утицаја на покретљивост сперматозоида.Аутори сугеришу да ефекат неураминидазе на гликокаликс отежава секвестрацију сперме на утеро-вагиналном споју, чиме се смањује плодност.Њихова запажања не могу занемарити могућност да третман неураминидазом може смањити препознавање сперматозоида и ооцита.Форман и Енгел10 су открили да је плодност смањена када су кокошке интравагинално осемењене семеном третираном неураминидазом.Међутим, ИВФ са спермом третираном неураминидазом није утицао на плодност у поређењу са контролним пилићима.Аутори су закључили да промене у гликопротеин-гликолипидном омотачу око мембране сперматозоида смањују способност сперматозоида да се оплоде нарушавањем секвестрације сперме на утеро-вагиналном споју, што заузврат повећава губитак сперме услед брзине утеро-вагиналног, али не и сперматозоидиног споја.
Код ћурки Бакст и Бауцхан 11 су пронашли мале везикуле и фрагменте мембране у лумену ССТ и приметили да су се неке од ових гранула спојиле са мембраном сперме.Аутори сугеришу да ови односи могу допринети дугорочном складиштењу сперматозоида у ССТ.Међутим, истраживачи нису прецизирали извор ових честица, да ли их луче ЦЦТ епителне ћелије, производе и луче мушки репродуктивни систем или производи сама сперма.Такође, ове честице су одговорне за аглутинацију.Грутзнер и сарадници27 су известили да епидидималне епителне ћелије производе и луче специфичан протеин који је неопходан за формирање семенских путева са једним порама.Аутори такође наводе да дисперзија ових снопова зависи од интеракције епидидималних протеина.Никон ет ал28 су открили да аднекси луче протеин, кисели остеонектин богат цистеином;СПАРЦ је укључен у формирање чуперака сперматозоида код краткокљуних ехидна и платипуса.Расипање ових зрака је повезано са губитком овог протеина.
У тренутној студији, ултраструктурна анализа помоћу електронске микроскопије показала је да су сперматозоиди пријањали за велику количину густог материјала.Сматра се да су ове супстанце одговорне за аглутинацију која се кондензује између и око прилепљених глава, али у нижим концентрацијама у пределу репа.Претпостављамо да се ова аглутинирајућа супстанца излучује из мушког репродуктивног система (епидидимиса или вас деференса) заједно са семеном, пошто често примећујемо да се сперма одваја од лимфе и семенске плазме током ејакулације.Пријављено је да док птичји сперматозоиди пролазе кроз епидидимис и вас деференс, они пролазе кроз промене у вези са сазревањем које подржавају њихову способност да везују протеине и добијају гликопротеине повезане са лемом плазме.Постојаност ових протеина на резидентним мембранама сперматозоида у ССТ сугерише да ови протеини могу утицати на стицање стабилности мембране сперматозоида 30 и одредити њихову плодност 31 .Ахаммад и сарадници32 су известили да сперматозоиди добијени из различитих делова мушког репродуктивног система (од тестиса до дисталног вас деференса) показују прогресивно повећање виталности у условима складиштења течности, без обзира на температуру складиштења, а одрживост код пилића се такође повећава у јајоводима након вештачке оплодње.
Шаркаши пилећи сперматозоиди имају различите карактеристике и функције од других врста као што су ехидне, платипуси, дрвени мишеви, јеленски пацови и заморци.Код пилића шаркаси, формирање снопова сперматозоида смањило је њихову брзину пливања у поређењу са појединачним сперматозоидима.Међутим, ови снопови су повећали проценат реолошки позитивних сперматозоида и повећали способност сперматозоида да се стабилизују у динамичном окружењу.Дакле, наши резултати потврђују претходну сугестију да је аглутинација сперматозоида у ССТ повезана са дуготрајним складиштењем сперме.Такође претпостављамо да склоност сперматозоида да формирају чуперке може контролисати стопу губитка сперме у ССТ, што може променити исход такмичења сперматозоида.Према овој претпоставци, сперматозоиди са ниским капацитетом аглутинације прво ослобађају ССТ, док сперматозоиди са високим капацитетом аглутинације производе већину потомства.Формирање снопова сперме са једним порама је корисно и утиче на однос родитељ-дете, али користи другачији механизам.Код ехидна и платипуса, сперматозоиди су распоређени паралелно један према другом како би се повећала брзина зрака.Снопови ехидна се крећу око три пута брже од појединачних сперматозоида.Верује се да је формирање таквих чуперака сперме код ехидна еволуциона адаптација за одржавање доминације, пошто су женке промискуитетне и обично се паре са неколико мужјака.Због тога се сперматозоиди из различитих ејакулата жестоко такмиче за оплодњу јајета.
Аглутиниране сперматозоиде шаркаси пилића лако се визуализују коришћењем фазног контрастног микроскопа, што се сматра корисним јер омогућава лако проучавање понашања сперматозоида ин витро.Механизам којим формирање чуперака сперме промовише репродукцију код шаркаси пилића се такође разликује од оног који се види код неких плацентних сисара који представљају кооперативно понашање сперматозоида, као што су дрвени мишеви, где неки сперматозоиди доспевају до јаја, помажући другим сродним јединкама да дођу и оштете своја јаја.да се докажеш.алтруистичко понашање.Самооплодња 34. Још један пример кооперативног понашања сперматозоида пронађен је код мишева јелена, где су сперматозоиди били у стању да идентификују и комбинују се са генетски најсроднијим сперматозоидима и формирају кооперативне групе како би повећали своју брзину у поређењу са неповезаним сперматозоидима35.
Резултати добијени у овој студији нису у супротности са Фомановом теоријом о дуготрајном складиштењу сперматозоида у СВС.Истраживачи наводе да сперматозоиди настављају да се крећу у току епителних ћелија које облажу ССТ током дужег временског периода, а након одређеног временског периода, залихе енергије сперматозоида су исцрпљене, што доводи до смањења брзине, што омогућава избацивање супстанци мале молекуларне тежине.енергија сперматозоида са протоком течности из лумена ССТ Шупљина јајовода.У тренутној студији, приметили смо да је половина појединачних сперматозоида показала способност да плива против текућих течности, а њихова адхезија у снопу повећала је њихову способност да покажу позитивну реологију.Штавише, наши подаци су у складу са онима из Матсузаки ет ал.1 који је известио да повећано лучење лактата у ССТ може инхибирати покретљивост сперматозоида.Међутим, наши резултати описују формирање покретних лигамената сперматозоида и њихово реолошко понашање у присуству динамичког окружења унутар микроканала у покушају да се разјасни њихово понашање у ССТ.Будућа истраживања могу се фокусирати на одређивање хемијског састава и порекла аглутинационог агенса, што ће несумњиво помоћи истраживачима да развију нове начине складиштења течне сперме и продуже трајање плодности.
Петнаест 30-недељних головратих мушких шаркасија (хомозиготни доминантни; На На) одабрани су као донатори сперме у студији.Птице су узгајане на Истраживачкој живинарској фарми Пољопривредног факултета Универзитета Ашит, губернија Ашит, Египат.Птице су смештене у појединачне кавезе (30 к 40 к 40 цм), подвргнуте светлосном програму (16 сати светлости и 8 сати мрака) и храњене храном која је садржала 160 г сирових протеина, 2800 кцал метаболичне енергије, по 35 г калцијума.5 грама доступног фосфора по килограму исхране.
Према подацима 36, 37, сперма је сакупљена од мушкараца масажом абдомена.Укупно је прикупљено 45 узорака сперме од 15 мушкараца током 3 дана.Семе (н = 15/дан) је одмах разблажено 1:1 (в:в) са Белсвилле Поултри Семен Дилуентом, који садржи калијум дифосфат (1,27 г), мононатријум глутамат монохидрат (0,867 г), фруктозу (0,5 д) анхидровани натријум.ацетат (0,43 г), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 г), калијум цитрат монохидрат (0,064 г), калијум монофосфат (0,065 г), магнезијум хлорид (0,034 г) и Х2О (100 мл), пХ = 7, 3мо3 кг хлор.Разблажени узорци сперме су прво прегледани под светлосним микроскопом да би се обезбедио добар квалитет сперме (влага), а затим су чувани у воденом купатилу на 37°Ц до употребе у року од пола сата након сакупљања.
Кинематика и реологија сперматозоида описана је помоћу система микрофлуидних уређаја.Узорци сперме су даље разблажени на 1:40 у Белтсвилле птичјем разблаживачу сперме, убачени у микрофлуидни уређај (види доле), а кинетички параметри су одређени коришћењем система за компјутеризовану анализу сперме (ЦАСА) који је претходно развијен за микрофлуидну карактеризацију.о мобилности сперматозоида у течним медијима (Департман за машинство, Факултет инжењерских наука, Универзитет Асиут, Египат).Додатак се може преузети на: хттп://ввв.ассиутмицрофлуидицс.цом/ресеарцх/цаса39.Мерене су крива брзина (ВЦЛ, μм/с), линеарна брзина (ВСЛ, μм/с) и просечна брзина путање (ВАП, μм/с).Видео снимци сперматозоида су снимљени помоћу инвертованог микроскопа с фазним контрастом Оптика КСДС-3 (са објективом 40к) повезаног са Туцсон ИСХ1000 камером при 30 фпс током 3 с.Користите ЦАСА софтвер за проучавање најмање три области и 500 путања сперме по узорку.Снимљени видео је обрађен помоћу кућне ЦАСА.Дефиниција покретљивости у ЦАСА додатку заснована је на брзини пливања сперме у поређењу са брзином протока и не укључује друге параметре као што је кретање са једне на другу страну, јер је утврђено да је то поузданије у протоку течности.Реолошко кретање се описује као кретање сперматозоида против смера протока течности.Сперматозоиди са реолошким својствима подељени су бројем покретних сперматозоида;сперматозоиди који су били у мировању и сперматозоиди који се конвективно крећу су искључени из бројања.
Све коришћене хемикалије су добијене од Елгомхориа Пхармацеутицалс (Каиро, Египат) осим ако није другачије назначено.Уређај је произведен како су описали Ел-Схерри ет ал.40 са извесним изменама.Материјали коришћени за производњу микроканала укључивали су стаклене плоче (Ховард Гласс, Ворцестер, МА), СУ-8-25 негативни отпор (МицроЦхем, Невтон, ЦА), диацетонски алкохол (Сигма Алдрицх, Стеинхеим, Немачка) и полиацетон.-184, Дов Цорнинг, Мидланд, Мицхиган).Микроканали се производе меком литографијом.Прво, провидна заштитна маска за лице са жељеним дизајном микроканала је одштампана на штампачу високе резолуције (Присматиц, Цаиро, Египт анд Пацифиц Артс анд Десигн, Маркхам, ОН).Мајстори су рађени коришћењем стаклених плоча као подлога.Плоче су очишћене у ацетону, изопропанолу и дејонизованој води, а затим пресвучене слојем од 20 µм СУ8-25 центрифугирањем (3000 о/мин, 1 мин).Слојеви СУ-8 су затим нежно осушени (65°Ц, 2 мин и 95°Ц, 10 мин) и изложени УВ зрачењу током 50 с.Пећи након излагања на 65°Ц и 95°Ц у трајању од 1 мин и 4 мин да би се укрштали слојеви изложени СУ-8, након чега је уследило развијање у диацетон алкохолу током 6,5 мин.Чврсто пеците вафле (200°Ц 15 мин) да би се слој СУ-8 додатно учврстио.
ПДМС је припремљен мешањем мономера и учвршћивача у тежинском односу 10:1, затим дегазиран у вакуум ексикатору и изливен на главни оквир СУ-8.ПДМС је осушен у пећници (120 ° Ц, 30 мин), затим су канали исечени, одвојени од главног и перфорирани да би се омогућило причвршћивање цеви на улаз и излаз из микроканала.Коначно, ПДМС микроканали су трајно причвршћени на микроскопске плочице помоћу преносног корона процесора (Елецтро-Тецхниц Продуцтс, Цхицаго, ИЛ) као што је описано на другом месту.Микроканал коришћен у овој студији мери 200 µм × 20 µм (Ш × В) и дугачак је 3,6 цм.
Проток флуида изазван хидростатичким притиском унутар микроканала постиже се одржавањем нивоа течности у улазном резервоару изнад висинске разлике Δх39 у излазном резервоару (слика 1).
где је ф коефицијент трења, дефинисан као ф = Ц/Ре за ламинарни ток у правоугаоном каналу, где је Ц константа у зависности од односа ширине и висине канала, Л је дужина микроканала, Вав је просечна брзина унутар микроканала, Дх је хидраулички пречник канала, г – убрзање гравитације.Користећи ову једначину, просечна брзина канала се може израчунати коришћењем следеће једначине: