Хвала вам што сте посетили Nature.com. Користите верзију прегледача са ограниченом CSS подршком. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Поред тога, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Недавно је развијена антимикробна платформа без хемикалија, заснована на нанотехнологији коришћењем вештачких водених наноструктура (EWNS). EWNS имају високо површинско наелектрисање и богате су реактивним врстама кисеоника (ROS) које могу да интерагују са бројним микроорганизмима и да их инактивирају, укључујући патогене који се преносе храном. Овде је показано да се њихова својства током синтезе могу фино подесити и оптимизовати како би се додатно побољшао њихов антибактеријски потенцијал. Лабораторијска платформа EWNS је дизајнирана да фино подеси својства EWNS променом параметара синтезе. Карактеризација својстава EWNS (наелектрисање, величина и садржај ROS) је извршена коришћењем савремених аналитичких метода. Поред тога, микроорганизми у храни као што су Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum и Saccharomyces cerevisiae су инокулирани на површину органског парадајза како би се проценио њихов потенцијал микробне инактивације. Резултати представљени овде показују да се својства EWNS могу фино подесити током синтезе, што резултира експоненцијалним повећањем ефикасности инактивације. Конкретно, површинско наелектрисање се повећало четири пута, а садржај реактивних врста кисеоника се повећао. Брзина уклањања микроба је зависила од микроба и кретала се од 1,0 до 3,8 log након 45 минута излагања дози аеросола од 40.000 #/cm3 EWNS.
Микробна контаминација је главни узрок болести изазваних храном, узрокованих уносом патогена или њихових токсина. Болести изазване храном узрокују око 76 милиона болести, 325.000 хоспитализација и 5.000 смртних случајева сваке године само у Сједињеним Државама1. Поред тога, Министарство пољопривреде Сједињених Држава (USDA) процењује да је повећана конзумација свежих производа одговорна за 48 процената свих болести изазваних храном пријављених у Сједињеним Државама2. Трошкови болести и смрти од патогена изазваних храном у Сједињеним Државама су веома високи, а Центри за контролу и превенцију болести (CDC) процењују их на више од 15,6 милијарди америчких долара годишње3.
Тренутно се хемијске4, радијационе5 и термичке6 антимикробне интервенције ради обезбеђивања безбедности хране углавном спроводе на ограниченим критичним контролним тачкама (ККТ) у производном ланцу (обично након жетве и/или током паковања), уместо да се континуирано спроводе на такав начин да су свежи производи подложни унакрсној контаминацији7. Антимикробне интервенције су потребне за бољу контролу болести које се преносе храном и кварења хране и имају потенцијал да се примене у целом континууму „од фарме до трпезе“. Мањи утицај и трошкови.
Недавно је развијена нанотехнологијска антимикробна платформа без хемикалија за инактивацију бактерија на површинама и у ваздуху коришћењем вештачких водених наноструктура (EWNS). За синтезу EVNS коришћена су два паралелна процеса: електроспреј и јонизација воде (Сл. 1а). Претходно је показано да EWNS имају јединствен скуп физичких и биолошких својстава8,9,10. EWNS има просечно 10 електрона по структури и просечну нанометарску величину од 25 nm (Сл. 1б,ц)8,9,10. Поред тога, електронска спинска резонанца (ESR) показала је да EWNS садрже велику количину реактивних врста кисеоника (ROS), углавном хидроксил (OH•) и супероксидних (O2-) радикала (Сл. 1ц)8. EWNS су остајале у ваздуху дуго времена и могле су да се сударају са микробима суспендованим у ваздуху и присутним на површинама, испоручујући свој ROS корисни терет и изазивајући инактивацију микроба (Сл. 1д). Ове раније студије су такође показале да EWNS могу да интерагују са различитим грам-негативним и грам-позитивним бактеријама од значаја за јавно здравље, укључујући микобактерије, на површинама и у ваздуху8,9. Трансмисиона електронска микроскопија је показала да је инактивација узрокована поремећајем ћелијске мембране. Поред тога, студије акутне инхалације су показале да високе дозе EWNS не изазивају оштећење плућа или упалу8.
(а) Електрораспршивање настаје када се високи напон примени између капиларе која садржи течност и контраелектроде. (б) Примена високог напона резултира два различита феномена: (и) електрораспршивањем воде и (ии) стварањем реактивних врста кисеоника (јона) заробљених у EWNS. (ц) Јединствена структура EWNS. (д) EWNS су веома мобилни због своје наноразмерне природе и могу да интерагују са патогенима који се преносе ваздухом.
Недавно је демонстрирана и способност антимикробне платформе EWNS да инактивира микроорганизме који се преносе храном на површини свеже хране. Такође је показано да се површинско наелектрисање EWNS-а може користити у комбинацији са електричним пољем за циљану испоруку. Још важније, обећавајући почетни резултат од приближно 1,4 log смањења активности органског парадајза против различитих микроорганизама у храни, као што су E. coli и Listeria, примећен је у року од 90 минута од излагања EWNS-у при концентрацији од приближно 50.000#/cm311. Поред тога, прелиминарни тестови органолептичке евалуације нису показали органолептички ефекат у поређењу са контролним парадајзом. Иако ови почетни резултати инактивације обећавају безбедност хране чак и при веома ниским дозама EWNS-а од 50.000#/cm³, јасно је да би већи потенцијал инактивације био кориснији за даље смањење ризика од инфекције и кварења.
Овде ћемо фокусирати наша истраживања на развој платформе за генерисање EWNS-а како бисмо фино подесили параметре синтезе и оптимизовали физичко-хемијске особине EWNS-а ради побољшања њиховог антибактеријског потенцијала. Конкретно, оптимизација је усмерена на повећање њиховог површинског наелектрисања (ради побољшања циљане испоруке) и садржаја ROS-а (ради побољшања ефикасности инактивације). Карактеризација оптимизованих физичко-хемијских особина (величина, наелектрисање и садржај ROS) коришћењем савремених аналитичких метода и коришћењем уобичајених микроорганизама у храни као што су E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae и M. parafortuitum.
EVNS је синтетисан истовременим електрораспршивањем и јонизацијом воде високе чистоће (18 MΩ cm–1). Електрични атомизатор 12 се обично користи за атомизацију течности и синтетичких полимерних и керамичких честица 13 и влакана 14 контролисане величине.
Као што је детаљно описано у претходним публикацијама 8, 9, 10, 11, у типичном експерименту, висок напон се примењује између металне капиларе и уземљене контраелектроде. Током овог процеса, дешавају се два различита феномена: 1) електроспреј и 2) јонизација воде. Јако електрично поље између две електроде узрокује накупљање негативних наелектрисања на површини кондензоване воде, што резултира формирањем Тејлорових конуса. Као резултат тога, формирају се високо наелектрисане капљице воде, које се настављају распадати на мање честице, према Рејлијевој теорији16. Истовремено, јако електрично поље узрокује да се неки молекули воде цепају и откидају електроне (јонизација), чиме се генерише велика количина реактивних врста кисеоника (ROS)17. Истовремено генерисани ROS18 пакети су капсулирани у EWNS (Сл. 1ц).
На слици 2а приказан је систем за генерисање EWNS-а развијен и коришћен у EWNS синтези у овој студији. Пречишћена вода ускладиштена у затвореној боци је довођена кроз тефлонску цев (унутрашњи пречник 2 mm) до игле од нерђајућег челика 30G (метална капилар). Као што је приказано на слици 2б, проток воде се контролише притиском ваздуха унутар боце. Игла је причвршћена за тефлонску конзолу која се може ручно подесити на одређену удаљеност од контраелектроде. Контраелектрода је полирани алуминијумски диск са рупом у средини за узорковање. Испод контраелектроде налази се алуминијумски левак за узорковање, који је повезан са остатком експерименталне поставке преко отвора за узорковање (слика 2б). Све компоненте узорковача су електрично уземљене како би се избегло накупљање наелектрисања које би могло да деградира узорковање честица.
(а) Систем за генерисање пројектованих наноструктура воде (EWNS). (б) Попречни пресек узорковача и јединице за електрораспршивање који приказује најважније параметре. (ц) Експериментална поставка за инактивацију бактерија.
Систем за генерисање EWNS-а описан горе је способан да мења кључне оперативне параметре како би се олакшало фино подешавање својстава EWNS-а. Подесите примењени напон (V), растојање између игле и контраелектроде (L) и проток воде (φ) кроз капилар да бисте фино подесили карактеристике EWNS-а. Симболи [V (kV), L (cm)] се користе за означавање различитих комбинација. Подесите проток воде да бисте добили стабилан Тејлоров конус одређеног скупа [V, L]. За потребе ове студије, отвор бленде контраелектроде (D) је подешен на 0,5 инча (1,29 cm).
Због ограничене геометрије и асиметрије, јачина електричног поља не може се израчунати из првих принципа. Уместо тога, за израчунавање електричног поља коришћен је софтвер QuickField™ (Свендборг, Данска)19. Електрично поље није једнообразно, па је вредност електричног поља на врху капиларе коришћена као референтна вредност за различите конфигурације.
Током студије, неколико комбинација напона и растојања између игле и контраелектроде је процењено у смислу формирања Тејлоровог конуса, стабилности Тејлоровог конуса, стабилности производње EWNS-а и репродуктивности. Различите комбинације су приказане у Додатној табели S1.
Излаз система за генерисање EWNS-а био је директно повезан са Scanning Mobility Particle Sizer-ом (SMPS, модел 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) за мерење концентрације броја честица и коришћен је са Фарадејевим аеросол електрометром (TSI, модел 3068B, Shoreview, САД). MN) за мерење протока аеросола, као што је описано у нашој претходној публикацији9. И SMPS и аеросол електрометар су узорковали брзином протока од 0,5 L/min (укупни проток узорка 1 L/min). Концентрације честица и флукси аеросола су мерени током 120 s. Поновите мерење 30 пута. Укупно аеросолоно наелектрисање се израчунава из мерења струје, а просечно EWNS наелектрисање се процењује из укупног броја узоркованих EWNS честица. Просечна цена EWNS-а може се израчунати помоћу једначине (1):
где је IEl измерена струја, NSMPS је бројна концентрација измерена помоћу SMPS-а, а φEl је брзина протока ка електрометру.
Пошто релативна влажност (RH) утиче на површинско наелектрисање, температура и (RH) су одржаване константним на 21°C и 45%, респективно, током експеримента.
За мерење величине и животног века EWNS коришћени су атомска силова микроскопија (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта Барбара, Калифорнија) и AC260T сонда (Olympus, Токио, Јапан). Брзина скенирања AFM-ом је 1 Hz, а површина скенирања је 5 µm × 5 µm са 256 линија скенирања. Све слике су подвргнуте поравнању слика првог реда коришћењем Asylum софтвера (маска са опсегом од 100 nm и прагом од 100 pm).
Уклоните левак за узорковање и поставите површину лискуна на растојање од 2,0 цм од контраелектроде на просечно време од 120 с како бисте избегли коалесценцију честица и стварање неправилних капљица на површини лискуна. EWNS је примењен директно на свеже исечене површине лискуна (Ted Pella, Redding, CA). Одмах након распршивања, површина лискуна је визуелизована помоћу AFM-а. Површински контактни угао свеже исеченог немодификованог лискуна је близу 0°, тако да се EWNS шири преко површине лискуна у облику куполе20. Пречник (a) и висина (h) дифузујућих капљица су мерени директно из AFM топографије и коришћени за израчунавање куполасте дифузионе запремине EWNS коришћењем наше претходно валидиране методе8. Под претпоставком да уграђени EVNS има исту запремину, еквивалентни пречник се може израчунати из једначине (2):
У складу са нашом претходно развијеном методом, коришћена је спинска замка електронске спинске резонанце (ESR) за детекцију присуства краткотрајних радикалских интермедијера у EWNS. Аеросоли су пропуштени кроз раствор који садржи 235 mM DEPMPO (5-(диетоксифосфорил)-5-метил-1-пиролин-N-оксид) (Oxis International Inc., Портланд, Орегон). Сва EPR мерења су извршена коришћењем Bruker EMX спектрометра (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САД) и низова равних ћелија. За прикупљање и анализу података коришћен је софтвер Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САД). Карактеризација ROS је извршена само за скуп радних услова [-6,5 kV, 4,0 cm]. Концентрације EWNS су мерене коришћењем SMPS након узимања у обзир губитка EWNS у импактору.
Нивои озона су праћени помоћу 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдер, Колорадо)8,9,10.
За сва својства EWNS-а, вредност мерења је средња вредност мерења, а грешка мерења је стандардна девијација. Извршен је t-тест да би се упоредила вредност оптимизованог атрибута EWNS-а са одговарајућом вредношћу основног EWNS-а.
Слика 2ц приказује претходно развијен и окарактерисан систем за пропуштање електростатичке таложе (EPES) који се може користити за циљање EWNS11 на површине. EPES користи EWNS наелектрисање у комбинацији са јаким електричним пољем да би директно „усмерио“ на површину мете. Детаљи EPES система представљени су у недавној публикацији Пиргиотакиса и др.11. Дакле, EPES се састоји од 3D штампане PVC коморе са суженим крајевима која садржи две паралелне металне плоче од нерђајућег челика (нерђајући челик 304, полиран као огледало) у средини, удаљене 15,24 цм. Плоче су биле повезане са спољним извором високог напона (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), доња плоча је увек била позитивна, а горња плоча је увек била уземљена (плутајућа). Зидови коморе су прекривени алуминијумском фолијом, која је електрично уземљена како би се спречио губитак честица. Комора има запечаћена предња врата за пуњење која омогућавају постављање тестних површина на пластичне носаче, подижући их са доње металне плоче како би се избегле сметње високог напона.
Ефикасност таложења EWNS у EPES је израчуната према претходно развијеном протоколу детаљно описаном у Додатној слици S111.
Као контролна комора, други проток кроз цилиндричну комору је повезан серијски са EPES системом користећи средњи HEPA филтер за уклањање EWNS-а. Као што је приказано на слици 2ц, EWNS аеросол је пумпан кроз две коморе повезане серијски. Филтер између контролне собе и EPES-а уклања све преостале EWNS-е, што резултира истом температуром (T), релативном влажношћу (RH) и нивоима озона.
Утврђено је да важни микроорганизми који се преносе храном контаминирају свеже производе, као што су Escherichia coli (ATCC #27325), фекални индикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647), патоген који се преноси храном, Listeria innocua (ATCC #33090), алтернатива патогеној Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) као алтернатива квасцу који изазива кварење, и Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) као отпорније живе бактерије купљене су од ATCC (Манасас, Вирџинија).
Насумично купите кутије органског парадајза са локалне пијаце и чувајте их у фрижидеру на 4°C до употребе (до 3 дана). Изаберите парадајз за експериментисање једне величине, пречника око 1,5 цм.
Протоколи за инкубацију, инокулацију, излагање и бројање колонија детаљно су описани у нашим претходним публикацијама и детаљно објашњени у Додатним подацима 11. Перформансе EWNS-а су процењене излагањем инокулираних парадајза концентрацији од 40.000 #/cm3 током 45 минута. Укратко, у времену t = 0 мин, три парадајза су коришћена за процену преживелих микроорганизама. Три парадајза су стављена у EPES и изложена EWNS-у на 40.000 #/cc (парадајз изложени EWNS-у), а три друга су стављена у контролну комору (контролни парадајз). Ниједна од група парадајза није подвргнута додатној обради. Парадајз изложени EWNS-у и контролне групе су уклоњене након 45 минута како би се проценио ефекат EWNS-а.
Сваки експеримент је спроведен у три примерка. Анализа података је извршена према протоколу описаном у Додатним подацима.
Узорци бактерија E. coli, Enterobacter и L. innocua изложени EWNS-у (45 мин, концентрација EWNS аеросола 40.000 #/cm3) и неизложени су пелетирани да би се проценили механизми инактивације. Талог је фиксиран 2 сата на собној температури у 0,1 M раствору натријум какодилата (pH 7,4) са фиксативом од 2,5% глутаралдехида, 1,25% параформалдехида и 0,03% пикринске киселине. Након прања, фиксирани су са 1% осмијум тетроксида (OsO4)/1,5% калијум фероцијанида (KFeCN6) током 2 сата, испрани 3 пута водом и инкубирани у 1% уранил ацетату током 1 сата, а затим испрани два пута водом. Накнадна дехидрација од 10 минута са 50%, 70%, 90%, 100% алкохолом. Узорци су затим стављени у пропилен оксид на 1 сат и импрегнирани смешом пропилен оксида и TAAP Epon-а у односу 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Узорци су уграђени у TAAB Epon и полимеризовани на 60°C током 48 сати. Очвршћена гранулирана смола је исечена и визуализована TEM-ом коришћењем JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Јапан), конвенционалног трансмисионог електронског микроскопа опремљеног AMT 2k CCD камером (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, САД).
Сви експерименти су спроведени у три примерка. За сваку временску тачку, бактеријски испирани узорци су посејани у три примерка, што је резултирало укупно девет тачака података по тачки, чији је просек коришћен као концентрација бактерија за тај одређени организам. Стандардна девијација је коришћена као грешка мерења. Све тачке се рачунају.
Логаритам смањења концентрације бактерија у поређењу са t = 0 min израчунат је коришћењем следеће формуле:
где је C0 концентрација бактерија у контролном узорку у тренутку 0 (тј. након што се површина осушила, али пре него што је стављена у комору) и Cn је концентрација бактерија на површини након n минута излагања.
Да би се узело у обзир природно разграђивање бактерија током периода излагања од 45 минута, израчунато је и логаритамско смањење у поређењу са контролом након 45 минута на следећи начин:
Где је Cn концентрација бактерија у контролном узорку у времену n, а Cn-Control је концентрација контролних бактерија у времену n. Подаци су представљени као логаритамско смањење у поређењу са контролом (без излагања EWNS-у).
Током студије, неколико комбинација напона и растојања између игле и контраелектроде је процењено у смислу формирања Тејлоровог конуса, стабилности Тејлоровог конуса, стабилности производње EWNS и репродуктивности. Различите комбинације су приказане у Додатној табели С1. Два случаја су одабрана за комплетну студију која показују стабилна и репродуктивна својства (Тејлоров конус, производња EWNS и стабилност током времена). На слици 3 приказани су резултати о наелектрисању, величини и садржају ROS за два случаја. Резултати су такође сумирани у Табели 1. Ради референце, Слика 3 и Табела 1 укључују својства претходно синтетизованих неоптимизованих EWNS8, 9, 10, 11 (основни-EWNS). Прорачуни статистичке значајности коришћењем двостраног t-теста поново су објављени у Додатној табели С2. Поред тога, додатни подаци укључују студије о утицају пречника отвора за узорковање контраелектроде (D) и растојања између уземљене електроде и врха игле (L) (Додатне слике С2 и С3).
(a–c) Расподела величине AFM. (d–f) Карактеристика површинског наелектрисања. (g) Карактеризација ROS и ESR.
Такође је важно напоменути да су за све горе наведене услове измерене струје јонизације биле у опсегу од 2-6 µA, а напони у опсегу од -3,8 до -6,5 kV, што је резултирало потрошњом енергије за овај једнотерминални EWNS мањом од 50 mW. . генерациони модул. Иако је EWNS синтетисан под високим притиском, нивои озона су били веома ниски, никада нису прелазили 60 ppb.
Додатна слика S4 приказује симулирана електрична поља за сценарије [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], респективно. Поља према сценаријима [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm] израчуната су као 2 × 10⁶ V/m и 4,7 × 10⁶ V/m, респективно. Ово је очекивано, јер је однос напона и удаљености много већи у другом случају.
На слици 3а,б приказан је пречник EWNS измерен помоћу AFM8. Просечни пречници EWNS за сценарије [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm] израчунати су као 27 nm и 19 nm, респективно. Геометријске стандардне девијације расподела за случајеве [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm] су 1,41 и 1,45, респективно, што указује на уску расподелу величине. И средња величина и геометријска стандардна девијација су веома близу основним EWNS, износећи 25 nm и 1,41, респективно. На слици 3ц приказана је расподела величине основних EWNS мерених коришћењем исте методе под истим условима.
На слици 3д,е приказани су резултати карактеризације наелектрисања. Подаци представљају просечна мерења 30 истовремених мерења концентрације (#/цм3) и струје (I). Анализа показује да је просечно наелектрисање на EWNS-у 22 ± 6 е- и 44 ± 6 е- за [-6,5 kV, 4,0 цм] и [-3,8 kV, 0,5 цм], респективно. У поређењу са Baseline-EWNS-ом (10 ± 2 е-), њихово површинско наелектрисање је значајно веће, двоструко веће него у сценарију [-6,5 kV, 4,0 цм] и четири пута веће него у сценарију [-3,8 kV, 0,5 цм]. Слика 3ф приказује основне податке о плаћању за EWNS.
Из мапа концентрације броја EWNS (додатне слике S5 и S6), може се видети да сцена [-6,5 kV, 4,0 cm] има знатно већи број честица него сцена [-3,8 kV, 0,5 cm]. Такође треба напоменути да су концентрације броја EWNS праћене до 4 сата (додатне слике S5 и S6), где је стабилност генерисања EWNS показала исте нивое концентрације броја честица у оба случаја.
Слика 3г приказује ЕПР спектар након одузимања контролне (позадинске) вредности за оптимизовани EWNS на [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS спектар је такође упоређен са базном линијом EWNS у претходно објављеном раду. Израчунати број EWNS који реагују са спинском замком је 7,5 × 10⁴ EWNS/s, што је слично претходно објављеној бази-EWNS8. ЕПР спектри су јасно указали на присуство две врсте ROS, где је O2- преовладавао, док је OH• био присутан у мањој количини. Поред тога, директно поређење интензитета пикова показало је да оптимизовани EWNS има значајно већи садржај ROS у поређењу са базном EWNS.
На слици 4 приказана је ефикасност таложења EWNS у EPES. Подаци су такође сумирани у Табели I и упоређени са оригиналним EWNS подацима. За оба EUNS случаја, таложење је било близу 100% чак и при ниском напону од 3,0 kV. Типично, 3,0 kV је довољно да се постигне 100% таложења без обзира на промену површинског наелектрисања. Под истим условима, ефикасност таложења Baseline-EWNS била је само 56% због нижег наелектрисања (просечно 10 електрона по EWNS).
Слика 5 и Табела 2 сумирају степен инактивације микроорганизама инокулираних на површини парадајза након излагања приближно 40.000 #/cm3 EWNS током 45 минута под оптималним сценаријем [-6,5 kV, 4,0 cm]. Инокулиране E. coli и L. innocua показале су значајно смањење од 3,8 log након 45 минута излагања. Под истим условима, S. enterica је показала ниже log смањење од 2,2 log, док су S. cerevisiae и M. parafortuitum показали смањење од 1,0 log.
Електронски микрографски снимци (слика 6) приказују физичке промене изазване EWNS у ћелијама E. coli, Salmonella enterica и L. innocua, што је довело до инактивације. Контролне бактерије су показале нетакнуте ћелијске мембране, док су изложене бактерије имале оштећене спољашње мембране.
Електронско микроскопско снимање контролних и изложених бактерија открило је оштећење мембране.
Подаци о физичко-хемијским својствима оптимизованих EWNS-а заједно показују да су својства EWNS-а (површинско наелектрисање и садржај ROS-а) значајно побољшана у поређењу са претходно објављеним основним подацима EWNS-а8,9,10,11. С друге стране, њихова величина је остала у нанометарском опсегу, што је веома слично претходно објављеним резултатима, што им омогућава да остану у ваздуху дужи временски период. Уочена полидисперзност може се објаснити променама површинског наелектрисања, које одређују величину Рејлијевог ефекта, случајности и потенцијалног спајања EWNS-а. Међутим, како су детаљно описали Нилсен и др.22, високо површинско наелектрисање смањује испаравање ефикасним повећањем површинске енергије/напона капи воде. Ова теорија је експериментално потврђена за микрокапљице22 и EWNS у нашој претходној публикацији8. Губитак времена такође може утицати на величину и допринети посматраној расподели величине.
Поред тога, наелектрисање по структури је око 22–44 е-, у зависности од околности, што је знатно више у поређењу са основним EWNS-ом, који има просечно наелектрисање од 10 ± 2 електрона по структури. Међутим, треба напоменути да је ово просечно наелектрисање EWNS-а. Сето и др. Показано је да наелектрисање није једнолично и да прати лог-нормалну расподелу21. У поређењу са нашим претходним радом, удвостручавање површинског наелектрисања удвостручује ефикасност таложења у EPES систему на скоро 100%11.