Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Лупин Ангустифолиус (НЛЛ, Lupinus angustifolius L.) је махунарка која се користи за производњу хране и побољшање земљишта. Глобална експанзија НЛЛ као усева привукла је многе патогене гљивице, укључујући лупину антракнозу, која узрокује разорну болест антракнозе. Два алела, Lanr1 и AnMan, који дају повећану отпорност, коришћена су у оплемењивању НЛЛ, али основни молекуларни механизми остају непознати. У овој студији, маркери Lanr1 и AnMan коришћени су за скрининг европских узорака НЛЛ. Тестирање вакцине у контролисаном окружењу потврдило је ефикасност оба резистентна донора. Диференцијално профилисање експресије гена извршено је на репрезентативним резистентним и осетљивим линијама. Отпорност на антракнозу била је повезана са прекомерном експресијом термина генске онтологије „GO:0006952 Одбрамбени одговор“, „GO:0055114 Редокс процес“ и „GO:0015979 Фотосинтеза“. Поред тога, линија Lanr1(83A:476) показала је значајно репрограмирање транскриптома брзо након инокулације, док су остале линије показале кашњење у овом одговору од око 42 сата. Одбрамбени одговори су повезани са генима TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 протеина укључених у патогенезу, протеинима за пренос липида, ендоглукан-1,3-β-глукозидазом, протеинима ћелијског зида богатим глицином и генима из реактивног пута кисеоника. Рани одговори на 83A:476, укључујући пажљиво сузбијање гена повезаних са фотосинтезом, поклопили су се са успешном заштитом током вегетативне фазе раста гљивичне биологије, што сугерише да ефектор покреће имунитет. Манделупова реакција је успорена, као и укупно хоризонтално отпорно дејство.
Усколисни лупин (НЛЛ, Lupinus angustifolius L.) је житарица са високим садржајем протеина пореклом из западног медитеранског региона1,2. Тренутно се гаји као прехрамбена култура за животиње и људе. Такође се сматра зеленим ђубривом у системима плодореда због фиксације азота симбиотским бактеријама које фиксирају азот и свеукупног побољшања структуре земљишта. НЛЛ је прошла кроз брз процес припитомљавања у прошлом веку и још увек је под великим притиском узгоја3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Са широко распрострањеним узгојем НЛЛ, сукцесија патогених гљивица развила је нове пољопривредне нише и изазвала нове болести које уништавају усеве. Најзначајнија за узгајиваче лупине била је појава антракнозе, коју је изазвала патогена гљивица Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Најзначајнија за узгајиваче лупине била је појава антракнозе, коју је изазвала патогена гљивица Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательним дла фермеров и селекционеров лупина било поавление антракнозе, визванного патогеном грибком Цоллетотрицхум лупини (Бондар) Ниренберг, Феилер & Хагедорн13. Најзначајнија за узгајиваче лупина била је појава антракнозе коју је изазвала патогена гљивица Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由眏出现, 它是由矏匎由矗(Бондар) Ниренберг, Феилер & Хагедорн13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由眏出现, 它是由矏匎由矗(Бондар)嵵Хаиред。1 Наиболее поразительним дла фермеров и селекционеров лупина авлаетса поавление антракнозе, визиваемого патогеном грибком Цоллетотрицхум лупини (Бондар) Ниренберг, Феилер & Хагедорн13. Најупечатљивија за узгајиваче лупине је појава антракнозе коју изазива патогена гљивица Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Најранији извештаји о болести потичу из Бразила и Сједињених Држава, са типичним симптомима који су се појавили 1912. и 1929. године, респективно. Међутим, након око 30 година, патоген је означен као Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Сацц., телеоморф Гломерелла цингулата (Стонеман) Спаулд. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Сацц.，有目的形态的Гломерелла цингулата (Стонеман) Спаулд. & Сацц.，有目的形态的Гломерелла цингулата (Стонеман) Спаулд. & Сацц., Гломерелла цингулата (Стонеман) Спаулд в Целенаправленној морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у циљаној морфологији. & Х. Шренк,. & Х. Шренк, .и Х. Шренк. & Х.施伦克，。 & Х.施伦克，。и Х. Шленк,.Прелиминарна фенотипизација болести урађена средином 20. века показала је извесну отпорност код НЛЛ и жутог лупина (L. luteus L.), али су сви тестирани примерци белог лупина (L. albus L.) били веома осетљиви15,16. Студије су показале да је развој антракнозе повезан са повећаним падавинама (влажношћу ваздуха) и температуром (у опсегу од 12-28°C), што доводи до нарушавања отпорности на вишим температурама17, 18. У ствари, време потребно за клијање конидија и почетак болести било је четири пута краће на 24°C (4 сата) него на 12°C (16 сати) у условима високе влажности19. Дакле, текуће глобално загревање довело је до ширења антракнозе. Међутим, болест је примећена у Француској (1982) и Украјини (1983) као претеча надолазеће претње, али ју је индустрија лупина очигледно у то време игнорисала20,21. Неколико година касније, ова разорна болест проширила се широм света и погодила је и главне земље произвођаче лупина, као што су Аустралија, Пољска и Немачка22,23,24. Након епидемије антракнозе средином 1990-их, опсежни скрининг је резултирао идентификацијом неколико отпорних донора у узорцима NLL19. Отпорност NLL на антракнозу контролишу два одвојена доминантна алела која се налазе у различитим изворима герминативне плазме: Lanr1 код сорти Tanjil и Wonga и AnMan код сорте Mandalay25,26. Ови алели допуњују молекуларне маркере који подржавају селекцију отпорне герминативне плазме у програмима оплемењивања25,26,27,28,29,30. Резистентна линија 83A:476 која носи алел Lanr1 укрштена је са осетљивом дивљом линијом P27255 да би се добила RIL популација која се сегрегира за отпорност на антракнозу, што је омогућило додељивање локуса Lanr1 хромозому NLL-1131, 32, 33. Поравнање маркера мапе повезивања од бочних локуса отпорности на антракнозу са геномским оквиром, NLL је открило локацију сва три алела на истом хромозому (NLL-11), али на различитим позицијама29,34,35. Међутим, због малог броја RIL-ова и велике генетске удаљености између маркера и одговарајућих алела, не могу се извући поуздани закључци о њиховим основним генима. С друге стране, употреба реверзне генетике код лупина је тешка због њиховог веома ниског потенцијала регенерације, што генетску манипулацију чини гломазном37.
Развој домаће герминативне плазме која носи жељени алел у хомозиготном стању, као што су 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), отворио је врата проучавању отпорности на антракнозу упркос присуству супротстављених комбинација алела у дивљим популацијама. Могућности молекуларних механизама. Упоредите одбрамбене одговоре генерисане специфичним генотиповима. Ова студија је проценила рани транскриптомски одговор NLL на вакцинацију против C. lupini. Прво, европски панел герминативне плазме NLL који садржи 215 линија је скриниран коришћењем молекуларних маркера који означавају алеле Lanr1 и AnMan. Фенотипизација антракнозе је затим извршена на 50 NLL линија, претходно одабраних за молекуларне маркере, под контролисаним условима. На основу ових експеримената, четири линије које се разликују у отпорности на антракнозу и алелном саставу Lanr1/AnMan су одабране за диференцијално профилисање експресије гена одбране коришћењем два комплементарна приступа: секвенцирање РНК високог протока и квантификација PCR-ом у реалном времену.
Скрининг скупа НЛЛ герминативне плазме (N = 215) са маркерима Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показао је да само једна линија (95726, близу Salamanca-b) амплификује алел „отпорности“ за све маркере, док је „Присуство 'осетљивих' алела“ пронашло удео свих маркера у 158 (~73,5%) линија. Тринаест линија је произвело два „отпорна“ алела маркера Lanr1, а 8 линија је произвело „отпорне“ алеле маркера Lanr1. Алел „отпорности“ маркера AnMan (Додатна табела S1). Две линије су биле хетерозиготне за маркер Anseq3, а једна хетерозиготна за маркер AnManM1. 42 линије (19,5%) су носиле супротне фазе алела Anseq3 и Anseq4, што указује на високу учесталост рекомбинације између ова два локуса. Фенотипови антракнозе под контролисаним условима (Додатна табела С2) показали су варијабилност у отпорности тестираних генотипова, што се одразило на тежину антракнозе. Разлике у средњим резултатима кретале су се од 1,8 (умерено отпорне) до 6,9 (осетљиве), а разлике у тежини биљака кретале су се од 0,62 (осетљиве) до 4,45 г (отпорне). Постојала је значајна корелација између вредности примећених у два понављања експеримента (0,51 за оцену тежине болести, P = 0,00017 и 0,61 за тежину биљке, P < 0,0001), као и између ова два параметра (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Постојала је значајна корелација између вредности примећених у два понављања експеримента (0,51 за оцену тежине болести, P = 0,00017 и 0,61 за тежину биљке, P < 0,0001), као и између ова два параметра (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Виављена достовернаа коррелациа между значениами, наблудаемими в двухмах експеримента (0,51 за баллов тажести болести, П = 0,00017 и 0,61 за масси растениа, П < 0,0001), а также между етим двема параметрима (-0,59 и -0,77, Р < 0,00) 0,00). Значајна корелација је пронађена између вредности примећених у два понављања експеримента (0,51 за оцену тежине болести, P = 0,00017 и 0,61 за тежину биљке, P < 0,0001), као и између ова два параметра (-0,59 и -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分度评分0,00017，植物重量为0,61，П <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,70,00П <0,0001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 熄度 语分为 0,51 ， п = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， п <0,0001） 以及 两 个 参数 乌 （（（（ （（（（（（（间） 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, П < 0,0001). Наблудалась значительнаа коррелациа между значениами, наблудаемими в двух ревностах (оценка тажести оболевања 0,51, П = 0,00017 и масса растениа 0,61, П <0,0001), и между етим двема параметрима (-0,59 и -0,0001) 0,77, П <0,000. Постојала је значајна корелација између вредности примећених у дупликату (оцена тежине болести 0,51, P = 0,00017 и тежина биљке 0,61, P < 0,0001) и између ова два параметра (-0,59 и -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Типични симптоми који се виде код осетљивих биљака укључују савијање и увијање стабљике које подсећа на структуру „пастирског лука“, након чега следе овалне лезије са наранџастим/ружичастим спорозоитима (Допунска слика 1). Аустралијски прикључци који носе гене Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup) су умерено отпорни, 0,0331 и 0,0036). Неке линије које такође носе „отпорне“ алеле Lanr1 и/или AnMan показују симптоме болести.
Занимљиво је да је неколико НЛЛ линија којима недостаје било који „резистентни“ маркер алел показало висок ниво отпорности на антракнозу (упоредив или виши него за генотипове Lanr1 или AnMan), као што су Boregine (P вредност < 0,0001 за оба параметра), Bojar (P вредност < 0,0001 за резултат и 0,001 за тежину биљке) и популација B-549/79b (P вредност < 0,0001 за резултат и није значајно за тежину). Занимљиво је да је неколико НЛЛ линија којима недостаје било који „резистентни“ маркер алел показало висок ниво отпорности на антракнозу (упоредив или виши него за генотипове Lanr1 или AnMan), као што су Boregine (P вредност < 0,0001 за оба параметра), Bojar (P вредност < 0,0001 за резултат и 0,001 за тежину биљке) и популација B-549/79b (P вредност < 0,0001 за резултат и није значајно за тежину). Интересно, што неколико линија НЛЛ, лишених каквог-или «резистентног» маркерског алела, показују високу отпорност на антракнозу (суставом или више високу, него за генотипов Ланр1 или АнМан), као што су Борегине (значење П <0,0001 за обоје оцењивања), Бојар (значење П < 0,0) и0 и0 популации Б-549/79б (значење П <0,0001 за оценки и незначимо за масу). Занимљиво је да је неколико НЛЛ линија којима недостаје било који „резистентни“ маркер алел показало висок ниво отпорности на антракнозу (упоредив са или виши него за генотипове Lanr1 или AnMan), као што су Boregine (P вредност < 0,0001 за оба параметра), Bojar (P вредност < 0,0001 за процену и 0,001 за тежину биљке) и популација B-549/79b (P вредност < 0,0001 за процену и није значајно за тежину).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的НЛЛ 系显示出高水平的炭疎 1或АнМан 基因型相当或更高）,例如Борегине (两个参数的П 值<0,0001)、Бојар（П 值<得分为0,0001, 植物重量为0,001）和种群Б-549/79б (得分П 值< 0,0001)，昝量 Занимљиво је да неки NLL системи који немају никакве „антигене“ маркере показују високу хоризонталну отпорност (еквивалентну Lanr1 или AnMan генима или вишу), као што су Boregine (оба параметра P < 0,0001), Bojar (P вредност < 0,0001, тежина биљке 0,001) и сој B-549/79b (P вредност < 0,0001, тежина није значајна). Интересно, што су неке линије НЛЛ, лишене било каквих-било маркерских алеја «резистентности», показале су високе отпорности на антракнозу (сравне или више, него у генотипов Ланр1 или АнМан), такве као Борегине (значење П за обојих параметара <0,0001), Бојар (значење П <0,010) Б-549/79б (оценка П-значение <0,0001, масса незначителна). Занимљиво је да су неке НЛЛ линије којима недостају алели маркера „отпорности“ показале високе нивое отпорности на антракнозу (упоредиве са или веће од генотипова Lanr1 или AnMan), као што су Boregine (P-вредност за оба параметра <0,0001), Bojar (P-вредност <0,0001, тежина биљке 0,001) и популација B-549/79b (P-вредност <0,0001, тежина није значајна).Овај феномен указује на могућност новог генетског извора отпорности, објашњавајући уочени недостатак корелације између маркерских генотипова и фенотипова болести (P вредности од ~0,42 до ~0,98). Дакле, Колмогоров-Смирновљев тест је показао да су подаци о отпорности на антракнозу приближно нормално распоређени за резултате (P-вредности 0,25 и 0,11) и масу биљке (P-вредности 0,47 и 0,55), што сугерише да претпостављам да је укључено више алела од Lanr1 и AnMan.
На основу резултата скрининга резистенције на антракнозу, одабране су 4 линије за анализу транскриптома: 83A:476, Boregine, Mandelup и Популација 22660. Ове линије су поново тестиране на резистенцију на антракс у експериментима инокулације секвенцирањем РНК, под условом да су исте као у претходном тесту. Вредности резултата су биле следеће: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) и популација 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina NovaSeq 6000 постигао је просечно 40,5 M парова очитавања по узорку (29,7 до 54,4 M очитавања) (Додатна табела S3). Резултати поравнања у референтној секвенци кретали су се од 75,5% до 88,6%. Просечна корелација података о броју очитавања између експерименталних варијанти између биолошких репликата кретала се од 0,812 до 0,997 (средња вредност 0,959). Од 35.170 анализираних гена, 2917 није показало никакву експресију, а осталих 4785 гена је експресовано на занемарљивом нивоу (основна средња вредност < 5). Од 35.170 анализираних гена, 2917 није показало никакву експресију, а осталих 4785 гена је експресовано на занемарљивом нивоу (основна средња вредност < 5). Из 35 170 проанализованих генов 2917 не исказали експрессии, а остальние 4785 генов експрессировались на незначителном уровну (базовое средње <5). Од 35.170 анализираних гена, 2917 није показало експресију, а преосталих 4785 гена је експресовано на занемарљивом нивоу (основна просек <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他4785个基因的表达可以忽略不计 (基本平均值< 5)。35.170 Из 35 170 проанализированих генов 2917 не експрессировались, а остальние 4785 генов имели незначительнуу експресиу (базовое средное значение <5). Од 35.170 анализираних гена, 2917 није било експресовано, а преосталих 4785 гена је имало занемарљиву експресију (основна просек <5).Дакле, број гена који су сматрани експресованим (основна средња вредност ≥ 5) током експеримента био је 27.468 (78,1%) (Додатна табела S4).
Од прве временске тачке, све NLL линије су реаговале на инокулацију C. lupini (сој Col-08) репрограмирањем транскриптома (Табела 1), међутим, примећене су значајне разлике између линија. Тако је линија отпорности 83A:476 (која носи ген Lanr1) показала значајно репрограмирање транскриптома у првој временској тачки (6 hpi) са повећањем броја изолованих up- и down-гена од 31-69 пута у поређењу са другим временским тачкама у овој временској тачки. Поред тога, овај врх је био краткотрајан, јер је експресија само неколико гена остала значајно измењена у другој временској тачки (12 hpi). Занимљиво је да Boregine, који је такође показао висок ниво отпорности у тесту калемљења, није подвргнут тако масовном транскрипционом репрограмирању током експеримента. Међутим, број диференцијално експримираних гена (DEG) био је исти за Boregine и 83A:476 на 12 HPI. И Манделуп и популација 22660 показали су врхове DEG-а у последњој временској тачки (48 л/с), што указује на релативно кашњење у одбрамбеним одговорима.
Пошто је 83A:476 подвргнут масовном репрограмирању транскриптома као одговор на C. lupini на 6 HPI у поређењу са свим осталим линијама, ~91% диференцијално експоненцијалних гена (DEG) примећених у овом тренутку било је специфично за лозу (Сл. 1). Међутим, дошло је до извесног преклапања у раним одговорима између испитиваних линија, јер се 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG код Boregine, Mandelup и популације 22660, респективно, преклапало са онима пронађеним код 83A:476 у одређеним временским тачкама. Међутим, ови DEG су чинили само мали део (0,97–1,70%) свих DEG тренутно детектованих помоћу 83A:476. Поред тога, 11 диференцијалних степена ћелијског зида (DEG) из свих линија било је кохерентно у овом тренутку (додатне табеле S4-S6), укључујући заједничке компоненте одбрамбених одговора биљака: протеин за пренос липида (TanjilG_32225), ензим ендоглукан-1,3-β-глукозид (TanjilG_23384), два протеина индукована стресом попут SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531), базични латекс протеин (TanjilG_32352) и два структурна протеина ћелијског зида богата глицином (TanjilG_19701 и TanjilG_19702). Такође је постојало релативно велико преклапање у одговорима транскриптома између 83A:476 и Boregine на 24 HPI (укупно 16-38% DEG) и између Mandelup и популације 22660 на 48 HPI (укупно 14-20% DEG).
Венов дијаграм који приказује број диференцијално експресованих гена (DEG) код линија усколисне лупине (NLL) инокулираних са Colletotrichum lupini (сој Col-08 добијен са поља лупине у Вјеженицама, Пољска, 1999). Анализиране NLL линије су биле: 83A:476 (отпорна, носи алел Lanr1), Boregine (отпорна, генетска позадина непозната), Mandelup (умерено отпорна, носи алел AnMan) и популација 22660 (веома осетљива). Скраћеница hpi означава сате након вакцинације. Нулте вредности су уклоњене ради поједностављења графикона.
Скуп прекомерно експресованих гена на 6 hpi је анализиран на присуство канонских R генских домена (Додатна табела S7). Ова студија је открила индукцију транскриптома класичних гена отпорности на болести само са NBS-LRR доменима на 83A:476. Овај сет се састојао од једног TIR-NBS-LRR гена (tanjilg_05042), пет CC-NBS-LRR гена (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), и четири NBS-LR, Tanjilg_16162), и четири NBS-LRRE (tanjilg_16162), као и четири NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четири NBS-LRR (TANJILG_16162). Сви ови гени имају канонске домене распоређене у конзервираним секвенцама. Поред гена NBS-LRR домена, неколико RLL киназа је активирано након 6 hpi, наиме једна у Boregine (TanjilG_19877), две у Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и у популацији 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две у 83A 27:476.
Гени са значајно измењеном експресијом као одговор на инокулацију са C. lupini (сој Col-08) подвргнути су анализи обогаћивања генске онтологије (GO) (Додатна табела S8). Најчешће прекомерно заступљени термин биолошког процеса био је „GO:0006952 одбрамбени одговор“ који се појавио у 6 од 16 (време × линија) комбинација са високом значајношћу (P вредност < 0,001) (Слика 2). Најчешће прекомерно заступљени термин биолошког процеса био је „GO:0006952 одбрамбени одговор“ који се појавио у 6 од 16 (време × линија) комбинација са високом значајношћу (P вредност < 0,001) (Слика 2). Наиболее често прекомерно представљеним термином биолошког процеса био је «ГО: 0006952 заситниј ответ», коториј поавлалса в 6 из 16 (време × високој линии) комбинацијом са значајем (значење П <0,001) (рис. 2). Најчешће прекомерно заступљени термин биолошког процеса био је „GO:0006952 одбрамбени одговор“, који се појавио у 6 од 16 (време × лоза) комбинација са високом значајношћу (P вредност < 0,001) (Слика 2).最常被过度代表的生物过程术语是“ГО:0006952 防御反应”，它出现在16个 (时间×线) 组合中的6 个中, 具有高显着性 (П 值< 0,001) (图2）). Најрепрезентативнији термин биолошког процеса је „GO:0006952 одбрамбени одговор“, који се појављује у 6 од 16 комбинација (时间×线), са високом значајношћу (P вредност < 0,001) (图2). Наиболее часто прекомерно представљеним термином биолошког процеса био је «ГО: 0006952 Дефенсе Респонсе», коториј поавилса в 6 из 16 комбинација (време × линиа) с високом значајем (значење П <0,001) (рис. 2). Најчешће прекомерно заступљени термин биолошког процеса био је „GO:0006952 Одбрамбени одговор“, који се појавио у 6 од 16 комбинација (време × линија) са високом значајношћу (P вредност < 0,001) (Слика 2).Овај термин је био прекомерно заступљен у две временске тачке код 83A: 476 и Boregine (6 и 24 hpi) и у једној временској тачки код Mandelup и популације 22660 (12 и 6 hpi, респективно). Ово је очекивани резултат, који истиче антифунгални одговор отпорних линија. Поред тога, 83A:476 је реаговао на C. lupini брзим индуковањем гена повезаних са оксидативним налетом представљеним термином „GO:0055114 редокс процес“, што указује на специфичан одбрамбени одговор, док је Boregine показао специфичне одбрамбене одговоре, повезане са термином 'GO'. :0006950 Одговор на стрес“. Популација 22660 је активирала хоризонтални одговор отпора који укључује секундарне метаболите, истичући превелики број термина „GO:0016104 Процес биосинтезе тритерпена“ и „GO:0006722 Процес метаболизма тритерпена“ (оба термина припадају истом скупу гена), узимајући у обзир резултате анализе обогаћивања GO термина, стабилност Манделупове реакције била је између Борегина и Популације 22660. Поред тога, рана реакција 83A:476 (6 hpi) и одложена реакција Манделупа и Популације 22660 укључују термин GO:0015979 „фотосинтеза“ и друге повезане биолошке процесе.
Термини онтологије гена биопроцеса одабрани у анотацији диференцијално експримираних гена током транскриптомских одговора усколисне лупине (NLL) инокулиране антраксом лупином (сој Col-08 добијен са поља лупине у Вјеженицама, Пољска, 1999. године) су знатно преувеличани. Анализиране NLL линије су: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни алел Lanr1), Boregine (отпорна, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни алел AnMan) и популација 22660 (осетљива).
Пошто је циљ ове студије био да идентификује гене који доприносе отпорности на антракнозу, гени додељени терминима GO „GO: 0006952 Одбрамбени одговори“ и „GO: 0055114 Редокс процеси“ анализирани су са граничним вредностима од почетних вредности ≥ 30 са најмање једном линијом. × временска тачка комбинујући статистички значајне вредности log2 (промена прегиба). Број гена који испуњавају ове критеријуме био је 65 за GO:0006952 и 524 за GO:0055114.
83A:476 је открио два DEG врха означена термином GO:0006952, први на 6 гена по инчу (64 гена, горња и доња регулација) и други на 24 гена по инчу (15 гена, само горња регулација). Борегин је такође показао да је GO:0006952 достигао врхунац у истој временској тачки, али са мање DEG (11 и 8) и преференцијалном активацијом. Манделуп је показао два врха GO:0006952 на 12 и 48 HPI, оба носећи 12 гена (први са активирајућим генима, а други само са супресивним генима), док је популација 22660 на 6 HPI (13 гена) имала већу превласт врха повећања регулације. Треба напоменути да је 96,4% GO:0006952 DEG у овим врховима имало исти тип одговора (горе или доле), што указује на значајно преклапање у одбрамбеним одговорима упркос разликама у броју укључених гена. Највећа група секвенци повезаних са термином GO:0006952 кодира протеин 22 повезан са стресом услед гладовања (SAM22-like), који припада протеинској клади PR-10 (pathogenesis-associated protein) класе 10 и протеину латекс сличном (MLP-like protein) (Сл. 3). Две групе су се разликовале по природи експресије и правцу одговора. Гени који кодирају протеине сличне SAM22 показали су конзистентну и значајну индукцију у раним временским тачкама (6 или 12 hpi) и генерално нису реаговали на крају експеримента (48 hpi), док су протеини слични MLP показали координацију на 6 hpi. 83A:476 и Mandelup на 48 hp/in, скоро све остале тачке података нису реаговале. Поред тога, разлике у профилима експресије гена протеина сличних SAM22 пратиле су уочену варијабилност у отпорности на антракнозу, јер су отпорније линије имале више временских тачака које значајно индукују ове гене него осетљивији гени. Још један LlR18A/B-сличан PR-10 ген показао је веома сличан образац експресије као и SAM22-сличан протеински ген.
Идентификоване су главне компоненте биолошког процесног термина „GO:0006952 Одбрамбени одговор“ и обрасци експресије кандидатских гена алела Lanr1 и AnMan. Log2 скала представља log2 вредности (промену пута) између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен са поља лупине, Виженица, Пољска, 1999) и контролних (лажно инокулираних) биљака у истој временској тачки. Анализиране су следеће линије лупине уског листа: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни алел Lanr1), Boregine (отпорна, генетска позадина непозната), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни алел AnMan) и Популација 22660 (осетљива).
Поред тога, процењени су профили експресије RNA-seq кандидатских гена Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (Сл. 3). Ген TanjilG_05042 је показао значајан одговор (активацију) на 83A:476 само у првој временској тачки (6 hpi), док је TanjilG_12861 био значајан у Mandeloop-у само у две временске тачке: 6 hpi (снижена регулација) и 24 hpi (6 hpi). Са.). подесивим) ).
Највише прекомерно експресовани гени у термину GO:0055114 „редокс процес“ били су гени који кодирају протеине цитохрома П450 и пероксидазу (Сл. 4). За узорке изоловане из 83A:476 на 6 HPI, максималне или минималне log2 (промена прегиба) вредности (за 86,6% гена) су генерално примећене између инокулираних и контролних биљака, што истиче висок одговор овог генотипа на инокулацију пола. 83A:476 је показао најзначајнији GO:0055114 DEG на 6 hpi (503 гена), док су остале линије на 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 гена; и Population 22660, 78 гена)). Код већине гена породице GO:0055114 примећена су два типа одговора на вакцинацију (активација и инхибиција). Занимљиво је да је до 97,6% ДИГ идентификованих за термин GO: 0055114 код Манделупа на 48 хп. Ова запажања сугеришу да је, упркос значајно мањој скали (тј. броју мутираних редокс гена, 85 наспрам 503), образац одложених транскриптомских одговора Манделупа на антракнозу сличан раном одговору 83А:476. Код Борегина и популације 22660, ова конвергенција је нижа, 51,6% и 75,6%, респективно.
Откривени су обрасци експресије главних компоненти термина биолошког процеса „GO:0055114 Редокс процес“. Log2 скала представља log2 вредности (промену пута) између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен са поља лупине, Виженица, Пољска, 1999) и контролних (лажно инокулираних) биљака у истој временској тачки. Анализиране су следеће линије лупине уског листа: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни алел Lanr1), Boregine (отпорна, генетска позадина непозната), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни алел AnMan) и Популација 22660 (осетљива).
83A:476 Транскриптомски одговори на инокулацију са C. lupini (сој Col-08) такође су укључивали координисано утишавање гена који се приписују термину GO:0015979 „фотосинтеза“ и другим сродним биолошким процесима (Сл. 5). Овај GO:0015979 DEG сет садржао је 105 гена који су били значајно репресирани након 6 hpi код 83A:476. У овом подскупу, 37 гена је такође било смањено код Mandelup-а након 48 HPI и 35 у истој временској тачки код популације 22660, укључујући 19 DEG заједничких за оба генотипа. Ниједан DEG повезан са термином GO: 0015979 није био значајно активиран ни у једној комбинацији (линија x време).
Откривени су обрасци експресије главних компоненти термина биолошког процеса „GO:0015979 Фотосинтеза“. Log2 скала представља log2 вредности (промену пута) између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен са поља лупине, Виженица, Пољска, 1999) и контролних (лажно инокулираних) биљака у истој временској тачки. Анализиране су следеће линије лупине уског листа: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни алел Lanr1), Boregine (отпорна, генетска позадина непозната), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни алел AnMan) и Популација 22660 (осетљива).
На основу резултата анализе диференцијалне експресије и вероватно укључених у одбрамбене одговоре против патогених гљивица, овај скуп од седам гена је одабран за квантификацију профила експресије помоћу PCR у реалном времену (Додатна табела С9).
Претпостављени протеински ген TanjilG_10657 је значајно индукован у свим проучаваним линијама и временским тачкама у поређењу са контролним (мимичким) биљкама (Додатне табеле S10, S11). Поред тога, профил експресије TanjilG_10657 показао је растући тренд током експеримента за све линије. Популација 22660 показала је највећу осетљивост TanjilG_10657 на инокулацију са 114-струком активацијом и највишим релативним нивоом експресије (4,4 ± 0,4) на 24 HPI (Слика 6а). Протеински ген PR10 LlR18A TanjilG_27015 такође је показао активацију у свим линијама и временским тачкама, са статистичком значајношћу на већини тачака података (Слика 6б). Слично TanjilG_10657, највиши релативни ниво експресије TanjilG_27015 је примећен у инокулираној популацији 22660 на 24 HPI (19,5 ± 2,4). Ген киселе ендохитиназе TanjilG_04706 је био значајно појачан у свим линијама и у свим временским тачкама осим код Boregine 6 hpi (Сл. 6ц). Био је снажно индукован у првој временској тачки (6 HPI) код 83A:476 (за 10,5 пута) и умерено повећан код осталих линија (за 6,6-7,5 пута). Током експеримента, експресија TanjilG_04706 је остала на сличним нивоима код 83A:476 и Boregine, док је код Mandelup и популације 22660 значајно порасла, достижући релативно високе вредности (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5, респективно). Ген сличан ендоглукан-1,3-β-глукозидази TanjilG_23384 показао је високу активацију у прве две временске тачке (6 и 12 hpi) код свих линија осим популације 22660 (Сл. 6д). Највиши релативни нивои експресије TanjilG_23384 примећени су у другој временској тачки (12 hpi) код Mandelup-а (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1). На 24 HPI, експресија TanjilG_23384 је била релативно ниска у свим проучаваним линијама (од 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили експресије одабраних гена (ag) откривени квантитативном PCR методом. Бројеви 6, 12 и 24 представљају сате након вакцинације. Гени LanDExH7 и LanTUB6 су коришћени за нормализацију, а LanTUB6 је коришћен за калибрацију између серија. Грешке представљају стандардну девијацију на основу три биолошка понављања, од којих је свако просек три техничка понављања. Статистичка значајност разлика у нивоима експресије између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен 1999. године са поља лупине у Вјеженици, Пољска) и контролних (лажно инокулираних) биљака означена је изнад тачака података (*P вредност < 0,05, **P вредност ≤ 0,01, ***P вредност ≤ 0,001). Статистичка значајност разлика у нивоима експресије између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен 1999. године са поља лупине у Вјеженици, Пољска) и контролних (лажно инокулираних) биљака означена је изнад тачака података (*P вредност < 0,05, **P вредност ≤ 0,01, ***P вредност ≤ 0,001). Статистическаа значајность различиј в уровнах експрессии между инокулированними (Цоллетотрицхум лупини, штамм Цол-08, добијен в 1999 г. с пола лупина у Верженице, Пољска) и контролними (ложно инокулированними) растениами отмечена над точками данних (*значение П < 0,0000, Пзначение, П < 0,000, Пзначение ≤ 0,001). Статистички значајне разлике у нивоима експресије између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен 1999. године са поља лупине у Вјеженицама, Пољска) и контролних (лажно инокулираних) биљака су наведене изнад тачака података (*P вредност < 0,05, **P-вредност ≤ 0,01, ***P-вредност ≤ 0,001).接种（Цоллетотрицхум лупини, Цол-08株, 1999年从波兰Виерзеница的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渀幈缊数渍0,05, **П 值≤ 0,01, ***П 值≤ 0,001)。接种 (цоллетотрицхум лупини, цолор-08 株, 1999 年 波兰 波兰 виерзеница 的 羽扇 获得) 和 秈捧 和 秈捧之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*п 值 <0,05, **П ≤ 0,01, ***0П. Статистички значајне разлике у нивоима експресије между инокулираним (Цоллетотрицхум лупини, штамм Цол-08, добијен с полеј лупина у Верженице, Пољска, 1999. г.) и контролним (ложно инокулираним) растењима отмечени над точками данних (* значење П < 0,05, П-0значение, П < 0,05, П≤ 0,05 ≤ 0,001). Статистички значајне разлике у нивоима експресије између инокулираних (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен са поља лупине у Верженицама, Пољска, 1999. године) и контролних (лажно инокулираних) биљака су наведене изнад тачака података (*P вредност < 0,05, **P-вредност ≤ 0,01, ***P-вредност ≤ 0,001).Анализиране NLL линије биле су: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни Lanr1 алел), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни AnMan алел), Boregine (отпорна, непозната генетска позадина) и популација 22660 (осетљива).
Кандидат ген TanjilG_05042 на локусу Lanr1 показао је знатно другачији образац експресије од профила добијених студијама RNA-seq (Сл. 6е). Значајна активација овог гена примећена је код Mandelup и популације 22660 (до 39,7 и 11,7 пута, респективно), што је резултирало релативно високим нивоима експресије (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3, респективно). 83A:476 је такође открио извесно повећање експресије гена TanjilG_05042 (до 3,8 пута), међутим, постигнути релативни нивои експресије (0,044 ± 0,002) били су више од 30 пута нижи од оних примећених код Mandelup и популације 22660. анализиране помоћу qPCR показале су значајне разлике у нивоима експресије између генотипова у контролним (лажно вакцинисаним) варијантама, достижући разлику од 58 пута између популација 22660 и 83A:476, као и између популација 22660 и 22660. Двострука разлика је постигнута између Boregine и Mandalup.
Кандидат ген на локусу AnMan, TanjilG_12861, активиран је као одговор на вакцинацију код 83A:476 и Mandelup, био је неутралан у популацији 22660, а смањен код Boregine (Сл. 6ф). Релативна експресија гена TanjilG_12861 била је највећа код инокулираног 83A:476 (0,14±0,01). Ген за протеин топлотног шока класе I од 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, показао је ниже релативне нивое експресије код свих проучаваних сојева и временских тачака (Сл. 6г). Највиша вредност је примећена на 24 HPI код популације 22660 (0,14 ± 0,02, осмоструко повећање одговора на вакцинацију).
Поређење профила експресије гена (Сл. 7) показало је високу корелацију између TanjilG_10657 и четири друга гена: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) и TanjilG_04706 (r = 0,79). Такви резултати могу указивати на корегулацију ових гена током одбрамбених одговора. Гени TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показали су различите профиле експресије са нижим вредностима Пирсоновог коефицијента корелације (од 0,08 до 0,43 и -0,19 до 0,28, респективно) у поређењу са другим генима.
Корелације између профила експресије гена откривене су коришћењем квантитативне ПЦР. Анализиране су следеће линије лупине уског листа: 83A:476 (отпорна, носи хомозиготни алел Lanr1), Mandelup (умерено отпорна, носи хомозиготни алел AnMan), Boregine (отпорна, непозната генетска позадина) и Популација 22660 (осетљива). Израчунате су три временске тачке (6, 12 и 24 сата након инокулације), укључујући инокулиране (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добијен са поља лупине у Вјеженицама, Пољска, 1999. године) и контролне (лажно инокулиране) биљке. Скала приказује вредност Пирсоновог коефицијента корелације.
На основу података добијених при снази од 6 коњских снага по инчу, WGCNA је спроведена на 9981 DEG идентификованих поређењем инокулираних и контролних биљака како би се фокусирало на ране одбрамбене одговоре (Додатна табела S12). Пронађена су двадесет два генска модула (кластера) са корелираним (позитивним или негативним) профилима експресије између генотипова и експерименталних варијанти. У просеку, нивои експресије гена су били опадајући редоследом 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (међутим, у обе варијанте овај тренд је био јачи код контролних биљака). У просеку, нивои експресије гена су били опадајући редоследом 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (међутим, у обе варијанте овај тренд је био јачи код контролних биљака). В среднем уровни експрессии генов снижались в порадке 83А:476 > Манделуп > Борегине > Популатион 22660 (в обоих вариантах, однако, ета тенденциа била сильнее у контролних растениј). У просеку, нивои експресије гена су се смањивали редоследом 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популација 22660 (међутим, у обе варијанте овај тренд је био јачи код контролних биљака).平均而言，基因表达水平按83А:476 > Манделуп > Борегине > Популација 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言, 基因 水平 按 按 按 按 按 按 83а: 476> манделуп> борегине> становништво 22660 的 顺序 下降 （秼 在 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）. В среднем уровни експрессии генов снижались в раду 83А:476 > Манделуп > Борегине > Популатион 22660 (однако в обоих вариантах ета тенденциа била сильнее у контролних растениј). У просеку, нивои експресије гена су се смањили у серији 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (међутим, у обе варијанте, овај тренд је био јачи код контролних биљака).Вакцинација је резултирала повећањем експресије гена, посебно у модулима 18, 19, 14, 6 и 1 (у опадајућем редоследу ефекта), негативном регулацијом (нпр. модули 9 и 20) или неутралним ефектима (нпр. модули 11, 22, 8 и 13). Анализа обогаћивања GO термина (Додатна табела S13) открила је „GO: 0006952 Заштитни одговори“ за инокулирани модул (18) са максималном активацијом, укључујући гене анализиране помоћу qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), као и многе модуле фотосинтезе који су највише инокулирани (9). Концентратор модула 18 (Сл. 8) идентификован је као ген TanjilG_26536 који кодира PR-10-сличан LlR18B протеин, а концентратор модула 9 идентификован је као ген TanjilG_28955 који кодира PsbQ протеин фотосистема II. Кандидат гена отпорности на антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, пронађен је у модулу 22 (Сл. 9) и повезан је са терминима „GO:0044260 Ћелијски макромолекуларни метаболички процеси“ и „GO:0006355 Транскрипциона регулација, ДНК шаблони“ који носе чвориште TanjilG_01212. Ген кодира транскрипциони фактор топлотног стреса А-4а (HSFA4a).
Анализа пондерисане мреже коекспресије гена модула са прекомерно заступљеним терминима биолошких процеса „GO: 0006952 Одбрамбени одговори“. Лигација је поједностављена да би се истакла четири гена анализирана помоћу qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Анализа пондерисане мреже коекспресије гена модула са прекомерно заступљеним термином биолошког процеса „GO: 0006355: Транскрипциона регулација, ДНК шаблон“ и који носи кандидатски ген отпорности на антракнозу Lanr1 TanjilG_05042. Лигација је поједностављена да би се изоловали ген TanjilG_05042 и централни ген TanjilG_01212.
Скрининг на отпорност на антракнозу прикупљен у Аустралији показао је да је већина рано објављених култивара била осетљива; Kalya, Coromup и Mandelup су описани као умерено отпорни, док су Wonga, Tanjil и 83A:476 описани као високо отпорни26,27,31. имали су исти алел отпорности, означен као Lanr1, а Coromup и Mandelup су имали другачији алел, означен као AnMan10, 26, 39, док је Kalya пренела другачији алел, Lanr2. Скрининг на отпорност на антракнозу у Немачкој резултирао је идентификацијом отпорне линије Bo7212 са кандидатским алелом који није Lanr1, означеним као LanrBo36.
Наша студија је открила веома ниску фреквенцију (око 6%) алела Lanr1 у тестираној гермплазми. Ово запажање је у складу са резултатима скрининга источноевропске гермплазме коришћењем маркера Anseq3 и Anseq4, који су показали да је алел Lanr1 присутан само у две белоруске линије. Ово сугерише да алел Lanr1 још увек није широко коришћен у локалним програмима оплемењивања, за разлику од Аустралије, где је један од кључних алела за оплемењивање уз помоћ маркера. То може бити због нижег нивоа отпорности који пружа алел Lanr1 у европским пољским условима у поређењу са аустралијским извештајем. Поред тога, студије антракнозе у подручјима са високим падавинама у Аустралији показале су да одговори отпорности посредовани алелом Lanr1 можда нису ефикасни у временским условима који погодују расту и брзом развоју патогена19,42. Заправо, у овој студији, неки симптоми антракнозе су такође примећени код генотипова који носе алел Lanr1, што сугерише да отпорност може нестати под оптималним условима за развој C. lupini. Поред тога, могућа су лажно позитивна тумачења присуства маркера Anseq3 и Anseq4, који су приближно 1 cM удаљени од локуса Lanr1 28,30,43.
Наша студија је показала да је 83A:476, који носи алел Lanr1, реаговао на инокулацију C. lupini репрограмирањем транскриптома великих размера у првој анализираној временској тачки (6 hpi), док су код Mandelup-а, који носи алел AnMan, транскриптомски одговори примећени много касније (од 24 до 48 hp). Ове временске варијације у одбрамбеним одговорима повезане су са разликама у симптомима болести, што истиче важност раног препознавања патогена за успешан одговор на отпорност. Да би инфицирале биљно ткиво, споре антракса морају проћи кроз неколико развојних фаза на површини домаћина, укључујући клијање, деобу ћелија и формирање апресоријума. Додатак је инфективна структура која се причвршћује за површину домаћина и олакшава продор у ткива домаћина. Дакле, споре C. gloeosporioides у екстракту грашка показале су прву деобу једра након 75-90 минута инкубације, формирање клице након 90-120 минута и супресију након 4 сата 45. Манго C. gloeosporioides показао је више од 40% клијавости конидија након 3 сата инкубације и око 20% формирања апресора након 4 сата. Ген CAP20 повезан са вируленцијом код C. gloeosporioides показао је транскрипциону активност у конидијама које формирају епифите након 3,5 сата инкубације у површинском воску авокада са високим концентрацијама протеина CAP20 након 4 сата и 46 минута. Слично томе, активност гена за биосинтезу меланина код C. trifolii индукована је током 2 сата инкубације, након чега је уследило формирање апресоријума након 1 сата. Студије ткива листа показале су да јагоде инокулиране са C. acutatum имају прву супресију након 8 hpi, док парадајз инокулиран са C. coccodes има прву супресију након 4 hpi48,49, што је у великој мери у складу са временском скалом инфективног процеса Colletotrichum spp. Брзи одбрамбени одговори на 83А:476 указују на укљученост гена отпорности биљака и ефекторски-покренутог имунитета (ETI) у овој линији, док Манделупови одложени одговори подржавају хипотезу о микро-асоцираном молекуларном обрасцу-покренутом имунитету (MTI) 50. Рани одговори на 83А: 476 и Манделупа. Делимично преклапање између гена регулисаних навише или наниже у одложеном одговору такође подржава овај концепт, јер се ETI често сматра убрзаним и побољшаним MTI одговором који кулминира програмираном ћелијском смрћу на месту инфекције, познатом као анафилактички шок 51,52.
Већина гена који се приписују прекомерно заступљеном термину Gene Ontology GO:0006952 „Одбрамбени одговор“ су 11 хомолога протеина поруке 22 изазваног стресом (слично SAM22) и седам главних протеина сличних латексним протеинима (MLP) 31, 34, 43 и 423 показали су сличност секвенци. Гени слични SAM22 показали су значајну активацију која је трајала дуже, показујући повећане нивое отпорности на антракнозу (83A:476 и Boregine). Међутим, гени слични MLP-у били су смањено регулисани само у линијама које носе кандидатски алел отпорности (83A:476/Lanr1 након 6 hpi и Mandelup/AnMan након 24 hpi). Треба напоменути да сви идентификовани хомолози слични SAM22 потичу из генског кластера који се простире на приближно 105 kb, док гени слични MLP-у потичу из одвојених региона генома. Координирана активација таквих гена сличних SAM22 је такође пронађена у нашој претходној студији отпорности NLL на инокулацију Diaporthetoxica, што сугерише да су они укључени у хоризонталне компоненте одбрамбеног одговора. Овај закључак је такође поткрепљен извештајима о позитивном одговору гена сличних SAM22 на повреду или третман салицилном киселином, индукторима гљивица или водоник-пероксидом.
Показано је да гени слични MLP-у реагују на различите абиотске и биотске стресове, укључујући бактеријске, вирусне и патогене гљивичне инфекције код многих биљних врста55. Правци одговора на одређене интеракције између биљака и патогена кретао се од снажног повећања (тј. током заразе памука са Verticillium dahliae) до значајног смањења (тј. након инфекције јабуке са Alternaria spp.)56,57. Значајно смањење експресије гена сличног MLP-у 423 примећено је током одбране авокада од инфекције F. niger и током инфекције јабуке Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola и Alternaria alternata су патотипови јабуке58,59. Поред тога, калуси јабуке који прекомерно експресују ген сличан MLP-у 423 имали су нижу експресију гена повезаних са отпорношћу и били су подложнији гљивичној инфекцији59. Након Fusarium oxysporum f, ген сличан MLP-у 423 је такође био потиснут у резистентној гермплазми обичног пасуља. cn. Bean infection 60.
Други чланови породице PR-10 идентификовани у нашој студији RNA-seq били су гени LlR18A и LlR18B као одговор на појачану регулацију, као и ген са појачаном (1 ген) или смањеном регулацијом (3 гена) за протеин преноса липида DIR1. Поред тога, WGCNA истиче ген LlR18B као чвориште у овом модулу, који је веома подложан вакцинацији и носи неколико гена заштитног одговора. Гени LlR18A и LlR18B су индуковани у листовима жутог лупина као одговор на патогене бактерије, као и у стабљикама NLL након инокулације D. toxica, док је пиринчани хомолог ових гена, RSOsPR10, брзо индукован гљивичном инфекцијом за коју се претпоставља да је укључена у сигнални пут јасмонске киселине53,61,62. Ген DIR1 кодира неспецифичне протеине транспорта липида који су потребни за појаву системске стечене резистенције (SAR). Са развојем заштитних реакција, протеин DIR1 се транспортује из жаришта инфекције кроз флоем да би индуковао SAR у удаљеним органима. Занимљиво је да је ген TanjilG_02313 DIR1 значајно индукован у првој временској тачки у линијама 84A:476 и популацији 22660, али се резистенција на антракнозу успешно развила само у линији 84A:476. Ово може указивати на извесну субфункционализацију гена DIR1 код NLL, пошто су преостала три хомолога реаговала на инокулацију само у линији 83A:476 након 6 hpi, а овај одговор је био усмерен надоле.
У нашој студији, најчешће компоненте које одговарају биолошком процесу названом „GO:0055114 Редокс процес“ биле су протеин цитохрома П450, пероксидаза, линолна киселина 9S-/13S-липоксигеназа и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилна киселина оксидаза. Поред тога, наша WGCNA дефинише хомолог HSFA4a као чвориште које носи модуле као што је кандидат гена отпорности на Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a је компонента редокс-зависне регулације нуклеарне транскрипције код биљака.
Протеини цитохрома П450 су оксидоредуктазе које катализују реакције хидроксилације зависне од NADPH и/или O2 у примарном и секундарном метаболизму, укључујући метаболизам ксенобиотика, као и хормона, масних киселина, стерола, компоненти ћелијског зида, биополимера и биосинтезу заштитних једињења 69. У нашој студији, варијабилност функције биљног цитохрома П450 смањена је са -10,6 log2 (промена пута) на 5,7 због великог броја измењених хомолога (37) и разлика у обрасцима одговора између специфичних гена, што одражава ревизију навише. Коришћење само података РНК секвенцирања за разјашњење претпостављене биолошке функције NLL гена у тако великој протеинској суперфамилији било би веома спекулативно. Међутим, вреди напоменути да су неки гени цитохрома П450 повезани са повећаном отпорношћу на патогене гљивице или бактерије, укључујући допринос алергијским реакцијама 69,70,71.
Пероксидазе класе III су мултифункционални биљни ензими укључени у широк спектар метаболичких процеса током раста и развоја биљака, као и као одговор на стресне услове из околине као што су салинитет, суша, висок интензитет светлости и напад патогена72. Пероксидазе су укључене у интеракцију неколико биљних врста са антрацисима, укључујући Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76. Одговор је веома брз, понекад чак и на 4 HPI, пре него што гљивица продре у биљно ткиво73. Ген пероксидазе је такође реаговао на инокулацију D. toxica NLL. Поред својих типичних функција за регулисање оксидативног налета или елиминисање оксидативног стреса, пероксидазе могу ометати раст патогена стварањем физичких баријера заснованих на ојачавању ћелијског зида током лигнификације, подјединице или умрежавања специфичних једињења. Ова функција се in silico може приписати гену TanjilG_03329 који кодира претпостављену анјон-пероксидазу која формира лигнин, а која је значајно појачана у нашој студији код линије отпорне на 83A:476 на 6 HPI, али не и код других сојева и временских тачака које нису реаговале.
9S-/13S-липоксигеназа линолне киселине је први корак у оксидативном путу биосинтезе липида78. Производи овог пута имају вишеструке функције у одбрани биљака, укључујући јачање ћелијског зида кроз формирање наслага калозе и пектина и регулацију оксидативног стреса кроз производњу реактивних врста кисеоника79,80,81,82,83. У овој студији, експресија линолне киселине 9S-/13S-липоксигеназе је измењена код свих сојева, али код осетљиве популације 22660, појачана регулација је преовладавала у различитим временским тачкама, док код сојева који носе резистентни Lanr1 и AnMan алел, она наглашава диверзификацију оксилипинског слоја у заштитним реакцијама антракса између ових генотипова.
Хомолог 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидазе (ACO) је био значајно појачан (9 гена) или смањен (2 гена) када је инокулиран лупином. Са два изузетка, сви ови одговори су се јавили при 6 hp. на 83A:476. Ензимска реакција посредована ACO протеинима је корак који ограничава брзину у производњи етилена и стога је високо регулисана84. Етилен је биљни хормон који игра различите улоге у регулацији развоја биљака и одговора на абиотске и биотске стресне услове. Индукција ACO транскрипције и активација етиленског сигналног пута су укључене у повећање отпорности пиринча на хемибиотрофну гљивицу oryzae oryzae регулисањем производње реактивних врста кисеоника и фитоалексина. Веома сличан процес инфекције листова пронађен између M. oryzae и C. lupini88,89, на позадини значајног повећања регулације ACO хомолога у линији 83A:476 пријављеној у овој студији, помера могућност давања отпорности на NLL антракнозу етилен као централни корак сигнализације у молекуларним путевима.
У овој студији, примећена је велика супресија многих гена повезаних са фотосинтезом након 6 hpi код 83A:476 и након 48 hpi код популације Mandeloop и 22660. Обим и прогресија ових промена су пропорционални нивоу. У овом експерименту је примећена отпорност на антракнозу. Недавно је забележена снажна и рана репресија транскрипата повезаних са фотосинтезом у неколико модела интеракција биљака и патогена, укључујући патогене бактерије и гљивице. Брзина (од 2 HPI у неким интеракцијама) и глобална супресија гена повезаних са фотосинтезом као одговор на инфекцију могу покренути имунитет биљака на основу примене реактивних врста кисеоника и њихове интеракције са путем салицилне киселине да би се посредовале алергијске реакције 90,94.
Закључно, механизми одбрамбеног одговора предложени за најотпорнију лозу (83A:476) укључују брзо препознавање патогена од стране R гена (вероватно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и сигнализацију салицилне киселине и етилена посредовану алергијским одговором, након чега следи успостављање SAR дугог домета. Дејство је подржано протеином DIR-1. Треба напоменути да је биотрофски период за инфекцију C. lupini веома кратак (приближно 2 дана), након чега следи некротични раст95. Прелаз између ових фаза може бити повезан са некрозом и експресијом протеина индуцибилних етиленом који делују као окидачи за реакције преосетљивости код биљака домаћина. Стога је временски прозор за успешно хватање C. lupini у биотрофској фази веома узак. Репрограмирање гена повезаних са редоксом и фотосинтезом примећено у 83A:476 на 6 hpi је у складу са прогресијом гљивичних хифа и најављује развој успешног заштитног одговора у биотрофској фази. Транскриптомски одговори Манделупа и популације 22660 могу бити превише одложени да би ухватили гљивицу пре преласка на некротични раст, међутим, Манделуп може бити ефикаснији од популације 22660 јер релативно брза регулација протеина PR-10 промовише хоризонталну отпорност.
ЕТИ, вођен канонским Р геном, изгледа да је уобичајени механизам за отпорност пасуља на антракнозу. Дакле, код моделне махунарке Medicago truncatula, отпорност на антракнозу даје ген RCT1, члан класе Р гена биљке TIR-NBS-LRR97. Овај ген такође даје отпорност на антракнозу широког спектра код луцерке када се пренесе на осетљиве биљке. Код обичног пасуља (P. vulgaris) до данас је идентификовано више од двадесетак гена отпорности на антракнозу. Неки од ових гена налазе се у регионима којима недостају канонски Р гени, међутим, многи други се налазе на ивицама хромозома који носе кластер гена NBS-LRR, укључујући TIR-NBS-LRRs99. Студија SSR на нивоу целог генома такође је потврдила повезаност гена NBS-LRR са отпорношћу на антракнозу код обичног пасуља. Канонски Р ген је такође пронађен у геномском региону који носи главни локус отпорности на антракнозу код белог лупина 101.
Наш рад показује да непосредна реакција отпорности, активирана у раној фази инфекције биљака (пожељно не касније од 12 hpi), ефикасно штити усколисни лупин од антракнозе изазване патогеном гљивицом Collelotrichum lupini. Користећи секвенцирање високог протока, демонстрирали смо диференцијалне профиле експресије гена отпорности на антракнозу код NLL биљака посредованих генима отпорности Lanr1 и AnMan. Успешна одбрана подразумева пажљиво дизајнирање гена за протеине укључене у редокс, фотосинтезу и патогенезу у року од неколико сати од првог контакта биљке са патогеном. Сличне заштитне реакције, али одложене у времену, много су мање ефикасне у заштити биљака од болести. Отпорност на антракс посредована геном Lanr1 подсећа на типичан брзи одговор R гена (имунитет изазван ефектором), док ген AnMan највероватније пружа хоризонтални одговор (имунитет изазван молекуларним обрасцем повезаним са микробом), пружајући умерен ниво одрживости.
215 НЛЛ линија коришћених за скрининг маркера антракнозе састојало се од 74 култивара, 60 линија добијених укрштањем или оплемењивањем, 5 мутаната и 76 дивљих или оригиналних гермплазми. Линије су потицале из 17 земаља, углавном из Пољске (58), Шпаније (47), Немачке (27), Аустралије (26), Русије (19), Белорусије (7), Италије (5) и других линија из 10 земаља. Скуп такође укључује референтне отпорне линије: 83A:476, Tanjil, Wonga које носе алел Lanr1 и Mandelup које носи алел AnMan. Линије су добијене из Европске базе података о генетичким ресурсима лупина коју одржава Poznań Plant Breeding Ltd., Вјатрово, Пољска (Додатна табела S1).
Биљке су гајене под контролисаним условима (фотопериод 16 сати, температура 25°C током дана и 18°C ​​​​ноћу). Анализиране су две биолошке реплике. ДНК је изолована из листова старих три недеље коришћењем DNeasy Plant Mini Kit-а (Qiagen, Хилден, Немачка) према протоколу. Квалитет и концентрација изоловане ДНК процењени су спектрофотометријским методама (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САД). Анализирани су маркер AnManM1 који означава ген отпорности на антракнозу AnMan (изведен из сорте Mandelup) и маркери Anseq3 и Anseq4 који окружују ген Lanr1 (изведен из сорте Tanjil) 11,26,28. Хомозиготи за отпорни алел су оцењени као „1“, осетљиви – као „0“, а хетерозиготи – као 0,5.
На основу резултата скрининга за маркере AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и доступности семена за финалне експерименте праћења, одабрано је 50 NLL линија за фенотипизацију отпорности на антракнозу. Анализа је спроведена у дупликату у рачунарски контролисаном стакленику са фотопериодом од 14 сати и температурним опсегом од 22°C током дана и 19°C ноћу. Семе се гребе (одсецање семене љуске на супротној страни ембриона оштрим сечивом) пре сетве како би се спречило мировање семена услед претврде семене љуске и како би се обезбедило равномерно клијање. Биљке су гајене у саксијама (11 × 11 × 21 цм) са стерилном земљом (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Пољска). Инокулација је спроведена сојем Colletotrichum lupini Col-08, узгајаним 1999. године са стабљика усколисних биљака лупине узгајаних на пољу у Верженици, Великопољска (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Изабрано подручје. Изолати су култивисани у SNA медијуму на 20° C под црним светлом током 21 дан да би се индуковала спорулација. Четири недеље након сетве, када су биљке достигле фазу 4-6 листова, инокулација је спроведена прскањем суспензијом конидија у концентрацији од 0,5 x 10⁶ конидија по мл. Након инокулације, биљке су држане у мраку 24 сата на влажности од око 98% и температури од 25°C како би се олакшало клијање конидија и процес инфекције. Биљке су затим гајене под 14-часовним фотопериодом на 22°C дању/19°C ноћу и 70% влажности ваздуха. Скор болести је израчунат 22 дана након инокулације и кретао се од 0 (имуно) до 9 (веома осетљиво) у зависности од присуства или одсуства некротичних лезија на стабљикама и листовима. Поред тога, након бодовања, мерена је тежина биљака. Односи између маркер генотипова и фенотипова болести израчунати су као корелације тачака две секвенце (одсуство хетерозиготних маркера у скупу линија за анализу фенотипа отпорности на антракнозу).